CN109112199A - 一种用于检测α-地中海贫血的基因芯片、扩增试剂和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明“一种用于检测α‑地中海贫血的基因芯片、扩增试剂和试剂盒”，属于分子诊断技术，用于检测3种非缺失型α‑地中海贫血基因α^CSα、α^QSα、α^WSα所对应的探针，其碱基序列如SEQ ID NO：7‑12所示；和/或用于检测2种缺失型α‑地中海贫血基因‑‑^SEA、‑‑^THAI的探针，其碱基序列如SEQ ID NO：13‑14所示。可单管直接快速检测2种缺失型α‑地中海贫血基因(‑‑^SEA、‑‑^THAI)和3种非缺失型α‑地中海贫血基因(α^CSα、α^QSα、α^WSα)的试剂盒。

Description

一种用于检测α-地中海贫血的基因芯片、扩增试剂和试剂盒

技术领域

本发明涉及α-地中海贫血的分子检测技术，特别是一种利用直接PCR(DirectPCR)单管同时快速检测缺失型α-地中海贫血基因(--^SEA、--^THAI)和3种非缺失型α-地中海贫血基因(α^CSα、α^QSα、α^WSα)试剂盒，属于分子生物学医药领域。

背景技术

地中海贫血(thalassemia,简称地贫)，又称“珠蛋白合成障碍性贫血”和“海洋性贫血”，是一种隐性基因遗传病，可导致遗传性溶血性贫血，其分子病理学基础主要是由于珠蛋白基因的缺陷(基因突变或缺失)使血红蛋白(hemoglobin，Hb)的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成，而引起血红蛋白的α-链/非α-链比例失衡，进而导致血红蛋白不稳定、红细胞破坏，血红蛋白产量减少所引起的表现为临床症状轻重不等的慢性进行性溶血性贫血；是一组全球最常见严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病，也是世界卫生组织推荐进行重点预防的遗传病。根据受累的氨基酸链来分类，通常将地中海贫血分为α、β、δβ和δ等4种类型，其中以α和β地中海贫血较为常见。α-地中海贫血基因在广西、广东的人群携带率分别高达17.55％.8.53％。由于此病的涉及范围广并且人口基数大，重症地中海贫血患儿的出生成为目前全球的公共卫生问题。

α-地中海贫血(以下简称α-地贫)，其分子基础是位于16号染色体短臂末端16p13.3位点上的α珠蛋白基因簇的先天性遗传缺陷，致使α-珠蛋白链不能合成或合成减少，使β链与δ链异常结合而导致HbA2减少的疾病。α-地贫主要由于一条染色体上1个或同时2个α珠蛋白基因缺失引起、少部分由非缺失型突变引起的。根据基因的缺失或突变情况及临床表现严重程度，可将α地贫分为静止型(-α/αα)、轻型(标准型，--/αα或-α/-α)、中间型(HbH病，--/-α或--/α^Tα)和重型(Hb Bart's胎儿水肿综合征，--/--)4种类型。如果缺失型α-地贫是由于缺失一条染色体上两个功能性α-基因的其中一个，则a珠蛋白链的合成部分受抑制，例如亚洲人群中最常见的-α^4.2/αα与-α^3.7/αα；如果两个功能性α基因全部缺失，例如东南亚人群中最常见的--^SEA以及--^THAI，则α珠蛋白链的合成部分更受抑制。--^SEA自身或--^THAI自身或与-α^3.7或-α^4.2相互共同遗传可引起致死性的Hb Bart's胎儿或严重影响生命质量的HbH病。东南亚型(--^SEA)的纯合子(--^SEA/--^SEA)与泰国型(--^THAI/--^THAI)或者东南亚复合泰国型(--^SEA/--^THAI)，由于其4个α珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α链生成，是α-地贫中最为严重的一种，即重型α地贫。患者在胎儿期即发生大量γ链合成γ4(Hb Bart′s)，Hb Bart′s对氧的亲合力极高，造成组织缺氧而引起胎儿水肿综合征，胎儿常于30～40周时流产、死胎或娩出后半小时内死亡。在中国，目前已报道至少6种非缺失型α-地贫基因突变，其中WS、QS和CS三种点突变是最常见突变，在地中海贫血发病率最高的广西有45.8-53.3％的Hb H病患者携带上述非缺失型α地贫基因，并且这类病人比那些缺失3个α珠蛋白基因所表现出更严重的临床症状，贫血也更严重。

目前对地贫尚无有效的治疗方法，因此通过婚检及产前筛查等途径进行大规模的人群筛查和诊断，发现携带地贫基因的夫妻，在妊娠早期进行产前基因诊断，对产前诊断为中重型地贫的胎儿进行有效干预和终止妊娠，是防止中重型地贫儿出生、提高出生人口素质的有效措施。

目前已报道的基因突变检测方法很多，包括基于单链构象多态性(SSCP)、引物延伸技术、聚合酶链式反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、TaqMan探针技术、变性高效液相色谱(DHPLC)、高分辨熔解曲线检测技术(HRM)、DNA直接测序和DNA微阵列技术等。但这些方法检测过程繁琐、检测所用时间长、使用试剂或者仪器昂贵和特殊的标记引物等，因而不利于临床广泛的推广应用。

现有的非缺失型α地中海贫血基因检测相关的专利种类有几种，其主要是利用PCR反向结合点杂交法、基因芯片法、TaqMan探针荧光PCR法与高分辨熔解曲线检测技术(HRM)。目前缺失型地贫检测方法多采用Gap-PCR结合电泳方法检测中国常见的三种--^SEA、-α^4.2和-α^3.7，必须提取与纯化DNA，才能继续后续实验，标本提取时间约1-2h，PCR扩增时间检测长达3-4h。电泳时间约50-60min，整个流程时间7h，漏检泰国型(--^THAI)可能引起的胎儿水肿综合征。少部分也有采用Gap-PCR结合杂交的方法检测泰国型(--^THAI)，但是PCR扩增耗时长，约3.5h。并且这些PCR诊断性检测都是以血液或羊水等作为生物性材料，从血液中提取DNA；可是这样既耗时又容易导致提取过程中的DNA污染或降解，造成漏检或误检。耗时长，且成本较高，难以满足临床检测快速，低成本的要求。

采用基因检测方法的地贫检测产品有深圳益生堂的缺失型α-地中海贫血基因诊断试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、达安基因的α-地中海贫血基因检测试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、亚能生物的α-地中海贫血基因检测试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、潮州凯普的α-地中海贫血基因检测试剂盒(PCR+导流杂交法)，这些产品均需核酸提取，标本提取时间约1～2h，PCR扩增时间检测长达3～4h。电泳时间约50～60min或者杂交3h，整个流程时间7h。操作繁琐，耗时长，易污染和降解。尚不能满足临床简洁快速的需要。不能单管同时检测缺失型α-地中海贫血基因(--^SEA、--^THAI)和3种非缺失型α-地中海贫血基因(α^CSα、α^QSα、α^WSα)。

另外，普通常规缺失型地贫检测方法所需样本量多，对于边远地带采集的标本运输需要冷链设备，需三级包装系统，标本储存空间大；生物安全风险系数高。对全血、羊水和DBS直接扩增检测地贫技术的专利尚无，市场上尚无此类产品。

至今为止，临床上尚未出现单管直接PCR法检测检测α-地中海贫血缺失型α-地中海贫血基因(--^SEA、--^THAI)和3种非缺失型α-地中海贫血基因(α^CSα、α^QSα、α^WSα)突变的检测产品。并且，现在的试剂盒使用非常不方便，容易造成漏检与误检，危害巨大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种可单管直接快速检测2种缺失型α-地中海贫血基因(--^SEA、--^THAI)和3种非缺失型α-地中海贫血基因(α^CSα、α^QSα、α^WSα)的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种用于检测α-地中海贫血的基因芯片，其特征在于，所述芯片上固定有：

用于检测3种非缺失型α-地中海贫血基因α^CSα、α^QSα、α^WSα所对应的探针，其碱基序列如SEQ ID NO：7-12所示；和/或

用于检测2种缺失型α-地中海贫血基因--^SEA、--^THAI的探针，其碱基序列如SEQ IDNO：13-14所示。

优选地，所述芯片上还固定有：

阴性对照探针(NC)，其碱基序列如SEQIDNO：15，

阳性对照探针(AC)，其碱基序列如SEQIDNO：16，

显色体系控制探针(CC)，其碱基序列如SEQIDNO：17。

优选地，所述芯片的基底材料选自：硝酸纤维素、醋酸纤维素、玻璃片、硅胶晶片、尼龙膜、聚丙烯膜和微缩磁珠组成的组。

基于上述芯片，本发明提供相应的一种用于PCR检测非缺失α-地中海非贫血基因的扩增试剂，其特征在于：包括如下核苷酸序列的引物组：

APF:SEQ ID NO.1

APR:SEQ ID NO.2

SEAF:SEQ ID NO.3

SEAR:SEQ ID NO.4

THAIF:SEQ ID NO.5

THAIR:SEQ ID NO.6

其扩增的特征序列与任一所述的基因芯片中的用于检测α-地中海贫血基因的探针特异性结合；

所述扩增试剂中加入其它PCR扩增组分，通过一次PCR反应对待测样品或提取自待测样品的DNA直接进行三种非缺失α-地中海贫基因α^CSα、α^QSα、α^WSα以及2种缺失型α-地中海贫血基因--^SEA、--^THAI；

所述待测样品选自新鲜采集的抗凝外周血、-20℃－-80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、DBS样本和/或类似DBS处理的样本、唾液、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞，即囊胚细胞、多个细胞或单个细胞等。

滤纸片是血液标本采集和运输的极好载体。全血滴在滤纸片上制成滤纸片干血斑(Dried blood spots,DBS),有很好的生物稳定性和安全性,便于储存和运输。特别是当筛查范围扩大到一些地域偏远、医疗条件相对落后的地区时，应用滤纸干血斑(DBS)对于患者标本采集、保存和运输及流行病学调查则更为有利。

优选地，用于一个反应的所述扩增试剂中，含有

使用时，加入蒸馏水和待测样品或者提取自待测样品的DNA达到20份体积。

优选地，所述引物组各引物摩尔浓度比例如下：

优选的，用于一个反应的所述扩增试剂中，含有:

优选地，所述引物的5′端标记有标记物，用于使扩增的条带带有所述标记物。

本发明还提供一种检测α-地中海贫血的试剂盒，其特征在于：

包含任一所述的基因芯片，以及任一所述的扩增试剂。

上述任一基因芯片的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(1)配制探针工作液：将合成好的特异性探针稀释成10μM的工作液，以备点样用；

(2)固定探针：尼龙膜浸泡于10％的EDAC溶液中活化30分钟，纯水洗涤后室温晾干；在活化处理好的尼龙膜上点上所述工作液，每滴0.5μL；点膜结束后，将膜放置于室温进行反应；

(3)制备基因芯片：利用氢氧化钠停止反应，制得基因芯片；

其中，所述特异性探针包括用于检测3种非缺失型α-地中海贫血基因α^CSα、α^QSα、α^WSα所对应的探针，其碱基序列如SEQ ID NO：7-12所示；和/或

用于检测2种缺失型α-地中海贫血基因--^SEA、--^THAI的探针，其碱基序列如SEQ IDNO：13-14所示。

优选地，所述特异性探针还包括有：

阴性对照探针(NC)，其碱基序列如SEQIDNO：15，

阳性对照探针(AC)，其碱基序列如SEQIDNO：16，

显色体系控制探针(CC)，其碱基序列如SEQIDNO：17。

本发明所述的快速检测α地中海贫血等位基因的试剂盒还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶液、MgCl₂和dNTP等。具体地，酶液为Taq聚合酶体系，包括可用于直接PCR法的热启动酶体系等；所述缓冲液为血液直接PCR缓冲液；当酶液选择采用宝生物工程(大连)有限公司所生产的MightyAmp^TM DNA Polymerase时，缓冲液则优选为与MightyAmp^TM DNA Polymerase配套的缓冲液。

本发明上述的试剂盒，所述引物的5′端标记有生物素或其它基团的标记，使得扩增的产物中含有相应的标记，以便在杂交后对杂交结果进行分析。

本发明上述的试剂盒，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。

本发明上述的试剂盒，用于该核酸杂交膜条的基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如玻璃片、硅胶晶片、尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、微缩磁珠等。所述基因芯片的探针是固定在膜条上。优选的，固定寡核苷酸探针的基底为尼龙膜。

本发明上述的试剂盒，所述杂交试剂包括用于杂交的杂交I液、杂交II液、杂交Ⅲ液、酶、显色液组成。核酸杂交的反应温度是45℃～54℃，其最佳反应温度为48℃～52℃。

本发明所述试剂盒基于Direct PCR的快速检测5种常见类型的α-地贫(2种缺失型和3种非缺失型突变)，即α-地中海贫血中的缺失型α-地中海贫血基因(--^SEA、--^THAI)和3种非缺失型α-地中海贫血基因(α^CSα、α^QSα、α^WSα)，采用该试剂盒快速检测α-地中海贫血等位基因的方法包括以下步骤：

1)样本采集及PCR模板的制备：a)样本采集：标本来源于抗凝外周血，DBS样本、类似DBS处理的样本、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、唾液、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞，即囊胚细胞、多个细胞或单个细胞等；b)PCR模板的制备：上述标本直接作为模板，也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板。

2)配制反应体系，具体为：

直接将样本(如外周血)或者样本提纯DNA加入PCR反应液、水和配制成反应体系；

3)样本检测：抗凝外周血，DBS样本、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、唾液、类似DBS处理的样本、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞，即囊胚细胞、多个细胞或单个细胞等标本直接作为模板，也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板配制的反应体系与反应条件进行PCR扩增，得到扩增产物。优选的反应体系与反应条件见表1。

4)膜芯片的制作

经活化液预处理尼龙膜30分钟后，激活表面羧基；同时，将自行设计合成的的探针(5’或3’端带有氨基标记)用探针稀释液调节到适当的浓度后，按DNA芯片阵列顺序点加于尼龙膜相应位置上，此时，氨基与活化的羧基发生反应生成稳定的共价键而固定探针在尼龙膜表面；最后，用封闭液处理尼龙膜，封闭未结合探针的表面羧基，完成膜芯片制备并低温保存。

5)：杂交

将扩增产物与固定在膜芯片上的探针进行杂交，杂交温度与探针和PCR扩增片段长度、盐浓度、甲酰胺、GC含量等有关。在本发明的体系中48℃孵育1.5～4小时后可获得满意的杂交结果。

6)：非特异性结合物的洗脱

利用不同的洗脱条件，如温度、盐浓度等最大限度的去除非特异性杂交。

7)显色反应

5’端带有的生物素PCR产物与标记有过氧化物酶(POD)的链霉亲和素(链霉抗生物素蛋白)特异结合，并在过氧化氢和棕色底物TMB(四甲基联苯胺)的作用下发生显色反应，膜条上对应探针位置呈现蓝色斑点。

8)检测结果判读

检测结果可以直接经肉眼观察判读。也可经阅读仪扫描阅读后，对信号与背景由相应的软件系统分析获得最终的杂交结果，并自动对结果进行保存和统计。

本发明所述地中海贫血基因检测试剂盒可以单管闭管直接快速检测5种常见类型的α-地贫(2种缺失型和3种突变型)，即α-地中海贫血中的2种缺失型α-地中海贫血基因(--^SEA、--^THAI)和3种非缺失型α-地中海贫血基因(α^CSα、α^QSα、α^WSα)，快速基因诊断点突变引起的HbH病及Hb Bart's胎儿水肿综合征。无需核酸提取，减少污染，节约人力和试剂成本。PCR扩增时间1.5h，比其他方法节约3.5h，单管测试可以只需要一台PCR仪，与其他同类比，节约仪器和试剂成本。因此，本发明试剂盒具备检测时间短、成本低、操作方便，闭管操作，减少污染，对开展地贫人群筛查，遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。

附图说明

以下是附图的说明，以便于理解上述发明的目的和具体特征。

图1为本发明的基因芯片上探针的具体分布位置的图片，

每个位置代表不同的基因突变或对照。

图2.琼脂糖凝胶电泳检测。M：50bp DNA Ladder(MD108)(TIANGEN)；泳道1：--^SEA与--^THAI杂合子混合物扩增出目的带图谱；泳道2：--^THAI杂合子扩增出目的带图谱；泳道3：野生型扩增目的带图谱；泳道4：--^SEA杂合子扩增出目的带图谱。PCR反应液分别加入不同基因型模板经PCR扩增，扩增产物经2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果参见附图2，从电泳结果可以观察到成功分别扩增出目的带：扩增条带片段长度分别为538bp、478bp、306bp。

图3.α-地中海贫血基因检测结果

(1)α^CSα/αα；(2)α^CSα/α^CSα；(3)α^WSα/αα；(4)α^WSα/α^WSα；(5)α^QSα/αα；(6)α^QSα/α^QSα；(7)--^THAI/αα；(8)--^SEA/αα；(9)--^SEA/--^SEA；(10)αα/αα；(11)空白对照。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的本质，通过对本发明实施方式详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，详细说明但不限制本发明。实施例中使用的组分，除特殊说明外，均选用发明内容中的优选方案。

本发明最关键的构思在于：基于直接多重PCR、Gap-PCR和反向点杂交相结合的检测原理，根据各基因型的突变或缺失位点设计相应的扩增引物和探针，以生物素标记引物，以氨基标记探针，并以基因芯片为基底，将探针固定在DNA芯片上，通过特异性引物扩增出来的PCR产物与探针进行杂交，以信号显色盒判读来进行地贫的诊断。同时设计质控探针，更加保证结果质量与准确性。

实施例1：采用本发明所述试剂盒标本来源及PCR模板类型

1.1 样本采集及PCR模板的制备：

a)样本采集：标本来源于抗凝外周血，DBS样本、唾液、绒毛、羊水、脐带血、类似DBS处理的样本、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞，即囊胚细胞、多个细胞或单个细胞等；

b)PCR模板的制备：上述标本直接作为模板，也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板。

1.2 DBS样本制备

上述1.1滤纸片干血斑样品(DBS)采集与制备如下：

①、使用Whatman903滤纸片(或者普通滤纸片)。在滤纸片上标记受检者编号和收集日期。②、末梢血和抗凝血均可用于滤纸片干血斑样品制作。如果从末梢血制备滤纸片干血斑，采集部位为足弓、耳垂或手指。用70％乙醇或酒精棉消毒采血部位，用消过毒的针头小心刺破皮肤。弃去第一滴末梢血。将第二滴血点在滤纸片中央的圆圈内，大约每孔需要50～80μl全血，保证滴满圆圈。每个样品应点满一张滤纸片的每个孔。如从抗凝血制备滤纸片干血斑，移液器吸取50～80μl抗凝血血样，对准滤纸片印圈的中心处，将血样滴在滤纸上。应滴满一张滤纸片的每个孔。③、血液滤纸片于室温下自然干燥至少4小时(在潮湿气候下至少24小时)，不要加热血片或将他们堆叠在一起，干燥过程中不要与其它界面接触。在滤纸片血斑充分干燥后，将滤纸片放入密封袋中，避免滤纸之间标本的相互污染。④、完整包装的DBS样品可在室温下避光储存2周。未及时检测的DBS样品存放冰箱在-20℃或以下待检。

本实施例中的DBS样品还可以替换成：滤纸片干羊水样品、滤纸片干唾液样品、滤纸片干胚胎的遗传物质样品、滤纸片干基因组DNA样品，上述各滤纸片干体液/胚胎的遗传物质/DNA样品制备方法同DBS样品的常规制备方式(如上所述)，并且，采用相同的引物组、相同的PCR方法能获得相同的实验结果，本文中不再一一赘述。

实施例2.用于PCR扩增的特异性引物的设计及PCR反应体系确定

1.1 引物设计

从GenBank数据库中获取α-珠蛋白基因序列，根据α-珠蛋白基因涵盖突变区域设计多对引物，进行大量实验；优选的，3对引物用于PCR扩增，3对引物组合置于同一个反应管中进行多重PCR，同时扩增α-地贫基因。引物由专业生物公司合成。引物序列如表1。

表1 检测α-地贫基因的引物组和探针组

1.2 多重PCR反应体系的确定

利用正交试验方法，通过大量的实验对比，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应液配方体系见表3：PCR反应液18μl，外周血(绒毛、羊水或脐带血)加样量2μl，DBS样本1-3片(直径1-2mm)(补水2μl)，反应总体积为20μl。

表2 地贫多重PCR反应液配方体系及反应条件

1.3 多重PCR扩增程序的确定

经过大量实验对比优化，所述PCR程序95℃预变性3～5分钟，然后94℃15～30秒，62-66℃退火25～35秒，28～38个循环。

控制退火温度和退火时间可以做到特异性好，扩增效率高，最终确定的最佳扩增程序见表3。

PCR反应液分别加入不同基因型模板经PCR扩增，扩增产物经2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果参见附图2，从电泳结果可以观察到成功扩增出不同目的带；扩增条带片段长度分别为538bp、478bp、306bp。

实施例3：寡核苷酸探针的设计、点样和固定

3.1.探针的设计及筛选

从GenBank数据库中获取α-珠蛋白基因序列，根据α-地贫基因突变区域设计特异性识别α-地贫5种突变(--^SEA、--^THAI、α^CSα、α^QSα、α^WSα)的寡核苷酸探针组合；并设计阴性、阳性及显色对照探针和空白对照(BC)。由专业生物公司合成(见表2)。

3.2.基因芯片的制备。

本发明所述基因芯片的制备方法，包括如下步骤：

(1)寡核苷酸探针的工作液的配制：将合成好的寡核苷酸探针用探针稀释液(pH8.4的0.5M Na₂CO₃和0.5M NaHCO₃的溶液)混合稀释成工作液(10μM)，以备点样用。

(2)固定探针：尼龙膜浸泡于10％的EDAC溶液中活化30分钟，纯水洗涤3次，每次2分钟，然后室温晾干。通过微量移液设备将上述制备好的探针分别点在在活化处理好的尼龙膜上，每滴0.5μL。点膜结束后，将膜放置于室温30分钟，进行反应。膜条上的探针序列如表1所示。特异性探针中用于检测没有发生突变的位点为正常探针(用N表示)，用于检测发生突变的位点为突变探针(用M表示)，膜条上的探针排列顺序如图1所示，由斑点显现的位置即可判断结果。检测的位点突变与正常对照关系如表3所示。检测位点包括2种缺失型α-地中海贫血基因(--^SEA、--^THAI)和3种非缺失型α-地中海贫血基因(α^CSα、α^QSα、α^WSα)。

表3 检测的位点突变与正常对照关系

(3)制备基因芯片：利用氢氧化钠停止反应，制得基因芯片。将膜转入0.1M NaOH溶液中浸泡10分钟，停止反应。并用蒸馏水充分洗涤，室温晾干后保存于4℃备用。即制得基因芯片。

实施例4：杂交条件的确定、显色反应及结果判断。

将待测样品或样品DNA直接用直接PCR反应液及在相应扩增条件进行PCR反应扩增，其扩增产物用于反向斑点杂交。反向斑点杂交过程包括以下几个步骤：核酸杂交、结合的核酸与酶交联及非特异性结合核酸的洗脱、与酶底物结合显色、杂交结果分析。下面详细说明各步骤的操作。

4.1 杂交

标有样品编号的膜条置入15ml塑料离心管，加入杂交I液(2×SSC、0.1％SDS)5-6ml及PCR反应液中部分或者所有(5-20μL)PCR产物，拧紧管盖。将离心管放入沸水浴中加热10分钟，取出拧紧盖子，放入杂交箱48℃杂交1.5小时以上，但不超过4小时。

取50ml塑料管，加入40ml杂交II液(0.5×SSC、0.1％SDS)于杂交箱(或者恒温水浴箱)中进行预热至48℃。

4.2 洗膜

取出膜条，移至装有预热杂交II液的50ml管中，于48℃轻摇洗涤15分钟(每管40ml溶液，最多可同时洗涤4张膜)。

4.3 显色

按杂交I液：POD＝2000:1配制孵育液，室温轻摇浸泡30分钟，弃去POD溶液。用杂交I液室温轻摇洗两次，每次5分钟。室温用C液洗膜1-2分钟，同时新鲜配制显色液。将膜条浸泡于显色液中避光显色6至12分钟即可观察结果。

4.4 结果判读

(1.1)杂交结果分析

弃去显色液，用蒸馏水洗涤两次，每次2-3分钟。吸水纸吸干基因芯片表面的水，肉眼直接判读结果或者在扫描仪上扫描记录结果。

(1.2)结果读取基本方式

膜条上相应探针位置显蓝色，说明膜条有相应信号；膜条上的突变位点有信号，说明待检样品含有该类型突变；若该突变位点对应的正常对照也有信号，说明待检样品为该类型突变的杂合子；若该突变位点对应的正常对照没有信号，说明待检样品为该类型突变纯合子或合并缺失型地贫。

(1.3)质量控制

(1.31)阴性对照样本(以水代替样本)进行杂交，膜条上除CC位置显示蓝色外若有杂交斑点，提示为实验有污染，实验结果无效。

(1.32)样品膜条上没有一个斑点，该样品实验无效。

(1.33)一般情况，BC、NC位置显示无色，AC位置显示蓝色，CC位置显示蓝色。NC位置显示蓝色提示为实验有污染，实验结果无效。若BC、NC位置显示无色，AC位置不显示蓝色，CC位置显示蓝色，需要考虑可能为纯合缺失型地贫和/或复合其他缺失型地贫和/或样品实验无效，需要进一步分析和/或进一步检测。CC位置不显示蓝色，说明显色系统有问题，询查试剂问题。

实施例5：试剂盒说明及具体实验方法

5.1 试剂盒主要成份

(1)基因芯片，其上带有检测正常与突变位点探针及阴阳性对照探针及空白对照；(2)用于直接扩增的PCR反应液含多重PCR的引物；(3)杂交试剂如POD、TMB及30％H₂O₂。

本检测需要用到的其他主要试剂

10％SDS：20g SDS用180ml纯水溶解，用1N HCl调pH值至pH7.0，最后定容至200ml。常温保存。

20×SSC：175.3g NaCl、88.2g柠檬酸钠用750ml纯水溶解，用浓盐酸调pH值至pH7.0，最后定容至1000ml，并高压灭菌保存。常温保存。

1M柠檬酸钠：294g柠檬酸钠用700ml溶解，用浓HCl调pH值至pH5.0，最后定容至1000ml。常温保存。

杂交试剂由杂交I液、杂交II液、杂交Ⅲ液、酶、显色液组成，其中杂交I液的组成为1～6×SSC，0.1％～1％SDS，其中优选的方案是2×SSC，0.5％SDS；杂交II液的组成为0.1～1×SSC，0.1％～1％SDS，其中优选的方案是0.5×SSC，0.5％SDS。酶为辣根过氧化物酶(Streptavidin-POD)，用量为0.005～1U/ml，优选的用量为0.1U。与之相匹配的显色系统，辣根过氧化物酶的显色底物可以是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine，简称TMB)，显色液优选的方案为0.1M柠檬酸钠(pH4.9)，0.42mMTMB，0.004％H₂O₂(v/v)。

杂交I液：100ml 20×SSC，10ml 10％SDS加纯水定容至1000ml。常温保存。

杂交II液：25ml 20×SSC，10ml 10％SDS加纯水定容至1000ml。常温保存。

杂交Ⅲ液：100ml 1M柠檬酸钠加纯水定容至1000ml。常温保存。

显色液：19ml杂交Ⅲ液加入1ml TMB和2μl 30％H₂O₂。

5.2 PCR反应所用仪器：Bio-Rad热循环仪C1000或者T100或者杭州晶格基因等普通PCR扩增仪。

5.3 样本采集及PCR模板要求：

a)样本采集：标本来源于抗凝外周血、DBS样本、绒毛、羊水、脐带血或其他体液标本等；

b)PCR模板要求：上述标本直接作为模板，也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板。

c)血样保存：抗凝全血或脐带血、绒毛、羊水或其他体液标本等在室温放置不超过24小时，DBS样本在室温放置不超过2周，2～8℃保存不超过7-15天，-20℃以下保存不超过1-2年，-70℃可长期保存，冷冻保存时应避免反复冻融。

d)样品运输：抗凝全血或脐带血、绒毛、羊水或其他体液标本等运输时需用冰壶或加冰袋的泡沫箱密封，应保证冰袋不化冻，且在途时限不宜超过72小时。DBS样本可以室温(不宜超过30℃)运输或运输时需用冰壶或加冰袋的泡沫箱密封，且在途时限不宜超过72小时。

5.4 检验方法

5.4.1 PCR扩增

从冰箱取出试剂盒，并从中取出所需PCR反应液，室温平衡溶解，在管壁上做好标记，于5000-10000rpm离心2-4秒，而后向PCR反应液中直接加入样本或者已提取的待测样品DNA1-4μL，反应总体系为20μL。

每次实验另取一管PCR反应液，以2μL纯水为模板，作空白对照。

PCR按以下条件进行扩增，优选的，表3。

5.4.2 杂交

标有样品编号的膜条置入15ml塑料离心管，加入杂交I液(2×SSC、0.1％SDS)5-6ml及PCR反应液中部分或者所有(5-20μl)PCR产物，拧紧管盖。将离心管放入沸水浴中加热10分钟，取出拧紧盖子，放入杂交箱48℃杂交1.5小时以上，但不超过4小时。

取50ml塑料管，加入40ml杂交II液(0.5×SSC、0.1％SDS)于杂交箱(或者恒温水浴箱)中进行预热至48℃。

5.4.3 洗膜

取出膜条，移至装有预热杂交II液的50ml管中，于48℃轻摇洗涤15分钟(每管40ml溶液，最多可同时洗涤4张膜)。

5.4.4 显色

按杂交I液：POD＝2000:1配制孵育液，室温轻摇浸泡30分钟，弃去POD溶液。用杂交I液室温轻摇洗两次，每次5分钟。再用杂交Ⅲ液室温洗涤膜条1-2分钟，同时新鲜配制显色液。将膜条浸泡于显色液中避光显色6至12分钟即可观察结果。

5.4.5 杂交结果分析

弃去显色液，用蒸馏水洗涤两次，每次2-3分钟。吸水纸吸干基因芯片表面的水，依据表3，判定方法同实施例4，肉眼直接判读结果或者在扫描仪上扫描记录结果。

实施例6：采用本发明所述试剂盒在已知基因型样本中的检测结果

1、试剂盒的组成：

同实施例5。

2、实施方法：

采用双盲实验，其他同实施例5。

3、样本来源：

所有样本均来源自经第三方提供已确定的基因型(研究者不知道)不同类型样本。

4、数据分析及结果判定：依据表3，判定方法同实施例4，肉眼直接判读结果或者在扫描仪上扫描记录结果。本实施例的结果如图3所示。

实施例7.本发明的产品性能验证

产品性能指标

1 测定准确性

收集10份阴性样本和20份地贫样本，选择低、中、高3个浓度，每个浓度重复3次，分别用3批产品来检测，分别计算阴性和阳性符合率。结果显示相应的基因型，研究结果与采用深圳益生堂生物企业有限公司和亚能生物技术(深圳)有限公司的地中海贫血基因诊断试剂盒(PCR法)试剂盒检测结果完全符合，产品阳性符合率和阴性符合率都达100％。

2 分析灵敏度

采用本发明试剂盒对地贫检测位点进行灵敏度分析，每个样本包含7个浓度梯度，确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为10ng/μL；

3 分析特异性

通过干扰筛查试验，临床正常剂量的EDTA、枸橼酸钠不是本品的干扰物质；溶血样本不会干扰本试剂盒检测结果；脂血样本中甘油三酯(14.1mmol/L)和黄疸样本(360.4mmol/L)对本品检测无干扰。

用本产品检测8例本产品检测范围外的临床样本，包括1例α-地贫阴性样本、2例β-地中海贫血临床样本、2例缺铁性贫血临床样本、2例G-6-PD临床样本，1例感染衣原体的全血样本，均无交叉反应。

4 重复性

采用本发明试剂盒不同批号产品，不同人(2人)操作，同一天做2次，共做2天，每个参考品每次试验重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测α-地贫基因型，结果显示一致。

本发明采用Direct PCR法在同一个条件同一个反应管中直接闭管同时扩增检测5种常见类型的α-地贫(--^SEA、--^THAI、α^CSα、α^QSα、α^WSα)，并且在同一条件下进行RDB试验。本发明具有避免核酸抽提致使标本间交叉污染或DNA降解优点，减少操作步骤，节约时间、人力、仪器和试剂成本，减少实验室污染，降低漏检和/或误检率，快速基因诊断点突变或缺失引起的HbH病及Hb Bart's胎儿水肿综合征。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

名称	序列编号	序列
			APF	SEQ ID NO.1	5'ACCCTCTTCTCTGCACAGCTCC 3'
APR	SEQ ID NO.2	5'TCCATTGTTGGCACATTCCG 3'
			SEAF	SEQ ID NO.3	5'AATGGATGAGGACGGAGCGAT 3'
SEAR	SEQ ID NO.4	5'GAGTCTCGCTCTGTCTCCTAGGCT 3'
			THAIF	SEQ ID NO.5	5'TGCCCTCAACCCCTGACAAT 3'
THAIR	SEQ ID NO.6	5'CTTGGATCTGCACCTCTGGGTAG 3'
			WSN	SEQ ID NO.7	5'TGCGGTGCACGCCTC 3'
QSN	SEQ ID NO.8	5'AACTTGTCCAGGGAGGCG 3'
			CSN	SEQ ID NO.9	5'CAAATACCGTTAAGCTGGAGCCT 3'
WSM	SEQ ID NO.10	5'GGAGGCCTGCACCGC 3'
			QSM	SEQ ID NO.11	5'CGCCTCCCCGGACAA 3'
CSM	SEQ ID NO.12	5'CCAAATACCGTCAAGCTGGA 3'
			SEA	SEQ ID NO.13	5'CCAGCCTCCAAGTGAACC 3'
THAI	SEQ ID NO.14	5'GCGGCTCAAGGGCTCAG 3'
			NC	SEQ ID NO.15	5'ACACCAACCGCATCGTCAT 3'
AC	SEQ ID NO.16	5'CTCGGTAGCCGTTCCTCCTG 3'
			CC	SEQ ID NO.17	5'CACATCACACACTCTGCGAC 3'

Claims (10)

1.一种用于检测α-地中海贫血的基因芯片，其特征在于，所述芯片上固定有：

用于检测3种非缺失型α-地中海贫血基因α^CSα、α^QSα、α^WSα所对应的探针，其碱基序列如SEQ ID NO：7-12所示；和/或

用于检测2种缺失型α-地中海贫血基因--^SEA、--^THAI的探针，其碱基序列如SEQ ID NO：13-14所示。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述芯片上还固定有：

阴性对照探针(NC)，其碱基序列如SEQIDNO：15，

阳性对照探针(AC)，其碱基序列如SEQIDNO：16，

显色体系控制探针(CC)，其碱基序列如SEQIDNO：17。

3.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述芯片的基底材料选自：硝酸纤维素、醋酸纤维素、玻璃片、硅胶晶片、尼龙膜、聚丙烯膜和微缩磁珠组成的组。

4.一种用于PCR检测非缺失α-地中海非贫血基因的扩增试剂，其特征在于：包括如下核苷酸序列的引物组：

APF:SEQ ID NO.1，

APR:SEQ ID NO.2，

SEAF:SEQ ID NO.3，

SEAR:SEQ ID NO.4，

THAIF:SEQ ID NO.5，

THAIR:SEQ ID NO.6，

其扩增的特征序列与权利要求1－3任一所述的基因芯片中的用于检测α-地中海贫血基因的探针特异性结合；

所述扩增试剂中加入其它PCR扩增组分，通过一次PCR反应对待测样品或提取自待测样品的DNA直接进行三种非缺失α-地中海贫基因α^CSα、α^QSα、α^WSα以及2种缺失型α-地中海贫血基因--^SEA、--^THAI；

所述待测样品选自新鲜采集的抗凝外周血、-20℃－-80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、DBS样本和/或类似DBS处理的样本、唾液、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞，即囊胚细胞、多个细胞或单个细胞等。

5.根据权利要求4所述的扩增试剂，其特征在于成分如下：用于一个反应的所述扩增试剂中，含有

使用时，加入蒸馏水和待测样品或者提取自待测样品的DNA达到20份体积。

6.根据权利要求4或5任一所述的扩增试剂，其特征在于，所述引物组各引物摩尔浓度比例如下：

优选的，用于一个反应的所述扩增试剂中，含有:

7.根据权利要求4-6任一所述的扩增试剂，其特征在于，所述引物的5′端标记有标记物，用于使扩增的条带带有所述标记物。

8.一种检测α-地中海贫血的试剂盒，其特征在于：

包含权利要求1-3任一所述的基因芯片，以及权利要求4-7任一所述的扩增试剂。

9.权利要求1-3任一所述的基因芯片的制备方法，其特征在于：

步骤如下：

(1)配制探针工作液：将合成好的特异性探针稀释成10μM的工作液，以备点样用；

(2)固定探针：尼龙膜浸泡于10％的EDAC溶液中活化30分钟，纯水洗涤后室温晾干；在活化处理好的尼龙膜上点上所述工作液，每滴0.5μL；点膜结束后，将膜放置于室温进行反应；

(3)制备基因芯片：利用氢氧化钠停止反应，制得基因芯片；

其中，所述特异性探针包括用于检测3种非缺失型α-地中海贫血基因α^CSα、α^QSα、α^WSα所对应的探针，其碱基序列如SEQ ID NO：7-12所示；和/或

用于检测2种缺失型α-地中海贫血基因--^SEA、--^THAI的探针，其碱基序列如SEQ ID NO：13-14所示。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述特异性探针还包括有：

阴性对照探针(NC)，其碱基序列如SEQIDNO：15，

阳性对照探针(AC)，其碱基序列如SEQIDNO：16，

显色体系控制探针(CC)，其碱基序列如SEQIDNO：17。