CN104372100A - 检测地中海贫血相关基因突变的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物组及其应用、试剂盒及其应用。该用于扩增地中海贫血基因核苷酸片段的引物组包括引物组A和/或引物组B。该引物对组相关基因位点所在基因片段进行扩增。该引物组和试剂盒能够有效地检测α和β地中海贫血的野生型和突变型结果，可行性好，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物组及其应用、试剂盒及其应用。
背景技术
珠蛋白生成障碍性贫血，原名地中海贫血，又称海洋性贫血，是一组遗传性溶血性贫血疾病。由于遗传的基因缺陷致使血红蛋白中一种或一种以上珠蛋白链合成缺如或不足所导致的贫血或病理状态。缘于基因缺陷的复杂性与多样性，使缺乏的珠蛋白链类型、数量及临床症状变异性较大。
珠蛋白链的分子结构及合成是由基因决定的。γ、δ、ε和β珠蛋白基因组成“β基因族”，ζ和α珠蛋白组成“α基因族”。正常人自父母双方各继承2个α珠蛋白基因(αα/αα)合成足够的α珠蛋白链；自父母双方各继承1个β珠蛋白基因合成足够的β珠蛋白链。由于珠蛋白基因的缺失或点突变，肽链合成障碍导致发病。地中海贫血分为α型、β型、δβ型和δ型4种，其中以β和α地中海贫血较为常见。
β珠蛋白生成障碍性贫血(简称β地贫)的发生的分子病理相当复杂，已知有100种以上的β基因突变，主要是由于基因的点突变，少数为基因缺失。大多数α珠蛋白生成障碍性贫血(地中海贫血)(简称α地贫)是由于α珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成。白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成。
对于少见类型和各种类型重叠所致的复合体则非常复杂，临床表现各异，仅根据临床特点和常规实验室血液学检查是无法诊断的。而且由于基因调控水平的差异，相同基因突变类型的患者不一定有相同的临床表现。血红蛋白电泳检查是诊断本病的必备条件，但输血治疗后的血液学检查会与实际结果有所不同。所以进行遗传学和分子生物学检查才能最后确诊。遗传学检查可确定为纯合子、杂合子以及双重杂合子等。
但是目前生物学检查检测单一、灵敏度不高，因此提供一种检测地中海贫血的引物组及试剂盒具有现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种引物组及其应用、试剂盒及其应用。该引物对组相关基因位点所在基因片段进行扩增。该引物组和试剂盒能够有效地检测α和β地中海贫血的野生型和突变型结果，可行性好，灵敏度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于扩增地中海贫血基因核苷酸片段的引物组，其包括引物组A和/或引物组B；
所述引物组A包括如下序列的引物：
所述引物组B具有如下序列所示的引物：
本发明还提供了上述引物组在检测地中海贫血基因突变中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述地中海贫血为α地中海贫血和/或β地中海贫血。
在本发明的一些实施例中，α地中海贫血为非缺失型α地中海贫血。
在本发明的另一些实施例中，α地中海贫血为缺失型α地中海贫血。
本发明还提供了一种检测地中海贫血基因突变的试剂盒，包括上述引物组。
本发明提供的试剂盒，还包括芯片和探针。
在本发明的一些实施例中，所述探针包括探针组C和/或探针组D；
所述探针组C具有如下序列的探针：
所述探针组D具有如下序列的探针：
在本发明提供的试剂盒中，还包括表面化学质控探针、杂交质控探针和阴性对照探针。
在本发明的一些实施例中，所述表面化学质控探针具有如SEQ ID No.123所示的序列。
在本发明的一些实施例中，所述杂交质控探针具有如SEQ ID No.124所示的序列。
在本发明的一些实施例中，所述阴性对照探针具有如SEQ ID No.125所示的序列。
本发明还提供了上述试剂盒在检测地中海贫血基因突变中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述地中海贫血为α地中海贫血和/或β地中海贫血。
在本发明的一些实施例中，α地中海贫血为非缺失型α地中海贫血。
在本发明的另一些实施例中，α地中海贫血为缺失型α地中海贫血。
本发明提供了一种用于扩增地中海贫血基因核苷酸片段的引物组，其包括引物组A和/或引物组B。特异性引物对相关基因位点所在基因片段进行扩增。能够有效地检测α和β地中海贫血的野生型和突变型结果，可行性好，灵敏度高。本试剂盒以人基因组DNA为模板，采用带有Tag标签序列的基因位点特异性引物对相关基因位点所在基因片段进行扩增和生物素标记，再通过磁珠将扩增后的寡聚核苷酸片段捕获，然后与能够识别相应标签序列的通用基因芯片进行杂交，最后通过对芯片进行扫描和数据分析就可以同时得到α和β地中海贫血的检测结果。由于针对所检测的β地中海贫血突变位点19个，缺失型α地中海贫血3个及非缺失型α地中海贫血3个的野生型和突变型分别设计了引物和探针，因此本试剂盒可以同时检测出β地中海贫血突变位点19个，缺失型α地中海贫血3个及非缺失型α地中海贫血3个的野生型和突变型结果。
附图说明
图1示本发明实施例2提供的试剂盒的检测原理；
图2示本发明实施例2提供的试剂盒检测灵敏度及重复性实验结果；
图3示本发明实施例2提供的试剂盒检测地中海贫血芯片杂交结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种引物组及其应用、试剂盒及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的引物组及其应用、试剂盒及其应用中所用试剂均可由市场购得。引物序列和探针序列由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1引物组对地中海贫血基因的扩增与检测
PCR扩增体系1、2、3、5四个扩增体系的组分相同：总体积为25μL，组成为：溶剂1×buffer，dNTP 0.1～0.2mM，MgCl21～3mM、热启动Taq DNA聚合酶1-1.5U。
PCR扩增体系所对应的4组引物组：
引物组1：用于鉴定nt29A>G的引物对(如SEQ ID No.1～3所示)、用于鉴定Cap(-ACCC)的引物对(如SEQ ID No.7～9所示)、用于鉴定CD14-15(+G)的引物对(如SEQ ID No.13～15所示)、用于鉴定CD26G>A的引物对(如SEQ ID No.19～21所示)、用于鉴定IVS-I-1G>T的引物对(如SEQ IDNo.25～27所示)、用于鉴定CD41-42(-TCTT)的引物对(如SEQ ID No.31～33所示)，各上游引物的浓度均为0.1μM，各下游引物的浓度均为0.2μM；
引物组2：用于鉴定CD71-72(+A)的引物对(如SEQ ID No.4～6所示)、用于鉴定起始密码子ATG>AGG的引物对(如SEQ ID No.10～12所示)、用于鉴定CD17A>T的引物对(如SEQ ID No.16～18所示)、用于鉴定CD27-28(+C)的引物对(如SEQ ID No.22～24所示)、用于鉴定IVS-I-5G>C的引物对(如SEQ ID No.28～30所示)、用于鉴定CD43G>T的引物对(如SEQ ID No.34～36所示)，各上游引物的浓度均为0.1μM，各下游引物的浓度均为0.2μM；
引物组3：用于鉴定CD30A>G的引物对(如SEQ ID No.37～39所示)、用于鉴定nt28A>G的引物对(如SEQ ID No.40～42所示)、用于鉴定IVS-II-654C>T的引物对(如SEQ ID No.43～45所示)、用于鉴定αCS的引物对(如SEQ ID No.46～48所示)、用于鉴定αWS的引物对(如SEQ ID No.49～51所示)、用于鉴定αQS的引物对(如SEQ ID No.52～54所示)、用于鉴定SEA的引物对(如SEQ IDNo.57～58所示)、用于鉴定2α的引物对(如SEQ ID No.55～56所示)，各上游引物的浓度均为0.1μM，各下游引物的浓度均为0.2μM；
引物组5：用于鉴定nt30T>C的引物对(如SEQ ID No.63～65所示)、用于鉴定IVS-II-5G>C的引物对(如SEQ ID No.66～68所示)、用于鉴定CD37G>A的引物对(如SEQ ID No.69～71所示)、用于鉴定nt32C>A的引物对(如SEQ ID No.72～74所示)，各上游引物的浓度均为0.1μM，各下游引物的浓度均为0.2μM。
PCR扩增体系4：体积为25μL，组成为：溶剂1×buffer，dNTP 0.1～0.2mM，MgCl21～3mM、热启动Taq DNA聚合酶1-1.5U、长片段扩增介质1～2M(DMSO、甜菜碱、BSA、甘油等)，引物组4：用于鉴定-3.7α的引物对(如SEQ ID No.61～62所示)、用于鉴定-4.2α的引物对(如SEQ ID No.59～60所示)，各上游引物的浓度均为0.3μM，各下游引物的浓度均为0.3μM。
PCR扩增程序：
采用wild type样本(样本编号：THX-024)进行实验，将其稀释成1ng/μL、5ng/μL、10ng/μL、50ng/μL、100ng/μL、200ng/μL共6个浓度梯度，采用本发明提供的试剂盒对这些不同浓度的样本进行3次重复实验。BC为空白对照。结果见图2。其中，图2(a)示第一次试验样本浓度为1ng/μL、5ng/μL、10ng/μL的芯片杂交图；图2(b)第一次试验样本浓度为50ng/μL、100ng/μL、200ng/μL的芯片杂交图以及对照组的芯片杂交图；图2(c)示第二次试验样本浓度为1ng/μL、5ng/μL、10ng/μL的芯片杂交图；图2(d)第二次试验样本浓度为50ng/μL、100ng/μL、200ng/μL的芯片杂交图以及对照组的芯片杂交图；图2(e)示第三次试验样本浓度为1ng/μL、5ng/μL、10ng/μL的芯片杂交图；图2(f)第三次试验样本浓度为50ng/μL、100ng/μL、200ng/μL的芯片杂交图以及对照组的芯片杂交图。
由实验结果可知，本发明提供的引物组及试剂盒灵敏度的检测结果与已知结果100％相符，同时进行了3次重复实验，结果也完全一致，证明了本实验的可重复性。因此，本发明提供的引物组、试剂盒及检测方法具有可行性。
实施例2本发明提供的试剂盒对地中海贫血基因的检测
PCR扩增体系1、2、3、5四个扩增体系的组分相同：总体积为25μL，组成为：溶剂1×buffer，dNTP 0.1～0.2mM，MgCl21～3mM、热启动Taq DNA聚合酶1-1.5U。
PCR扩增体系所对应的4组引物组：
引物组1：用于鉴定nt29A>G的引物对(如SEQ ID No.1～3所示)、用于鉴定Cap(-ACCC)的引物对(如SEQ ID No.7～9所示)、用于鉴定CD14-15(+G)的引物对(如SEQ ID No.13～15所示)、用于鉴定CD26G>A的引物对(如SEQ ID No.19～21所示)、用于鉴定IVS-I-1G>T的引物对(如SEQ IDNo.25～27所示)、用于鉴定CD41-42(-TCTT)的引物对(如SEQ ID No.31～33所示)，各上游引物的浓度均为0.1μM，各下游引物的浓度均为0.2μM；
引物组2：用于鉴定CD71-72(+A)的引物对(如SEQ ID No.4～6所示)、用于鉴定起始密码子ATG>AGG的引物对(如SEQ ID No.10～12所示)、用于鉴定CD17A>T的引物对(如SEQ ID No.16～18所示)、用于鉴定CD27-28(+C)的引物对(如SEQ ID No.22～24所示)、用于鉴定IVS-I-5G>C的引物对(如SEQ ID No.28～30所示)、用于鉴定CD43G>T的引物对(如SEQ ID No.34～36所示)，各上游引物的浓度均为0.1μM，各下游引物的浓度均为0.2μM；
引物组3：用于鉴定CD30A>G的引物对(如SEQ ID No.37～39所示)、用于鉴定nt28A>G的引物对(如SEQ ID No.40～42所示)、用于鉴定IVS-II-654C>T的引物对(如SEQ ID No.43～45所示)、用于鉴定αCS的引物对(如SEQ ID No.46～48所示)、用于鉴定αWS的引物对(如SEQ ID No.49～51所示)、用于鉴定αQS的引物对(如SEQ ID No.52～54所示)、用于鉴定SEA的引物对(如SEQ IDNo.57～58所示)、用于鉴定2α的引物对(如SEQ ID No.55～56所示)，各上游引物的浓度均为0.1μM，各下游引物的浓度均为0.2μM；
引物组5：用于鉴定nt30T>C的引物对(如SEQ ID No.63～65所示)、用于鉴定IVS-II-5G>C的引物对(如SEQ ID No.66～68所示)、用于鉴定CD37G>A的引物对(如SEQ ID No.69～71所示)、用于鉴定nt32C>A的引物对(如SEQ ID No.72～74所示)，各上游引物的浓度均为0.1μM，各下游引物的浓度均为0.2μM。
PCR扩增体系4：体积为25μL，组成为：溶剂1×buffer，dNTP 0.1～0.2mM，MgCl21～3mM、热启动Taq DNA聚合酶1-1.5U、长片段扩增介质1～2M(DMSO、甜菜碱、BSA、甘油等)，引物组4：用于鉴定-3.7α的引物对(如SEQ ID No.61～62所示)、用于鉴定-4.2α的引物对(如SEQ ID No.59～60所示)，各上游引物的浓度均为0.3μM，各下游引物的浓度均为0.3μM。
PCR扩增程序：
芯片杂交过程：
磁珠的准备：
分析一份样品时，涡漩震荡混匀磁珠，取200μL离心管置于架上，加入50μL结合缓冲液，再加入磁珠20μL，吸附15秒，用磁力架去除溶液。将离心管撤离磁力架，再加入50μL结合缓冲液，漩涡混匀。
磁珠纯化：
PCR扩增产物与磁珠混合。
向结合了PCR扩增产物的磁珠悬液中加入杂交缓冲液。
杂交缓冲液：25％去离子甲酰胺、6×SSC、5×Denhart’、1％SDS。
杂交：
通用芯片，每个通用芯片的每一个点阵上加入14μL混合液，密封，45-60℃杂交0.5-3小时。
样本均来源于广西医科大学第一附属医院。
芯片点阵排布：
1号点阵见表1。
表1 1号点阵排布
2号点阵见表2。
表2 2号点阵排布
结果见图3及表3。
表3 检测结果
| 样本号 | 本发明检测结果 | 已知结果 |
| THX-001 | CD17杂合 | CD17杂合 |
| THX-002 | CD41-42杂合 | CD41-42杂合 |
| THX-003 | CD43杂合 | CD43杂合 |
| THX-004 | 起始密码子Int杂合 | 起始密码子Int杂合 |
| THX-005 | IVSⅡ-654杂合 | IVSⅡ-654杂合 |
| THX-006 | IVSⅠ-1杂合 | IVSⅠ-1杂合 |
| THX-007 | nt29杂合 | nt29杂合 |
| THX-008 | nt28杂合 | nt28杂合 |
| THX-009 | SEA杂合缺失型 | SEA杂合缺失型 |
| THX-010 | 3.7杂合缺失型 | 3.7杂合缺失型 |
| THX-011 | 4.2杂合缺失型 | 4.2杂合缺失型 |
| THX-012 | CD14-15杂合 | CD14-15杂合 |
| THX-013 | α142杂合 | α142杂合 |
| THX-014 | α122杂合 | α122杂合 |
| THX-015 | α125杂合 | α125杂合 |
| THX-016 | CD71-72杂合 | CD71-72杂合 |
| THX-017 | Wild type | Wild type |
| THX-018 | Wild type | Wild type |
| THX-019 | Wild type | Wild type |
| THX-020 | Wild type | Wild type |
| THX-021 | Wild type | Wild type |
| THX-022 | Wild type | Wild type |
| THX-023 | Wild type | Wild type |
| THX-024 | Wild type | Wild type |
由图3及表3结果可知，本发明提供的引物组及试剂盒的检测结果与已知结果相符，相符率达100％。因此，本发明提供的引物组、试剂盒及检测方法具有可行性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.用于扩增地中海贫血基因核苷酸片段的引物组，其特征在于，其包括引物组A和/或引物组B；
所述引物组A包括如SEQ ID No.1～SEQ ID No.45、如SEQ ID No.63～SEQ ID No.74所示序列的引物：
其中，
针对突变位点nt29设计的引物具有如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的序列；
针对突变位点CD71/72设计的引物具有如SEQ ID No.4～SEQ ID No.6所示的序列；
针对突变位点Cap设计的引物具有如SEQ ID No.7～SEQ ID No.9所示的序列；
针对突变位点Int设计的引物具有如SEQ ID No.10～SEQ ID No.12所示的序列；
针对突变位点CD14/15设计的引物具有如SEQ ID No.13～SEQ ID No.15所示的序列；
针对突变位点CD17设计的引物具有如SEQ ID No.16～SEQ ID No.18所示的序列；
针对突变位点CD26设计的引物具有如SEQ ID No.19～SEQ ID No.21所示的序列；
针对突变位点CD27/28设计的引物具有如SEQ ID No.22～SEQ ID No.24所示的序列；
针对突变位点IVS I-1设计的引物具有如SEQ ID No.25～SEQ ID No.27所示的序列；
针对突变位点IVS I-5设计的引物具有如SEQ ID No.28～SEQ ID No.30所示的序列；
针对突变位点CD41/42设计的引物具有如SEQ ID No.31～SEQ ID No.33所示的序列；
针对突变位点CD43设计的引物具有如SEQ ID No.34～SEQ ID No.36所示的序列；
针对突变位点CD30设计的引物具有如SEQ ID No.37～SEQ ID No.39所示的序列；
针对突变位点nt28设计的引物具有如SEQ ID No.40～SEQ ID No.42所示的序列；
针对突变位点IVS II-654设计的引物具有如SEQ ID No.43～SEQ ID No.45所示的序列；
针对突变位点nt30设计的引物具有如SEQ ID No.63～SEQ ID No.65所示的序列；
针对突变位点IVS II-5设计的引物具有如SEQ ID No.66～SEQ ID No.68所示的序列；
针对突变位点CD37设计的引物具有如SEQ ID No.69～SEQ ID No.71所示的序列；
针对突变位点nt32设计的引物具有如SEQ ID No.72～SEQ ID No.74所示的序列；
所述引物组B包括如SEQ ID No.46～SEQ ID No.62所示序列的引物：
其中，
针对突变位点α142设计的引物具有如SEQ ID No.46～SEQ ID No.48所示的序列；
针对突变位点α122设计的引物具有如SEQ ID No.49～SEQ ID No.51所示的序列；
针对突变位点α125设计的引物具有如SEQ ID No.52～SEQ ID No.54所示的序列；
针对突变位点2α设计的引物具有如SEQ ID No.55～SEQ ID No.56所示的序列；
针对突变位点SEA设计的引物具有如SEQ ID No.57～SEQ ID No.58所示的序列；
针对突变位点4.2设计的引物具有如SEQ ID No.59～SEQ ID No.60所示的序列；
针对突变位点3.7设计的引物具有如SEQ ID No.61～SEQ ID No.62所示的序列。
2.根据权利要求1所述的引物组在检测地中海贫血基因突变中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述地中海贫血为α地中海贫血和/或β地中海贫血。
4.一种检测地中海贫血基因突变的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括芯片和探针。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述探针包括探针组C和/或探针组D；
所述探针组C包括如SEQ ID No.75～SEQ ID No.104、如SEQ ID No.115～SEQ ID No.122所示序列的探针：
其中，
针对位点nt29设计的探针具有如SEQ ID No.75～SEQ ID No.76所示的序列；
针对位点CD71/72设计的探针具有如SEQ ID No.77～SEQ ID No.78所示的序列；
针对位点Cap设计的探针具有如SEQ ID No.79～SEQ ID No.80所示的序列；
针对位点Int设计的探针具有如SEQ ID No.81～SEQ ID No.82所示的序列；
针对位点CD14/15设计的探针具有如SEQ ID No.83～SEQ ID No.84所示的序列；
针对位点CD17设计的探针具有如SEQ ID No.85～SEQ ID No.86所示的序列；
针对位点CD26设计的探针具有如SEQ ID No.87～SEQ ID No.88所示的序列；
针对位点CD27/28设计的探针具有如SEQ ID No.89～SEQ ID No.90所示的序列；
针对位点IVS I-1设计的探针具有如SEQ ID No.91～SEQ ID No.92所示的序列；
针对位点IVS I-5设计的探针具有如SEQ ID No.93～SEQ ID No.94所示的序列；
针对位点CD41/42设计的探针具有如SEQ ID No.95～SEQ ID No.96所示的序列；
针对位点CD43设计的探针具有如SEQ ID No.97～SEQ ID No.98所示的序列；
针对位点CD30设计的探针具有如SEQ ID No.99～SEQ ID No.100所示的序列；
针对位点nt28设计的探针具有如SEQ ID No.101～SEQ ID No.102所示的序列；
针对位点IVS II-654设计的探针具有如SEQ ID No.103～SEQ ID No.104所示的序列；
针对位点nt30设计的探针具有如SEQ ID No.115～SEQ ID No.116所示的序列；
针对位点IVS II-5设计的探针具有如SEQ ID No.117～SEQ ID No.118所示的序列；
针对位点CD37设计的探针具有如SEQ ID No.119～SEQ ID No.120所示的序列；
针对位点nt32设计的探针具有如SEQ ID No.121～SEQ ID No.122所示的序列；
所述探针组D包括如SEQ ID No.105～SEQ ID No.114所示序列的探针：
其中，
针对位点α142设计的探针具有如SEQ ID No.105～SEQ ID No.106所示的序列；
针对位点α122设计的探针具有如SEQ ID No.107～SEQ ID No.108所示的序列；
针对位点α125设计的探针具有如SEQ ID No.109～SEQ ID No.110所示的序列；
针对位点2α设计的探针具有如SEQ ID No.111所示的序列；
针对位点SEA设计的探针具有如SEQ ID No.112所示的序列；
针对位点4.2设计的探针具有如SEQ ID No.113所示的序列；
针对位点3.7设计的探针具有如SEQ ID No.114所示的序列。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括表面化学质控探针、杂交质控探针和阴性对照探针。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述表面化学质控探针具有如SEQ ID No.123所示的序列；
所述杂交质控探针具有如SEQ ID No.124所示的序列；
所述阴性对照探针具有如SEQ ID No.125所示的序列。
9.根据权利要求4至8任一项所述的试剂盒在检测地中海贫血基因突变中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述地中海贫血为α地中海贫血和/或β地中海贫血。
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