KR20110132283A

KR20110132283A - Ｖｋｏｒｃ１ 유전자의 -1639번째의 염기의 다형 검출법, 및 그것을 위한 핵산 프로브 및 키트

Info

Publication number: KR20110132283A
Application number: KR1020110052602A
Authority: KR
Inventors: 마리코 고모리
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2010-06-01
Filing date: 2011-06-01
Publication date: 2011-12-07
Also published as: JP5843487B2; EP2392676B1; KR101386918B1; EP2392676A1; JP2012010698A; CN102268476B; US8758997B2; US20110300539A1; CN102268476A

Abstract

[과제] 본 발명은, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형(多型)을 검출하기 위해 유효한 소광(消光) 프로브를 특정하여, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형을 검출하는 방법, 및 그것을 위한 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.
[해결 수단] VKORC1 유전자의 -1639번째의 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 서열번호 1 또는 2에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기번호 80∼89를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열이며, 서열번호 1 또는 2에 있어서의 80번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 이외는 서열번호 1 또는 2에 상동성을 갖고, 염기번호 80에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.

Description

ＶＫＯＲＣ１ 유전자의 -1639번째의 염기의 다형 검출법, 및 그것을 위한 핵산 프로브 및 키트{METHOD FOR DETECTING POLYMORPHISM AT NUCLEOTIDE POSITION -1639 OF VKORC1 GENE, AND NUCLEIC ACID PROBE AND KIT THEREFOR}

본 발명은, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형(多型) 검출법, 및 그것을 위한 핵산 프로브 및 키트에 관한 것이다.

심근경색이나 뇌경색의 환자에 대하여, 혈액의 응고를 방지하는 약제로서, 와파린(warfarin)이 널리 사용되고 있다. 와파린의 적량은, 인종에 따라 크게 다르고, 또한, 동일한 인종이어도 개인간에 차이가 보인다. 와파린을 대량으로 투여하면, 예를 들면 코피나 피부의 내출혈이 생기거나, 때로는 뇌내출혈 등의 부작용을 일으킬 우려가 있다. 이 때문에, 치료에 있어서 와파린의 적절한 양을 환자마다 결정하는 것은 매우 중요하게 되어 있다.

이와 같은 와파린의 적량치를 결정함에 있어서, 근래, CYP2C9 유전자 및 VKORC1 유전자의 다형이 와파린의 약효에 관계하고 있음이 보고되고 있다(비특허문헌 1,2). CYP2C9 유전자는, 와파린 대사 효소를 만드는 시토크롬 P450을 코드하는 유전자이다. VKORC1 유전자는, 혈액의 응고에 관여하는 비타민 K에 작용하는 단백질을 코드하는 유전자이다. 따라서, 이들 두 개의 유전자의 다형을 검출하는 것은, 환자에 따라 와파린의 적량을 결정하여, 부작용을 저감시키기 위해서도 매우 중요하다. 또한, VKORC1 유전자의 다형으로서는, 1173C＞T (rs9934438), -1639 G＞A (rs9923231) 등이 알려져 있다. 이와 같은 VKORC1 유전자의 다형은, 비특허문헌 3―5에 기재되어 있다.

염기의 다형을 검출하는 방법으로서는, PCR-RFLP법(비특허문헌 3) 또는 파이로 시퀀스에 의해 변이를 검출하는 방법이 있다(비특허문헌 4).

그러나, 비특허문헌 3의 PCR-RFLP법은, DNA의 추출 정제 및 PCR을 행한 후, 증폭 산물에 대하여 제한 효소 처리하고, 전기 영동(泳動)을 행할 필요가 있는 등, 수고나 비용을 요한다. 또한, PCR을 행한 후, 증폭 산물을 처리할 필요가 있기 때문에, 증폭 산물이 다음의 반응계에 혼입할 우려가 있어, 자동화가 곤란하며, 복수의 핵산 서열을 동시에 검사할 수 없다는 문제점이 있었다.

비특허문헌 4의 파이로 시퀀스는 뉴클레오티드가 DNA에 도입될 때에 방출되는 피로인산을 ATP로 변화시켜 발광 반응에 사용함으로써 뉴클레오티드가 얼마만큼 DNA에 도입되었는지를 정량할 수 있다는 원리에 의거하고 있다. 실제로는 디옥시리보뉴클레오티드를 1종류씩 가하여 발광량을 측정하고 제거하는 것을 반복함으로써 서열을 결정한다. 잉여 뉴클레오티드의 제거에는, 주형(鑄型)의 DNA를 어떠한 고상(固相)의 기질에 결합시켜 두고, 반응액을 씻어흘려 제거하는 고상화법과 아피라제(apyrase)를 첨가하여 뉴클레오티드를 분해하는 액상법이 있다. 이와 같이 복잡한 작업을 자동으로 행하기 위한 시스템이 시판되고 있지만, 매우 고가여서 비용을 요한다. 또한, DNA의 추출 정제, 전(前) 처리를 행하지 않으면 안 되는 등, 수고나 비용을 요한다는 문제점이 있었다.

한편, 변이를 포함하는 영역을 PCR로 증폭한 후, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여 융해 곡선 분석을 행하고, 융해 곡선 분석의 결과에 의거하여 변이를 해석하는 방법이 알려져 있다(특허문헌 1,2). 그러나, 이들 문헌에 있어서는, 프로브의 설계에 관하여, 말단부가 형광 색소에 의해 표지된 소광(消光) 프로브가 표적 핵산에 하이브리다이즈 했을 때, 말단 부분에 있어서 프로브―핵산 하이브리드의 복수 염기 쌍이 적어도 하나의 G와 C의 페어를 형성하도록 설계한다는 교시가 있을 뿐이다.

특허문헌 3에는, 5’ 말단을 형광 표지한 프로브를 사용하여, 융해 곡선 분석에 의해, VKORC1 1173C＞T(rs9934438)과 CYP2C9*3을 동시에 검출하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, VKORC1-1639 G＞A(rs9923231)의 다형을 검출하는 방법은 기재되어 있지 않다. 또한, VKORC1-1639 G＞A(rs9923231)의 다형과 CYP2C9*3 변이 부위의 다형을 동시에 검출하는 방법도 기재되어 있지 않다.

일본국 특개2001-286300호 공보 일본국 특개2002-119291호 공보 국제 공개 공보 WO／2008／117782

Simone Rost et al., Nature Vol. 427 2004 letters to nature Mark J. Rieder et al., The New England Journal of Medicine 352; 22, 2005 TDM 연구 Vol. 25 No. 4 (2008) 141-144 BLOOD, 1 SEPTEMBER 2007 VOLUME 110, NUMBER 5 Genet Med. 2008 Feb; 10(2) : 89-98

본 발명은, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형을 검출하기 위해 유효한 소광 프로브를 특정하여, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형을 검출하는 방법, 및 그것을 위한 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자는, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형을 포함하는 특정한 영역에 의거하여 소광 프로브를 설계하고, 당해 소광 프로브를 사용하는 융해 곡선 분석을 행함으로써 당해 변이를 검출할 수 있는 것을 찾아내어, 본 발명을 완성시키는데 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) VKORC1 유전자의 -1639번째의 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 서열번호 1 또는 2에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기번호 80∼89를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열이며, 서열번호 1 또는 2에 있어서의 80번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 이외는 서열번호 1 또는 2에 상동성을 갖고, 염기번호 80에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.

(2) 상기 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호 80에 대응하는 염기를 3’말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖는, (1)에 기재된 다형 검출용 프로브.

(3) 상기 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호 80에 대응하는 염기를 3’말단에 갖는, (1)에 기재된 다형 검출용 프로브.

(4) 상기 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈 하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈 했을 때에 형광 강도가 감소하거나 또는 증가하는, (1)~(3) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

(5) 상기 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈 하지 않을 때에 형광을 발하고, 표적 서열에 하이브리다이즈 했을 때에 형광 강도가 감소하는, (4)에 기재된 다형 검출용 프로브.

(6) 상기 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가 10∼40인, (1)~(5) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

(7) 상기 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가 15∼30인, (1)~(6) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

(8) 상기 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가 15∼25인, (1)~(7) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

(9) 상기 프로브가 융해 곡선 분석용의 프로브인, (1)~(8) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

(10) 상기 올리고뉴클레오티드가 서열번호 6으로 표시되는, (1)~(9) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

(11) (1)~(10) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브를 사용하는 VKORC1 유전자 근방 영역의 다형 검출 방법.

(12) (Ⅰ) (1)~(10) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈 시켜 하이브리드 형성체를 얻는 것,

(Ⅱ) 상기 하이브리드 형성체를 함유하는 시료의 온도를 변화시킴으로써, 상기 하이브리드 형성체를 해리시켜, 상기 하이브리드 형성체의 해리에 의거한 형광 시그널의 변동을 측정하는 것,

(Ⅲ) 상기 시그널의 변동에 의거하여 하이브리드 형성체의 해리 온도인 Tm 값을 결정하는 것, 및

(Ⅳ) 상기 Tm 값에 의거하여 VKORC1 유전자에 있어서의 다형의 존재 또는 다형을 갖는 핵산의 존재비를 결정하는 것을 포함하는, (11)에 기재된 다형 검출 방법.

(13) 상기 공정 (Ⅰ)의 전, 또는 공정 (Ⅰ)과 동시에 핵산을 증폭하는 것을 더 포함하는, (12)에 기재된 다형 검출 방법.

(14) 와파린의 적량을 판단하는 방법으로서, (11)~(13) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출 방법에 의해, VKORC1 유전자 근방 영역에 있어서의 다형을 검출하는 것, 및 검출된 다형의 유무에 의거하여 와파린의 적량을 판단하는 것을 포함하는 방법.

(15) (1)~(10) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브를 포함하는, 다형 검출용 키트.

(16) 서열번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈 하는 서열을 포함하는 영역을 주형으로 하여 증폭 가능한 프라이머를 더 포함하는, (15)에 기재된 다형 검출용 키트.

(17) 상기 프라이머가 서열번호 3과 4에 기재된 프라이머인, (16)에 기재된 다형 검출용 키트.

(18) 서열번호 8, 9에 기재된 프라이머 및 서열번호 10에 기재된 프로브를 더 포함하는, (16) 또는 (17)에 기재된 다형 검출용 키트.

또한, 상기에 있어서 VKORC1 유전자의 다형이란 동(同)유전자의 근방 영역의 다형도 포함한다.

본 발명의 프로브를 유전자 증폭계 내에 첨가해 둠으로써 PCR 반응 종료 후, 융해 곡선 분석(Tm 해석)을 행하는 것만으로, 복수의 유전자 변이형의 타이핑이 가능해진다. 또한, 전혈(全血)이나 구강 점막 현탁액을 직접 검사하는 것이 가능하기 때문에, 수고나 비용을 저감할 수 있다.

본 발명의 프로브는, 특이성이 높고, 검출 감도가 높다.

본 발명의 방법을 사용함으로써, PCR을 행하는 경우여도, 증폭 산물을 꺼낼 필요가 없기 때문에, 컨태미네이션(contamination)의 위험성이 거의 없다. 또한, 본 발명의 방법은, 기구가 간단하므로 자동화가 용이하다.

본 발명의 방법에 의해, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형과 CYP2C9*3 변이 부위의 다형을 동시에 검출할 수도 있다.

도 1은 실시예 1의 인간 게놈 1 및 인간 게놈 2(정제 게놈)에 대한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당의 TAMRA(VKORC1 프로브 1)의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 2는 실시예 2의 인간 게놈 1 및 인간 게놈 2(전혈)에 대한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당의 TAMRA(VKORC1 프로브 1)의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 3는 비교예의 인간 게놈 1 및 인간 게놈 2(정제 게놈)에 대한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당의 TAMRA(VKORC1 프로브 2)의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 4은 실시예 3의 인간 게놈 1 및 인간 게놈 2(정제 게놈)에 대한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당의 TAMRA(VKORC1 프로브 1)의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 5은 실시예 3의 인간 게놈 1 및 인간 게놈 2(정제 게놈)에 대한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당의 BODIPY FL(CYP2C9*3 프로브 1)의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 6은 실시예 4의 인간 게놈 1 및 인간 게놈 2(전혈)에 대한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당의 TAMRA(VKORC1 프로브 1)의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 7는 실시예 4의 인간 게놈 1 및 인간 게놈 2(전혈)에 대한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당의 BODIPY FL(CYP2C9*3 프로브 1)의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.

＜1＞ 본 발명 프로브 및 본 발명 검출 방법

본 발명 프로브는, VKORC1 유전자의 -1639번째의 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 서열번호 1 또는 2에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기번호 80∼89를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열이며, 서열번호 1 또는 2에 있어서의 80번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 이외는 서열번호 1 또는 2에 상동성을 갖고, 염기번호 80에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 여기에서, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기는, 서열번호 1, 2의 88번째의 염기이다.

본 발명 프로브는, 서열번호 1에 나타내는 염기 서열(VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기에 있어서의 야생형의 염기를 갖는 서열) 또는 서열번호 2에 나타내는 염기 서열(VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기에 있어서의 변이형(다형)의 염기를 갖는 서열)에 있어서 상기 특정된 서열을 갖는 것 외에는, 특허문헌 1, 2에 기재된 소광 프로브와 마찬가지로 하여 제작할 수 있다. 또한, 본 발명의 서열번호 1에 나타내는 서열은, GeneBank의 액세션 넘버 NG_011564의 3501번째부터 3680번째이다. 본 발명의 프로브의 길이로서는 10∼50 염기 길이, 바람직하게는 10∼40 염기 길이, 보다 바람직하게는 15∼30, 가장 바람직하게는 15∼25이다.

본 발명에 사용되는 프로브의 염기 서열의 예로서는, 5'-cattggccrggtgcggt-3'(서열번호 5)를 들 수 있다. 서열 중 “r”은 a 또는 g를 나타낸다. 보다 바람직하게는 5'-cattggccaggtgcggt-3'(서열번호 6)이다.

형광 색소로서는, 특허문헌 1,2에 기재된 것을 사용할 수 있지만, 구체예로서는, Pacific Blue(상표), FAM(상표), TAMRA(상표), BODIPY(상표) FL 등을 들 수 있다. 형광 색소의 올리고뉴클레오티드에의 결합 방법은, 통상의 방법, 예를 들면 특허문헌 1, 2에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다.

본원에 있어서의 「상동성」이란, 특정한 염기 서열에 있어서, 염기 서열에 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 서열을 갖고 있는 염기 서열을 가리킨다. 즉, 본 발명의 프로브는, 서열번호 1 또는 2에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기번호 80부터 89를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상동적인 서열이지만, 완전하게 동일하지 않고, 5염기, 4염기, 3염기, 2염기, 또는 1염기만 달라도 된다.

본 발명 프로브는, 표적 서열에 하이브리다이즈 했을 때에, 형광 색소의 형광이 감소 또는 증가하는 것이 바람직하다. 본 발명 프로브는, 바람직하게는 하이브리다이즈 했을 때에, 형광 색소의 형광이 소광하는 소광 프로브이다.

또한, 본 발명 프로브는, 5’ 또는 3’가 형광 색소에 의해 표지화되어 있는 것이 바람직하다.

또한, 본 명세서에 있어서, 「5’말단으로부터 세어 1∼3번째」라고 하는 경우에는, 5’말단을 1번째로서 세고, 「3’말단으로부터 세어 1∼3번째」라고 하는 경우에는, 3’말단을 1번째로서 센다.

본 실시예의 표 2에 나타나는 바와 같이, 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형을 검출할 수 있다.

본 발명 검출 방법은, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형의 부위를 갖는 핵산에 대해서, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여, 형광 색소의 형광을 측정함으로써 융해 곡선 분석을 행하고, 융해 곡선 분석의 결과에 의거하여 다형을 검출하는 방법으로서, 핵산 프로브는 본 발명 프로브인 것을 특징으로 한다.

본 발명 검출 방법은, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형의 부위를 포함하는 영역을 증폭하는 것, 및 본 발명 프로브를 사용하는 것 외에는, 통상의 핵산 증폭 및 융해 곡선 분석(Tm 분석)의 방법에 따라 행할 수 있다.

본 발명의 검출 방법은, 바람직하게는, 본 발명의 프로브를 사용하며, 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

(Ⅰ) DNA를 함유하는 시료에 본 발명의 프로브를 첨가하여, 상기 DNA에 상기 프로브를 하이브리다이즈 시키는 공정,

(Ⅱ) 온도를 변화시켜 상기 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드 형성체를 해리시켜, 하이브리드 형성체의 해리에 의거한 시그널의 변동을 측정하는 공정,

(Ⅲ) 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm 값을 결정하는 공정, 및

(Ⅳ) 상기 Tm 값으로부터 목적의 다형 유무 또는 다형을 갖는 염기 서열의 존재비를 결정하는 공정.

본 발명 검출 방법은, 본 발명 프로브를 사용하는 것 외에는, 통상의 핵산 증폭 및 융해 곡선 분석(Tm 분석)의 방법에 따라 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 검출 방법은, 상기 공정 (Ⅰ)의 전, 또는 공정 (Ⅰ)과 동시에 핵산을 증폭하는 것을 포함하고 있어도 된다.

핵산 증폭의 방법으로서는, 폴리머라제를 사용하는 방법이 바람직하고, 그 예로서는, PCR, ICAN, LAMP 등을 들 수 있다. 폴리머라제를 사용하는 방법에 의해 증폭하는 경우에는, 본 발명 프로브의 존재 하에서 증폭을 행하는 것이 바람직하다. 사용하는 프로브에 따라, 증폭의 반응 조건 등을 조정하는 것은 당업자라면 용이하다. 이에 따라, 핵산의 증폭 후에 프로브의 Tm 값을 해석할 뿐이므로, 반응 종료 후 증폭 산물을 취급할 필요가 없다. 따라서, 증폭 산물에 의한 오염의 걱정이 없다. 또한, 증폭에 필요한 기기와 동일한 기기로 검출하는 것이 가능하므로, 용기를 이동할 필요조차 없다. 따라서, 자동화도 용이하다.

본 발명에 있어서, 시료 중의 DNA는, 1본쇄 DNA여도 좋고 2본쇄 DNA여도 좋다. 상기 DNA가 2본쇄 DNA인 경우에는, 예를 들면 상기 하이브리다이즈 공정에 앞서, 가열에 의해 상기 시료 중의 2본쇄 DNA를 해리시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 2본쇄 DNA를 1본쇄 DNA로 해리함으로써, 다음의 하이브리다이즈 공정에 있어서 검출용 프로브와의 하이브리다이즈가 가능해진다.

본 발명에 있어서, 상기 시료 중의 DNA에 대한, 본 발명의 프로브의 첨가 비율(몰비)은 제한되지 않지만, 검출 시그널을 충분히 확보할 수 있기 때문에, 시료 중의 DNA에 대하여 1배 이하가 바람직하고, 0.3배 이하가 보다 바람직하다. 이 때, 시료 중의 DNA로는, 예를 들면 검출 목적의 다형이 발생하고 있는 검출 대상DNA와 상기 다형이 발생하지 않는 비검출 대상 DNA와의 합계여도 좋고, 검출 목적의 다형이 발생하고 있는 검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물과 상기 다형이 발생하지 않는 비검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물과의 합계여도 좋다. 또한, 시료 중의 DNA에 있어서의 상기 검출 대상 DNA의 비율은, 통상 불분명하지만, 결과적으로 상기 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 검출 대상 DNA(검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물)에 대하여 100배 이하가 되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 50배 이하, 더 바람직하게는 30배 이하이다. 또한, 그 하한은 특히 제한되지 않지만, 예를 들면 0.001배 이상이고, 바람직하게는 0.01배 이상이며, 더 바람직하게는 0.2배 이상이다.

상기 DNA에 대한 본 발명의 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면 2본쇄 DNA에 대한 몰비여도 좋고, 1본쇄 DNA에 대한 몰비여도 좋다.

Tm 값에 관하여 설명한다. 2본쇄 DNA를 함유하는 용액을 가열해가면, 260nm에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이는, 2본쇄 DNA에 있어서의 양 사슬 간의 수소 결합이 가열에 의해 풀려, 1본쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 2본쇄 DNA가 해리하여 1본쇄 DNA로 되면, 그 흡광도는 가열 개시시의 흡광도(2본쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내며, 이에 의해 융해가 완료한 것으로 판단할 수 있다. 이 현상에 의거하여, 융해 온도 Tm이란, 일반적으로 흡광도가 흡광도 전체 상승분의 50%에 달했을 때의 온도로 정의된다.

본 발명에 있어서, Tm 값을 결정하기 위한 온도 변화에 수반하는 시그널 변동의 측정은, 상술한 바와 같은 원리로부터 260nm의 흡광도 측정에 의해 행할 수도 있지만, 본 발명의 프로브에 부가한 표지의 시그널에 의거한 시그널로서 DNA와 프로브와의 하이브리드 형성의 상태에 따라 변동하는 시그널을 측정하는 것이 바람직하다. 이 때문에, 본 발명의 프로브로서, 상술의 표지화 프로브를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 표지화 프로브로서는, 예를 들면 표적 서열에 하이브리다이즈 하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈 했을 때에 형광 강도가 감소(소광)하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 표적 서열에 하이브리다이즈 하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈 했을 때에 형광 강도가 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드 프로브를 들 수 있다. 전자와 같은 프로브라면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하고 있는 때에는 시그널을 나타내지 않거나, 시그널이 약하지만, 가열에 의해 프로브가 유리(遊離)하면 시그널을 나타내게 되거나, 시그널이 증가한다. 또한, 후자의 프로브라면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성함으로써 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이 표지에 의거한 시그널의 변화를 시그널 특유의 조건(흡광도 등)으로 검출함으로써, 상기 260nm의 흡광도 측정과 마찬가지로, 융해의 진행 및 Tm 값의 결정을 행할 수 있다. 표지화 프로브에 있어서의 표지화 물질은, 예를 들면 상술한 대로이나 형광 색소 표지화 프로브가 바람직하다.

핵산 증폭을 행할 때의 주형이 되는 핵산으로서는, 핵산을 함유하고 있으면 되고, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 혈액, 구강 점막 현탁액, 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식 세포, 젖, 복수액, 파라핀 포매(包埋) 조직, 위액, 위 세정액, 복막액, 양수, 세포 배양 등의 임의의 생물학적 기원에 유래하는 또는 유래할 수 있는 것이다. 주형이 되는 핵산은, 당해 기원으로부터 얻어진 채로 직접적으로, 또는 당해 샘플의 특성을 개변하기 위해 전 처리한 후에 사용할 수 있다.

이하, PCR을 사용하는 경우를 예로 하여 더 설명한다. PCR에 사용하는 프라이머 쌍은, 본 발명 프로브가 하이브리다이즈 할 수 있는 영역이 증폭되도록 하는 것 외에는, 통상의 PCR에 있어서의 프라이머 쌍의 설정 방법과 같이 하여 설정할 수 있다. 프라이머의 길이 및 Tm 값은, 통상으로는 12mer∼40mer에서 40∼70℃, 바람직하게는 16mer∼30mer에서 55∼60℃이다. 프라이머 쌍의 각 프라이머의 길이는 동일하지 않아도 되지만, 양 프라이머의 Tm은 거의 동일(통상으로는, 상위(相違)가 2℃ 이내)한 것이 바람직하다. 또한, Tm 값은 최근접 염기 쌍(Nearest Neighbor)법에 의해 산출한 값이다. 프라이머 쌍의 예로서는, 서열번호 3, 4에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 것을 들 수 있다.

PCR은, 본 발명에서 사용되는 본 발명 프로브의 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 이에 따라 증폭 반응 종료 후에 증폭 산물을 취급하는 조작을 행하지 않고 Tm 분석을 행할 수 있다. 사용하는 프로브에 따라, 프라이머의 Tm 값이 PCR의 반응 조건을 조정하는 것은 당업자라면 용이하다.

대표적인 PCR 반응액의 조성을 들면, 이하와 같다.

[표 1]

또한, 대표적인 온도 사이클을 들면, 이하와 같으며, 이 온도 사이클을 통상 25∼50회 반복한다.

(1) 변성, 90∼98℃, 1∼60초

(2) 어닐링, 50∼70℃, 10∼60초

(3) 신장, 60∼75℃, 10∼180초

어닐링 및 신장을 1스텝으로 행할 경우에는, 55∼70℃, 10∼180초의 조건을 들 수 있다.

Tm 분석은, 본 발명 프로브의 형광 색소의 형광을 측정하는 것 외에는 통상의 방법에 따라 행할 수 있다. 형광의 측정은, 형광 색소에 따른 파장의 여기 광(勵起光)을 사용하여 발광 파장의 광을 측정하는 것으로 행할 수 있다. Tm 분석에 있어서의 승온 속도는, 통상으로는 0.1∼1℃／초이다. Tm 분석을 행할 때의 반응액의 조성은, 프로브와 그 염기 서열에 상보적인 서열을 갖는 핵산과의 하이브리다이즈가 가능하면 특별히 제한되지 않지만, 통상으로는, 1가의 양이온 농도가 1.5∼5mM, pH가 7∼9이다. PCR 등의 DNA 폴리머라제를 사용하는 증폭 방법의 반응액은, 통상, 이 조건을 충족시키므로, 증폭 후의 반응액을 그대로 Tm 분석에 사용할 수 있다.

Tm 분석의 결과에 의거하는 VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형의 검출은 통상의 방법에 따라 행할 수 있다. 본 발명에 있어서의 검출이란, 변이의 유무의 검출을 포함한다.

또한, 본 발명의 프로브 및 방법에 의해, 변이의 유무의 검출이 가능하기 때문에, 변이의 유무에 의거하여 와파린의 적량을 판단하는 것도 본 발명에 포함된다. 구체적으로는, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기가 A가 되어 있을 경우에는 와파린에 대한 감수성이 높아, 필요 투여량이 감소하는 것이 시사된다. 또한, 본 발명의 방법에 의해, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형과 CYP2C9*3 변이 부위의 다형을 동시에 검출하는 것도 가능하며, CYP2C9*3의 변이가 있을 경우도 마찬가지로, 와파린에 대한 감수성이 높아, 필요 투여량이 감소하는 것이 시사된다.

또한, CYP2C9의 다형인 CYP2C9*3의 유전자 서열 및 그 변이 부위의 다형을 검출하는 것이 가능한 프로브의 염기 서열은, 예를 들면, WO2008／066163, WO2008／117782 등에 기재되어 있다. 구체적으로는, 3’ 말단이 형광 색소로 표지되어, 하이브리다이즈 했을 때에 형광 색소의 형광이 감소하는 핵산 프로브로서, WO2008／066163의 서열번호 28 또는 29(WO2008／117782의 서열번호 44 또는 45)의 염기 서열로 이루어지는 핵산 프로브이다.

본 발명의 VKORC1 유전자의 다형과 동시에 CYP2C9*3 변이 부위의 다형을 동시에 검출(즉, 동일한 계로 검출)을 행할 수 있는 프로브로서는, 상기 WO2008／066163 및 WO2008／117782에 기재된 핵산 프로브를 들 수 있다.

＜2＞ 본 발명 키트

본 발명 키트는, 본 발명의 검출 방법에 사용하기 위한 키트이다. 이 키트는, 형광 색소로 표지되어, 하이브리다이즈 했을 때에 형광 색소의 형광이 변화하는 핵산 프로브(바람직하게는, 소광 프로브)로서, 상기 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 핵산 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 키트는, 와파린의 적량을 판단하기 위해서도 사용할 수 있다.

프로브에 대해서는, 본 발명 프로브에 관하여, 상기에 설명한 바와 같다.

본 발명 검출 키트는, 프로브 외에, 본 발명의 검출 방법에 있어서의 핵산 증폭을 행하기 위해 필요로 되어지는 시약류, 특히 DNA 폴리머라제를 사용하는 증폭을 위한 프라이머를 더 포함하고 있어도 된다.

본 발명 검출 키트에 있어서 프로브, 프라이머 및 그 외의 시약류는, 별개로 수용되어 있어도 되고, 그들의 일부가 혼합물로 되어 있어도 된다.

이하에, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다.

[실시예]

실시예 1(싱글, 정제 게놈)

VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형의 부위를 포함하는 염기 서열(서열번호 1(야생형))에 의거하여, 다형의 부위를 증폭할 수 있도록 표 2에 나타내는 프라이머를 설계했다. 표 2 중, F 프라이머 및 R 프라이머의 위치는, 서열번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다. 프로브 1의 위치는, 서열번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다.

다음으로 표 2에 나타내는 말단부에 C를 갖는 프로브를 설계했다. 표 2 중, 프로브 1의 위치는, 서열번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다. 3’ 말단의 P는, 인산화되어 있음을 나타낸다. TAMRA에 의한 표지는, 통상의 방법에 따라 행했다.

[표 2]

융해 온도(Tm)는, http:／／www.m-neko.net／tm_calc／의 Nearest Neighbor method, primer conc. 250nM, Na+ conc. 50mM으로 계산했다.

샘플로서 전혈로부터 정제한 인간 게놈(100카피/반응액) (표 4의 인간 게놈 1 및 2)을 사용하고, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행했다. PCR 및 Tm 분석의 조건은 표 5와 같고, PCR 반응액 조성은 표 3과 같다.

Tm 분석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 520∼555nm 및 585∼700nm(TAMRA)였다.

[표 3]

50μL의 PCR 반응액에 있어서:

1×반응 버퍼

1.25U Taq 폴리머라제

1.5mmol/L MgCl₂

0.2mmol/L dNTP

0.5μmol/L VKORC1 F 프라이머 (표 2)

1μmol/L VKORC1 R 프라이머 (표 2)

0.2μmol/L VKORC1 프로브 1 (표 2)

[표 4]

여기에서, Ht는 헤테로 접합형, Wt는 야생형, Mt는 변이형을 나타낸다.

[표 5]

표 2의 프로브를 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행한 결과, 인간 게놈 1에 대해서는 TAMRA의 피크가 56℃ 및 64℃ 부근에 보이고, 인간 게놈 2에 대해서는 TAMRA의 피크가 64℃ 부근에 보였다(도 1).

실시예 2(싱글, 전혈 )

샘플로서 전혈을 사용하고, 그 외는 실시예 1과 같이 반응시켰다.

표 2의 프로브를 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행한 결과, 실시예 1과 같이, 인간 게놈 1에 대해서는 TAMRA의 피크가 56℃ 및 64℃ 부근에 보이고, 인간 게놈 2에 대해서는 TAMRA의 피크가 64℃ 부근에 보였다(도 2).

[비교예]

표 6의 PCR 반응액 조성을 사용하고, 그 외는 실시예 1과 마찬가지로 반응시켰다.

[표 6]

50μL의 PCR 반응액에 있어서:

1×반응 버퍼

1.25U Taq 폴리머라제

1.5mmol/L MgCl₂

0.2mmol/L dNTP

1μmol/L VKORC1 F 프라이머 (표 2)

0.5μmol/L VKORC1 R 프라이머 (표 2)

0.2μmol/L VKORC1 프로브 2 (표 7)

[표 7]

프로브 2의 위치는, 서열번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다.

표 7의 프로브를 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행한 결과, 인간 게놈 1 및 2에 대해서, TAMRA의 피크가 모두 59℃ 부근에 보여질 뿐이며, 헤테로와 호모를 분별할 수는 없었다(도 3). 따라서, 프로브의 5’ 또는 3’ 말단의 C가 형광 표지되어 있으면 어떤 프로브 서열이어도 된다는 것이 아니고, 서열번호 6의 프로브와 같이, 80번째의 C가 형광 표지되어 있는 것이 중요함이 이해된다.

실시예 1,2 및 비교예의 결과로부터, 서열번호 6의 프로브를 사용했을 때, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형에 대해서, Tm 분석으로 해석이 가능한 형광 강도의 변화가 인정되었다. 즉, 이 변이에 대해서 헤테로 접합체인 인간 게놈 1은 56℃ 및 64℃ 부근에 2개의 피크를 갖고, 변이형인 인간 게놈 2는 64℃ 부근에 1개만 피크를 갖는 것이며, 고유한 형광 강도의 변화량의 패턴의 변화가 존재한다. 또한, 이들 결과로부터, 이 변이에 대해서 야생형인 인간 게놈에서 반응시킨 경우에는, 56℃ 부근에 1개만 피크를 갖는 것을 알 수 있다.

따라서, 서열번호 6의 프로브를 사용함으로써, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형을 검출할 수 있다.

실시예 3(멀티, 정제 게놈)

표 8의 PCR 반응액 조성을 사용하고, 그 외는 실시예 1과 마찬가지로 반응시켰다.

Tm 분석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 420∼485nm 및 520∼555nm(BODIPY FL), 또는, 각각 520∼555nm 및 585∼700nm(TAMRA)였다.

[표 8]

50μL의 PCR 반응액에 있어서:

1×반응 버퍼

1.25U Taq 폴리머라제

1.5mmol/L MgCl₂

0.2mmol/L dNTP

14% (v/v) 글리세롤

0.5μmol/L VKORC1 F 프라이머 (표2)

1μmol/L VKORC1 R 프라이머 (표 2)

0.4μmol/L VKORC1 프로브 1 (표 2)

2μmol/L CYP2C9*3 F 프라이머 (표 9)

1μmol/L CYP2C9*3 R 프라이머 (표 9)

0.2μmol/L CYP2C9*3 프로브 1 (표 9)

[표 9]

CYP2C9*3 프라이머 및 프로브로서 하기를 사용했다.

또한, 상기 CYP2C9*3 프로브 1은, WO2008／066163의 서열번호 29, WO2008／117782의 서열번호 45에 기재된 염기 서열로 이루어진다.

TAMRA의 형광에 의해 평가를 행한 결과, 인간 게놈 1에 대해서는 TAMRA의 피크가 52℃ 및 60℃ 부근에 보이고, 인간 게놈 2에 대해서는 TAMRA의 피크가 60℃ 부근에 보였다(도 4). 또한, BODIPY FL의 형광에 의해 평가를 행한 결과, 인간 게놈 1에 대해서는 BODIPY FL의 피크가 49℃ 부근에 보이고, 인간 게놈 2에 대해서는 BODIPY FL의 피크가 49℃ 및 56℃ 부근에 보였다(도 5).

실시예 4(멀티, 전혈 )

샘플로서 전혈을 사용하고, 그 외는 실시예 3과 같이 반응시켰다. 또한, 전혈은 하기의 전 처리를 행한 것을 사용했다.

전혈 10μl을 하기 희석액 (1) 70μl에 첨가하여 잘 혼합한 후, 이 혼합액 10μl을 하기 희석액 (2) 70μl에 첨가했다. 이 혼합액 17μl을 95℃ 10분으로 가열하여 4μl의 전 처리제 전혈을 얻어, 이를 샘플로서 사용했다.

희석액 (1)

10mM Tris-HCl (pH 8.0)

0.1mM EDTA (pH 8.0)

0.3% (v/v) SDS

희석액 (2)

10mM Tris-HCl (pH 8.0)

0.1mM EDTA (pH 8.0)

TAMRA의 형광에 의해 평가를 행한 결과, 실시예 3과 마찬가지로, 인간 게놈 1에 대해서는 TAMRA의 피크가 51℃ 및 60℃ 부근에 보이고, 인간 게놈 2에 대해서는 TAMRA의 피크가 60℃ 부근에 보였다(도 6). 또한, BODIPY FL의 형광에 의해 평가를 행한 결과, 인간 게놈 1에 대해서는 BODIPY FL의 피크가 49℃ 부근에 보이고, 인간 게놈 2에 대해서는 BODIPY FL의 피크가 49℃ 및 56℃ 부근에 보였다(도 7).

실시예 3, 4의 결과로부터, 서열번호 6의 프로브를 사용했을 때, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형에 대해서, Tm 분석으로 해석이 가능한 형광 강도의 변화가 인정되었다. 즉, 이 변이에 대해서 헤테로 접합체인 인간 게놈 1은 52℃ 및 60℃ 부근에 2개의 피크를 갖고, 변이형인 인간 게놈 2는 60℃ 부근에 1개만 피크를 갖는 것이며, 고유한 형광 강도의 변화량의 패턴의 변화가 존재한다. 또한, 이들 결과로부터, 이 변이에 대해서 야생형인 인간 게놈으로 반응시킨 경우에는, 52℃ 부근에 1개만 피크를 갖는 것을 알 수 있다.

또한, CYP2C9*3 변이 부위의 다형에 대해서도, Tm 분석으로 해석이 가능한 형광 강도의 변화가 인정되었다. 즉, 이 변이에 대해서 야생형인 인간 게놈 1은 49℃ 부근에 1개만 피크를 갖고, 헤테로 접합형인 인간 게놈 2는 49℃ 및 56℃ 부근에 2개의 피크를 갖는 것이며, 고유한 형광 강도의 변화량의 패턴의 변화가 존재한다. 또한, 이들 결과로부터, 이 변이에 대해서 변이형인 인간 게놈으로 반응시킨 경우에는, 56℃ 부근에 1개만 피크를 갖는 것을 알 수 있다.

따라서, 서열번호 6, 10의 프로브를 동시에 사용함으로써, VKORC1 유전자의 -1639번째의 염기의 다형 및 CYP2C9*3 변이 부위의 다형을 동시에 검출할 수 있다.

[서열표]

SEQUENCE LISTING <110> Arkray, Inc. <120> METHOD FOR DETECTING POLYMORPHISM AT NUCLEOTIDE POSITION -1639 OF VKORC1 GENE, AND NUCLEIC ACID PROBE AND KIT THEREFOR <130> P-110590 <150> JP2010-126306 <151> 2010-06-01 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aagagagttc ccagaagggt aggtgcaaca gtaagggatc cctctgggaa gtcaagcaag 60 agaagacctg aaaaacaacc attggccggg tgcggtggct cacgcctata atcctagcat 120 tttgggaggc cgaggtgggt ggatcacttg aggtcaggag tttaagacaa gcctggccaa 180 <210> 2 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aagagagttc ccagaagggt aggtgcaaca gtaagggatc cctctgggaa gtcaagcaag 60 agaagacctg aaaaacaacc attggccagg tgcggtggct cacgcctata atcctagcat 120 tttgggaggc cgaggtgggt ggatcacttg aggtcaggag tttaagacaa gcctggccaa 180 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggaagtcaag caagagaaga cctg 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aatgctagga ttataggcgt gag 23 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 5 cattggccrg gtgcggt 17 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 cattggccag gtgcggt 17 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 7 cacctggcca atggtt 16 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cggagcccct gcatgcaa 18 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aatgatacta tgaatttggg gacttcgaa 29 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 10 ggagaaggtc aaggtatc 18

Claims

VKORC1 유전자의 -1639번째의 다형(多型)을 검출하기 위한 프로브로서, 서열번호 1 또는 2에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기번호 80∼89를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열이며, 서열번호 1 또는 2에 있어서의 80번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신인 이외는 서열번호 1 또는 2에 상동성을 갖고, 염기번호 80에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호 80에 대응하는 염기를 3’말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖는, 다형 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호 80에 대응하는 염기를 3’말단에 갖는, 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈 하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈 했을 때에 형광 강도가 감소하거나 또는 증가하는, 다형 검출용 프로브.
제4항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈 하지 않을 때에 형광을 발하고, 표적 서열에 하이브리다이즈 했을 때에 형광 강도가 감소하는, 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가 10∼40인, 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가 15∼30인, 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가 15∼25인, 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 프로브가 융해 곡선 분석용의 프로브인, 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드가 서열번호 6으로 표시되는, 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브를 사용하는 VKORC1 유전자 근방 영역의 다형 검출 방법.
제11항에 있어서,
(Ⅰ) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈 시켜 하이브리드 형성체를 얻는 것,
(Ⅱ) 상기 하이브리드 형성체를 함유하는 시료의 온도를 변화시킴으로써, 상기 하이브리드 형성체를 해리시켜, 상기 하이브리드 형성체의 해리에 의거한 형광 시그널의 변동을 측정하는 것,
(Ⅲ) 상기 시그널의 변동에 의거하여 하이브리드 형성체의 해리 온도인 Tm 값을 결정하는 것, 및
(Ⅳ) 상기 Tm 값에 의거하여 VKORC1 유전자에 있어서의 다형의 존재 또는 다형을 갖는 핵산의 존재비를 결정하는 것을 포함하는, 다형 검출 방법.
제12항에 있어서,
상기 공정 (Ⅰ)의 전, 또는 공정 (Ⅰ)과 동시에 핵산을 증폭하는 것을 더 포함하는, 다형 검출 방법.
와파린의 적량을 판단하는 방법으로서, 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출 방법에 의해, VKORC1 유전자 근방 영역에 있어서의 다형을 검출하는 것, 및 검출된 다형의 유무에 의거하여 와파린의 적량을 판단하는 것을 포함하는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브를 포함하는, 다형 검출용 키트.
제15항에 있어서,
서열번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈 하는 서열을 포함하는 영역을 주형으로 하여 증폭 가능한 프라이머를 더 포함하는, 다형 검출용 키트.
제16항에 있어서,
상기 프라이머가 서열번호 3과 4에 기재된 프라이머인, 다형 검출용 키트.
제16항 또는 제17항에 있어서,
서열번호 8, 9에 기재된 프라이머 및 서열번호 10에 기재된 프로브를 더 포함하는, 다형 검출용 키트.