JP6490990B2 - Ｃｙｐ２ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット、ｃｙｐ２ｃ１９遺伝子増幅用キット、遺伝子増幅方法、多型解析方法、及び薬効判定方法 - Google Patents
Ｃｙｐ２ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット、ｃｙｐ２ｃ１９遺伝子増幅用キット、遺伝子増幅方法、多型解析方法、及び薬効判定方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用キット、遺伝子増幅方法、多型解析方法、及び薬効判定方法に関する。
シトクロムＰ４５０は、スーパーファミリーに分類される酵素群であって、多くのサブファミリー（ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ１Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ、ＣＹＰ２Ｅ、ＣＹＰ３Ａ等）が存在する。その中でも、ヒトＣＹＰ２ＣサブファミリーのアイソザイムであるＣＹＰ２Ｃ１９は、薬剤代謝に関与する代表的な酵素の１つである。
ＣＹＰ２Ｃ１９には、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７等の遺伝子多型が存在することが知られている。ＣＹＰ２Ｃ１９＊２は、エキソン５の６８１番目の塩基であるグアニンがアデニンとなる変異であり、スプライシング異常の原因となり、遺伝情報の翻訳開始部位が変化する。ＣＹＰ２Ｃ１９＊３は、エキソン４の６３６番目の塩基であるグアニンがアデニンとなる変異であり、終始コドンへの変化により翻訳が変異部位で中断される。ＣＹＰ２Ｃ１９＊２及びＣＹＰ２Ｃ１９＊３の遺伝子多型では、いずれもＣＹＰ２Ｃ１９の酵素活性が失活又は低下する。ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７は、プロモーター領域の−８０６番目の塩基であるシトシンがチミンとなる変異であり、ＣＹＰ２Ｃ１９の発現及び酵素活性が上昇する。
これらの遺伝子多型は、いずれも薬剤の血中動態及び薬効に影響を与える。このため、ＣＹＰ２Ｃ１９の遺伝子多型を解析することは、薬剤による副作用を予測し、より良い効果を示す薬剤の投与条件を決定するために、極めて重要である。
これらの遺伝子多型は、いずれも薬剤の血中動態及び薬効に影響を与える。このため、ＣＹＰ２Ｃ１９の遺伝子多型を解析することは、薬剤による副作用を予測し、より良い効果を示す薬剤の投与条件を決定するために、極めて重要である。
他方、あらゆる疾患の原因や、個体の疾患易罹患性（疾患のかかり易さ）、個体間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、点突然変異、いわゆる一塩基多型（ＳＮＰ）の検出が広く行われている。点突然変異の一般的な検出方法としては、（１）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域をＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）により増幅させ、その全遺伝子配列を解析するダイレクトシークエンス法、（２）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域をＰＣＲにより増幅させ、検出対象配列における目的の変異の有無により切断作用が異なる制限酵素によってその増幅産物を切断し、電気泳動することでタイピングを行うＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphisms）解析、（３）３’末端領域に目的の変異が位置するプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅の有無によって変異を判断するＡＳＰ−ＰＣＲ（Allele Specific Primer PCR）法等が挙げられる。
しかし、これらの方法は、例えば、試料から抽出したＤＮＡの精製、電気泳動、制限酵素処理等が必須であるため、手間やコストがかかってしまう。また、ＰＣＲを行った後、反応容器を一旦開封する必要があるため、増幅産物が次の反応系に混入し、解析精度が低下する虞がある。さらに、自動化が困難であるため、大量のサンプルを解析することができない。また、上記（３）のＡＳＰ−ＰＣＲ法については、特異性が低いという問題もある。
このような問題から、近年、点突然変異の検出方法として、標的核酸とプローブとから形成される二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ：melting temperature）を解析する方法が実用化されている。このような方法は、例えば、Ｔｍ解析又は融解曲線解析と呼ばれている。これは、以下のような方法である。すなわち、まず、検出目的の点突然変異を含む検出対象配列に相補的なプローブを用いて、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡとプローブとのハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成させる。続いて、このハイブリッド形成体に加熱処理を施し、温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を、吸光度等のシグナルの変動によって検出する。そして、この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することにより、点突然変異の有無を判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、点突然変異を含む検出対象配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について予めＴｍ値（評価基準値）を求めておき、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡとプローブとのＴｍ値（測定値）を測定し、得られた測定値が評価基準値と同じであればマッチ、すなわち標的ＤＮＡに点突然変異が存在すると判断できる。一方、測定値が評価基準値より低ければミスマッチ、すなわち標的ＤＮＡに点突然変異が存在しないと判断できる。そして、この方法によれば、自動化も可能である。
しかし、このようなＴｍ解析を利用した検出方法についても、ＰＣＲにおいて、検出目的部位を含む領域を特異的且つ効率的に増幅できなければならないという問題がある。特に、シトクロムＰ４５０は、前述のように、スーパーファミリーに分類される酵素群であって、同じサブファミリー（ＣＹＰ２Ｃサブファミリー）に属する分子種には、非常に相同性の高いアイソザイムが存在し、それらをコードする配列も極めて類似している。このため、ＰＣＲにおいて、ＣＹＰ２Ｃ１９以外のアイソザイムのコード遺伝子までもが増幅される虞がある。また、このように他のアイソザイムのコード遺伝子までも増幅された場合、例えば、ＣＹＰ２Ｃ１９の遺伝子多型の解析において、解析結果の信頼性を低下させる原因にもなる。
このような背景の下、本件出願人は、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２及びＣＹＰ２Ｃ１９＊３の遺伝子多型部位を含む領域を特異的且つ効率的に増幅するためのプライマーセットを提案している（例えば、特許文献１参照）。特許文献１記載のプライマーセットを用いることにより、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２及びＣＹＰ２Ｃ１９＊３の遺伝子多型部位を含む各領域を同一反応液において同時に且つ特異的に増幅することができる。
ところで、日本人を含むアジア人に存在するＣＹＰ２Ｃ１９の遺伝子多型は、大部分がＣＹＰ２Ｃ１９＊２及びＣＹＰ２Ｃ１９＊３であり、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の頻度は低い。一方、人種によっては、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の頻度が高いことが知られている。例えば、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の頻度は、スウェーデン人及びエチオピア人では１８％、ドイツ人では２５％、ポーランド人では２７％という報告がある。
近年、日本においても人種の多様化が進んでいるため、多様な人種に対応できるように、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域を同一反応液において同時に且つ特異的に増幅することが望まれる。
近年、日本においても人種の多様化が進んでいるため、多様な人種に対応できるように、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域を同一反応液において同時に且つ特異的に増幅することが望まれる。
しかし、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域を同一反応液において同時に且つ特異的に増幅するには、各領域の増幅を阻害せず、且つ、同一の温度条件にて増幅できるプライマーセットを探索する必要がある。また、その増幅産物は、プローブを用いて安定的に遺伝子型の検出ができるものでなければならない。このため、そのようなプライマーセットは、これまで提案されていないのが現状であった。
そこで、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域を特異的且つ効率的に増幅するためのＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット、及びこれを含むＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用キットを提供することを課題とする。また、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセットを用いた遺伝子増幅方法、多型解析方法、及び薬効判定方法を提供することを課題とする。
上記課題を解決するための手段は以下のとおりである。
［１］ 下記プライマーセット（１）及び（２）と、下記プライマーセット（３ａ）、（３ｂ）、及び（３ｃ）から選ばれる１種のプライマーセット（３）とを含み、核酸増幅法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅するためのＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット：
プライマーセット（１）
配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（２）
配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（３ａ）
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（３ｂ）
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（３ｃ）
配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット。
［２］ 上記プライマーセット（１）、（２）、及び（３ｂ）を含む、上記［１］に記載のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット。
［３］ 生体試料中のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を増幅するためのプライマーセットである、上記［１］又は［２］に記載のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット。
［４］ 上記生体試料が全血である、上記［３］に記載のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット。
［５］ 試料中の核酸を鋳型として、上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、一反応液中でＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅する増幅工程を含む遺伝子増幅方法。
［６］ 上記プライマーセット（１）の合計モル量と上記プライマーセット（２）の合計モル量との比が１：１〜１：３であり、上記プライマーセット（１）の合計モル量と上記プライマーセット（３）の合計モル量との比が１：１．５〜１：４である、上記［５］に記載の遺伝子増幅方法。
［７］ 上記［５］又は［６］に記載の遺伝子増幅方法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅する増幅工程と、
上記増幅工程で得られた増幅産物の一本鎖増幅核酸と、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域にハイブリダイズ可能な各プローブとのハイブリッドを形成するハイブリッド形成工程と、
上記ハイブリッドを含む反応液の温度を変化させ、上記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定するシグナル測定工程と、
上記シグナルの変動に基づいてＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析する解析工程と、を含む多型解析方法。
［８］ 上記増幅工程と上記ハイブリッド形成工程とが同時に進行する、上記［７］に記載の多型解析方法。
［９］ 上記プローブが蛍光標識化プローブである、上記［７］又は［８］に記載の多型解析方法。
［１０］ 上記［７］〜［９］のいずれか１項に記載の多型解析方法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析する解析工程と、
上記解析工程における解析結果に基づいて薬剤の薬効を判定する判定工程と、を含む薬効判定方法。
［１１］ 上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセットを含み、核酸増幅法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅するためのＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用キット。
［１２］ ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域にハイブリダイズ可能な各プローブをさらに含む、上記［１１］に記載のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用キット。
［１３］ 上記プローブが蛍光標識化プローブである、上記［１１］又は［１２］に記載のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用キット。
［１］ 下記プライマーセット（１）及び（２）と、下記プライマーセット（３ａ）、（３ｂ）、及び（３ｃ）から選ばれる１種のプライマーセット（３）とを含み、核酸増幅法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅するためのＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット：
プライマーセット（１）
配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（２）
配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（３ａ）
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（３ｂ）
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（３ｃ）
配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット。
［２］ 上記プライマーセット（１）、（２）、及び（３ｂ）を含む、上記［１］に記載のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット。
［３］ 生体試料中のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を増幅するためのプライマーセットである、上記［１］又は［２］に記載のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット。
［４］ 上記生体試料が全血である、上記［３］に記載のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット。
［５］ 試料中の核酸を鋳型として、上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、一反応液中でＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅する増幅工程を含む遺伝子増幅方法。
［６］ 上記プライマーセット（１）の合計モル量と上記プライマーセット（２）の合計モル量との比が１：１〜１：３であり、上記プライマーセット（１）の合計モル量と上記プライマーセット（３）の合計モル量との比が１：１．５〜１：４である、上記［５］に記載の遺伝子増幅方法。
［７］ 上記［５］又は［６］に記載の遺伝子増幅方法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅する増幅工程と、
上記増幅工程で得られた増幅産物の一本鎖増幅核酸と、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域にハイブリダイズ可能な各プローブとのハイブリッドを形成するハイブリッド形成工程と、
上記ハイブリッドを含む反応液の温度を変化させ、上記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定するシグナル測定工程と、
上記シグナルの変動に基づいてＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析する解析工程と、を含む多型解析方法。
［８］ 上記増幅工程と上記ハイブリッド形成工程とが同時に進行する、上記［７］に記載の多型解析方法。
［９］ 上記プローブが蛍光標識化プローブである、上記［７］又は［８］に記載の多型解析方法。
［１０］ 上記［７］〜［９］のいずれか１項に記載の多型解析方法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析する解析工程と、
上記解析工程における解析結果に基づいて薬剤の薬効を判定する判定工程と、を含む薬効判定方法。
［１１］ 上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセットを含み、核酸増幅法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅するためのＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用キット。
［１２］ ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域にハイブリダイズ可能な各プローブをさらに含む、上記［１１］に記載のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用キット。
［１３］ 上記プローブが蛍光標識化プローブである、上記［１１］又は［１２］に記載のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用キット。
本発明によれば、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域を特異的且つ効率的に増幅するためのＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット、及びこれを含むＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用キットを提供することができる。また、本発明によれば、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセットを用いた遺伝子増幅方法、多型解析方法、及び薬効判定方法を提供することができる。
以下、本発明を実施するための形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本明細書において組成物中のある成分の量について言及する場合、組成物中に当該成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に別途定義しない限り、当該量は、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
また、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（融解温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が吸光度全上昇分の５０％に達した時点の温度と定義される。二本鎖核酸、例えば二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度が加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって解離が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。
また、本明細書において組成物中のある成分の量について言及する場合、組成物中に当該成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に別途定義しない限り、当該量は、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
また、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（融解温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が吸光度全上昇分の５０％に達した時点の温度と定義される。二本鎖核酸、例えば二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度が加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって解離が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。
＜ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット＞
本発明のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット（以下、単に「本発明のプライマーセット」という。）は、下記プライマーセット（１）及び（２）と、下記プライマーセット（３ａ）、（３ｂ）、及び（３ｃ）から選ばれる１種のプライマーセット（３）とを含むものであり、核酸増幅法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅するために用いられる。
プライマーセット（１）
配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット。
プライマーセット（２）
配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット。
プライマーセット（３ａ）
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット。
プライマーセット（３ｂ）
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット。
プライマーセット（３ｃ）
配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット。
本発明のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット（以下、単に「本発明のプライマーセット」という。）は、下記プライマーセット（１）及び（２）と、下記プライマーセット（３ａ）、（３ｂ）、及び（３ｃ）から選ばれる１種のプライマーセット（３）とを含むものであり、核酸増幅法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅するために用いられる。
プライマーセット（１）
配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット。
プライマーセット（２）
配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット。
プライマーセット（３ａ）
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット。
プライマーセット（３ｂ）
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット。
プライマーセット（３ｃ）
配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット。
詳しくは後述するが、上記プライマーセット（１）及び（２）は、それぞれＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３の遺伝子多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーセットである。また、上記プライマーセット（３ａ）、（３ｂ）、及び（３ｃ）は、いずれもＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーセットである。
このような本発明のプライマーセットによれば、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域を同一反応液において同時に且つ特異的に増幅することができる。このため、従来法と比較して手間やコストを低減することが可能となる。また、このように同一反応液において３つの目的領域が特異的に増幅されるため、例えば、それぞれの目的領域における検出対象配列に相補的なプローブを使用することで、上記反応液を用いてそのままＴｍ解析を行い、上記３種類の多型をタイピングすることが可能となる。
このような本発明のプライマーセットによれば、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域を同一反応液において同時に且つ特異的に増幅することができる。このため、従来法と比較して手間やコストを低減することが可能となる。また、このように同一反応液において３つの目的領域が特異的に増幅されるため、例えば、それぞれの目的領域における検出対象配列に相補的なプローブを使用することで、上記反応液を用いてそのままＴｍ解析を行い、上記３種類の多型をタイピングすることが可能となる。
上記プライマーセット（１）は、前述のように、配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、を含む一対のプライマーセットである。
ここで、ヒト染色体１０におけるＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子のエキソン４及びエキソン５を含むゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。配列番号１において、１〜１６１番目の領域がエキソン４、１３２３〜１４４９番目の領域がエキソン５を示し、その間はイントロンを示す。
配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号１の１３０２〜１３４１番目の領域と同じ配列であり、１３４１番目のアデニンを３’末端とするオリゴヌクレオチドである。また、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号１の１４４２〜１４６４番目の領域に相補的な配列であり、１４４２番目のグアニンに相補的なシトシンを３’末端とするオリゴヌクレオチドである。すなわち、上記プライマーセット（１）は、配列番号１における１３０２〜１４６４番目の領域及びその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。
配列番号１における１３６１番目の塩基はエキソン５の６８１番目の塩基に対応する。エキソン５の６８１番目の塩基には、ＣＹＰ２Ｃ１９の機能に影響を与える点突然変異（６８１Ｇ、６８１Ａ）の存在が知られており、この多型が前述のＣＹＰ２Ｃ１９＊２である。この部位の多型は、ホモ接合体の場合には６８１Ｇ／Ｇ又は６８１Ａ／Ａ、ヘテロ接合体の場合には６８１Ｇ／Ａで表すことができる。
上記プライマーセット（２）は、前述のように、配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、を含む一対のプライマーセットである。
配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号１の１０９〜１４３番目の領域と同じ配列であり、１４３番目のアデニンを３’末端とするオリゴヌクレオチドである。また、配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号１の２３１〜２６０番目の領域に相補的な配列であり、２３１番目のチミンに相補的なアデニンを３’末端とするオリゴヌクレオチドである。すなわち、上記プライマーセット（２）は、配列番号１における１０９〜２６０番目の領域及びその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。
配列番号１における１５５番目の塩基はエキソン４の６３６番目の塩基に対応する。エキソン４の６３６番目の塩基には、ＣＹＰ２Ｃ１９の機能に影響を与える点突然変異（６３６Ｇ、６３６Ａ）の存在が知られており、この多型が前述のＣＹＰ２Ｃ１９＊３である。この部位の多型は、ホモ接合体の場合には６３６Ｇ／Ｇ又は６３６Ａ／Ａ、ヘテロ接合体の場合には６３６Ｇ／Ａで表すことができる。
上記プライマーセット（３ａ）は、前述のように、配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、を含む一対のプライマーセットである。
ここで、ヒト染色体１０におけるＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子のコーディング領域の５’上流の塩基配列を配列番号２に示す。
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端側から２１番目の塩基がチミンであるオリゴヌクレオチドは、配列番号２の４１１３〜４１４１番目の領域と同じ配列であり、４１４１番目のシトシンを３’末端とするオリゴヌクレオチドである。また、配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号２の４２３２〜４２５７番目の領域に相補的な配列であり、４２３２番目のチミンに相補的なアデニンを３’末端とするオリゴヌクレオチドである。すなわち、上記プライマーセット（３ａ）は、配列番号２における４１１３〜４２５７番目の領域及びその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。
なお、配列番号７の５’末端側から２１番目の塩基は配列番号２の４１３３番目の塩基に対応し、世界人口の約０．０９％は当該塩基がアデニンに変異していると推定されている。
なお、配列番号７の５’末端側から２１番目の塩基は配列番号２の４１３３番目の塩基に対応し、世界人口の約０．０９％は当該塩基がアデニンに変異していると推定されている。
上記プライマーセット（３ｂ）は、前述のように、配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、を含む一対のプライマーセットである。
配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号２の４２１９〜４２３９番目の領域に相補的な配列であり、４２１９番目のグアニンに相補的なシトシンを３’末端とするオリゴヌクレオチドである。すなわち、上記プライマーセット（３ｂ）は、配列番号２における４１１３〜４２３９番目の領域及びその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。
上記プライマーセット（３ｃ）は、前述のように、配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、を含む一対のプライマーセットである。
配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号２の４０５８〜４０８７番目の領域と同じ配列であり、４０８７番目のチミンを３’末端とするオリゴヌクレオチドである。すなわち、上記プライマーセット（３ｃ）は、配列番号２における４０５８〜４２５７番目の領域及びその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。
配列番号２における４１９５番目の塩基（３’末端側から８０６番目の塩基）はコーディング領域の５’上流の−８０６番目の塩基に対応する。この−８０６番目の塩基には、ＣＹＰ２Ｃ１９の機能に影響を与える点突然変異（−８０６Ｃ、−８０６Ｔ）の存在が知られており、この多型が前述のＣＹＰ２Ｃ１９＊１７である。この部位の多型は、ホモ接合体の場合には−８０６Ｃ／Ｃ又は−８０６Ｔ／Ｔ、ヘテロ接合体の場合には−８０６Ｃ／Ｔで表すことができる。
本発明のプライマーセットは、上記プライマーセット（３）として上記プライマーセット（３ａ）、（３ｂ）、及び（３ｃ）のいずれを含んでいてもよいが、ＰＣＲにより増幅する際の増幅効率、反応温度の変動に対する許容性等の観点から、上記プライマーセット（３ｂ）を含むことが好ましい。
なお、本発明のプライマーセットに含まれる少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドは、それぞれの塩基配列に対して１個〜３個の塩基が伸長、短縮、挿入、欠失、又は置換された塩基配列からなる改変オリゴヌクレオチドであってもよい。すなわち、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドが改変オリゴヌクレオチドであるプライマーセットも、本発明のプライマーセットに包含される。なお、本発明のプライマーセットに含まれる少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドが改変オリゴヌクレオチドであっても、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域を同一反応液において同時に且つ特異的に増幅することができる。
本発明のプライマーセットは、全血試料等の生体試料におけるＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅する際に使用することが好ましい。
＜遺伝子増幅方法＞
本発明の遺伝子増幅方法は、試料中の核酸を鋳型として、本発明のプライマーセットを用いて、反応液中でＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅する増幅工程を含むものである。本発明の遺伝子増幅方法によれば、試料中の核酸を鋳型として、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域を同一反応液において同時に且つ特異的に増幅することができる。
本発明の遺伝子増幅方法は、試料中の核酸を鋳型として、本発明のプライマーセットを用いて、反応液中でＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅する増幅工程を含むものである。本発明の遺伝子増幅方法によれば、試料中の核酸を鋳型として、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域を同一反応液において同時に且つ特異的に増幅することができる。
鋳型核酸を含む試料としては、例えば生体試料が挙げられる。生体試料としては、全血、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪、毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液、あるいはそれらの懸濁液等が挙げられる。また、生体試料から単離した核酸を鋳型として用いてもよい。例えば、全血からのゲノムＤＮＡの単離には、市販のゲノムＤＮＡ単離キットを使用することができる。また、生体試料に含まれるＤＮＡを遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物を鋳型として用いてもよい。あるいは、生体試料に含まれるＲＮＡから逆転写ＰＣＲ反応によりｃＤＮＡを生成し、このｃＤＮＡを遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物を鋳型として用いてもよい。
増幅工程における核酸増幅法は、特に制限されない。核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等が挙げられ、中でもＰＣＲ法が好ましい。
増幅工程において、上記反応液における試料の添加割合は特に制限されない。具体例として、上記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、添加割合の下限は、０．０１体積％以上であることが好ましく、０．０５体積％以上であることがより好ましく、０．１体積％以上であることがさらに好ましい。また、上記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、添加割合の上限は、２体積％以下であることが好ましく、１体積％以下であることがより好ましく、０．５体積％以下であることがさらに好ましい。
また、後述する多型解析方法において、例えば標識化プローブを用いた光学的検出を行う場合、上記反応液における生体試料の添加割合は、例えば、０．１体積％〜０．５体積％に設定することが好ましい。この範囲であれば、例えば、変性による沈殿物等の発生による影響を十分に防止でき、光学的手法による測定精度を向上できる。また、生体試料中の夾雑物によるＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上できることも期待される。
また、増幅反応の開始前に、上記反応液にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、沈殿物又は濁りの発生による影響をより一層低減でき、且つ、増幅効率もさらに向上する。
上記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１質量％〜２質量％であり、好ましくは０．１質量％〜１質量％であり、より好ましくは０．２質量％〜０．８質量％である。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等が挙げられ、特に制限されない。これらのアルブミンはいずれか１種類を使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
上記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１質量％〜２質量％であり、好ましくは０．１質量％〜１質量％であり、より好ましくは０．２質量％〜０．８質量％である。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等が挙げられ、特に制限されない。これらのアルブミンはいずれか１種類を使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
以下、増幅工程における増幅についてＰＣＲ法を例に挙げて説明するが、本発明は、この例に制限されない。
まず、鋳型核酸と本発明のプライマーセットとを含むＰＣＲ反応液を調製する。
ＰＣＲ反応液における各種プライマーの添加割合は、特に制限されない。例えば、上記プライマーセット（１）におけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの合計の添加割合は、１．０ｍｏｌ／Ｌ〜２．０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、１．４μｍｏｌ／Ｌ〜１．６μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
また、上記プライマーセット（２）におけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの合計の添加割合は、２．５μｍｏｌ／Ｌ〜３．５μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、２．８μｍｏｌ／Ｌ〜３．２μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
また、上記プライマーセット（３）におけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの合計の添加割合は、３．０μｍｏｌ／Ｌ〜５．０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、３．８μｍｏｌ／Ｌ〜４．２μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
ＰＣＲ反応液における各種プライマーの添加割合は、特に制限されない。例えば、上記プライマーセット（１）におけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの合計の添加割合は、１．０ｍｏｌ／Ｌ〜２．０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、１．４μｍｏｌ／Ｌ〜１．６μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
また、上記プライマーセット（２）におけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの合計の添加割合は、２．５μｍｏｌ／Ｌ〜３．５μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、２．８μｍｏｌ／Ｌ〜３．２μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
また、上記プライマーセット（３）におけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの合計の添加割合は、３．０μｍｏｌ／Ｌ〜５．０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、３．８μｍｏｌ／Ｌ〜４．２μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
ＰＣＲ反応液における上記プライマーセット（１）、（２）、及び（３）の含有比率は特に限定されない。増幅効率の観点から、上記プライマーセット（１）の合計モル量と上記プライマーセット（２）の合計モル量との比は、１：１〜１：３であることが好ましく、１：１．５〜１：２．５であることがより好ましい。また、上記プライマーセット（１）の合計モル量と上記プライマーセット（３）の合計モル量との比は、１：１．５〜１：４であることが好ましく、１：２〜１：３であることがより好ましい。
また、上記プライマーセット（１）、（２）、及び（３）のそれぞれにおけるフォワードプライマー（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）とのモル比は特に制限されない。例えば、Ｆ：Ｒ＝１：０．２５〜１：４が好ましい。
ＰＣＲ反応液における他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も特に制限されない。他の組成成分としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等のヌクレオチド、溶媒等が挙げられる。ＰＣＲ反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。
ＤＮＡポリメラーゼとしては特に制限されない。例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４８８９８１８号明細書及び米国特許第５０７９３５２号明細書を参照）（Ｔａｑポリメラーゼ（商品名））、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９１／０９９５０号を参照）（rTth DNA polymerase）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９２／９６８９号を参照）（Pfu DNA polymerase；Strategene社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（欧州特許第０４５５４３０号明細書を参照）（Ｖｅｎｔ（商標）；New England Biolabs社製）等が商業的に入手可能である。中でも、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
ＰＣＲ反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
ＰＣＲ反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ等）が挙げられる。ＰＣＲ反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
溶媒としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ（2-morpholinoethanesulfonic acid）、ＭＯＰＳ（3-morpholinopropanesulfonic acid）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）等の緩衝液が挙げられ、市販のＰＣＲ用緩衝液やＰＣＲキットに付属の緩衝液等をそのまま使用すればよい。
また、ＰＣＲ反応液には、グリセロール、ヘパリン、ベタイン、ＮａＮ３、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等が含まれていてもよい。
溶媒としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ（2-morpholinoethanesulfonic acid）、ＭＯＰＳ（3-morpholinopropanesulfonic acid）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）等の緩衝液が挙げられ、市販のＰＣＲ用緩衝液やＰＣＲキットに付属の緩衝液等をそのまま使用すればよい。
また、ＰＣＲ反応液には、グリセロール、ヘパリン、ベタイン、ＮａＮ３、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等が含まれていてもよい。
ＰＣＲは、通常、（ｉ）二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（解離工程）、（ｉｉ）プライマーの鋳型核酸へのアニーリング（アニーリング工程）、（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーからの核酸配列の伸長（伸長工程）の３工程を含む。各工程の条件は特に制限されない。解離工程の条件は、例えば、９０℃〜９９℃、１秒間〜１２０秒間が好ましく、９２℃〜９５℃、１秒間〜６０秒間がより好ましい。アニーリング工程の条件は、例えば、４０℃〜７０℃、１秒間〜３００秒間が好ましく、５０℃〜７０℃、５秒間〜６０秒間がより好ましい。また、伸長工程の条件は、例えば、５０℃〜８０℃、１秒間〜３００秒間が好ましく、５０℃〜８０℃、５秒間〜６０秒間がより好ましい。サイクル数も特に制限されない。３工程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されない。例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、より好ましくは５０サイクル以下である。各工程の温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。なお、アニーリング工程と伸長工程とを同じ温度条件とし、２工程でＰＣＲを行ってもよい。
以上のようにして、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む３つの目的領域に対応する増幅産物を得ることができる。
＜多型解析方法＞
本発明の多型解析方法は、本発明の遺伝子増幅方法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅する増幅工程と、上記増幅工程で得られた増幅産物の一本鎖増幅核酸と、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域にハイブリダイズ可能な各プローブとのハイブリッドを形成するハイブリッド形成工程と、上記ハイブリッドを含む反応液の温度を変化させ、上記ハイブリッドの解離状態に基づくシグナルの変動を測定するシグナル測定工程と、上記シグナルの変動に基づいてＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析する解析工程と、を含むものである。本発明の多型解析方法によれば、試料中の核酸を鋳型として、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域を同一反応液において同時に且つ特異的に増幅し、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析することができる。
本発明の多型解析方法は、本発明の遺伝子増幅方法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅する増幅工程と、上記増幅工程で得られた増幅産物の一本鎖増幅核酸と、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域にハイブリダイズ可能な各プローブとのハイブリッドを形成するハイブリッド形成工程と、上記ハイブリッドを含む反応液の温度を変化させ、上記ハイブリッドの解離状態に基づくシグナルの変動を測定するシグナル測定工程と、上記シグナルの変動に基づいてＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析する解析工程と、を含むものである。本発明の多型解析方法によれば、試料中の核酸を鋳型として、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域を同一反応液において同時に且つ特異的に増幅し、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析することができる。
上記増幅工程は、本発明の遺伝子増幅方法における増幅工程と同様であるため、詳細な説明を省略する。
次に、上記ハイブリッド形成工程では、上記増幅工程で得られた増幅産物の一本鎖増幅核酸と、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域にハイブリダイズ可能な各プローブ（以下、各プローブを区別する場合には「ＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブ」、「ＣＹＰ２Ｃ１９＊３用プローブ」、「ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７用プローブ」とも記し、各プローブを区別しない場合には「多型解析用プローブ」とも記す。）とのハイブリッドを形成する。上記一本鎖増幅核酸は、例えば、反応液を加熱し、上記増幅工程で得られた増幅産物である二本鎖増幅核酸を解離することで調製することができる。多型解析用プローブの配列等の詳細については後述する。
多型解析用プローブを反応液に添加するタイミングは特に制限されない。例えば、増幅工程前、増幅工程の開始時、増幅工程の途中、及び増幅工程後のいずれであってもよい。中でも、増幅工程前又は増幅工程の開始時に添加することが、増幅反応とハイブリダイゼーションとを連続的に行うことができるため好ましい。すなわち、上記増幅工程と上記ハイブリッド形成工程とが同時に進行することが、処理効率の観点から好ましい。
上記反応液における多型解析用プローブの添加割合は特に制限されない。例えば、多型解析用プローブを１０ｎｍｏｌ／Ｌ〜４００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、２０ｎｍｏｌ／Ｌ〜２００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することがより好ましい。
上記反応液における多型解析用プローブの添加割合は特に制限されない。例えば、多型解析用プローブを１０ｎｍｏｌ／Ｌ〜４００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、２０ｎｍｏｌ／Ｌ〜２００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することがより好ましい。
上記一本鎖増幅核酸と多型解析用プローブとのハイブリダイゼーションの手法及び条件には、特に制限はない。二本鎖増幅核酸を解離して一本鎖増幅核酸にすること、一本鎖核酸同士をハイブリダイズすることを目的として当業界で既知の条件をそのまま適用すればよい。
例えば、解離における加熱温度は、上記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒間〜１０分間であり、好ましくは１秒間〜５分間である。また、解離した一本鎖増幅核酸と多型解析用プローブとのハイブリダイズは、例えば、解離後、解離における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件は、例えば４０℃〜５０℃である。
例えば、解離における加熱温度は、上記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒間〜１０分間であり、好ましくは１秒間〜５分間である。また、解離した一本鎖増幅核酸と多型解析用プローブとのハイブリダイズは、例えば、解離後、解離における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件は、例えば４０℃〜５０℃である。
上記増幅工程において、本発明のプライマーセットと多型解析用プローブとを共存させる場合、ＤＮＡポリメラーゼの反応対象となって多型解析用プローブ自体の伸長を予防するために、３’末端側に後述する蛍光標識が付加されているか、多型解析用プローブの３’末端にリン酸基が付加されていることが好ましい。
また、多型解析用プローブは、標識が付されている標識化プローブであることが検出の効率性の観点から好ましい。特に、本発明の多型解析方法では、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブ、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３用プローブ、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７用プローブの３種類の多型解析用プローブが使用されるため、これらの３種類の多型解析用プローブは、それぞれ異なる条件で検出される異なる標識によって標識化されていることが好ましい。このように異なる標識を使用することによって、同一反応液であっても、検出条件を変えることによって各増幅産物を別個に解析することが可能となる。
標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、蛍光色素及び蛍光団が挙げられる。標識化プローブとしては、このような蛍光色素又は蛍光団で標識された蛍光標識化プローブを用いることが好ましい。蛍光標識化プローブの具体例としては、蛍光色素で標識され、単独（相補配列にハイブリダイズしていないとき）で蛍光を示し且つハイブリッド形成（相補配列にハイブリダイズしているとき）により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが挙げられる。
このような蛍光消光現象（Quenching phenomenon）を利用したプローブは、一般に蛍光消光プローブと称される。上記蛍光消光プローブは、オリゴヌクレオチドの３’領域（例えば、３’末端）又は５’領域（例えば、５’末端）の塩基が蛍光色素で標識化されていることが好ましく、標識化される塩基は、シトシン（Ｃ）であることが好ましい。この場合、蛍光消光プローブがハイブリダイズする検出目的配列において、蛍光消光プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基又は当該対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニン（Ｇ）となるように、蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このような蛍光消光プローブは、一般にグアニン消光プローブと称され、いわゆるＱ Ｐｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。
このようなグアニン消光プローブが検出目的配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のシトシン（Ｃ）が検出目的配列におけるグアニン（Ｇ）に近づくことによって、蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなグアニン消光プローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。標識物質は、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合することができる。
このようなグアニン消光プローブが検出目的配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のシトシン（Ｃ）が検出目的配列におけるグアニン（Ｇ）に近づくことによって、蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなグアニン消光プローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。標識物質は、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合することができる。
なお、Ｑ Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ Ｐｒｏｂｅ法、ＲＦＬＰ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法、ＭＧＢ ｐｒｏｂｅ法等が挙げられる。
上記蛍光色素としては、特に制限されないが、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられる。市販の蛍光色素としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｃｙ３及びＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）等が挙げられる。複数のプローブに使用する蛍光色素の組み合わせは、異なる条件で検出できればよく、特に制限されないが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（検出波長：４５０ｎｍ〜４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長：５８５ｎｍ〜７００ｎｍ）、及びＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（検出波長：５１５ｎｍ〜５５５ｎｍ）の組み合わせ等が挙げられる。
また、多型解析用プローブが、蛍光色素等の標識物質で標識化された標識化プローブである場合、標識化プローブと同じ配列である未標識プローブを併用してもよい。これにより、例えば、検出する蛍光強度等のシグナル強度を調節することができる等の利点が得られる。この未標識プローブは、その３’末端にリン酸基が付加されていてもよい。
次に、上記シグナル測定工程では、上記ハイブリッドを含む反応液の温度を変化させ、上記ハイブリッドの解離状態に基づくシグナルの変動を測定する。上記ハイブリッドの解離状態を示すシグナルの測定は、２６０ｎｍの吸光度測定でもよいが、標識物質のシグナル測定であることが好ましい。標識物質のシグナル測定とすることによって、検出感度を高めることができる。
上記ハイブリッドの解離状態に基づくシグナルの変動は、反応液の温度を変化させて行う。例えば、上記反応液を加熱し、すなわち、一本鎖増幅核酸と多型解析用プローブとのハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する。前述のように、例えば、末端のＣ塩基が標識化された標識化プローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖増幅核酸とハイブリダイズした状態では蛍光が減少（又は消光）し、解離した状態では蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（又は消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。なお、標識化プローブを使用する場合、シグナルは、標識化プローブの標識物質に応じた条件で測定することができる。
シグナルの変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃、好ましくは２５℃〜７０℃であり、終了温度が４０℃〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば０．１℃／秒〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３℃／秒〜５℃／秒である。
次に、上記解析工程では、上記シグナルの変動に基づいてＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析する。その際、上記シグナル測定工程で得られたシグナルの変動を解析してＴｍ値を決定し、このＴｍ値に基づいてＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析することが好ましい。
Ｔｍ値の決定は、例えば、以下のようにして行うことができる。前述のように、例えば、末端のＣ塩基が標識化された標識化プローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、得られた蛍光強度の変動から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を算出する。変化量を（−ｄ（蛍光強度増加量）／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定することができる。また、変化量を（ｄ（蛍光強度増加量）／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も高い値を示す温度をＴｍ値として決定することができる。
なお、標識化プローブとして、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
Ｔｍ値の決定は、例えば、以下のようにして行うことができる。前述のように、例えば、末端のＣ塩基が標識化された標識化プローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、得られた蛍光強度の変動から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を算出する。変化量を（−ｄ（蛍光強度増加量）／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定することができる。また、変化量を（ｄ（蛍光強度増加量）／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も高い値を示す温度をＴｍ値として決定することができる。
なお、標識化プローブとして、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
上記解析工程では、このようにして決定されたＴｍ値に基づいて、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析することができる。
例えば、目的の塩基部位の塩基を変異型と仮定し、その変異型塩基を含む検出目的配列に相補的な多型解析用プローブを使用した場合、形成したハイブリッドのＴｍ値が、基準値として予め決定しておいた完全に相補的なハイブリッドのＴｍ値と同じであれば、目的塩基は変異型と判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、基準値として予め決定しておいた一塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同じ（完全に相補的なハイブリッドのＴｍ値よりも低い値）であれば、目的塩基は正常型と判断できる。また、両方のＴｍ値が検出された場合には、変異型を示す核酸と正常型を示す核酸とが共存すると決定できる。
例えば、目的の塩基部位の塩基を変異型と仮定し、その変異型塩基を含む検出目的配列に相補的な多型解析用プローブを使用した場合、形成したハイブリッドのＴｍ値が、基準値として予め決定しておいた完全に相補的なハイブリッドのＴｍ値と同じであれば、目的塩基は変異型と判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、基準値として予め決定しておいた一塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同じ（完全に相補的なハイブリッドのＴｍ値よりも低い値）であれば、目的塩基は正常型と判断できる。また、両方のＴｍ値が検出された場合には、変異型を示す核酸と正常型を示す核酸とが共存すると決定できる。
なお、以上の説明では、上記シグナル測定工程においてハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴うシグナル変動を測定するものとしたが、ハイブリッド形成時におけるシグナルの変動を測定するようにしてもよい。つまり、多型解析用プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、温度降下に伴うシグナルの変動を測定してもよい。
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖増幅核酸と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発するが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光が減少（又は消光）する。したがって、例えば、反応液の温度を徐々に降下させて、温度降下に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖増幅核酸と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発しないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、反応液の温度を徐々に降下させて、温度降下に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
以下、本発明の多型解析方法で用いられる多型解析用プローブについて詳細に説明する。
多型解析用プローブは、特に制限されず、従来公知の方法によって設定できる。例えば、遺伝子多型部位を含む検出対象配列として、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子のセンス鎖の配列に基づいて設計してもよいし、アンチセンス鎖の配列に基づいて設計してもよい。また、遺伝子多型部位の塩基は、各多型の種類に応じて適宜決定できる。
多型解析用プローブは、特に制限されず、従来公知の方法によって設定できる。例えば、遺伝子多型部位を含む検出対象配列として、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子のセンス鎖の配列に基づいて設計してもよいし、アンチセンス鎖の配列に基づいて設計してもよい。また、遺伝子多型部位の塩基は、各多型の種類に応じて適宜決定できる。
例えば、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２の場合、配列番号１における１３６１番目の塩基に「Ｇ」及び「Ａ」の多型が知られていることから、１３６１番目がＧである検出対象配列、及び１３６１番目がＡである検出対象配列のいずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）、並びにそのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）を、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブとして使用することができる。
また、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３の場合、配列番号１における１５５番目の塩基に「Ｇ」及び「Ａ」の多型が知られていることから、例えば、１５５番目がＧである検出対象配列、及び１５５番目がＡである検出対象配列のいずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）、並びにそのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）を、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３用プローブとして使用することができる。
また、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の場合、配列番号２における４１９５番目の塩基に「Ｃ」及び「Ｔ」の多型が知られていることから、例えば、４１９５番目がＣである検出対象配列、及び４１９５番目がＴである検出対象配列のいずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）、並びにそのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）を、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７用プローブとして使用することができる。
また、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３の場合、配列番号１における１５５番目の塩基に「Ｇ」及び「Ａ」の多型が知られていることから、例えば、１５５番目がＧである検出対象配列、及び１５５番目がＡである検出対象配列のいずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）、並びにそのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）を、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３用プローブとして使用することができる。
また、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の場合、配列番号２における４１９５番目の塩基に「Ｃ」及び「Ｔ」の多型が知られていることから、例えば、４１９５番目がＣである検出対象配列、及び４１９５番目がＴである検出対象配列のいずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）、並びにそのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）を、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７用プローブとして使用することができる。
ＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブ、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３用プローブ、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７用プローブの具体例を表１〜３に示す。表１のプローブはＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブの一例であり、アンチセンス鎖を検出するためのプローブである。また、表２のプローブはＣＹＰ２Ｃ１９＊３用プローブの一例であり、アンチセンス鎖を検出するためのプローブである。また、表３のプローブはＣＹＰ２Ｃ１９＊１７用プローブの一例であり、センス鎖を検出するためのプローブである。
表１〜３において、大文字の塩基はＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、又はＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位の塩基を示す。この塩基はｒに置き換えることができ、当該ｒはＡ及びＧのいずれでもよい。
表１〜３において、大文字の塩基はＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、又はＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位の塩基を示す。この塩基はｒに置き換えることができ、当該ｒはＡ及びＧのいずれでもよい。
表１〜３に示す多型解析用プローブは、前述のように、蛍光色素等の標識物質で標識化することが好ましい。
ＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブ、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３用プローブ、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７用プローブの具体例としては、表１〜３に示すオリゴヌクレオチドの相補鎖であってもよい。
なお、本発明の多型解析方法で用いられる多型解析用プローブがこれらの具体例に限定されないことは勿論である。
ＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブ、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３用プローブ、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７用プローブの具体例としては、表１〜３に示すオリゴヌクレオチドの相補鎖であってもよい。
なお、本発明の多型解析方法で用いられる多型解析用プローブがこれらの具体例に限定されないことは勿論である。
＜薬効判定方法＞
本発明の薬効判定方法は、本発明の多型解析方法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析する解析工程と、上記解析工程における解析結果に基づいて薬剤の薬効を判定する判定工程と、を含むものである。
本発明の薬効判定方法は、本発明の多型解析方法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析する解析工程と、上記解析工程における解析結果に基づいて薬剤の薬効を判定する判定工程と、を含むものである。
前述のように、本発明の多型解析方法によれば、試料中の核酸を鋳型として、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域を同一反応液において同時に且つ特異的に増幅し、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析することができる。ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型は、プロトンポンプ阻害剤（オメプラゾール、エソメプラゾール、ランソプラゾール、ラベプラゾール、パントプラゾール等）、ジアゼパム、フェニトイン、イミプラミン、ヘキソバルビタール、プログアニル、カリソプロドール、クロピドグレル、ボリコナゾール、ネルフィナビル、シクロホスファミド、タモキシフェン等の様々な薬剤の血中動態及び薬効に影響を与えることが知られている。したがって、本発明の薬効判定方法によれば、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型解析結果に基づき、薬剤の薬効を判定することができる。
得られた判定結果は、薬剤による副作用の予測に用いることができるほか、投与量の変更、他の薬剤への切り替え等を含めた治療方針の決定に用いることができる。
得られた判定結果は、薬剤による副作用の予測に用いることができるほか、投与量の変更、他の薬剤への切り替え等を含めた治療方針の決定に用いることができる。
＜ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用キット＞
本発明のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用キット（以下、単に「本発明のキット」という。）は、本発明のプライマーセットを含むものであり、核酸増幅法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅するために用いられる。本発明のキットが本発明のプライマーセットを含むことにより、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む領域を特異的且つ効率的に増幅することができる。
本発明のＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用キット（以下、単に「本発明のキット」という。）は、本発明のプライマーセットを含むものであり、核酸増幅法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅するために用いられる。本発明のキットが本発明のプライマーセットを含むことにより、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む領域を特異的且つ効率的に増幅することができる。
本発明のキットは、本発明のプライマーセットを用いた遺伝子増幅法により得られる増幅産物を検出するために、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域にハイブリダイズ可能な各プローブをさらに含むことが好ましい。このプローブは、前述のように、蛍光標識化プローブであることが好ましい。プローブについては、前述した多型解析用プローブに関する事項をそのまま適用することができる。
本発明のキットに含まれるプライマーセット（１）〜（３）は、別個に収容されていてもよく、混合物とされていてもよい。また、本発明のプライマーセットと上記プローブとは、別個に収容されていてもよく、混合物とされていてもよい。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされていればよく、必ずしも独立して取扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされていればよく、必ずしも独立して取扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
本発明のキットは、上記のほかに、本発明の遺伝子増幅方法又は本発明の多型解析方法に必要な各種の試薬類をさらに含んでいてもよい。また、本発明のキットは、本発明の遺伝子増幅方法又は本発明の多型解析方法について記載された使用説明書、本発明のキットに含まれる若しくは追加的に含むことが可能な各種の試薬について記載された使用説明書等をさらに含んでいてもよい。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下の実施例では、ＣＹＰ２Ｃ１９の遺伝子多型部位を含む目的領域を増幅させるためのプライマーとして、表４に示す各プライマーを用いた。これらのプライマーは、いずれも常法に従って作製した。
また、以下の実施例では、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む各領域にハイブリダイズ可能な各プローブとして、表５に示す各プローブを用いた。これらのプローブは、いずれも常法に従って作製した。３’末端又は５’末端のシトシン（Ｃ）の標識化は、常法に従って、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、又はＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラープローブ社製）を用いて行った。５Ｔ−ＣＹＰ２Ｃ１９＊３については、常法に従って３’末端にリン酸基を付加した。なお、表５に示す塩基配列中、大文字の塩基は、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、又はＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を示す。
また、以下の実施例では、プライマーによる増幅効率を評価するために、「増幅判定値」という指標を用いた。この増幅判定値が概ね２．５以上であると、十分な量の増幅産物が得られたと判断できる。
なお、増幅判定値は次のようにして計算される値である。
まず、各種プライマーと蛍光消光プローブとを含むＰＣＲ反応液を用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応後、反応液を加熱して温度上昇に伴う蛍光強度変化を測定する。そして、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（一次微分値）を求め、その一次微分値に基づいて二次微分値を求める。一例として、ＰＣＲ反応後の反応液を４０℃から９５℃まで加熱した結果、表６のような蛍光強度、一次微分値、二次微分値が得られたと仮定する。なお、表６では、ｔ１＋１（℃）（ｔ１＝４１℃〜９４℃）における蛍光強度からｔ１（℃）における蛍光強度を減算した値をｔ１（℃）における一次微分値としている。また、ｔ２＋３（℃）（ｔ２＝４１℃〜９１℃）における一次微分値からｔ２（℃）における一次微分値を減算した値をｔ２（℃）における二次微分値としている。
まず、各種プライマーと蛍光消光プローブとを含むＰＣＲ反応液を用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応後、反応液を加熱して温度上昇に伴う蛍光強度変化を測定する。そして、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（一次微分値）を求め、その一次微分値に基づいて二次微分値を求める。一例として、ＰＣＲ反応後の反応液を４０℃から９５℃まで加熱した結果、表６のような蛍光強度、一次微分値、二次微分値が得られたと仮定する。なお、表６では、ｔ１＋１（℃）（ｔ１＝４１℃〜９４℃）における蛍光強度からｔ１（℃）における蛍光強度を減算した値をｔ１（℃）における一次微分値としている。また、ｔ２＋３（℃）（ｔ２＝４１℃〜９１℃）における一次微分値からｔ２（℃）における一次微分値を減算した値をｔ２（℃）における二次微分値としている。
一方、使用した蛍光消光プローブとミスマッチする場合のＴｍ値である最小ピーク温度Ｔｍｉｎと、パーフェクトマッチする場合のＴｍ値である最大ピーク温度Ｔｍａｘとを求めておく。ここでは仮に、最小ピーク温度Ｔｍｉｎを５９℃、最大ピーク温度Ｔｍａｘを７７℃とする。
次に、Ｔｍｉｎ−５（℃）からＴｍａｘ＋５（℃）までの範囲を探索範囲とし、この探索範囲内の最大蛍光強度を求める。表６の場合、５４℃から８２℃までの探索範囲内の最大蛍光強度は２７７８である。
次に、Ｔｍｉｎ−５（℃）からＴｍａｘ＋１（℃）までの探索範囲内の二次微分値の最大値及び最小値を求める。表６の場合、５４℃から７８℃までの探索範囲内の二次微分値の最大値は１０６、最小値は−１６１である。
その後、下記式に従って増幅判定値を計算する。
増幅判定値＝１００×（｜二次微分値の最大値｜＋｜二次微分値の最小値｜）／最大蛍光強度
表６の場合、増幅判定値＝１００×（１０６＋１６１）／２７７８≒９．６となる。
次に、Ｔｍｉｎ−５（℃）からＴｍａｘ＋５（℃）までの範囲を探索範囲とし、この探索範囲内の最大蛍光強度を求める。表６の場合、５４℃から８２℃までの探索範囲内の最大蛍光強度は２７７８である。
次に、Ｔｍｉｎ−５（℃）からＴｍａｘ＋１（℃）までの探索範囲内の二次微分値の最大値及び最小値を求める。表６の場合、５４℃から７８℃までの探索範囲内の二次微分値の最大値は１０６、最小値は−１６１である。
その後、下記式に従って増幅判定値を計算する。
増幅判定値＝１００×（｜二次微分値の最大値｜＋｜二次微分値の最小値｜）／最大蛍光強度
表６の場合、増幅判定値＝１００×（１０６＋１６１）／２７７８≒９．６となる。
＜実験例１＞
表７に示す処方のＥ−Ｍｉｘ及び表８に示す処方のＭＫ−Ｍｉｘをそれぞれ調製した。また、表９に示す処方のＰｒｅＰ−Ｍｉｘを調製し、このＰｒｅＰ−Ｍｉｘを用いて表１０に示す条件１〜８の処方のＰ−Ｍｉｘをそれぞれ調製した。そして、Ｅ−Ｍｉｘ、Ｐ−Ｍｉｘ、及びＭＫ−Ｍｉｘと全血から精製したヒトゲノムＤＮＡとを表１１のように混合し、反応液を調製した。なお、使用したヒトゲノムＤＮＡは、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７のいずれも野生型（すなわち、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２は６８１Ｇ／Ｇ、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３は６３６Ｇ／Ｇ、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７は−８０６Ｃ／Ｃ）を示すものである（以下、同じ）。
表７に示す処方のＥ−Ｍｉｘ及び表８に示す処方のＭＫ−Ｍｉｘをそれぞれ調製した。また、表９に示す処方のＰｒｅＰ−Ｍｉｘを調製し、このＰｒｅＰ−Ｍｉｘを用いて表１０に示す条件１〜８の処方のＰ−Ｍｉｘをそれぞれ調製した。そして、Ｅ−Ｍｉｘ、Ｐ−Ｍｉｘ、及びＭＫ−Ｍｉｘと全血から精製したヒトゲノムＤＮＡとを表１１のように混合し、反応液を調製した。なお、使用したヒトゲノムＤＮＡは、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊１７のいずれも野生型（すなわち、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２は６８１Ｇ／Ｇ、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３は６３６Ｇ／Ｇ、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７は−８０６Ｃ／Ｃ）を示すものである（以下、同じ）。
調製した反応液を用いて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ ＩＳ−５３２０、アークレイ社製）によりＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。なお、測定は各反応液の各反応温度について１回ずつ行った（ｎ＝１）。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒間処理した後、９５℃で１秒間及びｔ℃で３０秒間を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。反応温度ｔとしては、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃の４段階を設定した。
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒間、４０℃で６０秒間処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で４０℃から９５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。なお、Ｔｍ解析における蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの励起波長は４２０ｎｍ〜４８５ｎｍであり、検出波長は５２０〜５５５ｎｍである。また、蛍光色素ＴＡＭＲＡの励起波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍであり、検出波長は５８５ｎｍ〜７００ｎｍである。また、蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅの励起波長は３６５ｎｍ〜４１５ｎｍであり、検出波長は４４５ｎｍ〜４８０ｎｍである。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒間処理した後、９５℃で１秒間及びｔ℃で３０秒間を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。反応温度ｔとしては、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃の４段階を設定した。
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒間、４０℃で６０秒間処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で４０℃から９５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。なお、Ｔｍ解析における蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの励起波長は４２０ｎｍ〜４８５ｎｍであり、検出波長は５２０〜５５５ｎｍである。また、蛍光色素ＴＡＭＲＡの励起波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍであり、検出波長は５８５ｎｍ〜７００ｎｍである。また、蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅの励起波長は３６５ｎｍ〜４１５ｎｍであり、検出波長は４４５ｎｍ〜４８０ｎｍである。
ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む目的領域の増幅判定値を図１（Ａ）に示し、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２の遺伝子多型部位を含む目的領域の増幅判定値を図１（Ｂ）に示し、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３の遺伝子多型部位を含む目的領域の増幅判定値を図１（Ｃ）に示す。
図１（Ａ）に示されるとおり、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７について増幅判定値が２．５以上となるのは、Ｐ−Ｍｉｘの条件１、２、５であった。また、図１（Ｂ）に示されるとおり、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２について増幅判定値が２．５以上となるのは、Ｐ−Ｍｉｘの条件１、２であった。また、図１（Ｃ）に示されるとおり、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３について増幅判定値が２．５以上となるのは、Ｐ−Ｍｉｘの条件１であった。図１（Ａ）〜（Ｃ）の結果から、Ｐ−Ｍｉｘの条件１、２、５においてＤＮＡポリメラーゼの量を増やせば、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊３の全てについて増幅判定値が２．５以上になると考えられる。なお、Ｐ−Ｍｉｘの条件１、２、５の中でも特に条件２は、反応温度を変化させたときの影響が小さく、反応温度の変動に対する許容性が高かった。
図１（Ａ）に示されるとおり、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７について増幅判定値が２．５以上となるのは、Ｐ−Ｍｉｘの条件１、２、５であった。また、図１（Ｂ）に示されるとおり、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２について増幅判定値が２．５以上となるのは、Ｐ−Ｍｉｘの条件１、２であった。また、図１（Ｃ）に示されるとおり、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３について増幅判定値が２．５以上となるのは、Ｐ−Ｍｉｘの条件１であった。図１（Ａ）〜（Ｃ）の結果から、Ｐ−Ｍｉｘの条件１、２、５においてＤＮＡポリメラーゼの量を増やせば、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊３の全てについて増幅判定値が２．５以上になると考えられる。なお、Ｐ−Ｍｉｘの条件１、２、５の中でも特に条件２は、反応温度を変化させたときの影響が小さく、反応温度の変動に対する許容性が高かった。
＜実験例２＞
表１２に示す処方のＰｒｅＥ−Ｍｉｘを調製し、このＰｒｅＥ−Ｍｉｘを用いて表１３に示す条件１、２の処方のＥ−Ｍｉｘをそれぞれ調製した。また、表９に示す処方のＰｒｅＰ−Ｍｉｘを調製し、このＰｒｅＰ−Ｍｉｘを用いて表１０に示す条件１、２、５の処方のＰ−Ｍｉｘをそれぞれ調製した。さらに、表８に示す処方のＭＫ−Ｍｉｘを調製した。そして、Ｅ−Ｍｉｘ、Ｐ−Ｍｉｘ、及びＭＫ−Ｍｉｘと全血から精製したヒトゲノムＤＮＡとを表１４のように混合し、反応液を調製した。
表１２に示す処方のＰｒｅＥ−Ｍｉｘを調製し、このＰｒｅＥ−Ｍｉｘを用いて表１３に示す条件１、２の処方のＥ−Ｍｉｘをそれぞれ調製した。また、表９に示す処方のＰｒｅＰ−Ｍｉｘを調製し、このＰｒｅＰ−Ｍｉｘを用いて表１０に示す条件１、２、５の処方のＰ−Ｍｉｘをそれぞれ調製した。さらに、表８に示す処方のＭＫ−Ｍｉｘを調製した。そして、Ｅ−Ｍｉｘ、Ｐ−Ｍｉｘ、及びＭＫ−Ｍｉｘと全血から精製したヒトゲノムＤＮＡとを表１４のように混合し、反応液を調製した。
調製した反応液を用いて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ ＩＳ−５３２０、アークレイ社製）によりＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。なお、測定は各反応液について４回行った（ｎ＝４）。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒間処理した後、９５℃で１秒間及び６４℃で３０秒間を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒間、４０℃で６０秒間処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で４０℃から９５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
なお、実験例２における反応条件（Ｅ−ＭｉｘとＰ−Ｍｉｘとの組み合わせ）は表１５に示すとおりである。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒間処理した後、９５℃で１秒間及び６４℃で３０秒間を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒間、４０℃で６０秒間処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で４０℃から９５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
なお、実験例２における反応条件（Ｅ−ＭｉｘとＰ−Ｍｉｘとの組み合わせ）は表１５に示すとおりである。
ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む目的領域の増幅判定値を図２（Ａ）に示し、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２の遺伝子多型部位を含む目的領域の増幅判定値を図２（Ｂ）に示し、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３の遺伝子多型部位を含む目的領域の増幅判定値を図２（Ｃ）に示す。
図２（Ａ）〜（Ｃ）に示されるとおり、ＤＮＡポリメラーゼの量を２倍とした反応条件４〜６（Ｅ−Ｍｉｘの条件２）では、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊３の全てについて増幅判定値の平均値が２．５以上になった。特に、反応条件５、６（Ｐ−Ｍｉｘの条件２、５）では、測定した４回全てで増幅判定値が２．５以上になった。反応条件５と反応条件６とを比較すると、増幅判定値の大きさから、反応条件５の方が好ましいと考えられる。
図２（Ａ）〜（Ｃ）に示されるとおり、ＤＮＡポリメラーゼの量を２倍とした反応条件４〜６（Ｅ−Ｍｉｘの条件２）では、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊３の全てについて増幅判定値の平均値が２．５以上になった。特に、反応条件５、６（Ｐ−Ｍｉｘの条件２、５）では、測定した４回全てで増幅判定値が２．５以上になった。反応条件５と反応条件６とを比較すると、増幅判定値の大きさから、反応条件５の方が好ましいと考えられる。
＜実験例３＞
表１６に示す処方のＥ−Ｍｉｘ及び表１７に示す処方のＰ−Ｍｉｘをそれぞれ調製した。また、表８に示す処方のＭＫ−Ｍｉｘを調製した。そして、Ｅ−Ｍｉｘ、Ｐ−Ｍｉｘ、及びＭＫ−Ｍｉｘと全血から精製したヒトゲノムＤＮＡとを表１８のように混合し、反応液を調製した。
表１６に示す処方のＥ−Ｍｉｘ及び表１７に示す処方のＰ−Ｍｉｘをそれぞれ調製した。また、表８に示す処方のＭＫ−Ｍｉｘを調製した。そして、Ｅ−Ｍｉｘ、Ｐ−Ｍｉｘ、及びＭＫ−Ｍｉｘと全血から精製したヒトゲノムＤＮＡとを表１８のように混合し、反応液を調製した。
調製した反応液を用いて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ ＩＳ−５３２０、アークレイ社製）によりＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。なお、測定は各反応液の各反応温度について４回ずつ行った（ｎ＝４）。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒間処理した後、９５℃で１秒間及びｔ℃で３０秒間を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。反応温度ｔとしては、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃、６６℃の５段階を設定した。
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒間、４０℃で６０秒間処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で４０℃から９５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒間処理した後、９５℃で１秒間及びｔ℃で３０秒間を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。反応温度ｔとしては、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃、６６℃の５段階を設定した。
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒間、４０℃で６０秒間処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で４０℃から９５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７の遺伝子多型部位を含む目的領域の増幅判定値を図３（Ａ）に示し、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２の遺伝子多型部位を含む目的領域の増幅判定値を図３（Ｂ）に示し、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３の遺伝子多型部位を含む目的領域の増幅判定値を図３（Ｃ）に示す。
図３（Ａ）〜（Ｃ）に示されるとおり、特に反応温度を６２℃とした場合、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊３の全てについて増幅判定値が安定し、且つ、少なくとも±２℃の反応温度の許容性を有していた。
図３（Ａ）〜（Ｃ）に示されるとおり、特に反応温度を６２℃とした場合、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、及びＣＹＰ２Ｃ１９＊３の全てについて増幅判定値が安定し、且つ、少なくとも±２℃の反応温度の許容性を有していた。
＜実験例４＞
表１６に示す処方のＥ−Ｍｉｘ、表１７に示す処方のＰ−Ｍｉｘ、及び表８に示す処方のＭＫ−Ｍｉｘをそれぞれ調製した。
表１６に示す処方のＥ−Ｍｉｘ、表１７に示す処方のＰ−Ｍｉｘ、及び表８に示す処方のＭＫ−Ｍｉｘをそれぞれ調製した。
一方、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７及びＣＹＰ２Ｃ１９＊２がヘテロ接合型（Ｈｔ）（すなわち、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７が−８０６Ｃ／Ｔ、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２が６８１Ｇ／Ａ）、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３が野生型（ＷＴ）（すなわち、６３６Ｇ／Ｇ）である全血１と、ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７が野生型（ＷＴ）（すなわち、−８０６Ｃ／Ｃ）、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２及びＣＹＰ２Ｃ１９＊３がヘテロ接合型（Ｈｔ）（すなわち、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２が６８１Ｇ／Ａ、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３が６３６Ｇ／Ａ）である全血２とを準備した。この全血１、２の各２０μＬと下記希釈液Ａの１４０μＬとを混合し、さらにこの混合液の２０μＬと下記希釈液Ｂの１４０μＬとを混合した。この混合液１７μＬを９５℃で１０分間加熱することにより、４μＬの前処理後の全血を得た。
（希釈液Ａ）
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＮａＮ３、０．３％ ＳＤＳ
（希釈液Ｂ）
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＮａＮ３
（希釈液Ａ）
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＮａＮ３、０．３％ ＳＤＳ
（希釈液Ｂ）
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＮａＮ３
その後、Ｅ−Ｍｉｘ、Ｐ−Ｍｉｘ、及びＭＫ−Ｍｉｘと前処理後の全血１又は全血２とを表１９のように混合し、反応液を調製した。
調製した反応液を用いて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ ＩＳ−５３２０、アークレイ社製）によりＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒間処理した後、９５℃で１秒間及び６２℃で３０秒間を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒間、４０℃で６０秒間処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で４０℃から９５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒間処理した後、９５℃で１秒間及び６２℃で３０秒間を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒間、４０℃で６０秒間処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で４０℃から９５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
全血２又は全血１を用いた反応液について、３ＰＢ−ＣＹＰ２Ｃ１９＊１７のプローブに対応する検出波長で蛍光強度を測定したときのＴｍ解析結果を、それぞれ図４（Ａ）、（Ｂ）に示す。また、全血２を用いた反応液について、３ＦＬ−ＣＹＰ２Ｃ１９＊２のプローブに対応する検出波長で蛍光強度を測定したときのＴｍ解析結果を図４（Ｃ）に示す。また、全血１又は全血２を用いた反応液について、５Ｔ−ＣＹＰ２Ｃ１９＊３のプローブに対応する検出波長で蛍光強度を測定したときのＴｍ解析結果を、それぞれ図４（Ｄ）、（Ｅ）に示す。
図４（Ａ）〜（Ｅ）に示されるとおり、野生型（ＷＴ）の検体については１つのピークのみが観察され、ヘテロ接合型（Ｈｔ）の検体については野生型（ＷＴ）及び変異型（ｍｔ）の２つのピークが観察された。したがって、このＴｍ解析結果に基づいて遺伝子型の判定が可能である。
図４（Ａ）〜（Ｅ）に示されるとおり、野生型（ＷＴ）の検体については１つのピークのみが観察され、ヘテロ接合型（Ｈｔ）の検体については野生型（ＷＴ）及び変異型（ｍｔ）の２つのピークが観察された。したがって、このＴｍ解析結果に基づいて遺伝子型の判定が可能である。
Claims (8)
- 下記プライマーセット（１）及び（２）と、
下記プライマーセット（３ａ）、（３ｂ）、及び（３ｃ）から選ばれる１種のプライマーセット（３）と、
配列番号２４の塩基配列であり且つ、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドであるプローブ、配列番号３６の塩基配列であり且つ、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドであるプローブ、及び配列番号５１の塩基配列であり且つ、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドであるプローブと、
を含む、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析するためのキット：
プライマーセット（１）
配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（２）
配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（３ａ）
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（３ｂ）
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（３ｃ）
配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット。 - 前記プライマーセット（１）、（２）、及び（３ｂ）を含む、請求項１に記載のキット。
- 試料中の核酸を鋳型として、下記プライマーセット（１）及び（２）と、下記プライマーセット（３ａ）、（３ｂ）、及び（３ｃ）から選ばれる１種のプライマーセット（３）とを用いて、一反応液中でＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の目的領域を増幅する増幅工程と、
前記増幅工程で得られた増幅産物の一本鎖増幅核酸と、配列番号２４の塩基配列であり且つ、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドであるプローブ、配列番号３６の塩基配列であり且つ、５’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドであるプローブ、及び配列番号５１の塩基配列であり且つ、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドであるプローブのそれぞれとのハイブリッドを形成するハイブリッド形成工程と、
前記ハイブリッドを含む反応液の温度を変化させ、前記ハイブリッドの解離状態に基づくシグナルの変動を測定するシグナル測定工程と、
前記シグナルの変動に基づいてＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析する解析工程と、を含む多型解析方法：
プライマーセット（１）
配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（２）
配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（３ａ）
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（３ｂ）
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット、
プライマーセット（３ｃ）
配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、
配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、
を含む一対のプライマーセット。 - 前記試料が生体試料である、請求項３に記載の多型解析方法。
- 前記生体試料が全血である、請求項４に記載の多型解析方法。
- 前記プライマーセット（１）の合計モル量と前記プライマーセット（２）の合計モル量との比が１：１〜１：３であり、前記プライマーセット（１）の合計モル量と前記プライマーセット（３）の合計モル量との比が１：１．５〜１：４である、請求項３〜請求項５のいずれか１項に記載の多型解析方法。
- 前記増幅工程と前記ハイブリッド形成工程とが同時に進行する、請求項３〜請求項６のいずれか１項に記載の多型解析方法。
- 請求項３〜請求項７のいずれか１項に記載の多型解析方法によりＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の多型を解析する解析工程と、
前記解析工程における解析結果に基づいて薬剤の薬効を判定する判定工程と、を含む薬効判定方法。
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