CN109112208A

CN109112208A - 用于检测缺失型α-地中海贫血的引物组及试剂盒

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Publication number: CN109112208A
Application number: CN201710488661.7A
Authority: CN
Inventors: 陈治中; 卿吉琳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-06-23
Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2019-01-01

Abstract

本发明提供了一种用于检测缺失型α‑地中海贫血的引物组及试剂盒，属于分子生物学。所述引物组包括如下引物对：上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9所示的3.7F/3.7R；上下游引物序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的SEAF/SEAR；上下游引物序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的THAIF/THAIR；上下游引物序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的4.2F/4.2R；以及上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的APF/APR。本发明的引物组可应用于常见缺失型地中海贫血的检测，具有快速、灵敏、安全等优点。

Description

用于检测缺失型α-地中海贫血的引物组及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种检测缺失型α地中海贫血技术，特别是涉及一种直接PCR(Direct PCR)法单管同时检测缺失型(--^SEA、--^THAI、-α^3.7和-α^4.2)α地中海贫血的试剂盒。

背景技术

地中海贫血(thalassemia,简称地贫)，由于珠蛋白基因的缺陷(基因突变或缺失)导致一种或几种珠蛋白肤链合成障碍，而引起血红蛋白的α-链/非α-链比例失衡，进而导致血红蛋白不稳定，冗余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上，红细胞膜的通透性和脆性发生改变，导致溶血性贫血，临床上表现出症状轻重不一的慢性进行性溶血性贫血；是一种隐性基因遗传病。根据受累的珠蛋白肽链的类型分为α、β、γ、δ和δβ地贫等类型。其中以α、β地贫最为常见，危害也最大。广泛发生于热带和亚热带国家，我国长江以南发病率高，无明显症状的携带者超过人群20％。

α珠蛋白基因位于α珠蛋白基因簇，该基因簇的染色体定位为16p13.3，基因簇中，有Hb Z,Hbα1,Hbα2三个功能基因，表达相应的ζ(HBZ基因)和α(HBα1和HBα2基因)珠蛋白链，其再与相应的β珠蛋白链结合，形成ζ2γ2(胎儿期血红蛋白Hb Portland)和α2β2:(成人血红蛋白HbA)。α-地贫，是由于α珠蛋白基因缺失或缺陷导致α珠蛋白肽链合成障碍所致。地贫具高度的遗传异质性。α地贫可以分为缺失型和非缺失型两大基因类型。95％以上为缺失型，是由于α珠蛋白基因大片段缺失所致。相对人类正常基因组而言，α珠蛋白簇的基因型为ζ₂/α2₂/α1₂，有4个α珠蛋白基因，一条染色体上缺失或缺陷1个α基因，为α⁺地贫(静止型)，通常缺失一个α基因或一个α基因发生点突变或少数几个碱基的缺失或插入引起(-α/，α^Tα)，表现为α-珠蛋白肽链合成部分受阻，我国最常见的α⁺地贫基因为-α^3.7、-α^4.2缺失型突变以及Hb WS,Hb QS与Hb CS等点突变。缺失2个α基因，为α⁰地贫(标准型)，特点为α-珠蛋白肽链合成完全受阻，我国最常见的为--^SEA，少见--^THAI，而--^FIL则更罕见。缺失3个αl或/和α2基因的为HbH病，4个α珠蛋白基因均缺失的为Hb Bart's胎儿水肿综合征。当夫妇双方均为她中海贫血基因缺失携带者时，其后代有25％的机会罹患Hb Bart's或HbH病。HbH病患者中至重度贫血，可丧失劳动力，严重影响生存质量；Hb Bart's水肿胎受累患儿因严重缺氧而胎死腹中或一出生即死亡，引起的产科并发症给产妇带来极大的身心伤害；最常见的是α⁰-地贫复合α⁺地贫的缺失型Hb H病，然而非缺失型的Hb H病也占有相当的比例,这类病人比那些缺了3个α珠蛋白基因所表现出来的临床症状更严重，贫血更严重。这些都给家庭和社会造成巨大压力。

α地贫目前该病尚无理想的治疗方法，研究表明在地贫高发区，对夫妇双方均为地贫基因携带者的孕妇在妊娠早期筛查或中期应用相应分析技术通过遗传筛查和产前基因诊断选择性地淘汰重症α-地贫胎儿则是控制该病发生的首要途径和有效预防措施。因此，对于缺失型α-地贫的检测急需一种简单、能快速准确基因分型的技术手段。

目前对α-地贫筛查方法如血常规参数检测分析、红细胞渗透脆性试验、血红蛋白电泳试验等特异性不高，较易产生假阴性。对于α-地中海贫血的分子诊断，Southern Blot杂交技术是金标准，准确性高，但操作繁琐、标本用量大、费时费力、检测通量小而不适合常规检测；其他TaqMan探针技术、变性高效液相色谱(DHPLC)、DNA直接测序和DNA微阵列技术等。但这些方法检测过程繁琐、检测所用时间长、使用试剂或者仪器昂贵和特殊的标记引物等，因而不利于临床广泛的推广应用。

现有的缺失型α地中海贫血检测相关的专利种类有几种，除了专利申请号为201110098786.1的发明专利提供ELISA法通过特异性抗体检测SEA型地贫特异性珠蛋白的方法，不需要提取核酸DNA外，其他专利基于缺口PCR(Gap-PCR)、高分辨的溶解曲线分析、TaqMan探针技术、寡核苷酸探针杂交、变性高效液相色谱技术，多重连接酶依赖的探针扩增技术(MLPA)、基因芯片等技术，均需要提取外周血、胚胎绒毛组织和/或羊水中DNA，才能进行以后的实验操作，而DNA的质量是PCR成功的一个非常关键的因素，并且提取与纯化DNA过程极易污染，使得实验易出现假阴性或者假阳性，极易造成漏检或误检。

目前市场上缺失型地贫检测方法和产品多采用Gap-PCR结合电泳方法或者基因芯片等技术检测中国常见的四种缺失型α地贫(--^SEA、--^THAI、-α^3.7和-α^4.2)，都必须提取与纯化DNA，才能继续后续实验。

另外，普通常规缺失型地贫检测方法所需样本量多，对于边远地带采集的标本运输需冷链设备，需三级包装系统，标本储存空间大；生物安全风险系数高。目前，对全血、羊水和DBS等样品，无需DNA提纯，直接检测地贫的技术尚无，市场上尚无此类产品。

发明内容

有鉴于此，本发明目的是针对现有的检测方法的缺陷，采用直接PCR(Direct PCR)方法，提供一种不需要DNA抽提直接扩增检测中国常见的四种缺失型α地贫(--^SEA、--^THAI、-α^3.7和-α^4.2)的方法及其试剂盒。采用该试剂盒可以实现单管单次闭管反应完成缺失型α-地中海贫血等位基因的检测，本试剂盒可操作简便、分型快速、费用低廉，高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性，结果判读直观。

本发明的技术方案如下：

用于检测缺失型α-地中海贫血的引物组，包括如下引物对：

上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9所示的3.7F/3.7R；

上下游引物序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的SEAF/SEAR；

上下游引物序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的THAIF/THAIR；

上下游引物序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的4.2F/4.2R；

以及上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的APF/APR。

所述检测指以人体血液、和/或体液、和/或胚胎的遗传物质、和/或人体基因组DNA为模板，用所述引物组进行PCR扩增后，将所得扩增产物进行电泳即可获知结果。

用于快速检测缺失型α-地中海贫血的试剂盒，包括权利要求1所述的引物组。

所述快速检测指，直接以人体血液、和/或体液、和/或胚胎的遗传物质、和/或人体基因组DNA为模板，用所述引物组进行PCR扩增后，将所得扩增产物进行电泳即可获知结果。

所述试剂盒还包括用于进行PCR和/或电泳的试剂。

所述用于进行PCR的试剂包括引物、dNTP、DNA聚合酶、缓冲液、双蒸水、MgCl₂；

所述用于进行电泳的试剂包括琼脂糖、蒸馏水、核酸染料；

所述核酸染料选自：EB、GelGreen、SYBR GreenⅠ、GoldView、GelRed和GelGreen。

所述PCR的反应体系为：1～4μl模板、各引物：0.1～1μmol/L、MgCl₂浓度为1.5～5mM/L、dNTP的浓度为100～500μM/L、DNA聚合酶的浓度为1～4U/反应；

优选地，所述PCR反应体系包含如下体积份数的各组分：MightyAmp Taq 0.1-1份、2×MightyAmp Buffer 10份、APF/3.7F 0.1-1.2份、APR 0.1-0.8份、4.2F 0.1-0.6份、4.2R0.1-0.6份、3.7R 0.1-0.6份、SEA-F 0.1-0.6份、SEA-R 0.1-0.6份、THAI-F 0.1-0.6份、THAI-R 0.1-0.6份、模板+超纯水2.8-9份；

进一步优选地，所述PCR反应体系如下：MightyAmp Taq 0.5μl、2×MightyAmpBuffer 10μl、APF/3.7F 0.9μl、APR 0.5μl、4.2F 0.3μl、4.2R 0.3μl、3.7R 0.4μl、SEA-F0.2μl、SEA-R 0.2μl、THAI-F 0.2μl、THAI-R 0.2μl、模板+超纯水6.3μl；

优选地，所述引物组中各引物摩尔浓度比例为：

APF/3.7F∶APR∶4.2F∶4.2R∶3.7R∶SEA-F∶SEA-R∶THAI-F∶THAI-R＝9∶5∶3∶3∶4∶2∶2∶2∶2；

所述PCR的反应程序为：95℃5-8分钟；以94℃30秒、61℃～64℃45秒～1分钟、72℃130秒为1个循环，进行31～34个循环；72℃8分钟；12℃12秒；

所述电泳指，将所述PCR反应产物置于添加了质量比为0.8～1.5％的琼脂糖凝胶中，在5V/cm电压下电泳40～55分钟；所述琼脂糖凝胶中添加有体积比0.005％的核酸染料。

所述模板还包括固定在固体载体上的人体血液、和/或体液、和/或胚胎的遗传物质、和/或基因组DNA；

优选地，所述模板可以选自滤纸片干血斑样品、滤纸片干羊水样品、滤纸片干浆膜腔液样品、滤纸片干关节液样品、滤纸片干唾液样品、滤纸片干胚胎的遗传物质、和/或滤纸片干基因组DNA样品。

滤纸片是液体标本采集和运输的极好载体。全血滴在滤纸片上制成滤纸片干血斑(Dried blood spots,DBS)，有很好的生物稳定性和安全性，便于储存和运输。随着我国产前筛查、新生儿筛查力度的不断增强，特别是当筛查范围扩大到一些地域偏远、医疗条件相对落后的地区时，应用滤纸干血斑(DBS)对于患者标本采集、保存和运输及流行病学调查则更为有利。

所述人体体液选自下述物质的一种或多种：羊水、胚胎绒毛组织、浆膜腔液、关节液、唾液；所述血液包括外周血、脐带血、末梢血；所述胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞，即囊胚细胞。

所述的引物组，和/或，所述的试剂盒在制备缺失型α-地中海贫血检测试剂方面的用途，其特征在于，在标有缺失型α-地中海贫血检测用途的包装内放入所述引物组，和/或，在装有所述引物组的容器上标有缺失型α-地中海贫血检测用途。

本发明所述的快速检测缺失型α-地中海贫血的试剂盒，包括扩增引物，经过大量实践调整本发明的引物序列，优选的引物组合序列如下：一组可以扩增α-珠蛋白基因簇中四种缺失型α-地贫(--^SEA、--^THAI、-α^3.7和-α^4.2)等位基因的特征序列的引物，其碱基序列如下：引物3.7F，SEQ ID NO.1；引物3.7R，SEQ ID NO.9；引物SEAF，SEQ ID NO.3；引物SEAR，SEQ ID NO.4；引物THAIF，SEQ ID NO.5；引物THAIR，SEQ ID NO.6；引物4.2F，SEQ ID NO.7；引物4.2R，SEQ ID NO.8；

为了对缺失型α-地贫进行基因分型评估，在该PCR体系中，引入内对照扩增α-珠蛋白基因簇中正常人基因(NG_000006.1)序列的引物。PCR扩增的产物片段约为1.8kb。

引物APF：SEQ ID NO.1；引物APR：SEQ ID NO.2。

本发明所述的快速检测缺失型地中海贫血等位基因的试剂盒还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如PCR缓冲液、酶液、MgCl₂和dNTP等。具体地，酶液为Taq聚合酶体系，包括可用于直接PCR法的热启动酶体系等；所述缓冲液为可用于血液直接PCR缓冲液；当酶液选择采用宝生物工程(大连)有限公司所生产的MightyAmpTMDNA Polymerase时，缓冲液则优选为与MightyAmp^TM DNA Polymerase配套的缓冲液。

优选的，上述4种缺失型α-地中海贫血的基因检测试剂盒中，用于多重直接PCR的反应液按每人份含量由以下组份组成配方(引物工作浓度μmol/L，MightyAmp DNAPolymerase为1.25U/μL)：

表1 PCR反应液配方

本发明所述试剂盒适用于琼脂糖凝胶电泳法。

本发明所述试剂盒基于Direct PCR的快速检测地中海贫血4种常见缺失型等位基因，采用该试剂盒快速检测缺失型地中海贫血等位基因的方法包括以下步骤：

1)样本采集：抗凝外周血(如静脉血、动脉血、足跟血或指尖血等)、DBS样本、胚胎绒毛组织、羊水或脐带血等标本直接作为模板，也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板。

2)配制PCR反应液配方及体系，具体为：

将引物THAIF、THAIR、SEAF、SEAR、4.2F、4.2R、3.7F、3.7R、APF和APR；以及PCR缓冲液、酶液、MgCl₂、dNTP、水和外周血配制成反应体系。

优选的，PCR反应液配方见表1。

3)样本检测：抗凝外周血、DBS样本、胚胎绒毛组织、羊水或脐带血等标本直接作为模板，也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板配制的反应体系与反应条件进行PCR扩增，得到扩增产物；优选的，反应体系与反应条件见表1。

4)电泳检测鉴定PCR产物：取PCR扩增中的产物1.0～5.0μL；点样于0.8～1.5％琼脂糖凝胶外加0.005％核酸染料(如溴化乙锭、GelGreen、SYBR GreenⅠ、GoldView、GelRed和GelGreen等)；在5V/cm电压下电泳约40～55分钟，取出于凝胶成像系统里观察结果并拍照保存。

5)数据分析及结果判定：根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析判读结果，仅有1.8kb条带时，结果为正常野生型；同时有1.8kb和1.3kb两条带时结果为SEA等位基因杂合子；同时有1.8kb和1.5kb两条带时结果为4.2等位基因杂合子；同时有1.8kb和2.1kb两条带时结果为3.7等位基因杂合子；同时有1.8kb和1.1kb两条带时结果为THA等位基因杂合子；仅有一条带1.3kb或1.5kb或2.1kb或1.1kb条带时，结果为SEA等位基因纯合子或者4.2等位基因纯合子或者3.7等位基因纯合子或者THAI等位基因纯合子；同时有1.3kb和1.5kb两条带时结果为SEA等位基因杂合4.2等位基因，同时有1.3kb和2.1kb两条带时结果为SEA等位基因杂合3.7等位基因，同时有1.5kb和2.1kb两条带时结果为4.2等位基因杂合3.7等位基因，同时有1.1kb和1.5kb两条带时结果为THAI等位基因杂合4.2等位基因，同时有1.1kb和2.1kb两条带时结果为THAI等位基因杂合3.7等位基因，同时有1.3kb和1.1kb两条带时结果为SEA等位基因杂合THAI等位基因。

上述方法的步骤1)中，采用新鲜采集的抗凝外周血或者(-20℃或者-80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血)或者培养羊水细胞或者DBS样本为模板。检测胚胎绒毛组织、羊水或脐带血时须避免母体血污染，采用其他相关鉴定实验排除。

上述方法的步骤1)中的滤纸片干血斑样品采集与制备保存：①、使用Whatman 903滤纸片(或者普通滤纸片)。在滤纸片上标记受检者编号和收集日期。②、末梢血和抗凝血均可用于滤纸片干血斑样品制作。如果从末梢血制备滤纸片干血斑，采集部位为足弓、耳垂或手指。用70％乙醇或酒精棉消毒采血部位，用消过毒的针头小心刺破皮肤。弃去第一滴末梢血。将第二滴血点在滤纸片中央的圆圈内，大约每孔需要50～80μl全血，保证滴满圆圈。每个样品应点满一张滤纸片的每个孔。如从抗凝血制备滤纸片干血斑，移液器吸取50～80μl抗凝血血样，对准滤纸片印圈的中心处，将血样滴在滤纸上。应滴满一张滤纸片的每个孔。③、血液滤纸片于室温下自然干燥至少4小时(在潮湿气候下至少24小时)，不要加热血片或将他们堆叠在一起，干燥过程中不要与其它界面接触。在滤纸片血斑充分干燥后，将滤纸片放入密封袋中，避免滤纸之间标本的相互污染。④、完整包装的DBS样品可在室温下避光储存2周。未及时检测的DBS样品存放冰箱在-20℃或以下待检。

上述方法的步骤2)中，反应体系中各组分的浓度优选为：外周血(羊水)模板：1～4μl(待检测DNA：1～4ng/μL)；各引物：0.1～1μmol/L，MgCl₂浓度为1.5～5mM/L，dNTP的浓度为100～500μM/L，DNA聚合酶的浓度为1～4U/反应。反应体系的终体积优选为20μL。上述方法的步骤3)中，PCR扩增条件优选为表1，所有循环结束后进行琼脂糖凝胶电泳分析。

与现有技术相比，本发明的特点在于：

1、本发明所述试剂盒可以实现单管单次闭管反应完成缺失型地中海贫血等位基因的检测，进行缺失型地中海贫血检测只需要约3h，比其他方法整体流程节约2-3h，具有快捷简洁、高度的稳定性、灵敏性和准确性，特异性。

2、当本发明所述试剂盒应用于Direct PCR法中以检测缺失型地中海贫血等位基因时，无需开管操作，极大限度地降低实验室PCR产物污染的可能；另一方面，采用琼脂糖凝胶电泳法，该方法是目前使用PCR分子诊断技术中最廉价的实验体系构建方法，成本更低，不需要昂贵的仪器和探针设计，各级实验室和医院都易开展，更易于推广。

采用本发明所述试剂盒用于Direct PCR分析法进行4种缺失型地中海贫血等位基因(--^SEA、--^THAI、-α^3.7和-α^4.2)检测，结果准确；而且野生型样本只能检测出正常条带，具有较高的特异性，结果直观。

本发明的检测试剂盒采用Direct PCR法进行缺失型地中海贫血检测，闭管操作，无需提取DNA操作，避免DNA交叉污染和降解。整个流程仅需要约3h，且本发明的检测试剂盒的检测结果与经核酸提取DNA的普通常规Gap-PCR法检测结果一致，而核酸提取DNA的普通常规Gap-PCR法检测则需要4.5h以上，而且花费成本较高，操作繁琐，DNA易相互污染和降解。因此，Direct PCR法检测缺失型地中海贫血方面具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于常见缺失型地中海贫血的检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中琼脂糖凝胶电泳结果；M：250bp DNA Ladder(Dye Plus)(Takara Code No.3424A)；1：--^SEA杂合子；2：正常野生型；3：--^THAI杂合子；4：-α^4.2杂合子；5：-α^3.7杂合子；6：--^SEA/-α^3.7；7：--^SEA纯合子；8：阴性对照。

图2为本发明实施例2中琼脂糖凝胶电泳结果；M：250bp DNA Ladder(Dye Plus)(Takara Code No.3424A)；1：阴性对照；2：--^SEA杂合子；3：正常野生型；4：--^THAI杂合子；5：-α^4.2杂合子；6：-α^3.7杂合子；7：--^SEA/-α^3.7双杂合子；8：--^SEA纯合子。

图3为本发明实施例3中琼脂糖凝胶电泳结果；M：1kb DNA Ladder(Dye Plus)(Takara Code No.3426A)；1：阴性对照；2：--^SEA杂合子；3：正常野生型；4：--^THAI杂合子；5：-α^4.2杂合子；6：-α^3.7杂合子。

图4为本发明实施例4中琼脂糖凝胶电泳结果；M：1kb DNA Ladder(Dye Plus)(Takara Code No.3426A)；1：阴性对照；2：--^SEA杂合子；3：正常野生型；4：--^THAI杂合子；5：-α^4.2杂合子；6：-α^3.7杂合子。

图5为本发明实施例5中琼脂糖凝胶电泳结果；M：1kb DNA Ladder(Dye Plus)(Takara Code No.3426A)；1：-α^3.7杂合子(羊水)；2：-α^4.2纯合子(DBS)；3：-α^4.2/--^SEA双杂合子(DBS)；4：--^SEA纯合子(DNA)；5：--^THAI/-α^3.7双杂合子(DNA)；6：--^SEA杂合子(全血)；7：正常野生型(全血)；8：--^THAI杂合子(全血)；9：-α^4.2杂合子(全血)；10：-α^3.7杂合子(全血)。

图6为本发明实施例6中琼脂糖凝胶电泳结果；(A)：为全血样本，M：1kb DNALadder(Dye Plus)(Takara Code No.3426A)；(B)：为全血样本对应提纯DNA，M：亚能生物技术(深圳)有限公司配套DNA marker；1：--^SEA杂合子；2：正常野生型；3：--^THAI杂合子；4：-α^4.2杂合子；5：-α^3.7杂合子；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。

仪器设备

PCR反应所用仪器：PCR热循环仪，如ABI热循环仪、Bio-Rad热循环仪C1000或者T100或者杭州晶格基因扩增PCR仪等。

试剂与耗材

DNA Ladder(Dye Plus)购自Takara公司，货号：Takara Code No.3424A；

MightyAmp^TM DNA Polymerase与MightyAmp^TM DNA Polymerase配套的缓冲液均购自宝生物工程(大连)有限公司；

生物材料的来源

本发明实施例中使用的所有与人体相关的血液/体液样本，如：抗凝外周血、脐带血、羊水、脐血或胚胎绒毛组织等生物样本来自广西壮族自治区人民医院。

实施例1.采用本发明所述试剂盒在已知基因型样本中的检测结果

1、试剂盒的组成：

可以扩增α-珠蛋白基因簇中四种常见缺失型等位基因与正常基因(NG_000006.1)的特征序列的引物组THAIF、THAIR、SEAF、SEAR、4.2F、4.2R、3.7F、3.7R、APF和APR,其碱基序列见表2：

表2 4种缺失型α-地贫等位基因的特征序列的引物

优选地，所述引物组中各引物摩尔浓度比例为：

或者，优选的，按下述表3配制PCR反应体系(引物工作浓度10μmol/L，MightyAmpDNA Polymerase为1.25U/μL)：

利用正交试验方法，通过大量的实验对比，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应液配方及体系见表3：PCR反应液18μl，外周血(胚胎胚胎绒毛组织组织、羊水或脐带血)等样本加样量2μl，反应总体积为20μl。

表3 PCR反应液配方体系及反应条件：

2、实施方法：

优选的，PCR反应程序见表1，所有循环结束后进行琼脂糖凝胶电泳分析。

样本采集：抗凝外周血、脐带血等标本。

样本检测：将用常规方法检测确定的已知基因型待检样本(全血或提纯DNA)，根据上述反应体系和反应程序，于PCR仪上进行扩增检测，所有循环结束后进行琼脂糖凝胶电泳分析。

3、样本来源：所有样本均来源自经常规Gap-PCR技术确定基因型的抗凝外周血样本。

4、数据分析及结果判定：数据分析及结果判定：根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析判读结果，仅有1.8kb条带时，结果为正常野生型；同时有1.8kb和1.3kb两条带时结果为SEA等位基因杂合子；同时有1.8kb和1.5kb两条带时结果为4.2等位基因杂合子；同时有1.8kb和2.1kb两条带时结果为3.7等位基因杂合子；同时有1.8kb和1.1kb两条带时结果为THA等位基因杂合子；仅有一条带1.3kb或1.5kb或2.1kb或1.1kb条带时，结果为SEA等位基因纯合子或者4.2等位基因纯合子或者3.7等位基因纯合子或者THAI等位基因纯合子；同时有1.3kb和1.5kb两条带时结果为SEA等位基因杂合4.2等位基因，同时有1.3kb和2.1kb两条带时结果为SEA等位基因杂合3.7等位基因，同时有1.5kb和2.1kb两条带时结果为4.2等位基因杂合3.7等位基因，同时有1.1kb和1.5kb两条带时结果为THAI等位基因杂合4.2等位基因，同时有1.1kb和2.1kb两条带时结果为THAI等位基因杂合3.7等位基因，同时有1.3kb和1.1kb两条带时结果为SEA等位基因杂合THAI等位基因。

本实施例中的检测样本也可以采集人体体液、胚胎的遗传物质、或人体基因组DNA作为PCR反应模板，所述人体体液选自下述物质的一种或多种：羊水、胚胎绒毛组织、浆膜腔液、关节液、唾液；所述胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞，即囊胚细胞。采用上述体液样品中的任一种，或者胚胎的遗传物质样品中的任一种，或者采用人体基因组DNA，通过本发明所提供的引物组或试剂盒，采用相同的PCR方法，能获得同样的实验结果，达到同样的检测目的，本文不再一一赘述。

实施例2.本发明所述试剂盒在DBS样本中的检测效果。

1、试剂盒的组成：

同实施例1。

优选的，按下述表3配制PCR反应体系：

利用正交试验方法，通过大量的实验对比，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应液配方见表3：PCR反应液18μl，DBS样本1-3片(直径1-2mm)(补水2μl)，反应总体积为20μl。

2、实施方法：

同实施例1。

3、样本来源：

所有样本均来源自经常规Gap-PCR技术确定基因型的抗凝外周血样本，均经滤纸片干血斑样品采集与制备。采用双盲实验进行检测。用打孔器在样品区截取一个小圆片(直径：1-2mm)。4、滤纸片干血斑样品(DBS)采集与制备：①、使用Whatman903滤纸片(或者普通滤纸片)。在滤纸片上标记受检者编号和收集日期。②、末梢血和抗凝血均可用于滤纸片干血斑样品制作。如果从末梢血制备滤纸片干血斑，采集部位为足弓、耳垂或手指。用70％乙醇或酒精棉消毒采血部位，用消过毒的针头小心刺破皮肤。弃去第一滴末梢血。将第二滴血点在滤纸片中央的圆圈内，大约每孔需要50～80μl全血，保证滴满圆圈。每个样品应点满一张滤纸片的每个孔。如从抗凝血制备滤纸片干血斑，移液器吸取50～80μl抗凝血血样，对准滤纸片印圈的中心处，将血样滴在滤纸上。应滴满一张滤纸片的每个孔。③、血液滤纸片于室温下自然干燥至少4小时(在潮湿气候下至少24小时)，不要加热血片或将他们堆叠在一起，干燥过程中不要与其它界面接触。在滤纸片血斑充分干燥后，将滤纸片放入密封袋中，避免滤纸之间标本的相互污染。④、完整包装的DBS样品可在室温下避光储存2周。未及时检测的DBS样品存放冰箱在-20℃或以下待检。

5、数据分析及结果判定：同实施例1。

本实施例中的DBS样品还可以替换成：滤纸片干羊水样品、滤纸片干浆膜腔液样品、滤纸片干关节液样品、滤纸片干唾液样品、滤纸片干胚胎的遗传物质样品、和/或滤纸片干基因组DNA样品，上述各滤纸片干体液/DNA样品制备方法同DBS样品的常规制备方式，并且，采用相同的引物组、相同的PCR方法能获得相同的实验结果，本文中不再一一赘述。

实施例3.本发明所述试剂盒在羊水样本(或经培养的羊水样本)的检测效果。

1、试剂盒的组成：

同实施例1。

按表3配制PCR反应体系：

2、实施方法：

同实施例1。

3、样本来源：

所有样本均来源自经常规Gap-PCR技术确定基因型的羊水样本。

4、数据分析及结果判定：同实施例1。

实施例4.本发明所述试剂盒在脐血或胚胎绒毛组织中的检测效果。

1、试剂盒的组成：

同实施例1。

按表1配制PCR反应体系：

2、实施方法：

同实施例1。

3、样本来源：

所有样本均来源自经常规Gap-PCR技术确定基因型的脐血样本。

4、数据分析及结果判定：同实施例1。

实施例5.采用双盲实验，本发明所述试剂盒在不同直接模板类型中的检测效果。

1、试剂盒的组成：

同实施例1。

按表1配制PCR反应体系：

2、实施方法：

采用双盲实验，其他同实施例1。

3、样本来源：

所有样本均来源自经第三方提供的常规Gap-PCR技术确定基因型(研究者不知道)不同类型样本。

4、数据分析及结果判定：同实施例1。

实施例6.本发明所述试剂盒在同一标本分别采用全血和提纯DNA模板(加入相同模板量)类型中的检测效果。

1、试剂盒的组成：

同实施例1。

按表1配制PCR反应体系：

2、实施方法：

DNA提纯按照天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒(货号：DP318-02)说明书进行提纯。其他同实施例1。

3、样本来源：

所有样本均来源自经第三方提供的常规Gap-PCR技术确定基因型不同模板类型样本。

4、数据分析及结果判定：同实施例1。

产品性能指标

1测定准确性

收集10份阴性样本和30份地贫样本，选择低、中、高3个浓度，每个浓度重复3次，分别用3批产品来检测，分别计算阴性和阳性符合率。结果显示相应的基因型，研究结果与采用深圳益生堂生物企业有限公司的缺失型α-地中海贫血基因诊断试剂盒(PCR法)试剂盒检测结果完全符合，产品阳性符合率和阴性符合率都达100％。

2分析灵敏度

采用本发明试剂盒对4种α-地贫检测位点进行灵敏度分析，每个样本包含7个浓度梯度，确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为10ng/μL。

3分析特异性

通过干扰筛查试验，临床正常剂量的EDTA、枸橼酸钠不是本品的干扰物质；溶血样本不会干扰本试剂盒检测结果；脂血样本中甘油三酯(14.1mmol/L)和黄疸样本(360.4mmol/L)对本品检测无干扰。

用本产品检测8例本产品检测范围外的临床样本，包括1例α-地贫阴性样本、2例β-地中海贫血临床样本、2例缺铁性贫血临床样本、2例G-6-PD临床样本，1例感染支原体临床样本，均无交叉反应。

4重复性

采用本发明试剂盒不同批号产品，不同人(2人)操作，同一天做2次，共做2天，每个参考品每次试验重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测α-地贫基因型，结果显示一致。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 陈治中

<120> 用于检测缺失型α-地中海贫血的引物组及试剂盒

<130> P170156/CZZ

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> APF/ 3.7F

<400> 1

ctgtcctttc cctacccaga gc 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> APR

<400> 2

tccattgttg gcacattccg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> SEAF

<400> 3

ccttcaccct cccacagttc c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> SEAR

<400> 4

cgtcaccctc agagccatca c 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> THAIF

<400> 5

tgcggtcagc agcacttcc 19

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> THAIR

<400> 6

tcaccaccac ctgtgtagga gtg 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 4.2F

<400> 7

ggtttaccca tgtggtgcct c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 4.2R

<400> 8

aggcggagtt tcgctgttgt 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 3.7R

<400> 9

cagccagttc ttggcacaag ag 22

Claims

1.用于检测缺失型α-地中海贫血的引物组，包括如下引物对：

上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9所示的3.7F/3.7R；

上下游引物序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的SEAF/SEAR；

上下游引物序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的THAIF/THAIR；

上下游引物序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的4.2F/4.2R；

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述检测指以人体血液、和/或体液、和/或胚胎的遗传物质、和/或人体基因组DNA为模板，用所述引物组进行PCR扩增后，将所得扩增产物进行电泳即可获知结果。

3.用于快速检测缺失型α-地中海贫血的试剂盒，包括权利要求1所述的引物组。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述快速检测指，直接以人体血液和/体液或和/或胚胎的遗传物质为模板，用所述引物组进行PCR扩增后，将所得扩增产物进行电泳即可获知结果。

5.根据权利要求2-4任一所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于进行PCR和/或电泳的试剂。

6.根据权利要求2-5任一所述的试剂盒，其特征在于，所述用于进行PCR的试剂包括引物、dNTP、DNA聚合酶、缓冲液、双蒸水、MgCl₂；

所述用于进行电泳的试剂包括琼脂糖、蒸馏水、核酸染料；

所述核酸染料选自：EB、GelGreen、SYBR Green Ⅰ、GoldView、GelRed和GelGreen。

7.根据权利要求2-5任一所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR的反应体系为：1～4μl模板、各引物：0.1～1μmol/L、MgCl₂浓度为1.5～5mM/L、dNTP的浓度为100～500μM/L、DNA聚合酶的浓度为1～4U/反应；

进一步优选地，所述PCR反应体系如下：MightyAmp Taq 0.5μl、2×MightyAmp Buffer10μl、APF/3.7F 0.9μl、APR 0.5μl、4.2F 0.3μl、4.2R 0.3μl、3.7R 0.4μl、SEA-F 0.2μl、SEA-R 0.2μl、THAI-F 0.2μl、THAI-R 0.2μl、模板+超纯水6.3μl；

优选地，所述引物组中各引物摩尔浓度比例为：

8.根据权利要求4或7所述的试剂盒，其特征在于，所述模板还包括固定在固体载体上的人体血液、和/或体液、和/或胚胎的遗传物质、和/或提纯基因组DNA；

优选地，所述模板可以选自滤纸片干血斑样品、滤纸片干羊水样品、滤纸片干浆膜腔液样品、滤纸片干关节液样品、滤纸片干唾液样品、滤纸片干基因组DNA样品、滤纸片干胚胎的遗传物质样品。

9.根据权利要求4或8所述的试剂盒，其特征在于，所述人体体液选自下述物质的一种或多种：羊水、胚胎绒毛组织、浆膜腔液、关节液、唾液；所述血液包括外周血、脐带血、末梢血；所述胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞，即囊胚细胞。

10.权利要求1所述的引物组，和/或，权利要求2-9所述的试剂盒在制备缺失型α-地中海贫血检测试剂方面的用途，其特征在于，在标有缺失型α-地中海贫血检测用途的包装内放入所述引物组，和/或，在装有所述引物组的容器上标有缺失型α-地中海贫血检测用途。