CN106399478A - 一种荧光探针PCR 法快速检测α/β‑地中海贫血的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于荧光探针PCR法快速检测α/β‑地中海贫血的引物和探针的组合，包含所述组合的试剂盒。本发明还涉及用于所述PCR法的PCR反应液。所述PCR反应液包括缓冲液、酶液、引物、探针、MgCl2和dNTP成分。本发明提供了所述PCR反应液各成分的最佳配比浓度。本发明还提供了相关PCR条件。本发明仅通过一次PCR扩增即可同时对多种疾病基因型进行检测，操作简单，耗时短，结果稳定，特异性强。
Description
发明领域
本发明涉及医学检测领域，具体涉及一种荧光探针PCR法快速检测疾病的试剂盒，所述疾病优选为α/β-地中海贫血，以及相关PCR方法。
发明背景
地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一，也是我国长江以南各省发病率最高，影响最大的遗传病之一。地中海贫血是由于珠蛋白基因的缺失或点突变使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成，导致血红蛋白的组分改变，肽链失平衡，导致RBC寿命缩短及过早破坏所致的慢性溶血性贫血。通常将地中海贫血分为α、β、δβ和δ等4种类型，其中α和β地中海贫血是最主要的地中海贫血类型。有研究表明，我国地中海贫血严重的地区是两广、云南、海南、四川、贵州、香港、台湾等，其中广西地中海贫血携带率高达21.73％。
α-地中海贫血(α-mediterranean anemia)是由于α-珠蛋白基因的缺失或功能缺陷(点突变)而导致α-珠蛋白链合成障碍所引起的一组溶血性贫血。α-珠蛋白基因为常染色体不完全显性遗传，其位于16号染色体短臂(16P13.33～p13.11～pter)，总长约29kb，包含7个连锁的α类基因或假基因。缺失型α-地中海贫血的分子缺陷包含α-珠蛋白基因在内的DNA片段的大片段缺失，其缺失范围从几kb到100kb以上不等，目前在世界上不同种族中已发现至少有35种此类缺失，其中在中国人中，29种为α-地中海贫血1基因，6种为α-地中海贫血2基因。其中在广西，最常见类型包括右缺(-α3.7)、左缺(-α4.2)和东南亚缺失(--SEA)。非缺失型α-地中海贫血，是由于α-基因核苷酸的“点突变”致基因功能缺陷。目前中国常见的非缺失型α-地中海贫血包括：αConstantSpringα(αCSα)：其为α2基因终止密码突变，使α链延长为172个氨基酸，这种突变基因转录的mRNA不稳定，易被破坏，导致α珠蛋白链合成减少；αQuongSzeα(αQSα)：其为α2基因第125密码子CTG(亮氨酸)突变为CCG(脯氨酸)，导致翻译后肽链不稳定，易被蛋白酶水解；αWestmeadα(αWSα)：其为α2基因第122密码子CAC(组氨酸)突变为CAG(谷氨酰胺)。
β-地中海贫血(β-mediterranean anemia)是由于β-珠蛋白基因的缺失或功能缺陷(点突变)而导致β-珠蛋白链合成障碍所引起的溶血性贫血。β-珠蛋白基因为常染色体不完全显性遗传，其位于11号染色体上，每条染色体上有1个基因。多数β-地中海贫血为基因突变所致，目前在全世界已发现了近200多种突变类型，中国人群中共发现约48种，其中常见的6种基因突变(突变位点分别为41-42M、-28M、71-72M、17M、βEM、654M)占90％以上，此外，突变位点31M、14-15M、43M、27/28M、IVS-I-1M、IVS-I-5M、CAPM、IntM、-30M、-29M、-32M在广西、广东等地区为临床少见突变类型。
α/β地中海贫血基因检测的常见诊断方法有跨越断裂点的PCR技术(Gap-PCR)、溶解曲线法、多重PCR法、多重连接依赖式探针扩增技术MLPA、PCR结合反向点杂交法。现简介如下：
(一)跨越断裂点的PCR技术
跨越断裂点的PCR技术(Gap-PCR)是目前缺失型地中海贫血最常用的检测方法，该法是在缺失基因片段两端分别设计正向引物和反向引物，再通过琼脂糖凝胶电泳，根据电泳片段大小判断检测样品的基因型。
(二)溶解曲线法
溶解曲线法是指待检DNA通过Gap-PCR扩增后，加一个溶解曲线的反应程序得到溶解曲线图，获得不同的Tm值，从而判定地中海贫血的基因型。
(三)PCR结合反向点杂交法
针对突变位点设计特异性带有生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增产物与固定在膜条上寡核苷酸探针进行杂交，通过显色反应分析突变位点。
以上方法的缺点是，溶解曲线法结果判定特异性、准确性差；Gap-PCR和PCR结合反向点杂交法操作步骤繁杂，易造成实验和环境的污染，且不适于大样本量检测。
目前α和β地中海贫血尚无有效的治疗方法，但可预防，通过产前筛查和诊断，可减少甚至基本杜绝重型或中间型地中海贫血症胎儿的出生，从而减轻社会和家庭负担，提高出生素质。由于基因诊断取材不受组织器官等特异性限制，怀孕早期的绒毛、中期的羊水、血液样本均可用于检测。如前所述，地中海贫血检测常见诊断方法有跨越断裂点的PCR技术(Gap-PCR)、溶解曲线法、多重PCR法、多重连接依赖式探针扩增技术MLPA、PCR结合反向点杂交法，但这些方法费时费力，在检验人员人手不足或样本量很多时，这个缺点就显得非常明显，大大降低了医院检验科的检测效率，无形之中也就增加了成本。
发明简述
本发明人经过大量实验研究，出乎意料地发现仅通过一次PCR扩增即可同时对多种疾病基因型进行检测，其操作简单，耗时短，结果稳定，特异性强。
因此，本发明提供用于荧光探针PCR法快速检测α/β-地中海贫血的引物和探针的组合。
本发明还提供包含上述引物和探针的组合的试剂盒。
本发明进一步提供包含PCR反应液的试剂盒。
所述PCR反应液包括缓冲液、酶液、引物、探针、MgCl2和dNTP成分。
本发明还提供使用前述任一项所述的试剂盒进行PCR扩增的方法，该方法包括：预反应，预变性，变性，退火，循环扩增，荧光信号采集。
所述方法包括：第一步：50℃预反应，2min；第二步：95℃预变性，1min；第三步：95℃变性，15sec，60℃退火，1min，39个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。
附图说明
图1：应用检测右缺(-α3.7)与左缺(-α4.2)基因型的三对引物及探针的扩增曲线及△Cq值柱形示意图。
图2：应用检测东南亚缺失(--SEA)基因型引物及探针的扩增曲线示意图。
图3：检测突变型α-地中海贫血基因型的扩增曲线示意图。
图4：检测突变型β-地中海贫血基因型的扩增曲线示意图。
发明详述
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明针对每种基因型设计相应的荧光探针，通过一次PCR扩增同时检测α-地中海贫血常见的3种缺失型、3种突变基因型和17种β突变基因型，具有高度的灵敏性、稳定性、准确性和特异性。
本发明只需加入待测DNA模板，极大地缩减实验操作步骤，以便于减少污染及适合大样本量检测。
在一个方面，本发明提供引物和探针的组合，其用于荧光探针PCR法快速检测α/β-地中海贫血。
目前检测缺失型α-地中海贫血基因型引物的设计主要在缺失位点两侧设计长扩增片段(例如Gap-PCR法)和在α1基因和α2基因保守区域设计引物(例如荧光定量PCR法)，均由单一扩增片段进行基因分型，但本申请设计的缺失型α-地中海贫血(-α3.7和-α4.2)基因型通过两对引物与内参基因比较共同检测进行分析，准确性、特异性更高。针对突变位点，本申请分别设计了正常探针和突变探针，不需要进行熔解曲线分析，且扩增条件与缺失型α-地中海贫血基因型一致。
所述引物和探针包括右缺(-α3.7)和左缺(-α4.2)基因型引物及探针的设计，其设计原理为:在右缺(-α3.7)的缺失范围内设计α1引物及探针(α1-F、α1-R和Probe-α1)，在右缺(-α3.7)与左缺(-α4.2)重叠缺失范围内设计α2引物及探针(α2-F、α2-R和Probe-α2)，同时设计内参基因(LIS1)的引物及探针，由这三对引物及探针共同判定右缺(-α3.7)和左缺(-α4.2)基因型；东南亚缺失(--SEA)基因型引物及探针的设计原理为：在缺失的两侧设计上下游引物及探针(SEA-F、SEA-R和Probe-SEA)，检测--SEA基因型；对于其它突变基因型，其引物及探针设计原理为：在突变位点的两侧设计上下游引物，在突变位点同时设计正常位点探针及突变位点探针，检测突变基因型。
作为一个实施方案，本发明提供用于荧光探针PCR法快速检测α/β-地中海贫血的引物和探针的组合，其中包括：
检测α-珠蛋白基因簇中-α3.7缺失型、-α4.2缺失型、--SEA缺失型、αCSα突变型、αQSα突变型、αWSα突变型的扩增引物和荧光探针，以及
检测β-珠蛋白基因簇中17种突变型的扩增引物和荧光探针，这17种突变型为41-42M突变型、-28M突变型、71-72M突变型、17M突变型、βEM突变型、654M突变型、31M突变型、14-15M突变型、43M突变型、27/28M突变型、IVS-I-1M突变型、IVS-I-5M突变型、CAPM突变型、IntM突变型、-30M突变型、-29M突变型、-32M突变型。
作为优选实施方案，所述组合包括：
检测α-珠蛋白基因簇中-α3.7和-α4.2缺失型的正向引物包含SEQID No.1和SEQ IDNo.3所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中-α3.7和-α4.2缺失型的反向引物包含SEQID No.2和SEQ IDNo.4所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中-α3.7缺失型的探针包含SEQ ID No.5所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中-α4.2缺失型的探针包含SEQ ID No.6所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中--SEA缺失型的正向引物包含SEQ ID No.10所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中--SEA缺失型的反向引物包含SEQ ID No.11所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中--SEA缺失型的探针包含SEQ ID No.12所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αCSα突变型的正向引物包含SEQ ID No.13所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αCSα突变型的反向引物包含SEQ ID No.14所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αQSα突变型的正向引物包含SEQ ID No.15所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αQSα突变型的反向引物包含SEQ ID No.16所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αWSα突变型的正向引物包含SEQ ID No.17所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αWSα突变型的反向引物包含SEQ ID No.18所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αCSα突变型的正常探针包含SEQ ID No.19所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αCSα突变型的突变探针包含SEQ ID No.20所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αQSα突变型的正常探针包含SEQ ID No.21所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αQSα突变型的突变探针包含SEQ ID No.22所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αWSα突变型的正常探针包含SEQ ID No.23所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αWSα突变型的突变探针包含SEQ ID No.24所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中41-42M突变型的正向引物包含SEQ IDNo.25所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中41-42M突变型的反向引物包含SEQ IDNo.26所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-28M突变型的正向引物包含SEQ ID No.27所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-28M突变型的反向引物包含SEQ ID No.28所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中71-72M突变型的正向引物包含SEQ IDNo.29所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中71-72M突变型的反向引物包含SEQ IDNo.30所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中17M突变型的正向引物包含SEQ ID No.31所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中17M突变型的反向引物包含SEQ ID No.32所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中βEM突变型的正向引物包含SEQ ID No.33所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中βEM突变型的反向引物包含SEQ ID No.34所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中654M突变型的正向引物包含SEQ ID No.35所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中654M突变型的反向引物包含SEQ ID No.36所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中31M突变型的正向引物包含SEQ ID No.37所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中31M突变型的反向引物包含SEQ ID No.38所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中14-15M突变型的正向引物包含SEQ IDNo.39所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中14-15M突变型的反向引物包含SEQ IDNo.40所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中43M突变型的正向引物包含SEQ ID No.41所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中43M突变型的反向引物包含SEQ ID No.42所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中27/28M突变型的正向引物包含SEQ IDNo.43所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中27/28M突变型的反向引物包含SEQ IDNo.44所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-1M突变型的正向引物包含SEQ IDNo.45所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-1M突变型的反向引物包含SEQ IDNo.46所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-5M突变型的正向引物包含SEQ IDNo.47所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-5M突变型的反向引物包含SEQ IDNo.48所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中CAPM突变型的正向引物包含SEQ IDNo.49所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中CAPM突变型的反向引物包含SEQ IDNo.50所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IntM突变型的正向引物包含SEQ ID No.51所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IntM突变型的反向引物包含SEQ ID No.52所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-30M突变型的正向引物包含SEQ ID No.53所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-30M突变型的反向引物包含SEQ ID No.54所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-29M突变型的正向引物包含SEQ ID No.55所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-29M突变型的反向引物包含SEQ ID No.56所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-32M突变型的正向引物包含SEQ ID No.57所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-32M突变型的反向引物包含SEQ ID No.58所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中41-42M突变型的正常探针包含SEQ IDNo.59所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中41-42M突变型的突变探针包含SEQ IDNo.60所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-28M突变型的正常探针包含SEQ ID No.61所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-28M突变型的突变探针包含SEQ ID No.62所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中71-72M突变型的正常探针包含SEQ IDNo.63所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中71-72M突变型的突变探针包含SEQ IDNo.64所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中17M突变型的正常探针包含SEQ ID No.65所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中17M突变型的突变探针包含SEQ ID No.66所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中βEM突变型的正常探针包含SEQ ID No.67所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中βEM突变型的突变探针包含SEQ ID No.68所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中654M突变型的正常探针包含SEQ ID No.69所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中654M突变型的突变探针包含SEQ ID No.70所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中31M突变型的正常探针包含SEQ ID No.71所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中31M突变型的突变探针包含SEQ ID No.72所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中14-15M突变型的正常探针包含SEQ IDNo.73所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中14-15M突变型的突变探针包含SEQ IDNo.74所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中43M突变型的正常探针包含SEQ ID No.75所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中43M突变型的突变探针包含SEQ ID No.76所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中27/28M突变型的正常探针包含SEQ IDNo.77所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中27/28M突变型的突变探针包含SEQ IDNo.78所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-1M突变型的正常探针包含SEQ IDNo.79所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-1M突变型-A的突变探针包含SEQID No.80所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-1M突变型-T的突变探针包含SEQID No.81所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-5M突变型的正常探针包含SEQ IDNo.82所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-5M突变型的突变探针包含SEQ IDNo.83所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中CAPM突变型的正常探针包含SEQ IDNo.84所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中CAPM突变型的突变探针包含SEQ IDNo.85所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IntM突变型的正常探针包含SEQ ID No.86所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IntM突变型的突变探针包含SEQ ID No.87所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-30M突变型的正常探针包含SEQ ID No.88所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-30M突变型的突变探针包含SEQ ID No.89所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-29M突变型的正常探针包含SEQ ID No.90所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-29M突变型的突变探针包含SEQ ID No.91所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-32M突变型的正常探针包含SEQ ID No.92所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-32M突变型的突变探针包含SEQ ID No.93所示的序列。
作为优选实施方案，所述组合还包括内参基因的扩增引物和荧光探针。
作为优选实施方案，其中：
内参基因的正向引物包含SEQ ID No.7所示的序列；
内参基因的反向引物包含SEQ ID No.8所示的序列；
内参基因的探针包含SEQ ID No.9所示的序列。
作为优选实施方案，其中所述探针的5’端标记有荧光报告基团，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
作为优选实施方案，其中荧光探针分别为：
Probe-α1：5'-FAM-TGCCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGC-BHQ1-3'；
Probe-α2：5'-HEX-TGAATAAAGTCTGAGTGGGCAGCAGCCTGTG-BHQ1-3'；
Probe-SEA：5'-FAM-AGGGGAGAAGCTGAGTGATGGGTCCG-BHQ1-3'；
Probe-CSN：5'-HEX-CACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAAGC-BHQ1-3'；
Probe-CSM：5'-FAM-CACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTCAAGC-BHQ1-3'；
Probe-QSN：5'-HEX-CTGCGGTGCACGCCTCCCTGGA-BHQ1-3'；
Probe-QSM：5'-FAM-CTGCGGTGCACGCCTCCCCGGA-BHQ1-3'；
Probe-WSN：5'-HEX-CTGCGGTGCACGCCTCCCTGGA-BHQ1-3'；
Probe-WSM：5'-FAM-CTGCGGTGCAGGCCTCCCTGGA-BHQ1-3'；
Probe-41-42N：5'-HEX-AGGACTCAAAGAACCTCT-BHQ1-3'；
Probe-41-42M：5'-FAM-CAAAGGACTCAACCTCT-BHQ1-3'；
Probe-28N：5'-HEX-CCCTGACTTTTATGCCC-BHQ1-3'；
Probe-28M：5'-FAM-CCTGACTTCTATGCCC-BHQ1-3'；
Probe-71-72N：5'-HEX-TCGGTGCCTTTAGTG-BHQ1-3'；
Probe-71-72M：5'-FAM-CGGTGCCTTTAAGTG-BHQ1-3'；
Probe-17N：5'-HEX-CACGTTCACCTTGCCCCA-BHQ1-3'；
Probe-17M：5'-FAM-ACGTTCACCTAGCCCCA-BHQ1-3'；
Probe-βEN：5'-HEX-TGGTGGTGAGGCCCT-BHQ1-3'；
Probe-βEM：5'-FAM-TTGGTGGTAAGGCCCT-BHQ1-3'；
Probe-654N：5'-HEX-AGATATTGCTATTGCCTTAAC-BHQ1-3'；
Probe-654M：5'-FAM-AGATATTGCTATTACCTTAAC-BHQ1-3'；
Probe-31N：5'-HEX-CACCAGCAGCCTAAG-BHQ1-3'；
Probe-31M：5'-FAM-CCACCAGCACCTAAG-BHQ1-3'；
Probe-14-15N：5'-HEX-CGTTACTGCCCTGTGG-BHQ1-3'；
Probe-14-15M：5'-FAM-CGTTACTGCCCTGGTG-BHQ1-3'；
Probe-43N：5'-HEX-AGAGGTTCTTTGAGTCCTT-BHQ1-3'；
Probe-43M：5'-FAM-CAGAGGTTCTTTTAGTCCTT-BHQ1-3'；
Probe-27/28N：5'-HEX-TGAGGCCCCTGGGCAG-BHQ1-3'；
Probe-27/28M：5'-FAM-TGAGGCCCTGGGCAG-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-1N：5'-HEX-CTGGGCAGGTTGGTAT-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-1M-A：5'-FAM-CTGGGCAGATTGGTAT-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-1M-T：5'-FAM-CTGGGCAGTTTGGTAT-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-5N：5'-HEX-CAGGTTGGTATCAAGG-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-5M：5'-FAM-CAGGTTGCTATCAAGG-BHQ1-3'；
Probe-CAPN：5'-HEX-CAACCTCAAACAGACACC-BHQ1-3'；
Probe-CAPM：5'-FAM-TAGCAACCTCAGACACC-BHQ1-3'；
Probe-IntN：5'-HEX-TCAAACAGACACCATGG-BHQ1-3'；
Probe-IntM：5'-FAM-TCAAACAGACACCAGGG-BHQ1-3'；
Probe-30N：5'-HEX-CCCTGACTTTTATGCCCAG-BHQ1-3'；
Probe-30M：5'-FAM-CCTGACTTTTGTGCCCAG-BHQ1-3'；
Probe-29N：5'-HEX-CCCTGACTTTTATGCCC-BHQ1-3'；
Probe-29M：5'-FAM-CCTGACTTTCATGCCC-BHQ1-3'；
Probe-32N：5'-HEX-CCTGACTTTTATGCCCAGCC-BHQ1-3'；
Probe-32M：5'-FAM-CCCTGACTTTTATTCCCAGCC-BHQ1-3'。
在另一个方面，本发明提供包含上述引物和探针的组合的试剂盒。
作为一个实施方案，试剂盒还包含额外的组分。
作为又一个实施方案，所述额外的组分选自缓冲液、酶液、引物、探针、MgCl2、dNTP成分。
作为又一个实施方案，所述额外的组分选自Tris缓冲液、Taq酶、正向引物和反向引物、正常探针和突变探针、MgCl2、dNTP成分。
作为又一个实施方案，所述额外的组分为预冻干形式的组分。
作为一个实施方案，试剂盒包含PCR反应液。
作为又一个实施方案，PCR反应液包括缓冲液、酶液、引物、探针、MgCl2和dNTP成分。
作为又一个实施方案，PCR反应液包括Tris缓冲液的终浓度为20-100mM，MgCl2的终浓度为2-10mM，每种dNTP的终浓度为0.1-0.5mM，Taq酶的终浓度为0.01-0.1U/μL，正向引物和反向引物的终浓度分别为5-15μM，正常探针和突变探针的终浓度分别为1-5μM。
作为又一个实施方案，PCR反应液包括Tris缓冲液的终浓度为50mM，MgCl2的终浓度为5mM，每种dNTP的终浓度为0.2mM，Taq酶的终浓度为0.05U/μL，正向引物和反向引物的终浓度分别为9μM，正常探针和突变探针的终浓度分别为2.5μM。
作为又一个实施方案，所述PCR反应液包括缓冲液、酶液、引物、探针、MgCl2和dNTP成分，按最佳比例配制，并制成预冻干形式的PCR反应液。优选地，所述PCR反应液以18μL/孔的体积加入到96孔板中进行真空冷冻干燥，最终得到PCR预冻干试剂(粉末)。
在另一个方面，本发明提供用于荧光探针PCR法快速检测α/β-地中海贫血的方法，其包括：样本制备；配制反应体系；样本检测；数据分析及结果判定。
作为一个实施方案，样本采取全血样本，抽提样本基因组DNA，制备DNA模板。
作为一个实施方案，将DNA模板和PCR预冻干试剂配成反应体系。
优选地，将DNA模板、助溶剂和PCR预冻干试剂配成反应体系。助溶剂任选地包含水。本领域技术人员理解的是，所述助溶剂可以是任意溶剂或溶液，只要其能够便于将DNA模板和PCR预冻干试剂配制成最终反应体系即可。
作为一个实施方案，将配制的反应体系进行荧光PCR扩增。
在又一个方面，本发明提供使用前述任一项所述的试剂盒进行PCR扩增的方法，该方法包括：预反应，预变性，变性，退火，循环扩增，荧光信号采集。
作为一个实施方案，所述PCR扩增的方法包括：第一步：49-51℃预反应，1-3min；第二步：94-96℃预变性，1-10min；第三步：94-96℃变性，12-20sec，55-62℃退火，0.5-1.5min，30-50个循环，于55-62℃退火步骤末采集荧光信号。
作为又一个实施方案，所述PCR扩增的方法包括：第一步：50℃预反应，2min；第二步：95℃预变性，1min；第三步：95℃变性，15sec，60℃退火，1min，39个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。
本发明的有益效果：
本发明通过一次PCR扩增同时检测α-地中海贫血常见的3种缺失型、3种突变基因型和17种β突变基因型(同一条件，多管检测)，灵敏度高、稳定性好、准确性和特异性均俱佳。本发明的试剂盒只需加入待测DNA模板，极大地缩减实验操作步骤，不易污染并适用于大样本量检测。
实施例
本领域技术人员应当理解的是，以下实施例仅用于示例性描述本发明的实施方案，其不以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1
检测引物和探针
α-地中海贫血检测引物和探针包括检测α-珠蛋白基因簇中-α3.7、-α4.2缺失型的扩增引物α1-F、α1-R、α2-F、α2-R和荧光探针Probe-α1和Probe-α2，内参基因扩增引物LIS1-F、LIS1-R和荧光探针Probe-LIS1，检测α-珠蛋白基因簇中--SEA缺失型的扩增引物SEA-F、SEA-R和荧光探针Probe-SEA。检测α-珠蛋白基因簇中αCSα，αQSα，αWSα突变型的扩增引物CS-F、CS-R、QS-F、QS-R、WS-F、WS-R和荧光探针Probe-CSN、Probe-CSM、Probe-QSN、Probe-QSM、Probe-WSN、Probe-WSM。
β-地中海贫血检测引物和探针包括检测β-珠蛋白基因簇中17种突变型的扩增引物41-42M-F、41-42M-R、-28M-F、-28M-R、71-72M-F、71-72M-R、17M-F、17M-R、βEM-F、βEM-R、654M-F、654M-R、31M-F、31M-R、14-15M-F、14-15M-R、43M-F、43M-R、27/28M-F、27/28M-R、IVS-I-1M-F、IVS-I-1M-R、IVS-I-5M-F、IVS-I-5M-R、CAPM-F、CAPM-R、IntM-F、IntM-R、-30M-F、-30M-R、-29M-F、-29M-R、-32M-F、-32M-R和荧光探针Probe-41-42N、Probe-41-42M、Probe--28N、Probe--28M、71-72N、Probe-71-72M、Probe-17N、Probe-17M、Probe-βEN、Probe-βEM、Probe-654N、Probe-654M、Probe-31N Probe-31M、Probe-14-15N、Probe-14-15M、Probe-43N、Probe-43M、Probe-27/28N、Probe-27/28M、Probe-IVS-I-1N、Probe-IVS-I-1M、Probe-IVS-I-5N、Probe-IVS-I-5M、Probe-CAPN、Probe-CAPM、Probe-IntN、Probe-IntM、Prob--30N、Prob--30M、Probe-29N、Probe-29M、Probe-32N、Probe-32M。
所述引物和探针包括右缺(-α3.7)和左缺(-α4.2)基因型引物及探针的设计，其设计原理为:在右缺(-α3.7)的缺失范围内设计α1引物及探针(α1-F、α1-R和Probe-α1)，在右缺(-α3.7)与左缺(-α4.2)重叠缺失范围内设计α2引物及探针(α2-F、α2-R和Probe-α2)，同时设计内参基因LIS1的引物及探针，由这三对引物及探针共同判定右缺(-α3.7)和左缺(-α4.2)基因型；东南亚缺失(--SEA)基因型引物及探针的设计原理为：在缺失的两侧设计上下游引物及探针(SEA-F、SEA-R和Probe-SEA)，检测--SEA基因型；对于其它突变基因型，其引物及探针设计原理为：在突变位点的两侧设计上下游引物，在突变位点同时设计正常位点探针及突变位点探针，检测突变基因型。探针的5’端标记有荧光报告基团，其3’端标记有荧光淬灭基团。本领域技术人员知晓合适的荧光基团。
引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，本领域技术人员理解的是，这些引物或探针也可由其他公司合成。
作为示例，本实施例提供以下引物和探针：
α1-F：5'-TGTGTGTACTTGTGTGATGGTTAGA-3'(SEQ ID No.1)；
α1-R：5'-CTGGTTAAACAGGTAAACAAAGCAATAG-3'(SEQID No.2)；
α2-F：5'-TCCTTGCACCGGCCCTTC-3'(SEQ ID No.3)；
α2-R：5'-GTCCTTGGTCTGAGACAGGTAA-3'(SEQ ID No.4)；
Probe-α1：5'-FAM-TGCCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGC-BHQ1-3'；
Probe-α2：5'-HEX-TGAATAAAGTCTGAGTGGGCAGCAGCCTGTG-BHQ1-3'；
LIS1-F：5'-GATTGCCACAGCCTGCTGCT-3'(SEQ ID No.7)；
LIS1-R：5'-AGGGCTCATTACATGTGGACC-3'(SEQ ID No.8)；
Probe-LIS1：5'-ROX-CCAGACATCCTCCATGTGAGAAGCAGCGA-BHQ2-3'；
SEA-F：5'-CTCTGTGTTCTCAGTATTGGAGG-3'(SEQ ID No.10)；
SEA-R：5'-GAGTGCAGTGTTGTAGTCATGG-3'(SEQ ID No.11)；
Probe-SEA：5'-FAM-AGGGGAGAAGCTGAGTGATGGGTCCG-BHQ1-3'；
CS-F：5'-CTGGACAAGTT CCTGGCTTCT-3'(SEQ ID No.13)；
CS-R：5'-GTGCAAGGAGGGGAGGAG-3'(SEQ ID No.14)；
QS-F：5'-ACCTCCCCGCCGAGTTCA-3'(SEQ ID No.15)；
QS-R：5'-GAGGCTCCAGCTTAACGGTAT-3'(SEQ ID No.16)；
WS-F：5'-ACCTCCCCGCCGAGTTCA-3'(SEQ ID No.17)；
WS-R：5'-GAGGCTCCAGCTTAACGGTAT-3'(SEQ ID No.18)；
Probe-CSN：5'-HEX-CACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAAGC-BHQ1-3'；
Probe-CSM：5'-FAM-CACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTCAAGC-BHQ1-3'；
Probe-QSN：5'-HEX-CTGCGGTGCACGCCTCCCTGGA-BHQ1-3'；
Probe-QSM：5'-FAM-CTGCGGTGCACGCCTCCCCGGA-BHQ1-3'；
Probe-WSN：5'-HEX-CTGCGGTGCACGCCTCCCTGGA-BHQ1-3'；
Probe-WSM：5'-FAM-CTGCGGTGCAGGCCTCCCTGGA-BHQ1-3'；
41-42M-F：5'-CTTAGGCTGCTGGTGGTCTAC-3'(SEQ ID No.25)；
41-42M-R：5'-CAGCATCAGGAGTGGACAGATC-3'(SEQ ID No.26)；
-28M-F：5'-GCAGGGAGGGCAGGAG-3'(SEQ ID No.27)；
-28M-R：5'-GTTGTGTCAGAAGCAAATGTAAGCA-3'(SEQ IDNo.28)；
71-72M-F：5'-AAGGCTCATGGCAAGAAAGTG-3'(SEQ ID No.29)；
71-72M-R：5'-AAAGGTGCCCTTGAGGTTGTC-3'(SEQ ID No.30)；
17M-F：5'-GAGGAGAAGTCTGCCGTTACTG-3'(SEQ ID No.31)；
17M-R：5'-GGCCTCACCACCAACTTCAT-3'(SEQ ID No.32)；
βEM-F：5'-GCAAGGTGAACGTGGATGAAG-3'(SEQ ID No.33)；
βEM-R：5'-GTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCT-3'(SEQ IDNo.34)；
654M-F：5'-TGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAA-3'(SEQ IDNo.35)；
654M-R：5'-AACCTCTTACATCAGTTACAATTTATATGCAGAA-3'(SEQ IDNo.36)；
31M-F：5'-ACTGACTCTCTCTGCCTATTGGT-3'(SEQ ID No.37)；
31M-R：5'-CCTCTGGGTCCAAGGGTAGA-3'(SEQ ID No.38)；
14-15M-F：5'-CTAGCAACCTCAAACAGACACCAT-3'(SEQ IDNo.39)；
14-15M-R：5'-CACCAACTTCATCCACGTTCA-3'(SEQ ID No.40)；
43M-F：5'-CTTAGGCTGCTGGTGGTCTAC-3'(SEQ ID No.41)；
43M-R：5'-CAGCATCAGGAGTGGACAGATC-3'(SEQ ID No.42)；
27/28M-F：5'-GGTGAACGTGGATGAAGTTGGT-3'(SEQ ID No.43)；
27/28M-R：5'-GTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCT-3'(SEQID No.44)；
IVS-I-1M-F：5'-GGTGAACGTGGATGAAGTTGGT-3'(SEQ IDNo.45)；
IVS-I-1M-R：5'-GCCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAA-3'(SEQID No.46)；
IVS-I-5M-F：5'-GGTGAACGTGGATGAAGTTGGT-3'(SEQ IDNo.47)；
IVS-I-5M-R：5'-GCCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAA-3'(SEQ ID No.48)；
CAPM-F：5'-GCTTACATTTGCTTCTGACACAACT-3'(SEQ IDNo.49)；
CAPM-R：5'-CTCAGGAGTCAGATGCACCAT-3'(SEQ ID No.50)；
IntM-F：5'-CTGTGTTCACTAGCAACCTCAAAC-3'(SEQ ID No.51)；
IntM-R：5'-GGCAGTAACGGCAGACTTCTC-3'(SEQ ID No.52)；
-30M-F：5'-GCAGGGAGGGCAGGAG-3'(SEQ ID No.53)；
-30M-R：5'-GTTGTGTCAGAAGCAAATGTAAGCA-3'(SEQ IDNo.54)；
-29M-F：5'-GCAGGGAGGGCAGGAG-3'(SEQ ID No.55)；
-29M-R：5'-GTTGTGTCAGAAGCAAATGTAAGCA-3'(SEQ IDNo.56)；
-32M-F：5'-GCAGGGAGGGCAGGAG-3'(SEQ ID No.57)；
-32M-R：5'-GTTGTGTCAGAAGCAAATGTAAGCA-3'(SEQ IDNo.58)；
Probe-41-42N：5'-HEX-AGGACTCAAAGAACCTCT-BHQ1-3'；
Probe-41-42M：5'-FAM-CAAAGGACTCAACCTCT-BHQ1-3'；
Probe-28N：5'-HEX-CCCTGACTTTTATGCCC-BHQ1-3'；
Probe-28M：5'-FAM-CCTGACTTCTATGCCC-BHQ1-3'；
Probe-71-72N：5'-HEX-TCGGTGCCTTTAGTG-BHQ1-3'；
Probe-71-72M：5'-FAM-CGGTGCCTTTAAGTG-BHQ1-3'；
Probe-17N：5'-HEX-CACGTTCACCTTGCCCCA-BHQ1-3'；
Probe-17M：5'-FAM-ACGTTCACCTAGCCCCA-BHQ1-3'；
Probe-βEN：5'-HEX-TGGTGGTGAGGCCCT-BHQ1-3'；
Probe-βEM：5'-FAM-TTGGTGGTAAGGCCCT-BHQ1-3'；
Probe-654N：5'-HEX-AGATATTGCTATTGCCTTAAC-BHQ1-3'；
Probe-654M：5'-FAM-AGATATTGCTATTACCTTAAC-BHQ1-3'；
Probe-31N：5'-HEX-CACCAGCAGCCTAAG-BHQ1-3'；
Probe-31M：5'-FAM-CCACCAGCACCTAAG-BHQ1-3'；
Probe-14-15N：5'-HEX-CGTTACTGCCCTGTGG-BHQ1-3'；
Probe-14-15M：5'-FAM-CGTTACTGCCCTGGTG-BHQ1-3'；
Probe-43N：5'-HEX-AGAGGTTCTTTGAGTCCTT-BHQ1-3'；
Probe-43M：5'-FAM-CAGAGGTTCTTTTAGTCCTT-BHQ1-3'；
Probe-27/28N：5'-HEX-TGAGGCCCCTGGGCAG-BHQ1-3'；
Probe-27/28M：5'-FAM-TGAGGCCCTGGGCAG-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-1N：5'-HEX-CTGGGCAGGTTGGTAT-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-1M-A：5'-FAM-CTGGGCAGATTGGTAT-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-1M-T：5'-FAM-CTGGGCAGTTTGGTAT-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-5N：5'-HEX-CAGGTTGGTATCAAGG-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-5M：5'-FAM-CAGGTTGCTATCAAGG-BHQ1-3'；
Probe-CAPN：5'-HEX-CAACCTCAAACAGACACC-BHQ1-3'；
Probe-CAPM：5'-FAM-TAGCAACCTCAGACACC-BHQ1-3'；
Probe-IntN：5'-HEX-TCAAACAGACACCATGG-BHQ1-3'；
Probe-IntM：5'-FAM-TCAAACAGACACCAGGG-BHQ1-3'；
Probe-30N：5'-HEX-CCCTGACTTTTATGCCCAG-BHQ1-3'；
Probe-30M：5'-FAM-CCTGACTTTTGTGCCCAG-BHQ1-3'；
Probe-29N：5'-HEX-CCCTGACTTTTATGCCC-BHQ1-3'；
Probe-29M：5'-FAM-CCTGACTTTCATGCCC-BHQ1-3'；
Probe-32N：5'-HEX-CCTGACTTTTATGCCCAGCC-BHQ1-3'；
Probe-32M：5'-FAM-CCCTGACTTTTATTCCCAGCC-BHQ1-3'。
实施例2
试剂盒的组成
作为本发明的一个实施方案，发明人已经按照最佳配比将缓冲液、酶液、引物、探针、Mg2+和dNTP等成分混合获得本发明的PCR反应液，其具体成分示于表1中。
表1
其中，引物-F为正向引物，引物-R为反向引物，探针-N为正常探针，探针-M为突变探针。
作为优选示例方案，将PCR反应液以18μL/孔的体积加入到96孔板中进行真空冷冻干燥，最终得到PCR预冻干试剂(粉末)。
实施例3
检测步骤
作为本发明的一个实施方案，采用上述试剂盒快速检测α/β-地中海贫血的方法包括以下步骤：
1)样本来源：已通过Gap-PCR结合凝胶电泳技术与PCR-反向点杂交技术进行地中海贫血基因型确诊的成人全血样本，采用现有常规方法抽提样本基因组DNA，制备DNA模板(优选浓度：10ng/μL)；
2)配制反应体系，只需将2μL DNA模板(优选含量：20ng)和18μL水加入到PCR预冻干试剂中配成反应体系，反应体系的终体积优选为20μL；
3)样本检测：将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的阈值时的循环次数Cq值和采集荧光信号；
4)-α3.7和-α4.2缺失基因型数据分析及结果判定：通过α1基因、α2基因与内参基因LIS1的Cq值的比较来分型，α1△Cq＝FAM△Cq—ROX△Cq，α2△Cq＝HEX△Cq—ROX△Cq；当α1△Cq≈2且α2△Cq≈3时，样本基因型为-α3.7/αα基因型；当α1△Cq≈1且α2△Cq≈3时，样本基因型为-α4.2/αα基因型；当α1△Cq≈1且α2△Cq≈2时，样本基因型为αα/αα基因型；
5)--SEA缺失基因型数据分析及结果判定：根据实时荧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结果；当FAM通道有Cq值读数时，则表示该样本携带--SEA等位基因，为--SEA/αα基因型；当FAM通道没有Cq值读数时，则表示该样本不携带--SEA等位基因，为αα/αα基因型；
6)αCSα，αQSα，αWSα突变基因型以及β-地中海贫血的17种突变基因型数据分析及结果判定，根据实时荧光定量PCR仪扩增收集的荧光信号，当荧光强度FAM>HEX则为相应的突变基因型，当荧光强度FAM<HEX则为非突变基因型。
上述方法的步骤3)中，PCR扩增条件为：第一步：50℃预反应，2min；第二步：95℃预变性，1min；第三步：95℃变性，15sec，60℃退火，1min，39个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。
结果与分析
从图1可以看出，通过△Cq值的比较可准确区分-α3.7基因型、-α4.2基因型和正常基因型，α1△Cq≈2且α2△Cq≈3，样本1和样本2样本可判定为-α3.7缺失基因型；α1△Cq≈1且α2△Cq≈3，样本3和样本4样本可判定为-α4.2缺失基因型；α1△Cq≈1且α2△Cq≈2，样本5和样本6样本可判定为非-α3.7和-α4.2基因型；判定结果具有较高的特异性。右侧图表示应用Gap-PCR结合凝胶电泳技术对相关的基因型的确认。
从图2可以看出，样本7、样本8、样本9、样本10样本的FAM通道有Cq值读数，表示样本7、样本8、样本9、样本10样本携带--SEA等位基因，为--SEA/αα杂合子；样本11、样本12的FAM通道没有Cq值读数时，表示样本11、样本12不携带--SEA等位基因，为αα/αα基因型。右侧图表示应用Gap-PCR结合凝胶电泳技术对相关的基因型的确认。
从图3可以看出，通过荧光强度结果分析表明：荧光强度FAM-CSM>HEX-CSN，样本13为αCSα/αα突变基因型；荧光强度FAM-QSM>HEX-QSN，样本14为αQSα/αα突变基因型；荧光强度FAM-WSM>HEX-WSN，样本15为αWSα/αα突变基因型；荧光强度FAM<HEX，样本16为非突变基因型。右侧图表示应用PCR-反向点杂交技术对相关的基因型的确认。
从图4可以看出，通过荧光强度结果分析表明：荧光强度FAM-28M>HEX-28N，样本1为-28M/N突变基因型；荧光强度FAM-17M>HEX-17N，样本2为17M/N突变基因型；荧光强度FAM-28M>HEX-28N且FAM-17M>HEX-17N，样本3为-28M/17M突变基因型；荧光强度FAM-29M>HEX-29N，样本4为-29M/N突变基因型；荧光强度FAM-41-42M>HEX-41-42N，样本5为41-42M/N突变基因型；荧光强度FAM<HEX，样本6和样本7为非突变基因型。右侧图表示应用PCR-反向点杂交技术对相关的基因型的确认。
结论
本发明试剂盒仅通过一次PCR扩增(同一条件，多管检测)可同时对α-地中海贫血常见的3种缺失和3种突变基因型以及β-地中海贫血的17种突变基因型进行检测，操作简单，耗时短，整个实验过程仅需2-5小时，结果稳定，特异性强。
Claims (10)
1.用于检测α/β-地中海贫血的引物和探针的组合，其包括：
检测α-珠蛋白基因簇中-α3.7缺失型、-α4.2缺失型、--SEA缺失型、αCSα突变型、αQSα突变型、αWSα突变型的扩增引物和荧光探针，以及
检测β-珠蛋白基因簇中17种突变型的扩增引物和荧光探针，这17种突变型为41-42M突变型、-28M突变型、71-72M突变型、17M突变型、βEM突变型、654M突变型、31M突变型、14-15M突变型、43M突变型、27/28M突变型、IVS-I-1M突变型、IVS-I-5M突变型、CAPM突变型、IntM突变型、-30M突变型、-29M突变型、-32M突变型。
2.权利要求1所述的组合，其中：
检测α-珠蛋白基因簇中-α3.7和-α4.2缺失型的正向引物包含SEQ ID No.1和SEQ IDNo.3所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中-α3.7和-α4.2缺失型的反向引物包含SEQ ID No.2和SEQ IDNo.4所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中-α3.7缺失型的探针包含SEQ ID No.5所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中-α4.2缺失型的探针包含SEQ ID No.6所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中--SEA缺失型的正向引物包含SEQ ID No.10所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中--SEA缺失型的反向引物包含SEQ ID No.11所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中--SEA缺失型的探针包含SEQ ID No.12所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αCSα突变型的正向引物包含SEQ ID No.13所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αCSα突变型的反向引物包含SEQ ID No.14所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αQSα突变型的正向引物包含SEQ ID No.15所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αQSα突变型的反向引物包含SEQ ID No.16所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αWSα突变型的正向引物包含SEQ ID No.17所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αWSα突变型的反向引物包含SEQ ID No.18所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αCSα突变型的正常探针包含SEQ ID No.19所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αCSα突变型的突变探针包含SEQ ID No.20所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αQSα突变型的正常探针包含SEQ ID No.21所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αQSα突变型的突变探针包含SEQ ID No.22所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αWSα突变型的正常探针包含SEQ ID No.23所示的序列；
检测α-珠蛋白基因簇中αWSα突变型的突变探针包含SEQ ID No.24所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中41-42M突变型的正向引物包含SEQ ID No.25所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中41-42M突变型的反向引物包含SEQ ID No.26所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-28M突变型的正向引物包含SEQ ID No.27所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-28M突变型的反向引物包含SEQ ID No.28所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中71-72M突变型的正向引物包含SEQ ID No.29所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中71-72M突变型的反向引物包含SEQ ID No.30所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中17M突变型的正向引物包含SEQ ID No.31所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中17M突变型的反向引物包含SEQ ID No.32所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中βEM突变型的正向引物包含SEQ ID No.33所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中βEM突变型的反向引物包含SEQ ID No.34所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中654M突变型的正向引物包含SEQ ID No.35所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中654M突变型的反向引物包含SEQ ID No.36所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中31M突变型的正向引物包含SEQ ID No.37所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中31M突变型的反向引物包含SEQ ID No.38所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中14-15M突变型的正向引物包含SEQ ID No.39所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中14-15M突变型的反向引物包含SEQ ID No.40所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中43M突变型的正向引物包含SEQ ID No.41所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中43M突变型的反向引物包含SEQ ID No.42所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中27/28M突变型的正向引物包含SEQ ID No.43所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中27/28M突变型的反向引物包含SEQ ID No.44所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-1M突变型的正向引物包含SEQ ID No.45所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-1M突变型的反向引物包含SEQ ID No.46所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-5M突变型的正向引物包含SEQ ID No.47所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-5M突变型的反向引物包含SEQ ID No.48所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中CAPM突变型的正向引物包含SEQ ID No.49所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中CAPM突变型的反向引物包含SEQ ID No.50所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IntM突变型的正向引物包含SEQ ID No.51所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IntM突变型的反向引物包含SEQ ID No.52所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-30M突变型的正向引物包含SEQ ID No.53所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-30M突变型的反向引物包含SEQ ID No.54所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-29M突变型的正向引物包含SEQ ID No.55所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-29M突变型的反向引物包含SEQ ID No.56所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-32M突变型的正向引物包含SEQ ID No.57所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-32M突变型的反向引物包含SEQ ID No.58所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中41-42M突变型的正常探针包含SEQ ID No.59所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中41-42M突变型的突变探针包含SEQ ID No.60所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-28M突变型的正常探针包含SEQ ID No.61所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-28M突变型的突变探针包含SEQ ID No.62所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中71-72M突变型的正常探针包含SEQ ID No.63所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中71-72M突变型的突变探针包含SEQ ID No.64所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中17M突变型的正常探针包含SEQ ID No.65所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中17M突变型的突变探针包含SEQ ID No.66所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中βEM突变型的正常探针包含SEQ ID No.67所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中βEM突变型的突变探针包含SEQ ID No.68所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中654M突变型的正常探针包含SEQ ID No.69所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中654M突变型的突变探针包含SEQ ID No.70所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中31M突变型的正常探针包含SEQ ID No.71所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中31M突变型的突变探针包含SEQ ID No.72所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中14-15M突变型的正常探针包含SEQ ID No.73所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中14-15M突变型的突变探针包含SEQ ID No.74所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中43M突变型的正常探针包含SEQ ID No.75所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中43M突变型的突变探针包含SEQ ID No.76所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中27/28M突变型的正常探针包含SEQ ID No.77所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中27/28M突变型的突变探针包含SEQ ID No.78所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-1M突变型的正常探针包含SEQ ID No.79所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-1M突变型-A的突变探针包含SEQ ID No.80所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-1M突变型-T的突变探针包含SEQ ID No.81所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-5M突变型的正常探针包含SEQ ID No.82所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IVS-I-5M突变型的突变探针包含SEQ ID No.83所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中CAPM突变型的正常探针包含SEQ ID No.84所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中CAPM突变型的突变探针包含SEQ ID No.85所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IntM突变型的正常探针包含SEQ ID No.86所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中IntM突变型的突变探针包含SEQ ID No.87所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-30M突变型的正常探针包含SEQ ID No.88所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-30M突变型的突变探针包含SEQ ID No.89所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-29M突变型的正常探针包含SEQ ID No.90所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-29M突变型的突变探针包含SEQ ID No.91所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-32M突变型的正常探针包含SEQ ID No.92所示的序列；
检测β-珠蛋白基因簇中-32M突变型的突变探针包含SEQ ID No.93所示的序列。
3.权利要求1或2所述的组合，其还包括内参基因的扩增引物和荧光探针。
4.权利要求3所述的组合，其中：
内参基因的正向引物包含SEQ ID No.7所示的序列；
内参基因的反向引物包含SEQ ID No.8所示的序列；
内参基因的探针包含SEQ ID No.9所示的序列。
5.权利要求1-4任一项所述的组合，其中所述探针的5’端标记有荧光报告基团，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
6.权利要求5所述的组合，其中荧光探针优选选自：
Probe-α1：5'-FAM-TGCCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGC-BHQ1-3'；
Probe-α2：5'-HEX-TGAATAAAGTCTGAGTGGGCAGCAGCCTGTG-BHQ1-3'；
Probe-SEA：5'-FAM-AGGGGAGAAGCTGAGTGATGGGTCCG-BHQ1-3'；
Probe-CSN：5'-HEX-CACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAAGC-BHQ1-3'；
Probe-CSM：5'-FAM-CACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTCAAGC-BHQ1-3'；
Probe-QSN：5'-HEX-CTGCGGTGCACGCCTCCCTGGA-BHQ1-3'；
Probe-QSM：5'-FAM-CTGCGGTGCACGCCTCCCCGGA-BHQ1-3'；
Probe-WSN：5'-HEX-CTGCGGTGCACGCCTCCCTGGA-BHQ1-3'；
Probe-WSM：5'-FAM-CTGCGGTGCAGGCCTCCCTGGA-BHQ1-3'；
Probe-41-42N：5'-HEX-AGGACTCAAAGAACCTCT-BHQ1-3'；
Probe-41-42M：5'-FAM-CAAAGGACTCAACCTCT-BHQ1-3'；
Probe-28N：5'-HEX-CCCTGACTTTTATGCCC-BHQ1-3'；
Probe-28M：5'-FAM-CCTGACTTCTATGCCC-BHQ1-3'；
Probe-71-72N：5'-HEX-TCGGTGCCTTTAGTG-BHQ1-3'；
Probe-71-72M：5'-FAM-CGGTGCCTTTAAGTG-BHQ1-3'；
Probe-17N：5'-HEX-CACGTTCACCTTGCCCCA-BHQ1-3'；
Probe-17M：5'-FAM-ACGTTCACCTAGCCCCA-BHQ1-3'；
Probe-βEN：5'-HEX-TGGTGGTGAGGCCCT-BHQ1-3'；
Probe-βEM：5'-FAM-TTGGTGGTAAGGCCCT-BHQ1-3'；
Probe-654N：5'-HEX-AGATATTGCTATTGCCTTAAC-BHQ1-3'；
Probe-654M：5'-FAM-AGATATTGCTATTACCTTAAC-BHQ1-3'；
Probe-31N：5'-HEX-CACCAGCAGCCTAAG-BHQ1-3'；
Probe-31M：5'-FAM-CCACCAGCACCTAAG-BHQ1-3'；
Probe-14-15N：5'-HEX-CGTTACTGCCCTGTGG-BHQ1-3'；
Probe-14-15M：5'-FAM-CGTTACTGCCCTGGTG-BHQ1-3'；
Probe-43N：5'-HEX-AGAGGTTCTTTGAGTCCTT-BHQ1-3'；
Probe-43M：5'-FAM-CAGAGGTTCTTTTAGTCCTT-BHQ1-3'；
Probe-27/28N：5'-HEX-TGAGGCCCCTGGGCAG-BHQ1-3'；
Probe-27/28M：5'-FAM-TGAGGCCCTGGGCAG-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-1N：5'-HEX-CTGGGCAGGTTGGTAT-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-1M-A：5'-FAM-CTGGGCAGATTGGTAT-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-1M-T：5'-FAM-CTGGGCAGTTTGGTAT-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-5N：5'-HEX-CAGGTTGGTATCAAGG-BHQ1-3'；
Probe-IVS-I-5M：5'-FAM-CAGGTTGCTATCAAGG-BHQ1-3'；
Probe-CAPN：5'-HEX-CAACCTCAAACAGACACC-BHQ1-3'；
Probe-CAPM：5'-FAM-TAGCAACCTCAGACACC-BHQ1-3'；
Probe-IntN：5'-HEX-TCAAACAGACACCATGG-BHQ1-3'；
Probe-IntM：5'-FAM-TCAAACAGACACCAGGG-BHQ1-3'；
Probe-30N：5'-HEX-CCCTGACTTTTATGCCCAG-BHQ1-3'；
Probe-30M：5'-FAM-CCTGACTTTTGTGCCCAG-BHQ1-3'；
Probe-29N：5'-HEX-CCCTGACTTTTATGCCC-BHQ1-3'；
Probe-29M：5'-FAM-CCTGACTTTCATGCCC-BHQ1-3'；
Probe-32N：5'-HEX-CCTGACTTTTATGCCCAGCC-BHQ1-3'；
Probe-32M：5'-FAM-CCCTGACTTTTATTCCCAGCC-BHQ1-3'。
7.包含权利要求1-6任一项所述组合的试剂盒。
8.权利要求7所述的试剂盒，其还包含额外的组分，所述组分选自缓冲液、酶液、引物、探针、MgCl2、dNTP成分，更优选选自Tris缓冲液、Taq酶、正向引物和反向引物、正常探针和突变探针、MgCl2、dNTP成分，更优选为预冻干形式的组分。
9.权利要求8所述的试剂盒，其中：
Tris缓冲液的终浓度为20-100mM，MgCl2的终浓度为2-10mM，每种dNTP的终浓度为0.1-0.5mM，Taq酶的终浓度为0.01-0.1U/μL，正向引物和反向引物的终浓度分别为5-15μM，正常探针和突变探针的终浓度分别为1-5μM。
10.权利要求9所述的试剂盒，其中：
Tris缓冲液的终浓度为50mM，MgCl2的终浓度为5mM，每种dNTP的终浓度为0.2mM，Taq酶的终浓度为0.05U/μL，正向引物和反向引物的终浓度分别为9μM，正常探针和突变探针的终浓度分别为2.5μM。
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