CN111690737A - 一种a-地中海贫血基因检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种a‑地中海贫血基因检测试剂盒，用于α地贫中的3种缺失型‑‑SEA、‑α3.7、‑α4.2，‑α3.7三种亚型及三种点突变非缺失型αCSα、αQSα和αWestmeadα基因的联合检测，包括针对3种缺失型‑‑SEA、‑α3.7三种亚型、‑α4.2，及三种点突变非缺失型αCSα、αQSα和αWestmeadα设计的引物对、探针和抑制剂，还包括PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品。本发明还提供了一种a‑地中海贫血基因检测试剂盒的使用方法。解决了基因检测试剂盒检测周期长、操作复杂、成本高和特异性不强等问题。

Description

一种a-地中海贫血基因检测试剂盒及使用方法
技术领域
本发明应用于基因检测技术领域，具体涉及一种a-地中海贫血基因检测试剂盒及使用方法。
背景技术
地中海贫血简称“地贫”，又称海洋性贫血、珠蛋白合成障碍性贫血，因最早发现于地中海沿岸国家而得名，是一种遗传性溶血性贫血病，此病在全球范围内广泛分布，在我国南方地区较为高发，其病因是珠蛋白基因的缺失或突变导致珠蛋白链的合成障碍。地中海贫血患者轻者会出现贫血，较为严重的患儿可能在青少年时期因并发症死亡，最为严重的患儿可能于宫内死亡，还会导致孕妇发生妊高症、产时和产后大出血、胎盘过早剥落等危重并发症。在当前此病仍然没有理想的治疗方法，因此做好预防和监控对控制和降低地中海贫血的发病率非常重要，在孕期进行地贫筛查，减少重症地贫胎儿的出生，对优生优育、降低地贫发病率有重要作用。
根据血红蛋白中珠蛋白肽链受损的不同，地贫主要分为α地贫和β地贫两大类。我国广东、广西及海南是该疾病的高发区，其中广西人群的地贫基因携带率最高，高达25％。在广西人群中，导致α地贫的α珠蛋白基因簇变异在人群中的携带率高达17％。由于重度α地贫会导致血红蛋白Barts胎儿水肿综合征，中间型α地贫会导致血红蛋白H病。最常见α地贫缺失类型是--SEA，其次为-α4.2和-α3.7；常见的突变类型是αCSα、αQSα和αWestmeadα。
目前地贫缺失型基因检测的技术多为Gap-PCR法，地贫点突变基因检测的技术多为Sanger法，无法同时对缺失型和非缺失型进行检测，且操作繁琐，检测周期长，无法进行多位点同时检测，亟待开发简单快捷的a-地中海贫血基因检测方法。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的a-地中海贫血基因检测时对样本检测周期长、操作复杂、成本高和特异性不强等问题，提供一种a-地中海贫血基因检测试剂盒及使用方法。本试剂盒具有高灵敏度、低成本、高特异性、操作简便、检测周期短等特点，可以快速精准的对地中海贫血相关基因进行检测。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：
一种a-地中海贫血基因检测试剂盒，用于α地贫中的3种缺失型--SEA、-α3.7、-α4.2，-α3.7三种亚型及三种点突变非缺失型αCSα、αQSα和αWestmeadα基因的联合检测，包括针对3种缺失型--SEA、-α3.7三种亚型、-α4.2，及三种点突变非缺失型αCSα、αQSα和αWestmeadα设计的引物对、探针和抑制剂，还包括PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品。
进一步的，所述引物对、探针序列如下：
用于检测--SEA(I/D)引物对、探针：
SEA-F:ATGGATGAGGACGGAGCGATCTGG
SEA-DR:TACTGCAGCCTTGAACTCCTGGA
SEA-DP:FAM-TCCGGGGGCTTCGCAGGAACTCGGT-TRAMA
4.2-IF:TACTTAAAGTAGGAGAGTGTCTC
4.2-IR:AGAGAGCCTGTGGCAGTAGTTGTAG
4.2-IP:FAM-CAGAAGAGACCAAAATGAAGGGTTT-TRAMA
用于检测-α4.2(I/D)引物对、探针：
4.2-DF:CCCTGCCCCAGCACTTCCTGATCTTTGAAT
4.2-DR:TCAGGTGATCCTCCCACCTAG
4.2-DP:FAM-CCTGTGTGTGCCTGGGTTCTCTCTG-TRAMA
4.2-IF:TACTTAAAGTAGGAGAGTGTCTC
4.2-IR:AGAGAGCCTGTGGCAGTAGTTGTAG
4.2-IP:FAM-CAGAAGAGACCAAAATGAAGGGTTT-TRAMA
用于检测-α3.7(I/D)引物对、探针：
3.7-DF1:GCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCC
3.7-DR1:TTCCAGCTGGACTTCGCGGTGGCTC
3.7-DP1:FAM-TCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGT-TRAMA
3.7-DF2:GCAGGCGGCGGCTGCGGGCC
3.7-DR2:CCATGTGTGTCCCAGCTGCTGTC
3.7-DP2:FAM-TGCCTGAGTTTTTTCCCTCAGCAAA-TRAMA
3.7-DF3:CCTACCCAGAGCCAAGTTTGTTTA
3.7-DR3:GCGAGCGAGTGCGAGCCGGGA
3.7-DP3:FAM-CTTAGCCAGCACCCACCACCCCACG-TARMA
3.7-IF:GAATCATTTTAACCAAGGAGGCA
3.7-IR:GACCAGGGTTAGTCTGAGGGCTTC
3.7-IP:FAM-CAGAGAAGGAAGTAGCTCCGACCA-TRAMA
用于检测αCSα引物对、探针和抑制剂：
CS-WF:CCTGCGGTGCACGCCTCAAT
CS-MF:CCTGCGGTGCACGCCTCAAC
CS-R:GGCAGCAGCCTGTGTGTGCCTG
CS-P:VIC-CCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTG-TRAMA
CS-WB:CTGACCTCCAAATACCGTTAAGCTGGAGCCT-ddC
CS-MB:CTGACCTCCAAATACCGTCAAGCTGGAGCCT-ddC
用于检测αQSα引物对、探针和抑制剂：
QS-WF:CCTGCGGTGCACGCCTCAAT
QS-MF:CCTGCGGTGCACGCCTCAAC
CS-R:GGCAGCAGCCTGTGTGTGCCTG
CS-P:VIC-CCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTG-TRAMA
QS-WB:ACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTT-ddC
QS-MB:ACCCCTGCGGTGCAGGCCTCCCCGGACAAGTT-ddC
用于检测αWestmeadα引物对、探针和抑制剂：
WS-WF:GAGTTCACCCCTGCGGTGTGC
WS-MF:GAGTTCACCCCTGCGGTGTGG
CS-R:GGCAGCAGCCTGTGTGTGCCTG
CS-P:VIC-CCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTG-TRAMA
QS-WB:ACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTT-ddC
QS-MB:ACCCCTGCGGTGCAGGCCTCCCCGGACAAGTT-ddC
进一步的，所述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX荧光报告基团，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1荧光淬灭基团。
进一步的，所述探针5’端荧光基团为FAM或VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。
进一步的，所述抑制剂3’端采用C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB或双脱氧胞苷(ddC)修饰。
进一步的，所述抑制剂3’端采用ddC修饰。
进一步的，所述PCR反应液包含了PCR反应所需要的热启动taq酶、缓冲液、镁离子、dNTP物质。
进一步的，所述阳性质控品的获取方法为：--SEA、-α4.2、αCSα、αQSα和αWestmeadα根据NCBI数据库公布的基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，3种-α3.7缺失亚型为自测断裂位点后得到基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，将各质控品质粒等比例混合即为所述阳性质控品。
进一步的，所述阴性质控品为DEPC处理过的去离子水。
一种地中海贫血基因检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)取含有EDTA抗凝剂的真空血液样本进行核酸提取；
2)预混分装热启动taq酶、缓冲液、镁离子、dNTP物质基因检测试剂得到PCR反应液；
3)将步骤1)得到的DNA及各引物加入步骤2)中的PCR反应液中，分别得到PCR反应体系1、PCR反应体系2、PCR反应体系3、PCR反应体系4、PCR反应体系5、PCR反应体系6、PCR反应体系7、PCR反应体系8，共同组成PCR反应体系；混匀后进行PCR扩增；
4)反应结束后进行基因分型判读。
进一步的，所述步骤3)PCR反应体系中各组分的浓度为：DNA，1-200ng；各引物，2-3μM；热启动taq酶，0.5U；镁离子，5Xbuffer；dNTP物质，20mM；反应总体积为20μl。
进一步的，步骤3)中所述PCR扩增的条件为：
预变性的条件为：95℃，2分钟；
第一个阶段由5个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒；延伸：72℃，20秒；
第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒，设置荧光信号采集；延伸：72℃，30秒。
基因分型判读的方式：在上述PCR反应体系和循环程序条件下，阳性质控品1-8号FAM和VIC荧光检测信号应该形成对数扩增“S”型曲线；阴性质控品1-8号应无扩增曲线或者Ct值为0；观察1-8号的FAM和VIC荧光检测信号是否形成对数扩增“S”型曲线。
以上满足的情况下，观察待测样本反应管扩增曲线，如果形成对数扩增“S”型曲线，该待检测样本含有相应的碱基突变；如果无对数扩增“S”型曲线或者Ct值为0，则无相应的碱基突变。
PCR反应体系中检测位点如表1所示。
表1 PCR反应体系中检测位点
PCR反应液 FAM信号 VIC信号
PCR反应液1 --<sup>SEA</sup>&gt;I α<sup>CS</sup>α&gt;T
PCR反应液2 --<sup>SEA</sup>&gt;D α<sup>CS</sup>α&gt;C
PCR反应液3 -α<sup>4.2</sup>&gt;I α<sup>QS</sup>α&gt;T
PCR反应液4 -α<sup>4.2</sup>&gt;D α<sup>QS</sup>α&gt;C
PCR反应液5 -α<sup>3.7</sup>&gt;I α<sup>Westmead</sup>α&gt;C
PCR反应液6 -α<sup>3.7</sup>&gt;D1 α<sup>Westmead</sup>α&gt;G
PCR反应液7 -α<sup>3.7</sup>&gt;D2 --
PCR反应液8 -α<sup>3.7</sup>&gt;D3 --
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明将6种地中海贫血相关基因突变类型分装在一个8联PCR反应条中，预混包装，方便检测，实现了一个反应体系的多基因变异分析，降低成本的同时提升了检测效率；
(2)本发明具有高灵敏度、低成本、高特异性、操作简便、检测周期短等特点，可以快速精准的对地中海贫血相关基因进行检测。
附图说明
图1为本发明一种a-地中海贫血基因检测试剂盒及使用方法的阳性质控品扩增曲线。
图2为本发明一种a-地中海贫血基因检测试剂盒及使用方法的阴性质控品扩增曲线。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
另外，除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买获得或现有方法制备得到。
发明人通过分析临床上地中海贫血病人基因突变类型及突变频率，筛选出地中海贫血相关的3种缺失型--SEA、-α3.7、-α4.2，及3种点突变αCSα、αQSα和αWestmeadα6种基因突变类型，其中-α3.7缺失突变包括3种亚型。制备出检测该6种基因突变的组合物和使用该组合物的检测试剂盒，并建立准确的检测方法用以高效鉴定地中海贫血相关基因突变类型。
实施例1：引物和探针组合设计及使用
1、用于检测以上各基因型的引物对、探针序列如表2所示：
表2
Figure BDA0002587337900000051
Figure BDA0002587337900000061
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1。
在一具体实施例中，3种缺失型--SEA、-α3.7、-α4.2基因突变类型中及5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为TAMRA。3种点突变αCSα、αQSα和αWestmeadα基因突变类型中5’端荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，在一具体实施例中用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
上述引物和探针可用于特异性地检测样本中的地中海贫血相关基因突变类型，如表3所示。
表3
编号 基因 RS编号 核酸变异
1 --<sup>SEA</sup> - (I/D)
2 -α<sup>4.2</sup> - (I/D)
3 -α<sup>3.7</sup> - (I/D1/D2/D3)
4 α<sup>CS</sup>α rs41464951 HBA2:c.427T>C
5 α<sup>QS</sup>α rs41397847 HBA2:c.377T>C
6 α<sup>Westmead</sup>α rs41479347 HBA2:c.369C>G
实施例2：阳性质控品的获取
所述阳性质控品的获取方法为：--SEA、-α4.2、αCSα、αQSα和αWestmeadα根据NCBI数据库公布的基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，3种-α3.7缺失亚型为自测断裂位点后得到基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，将各质控品质粒等比例混合即为阳性质控品。
实施例3：PCR反应体系的配置
本发明试剂盒采用8联PCR反应条设计，1-8号管由基因检测试剂组成，分别指示--SEA、-α4.2、αCSα、αQSα和αWestmeadα不同基因多态位点，1-8号管预混分装热启动taq酶、缓冲液、镁离子、dNTP物质基因检测试剂得到PCR反应液，并将各引物分别加入1-8号管的PCR反应液中，分别得到对应PCR反应体系1-8，PCR反应体系1-8的组成如表4。
表4PCR反应体系
Figure BDA0002587337900000071
Figure BDA0002587337900000081
Figure BDA0002587337900000091
Figure BDA0002587337900000101
仪器通道及反应体积选择：
①选择FAM通道(Reporter：FAM，Quencher：TAMRA)和VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：TAMRA)检测扩增情况；
②反应体积(Sample Volume)为20μL。
③参考荧光(Reference Dye)：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passivereference选择“none”；具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。
实施例4：基因检测试剂盒的使用
1、样本收集
本实施例采集患者外周血，使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，分别收集血浆和血液中细胞于无菌螺口塑料管中。
2、样本处理
将样本利用商业化试剂盒进行核酸提取，本发明采用美基生物生产的HiPureBlood DNA Mini Kit(货号：D3111)，实验步骤参考说明书进行。
在1.5ml离心管中，加入25μl Proteinase K，转移10-250μl抗凝血液，血清，血浆，牛奶，唾液，或其它液体样品至装有蛋白酶的离心管中。轻轻振荡混匀，加入250μl BufferAL至样品中，颠倒3-5次混匀，最高速度涡旋30秒混匀，70℃水浴10分钟，其间涡旋混匀一次。加入250μl无水乙醇至样品中，涡旋30秒混匀，短暂离心收集管壁的液滴。把DNA柱装在新的收集管中，转移混合液至柱子中。10000×g离心1分钟，丢弃收集管和流出液。把DNA柱装在新的收集管中，加入500μl Buffer DW1至柱子上，颠倒混匀几次，10000×g离心30-60秒，倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。加入650μl Buffer DW2(已用乙醇稀释)至柱子中，10000×g离心30-60秒，倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。10000×g离心2分钟，可彻底去除柱子中残留的乙醇。将柱子转移至新的1.5ml离心管中。加入30-100μl预热至70℃Elution Buffer或Buffer TE至柱子的膜中央，放置3分钟后，10000×g离心1分钟。再加入30-100μl预热至70℃Elution Buffer或Buffer TE至柱子的膜中央，放置3分钟，10000×g离心1分钟，丢弃DNA结合柱，把DNA保存2-8℃，长期保存需保存于-20℃。
3、反应体系配制
反应体系配制按照实施例3中的PCR反应体系1-8配制反应体系。
4、PCR反应
将1-10号样本提取的DNA加入配制好的反应体系中，加入的模板量1-200ng。在进行PCR反应时需要将待测样本、阳性质控品和阴性质控品一起平行上机检测，每个样本需要同时加入1-8号管进行反应。
5、仪器通道及反应体积选择
①选择FAM通道(Reporter：FAM，Quencher：TAMRA)和VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：TAMRA)检测扩增情况；
②反应体积(Sample Volume)为20μL。
③参考荧光(Reference Dye)：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passivereference选择“none”；具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。
6、PCR反应程序
预变性的条件为：95℃，2分钟；
第一个阶段由5个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒；延伸：72℃，20秒；
第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒，设置荧光信号采集；延伸：72℃，30秒。
7、实验结果
反应程序结束后保存结果并进行判读。
参见附图1，阳性质控品1-8号反应管中FAM和VIC荧光检测信号形成对数扩增“S”型曲线；
参见附图2，阴性质控品1-8号管,无扩增曲线。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司
<120> 一种a-地中海贫血基因检测试剂盒及使用方法
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgcctgagtt ttttccctca gcaaa 25
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctacccaga gccaagtttg ttta 24
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcgagcgagt gcgagccggg a 21
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cttagccagc acccaccacc ccacg 25
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaatcatttt aaccaaggag gca 23
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaccagggtt agtctgaggg cttc 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cagagaagga agtagctccg acca 24
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cctgcggtgc acgcctcaat 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cctgcggtgc acgcctcaac 20
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggcagcagcc tgtgtgtgcc tg 22
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cccaacgggc cctcctcccc tccttg 26
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ctgacctcca aataccgtta agctggagcc t 31
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ctgacctcca aataccgtca agctggagcc t 31
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cctgcggtgc acgcctcaat 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cctgcggtgc acgcctcaac 20
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acccctgcgg tgcacgcctc cctggacaag tt 32
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acccctgcgg tgcaggcctc cccggacaag tt 32
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gagttcaccc ctgcggtgtg c 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gagttcaccc ctgcggtgtg g 21

Claims (10)

1.一种a-地中海贫血基因检测试剂盒，其特征在于：用于α地贫中的3种缺失型--SEA、-α3.7、-α4.2，-α3.7三种亚型及三种点突变非缺失型αCSα、αQSα和αWestmeadα基因的联合检测，包括针对3种缺失型--SEA、-α3.7三种亚型、-α4.2，及三种点突变非缺失型αCSα、αQSα和αWestmeadα设计的引物对、探针和抑制剂，还包括PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品。
2.如权利要求1所述一种a-地中海贫血基因检测试剂盒，其特征在于：所述引物对、探针序列如下：
用于检测--SEA(I/D)引物对、探针：
SEA-F:ATGGATGAGGACGGAGCGATCTGG
SEA-DR:TACTGCAGCCTTGAACTCCTGGA
SEA-DP:FAM-TCCGGGGGCTTCGCAGGAACTCGGT-TRAMA
4.2-IF:TACTTAAAGTAGGAGAGTGTCTC
4.2-IR:AGAGAGCCTGTGGCAGTAGTTGTAG
4.2-IP:FAM-CAGAAGAGACCAAAATGAAGGGTTT-TRAMA
用于检测-α4.2(I/D)引物对、探针：
4.2-DF:CCCTGCCCCAGCACTTCCTGATCTTTGAAT
4.2-DR:TCAGGTGATCCTCCCACCTAG
4.2-DP:FAM-CCTGTGTGTGCCTGGGTTCTCTCTG-TRAMA
4.2-IF:TACTTAAAGTAGGAGAGTGTCTC
4.2-IR:AGAGAGCCTGTGGCAGTAGTTGTAG
4.2-IP:FAM-CAGAAGAGACCAAAATGAAGGGTTT-TRAMA
用于检测-α3.7(I/D)引物对、探针：
3.7-DF1:GCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCC
3.7-DR1:TTCCAGCTGGACTTCGCGGTGGCTC
3.7-DP1:FAM-TCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGT-TRAMA
3.7-DF2:GCAGGCGGCGGCTGCGGGCC
3.7-DR2:CCATGTGTGTCCCAGCTGCTGTC
3.7-DP2:FAM-TGCCTGAGTTTTTTCCCTCAGCAAA-TRAMA
3.7-DF3:CCTACCCAGAGCCAAGTTTGTTTA
3.7-DR3:GCGAGCGAGTGCGAGCCGGGA
3.7-DP3:FAM-CTTAGCCAGCACCCACCACCCCACG-TARMA
3.7-IF:GAATCATTTTAACCAAGGAGGCA
3.7-IR:GACCAGGGTTAGTCTGAGGGCTTC
3.7-IP:FAM-CAGAGAAGGAAGTAGCTCCGACCA-TRAMA
用于检测αCSα引物对、探针和抑制剂：
CS-WF:CCTGCGGTGCACGCCTCAAT
CS-MF:CCTGCGGTGCACGCCTCAAC
CS-R:GGCAGCAGCCTGTGTGTGCCTG
CS-P:VIC-CCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTG-TRAMA
CS-WB:CTGACCTCCAAATACCGTTAAGCTGGAGCCT-ddC
CS-MB:CTGACCTCCAAATACCGTCAAGCTGGAGCCT-ddC
用于检测αQSα引物对、探针和抑制剂：
QS-WF:CCTGCGGTGCACGCCTCAAT
QS-MF:CCTGCGGTGCACGCCTCAAC
CS-R:GGCAGCAGCCTGTGTGTGCCTG
CS-P:VIC-CCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTG-TRAMA
QS-WB:ACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTT-ddC
QS-MB:ACCCCTGCGGTGCAGGCCTCCCCGGACAAGTT-ddC
用于检测αWestmeadα引物对、探针和抑制剂：
WS-WF:GAGTTCACCCCTGCGGTGTGC
WS-MF:GAGTTCACCCCTGCGGTGTGG
CS-R:GGCAGCAGCCTGTGTGTGCCTG
CS-P:VIC-CCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTG-TRAMA
QS-WB:ACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTT-ddC
QS-MB:ACCCCTGCGGTGCAGGCCTCCCCGGACAAGTT-ddC
3.如权利要求2所述一种a-地中海贫血基因检测试剂盒，其特征在于：所述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX荧光报告基团，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1荧光淬灭基团。
4.如权利要求2所述一种a-地中海贫血基因检测试剂盒，其特征在于：所述抑制剂3’端采用C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB或双脱氧胞苷(ddC)修饰。
5.如权利要求1所述一种a-地中海贫血基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液包含了PCR反应所需要的热启动taq酶、缓冲液、镁离子、dNTP物质。
6.如权利要求1所述一种a-地中海贫血基因检测试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品的获取方法为：--SEA、-α4.2、αCSα、αQSα和αWestmeadα根据NCBI数据库公布的基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，3种-α3.7缺失亚型为自测断裂位点后得到基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，将各质控品质粒等比例混合即为所述阳性质控品。
7.如权利要求1所述一种a-地中海贫血基因检测试剂盒，其特征在于：所述阴性质控品为DEPC处理过的去离子水。
8.一种根据权利要求1-7中任一项所述一种地中海贫血基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)取含有EDTA抗凝剂的真空血液样本进行核酸提取；
2)预混分装热启动taq酶、缓冲液、镁离子、dNTP物质基因检测试剂得到PCR反应液；
3)将步骤1)得到的DNA及各引物加入步骤2)中的PCR反应液中，分别得到PCR反应体系1、PCR反应体系2、PCR反应体系3、PCR反应体系4、PCR反应体系5、PCR反应体系6、PCR反应体系7、PCR反应体系8，共同组成PCR反应体系；混匀后进行PCR扩增；
4)反应结束后进行基因分型判读。
9.如权利要求8所述一种地中海贫血基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤3)PCR反应体系中各组分的浓度为：DNA，1-200ng；各引物，2-3μM；热启动taq酶，0.5U；镁离子，5Xbuffer；dNTP物质，20mM；反应总体积为20μl。
10.如权利要求8所述一种地中海贫血基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤3)中所述PCR扩增的条件为：
预变性的条件为：95℃，2分钟；
第一个阶段由5个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒；延伸：72℃，20秒；
第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒，设置荧光信号采集；延伸：72℃，30秒。
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