CN110951857A - 基于数字pcr无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法及试剂盒 - Google Patents

基于数字pcr无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN110951857A
CN110951857A CN201911265644.2A CN201911265644A CN110951857A CN 110951857 A CN110951857 A CN 110951857A CN 201911265644 A CN201911265644 A CN 201911265644A CN 110951857 A CN110951857 A CN 110951857A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chromosome
sample
seq
detection
copy number
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911265644.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110951857B (zh
Inventor
梁军
景奉香
吴东平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Turtle Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Turtle Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Turtle Technology Co ltd filed Critical Shanghai Turtle Technology Co ltd
Priority to CN201911265644.2A priority Critical patent/CN110951857B/zh
Publication of CN110951857A publication Critical patent/CN110951857A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110951857B publication Critical patent/CN110951857B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种基于数字PCR无创产前筛查21、18、13三体综合征的方法及试剂盒。本发明根据人类第21、18、13号染色体基因序列设计扩增引物和taqman探针，检测目标基因；同时，根据人类第2、8号染色体基因序列设计扩增引物和taqman探针，检测参照基因；并基于数字PCR技术和数据分析，得出待测样本的21、18和13号染色体数目是否存在异常的检测结果。本发明所提供的检测方法相比于二代测序，操作简单、无需建库和测序等步骤，数据分析简单易学，大规模检测速度快，且检测成本较低，便于常规临床实验室开展。

Description

基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法 及试剂盒
技术领域
本申请涉及数字PCR技术领域，尤其涉及一种基于数字PCR无创产前检测21、18、13三体综合征的方法及试剂盒。
背景技术
我国已成为出生缺陷的高发国，平均每年新增出生缺陷患儿高达120万，约占每年新增人口总数的4-6％，其中染色体异常性疾病是主要的疾病之一。这类疾病目前尚无有效的治疗方法，关键在于预防，即进行产前筛查和诊断。
染色体异常性疾病是指染色体的数目异常和/或形态结构变化，可发生于每一条染色体上。其中，又以21三体(唐氏综合征)、18三体(爱德华氏综合征)和13三体(帕陶氏综合征)三种常染色体非整倍体最为常见，在新生儿中的发病率分别为1/800，1/8000，1/25000。
目前，检测染色体非整倍体的疾病的方法有多种，通常使用羊膜穿刺来诊断胎儿遗传异常，但是羊膜穿刺术是侵入性的测试方法，可能引起感染和流产。近年来，基于二代测序检测孕妇血液中胎儿DNA，从而实现无创筛查遗传异常的方法被广泛应用，但存在检测费用高、检测流程长等问题。
发明内容
鉴于背景技术中存在的问题，本申请的目的在于提供一种基于数字PCR技术无创产前检测21、18、13三体综合征的方法及试剂盒。
为了达到上述目的，本申请的第一方面所提供的一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法，包括如下步骤：
(1)从待测样本孕妇外周血中获得游离DNA，作为待测基因组DNA；
(2)选择人类第21号、第18号和第13号染色体的检测位点，分别设计用于扩增和检测目标染色体的特异性引物和Taqman探针；选择人类第8号、第2号染色体的检测位点，分别设计用于扩增和检测参照染色体的特异性引物和Taqman探针；
其中，所述用于扩增和检测目标染色体的特异性引物和Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：36所示；所述用于扩增和检测参照染色体的特异性引物和Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：37～SEQ ID NO：48所示；
(3)配制数字PCR扩增反应体系，以步骤(1)所述的待测基因组DNA为模板，利用步骤(2)所述的特异性引物和Taqman探针进行数字PCR扩增和检测；
(4)根据数字PCR的荧光信号，分别得到待测样本的第21号染色体的拷贝数a21、第18号染色体的拷贝数a18、第13号染色体的拷贝数a13和参照染色体的拷贝数b；
其中，参照染色体的拷贝数b为待测样本的第2号染色体的拷贝数b2和第8号染色体的拷贝数b8的平均值；
(5)分别计算待测样本第21号染色体的拷贝数a21、第18号染色体的拷贝数a18、第13号染色体的拷贝数a13占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比y21、y18和y13；
(6)分别计算待测样本的第21号、第18号和第13号染色体的Z-score：(Z-score)21＝(y21-m)/σm；(Z-score)18＝(y18-n)/σn；(Z-score)13＝(y13-p)/σp；其中，
m为三体综合征阴性样本的第21号染色体的拷贝数a21占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比的平均值；
n为三体综合征阴性样本的第18号染色体的拷贝数a18占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比的平均值；
p为三体综合征阴性样本的第13号染色体的拷贝数a13占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比的平均值；
σm为三体综合征阴性样本的第21号染色体的拷贝数a21占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比的标准差；
σn为三体综合征阴性样本的第18号染色体的拷贝数a18占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比的标准差；
σp为三体综合征阴性样本的第13号染色体的拷贝数a13占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比的标准差；
(7)根据待测样本的第21号、第18号和第13号染色体的Z-score值分别判断待测样本的第21号染色体、第18号染色体或第13号染色体的数目是否存在异常。
本发明的实施方式中所选择的人类第21号、第18号、第13号、第8号、第2号染色体的检测位点，以及设计的用于扩增和检测目标染色体、参照染色体的特异性引物和Taqman探针如下表1所示。引物及探针的设计原则为：采用primer express3.0.1对筛选到的序列进行引物和探针设计，引物退火温度在59℃左右，探针退火温度在68℃左右，不易形成二聚体和发夹结构，GC含量正常，检测的扩增范围在65-100bp，并进行引物和探针特异性检测。
表1特异性引物和Taqman探针
Figure BDA0002312752300000031
Figure BDA0002312752300000041
优选地，根据待测样本的第21号、第18号和第13号染色体的Z-score值分别判断待测样本的第21号染色体、第18号染色体或第13号染色体的数目是否存在异常的步骤中：
当(Z-score)21≤1.96时，表明待测样本的21号染色体数目正常；当1.96＜(Z-score)21≤3时，重新检测；当(Z-score)21>3时，表明待测样本的21号染色体数目存在异常；
当(Z-score)18≤1.96时，表明待测样本的18号染色体数目正常；当1.96＜(Z-score)18≤3时，重新检测；当(Z-score)18>3时，表明待测样本的18号染色体数目存在异常；
当(Z-score)13≤1.96时，表明待测样本的13号染色体数目正常；当1.96＜(Z-score)13≤3时，重新检测；当(Z-score)13>3时，表明待测样本的13号染色体数目存在异常。
优选地，在本发明的实施方式所提供的检测方法中，根据人类第21号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用FAM标记；根据人类第18号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用HEX标记；根据人类第13号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用ROX标记；根据人类第8号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用CY5标记；根据人类第2号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用Alexa Fluor 700标记。
优选地，在本发明的实施方式所提供的检测方法中，所述数字PCR扩增反应的体系组成为：10×dPCR Buffer：3.5μL；酶：1.0μL；引物和探针：2.8μL；检测模板：1.0～17.5μL；总体积：用无核酶水补至30～35μL。
优选地，在本发明的实时方式所提供的检测方法中，所述数字PCR扩增反应的程序为：50℃：10分钟、1循环；90℃：10分钟、1循环；95℃：20秒，59℃：40s，45循环；25℃保持。
本申请的第二方面提供了一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的引物组合，包括：分别根据人类第21号、第18号和第13号染色体的检测位点设计的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：24所示；分别根据人类第8号、第2号染色体的检测位点设计的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：37～SEQ ID NO：44所示。
本申请的第三方面提供了一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的探针组合，包括：分别根据人类第21号、第18号和第13号染色体的检测位点设计的Taqman探针，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：36所示；分别根据人类第8号、第2号染色体的检测位点设计的Taqman探针，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：45～SEQ ID NO：48所示。
优选地，所述根据人类第21号染色体基因序列设计的Taqman探针采用FAM标记；所述根据人类第18号染色体基因序列设计的Taqman探针采用HEX标记；所述根据人类第13号染色体基因序列设计的Taqman探针采用ROX标记；所述根据人类第8号染色体基因序列设计的Taqman探针采用CY5标记；所述根据人类第2号染色体基因序列设计的Taqman探针采用Alexa Fluor 700标记。
本申请的第四方面提供了一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的试剂盒，包括：根据人类第21号、第18号和第13号染色体的检测位点设计的用于扩增和检测目标基因的特异性引物和Taqman探针；和根据人类第8号、第2号染色体的检测位点设计的用于检测参照基因的特异性引物和Taqman探针；其中，用于扩增和检测目标染色体的特异性引物和Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：36所示；用于扩增和检测参照染色体的特异性引物和Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：37～SEQ ID NO：48所示。
优选地，在本申请的实施方式所提供的基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的试剂盒中，所述根据人类第21号染色体基因序列设计的Taqman探针采用FAM标记；所述根据人类第18号染色体基因序列设计的Taqman探针采用HEX标记；所述根据人类第13号染色体基因序列设计的Taqman探针采用ROX标记；所述根据人类第8号染色体基因序列设计的Taqman探针采用CY5标记；所述根据人类第2号染色体基因序列设计的Taqman探针采用Alexa Fluor 700标记。
相对于现有技术而言，本发明提供了基于数字PCR无创产前筛查13、18、21三体综合征的方法及试剂盒。本发明根据13、18、21号染色体的基因序列设计扩增引物和taqman探针，检测目标基因；同时根据2、8号染色体基因基因序列设计扩增引物和taqman探针，检测参照基因。血浆中母体游离DNA的长度大约为166bp，胎儿游离DNA的长度大约为146bp，本发明在一条目标染色体上设计4个检测位点，一条参照染色体上设计2个检测位点，这样设计可以提高检测的准确性。检测位点的筛选主要标准为序列保守，无重复序列，检测位点间隔大于500bp。
本发明基于数字PCR技术，操作比二代测序简单，无需建库、测序等步骤，数据分析简单易学，大规模检测速度快，便于常规临床实验室开展，成本只有二代测序方法的一半，是无创产前DNA检测的新方法。
附图说明
图1是根据本申请实施方式的检测方法流程图；
图2是根据本申请实施方式的三体综合征阴性样本21、18、13号染色体的y值的标准正态分布图。
具体实施方式
实施例一方法有效性验证
1、待测样本制备
(1)实验组样本：
分别以21三体患者血浆与正常人血浆样本按16％、8％、4％、2％、1％比例混匀，得到具有不同突变频率的21三体混合样本。
以上述同样方法，制备18三体混合样本和13三体混合样本。
(2)对照组样本：即参考样本，为大量已知1000例正常孕妇样本(阴性)。
使用血浆游离DNA提取试剂盒提取样本DNA备用。
2、试剂配制：
按照以下配方制备dPCR反应液(推荐dPCR反应体系，1个反应)：
Figure BDA0002312752300000071
Figure BDA0002312752300000081
将上述反应液混合均匀，涡旋混匀30秒，瞬时离心将反应液收集于管底后置于冰上待用。
3、按照以下比例制备油相混合液(1个反应)：
组分 用量
油相A 30μL
油相B 10μL
总计 40μL
按上表配方将反应油相混合后，涡旋混匀30s，瞬时离心除去气泡，并将液体收集于管底，置于冰上待用(注：混合后的油相混合液在30min以内使用)。
4、芯片进样
(1)检测系统
本实施例使用上海小海龟科技有限公司数字PCR系统biodigital·青，系统为5路荧光通道，可并行处理96个样本，芯片有效液滴数为20万个。
I、如每样本检测使用2张生物芯片，则：
表1中，SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26引物探针位于芯片1FAM通道；SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28引物探针位于芯片2FAM通道，检测21号染色体；SEQ ID NO：9～SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30引物探针位于芯片1HEX通道，SEQ ID NO：13～SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32引物探针位于芯片2HEX通道，检测18号染色体；SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34引物探针位于芯片1ROX通道，SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36引物探针位于芯片2ROX通道，检测13号染色体；SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：45引物探针位于芯片1CY5通道，SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：46引物探针位于芯片2CY5通道，检测8号染色体；SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：47引物探针位于芯片1Alexa Fluor 700通道，SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：48引物探针位于芯片2Alexa Fluor 700通道，检测2号染色体。
II、如每样本检测使用1张生物芯片，则：
表1中，SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：28引物探针位于FAM通道，检测21号染色体；SEQ ID NO：9～SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：29～SEQ ID NO：32引物探针位于HEX通道，检测18号染色体；SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：33～SEQID NO：36引物探针位于ROX通道，检测13号染色体；SEQ ID NO：37～SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46引物探针位于CY5通道，检测8号染色体；SEQ ID NO：41～SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48引物探针位于Alexa Fluor 700通道，检测2号染色体。
本实施例每样检测使用一张生物芯片。
(2)进样操作
按照数字PCR进样仪使用操作说明书的要求，开启芯片进样程序，完成芯片进样。
5、芯片热循环反应
将芯片置于核酸扩增仪的芯片槽内，进行热循环反应。
反应程序：
Figure BDA0002312752300000091
6、芯片阅读分析
热循环反应结束后将芯片移至生物芯片阅读仪上，按照生物芯片阅读仪使用操作说明书的要求进行阅读分析，得到每个荧光通道拷贝数，即：分别得到待测样本的第21号染色体的拷贝数a21、第18号染色体的拷贝数a18、第13号染色体的拷贝数a13和参照染色体的拷贝数b；其中，参照染色体的拷贝数b为待测样本的第2号染色体的拷贝数b2和第8号染色体的拷贝数b8的平均值；
分别计算待测样本第21号染色体的拷贝数a21、第18号染色体的拷贝数a18、第13号染色体的拷贝数a13占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比y21、y18和y13。
此外，提供三体综合征阴性样本(即参考样本)21号、18号、13号染色体y值均值和标准差：
参考样本21号染色体y值均值m＝0.9931，y值标准差σm＝0.006634；参考样本18号染色体y值均值n＝0.9955，y值标准差σn＝0.005949；参考样本18号染色体y值均值p＝0.9968，y值标准差σn＝0.006582；然后，计算待测样本染色体的Z-score，根据Z-score值大小从而判断该染色体是否存在异常。Z-score的计算公式如下：
(Z-score)21＝(y21-m)/σm；(Z-score)18＝(y18-n)/σn；(Z-score)13＝(y13-p)/σp；
通过计算得到样本21号染色体、18号染色体和13号染色体的Z-score值，根据每个样本的Z-score值判断样本的检测结果。
21三体混合样本检测结果
Figure BDA0002312752300000101
18三体混合样本检测结果
Figure BDA0002312752300000111
13三体混合样本检测结果
Figure BDA0002312752300000112
注：染色体拷贝数为各相关通道拷贝数计总
对1000例参考样本的y值采用Kolmogorov-Smirnov检验和shapiro检验进行正态检验分析，结果表明21、18、13号染色体的y值满足标准正态分布(如附图2所示)，因此可使用Z-score检验验证阳性样本与阴性样本是否存在显著性差异。
通过参考样本Z-score值统计，结果满足标准正态分布，三体阴性样本的Z-score≤1.96的概率约为98％；Z-score在(1.96,3]的概率在1.14％～2.14％之间；Z-score>3的概率为0。在标准正态分布下，Z-score≤1.96的概率是97.49％；Z-score在(1.96,3]之间概率为2.37％；Z-score>3的概率为0.14％。因此，三体阴性样本的Z-score值与标准正态分布基本一致。
7、结果判定
判定阴性样本：当21号染色体、18号染色体、13号染色体的Z-score≤1.96时，表明检测样本的21号染色体、18号染色体或13号染色体与参考样本库中正常的染色体无显著差异，即21号染色体、18号染色体或13号染色体数目正常；
判断灰区样本：当21号染色体、18号染色体或13号染色体的Z-score落于灰区(1.96,3]范围内时，因无法排除由于胎儿DNA浓度过低(<4％)而导致假阴性的可能，故建议重新抽血取样后复检，复检结果仍在灰区的，判断为阳性；
判断阳性样本：当21号染色体、18号染色体或13号染色体的Z-score>3时，表明检测样本的21号染色体、18号染色体或13号染色体与参考数据库中正常的染色体存在显著差异，即检测样本的21号染色体、18号染色体或13号染色体的数目存在异常，预测患有21-三体综合征、18-三体综合征或13-三体综合征；
综上表明，本系统可对含4％及以上比例的胎儿DNA的母体血浆游离DNA进行准确检测。根据本申请实施方式的检测方法流程图如附图1所示。
实施例二样本检测试验
1、待测样本制备
分别取经水羊穿刺确认过的21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征患者血浆样本各2例，样本编号为1～6。使用血浆游离DNA提取试剂盒提取样本DNA备用。
2、试剂配制按说明书进行。
3、芯片进样
(1)检测系统
本实施例使用上海小海龟科技有限公司数字PCR系统biodigital·青，系统为5路荧光通道，可并行处理96个样本，芯片有效液滴数为20万个，每样本检测使用1张生物芯片。
(2)进样操作
按照数字PCR进样仪使用操作说明书的要求，开启芯片进样程序，完成芯片进样。
4、芯片热循环反应、检测分析同上。
5、样本检测结果
Figure BDA0002312752300000131
Figure BDA0002312752300000132
Figure BDA0002312752300000133
注：染色体拷贝数为各相关通道拷贝数计总
1～2号样本21号染色体Z-score均>3，即21号染色体的数目存在异常，预测患有21-三体综合征。3～4号样本18号染色体Z-score均>3，即18号染色体的数目存在异常，预测患有18-三体综合征。5～6号样本13号染色体Z-score均>3，即13号染色体的数目存在异常，预测患有13-三体综合征。检测结果与预期稳合。
根据上述说明书的揭示和教导，本领域技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本申请并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本申请的一些修改和变更也应当落入本申请的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本申请构成任何限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海小海龟科技有限公司
<120> 基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法及试剂盒
<130> 191568CN-CH-I
<160> 48
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagccagtaa atgcgacgat ta 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tccatatcat ctccggttcg a 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caatgtctct gttctgctgg aaga 24
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cagtaccaaa tttcagaaca caagaag 27
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctcacatgg tcactttgga cat 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agtgttcaga aagaactgca gatga 25
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctgatgagag agtgctgaga agga 24
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcgctgtccc cttcttgat 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cggagtgcca ttaaggaaag at 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ataagtggtc atgccaggat taaat 25
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggagcccttt cttcctaaga gatt 24
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtgagccata ccaaaaacaa aaataa 26
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cacggctgct gcataaactc 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tctccatcaa ggctttcgac tac 23
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ttgaaacacg gttgacctga ac 22
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cacccgcagg tgcaattc 18
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgcggatact ttgcttattc gttt 24
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aactgatctg cagcataacg ataga 25
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cacgcatcac taaatgcaag ttc 23
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tcatgtgttt ctcattcttc ttcca 25
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
agcttctcta caggtgggtt tga 23
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gaacttcgag atacgggcac at 22
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cattgctgat ggactgcata gtc 23
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tccagcggtc gatccatag 19
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
aagcctctgc ttccgttttc catctgg 27
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cccataaaca ggagaaaggc tgacaaacca 30
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tcacgcttat tttcagctcc gtggactt 28
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tcctcagtcc tggaagccgg cc 22
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
catcccagaa tagtggctgt tgctcaca 28
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ttaggtgatt ctcacttcct cttgcccca 29
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ccgctgcagg ctgtacgcct tc 22
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
aggaattaat gcccccttat ggaacctgc 29
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
acgaccgcac agctccgagg tt 22
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
caagctgcac tcttgctgag tcccc 25
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cgctccggca gcaagaatcc g 21
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tcctgcctgt gtaggaccct ggctc 25
<210> 37
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
caaaattaca ttacagcagg cagagt 26
<210> 38
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
tccattacaa caacctagaa tgataagtc 29
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
atgatcacct tgtctatacg ttgctt 26
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
agggaggaga tgatttgaga acag 24
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
aagctcctct tggagacaaa agc 23
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
gctctaaact gcaaggaaaa caatg 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
atatatctgt tccaaacccc atctg 25
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tgggccagga gaaatcttat acc 23
<210> 45
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ccaaattcca acctgcagct actggc 26
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
tctgtccatt gcttttgcca cacca 25
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ttctttatca gagccccggg ccc 23
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
aattctatcc cttctccact ccctgggc 28

Claims (10)

1.一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从待测样本孕妇外周血中获得游离DNA，作为待测基因组DNA；
(2)选择人类第21号、第18号和第13号染色体的检测位点，分别设计用于扩增和检测目标染色体的特异性引物和Taqman探针；选择人类第8号、第2号染色体的检测位点，分别设计用于扩增和检测参照染色体的特异性引物和Taqman探针；
其中，所述用于扩增和检测目标染色体的特异性引物和Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：36所示；所述用于扩增和检测参照染色体的特异性引物和Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：37～SEQ ID NO：48所示；
(3)配制数字PCR扩增反应体系，以步骤(1)所述的待测基因组DNA为模板，利用步骤(2)所述的特异性引物和Taqman探针进行数字PCR扩增和检测；
(4)根据数字PCR的荧光信号，分别得到待测样本的第21号染色体的拷贝数a21、第18号染色体的拷贝数a18、第13号染色体的拷贝数a13和参照染色体的拷贝数b；
其中，参照染色体的拷贝数b为待测样本的第2号染色体的拷贝数b2和第8号染色体的拷贝数b8的平均值；
(5)分别计算待测样本第21号染色体的拷贝数a21、第18号染色体的拷贝数a18、第13号染色体的拷贝数a13占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比y21、y18和y13；
(6)分别计算待测样本的第21号、第18号和第13号染色体的Z-score：(Z-score)21＝(y21-m)/σm；(Z-score)18＝(y18-n)/σn；(Z-score)13＝(y13-p)/σp；其中，
m为三体综合征阴性样本的第21号染色体的拷贝数a21占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比的平均值；
n为三体综合征阴性样本的第18号染色体的拷贝数a18占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比的平均值；
p为三体综合征阴性样本的第13号染色体的拷贝数a13占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比的平均值；
σm为三体综合征阴性样本的第21号染色体的拷贝数a21占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比的标准差；
σn为三体综合征阴性样本的第18号染色体的拷贝数a18占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比的标准差；
σp为三体综合征阴性样本的第13号染色体的拷贝数a13占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比的标准差；
(7)根据待测样本的第21号、第18号和第13号染色体的Z-score值分别判断待测样本的第21号染色体、第18号染色体或第13号染色体的数目是否存在异常。
2.根据权利要求1所述的基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法，其特征在于，
当(Z-score)21≤1.96时，表明待测样本的21号染色体数目正常；当1.96＜(Z-score)21≤3时，重新检测；当(Z-score)21>3时，表明待测样本的21号染色体数目存在异常；
当(Z-score)18≤1.96时，表明待测样本的18号染色体数目正常；当1.96＜(Z-score)18≤3时，重新检测；当(Z-score)18>3时，表明待测样本的18号染色体数目存在异常；
当(Z-score)13≤1.96时，表明待测样本的13号染色体数目正常；当1.96＜(Z-score)13≤3时，重新检测；当(Z-score)13>3时，表明待测样本的13号染色体数目存在异常。
3.根据权利要求1所述的基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法，其特征在于，根据人类第21号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用FAM标记；根据人类第18号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用HEX标记；根据人类第13号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用ROX标记；根据人类第8号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用CY5标记；根据人类第2号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用Alexa Fluor 700标记。
4.根据权利要求1所述的基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法，其特征在于，所述数字PCR扩增反应的体系组成为：10×dPCR Buffer：3.5μL；酶：1.0μL；引物和探针：2.8μL；检测模板：1.0～17.5μL；总体积：用无核酶水补至30～35μL。
5.根据权利要求1所述的基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法，其特征在于，所述数字PCR扩增反应的程序为：50℃：10分钟、1循环；90℃：10分钟、1循环；95℃：20秒，59℃：40s，45循环；25℃保持。
6.一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的引物组合，其特征在于，包括：
分别根据人类第21号、第18号和第13号染色体的检测位点设计的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：24所示；
分别根据人类第8号、第2号染色体的检测位点设计的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：37～SEQ ID NO：44所示。
7.一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的探针组合，其特征在于，包括：
分别根据人类第21号、第18号和第13号染色体的检测位点设计的Taqman探针，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：36所示；
分别根据人类第8号、第2号染色体的检测位点设计的Taqman探针，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：45～SEQ ID NO：48所示。
8.根据权利要求7所述的基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的探针组合，其特征在于，
所述根据人类第21号染色体基因序列设计的Taqman探针采用FAM标记；所述根据人类第18号染色体基因序列设计的Taqman探针采用HEX标记；所述根据人类第13号染色体基因序列设计的Taqman探针采用ROX标记；所述根据人类第8号染色体基因序列设计的Taqman探针采用CY5标记；所述根据人类第2号染色体基因序列设计的Taqman探针采用Alexa Fluor700标记。
9.一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的试剂盒，其特征在于，包括：
根据人类第21号、第18号和第13号染色体的检测位点设计的用于扩增和检测目标基因的特异性引物和Taqman探针；
根据人类第8号、第2号染色体的检测位点设计的用于检测参照基因的特异性引物和Taqman探针；
其中，
用于扩增和检测目标染色体的特异性引物和Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：36所示；用于扩增和检测参照染色体的特异性引物和Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：37～SEQ ID NO：48所示。
10.根据权利要求9所述的基于数字PCR无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的试剂盒，其特征在于：
所述根据人类第21号染色体基因序列设计的Taqman探针采用FAM标记；所述根据人类第18号染色体基因序列设计的Taqman探针采用HEX标记；所述根据人类第13号染色体基因序列设计的Taqman探针采用ROX标记；所述根据人类第8号染色体基因序列设计的Taqman探针采用CY5标记；所述根据人类第2号染色体基因序列设计的Taqman探针采用Alexa Fluor700标记。
CN201911265644.2A 2019-12-11 2019-12-11 基于数字pcr无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法及试剂盒 Active CN110951857B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911265644.2A CN110951857B (zh) 2019-12-11 2019-12-11 基于数字pcr无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911265644.2A CN110951857B (zh) 2019-12-11 2019-12-11 基于数字pcr无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110951857A true CN110951857A (zh) 2020-04-03
CN110951857B CN110951857B (zh) 2023-11-21

Family

ID=69980883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911265644.2A Active CN110951857B (zh) 2019-12-11 2019-12-11 基于数字pcr无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110951857B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114921459A (zh) * 2022-05-16 2022-08-19 西北工业大学 基于数字pcr技术无创产前筛查胎儿常见染色体异常的引物组合

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105695567A (zh) * 2015-11-30 2016-06-22 北京昱晟达医疗科技有限公司 一种用于检测胎儿染色体非整倍体的试剂盒、引物和探针序列及检测方法
CN110106235A (zh) * 2019-05-24 2019-08-09 苏州索真生物技术有限公司 一种基于数字微滴pcr无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105695567A (zh) * 2015-11-30 2016-06-22 北京昱晟达医疗科技有限公司 一种用于检测胎儿染色体非整倍体的试剂盒、引物和探针序列及检测方法
CN110106235A (zh) * 2019-05-24 2019-08-09 苏州索真生物技术有限公司 一种基于数字微滴pcr无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114921459A (zh) * 2022-05-16 2022-08-19 西北工业大学 基于数字pcr技术无创产前筛查胎儿常见染色体异常的引物组合

Also Published As

Publication number Publication date
CN110951857B (zh) 2023-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021128659A1 (zh) 特异性引物探针组合及其适于血液直接扩增结合荧光pcr法检测叶酸代谢能力基因的应用
CN111073961A (zh) 一种基因稀有突变的高通量检测方法
CN111235272B (zh) 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用
CN110093413A (zh) 检测β地中海贫血的引物组和试剂盒
CN111004862B (zh) 用于快速检测并鉴定隐球菌的引物和探针及其应用
CN113025701B (zh) 非酒精性脂肪性肝病易感基因的早筛方法及试剂盒
CN109694907B (zh) 一种无创产前筛查三体综合征的试剂盒及其应用
CN115786459B (zh) 一种应用于高通量测序检测实体瘤微小残留病的方法
CN111118138A (zh) 一种叶酸代谢能力基因mthfr和mtrr多态性检测试剂盒及方法
CN106939334B (zh) 一种孕妇血浆中胎儿dna含量的检测方法
CN106521023A (zh) 一种检测中国人HPFH和δβ‑地中海贫血的试剂盒及方法
CN111455044A (zh) 一种用于母羊早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用
CN110923306B (zh) 基于数字pcr无创产前检测胎儿21-三体综合征的引物、探针、试剂盒及方法
CN114107488A (zh) 一种检测mthfr基因多态性的引物组及试剂盒
CN101921864A (zh) 一种肝癌外周血基因诊断模型及诊断试剂盒
CN112921126A (zh) 一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法
CN110951857B (zh) 基于数字pcr无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法及试剂盒
CN108220416B (zh) 一种用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒及其应用
CN113755568B (zh) 利用微滴数字PCR检测α珠蛋白基因拷贝数的引物探针、试剂盒及应用
CN116064775A (zh) TRECs、KRECs和SMN1的检测试剂盒和检测方法
CN112899358A (zh) 一种无创产前胎儿染色体非整倍体的检测方法及其试剂盒
CN111334568A (zh) 一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选的多重连接探针扩增探针组合及试剂盒
CN112779322A (zh) 一种基于非荧光标记探针的高分辨熔解曲线的基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用
CN112029851A (zh) 一种氯吡格雷用药基因多态性检测的方法、试剂盒及其应用
CN114606311B (zh) SLC39A13基因rs755555位点的应用及其检测引物和探针组合、试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant