CN114921459A - 基于数字pcr技术无创产前筛查胎儿常见染色体异常的引物组合 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于数字PCR技术无创产前筛查胎儿常见染色体异常的引物组合，根据已知通用探针序列，通过筛选21、18、13号染色体上的保守区域序列来设计多重引物作为靶染色体引物，通过筛选其他染色体的保守区域来设计多重引物作为参考染色体引物，优化反应条件解决可能出现的多重引物的互相配对问题，并以微滴式数字PCR作为平台，可增加阳性率、提高检测限，筛查胎儿21、18、13号染色体是否存在异常，操作简单，适于临床推广。
Description
技术领域
本发明属于染色体检测，特别涉及母血中胎儿游离核酸的检测，涉及一种基于数字PCR技术无创产前筛查胎儿常见染色体异常的引物组合。
背景技术
21三体综合征(唐氏综合征)、18三体综合征(爱德华氏综合征)和13三体综合征(帕陶氏综合征)为常见染色体异常疾病，占总染色体非整倍体出生缺陷人口的80％-90％。染色体疾病在出生缺陷患儿中发生率高，常常导致智力障碍及婴幼儿期死亡，对人类危害极大。出生缺陷是影响出生人口素质的重要问题，给社会和家庭带来沉重负担，而产前检测是减少出生缺陷的有效措施之一。
在新一代测序技术出现之前，诊断胎儿染色体疾病常通过侵入性产前诊断操作,如绒毛活检、羊膜腔穿刺获得样本,对细胞培养后进行染色体核型分析以明确诊断。但穿刺引起的出血或感染而导致的流产率达0.2％-0.4％，绒穿导致胎儿肢体畸形的风险达0.01％-0.03％，且产前胎儿组织取材时不可避免混入母体组织，影响了胎儿遗传物质诊断的准确性。随着测序技术的发展，利用孕妇外周血中的胎儿游离DNA进行无创性产前诊断方法取得尤为突出的进展，该技术从母体外周血中胎儿细胞和游离胎儿核酸采样和分析技术，可避免流产风险，特异性好。
目前检测胎儿是否患有三大染色体疾病主要就是通过抽取孕妇外周血，对孕妇外周血中的游离DNA(cfDNA)，利用二代测序(NGS)即无创产前筛查来检测胎儿染色体，再将测序结果进行生物信息学分析，对染色体具有优越的全景性描述，但其数据冗余需要专业的人员来操作，导致检测耗时长且费用昂贵，用于筛查对于社会和家庭负担较重，另外，胎儿游离核酸在血液中清除速率极快，检测难度较大。而数字PCR用于无创产前筛查没有做冗余的扩增，成本较低，并且数字PCR数据分析简单，可用于广泛的筛查工作。数字PCR进行产前筛查的方法一般采取多对引物配合多条探针进行检测，每条探针仅标记一对引物。且目前数字PCR仪多为2个荧光通道，且探针价格较高，探针的数量受到限制，因此引物的数量也受到限制。而胎儿游离核酸含量很少，仅用几对引物进行扩增，实际上并不能充分扩增，DNA的扩增效率较低，阳性克隆数少，导致诊断敏感性下降。
因而，期望能够提供一种基于数字PCR用于胎儿常见染色体异常疾病筛查的成本低且能够保证DNA得到充分的扩增的引物组合。
发明内容
要解决的技术问题
为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种基于数字PCR技术无创产前筛查胎儿常见染色体异常的引物组合，解决目前检测存在二代测序耗时长、价格高昂、进行广泛筛查对家庭和社会造成的负担较重、以及检测敏感性低的不足之处。
技术方案
一种基于数字PCR技术无创产前筛查胎儿常见染色体异常的引物组合，其特征在于包括：根据人类第21、18、13号染色体的基因序列设计的多条特异性引物即靶染色体引物，以及根据人类其他染色体的基因序列设计设计的多条特异性引物即参考染色体引物；其中所述多条特异性引物的核苷酸序列为SEQIDNO：1-80。
所述的引物组合分为四组，第一组包括SEQIDNO1-20的核苷酸序列，检测21号染色体；第二组包括SEQIDNO21-40的核苷酸序列，检测18号染色体；第三组包括SEQIDNO41-60的核苷酸序列，检测13号染色体；第四组包括SEQIDNO61-80的核苷酸序列，检测其他参染色体。
为实现本发明检测染色体数目的目的，本发明提供了一种基于数字PCR无创产前筛查胎儿常见染色体异常的引物组合。本发明通过筛选目标染色体及参考染色体上的保守区域设计多重引物，在数字PCR检测的引物中进行了严格的实验筛选，优化解决可能出现的多重引物的互相配对问题，筛选出具有大致相同扩增效率，混在一起又互不干扰的引物组合。只需扩增21、18、13号染色体及参考染色体的基因序列，可增加阳性率、提高检测限。
其中，在孕妇血浆中，母体和胎儿游离的DNA是片段化的，且浓度极低，而游离DNA的浓度是染色体非整倍体结果判断和分析中的一个关键参数。在数字PCR中，来自同一染色体的游离DNA分散到不同的液滴中进行独立数字PCR反应。基于此，可以根据通用探针序列，在染色体保守序列上寻找重复的短核苷酸序列，对同一染色体上多个基因设计多个引物对，根据21、18、13及参考染色体的基因序列设计多条扩增引物。在本发明中在21、18、13及参考染色体上分别设计和筛选出10个位点合格的扩增引物，并用通用探针标记。采用两条通用探针同时检测21、18、13号染色体及参考染色体，并对引物组合进行优化，在不增加模板量的情况下，增加检测到的目标DNA分子的数量，能够获得足够的阳性克隆，大大提高了准确性。
其中，由于血浆中游离DNA的长度在166bp左右，设计引物时，应注意扩增长度在60-100bp内，扩增子之间的距离大于10000bp。扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得，也容易保证分析的一致性。
其中，为了筛选出大致相同的扩增效率的检测反应，本发明对每对引物的检测都进行了单独测试，筛选出扩增效率高，同时扩增效率相近的引物检测反应。筛选出单独扩增满足要求的引物后，再检测目标染色体引物和参考染色体引物组合的扩增表现。
其中，为了提高检测的准确性，参考染色体选择了多条染色体对比计算被检测染色体的整倍性。同时，为了降低成本，21、18、13号染色体所用通用探针为同一条，用FAM荧光基团标记，参考染色体所用通用探针为另外的同一条，用VIC荧光基团标记，且在通用探针中加入LNA修饰来提高探针的退火温度。检测一个样本的三条染色体用三个数字PCR反应完成，均为参考染色体和目标染色体的检测组合。
具体为：本发明请求保护一种基于数字PCR检测胎儿常见染色体异常的引物组合，包括：根据人类21、18、13号染色体及参考染色体基因序列，分别设计筛选的多条特异性引物。
其中所述多条特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1-80。
其中所述的引物组合分为四组，第一组包括SEQ ID NO：1-20的核苷酸序列，检测21号染色体；第二组包括SEQ ID NO：21-40的核苷酸序列，检测18号染色体；第三组包括SEQID NO：41-60的核苷酸序列，检测13号染色体；第四组包括SEQ ID NO：61-80的核苷酸序列，检测其他参考染色体。探针序列为AEQ ID NO:81-82。
为了提升检测的精准性和敏感性，本发明对检测的引物和探针浓度进行了优化。针对本发明中引物组合的浓度上下限范围为100-400nM，探针组合的浓度上下限范围为50nM-200nM。
进一步，本发明发现三组引物组合浓度在200nM时的表现最优，探针组合浓度在100nM时的表现最优。
本发明的检测可以运行在任何一家生产的数字PCR仪上，如果仪器荧光信号通道足够多，本发明的检测的检测反应可以合成在一管中进行检测来实现更便宜高效且快速简便的经济效益，本发明的检测21、18、13号染色体及参考染色体，但并仅限检测这三条染色体，根据本发明的设计思想可以检测其他染色体。
有益效果
本发明提出的一种基于数字PCR技术无创产前筛查胎儿常见染色体异常的引物组合，根据已知通用探针序列，通过筛选21、18、13号染色体上的保守区域序列来设计多重引物作为靶染色体引物，通过筛选其他染色体的保守区域来设计多重引物作为参考染色体引物，优化反应条件解决可能出现的多重引物的互相配对问题，并以微滴式数字PCR作为平台，可增加阳性率、提高检测限，筛查胎儿21、18、13号染色体是否存在异常，操作简单，适于临床推广。
本发明的有益效果体现在：
1.本发明的引物组合可直接检测孕妇血浆中DNA的拷贝数，同时检测每条染色体的10个特异片段，避免因样本质量问题或扩增过程中碱基突变产生的误差而导致临床误诊，是无创条件下最准确和直接地检测胎儿染色体倍性地方法。
本发明提供的引物组合只需对孕妇血浆DNA在数字PCR上进行检测，不需复杂的数据分析，整个检测过程耗时短，操作简单，成本低，适合地区级医院推广使用，不受资金投入和人员素质地限制。
附图说明
图1.引物组合的模拟样本中的结果图
图2.引物组合在临床样本中的结果图
具体实施方式
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述：
以下结合附图和具体实施例对本发明的内容作进一步的详细描述。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1引物组合的设计筛选
本发明提供了一种基于数字PCR无创产前筛查胎儿常见染色体异常的引物组合，通过筛选目标染色体及参考染色体上的保守区域设计多重引物，在数字PCR检测的引物中进行了严格的实验筛选，优化解决可能出现的多重引物的互相配对问题，筛选出具有大致相同扩增效率，混在一起又互不干扰的引物组合。只需扩增21、18、13号染色体及参考染色体的基因序列，可增加阳性率、提高检测限。
其中，在孕妇血浆中，母体和胎儿游离的DNA是片段化的，且浓度极低，而游离DNA的浓度是染色体非整倍体结果判断和分析中的一个关键参数。在数字PCR中，来自同一染色体的游离DNA分散到不同的液滴中进行独立数字PCR反应。基于此，可以根据通用探针序列，在染色体保守序列上寻找重复的短核苷酸序列，对同一染色体上多个基因设计多个引物对，根据21、18、13及参考染色体的基因序列设计多条扩增引物。在本发明中在21、18、13及参考染色体上分别设计和筛选出10个位点合格的扩增引物，并用通用探针标记。采用两条通用探针同时检测21、18、13号染色体及参考染色体，并对引物组合进行优化，在不增加模板量的情况下，增加检测到的目标DNA分子的数量，能够获得足够的阳性克隆，大大提高了准确性。
其中，由于血浆中游离DNA的长度在166bp左右，设计引物时，应注意扩增长度在60-100bp内，扩增子之间的距离大于10000bp。扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得，也容易保证分析的一致性。
其中，为了筛选出大致相同的扩增效率的检测反应，本发明对每对引物的检测都进行了单独测试，筛选出扩增效率高，同时扩增效率相近的引物检测反应。筛选出单独扩增满足要求的引物后，再检测目标染色体引物和参考染色体引物组合的扩增表现。
本发明根据已有文献在通用探针库分析设计中心(https://lifescience.roche.com/en_cn/brands/universal-probe-library.html)中选取了两条通用探针，直接将多个LNA核苷酸位点选择性地掺入DNA序列中，分别标记靶染色体和参考染色体。通用探针序列如SEQ ID NO 81-82所示。
根据上述所述和实验筛选，本发明筛选出检测21、18、13号染色体及参考染色体数目的引物组合，一共40组引物及2条通用探针序列，序列分别为：
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chr2-1-R(SEQ ID NO 66):ggtagacgatggagccttgt
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chr3-1-R(SEQ ID NO 68):ttgttgcaaagaagactgtacca
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chr4-1-R(SEQ ID NO 70):tgaccctccaaccctcataa
chr4-2-F(SEQ ID NO 71):gcactgaccttccaattcct
chr4-2-R(SEQ ID NO 72):ggcaatttgggattggagta
chr5-1-F(SEQ ID NO 73):aaaatacttgtctgcttctgcgta
chr5-1-R(SEQ ID NO 74):agactggcttctatgaagatatgga
chr5-2-F(SEQ ID NO 75):caagagtgccaatccaaaaga
chr5-2-R(SEQ ID NO 76):cccaggcaacacatttatacc
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chr10-1-R(SEQ ID NO 78):aggcaacctaaagccagttg
chr10-2-F(SEQ ID NO 79):aggagagggctcctcgtg
chr10-2-R(SEQ ID NO 80):gtgctttggctccgtcag
Probe1(SEQ ID NO 81):FAM-5‘C/iXNA_C//iXNA_C/T/iXNA_G//iXNA_C/CT/iXNA_C/T3’-BHQ1
Probe2(SEQ ID NO 82):VIC-5‘C/iXNA_C//iXNA_C/A/iXNA_C//iXNA_C/TC/iXNA_C/A3’-BHQ1
实施例2引物组合的可行性
根据质量比配制胎儿DNA浓度为100％、25％、10％、5％、2％、1％、0％的模拟血浆DNA样本，分别来模拟孕妇血浆中21、18、13三体胎儿游离DNA的浓度。配制公式为C胎儿游离DNA浓度＝N胎儿片段化gDNA/(N胎儿片段化gDNA+N健康未孕女性片段化gDNA)，总模板量为2ng。分别以21、18、13号染色体及参考染色体的4，6，8，10对引物用进行ddPCR扩增。利用from sklearn.metrics import r2_score函数将实际检测到的Ratio与理论Ratio作拟合分析检测结果。
在对21号染色体的检测中，当引物数量为4对时，R2＝0.8296；当引物数量为6对时，R2＝0.9697；当引物数量为8对时，R2＝0.9246；当引物数量为10对时，R2＝0.9934。
在对18号染色体的检测中，当引物数量为4对时，R2＝0.94447；当引物数量为6对时，R2＝0.9766；当引物数量为8对时，R2＝0.9644；当引物数量为10对时，R2＝0.9639。
在对13号染色体的检测中，当引物数量为4对时，R2＝0.8868；当引物数量为6对时，R2＝0.8233；当引物数量为8对时，R2＝0.92；当引物数量为10对时，R2＝0.9648。
结果显示(如图1所示)ddPCR在不同浓度的实际检测Ratio值与理论Ratio值的相关性分析中，检测值与理论值高度相关，并且，在不增加模板量的情况下，随着引物对的数目增加，检测到的目标DNA分子的数量也随之增加，我们可以看到ddPCR在不同浓度的检测值与理论值相比有着较高的准确性和一致性。证明了在不增加cfDNA量的情况下，增加引物对数进行NIPT的策略是可行的。
实施例3引物组合的实用性
提取孕妇血浆cfDNA，以49例NGS提示为胎儿低风险的孕妇血浆作为训练集进行该引物组合的数字PCR检测。
根据训练集样本进行结果判定：
21号染色体数目判断：当Z-scorechr21≤1.442089时，说明测试血浆样本与训练集中正常血浆样本无显著差异，即21号染色体正常；当Z-scorechr21在(1.442089,1.727363]范围内时，可能是因为cfDNA浓度过低导致假阴性，建议复检；当Z-scorechr21＞1.727363时，说明测试血浆样本与训练集正常血浆样本存在显著差异，即21号染色体数目异常，预测胎儿患有21三体综合征。
18号染色体数目判断：当Z-scorechr18≤1.112509时，说明测试血浆样本与训练集中正常血浆样本无显著差异，即18号染色体正常；当Z-scorechr18在(1.112509，1.634793]范围内时，可能是因为cfDNA浓度过低导致假阴性，建议复检；当Z-scorechr18>1.634793时，说明测试血浆样本与训练集正常血浆样本存在显著差异，即18号染色体数目异常，预测胎儿患有18三体综合征。
13号染色体数目判断：当Z-scorechr13≤1.562367时，说明测试血浆样本与训练集中正常血浆样本无显著差异，即13号染色体正常；当Z-scorechr13在(1.562367，2.484735]范围内时，可能是因为cfDNA浓度过低导致假阴性，建议复检；当Z-scorechr13>2.484735时，说明测试血浆样本与训练集正常血浆样本存在显著差异，即13号染色体数目异常，预测胎儿患有13三体综合征。
为了测试本发明中提供的引物组合检测结果与NGS结果的一致性，我们以46例孕妇血浆作为测试集样本，包含37例NGS提示为胎儿低风险的孕妇血浆样本及6例21三体高风险孕妇血浆样本，3例18三体高风险的孕妇血浆样本。根据每个测试集孕妇血浆样本的Z-score值来判断样本检测结果与测试集正常样本是否存在显著差异，从而判断该染色体是否存在异常。
在测试集样本的检测结果中，我们观察到，NGS提示为低风险的临床样本Ratiochr21:ref均在0.81-1.01范围内，Ratio18:ref均在0.85-1.016范围内，Ratio13:ref均在0.81-0.983范围内，经过计算获得Z-score，NGS提示为低风险的临床样本Z-scorechr21均在-4.54867-1.156815范围内，Z-scorechr18均在-2.28234-1.330127范围内，Z-scorechr13均在-3.66438范围内。同时，NGS提示为21三体高风险的临床样本Ratiochr21:ref均在1.04-1.08范围内，Z-scorechr21均在2.012638-3.153734范围内；NGS提示为18三体高风险的临床样本Ratiochr18:ref均在1.852411-2.07003范围之间。
测试集的检测结果显示，有一例NGS提示为21三体高风险的样本Z-scorechr21落在灰度区，随后再进行一次ddPCR后，显示为21三体阳性，其余临床样本ddPCR测试结果和NGS测试结果完全一致。本发明中提供的基于数字PCR对胎儿21三体、18三体的无创产前检测结果与NGS结果一致性达到100％，由于没有收集到13三体阳性病例，因此无法对13三体的诊断准确性做出判断。如图2所示。
Claims (2)
1.一种基于数字PCR技术无创产前筛查胎儿常见染色体异常的引物组合，其特征在于包括：根据人类第21、18、13号染色体的基因序列设计的多条特异性引物即靶染色体引物，以及根据人类其他染色体的基因序列设计设计的多条特异性引物即参考染色体引物；其中所述多条特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1-80。
2.根据权利要求1所述基于数字PCR技术无创产前筛查胎儿常见染色体异常的引物组合，其特征在于：所述的引物组合分为四组，第一组包括SEQ ID NO 1-20的核苷酸序列，检测21号染色体；第二组包括SEQ ID NO 21-40的核苷酸序列，检测18号染色体；第三组包括SEQ ID NO 41-60的核苷酸序列，检测13号染色体；第四组包括SEQ ID NO 61-80的核苷酸序列，检测其他参染色体。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHIANRU TAN 等: "A multiplex droplet digital PCR assay for noninvasive prenatal testing of fetal aneuploidies", 《ANALYST》, vol. 144, pages 2239, XP055820640, DOI: 10.1039/C8AN02018C * |
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