CN107385028B - 一种检测β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针及其试剂盒 - Google Patents
一种检测β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针及其试剂盒，该试剂盒由非对称PCR单链DNA模板富集PCR扩增引物、靶序列互补淬灭探针、LA DNA聚合酶等组成。通过非对称特异性PCR单链DNA模板富集人类β珠蛋白基因突变位点目的序列、特异性荧光探针的分子杂交及解链分析，检测受检样本的β‑地贫点突变基因型。该试剂盒对检测β‑地中海贫血突变位点的野生型和突变型具有良好的敏感性和准确性，重复性和稳定性很好，完全适用于β‑地中海贫血点突变的临床检测。
Description
技术领域
本发明属于分子检测领域，具体涉及一种检测β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针及其试剂盒。
背景技术
人类β-珠蛋白基因簇位于11号染色体上，表达β珠蛋白链，与α珠蛋白链结合，形成具有功能血红蛋白四聚体。正常情况下，人类珠蛋白基因所表达的α类和β类珠蛋白链比例适当(1:1)，当β珠蛋白基因缺陷，导致β链合成减少而α链相对过剩，即可导致β-地中海贫血疾病。地中海贫血(简称“地贫”)是全球最常见、对人类健康影响最大的单基因遗传病之一，主要集中在地中海沿岸国家、东南亚、少数非洲地区和我国南方，保守估计全世界携带者近2亿人。临床上分为α-地贫和β-地贫。此病无有效治疗手段，应用相应分析技术通过人群分子筛查，对夫妇双方均为同类型地贫携带者的孕期胎儿进行产前诊断，以阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。导致β珠蛋白链合成减少而引起β-地中海贫血的根本原因是β珠蛋白基因突变，又称β-地贫基因突变，包含点突变和大片段缺失两种类型。
β-地贫主要由β珠蛋白基因点突变所引起(98％以上)。到目前为止，全世界已发现了200多种β-地贫基因突变，在中国已报道有60多种，其中中国南方报道有50余种。β-地贫基因不但遗传异质性大，还存在明显的地域性。在中国人群中，CD41-42(-CTTT)、CD17(A>T)、–28(A>G)、CD26(G>A)、IVS-Ⅱ-654(C>T)和CD71-72(+A)这6种突变占了全部突变类型的90％以上；另外–32(C>A)、–31(A>C)、–30(T>C)、-29(A>G)、Cap+1(A>C)、Int(ATG>AGG)、CD14/15(+G)、CD71/72(+T)、CD43(G>T)、CD27/28(+C)、IVS-1-1(G>T)、IVS-1-5(G>C)、CD31(–C)在中国人群中也有一定的基因频率。
众所周知，通过DNA分析而获得β-地贫基因型，不但是对个体β-地贫进行准确诊断的依据，也是提供遗传咨询、实施防控措施的基础。当前β-地贫基因点突变的分子诊断和产前诊断策略，是采用相应的技术方法，分析β珠蛋白基因是否存在点突变。检测技术的发展历程中，扩增阻碍突变系统PCR(ARMS-PCR)，是分别针对每一个突变位点，采用两个PCR反应管逐一检测，操作繁琐、费时费力，并且这种技术的检测条件难以控制，易于出现假阴性和假阳性结果。随后采用的等位基因特异性寡核苷酸杂交法(ASO)，大大减少了假阴性和假阳性结果，但仍需逐一检测每一个突变位点，检测通量低，费时费力。当前在临床上常规使用的反向点杂交法(RDB)，可同时检测中国人群中常见和次常见的17种突变类型，在一定程度上减小了劳动强度，增加了检测通量，可是，此技术的操作流程依然繁琐，先PCR扩增β珠蛋白基因2－3个目的DNA片段，然后再通过变性、杂交、洗膜、显色等一系列操作再观察检测结果，同时，PCR产物的开盖操作也大大增加了实验室携带污染的风险。DNA测序分析也是当前可选的一种β珠蛋白基因点突变检测方案，此技术操作过程是先PCR扩增，再PCR产物纯化、测序PCR反应、测序仪上毛细管电泳分析等，同样存在操作繁琐、携带污染等问题。这些方法，检测成本高、工作量大、操作繁琐、检测通量小，难以实现自动化和标准化，且存在PCR产物携带污染等技术局限，不能满足当前α-地贫的大规模人群筛查和临床常规分子诊断需要。
继RDB技术之后的改良分子信标解链技术[β-地中海贫血基因检测试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)，国食药监械(准)字2013第3401294号]，实现了技术方案和检测方法的根本性改变，自动化、高通量、一次性闭管，操作简单大大降低了工作量，也大大降低了试剂成本。但经过2－3年的临床应用，也凸现了此试剂盒技术方案和检测体系的局限性，有些中国南方较为多见的突变位点不在检测范围，如Initiation CD(ATG>AGG)、CAP+1(A>C)等，还有诸如-28(A>C)与-29(A>G)、CD41/42(-CTTT)与CD43(G>T)等相邻的突变位点不能准确区分。
随着目前以降低地贫患儿出生率为目标的预防计划与措施的相继实施，以及地贫分子机制及分子流行病学的深入研究，准确可靠、简单实用、能实现自动化和标准化、适合大规模人群筛查和常规分子诊断的高通量检测技术与方法，是这些项目实施的技术支撑条件，更是当前地中海贫血分子诊断的迫切需要。针对上述β珠蛋白基因点突变检测分析的技术局限，研发相应的技术方法，一次性闭管操作以防止PCR产物携带污染，单反应管检测多种突变类型以提高检测通量且简化操作强度，仪器自动检测分析以实现自动和标准化，是目前方法学研究的主要方向。
发明内容
为了解决现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种可以一次性闭管检测中国人群中常见β珠蛋白基因点突变类型的检测试剂盒，所述的基因点突变类型包括–32(C>A)、–31(A>C)、–30(T>C)、-29(A>G)、-28(A>G)、Cap+1(A>C)、Int(ATG>AGG)、CD17(A>T)、CD14/15(+G)、CD41/42(-TCTT)、CD71/72(+A)、CD71/72(+T)、IVS-2-654(C>T)、CD26(G>A)、CD43(G>T)、CD27/28(+C)、IVS-1-1(G>T)、IVS-1-5(G>C)、CD31(–C)、CD37(G>A)。
本发明的目的在于提供用于检测人类β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针组。
本发明的另一目的在于提供一种检测β珠蛋白基因点突变的试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种检测β珠蛋白基因点突变的方法。
本发明所采取的技术方案是：
用于检测人类β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针组，所述靶序列互补淬灭探针组的序列如SEQ ID NO：5～36所示。
一种检测β珠蛋白基因点突变的试剂盒，该试剂盒含有SEQ ID NO：5～36所示的靶序列互补淬灭探针组。
进一步的，该试剂盒还含有特异性扩增β珠蛋白基因突变热点序列的引物组。
进一步的，所述引物组序列如SEQ ID NO：1～4所示。
进一步的，该试剂盒还含有TaKaRa LA Taq酶、LA Taq Buffer、dNTPS、甜菜碱。
一种检测β珠蛋白基因点突变的方法，包括以下步骤：
(1)提取样品中的gDNA及以配制检测试剂，检测试剂的配制体系如下：
其中，1F：5’-gccaaggacaggtacggctgtcatc-3’(SEQ ID NO：1)；
1R：5’-ggcaaaggtgcccttgaggttgtc-3’(SEQ ID NO：2)；
2F：5’-cagggcaataatgatacaatgtatcatgc-3’(SEQ ID NO：3)；
2R：5’-gctgtgggaggaagataagaggtatgaac-3’(SEQ ID NO：4)
28-32W：5’-ROX-agggctgggcataaaagtcagcca-BHQ2-3’(SEQ ID NO：5)；
-32M：5’-ROX-ctagctgggaataaaagtcaggctag-BHQ2-3’(SEQ ID NO：6)；
-31M：5’-ROX-ctgagctgggcctaaaagtctcag-BHQ2-3’(SEQ ID NO：7)；
-30M：5’-ROX-agctgggcacaaaagtcagca-BHQ2-3’(SEQ ID NO：8)；
-29M：5’-ROX-cagtgctgggcatgaaagtcactg-BHQ2-3’(SEQ ID NO：9)；
-28M：5’-ROX-cagtgctgggcatacaagtcactg-BHQ2-3’(SEQ ID NO：10)；
Cap+1W：5’-FAM-agaagctattgcttacatttgcttc-BHQ1-3’(SEQ ID NO：11)；
Cap+1M：5’-FAM-tctgcttccatttgcttctgcaga-BHQ1-3’(SEQ ID NO：12)；
IntW：5’-CY5-cgaagatcaaacagacaccatggtgcatcttcg-BHQ2-3’(SEQ ID NO：13)；
Int-M：5’-CY5-gatgcagacaccagggtgcatc-BHQ2-3’(SEQ ID NO：14)；
CD14-17W：5’-HEX-tcggaagtggggcaaggtgaacgttccgt-BHQ1-3’(SEQ ID NO：15)；
CD14/15M:5’-HEX-cctgacttactgccctggtgggtttagtcagg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：16)；
CD17M:5’-HEX-tctgtatgtggggctaggtgaatacagt-BHQ1-3’(SEQ ID NO：17)；
CD26-28W:5’-FAM-ccatgaaaggtggtgaggccctggaatcatgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：18)；
CD26M:5’-FAM-tctgactagttggtggtaaggcctgtcagt-BHQ1-3’(SEQ ID NO：19)；
CD27/28M:5’-FAM-tctgcaaaaggcccctgggcaga-BHQ1-3’(SEQ ID NO：20)；
CD30-I5W:5’-ROX-cagaggggcaggttggtatcaaggttacctctg-BHQ2-3’(SEQ ID NO：21)；
CD30M：5’-FAM-ccatacaagggcgggttggtatgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：22)；
IVS11M：5’-FAM-tcttctgggcagtttggtatcacagaagt-BHQ1-3’(SEQ ID NO：23)；
IVS15M：5’-FAM-caggttggtatcaaggttacaacctg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：24)；
CD31W:5’-CY5-ctgacttaggctgctggtgtcag-BHQ2-3’(SEQ ID NO：25)；
CD31M:5’-CY5-cagtcacccttaggtgctggtgactg-BHQ2-3’(SEQ ID NO：26)；
CD37W:5’-HEX-cagtacccttggacccagttatgtactg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：27)；
CD37M:5’-HEX-cagtctacccttagacccagaggactg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：28)；
CD41-43W:5’-CY5-cggttcagaggttctttgagtcctttggaaccg-BHQ2-3’(SEQ ID NO：29)；
CD41/42M:5’-CY5-cgtgtagaggttgagtcctttggaacacg-BHQ2-3’(SEQ ID NO：30)；
CD43M:5’-CY5-ctgtaggttcttttagtcctttggctacag-BHQ2-3’(SEQ ID NO：31)；
CD71/72W:5’-HEX-ccacgatgtgcctttagtgatggcctgtacgtgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：32)；
CD71/72A:5’-HEX-ccacatcggtgcctttaagtgatatgtgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：33)；
CD71/72T:5’-HEX-ccacaggtgccttttagtgatgtgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：34)；
654W:5’-FAM-ccttgatttctgggttaaggcaatagcaatatcaagg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：35)；
654M:5’-FAM-ccttgatttctgggttaaggtaatagcaatcaagg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：36)；
然后再配制上机检测反应管1和反应管2的反应体系，具体反应体系如下：
(2)将上述反应管1和反应管2中的反应体系进行荧光定量PCR检测；记录解链分析图谱及对应解链温度值；
(3)数据分析和结果判断：仪器配套软件会根据解链分析荧光信号的变化而自动显示解链分析峰图，峰图峰尖处对应的温度即为解链温度，根据解链分析图谱和解链温度确定是否发生基因突变。
进一步的，步骤2)中所述的荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃30sec、64℃30sec、72℃30sec，50个循环；95℃变性5min；40℃复性30min；40℃-70℃解链分析并采集不同通道的荧光信号。
本发明的有益效果是：
(1)本发明设计的引物探针具有很好的特异性和重复性；
(2)本发明所述的方法对人类β珠蛋白基因-32(C>A)、-31(A>C)、-30(T>C)、-29(A>G)、-28(A>G)、Cap+1(A>C)、Int(ATG>AGG)、CD14/15(+G)、CD17(A>T)、CD26(G>A)、CD27/28(+C)、CD30(A>G)、IVS-1-1(G>T)、IVS-1-5(G>C)、CD31(–C)、CD37(G>A)、CD41/42(-TCTT)、CD43(G>T)、CD71/72(+A)、CD71/72(+T)、IVS-2-654(C>T)点突变检测具有良好的灵敏度、稳定性与准确性；
(3)本发明所述的方法，只需将受检样本基因组DNA加入到检测试剂中，一次性闭管操作，无中间环节，操作简单且可消除PCR产物对实验环境的污染；
(4)本发明是以当前的常规荧光定量PCR仪为仪器平台，可实现自动化和规模化检测。
附图说明
图1为本发明所检测的β珠蛋白基因各点突变位置图；
图2为本发明检测β珠蛋白基因点突变中反应管1中的部分位点解链分析结果图；图中CD26、CD27/28、CD17、CD14/15、-31、-30、-29、-28、CD41-42、CD43分别表示检测突变型CD26(G>A)、CD27/28(+C)、CD17(A>T)、CD14/15(+G)、-31(A>C)、-30(T>C)、-29(A>G)、-28(A>G)、CD41/42(-TCTT)、CD43(G>T)的探针的解链分析曲线；
图3为本发明检测β珠蛋白基因点突变中反应管2中部分位点解链分析结果图；其中,Cap+1、IVS-II-654、CD71/72(+A)、-32、IVS-I-I、IVS-I-5(IVSI-5)、CD31、Initiationcondon分别表示检测突变型Cap+1(A>C)、IVS-2-654(C>T)、CD71/72(+A)、-32(C>A)、IVS-1-1(G>T)、IVS-1-5(G>C)、CD31(–C)、Int(ATG>AGG)的探针的解链分析曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1一种检测β珠蛋白基因点突变的试剂盒
用于检测β珠蛋白基因-32(C>A)、-31(A>C)、-30(T>C)、-29(A>G)、-28(A>G)、Cap+1(A>C)、Int(ATG>AGG)、CD14/15(+G)、CD17(A>T)、CD26(G>A)、CD27/28(+C)、CD30(A>G)、IVS-1-1(G>T)、IVS-1-5(G>C)、CD31(–C)、CD37(G>A)、CD41/42(-TCTT)、CD43(G>T)、CD71/72(+A)、CD71/72(+T)、IVS-2-654(C>T)点突变的靶序列互补淬灭探针试剂盒
试剂盒组成：
(1)2对特异性富集扩增β珠蛋白基因突变热点序列引物
1F：5’-gccaaggacaggtacggctgtcatc-3’(SEQ ID NO：1)；
1R：5’-ggcaaaggtgcccttgaggttgtc-3’(SEQ ID NO：2)；
2F：5’-cagggcaataatgatacaatgtatcatgc-3’(SEQ ID NO：3)；
2R：5’-gctgtgggaggaagataagaggtatgaac-3’(SEQ ID NO：4)；
(2)靶序列互补淬灭探针
特异性检测-32至–28位点野生型的靶序列互补淬灭探针：
28-32W：5’-ROX-agggctgggcataaaagtcagcca-BHQ2-3’(SEQ ID NO：5)；
特异性检测-32(C>A)突变型的靶序列互补淬灭探针：
-32M：5’-ROX-ctagctgggaataaaagtcaggctag-BHQ2-3’(SEQ ID NO：6)；
特异性检测-31(A>C)突变型的靶序列互补淬灭探针：
-31M：5’-ROX-ctgagctgggcctaaaagtctcag-BHQ2-3’(SEQ ID NO：7)；
特异性检测-30(T>C)突变型的靶序列互补淬灭探针：
-30M：5’-ROX-agctgggcacaaaagtcagca-BHQ2-3’(SEQ ID NO：8)；
特异性检测-29(A>G)突变型的靶序列互补淬灭探针：
-29M：5’-ROX-cagtgctgggcatgaaagtcactg-BHQ2-3’(SEQ ID NO：9)；
特异性检测-28(A>G)突变型的靶序列互补淬灭探针：
-28M：5’-ROX-cagtgctgggcatacaagtcactg-BHQ2-3’(SEQ ID NO：10)；
特异性检测Cap+1(A>C)位点野生型的靶序列互补淬灭探针：
Cap+1W：5’-FAM-agaagctattgcttacatttgcttc-BHQ1-3’(SEQ ID NO：11)；
特异性检测Cap+1(A>C)突变型的靶序列互补淬灭探针：
Cap+1M：5’-FAM-tctgcttccatttgcttctgcaga-BHQ1-3’(SEQ ID NO：12)；
特异性检测Int(ATG>AGG)位点野生型的靶序列互补淬灭探针：
IntW：5’-CY5-cgaagatcaaacagacaccatggtgcatcttcg-BHQ2-3’(SEQ ID NO：13)；
特异性检测Int(ATG>AGG)突变型的靶序列互补淬灭探针：
Int-M：5’-CY5-gatgcagacaccagggtgcatc-BHQ2-3’(SEQ ID NO：14)；
特异性检测CD14/15(+G)、CD17(A>T)位点野生型的靶序列互补淬灭探针：
CD14-17W：5’-HEX-tcggaagtggggcaaggtgaacgttccgt-BHQ1-3’(SEQ ID NO：15)；
特异性检测CD14/15(+G)突变型的靶序列互补淬灭探针：
CD14/15M:5’-HEX-cctgacttactgccctggtgggtttagtcagg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：16)；
特异性检测CD17(A>T)突变型的靶序列互补淬灭探针：
CD17M:5’-HEX-tctgtatgtggggctaggtgaatacagt-BHQ1-3’(SEQ ID NO：17)；
特异性检测CD26(G>A)、CD27/28(+C)位点野生型的靶序列互补淬灭探针：
CD26-28W:5’-FAM-ccatgaaaggtggtgaggccctggaatcatgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：18)；
特异性检测CD26(G>A)突变型的靶序列互补淬灭探针：
CD26M:5’-FAM-tctgactagttggtggtaaggcctgtcagt-BHQ1-3’(SEQ ID NO：19)；
特异性检测CD27/28(+C)突变型的靶序列互补淬灭探针：
CD27/28M:5’-FAM-tctgcaaaaggcccctgggcaga-BHQ1-3’(SEQ ID NO：20)；
特异性检测CD30(A>G)、IVS-1-1(G>T)、IVS-1-5(G>C)位点野生型的靶序列互补淬灭探针：
CD30-I5W:5’-ROX-cagaggggcaggttggtatcaaggttacctctg-BHQ2-3’(SEQ ID NO：21)；
特异性检测CD30(A>G)突变型的靶序列互补淬灭探针：
CD30M：5’-FAM-ccatacaagggcgggttggtatgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：22)；
特异性检测IVS-1-1(G>T)突变型的靶序列互补淬灭探针：
IVS11M：5’-FAM-tcttctgggcagtttggtatcacagaagt-BHQ1-3’(SEQ ID NO：23)；
特异性检测IVS-1-5(G>C)突变型的靶序列互补淬灭探针：
IVS15M：5’-FAM-caggttggtatcaaggttacaacctg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：24)；
特异性检测CD31(–C)位点野生型的靶序列互补淬灭探针：
CD31W:5’-CY5-ctgacttaggctgctggtgtcag-BHQ2-3’(SEQ ID NO：25)；
特异性检测CD31(–C)突变型的靶序列互补淬灭探针：
CD31M:5’-CY5-cagtcacccttaggtgctggtgactg-BHQ2-3’(SEQ ID NO：26)；
特异性检测CD37(G>A)位点野生型的靶序列互补淬灭探针：
CD37W:5’-HEX-cagtacccttggacccagttatgtactg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：27)；
特异性检测CD37(G>A)突变型的靶序列互补淬灭探针：
CD37M:5’-HEX-cagtctacccttagacccagaggactg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：28)；
特异性检测CD41/42(-TCTT)、CD43(G>T)位点野生型的靶序列互补淬灭探针：
CD41-43W:5’-CY5-cggttcagaggttctttgagtcctttggaaccg-BHQ2-3’(SEQ ID NO：29)；
特异性检测CD41/42(-TCTT)突变型的靶序列互补淬灭探针：
CD41/42M:5’-CY5-cgtgtagaggttgagtcctttggaacacg-BHQ2-3’(SEQ ID NO：30)；
特异性检测CD43(G>T)突变型的靶序列互补淬灭探针：
CD43M:5’-CY5-ctgtaggttcttttagtcctttggctacag-BHQ2-3’(SEQ ID NO：31)；
特异性检测CD71/72位点野生型的靶序列互补淬灭探针：
CD71/72W:5’-HEX-ccacgatgtgcctttagtgatggcctgtacgtgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：32)；
特异性检测CD71/72(+A)突变型的靶序列互补淬灭探针：
CD71/72A:5’-HEX-ccacatcggtgcctttaagtgatatgtgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：33)；
特异性检测CD71/72(+T)突变型的靶序列互补淬灭探针：
CD71/72T:5’-HEX-ccacaggtgccttttagtgatgtgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：34)；
特异性检测IVS-2-654(C>T)位点野生型的靶序列互补淬灭探针：
654W:5’-FAM-ccttgatttctgggttaaggcaatagcaatatcaagg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：35)；
特异性检测IVS-2-654(C>T)突变型的靶序列互补淬灭探针：
654M:5’-FAM-ccttgatttctgggttaaggtaatagcaatcaagg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：36)；
所述的荧光探针中，FAM指羧基荧光素，HEX指六氯－6－甲基荧光素，ROX指羧基-X-罗丹明，Cy5是指花青染料分子5，BHQ1和BHQ2是指荧光淬灭基团。
本发明所检测的β珠蛋白基因各点突变位置见图1。
(3)其它组成成份：
TaKaRa LA Taq酶及配套LA Taq Buffer、dNTPS购自Takara公司，甜菜碱购自美国Sigma公司。
(4)所用仪器设备：
美国Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪。
实施例2一种检测β珠蛋白基因点突变的试剂盒
本发明所述试剂盒，按检测探针的荧光标记、解链温度，分成两个反应管，反应管1和反应管2中探针所检测的位点及基因型见下表1。
表1反应管1和反应管2中探针所检测的位点及基因型
实施例3一种检测β珠蛋白基因点突变的方法
本发明检测体系的使用方法为：
(1)样品处理：
用灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至10-100ng/μl备用。其中gDNA标本可以通过以下方法获得：抽取外周全血标本，EDTA抗凝，采用天根柱式外周血基因组DNA柱式提取试剂(北京天根生物技术公司)抽提得到gDNA样本；或采用传统酚氯仿法抽提得到gDNA样本。
(2)检测试剂的配制：
表2所列为每个检测反应的试剂成分加入量。由于所含组份较多，需预先分别配制引物、探针、PCR基本体系等混合组份。可根据所需检测的样本量或将要用于检测的试剂需要量进行配制，如每次配制50个检测的试剂量，则按下表所列加入量的50倍进行混合配制。
表2检测试剂分装配制表
按下表分别配制上机检测反应管1和反应管2体系(体积μL)：
表3反应管1和反应管2上机检测体系配制表
| 试剂成份 | 反应管1(μL) | 反应管2(μL) |
| MB-Bf | 5.00 | 5.00 |
| MB-Pm1 | 4.00 | |
| MB-Pb1 | 4.00 | |
| MB-Pm2 | 4.00 | |
| MB-Pb2 | 4.00 | |
| LA Taq酶(5u/μL) | 0.30 | 0.30 |
| D.D.W | 0.70 | 0.70 |
| gDNA(10-50ng/μL) | 6.00 | 6.00 |
| 总体积 | 20.00 | 20.00 |
(3)反应程序为：
95℃预变性5min；95℃30sec、64℃30sec、72℃30sec，50个循环；95℃变性5min；40℃复性30min；40℃-70℃解链分析并采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道荧光信号。
所用仪器为Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪，购于美国Bio-Rad公司。
(4)样本检测：
将待检gDNA标本，应用上述反应体系和反应程序，于荧光定量PCR仪上进行扩增检测，记录解链分析图谱及对应解链温度值。
(5)数据分析和结果判断：
仪器配套软件会根据解链分析荧光信号的变化而自动显示解链分析峰图，峰图峰尖处(向上峰的最高点)对应的温度即为解链温度，如图2所示：A中只有一个56.5±0.5℃的解链温度；B中有两个解链温度，分别为47.5±0.5℃和56.5±0.5℃。
本发明中检测的11种野生型21种突变型，其解链温度均设计在45℃-64℃之间,对应的荧光通道及解链温度见表4。检测结果可按上述操作说明获得受检样本的解链温度，然后再结合表4，分析某突变位点的野生型及突变型序列组成方式，分析基因型。如某样本存在CD26-CD28野生型解链峰，也存在CD26(G>A)突变峰，则此受检样本为CD26(G>A)突变位点杂合子。
表4本发明中β珠蛋白基因11种野生型21种突变型对应荧光通道及解链温度表
(6)部分位点解链分析结果图：
本发明部分位点解链分析结果图如图2和图3所示，图2为本发明β珠蛋白基因点突变检测反应管1部分位点解链分析结果图，图3为本发明β珠蛋白基因点突变检测反应管2部分位点解链分析结果图，突变位点及解链温度，见结果图标注。从图2和图3的结果中可以看出，本发明能同时对β珠蛋白基因点突变位点进行很好的检测。
实施例4一种检测β珠蛋白基因点突变的方法
利用实施例1的试剂盒及方法对β-地中海贫血基因-32(C>A)、-31(A>C)、-30(T>C)、-29(A>G)、-28(A>G)、Cap+1(A>C)、Int(ATG>AGG)、CD14/15(+G)、CD17(A>T)、CD26(G>A)、CD27/28(+C)、CD30(A>G)、IVS-1-1(G>T)、IVS-1-5(G>C)、CD31(–C)、CD37(G>A)、CD41/42(-TCTT)、CD43(G>T)、CD71/72(+A)、CD71/72(+T)、、IVS-2-654(C>T)点突变进行检测：
1、样本来源及类型：
从本实验室样本库中选取已确诊的β-地贫gDNA标本，基因型分别为βCD41/42/βN 5份、βCD26/βN 3份、βCD17/βN 3份、β-28/βN 2份、β-29/βN 2份、β654/βN 3份、βCD71/72+A/βN 1份、βCD43/βN1份、βINT/βN 1份、βIVS-1-1/βN 1份、βCD41/42/βCD41/42 1份、βCD26/βCD17 1份、βN/βN 6份、，共计30份，用灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至10－30ng/μL备用。
2、样本检测：
将上述待检gDNA标本，应用上述本试剂盒的反应体系(表2和表3)，以本发明的PCR反应程序(95℃预变性5min；95℃30sec、64℃30sec、72℃30sec，50个循环；95℃变性5min；40℃复性30min；40℃-70℃解链分析并采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道荧光信号)，于Bio-RadCFX96荧光定量PCR仪上进行扩增检测，根据解链分析峰图，判断和记录解链温度值。
3、数据分析和结果判断：
根据表4分析本案例的检测结果，判断受检样本的β-地贫基因型。本实施例中30例已知基因型样本的检测结果见表5所列。本方法检测确定的β-地贫点突变基因型与已知的点突变基因型完全相符，灵敏度与准确性均达到100％。
表5 30例已知基因型样本的检测结果表
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学
<120> 一种检测β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针及其试剂盒
<130>
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gccaaggaca ggtacggctg tcatc 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggcaaaggtg cccttgaggt tgtc 24
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cagggcaata atgatacaat gtatcatgc 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctgtgggag gaagataaga ggtatgaac 29
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agggctgggc ataaaagtca gcca 24
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctagctggga ataaaagtca ggctag 26
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctgagctggg cctaaaagtc tcag 24
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agctgggcac aaaagtcagc a 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cagtgctggg catgaaagtc actg 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cagtgctggg catacaagtc actg 24
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agaagctatt gcttacattt gcttc 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tctgcttcca tttgcttctg caga 24
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cgaagatcaa acagacacca tggtgcatct tcg 33
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gatgcagaca ccagggtgca tc 22
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tcggaagtgg ggcaaggtga acgttccgt 29
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cctgacttac tgccctggtg ggtttagtca gg 32
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tctgtatgtg gggctaggtg aatacagt 28
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ccatgaaagg tggtgaggcc ctggaatcat gg 32
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tctgactagt tggtggtaag gcctgtcagt 30
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tctgcaaaag gcccctgggc aga 23
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cagaggggca ggttggtatc aaggttacct ctg 33
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ccatacaagg gcgggttggt atgg 24
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tcttctgggc agtttggtat cacagaagt 29
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
caggttggta tcaaggttac aacctg 26
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ctgacttagg ctgctggtgt cag 23
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cagtcaccct taggtgctgg tgactg 26
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cagtaccctt ggacccagtt atgtactg 28
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cagtctaccc ttagacccag aggactg 27
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cggttcagag gttctttgag tcctttggaa ccg 33
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cgtgtagagg ttgagtcctt tggaacacg 29
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ctgtaggttc ttttagtcct ttggctacag 30
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ccacgatgtg cctttagtga tggcctgtac gtgg 34
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ccacatcggt gcctttaagt gatatgtgg 29
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ccacaggtgc cttttagtga tgtgg 25
<210> 35
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ccttgatttc tgggttaagg caatagcaat atcaagg 37
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ccttgatttc tgggttaagg taatagcaat caagg 35
Claims (7)
1.用于检测人类β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针组，其特征在于，所述靶序列互补淬灭探针组的序列如SEQ ID NO：5～36所示。
2.一种检测β珠蛋白基因点突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1所述的靶序列互补淬灭探针组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有特异性扩增β珠蛋白基因突变热点序列的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组序列如SEQ ID NO：1～4所示。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有TaKaRa LA Taq酶、LATaq Buffer、dNTPS、甜菜碱。
6.一种检测β珠蛋白基因点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品中的gDNA及以配制检测试剂，检测试剂的配制体系如下：
CD43M:5’-CY5-ctgtaggttcttttagtcctttggctacag-BHQ2-3’(SEQ ID NO：31)；
CD71/72W:5’-HEX-ccacgatgtgcctttagtgatggcctgtacgtgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：32)；
CD71/72A:5’-HEX-ccacatcggtgcctttaagtgatatgtgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：33)；
CD71/72T:5’-HEX-ccacaggtgccttttagtgatgtgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：34)；
654W:5’-FAM-ccttgatttctgggttaaggcaatagcaatatcaagg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：35)；
654M:5’-FAM-ccttgatttctgggttaaggtaatagcaatcaagg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：36)；
然后再配制上机检测反应管1和反应管2的反应体系，具体反应体系如下：
(2)将上述反应管1和反应管2中的反应体系进行荧光定量PCR检测；记录解链分析图谱及对应解链温度值；
(3)数据分析和结果判断：仪器配套软件会根据解链分析荧光信号的变化而自动显示解链分析峰图，峰图峰尖处对应的温度即为解链温度，根据解链分析图谱和解链温度确定是否发生基因突变；
所述方法不用于疾病的诊断。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃30sec、64℃30sec、72℃30sec，50个循环；95℃变性5min；40℃复性30min；40℃-70℃解链分析并采集不同通道的荧光信号。
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