CN106868196A

CN106868196A - 一种检测地中海贫血基因突变的探针、引物及试剂盒

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Publication number: CN106868196A
Application number: CN201710260742.1A
Authority: CN
Inventors: 曲玲; 刘福平; 未纪涛; 李印淑; 刘晶晶
Original assignee: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Current assignee: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Priority date: 2017-04-20
Filing date: 2017-04-20
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2037-04-20
Also published as: CN106868196B

Abstract

本发明涉及一种荧光不对称PCR‑熔点分析法检测地贫基因的探针，所述探针为双杂交探针，所述双杂交探针包括：检测缺失型α‑地贫的双杂交探针，其对应寡核苷酸序列SEQ ID No：1‑14；检测非缺失型α‑地贫的双杂交探针，其对应寡核苷酸序列SEQ ID No：15‑26；检测β‑地贫的双杂交探针，其对应寡核苷酸序列SEQ ID No：27‑48。本发明还涉及荧光不对称PCR‑熔点分析法检测地贫基因的引物及试剂盒。本发明具有可以同时检测36种地贫突变基因的优点，与同类产品相比，检测位点更全面，检测时间更短，效率更高。

Description

一种检测地中海贫血基因突变的探针、引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术，特别涉及一种使用荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的探针、引物及试剂盒。

背景技术

地中海贫血(简称“地贫”)是由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白链合成减少或不能合成，使形成血红蛋白的珠蛋白链比例失衡，而导致的一种可遗传的溶血性血液病。主要包括两种类型：α-地贫和β-地贫。

α-地贫包括缺失型α-地贫和非缺失型α-地贫，是世界上最常见的单基因遗传病之一。α珠蛋白基因位于16号染色体上，每条16号染色体有2个α珠蛋白基因(简称“α-基因”)。α-地贫是由于α-基因发生突变导致肽链失衡而造成的。若是染色体上的1个α-基因发生了缺失或缺陷，α链的合成只受到了部分抑制，则称为α⁺地贫；若是染色体上2个α-基因都发生了缺失或缺陷称为α⁰地贫。只有1个α-基因发生异常，即α⁺地贫杂合状态时，一般没有明显的临床症状，表现型为静止型；当2个α-基因发生异常，即α⁺地贫纯合子或者α⁰杂合子状态时，仍有相当数量的α-链合成，症状轻微，表现型为标准型；当3个α-基因发生异常，即α⁰和α⁺地贫的杂合子状态时，患者仅能合成少量的α-链，症状为中度溶血性贫血，表现型为血红蛋白H病(Hb H病)；当4个α-基因发生异常，即α⁰地贫纯合子状态，无法生成α-链。正常情况下胎儿的血红蛋白主要成分为Hb F，由于缺乏α-链。多余的γ-链聚合形成四聚体，即Hb Bart’s。Hb Bart’s具有很高的氧亲和性，无法解决胎儿宫内供养的生理机能，继而引发胎儿水肿症，导致胎儿在宫内受累或分娩后半小时内死亡的妊娠结局。

中国常见的缺失型α-地贫基因型主要为-α^3.7、-α^4.2和--^SEA，这三种缺失型在个体中的不同组合，可表现为静止型、标准型、血红蛋白H病和Hb Bart’s胎儿水肿综合症这四种表现型。随着α-地贫机制的进一步阐明，一些新的基因缺失型相继被发现，如--^THAI/、--^FIL/与-α^27.6。

α-地贫除了缺失类型外，还包括非缺失型即α-珠蛋白基因点突变，由于非缺失型α-地贫的基因突变大多数发生在1个基因(α2或α1)上，不会使另一个α-基因功能受损，所以定义为α⁺-地贫，即为α^Tα/或αα^T/。其杂合子既有静止型α-地贫表型(Hb Westmead，即α^WSα/)，也有轻型α-地贫表型(如α^CSα/和α^QSα/)。α^CSα/在泰国人群中的基因频率达4％，是东南亚地区最常见的非缺失型。α^WSα/是最常见的非缺失型α-地中海贫血，在广西地区的发生率约为1.55％，α^CSα/和α^QSα/次之，分别为1.21％和0.36％。近几年，中国人群中还报道了CD30(-GAG)、CD31(AGG>AAG)、CD78(-C)和CD118(+TCA)等变异类型。

在中国南方非缺失型α-地贫的发病率也较高，常见基因型为α^CSα、α^QSα和α^WSα。非缺失型α-地贫类型是导致临床α-地贫漏诊的主要原因之一。在正常情况下，α2较α1基因的功能强，表达量也较α1基因大；当发生基因突变时，α2基因的突变一般会比α1基因突变降低基因产物的作用更大。当α2基因发生非缺失型突变时，α-链的产量比α2基因发生缺失时明显减少。因此，有些非缺失型α-地贫的纯合子可以表现为Hb H病。在本发明中，我们另外还增加了4个稀有α点突变类型α⁵⁹α/、α³⁰α/、α³¹α/和α¹³α/。

β-地贫包括点突变β-地贫和缺失型β-地贫，但β-地贫主要是由β-珠蛋白基因点突变所引起。

β-地贫杂合子通常表现为轻型β-地贫，β-地贫纯合子或双重杂合子通常表现为重型地贫。到目前为止，全世界已发现了200多种β-珠蛋白基因突变可引起β-地贫的发生，其中中国南方报道有46种，常见β-地贫点突变有17种，另外一些属于发生率较低的突变，本发明拟检测常见的β-地贫点突变，另外还增加6种稀有β-地贫点突变。

目前对于地贫尚无理想的治疗方法，而地贫携带者又多无症状而不易察觉，因此降低其发生率的有效方法是对高发地区的婚孕人群广泛开展地贫基因筛查，若检出高危人群即患者或者携带者则应进行产前诊断，产前诊断可预防重型和中间型地贫患儿出生，对于优生优育和提高国民身体素质有着重要的意义。

目前常见的缺失型α地贫基因检测方法有跨越断裂点PCR(GAP-PCR)法、PCR-寡核苷酸探针(ASO)和PCR-反向点杂交(PCR-RDB)法等；国内临床常用的方法为PCR-反向点杂交法(可检测-α^3.7、-α^4.2和--^SEA3种缺失型α-地贫、α^CS、α^QS和α^WS3种非缺失型α-地贫、或17种常见β-地贫点突变)和GAP-PCR法(可检测-α^3.7、-α^4.2、--^SEA和--^THAI4种缺失型)。GAP-PCR法通过一次PCR确定缺失突变形成的各种α地贫基因类型，已广泛应用于产前基因诊断。但扩增完之后，需要开盖进行电泳分析，易造成样品污染，并且检测较繁琐，耗时长，难以实现自动化。PCR-反向点杂交法具有灵敏度高、特异性好和通量高等优点，目前已广泛应用于α-地贫的临床基因诊断，但其人工操作繁琐，检测时间较长，降低了工作效率。

采用反向点杂交、Gap-PCR法进行地贫基因检测的产品有亚能生物的地中海贫血基因检测试剂盒、深圳益生堂的缺失型α-地中海贫血基因诊断试剂盒、达安基因的缺失型α-地中海贫血基因诊断试剂盒与非缺失型α-地中海贫血点突变基因检测试剂盒，以及采用导流杂交技术的凯普生物的α-和β-地贫检测试剂盒。

上述基因检测试剂盒都可以准确检测地贫，这些试剂盒检测灵敏度高，检出率高、特异度好，假阳性率和假阴性率低，在临床诊断中得到了一定的推广。但是由于这些产品操作要求条件高、方法繁琐、耗时长、难以实现自动化，尚不能满足临床诊断简便快速的要求。

发明内容

本发明解决的技术问题为：提供一种可简便快速且保证检测准确性的荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的探针、引物及试剂盒。

本发明的一种荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的探针，所述探针为双杂交探针，所述双杂交探针包括：

检测缺失型α-地贫的双杂交探针，其对应寡核苷酸序列SEQ ID No：1-14；

检测非缺失型α-地贫的双杂交探针，其对应寡核苷酸序列SEQ ID No：15-26；

检测β-地贫的双杂交探针，其对应寡核苷酸序列SEQ ID No：27-48；

所述双杂交探针包括供体探针和受体探针，所述供体探针的3’端标记荧光基团，所述受体探针的5’端标记荧光基团，所述双杂交探针中至少一条寡核苷酸序列进行锁核酸和/或肽核酸修饰。

本发明还提供一种荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的引物，所述引物包括：

检测缺失型α-地贫的引物，其对应寡核苷酸序列SEQ ID No：53-64；

检测非缺失型α-地贫的引物，其对应寡核苷酸序列SEQ ID No：65-68；

检测β-地贫的引物，其对应寡核苷酸序列SEQ ID No：69-72；

检测α-地贫的引物，其对应寡核苷酸序列SEQ ID No：73-74；

本发明还提供一种荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的试剂盒，包括反应液，所述反应液包括上述的荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的探针以及上述的不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的引物。

本发明的有益效果在于：

(1)利用荧光探针熔点分析，将不对称PCR扩增与基因检测过程合二为一，自动化程度高，可以在实时荧光PCR扩增反应后直接进行，无需开管操作，从而减少样本污染的概率，也可以在普通PCR进行扩增后转移到实时荧光PCR仪进行分析；荧光探针熔点分析法属于非消耗性的检测，在分析结束后，样本保持PCR后的状态，并且可以多次重复分析；

(2)本发明是用于同时检测36种地贫突变基因的试剂盒，与同类产品相比，检测位点更全面，检测时间更短，效率更高；

(3)本发明将双杂交探针引入探针熔点分析技术中，并对其进行锁核酸与肽核酸修饰，这一技术设计在其他专利、期刊等文件中未见报道，经修饰后的探针可将同一通道Tm值相近的基因型区分开。同时在受体探针的3’端连接一段PCR终止子，可防止受体探针发生扩增，体现了探针设计的优势及创新点。

(4)本发明使用不对称PCR进行扩增，因此扩增过程存在较大的难度，我们进行大量实验，筛选了大量PCR引物，最终筛选出适合不对称PCR扩增的引物对及合适的引物比例。

附图说明

图1为本发明实施例的不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的探针与靶序列杂交的示意图；

图2为经锁核酸与肽核酸修饰后的探针的熔点图；

图3为本发明实施例的不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的试剂盒检测缺失型α地贫样本的熔点图；

图4为本发明实施例的不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的试剂盒检测非缺失型α地贫及β-地贫样本的熔点图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

本发明最关键的构思在于：设计包括锁核酸、肽核酸修饰的上述双杂交探针，利用不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因。

本发明试剂盒包括3管反应试剂，即包括试剂A、试剂B和试剂C，试剂A一次试验可以检测6种缺失型α-地贫、7种非缺失型α-地贫，试剂B与试剂C一次检测23种β-地贫点突变，同时以内参基因的扩增及检测来监控实验的成败。

现在市面上检测缺失型α-地贫的方法主要通过Gap-PCR法检测α-地贫(4种缺失型-α^3.7、-α^4.2、--^SEA、--^THAI)或通过PCR-反向点杂交法检测3种缺失型α-地贫(-α^3.7、-α^4.2、--^SEA)、3种非缺失型α-地贫(α^CS、α^QS、α^WS)或17种常见β-地贫点突变。

但是由于这些产品操作要求条件高、方法繁琐、耗时长、难以实现自动化，尚不能满足临床诊断简便快速的要求。

本发明的试剂盒采用荧光不对称PCR熔点分析技术，可检测6种缺失型α-地贫、7种非缺失型α-地贫及23种β-地贫点突变。

1.技术基础

1.1利用已知的珠蛋白基因研究成果进行引物探针设计和实施

本发明根据不同的α-珠蛋白基因突变序列来确定缺失型α-地贫的种类；根据不同的缺失基因序列设计两条特异的荧光探针；根据缺失区域设计跨越断裂点的PCR引物以扩增获得各种缺失型α-地贫的DNA片段；同时在几种缺失区域的共同区域内设计一对正常内对照引物及两条杂交探针，通过不对称PCR产物与探针杂交形成不同的熔点温度和熔点峰的有无来进行缺失型α-地贫基因的诊断。

根据非缺失型α-地贫与β-地贫突变基因位置设计两条杂交探针，同时在这两条探针的上游及下游位置设计相应的引物扩增待检测区域，扩增结束后进行熔解曲线分析，通过PCR产物与探针杂交形成不同的熔点温度和熔点峰来进行非缺失型α-地贫与β-地贫突变基因的诊断。

本发明使用不对称PCR进行扩增，因此扩增过程存在较大的难度，我们进行大量实验，筛选了大量PCR引物，最终筛选出适合不对称PCR扩增的引物对及合适的引物比例。

1.2本发明的技术包括不对称PCR扩增和熔点分析分析两个步骤

本发明的试剂盒采用的是荧光不对称PCR熔点分析技术，利用特定的探针在PCR扩增完成后，与靶序列杂交形成的熔点峰及熔点值(Tm)进行分析，检测探针覆盖区域是否存在碱基突变以及具体的突变类型。它包括不对称PCR扩增和熔点分析，首先是使用不对称PCR进行扩增，富集单链靶序列，使熔点分析过程探针可以与靶序列杂交，具体实施方式是在需要检测的区域设计相应的探针，并在设计好的探针外围设计一条上游引物和一条下游引物，用该上游引物和下游引物扩增含有待检测区域的片段；不对称PCR扩增结束后进行熔点分析。

在本实施方案中，我们对设计的探针进行修饰，目的是提高探针的稳定性及特异性，主要包括肽核酸修饰的分子探针及锁核酸修饰的探针，以上修饰的探针首次应用于探针熔点分析技术中。同时本发明使用不对称PCR扩增技术，经过大量扩增实验测试引物，最终筛选出适合不对称PCR扩增的引物对。

1.3熔点分析检测原理

本发明使用的熔点分析技术原理如下：

本发明中检测缺失型α-地贫、非缺失型α-地贫与β-地贫的探针为双杂交探针，其包括供体探针与受体探针两部分。不对称PCR扩增完成之后，进行熔点分析，根据解链温度的变化确定有无突变。扩增的DNA片段覆盖突变的区域，供体探针与受体探针上分别标记荧光供体基团(FAM等荧光基团)和荧光受体基团(Red 640等荧光基团)。供体探针的3’端标记荧光供体基团，受体探针覆盖突变位点，其序列与野生型相匹配，其5’端标记荧光受体基团。PCR完成之后反应体系温度逐渐降低，供体探针由于其Tm值高于受体探针，因此其首先与目标靶序列结合，使靶序列保持单链状态，随后受体探针与其他未与供体探针结合的序列进行杂交，根据荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)原理，此时由于两探针序列距离较近，荧光受体基团会发出荧光，当体系开始升温，受体探针会逐渐从靶序列上脱离下来，从而使得荧光强度下降。荧光变化最强的点对应的温度即是探针与靶序列形成双链结构的熔点(Tm)，探针与不同的靶序列杂交形成双链结构的稳定性不同，因而具有不同的熔点。若受体探针结合的靶序列区域发生碱基的突变，则探针与序列的杂交能力下降，因此其Tm值会低于野生型的。

1.4探针设计原理

本发明中使用的探针是双杂交探针，探针序列碱基经锁核酸、肽核酸进行修饰，目的是提高探针的稳定性及特异性，我们在供体荧光探针序列上标记荧光供体基团，在受体探针序列上标记荧光受体基团。

锁核酸(LNA-Locked Nucleic Acid，简称LNA)是一种类寡核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-O，4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。锁核酸修饰的探针在降低了探针的长度时，还能保持探针和DNA模板形成的杂交体保持较高的熔解温度(Tm值)，并且由于LNA碱基可以在探针的任何位置进行修饰，因此锁核酸修饰的探针在增加检测基因点突变的特异性方面具有很大的灵活性，它在荧光熔点分析中的应用是可以使同一检测通道的基因型Tm值差值变大，更容易区分。如广东省妇幼保健院发明的一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针(CN 104293937A)，克服现有技术的不足和缺点，他们在提高液相芯片检测地中海贫血基因突变的准确度方面体现出以下优势：基于LNA增敏的探针较常规的探针长度缩短，但仍能保持较高的Tm值，使得完全匹配的探针和错配的探针杂交信号比值从原来的不到2倍提高到超过4倍以上的差异，因而容易区分。但基于锁核酸探针应用于探针熔点分析技术的专利还未见报道。

PNA即肽核酸，它是一种人工合成的，以多肽结构作为骨架的核酸类似物。其结构主要是用中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA、RNA相同，也遵循碱基互补配对的原则与靶核酸的相应序列配对形成杂交链。使其可以进行杂交反应及熔点分析，使较短的探针具有较高的Tm值，同时稳定性也大大提高了，简化探针的设计和成本。

荧光共振能量转移(FRET)是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光(敏化荧光)，也可以不发荧光(荧光淬灭)，同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。此过程没有光子的参与，所以是非辐射的。该分析方法具有快速、敏感和简单等优点。

简单地说，荧光共振能量转移是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程。通常，供体(Donor)荧光基团的发射光谱要与受体(Acceptor)基团的吸收光谱有一定的重叠。当这两个荧光基团间的距离合适时(1-10nm，通常为1-5个碱基)，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象。能量转移发生方式依赖于受体的化学结构：当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移(即发生能量共振转移)。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：

(1)受、供体的激发光要足够分得开；

(2)供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。

本专利所述探针的形式如图1所示。图1中，靠左的为供体探针，靠右的为受体探针，靠下的则是靶序列。

其中受体探针进行锁核酸、肽核酸修饰。受体分子3‘端连接一段PCR终止子，可连接一段不可扩增的单体即碳链，目的是防止受体探针序列发生扩增。当反应体系中无靶序列存在时，供体探针与受体探针由于距离较远，荧光基团此时并不发出荧光，当体系扩增出靶序列时，反应体系温度逐渐下降，供体探针由于其Tm值高于受体探针，所以先与靶序列杂交，从而使靶序列保持单链状态，随后受体探针与靶序列也进行结合，根据FRET原理，受体荧光基团受到供体荧光基团激发开始发出荧光，此时在系统中可以检测到荧光信号，当体系开始升温，受体探针会逐渐从靶序列上脱离下来，从而使得荧光强度下降。荧光变化最强的点对应的温度即是探针与靶序列形成双链结构的熔点(Tm)，探针与不同的靶序列杂交形成双链结构的稳定性不同，因而具有不同的熔点。由于两个不同的探针必须杂交到正确的靶序列时，才能检测到荧光，因此，该方法的特异性较强。

2、具体技术实施方案

2.1引物、探针的设计及筛选：从GenBank数据库中获取人类珠蛋白基因序列，根据不同的缺失或突变类型，用Primer Premier 5和Oligo6.0设计相应的引物与探针序列。引物和探针均为人工合成寡聚核苷酸，均由上海英骏生物技术有限公司合成。序列合成完毕后由公司人员核对，然后根据需要稀释成所需的浓度。此引物和探针长度或位置的改变均会降低本试剂盒的灵敏度、特异性和重复性，因此引物和探针序列是本发明的保护内容。引物和探针序列如下表1和表2，表1为本发明的荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的引物序列表；表2为本发明的荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的探针序列表。

表1

表2

其中，表2的“探针序列”一列中的“+”符号表示3’端的碱基为锁核酸修饰碱基，“_”符号表示碱基为肽核酸修饰的碱基。

2.2引物、探针浓度以及反应体系其他组分浓度确定：利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的不对称PCR反应体系见表3-1、3-2、3-3，表3-1为本发明的试剂A的PCR反应液配方列表，表3-2为本发明的试剂A的PCR反应液配方列表，表3-3为本发明的试剂A的PCR反应液配方列表。

表3-1

表3-2

试剂B	1人份(μL)
		水	11.52
10×PCR buffer	2
		25mM dNTP	0.2
PCR Enhancer	5
		Taq酶	0.5
10μM BF1	0.1
		10μM BR1	1
10μM BF2	0.08
		10μM BR2	0.8
10μMβ-actinF	0.5
		10μMβ-actinR	0.1
100μM B29-P1	0.1
		100μM B29-P2	0.1
100μM CAP-P1	0.1
		100μM CAP-P2	0.1
100μM B17-P1	0.1
		100μM B17-P2	0.1
100μM B27-P1	0.1
		100μM B27-P2	0.1
100μM B31-P1	0.1
		100μM B31-P2	0.1
100μMβ-actin-P1	0.1
		100μMβ-actin-P2	0.1
总量	23

表3-3

其中，上述表3-1、3-2和3-3中，其DNA加样量均为2μL，总反应体积为25μL。

2.3PCR反应条件的确定

经过大量的实验对比，最终确定最佳反应条件为：

2.4有益效果：本发明采用荧光不对称PCR熔点分析法，检测6种常见的缺失型α-地贫、7种非缺失型α-地贫及23种β点突变，本发明比同类专利检测的更全面，提高了地贫检测的种类。此发明使用的技术检测时间短，操作简单快速，自动化程度高，提高临床检测效率。

本发明的试剂盒具有操作简单，检测迅速等优点，可以弥补传统检测方法的不足，对市场上已有的检测地贫的产品进行补充完善，简化操作步骤，缩短检测地贫的时间，为开展高效有力的遗传病检测提供新的技术平台。

例如，请参见图2，图2为经锁核酸与肽核酸修饰后的探针的熔点结果图，图2中，横坐标为Tm值，图2中存在横坐标的Tm值相近的一峰值较高的基因型和一峰值较低的基因型的熔点图，靠右边的熔点图为上述一峰值较高的基因型经过锁核酸与肽核酸修饰后对应的熔点图。由图2可知，经修饰后的探针可将同一通道Tm值相近的基因型区分开。

本发明和现有专利中利用基因诊断技术检测地贫的对比如表4。

表4

2.5本发明对临床样本的检测情况：本发明试剂盒检测200例临床样本，其检测结果与金标准测序结果对比，准确率为100％；对非本发明试剂盒检测范围的β-地贫和非缺失型α-地贫基因型阳性(β-地贫：130M/N、113M/N和非缺失型α-地贫：49M/N)和阴性样本，本发明试剂盒检测结果均为阴性，阴性符合率为100％，特异性为100％。

3.本发明试剂盒的性能指标：

3.1测定准确性

用108份临床阳性样本和10份临床阴性样本，选择高、中、低3个浓度，每个浓度重复3次，分别用3批产品来检测，分别计算阳性符合率和阴性符合率。结果显示相应的基因型，研究结果与测序结果完全符合，产品阳性符合率和阴性符合率都达100％。

3.2分析灵敏度

使用本发明试剂盒对13种α-地贫与23种β-地贫检测位点进行灵敏度分析，每个样本包含7个浓度梯度，确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为10ng/μL。

3.3分析特异性

通过干扰筛查试验，临床正常剂量的枸橼酸钠、EDTA不是本品的干扰物质；服用过去铁胺的病人的样本用本品检测时不影响检测结果，说明去铁胺不是本品的干扰物质；溶血样本(即使是完全溶血)不会干扰本试剂盒检测结果；脂血样本中甘油三酯和黄疸样本中总胆红素的浓度分别为13.8mmol/L和359.28μmol/L，均已达到临床的极高水平，却对本品检测无干扰，所以当甘油三酯≤13.8mmol/L或总胆红素≤359.28μmol/L对本试剂盒的检测结果均无干扰，不是本品的干扰物质；肝素钠是本品的外源性干扰物质，干扰效果评价试验结果表明，按15IU肝素钠抗凝1mL血液比例处理的全血样本不适用于本试剂盒。

用本产品检测7例本产品检测范围外的临床样本，包括1例非缺失型α地贫临床样本(CD142)、3例G-6-PD临床样本、1例缺铁性贫血临床样本、1例感染弓形虫的全血样本和1例乙肝病毒DNA临床样本，前6例结果均为阴性，乙肝病毒DNA样本结果为无信号，即7例均无交叉反应。

3.4重复性

不同批号产品，不同人(2人)操作，一天做2次，共做2天，每次试验每个参考品重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测试剂盒中的地贫基因型，结果显示一致。

实施例

本实施例的试剂盒用于地中海贫血临床患者、婚前、产前筛查样本中的全血基因组DNA，能够定性检出中国人群中检出率较高的地贫基因型，共包括6种缺失型α-地贫(-α^3.7/、-α^4.2/、--^SEA/、--^THAI/、--^FIL/、-α^27.6/)、7种非缺失型α-地贫(α^CSα/、α^QSα/、α^WSα/、α⁵⁹α/、α³⁰α/、α³¹α/和α¹³α/)及23种β点突变类型(41-42M、43M、654M、-28M、-29M、-32M、71-72M、βEM、17M、14-15M、27/28M、CAPM、IntM、IVS-I-1M、IVS-I-5M、-30M、31M、-90M、37M、38M、95M、112M和19M)。

本实施例基于荧光不对称PCR扩增和熔点分析。

设计特异的PCR引物，扩增获得一定长度的DNA片段，该片段包含了所要检测的缺失基因型。

其检测过程是使用不对称PCR进行扩增，富集单链靶序列，使熔解曲线分析过程探针可以与靶序列杂交，具体实施方式是在需要检测的区域设计相应的探针，并在设计好的探针外围设计一条上游引物和一条下游引物，用该上游引物和下游引物扩增含有待检测区域的片段；PCR扩增结束后进行熔点分析。

根据熔点值的大小及不同通道出现的熔点峰形状对模板的基因型作出判断。

本实施例的试剂盒的主要组成成份有：

1.试剂盒主要成份如表5所示。

表5

说明：试剂盒中不同批号的各组份可以互换使用。

2.本检测需要用到的其他主要试剂(盒)

全血基因组DNA提取试剂：推荐使用亚能生物技术(深圳)有限公司的“核酸提取试剂”(备案号：粤深械备20150099号；型号：全血DNA(离心柱型)；规格：25人份/盒。)

储存条件及有效期：

储存条件：试剂盒置于-18℃以下保存，避免反复冻融。

有效期：6个月。

适用仪器：

本试剂盒适用于具有熔解曲线分析功能的实时荧光PCR扩增仪，如Bio-RadCFX96、Rotor-Gene LC480、SLAN96。

样本要求

1.本试剂盒样本来源为抗凝全血，所用抗凝剂为枸橼酸钠或EDTA，不能使用肝素抗凝。

2.样本采集：抽取静脉血1～5mL入含有抗凝剂的管中，标记好样本信息。

3.血样保存：抗凝全血在室温放置不超过24小时，2～8℃保存不超过一个月，-18℃以下保存不超过两年，-70℃可长期保存，冷冻保存时应避免反复冻融。

4.血样运输：抗凝全血运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封，应保证冰袋不化冻，且在途时限不宜超过72小时。

检验方法：

1.全血DNA的提取：

推荐使用亚能公司的“核酸提取试剂”提取人基因组DNA。

PCR前模板DNA浓度和纯度的测定可采用核酸定量仪或紫外分光光度计。本试剂盒要求待检基因组DNA的浓度为10-100ng/μL，纯度(A260/A280)为1.7～2.0。

2.不对称PCR扩增

从试剂盒中取出所有组分置于室温融化并振荡混匀，5000rpm离心5～10秒。先设置好同批实验的实验组别，取出八联管或96孔PCR板，标记好实验组、对照组。各管反应液需求量＝待检样本数N+1个阳性质控+1个空白对照，反应液可直接分装成23μL/份使用，而后向PCR反应液中加入已提取的待测样品DNA2μL，反应总体系为25μL。

不对称PCR按以下条件进行扩增：

3.结果判读

参考值(参考范围)：

野生型对照在各通道的熔解峰的Tm值范围如下：

反应体系A：Red 640通道60.0℃±1℃；CY3通道64.0℃±1℃；TAMRA通道65.0℃±1℃；Texas Red通道62.0℃±1℃。

反应体系B：Red 640通道61.0℃±1℃；CY3通道64.0℃±1℃；TAMRA通道66.0℃±1℃；Texas Red通道63.0℃±1℃。

反应体系C：Red 640通道63.0℃±1℃；CY3通道60.0℃±1℃；TAMRA通道68.0℃±1℃；Texas Red通道65.0℃±1℃。

检验结果的解释：本产品检测一个样本包括一个PCR反应体系和四个检测通道，即每个样本要查看四个通道的熔点峰情况综合判断样本的基因型，其中：试剂A体系中的Red640通道检测--^27.6/、--^THAI/、α³⁰α/、α³¹α/，体系中的CY3通道检测-α^3.7/、β-actin、α^QSα/、--^SEA/、α¹³α/，反应体系中的Texas Red通道检测-α^4.2/、--^FIL/、α⁵⁹α/及正常基因型αα，反应体系中的TAMRA通道检测α^WSα/、α^CSα/，在正常检测中均有稳定的内控熔点峰(内控峰)。

试剂B体系中的TAMRA通道检测-30M、-28M、-29M、-32M、14-15M、17M、19M，Red 640通道检测CAPM、IntM、31M，Texas Red通道检测βEM、27/28M、IVS-I-1M、IVS-I-5M，CY3通道检测β-actin。

试剂C体系中的管体系中的TAMRA通道检测71-72M，Red 640通道检测37M、38M、41-42M、43M、95M，Texas Red通道检测112M，CY3通道检测654M、-90M、β-actin。

缺失型α地贫的检测结果解释如下：当检测样本为杂合型时，会出现一个缺失型熔点峰、野生型熔点峰及内控峰，当检测样本为纯合型时，会出现一个缺失型熔点峰及内控峰，当检测样本为野生型时，则会出现一个内控峰及野生型熔点峰。

非缺失型α地贫及β地贫的检测结果解释如下：当检测样本为杂合型时，会出现一个杂合型熔点峰、野生型熔点峰及内控峰，当检测样本为纯合型时，会出现一个纯合型熔点峰及内控峰，当检测样本为野生型时，则会出现一个内控峰及野生型熔点峰。

缺失型α地贫的样本典型检测结果如图3所示，图3中，横坐标为Tm值，以Tm值为60时为基准，纵坐标的值由低至高依次对应的第一条熔点曲线为NTC，对应的第二条熔点曲线出现了一个缺失型熔点峰，对应的第三条熔点曲线出现了一个野生型熔点峰及一个内控峰。即，同时出现一个缺失型熔点峰、野生型熔点峰及内控峰，检测样本为杂合型缺失型α地贫。

非缺失型α地贫及β地贫的样本典型检测结果如图4所示，图4中，横坐标为Tm值，以纵坐标为50时为基准，横坐标的值由低至高依次对应的第一条熔点曲线出现了一个内控熔点峰，对应的第二条熔点曲线出现了一个纯合型熔点峰，对应的第三条熔点曲线出现了一个杂合型熔点峰，对应的第四条熔点曲线出现了一个野生型熔点峰，纵坐标的值为0对应的熔点曲线为NTC。即，同时出现一个杂合型熔点峰、野生型熔点峰及内控峰，一个纯合型熔点峰及内控峰，检测样本为杂合型非缺失型α地贫和纯合型β地贫。

产品性能指标

1.测定准确性：用108份临床阳性样本和10份临床阴性样本，选择高、中、低3个浓度，每个浓度重复3次，分别用3批产品来检测，分别计算阳性符合率和阴性符合率。结果显示相应的基因型，研究结果与测序结果完全符合，产品阳性符合率和阴性符合率都达100％；

2.分析灵敏度：使用本发明试剂盒对13种α-地贫与23种β-地贫检测位点进行灵敏度分析，每个样本包含7个浓度梯度，确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为10ng/μL；

3.分析特异性：通过干扰筛查试验，临床正常剂量的枸橼酸钠、EDTA不是本品的干扰物质；服用过去铁胺的病人的样本用本品检测时不影响检测结果，说明去铁胺不是本品的干扰物质；溶血样本(即使是完全溶血)不会干扰本试剂盒检测结果；脂血样本中甘油三酯和黄疸样本中总胆红素的浓度分别为13.8mmol/L和359.28μmol/L，均已达到临床的极高水平，却对本品检测无干扰，所以当甘油三酯≤13.8mmol/L或总胆红素≤359.28μmol/L对本试剂盒的检测结果均无干扰，不是本品的干扰物质；肝素钠是本品的外源性干扰物质，干扰效果评价试验结果表明，按15IU肝素钠抗凝1mL血液比例处理的全血样本不适用于本试剂盒。

4.重复性：不同批号产品，不同人(2人)操作，一天做2次，共做2天，每次试验每个参考品重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测α-地贫基因型，结果显示一致。

缩略语和关键术语定义：

PCR：Polymerase Chain Reaction聚合酶链式反应；荧光不对称PCR-熔点分析法：荧光不对称PCR扩增产物与荧光探针结合，根据熔点Tm值及不同通道熔点峰的有无判断基因型；地贫：地中海贫血(Thalassemia)；-α^3.7：是指在两个α珠蛋白基因之间缺失3.7kb所造成的缺失型α地贫，类似定义的有-α^4.2/、--^SEA/、--^THAI/、--^FIL/、--^27.6/。NTC：阴性对照，无模板对照。

根据上述可知，本发明试剂盒采用荧光探针熔点分析技术可以同时检测36种地贫基因突变，发明了包含6种缺失型α-地贫、7种非缺失型α-地贫及23种β点突变的引物、探针序列以及检测方法。

(1)本发明可以同时检测36种地贫突变基因的试剂盒，与同类产品相比，检测位点更全面，检测时间更短，效率更高。(2)本专利将双杂交探针引入探针熔点分析技术中，并对其进行锁核酸与肽核酸修饰，体现了专利保护点，在其他专利中未见报道。同时在受体探针的3’端连接一段PCR终止子，可防止受体探针发生扩增，体现了探针设计的优势及创新点。(3)本发明使用不对称PCR进行扩增，与常规PCR相比，扩增过程存在较大的难度，我们进行大量实验，筛选了大量PCR引物，最终筛选出适合不对称PCR扩增的引物对及合适的引物比例。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 亚能生物技术（深圳）有限公司

<120> 一种检测地中海贫血基因突变的探针、引物及试剂盒

<130> 2017

<160> 76

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggccatgct tcttgcccct tgg 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctccccccag cccctcctcc c 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cttcctgatc tttgaatgaa gtc 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtaggcagca gcctgtgtgt gcct 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cagcccagga gttcccaaga atat 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agcaacatag tgagacctgt ct 22

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctgggatta catctggagc atca 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aggtggaaga gccagaccgc atc 23

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aatggcttga gcccaggagg ca 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgtggtgagc tgagatcatg cca 23

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cctggaaaca ggactctact tcct 24

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tctgttaggg ggcagagcag cc 22

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggggagactc ttcagcagag cacct 25

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggccttactc ctgcacgtct cc 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccctggccgc ccacctcccc 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gagttcaccc ctgcggtgca c 21

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gagttcaccc ctgcggtgca cg 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccctggacaa gttcctggct tc 22

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

caccgtgctg acctccaaat 20

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gttaagctgg agcctcggta gccgtt 26

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ccaccatggt gctgtctcct gcc 23

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

caagaccaac gtcaaggccg cctgg 25

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gctggcgagt atggtgcgga gg 22

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cctggagagg tgaggctccc tcc 23

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

acccacaggc caccctcaac c 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tcctggcccc ggacccaaac c 21

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tactcccagg agcagggagg gca 23

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

agggctgggc ataaaagtca 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ttctgacaca actgtgttca 20

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gcaacctcaa acagacacca tggt 24

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tctgactcct gaggagaagt 20

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gttactgccc tgtggggcaa ggtgaa 26

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cgtggatgaa gttggtggt 19

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gaggccctgg gcaggttgct a 21

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ctctctctgc ctattggtct at 22

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cccaccctta ggctgctggt ggtc 24

<210> 37

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ccttggaccc agaggttctt tgagtc 26

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tggggatctg tccactcctg a 21

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gtgcctttag tgatggcctg gct 23

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

tggacaacct caagggcacc tt 22

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

aagaataaca gtgataattt ct 22

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

taaggcaata gcaatatttc t 21

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

atcacttaga cctcaccctg tgga 24

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

cacaccctag ggttggccaa 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

gccacactga gtgagctgca 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gtgacaagct gcacgtggat 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

aacttcaggg tgagtctatg 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

acgcttgatg ttttctttcc 20

<210> 49

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

ccaccttcca gcagatgtgg atcagc 26

<210> 50

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

aggagtatga cgagtccggc ccc 23

<210> 51

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

ccaccttcca gcagatgtgg atcagc 26

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

aggagtatga cgagtccggc c 21

<210> 53

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

gccttctctc ccctgtcctt tcc 23

<210> 54

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

ttattcaaag accacggggg tacgg 25

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

ccctgcccca gcacttcctg at 22

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

ccgttggatc ttctcatttc cc 22

<210> 57

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

ttcgcaggaa ctcggtcgtc cccac 25

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

gacaggtctc actatgttgc 20

<210> 59

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

attcacatac catacggttc acc 23

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

tggctcttcc accttcagtg 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

tgtttggata acttccctat 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

tctgccacat gtagcaaata 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

ttactgaaaa gcaggcctgg 20

<210> 64

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

tggcctagag gtcgtggttc a 21

<210> 65

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

tgcgggcctg ggccgcactg ac 22

<210> 66

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

gggcccgttg ggaggcccag cg 22

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

cccacagact cagagagaac 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

ggacaggaac atcctgcggg 20

<210> 69

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

tagagggagg gctgagggtt t 21

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

cctatgacat gaacttaacc 20

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

agaataacag tgataatttc 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

ttatatgcag aaatatttat 20

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

ctcggtagcc gttcctcctg 20

<210> 74

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

tggggtttct acatgttgat ca 22

<210> 75

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

gctccatcct ggcctcgc 18

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

cgtccaccgc aaatgcttct 20

Claims

1.一种荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的探针，其特征在于，所述探针为双杂交探针，所述双杂交探针包括：

所述双杂交探针包括供体探针和受体探针，所述供体探针的3’端标记荧光供体基团，所述受体探针的5’端标记荧光受体基团，所述双杂交探针中至少一条寡核苷酸序列进行锁核酸和/或肽核酸修饰。

2.根据权利要求1所述的荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的探针，其特征在于，还包括内参探针，所述内参探针包括：

检测α-地贫的双杂交探针，其对应寡核苷酸序列SEQ ID No：49-50；

检测β-地贫的双杂交探针，其对应寡核苷酸序列SEQ ID No：51-52。

3.根据权利要求2所述的荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的探针，其特征在于，对下述寡核苷酸序列进行锁核酸和/或肽核酸修饰，修饰后的寡核苷酸序列具体为：

SEQ ID No：10为：5’-TGTGGTGAGCTGAGATC+ATGCCA-3’；

SEQ ID No：49为：5’-CCACCTTCCAGCAGATGTGGAT+CAGC-3’；

SEQ ID No：50为：5’-AGGAGTATGACGAGT+CCGGCCCC-3’；

SEQ ID No：16为：5’-GAG+TTCACCCCTGCGGTGCAC-3’；

SEQ ID No：18为：5’-CCCTGGAC+AAGTTCCTGGCTTC-3’；

SEQ ID No：20为：5’-GTTAAGC+TGGAGCCTCGGTAGCCGTT-3’；

SEQ ID No：26为：5’-TCCTGGCCCCG+GACCCAAACC-3’；

SEQ ID No：28为：5’-AGGG+CTGGGCAT+AAAAGTCA-3’；

SEQ ID No：30为：5’-GCAACCTCAAA+CAGACACCATGGT-3’；

SEQ ID No：31为：5’-TCTGACTCCT+GAGGAGAAGT-3’；

SEQ ID No：32为：5’-GTTACTGCCCTGT+GGGGCAAGGTGAA-3’；

SEQ ID No：33为：5’-CGTGGATGA+AGTTGGTGGT-3’；

SEQ ID No：34为：5’-GAGGCC+CTGGGCAGGTTGCTA-3’；

SEQ ID No：35为：5’-CTCTCTCTGCCTAT+TGGT+CTAT-3’；

SEQ ID No：36为：5’-CCCACCCTTAGGCTGCT+GGTGG+TC-3’；

SEQ ID No：37为：5’-CCTTGGA+CCCAGAGGTT+CTTTGAGTC-3’；

SEQ ID No：39为：5’-GTGCCTTTAGTG+ATGG+CCTGGCT-3’；

SEQ ID No：40为：5’-TGG+ACAACC+TCAAGGGCACCTT-3’；

SEQ ID No：51为：5’-CCACCTTCCAGCAGATGTGGAT+CAGC-3’；

SEQ ID No：52为：5’-AGGAGTATGACGAGT+CCGGCC-3’；

其中，“+”符号表示3’端的碱基为锁核酸修饰碱基，“_”符号表示碱基为肽核酸修饰碱基。

4.一种荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的引物，其特征在于，所述引物包括：

检测β-地贫的引物，其对应寡核苷酸序列SEQ ID No：69-72；

检测α-地贫的引物，其对应寡核苷酸序列SEQ ID No：73-74。

5.根据权利要求4所述的荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的引物，其特征在于，还包括内参引物，所述内参引物对应寡核苷酸序列SEQ ID No：75-76。

6.一种荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的试剂盒，包括反应液，其特征在于，所述反应液包括权利要求1-3任意一项所述的检测地贫基因的探针以及权利要求4-5任意一项所述的检测地贫基因的引物。

7.根据权利要求6所述的荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的试剂盒，其特征在于，单个的所述引物和探针的浓度比为1:10。

8.根据权利要求6所述的荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的试剂盒，其特征在于，所述反应液还包括dNTP、缓冲液和增强剂。

9.根据权利要求6-8任意一项所述的荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的试剂盒，其特征在于，还包括酶混合液、阳性质控品和纯水。

10.根据权利要求9所述的荧光不对称PCR-熔点分析法检测地贫基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括等体积的试剂A、试剂B和试剂C，所述试剂A包括对应寡核苷酸序列SEQ ID No：53-68和SEQ ID No：75-76的引物、对应寡核苷酸序列SEQ ID No：1-26和SEQ IDNo：49-50的探针、dNTP、缓冲液、增强剂、酶混合液、阳性质控品和纯水，所述试剂B包括对应寡核苷酸序列SEQ ID No：69-72和SEQ ID No：75-76的引物、对应寡核苷酸序列SEQ ID No：27-36和SEQ ID No：51-52的探针、dNTP、缓冲液、增强剂、酶混合液、阳性质控品和纯水，所述试剂C包括对应寡核苷酸序列SEQ ID No：69-72和SEQ ID No：75-76的引物、对应寡核苷酸序列SEQ ID No：37-48和SEQ ID No：51-52的探针、dNTP、缓冲液、增强剂、酶混合液、阳性质控品和纯水。