CN108277273A

CN108277273A - 检测非缺失型α地贫基因突变的探针、引物及试剂盒

Info

Publication number: CN108277273A
Application number: CN201810353664.4A
Authority: CN
Inventors: 曲玲; 陈永娟; 田洁
Original assignee: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Current assignee: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Priority date: 2018-04-19
Filing date: 2018-04-19
Publication date: 2018-07-13
Anticipated expiration: 2038-04-19
Also published as: CN108277273B

Abstract

本发明涉及一种检测非缺失型α地贫基因突变的探针、引物及试剂盒，其中检测非缺失型α地贫基因突变的探针，所述探针包括：用于检测α^WS和α^QS位点的探针αα^T‑P1；用于检测α^CS位点的探针αα^T‑P2；用于检测CD30和CD31位点的探针αα^T‑P3；用于检测CD13位点的探针αα^T‑P4；用于检测CD59位点的探针αα^T‑P5。本发明可实现一次同时检测7种非缺失型α‑地贫基因突变，与同类产品相比，检测位点更全面，检测时间更短，效率更高。

Description

检测非缺失型α地贫基因突变的探针、引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术，特别涉及一种检测非缺失型α地贫基因突变的探针、引物及试剂盒。

背景技术

人类α-珠蛋白基因簇位于16号染色体上，表达α珠蛋白链与β珠蛋白链结合，形成具有功能血红蛋白四聚体。正常情况下，人类珠蛋白基因所表达的α类和β类珠蛋白链比例适当(1:1)，当α珠蛋白基因缺陷，导致α链合成减少而β链相对过剩，即可导致α-地中海贫血疾病。α-地中海贫血包括缺失型α-地中海贫血与非缺失型α-地中海贫血。

非缺失型α-地贫，其基因突变大多数发生在1个基因(α2或α1)上，不会使另一个α-基因功能受损，所以定义为α⁺-地贫，即为α^Tα/或αα^T/。其杂合子既有静止型α-地贫表型(HbWestmead，即α^WSα/)，也有轻型α-地贫表型(如α^CSα/和α^QSα/)。在正常情况下，α2较α1基因的功能强，表达量也较α1基因大，α2约占基因表达量的2/3，α1约占基因表达量的1/3；因此当发生基因突变时，α2基因的突变一般会比α1基因突变降低基因产物的作用更大。当α2基因发生非缺失型突变时，α-链的产量比α2基因发生缺失时明显减少。因此，有些非缺失型α-地贫的纯合子可以表现为血红蛋白H病，即Hb H病，同样，部分点突变导致的α-地中海贫血如Hb CS和Hb QS杂合子合并轻型α-地中海贫血(--/αα)可使患者表型加重，即(--/α^CSα)和(--/α^QSα)可能比(--/-α)临床表现更为严重。

中国南方非缺失型α-地贫的发病率较高，常见基因型为α^CSα、α^QSα和α^WSα。其中α^CSα/在泰国人群中的基因频率达4％，是东南亚地区最常见的非缺失型。α^WSα/是最常见的非缺失型α-地中海贫血，在广西地区的发生率约为1.55％，α^CSα/和α^QSα/次之，分别为1.21％和0.36％。此外，中国人群中还报道了CD30(-GAG)、CD31(AGG>AAG)、CD13(GCC>TCC)和CD59(GGC>GAC)等变异类型。由于以上非缺失型α都是发生在α2基因上的突变，因此临床检测意义更为重要，在本专利中，我们检测7种类型的α点突变，涵盖了约90％以上的非缺失型α地贫类型，上述7种类型的α点突变的位点名称依次为CD122、CD142、CD125、CD30、CD31、CD13、CD59，其检测的突变类型依次对应为CAC→CAG(α2基因)、TAA→CAA(α2基因)、CTG→CCG(α2基因)、-GAG(α2基因)、AGG→AAG(α2基因)、GCC→TCC(α2基因)、GGC→GAC(α2基因)，其位点简称依次对应为WSM、CSM、QSM、30M、31M、13M、59M。

目前对于地贫尚无理想的治疗方法，而地贫携带者又多无症状而不易察觉，因此降低其发生率的有效方法是对高发地区的婚孕人群广泛开展地贫基因筛查，若检出高危人群即患者或者携带者则应进行产前诊断，产前诊断可预防重型和中间型地贫患儿出生，对于优生优育和提高国民身体素质有着重要的意义。

目前常见的非缺失型α地贫基因检测方法有：

1、扩增阻碍突变系统PCR(ARMS-PCR)，是分别针对每一个突变位点，采用两个PCR反应管逐一检测，操作繁琐、费时费力，并且这种技术的检测条件难以控制，易于出现假阴性和假阳性结果。

2、等位基因特异性寡核苷酸杂交法(ASO)，可减少假阴性和假阳性结果，但仍需逐一检测每一个突变位点，检测通量低，费时费力。

3、PCR-反向点杂交(PCR-Reverse Dot Blot，PCR-RDB)法：这一方法具有灵敏度高、特异性好和通量高等优点，可同时检测WS、QS和CS三种突变类型，目前已广泛应用于α-地贫的临床基因诊断，但其人工操作繁琐，先进行PCR扩增α2珠蛋白基因，然后再通过变性、杂交、洗膜、显色等一系列操作再观察检测结果，检测时间较长，降低了工作效率。同时，PCR产物的开盖操作也大大增加了实验室携带污染的风险。

4、DNA测序：此技术操作过程是先PCR扩增，再PCR产物纯化、测序PCR反应、测序仪上毛细管电泳分析等，同样存在操作繁琐、携带污染等问题。

目前市场上生产厂家主要有：亚能生物技术(深圳)有限公司、深圳益生堂生物企业有限公司、中山大学达安基因股份有限公司和潮州凯普生物化学有限公司等。国内主要产品(包括产品名称、生产厂家、注册证号)为：1、《地中海贫血基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)》，亚能生物，国食药监械(准)字2015第3401272；2、《α-地中海贫血基因检测试剂盒(PCR+导流杂交法)》，凯普生物，国械注准20153400437；3、《α-和β-地中海贫血基因检测试剂盒(PCR+膜杂交法)》，凯普生物，国食药监械(准)字2015第3401664号；4、《非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒》，厦门致善，国食药监械(准)字2014第3401352号；5、《非缺失型α地中海贫血基因检测试剂盒(PCR探针法)》，深圳益生堂，国械注准20143402140；6、《非缺失型α-地中海贫血点突变基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)》，中山大学达安基因，国械注准20153401298；7、《地中海贫血((α/β型))基因检测试剂盒》，中山大学达安基因，国械注准20153401068。

上述产品中，深圳益生堂的非缺失型α地中海贫血基因检测试剂盒(PCR探针法)及达安基因的非缺失型α-地中海贫血点突变基因检测试剂盒，它们采用的技术均为PCR-反向点杂交技术，虽然其通量较高，特异性好，但人工操作繁琐耗时，检测时间长，难以实现自动化，并且扩增结束之后的开盖操作易污染。厦门致善生物的非缺失型α地中海贫血基因检测试剂盒(PCR-熔解曲线技术)，其只检测常见的三种点突变(αCS、αQS、αWS)，检测位点少，灵敏度也不够高。

发明内容

针对上述，本发明解决的技术问题为：提供一种检测非缺失型α地贫基因突变的探针、引物及试剂盒，可解决上述检测时间长、位点少和灵敏度不高的问题。

一种检测非缺失型α地贫基因突变的探针，所述探针包括：

用于检测α^WS和α^QS位点的探针αα^T-P1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

用于检测α^CS位点的探针αα^T-P2，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

用于检测CD30和CD31位点的探针αα^T-P3，其核苷酸序列为如SEQ ID No.3所示；

用于检测CD13位点的探针αα^T-P4，其核苷酸序列为如SEQ ID No.4所示；

用于检测CD59位点的探针αα^T-P5，其核苷酸序列为如SEQ ID No.5所示。

一种检测非缺失型α地贫基因突变的引物，所述引物包括：

用于检测α^WS、α^QS和α^CS位点的上游引物α^T-F和下游引物α^T-R，其核苷酸序列如SEQID No.7-8所示；

用于检测CD13、CD30、CD31和CD59位点的上游引物α^B-F和下游引物α^B-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.9-10所示。

一种检测非缺失型α地贫基因突变的试剂盒，包括反应液，所述反应液包括上述的检测非缺失型α地贫基因突变的探针以及上述的检测非缺失型α地贫基因突变的引物。

本发明的技术效果为：

本发明的检测非缺失型α地贫基因突变的探针、引物及试剂盒，设计上述SEQ IDNo.1-5和SEQ ID No.7-10，可实现一次同时检测7种非缺失型α-地贫基因突变，与同类产品相比，检测位点更全面，检测时间更短，效率更高。

附图说明

图1为本发明实施例的检测非缺失型α地贫基因突变的试剂盒检测7种非缺失型α-地贫样本的荧光PCR熔解曲线图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

本发明涉及一种检测非缺失型α地贫基因突变的探针，所述探针包括：

进一步的，还包括内参探针β-actin-P，其核苷酸序列为如SEQ ID No.6所示。

进一步的，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

进一步的，所述探针中至少一条探针序列的碱基的3’端进行肽核酸修饰，所述探针中至少一条探针序列的碱基的5’端进行硫代磷酸化修饰。

本发明对探针进行修饰改良，包括对探针的5‘端进行修饰，包括硫代磷酸化或者硼酸磷酸化，可防止探针被酶水解，在探针3’端有若干个碱基与靶序列是错配的，可防止探针发生扩增，体现了探针设计的优势及创新点。

本发明首次将肽核酸修饰的探针应用于探针熔解曲线技术中，体现了专利创新点，在其他同型专利中未见报道。

本发明还提供一种检测非缺失型α地贫基因突变的引物，所述引物包括：

进一步的，还包括内参上游引物β-actinF和下游引物β-actinR，其核苷酸序列为如SEQ ID No.11-12所示。

同时，本发明还提供了一种检测非缺失型α地贫基因突变的试剂盒，包括反应液，所述反应液包括上述的检测非缺失型α地贫基因突变的探针以及上述的检测非缺失型α地贫基因突变的引物。

本发明的试剂盒包括1管反应液，一次试验可以检测7种非缺失型α-地贫，同时以内参基因的扩增及检测来监控实验的成败。本试剂盒采用的技术是荧光PCR熔解曲线技术。

1、技术基础

1.1利用已知的珠蛋白基因研究成果进行引物探针设计和实施

根据非缺失型α地贫基因位置设计两条杂交探针，同时在这两条探针的上游及下游位置设计相应的引物扩增待检测区域，扩增结束后进行熔解曲线分析，通过PCR产物与探针杂交形成不同的熔解温度和熔解峰来进行地贫突变基因的诊断。

体系中使用非对称PCR进行扩增，即反应过程中，上游或者下游引物相对过量，其延伸的靶序列产物与探针进行杂交产生信号，并且其浓度一般是另一条引物的3-40倍。

1.2本技术包括非对称PCR扩增和熔解曲线分析两个步骤

本试剂盒采用的是荧光PCR熔解曲线技术，利用特定的探针在PCR扩增完成后，与靶序列杂交形成的熔解曲线及熔点值(Tm)进行分析，检测探针覆盖区域是否存在碱基突变以及具体的突变类型。它包括非对称PCR扩增和熔解曲线分析，首先是使用非对称PCR进行扩增，富集单链靶序列，使熔解曲线分析过程探针可以与靶序列杂交，具体实施方式是在需要检测的区域设计相应的探针，并在设计好的探针外围设计一条上游引物和一条下游引物，用该上游引物和下游引物扩增含有待检测区域的片段；PCR扩增结束后进行熔解曲线分析。

在本实施方案中，我们对设计的探针进行修饰，目的是提高探针的稳定性及特异性，主要包括肽核酸分子探针，以上修饰的探针首次应用于探针熔解曲线技术中。

1.3熔解曲线检测原理

本发明使用的熔解曲线技术原理如下：

熔解曲线过程是由低温到高温的过程，检测非缺失型α-地贫的探针为经过改良的TaqMan探针。熔解曲线技术的原理是利用特定的探针在PCR扩增完成后，与靶序列杂交形成的熔解曲线及熔点值(Tm)进行分析，检测探针覆盖区域是否存在碱基突变以及具体的突变类型。

它包括PCR扩增和熔解曲线分析，首先是使用非对称PCR进行扩增，富集单链靶序列，使熔解曲线分析过程探针可以与靶序列杂交，具体实施方式是在需要检测的区域设计相应的探针，并在设计好的探针外围设计一条上游引物和一条下游引物，用该上游引物和下游引物扩增含有待检测区域的片段；PCR扩增结束后进行熔解曲线分析，当反应体系中没有靶序列存在时，即处于非杂交状态时，整个熔解曲线过程中，从低温到高温，探针都是处于自由卷曲的状态，使得荧光基团和淬灭基团相互靠近，根据荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)的原理，当一个荧光基团与一个淬灭基团的距离邻近至一定范围内时，就会发生能量转移，淬灭基团会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，从而使其不发光或发出的荧光很弱。当反应体系中有互补的靶序列存在时，在整个熔解曲线的过程中，低温时，探针与靶序列杂交，形成刚性而稳定的双链结构，荧光基团和淬灭基团的距离很远，荧光基团发出的荧光不会被淬灭基团吸收，因而可以检测到很强的荧光信号；随着温度的升高，双链杂交体逐渐解链，达到熔点时荧光迅速下降，荧光变化最强的点对应的温度即是探针与靶序列形成双链结构的熔点(Tm)，探针与不同的靶序列杂交形成双链结构的稳定性不同，因而具有不同的熔点。

2、具体技术实施方案

2.1引物、探针的设计及筛选

从GenBank数据库中获取人类珠蛋白基因序列，根据不同的缺失或突变类型，用Primer Premier 5和Oligo6.0设计相应的引物与探针序列。引物和探针均为人工合成寡聚核苷酸，均由上海英骏生物技术有限公司合成。序列合成完毕后由公司人员核对，然后根据需要稀释成所需的浓度。此引物和探针长度或位置的改变均会降低本试剂盒的灵敏度、特异性和重复性，因此引物和探针序列是本发明的保护内容。本发明的引物和探针序列如下表1和表2所示。

表1

表2

表2中，“+”符号表示5’端的碱基为硫代磷酸化修饰碱基，“_”符号表示3’端的碱基为肽核酸修饰碱基。

2.2引物、探针浓度以及反应体系其他组分浓度确定

利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应体系，具体的PCR反应液配方见下表3。

表3

注：DNA加样量为2μL，总反应体积为25μL。

2.3PCR反应条件的确定

经过大量的实验对比，最终确定最佳反应条件为：

技术效果说明

1、本发明采用荧光PCR熔解曲线法，检测7种非缺失型α-地贫，本发明比同类专利检测的更全面，提高了地贫检测的种类；同时技术检测时间短、操作简单快速、自动化程度高，可提高临床检测效率。

本发明的有益效果在于：

(1)荧光探针熔解曲线分析将PCR扩增与基因检测过程合二为一，自动化程度高，可以在实时荧光PCR扩增反应后直接进行，无需开管操作，从而减少样本污染的概率，也可以在普通PCR进行扩增后转移到实时荧光PCR仪进行分析；

(2)荧光探针熔解曲线分析属于非消耗性的检测，在分析结束后，样本保持PCR后的状态，并且可以多次重复分析。

(3)本专利首次将肽核酸修饰的探针应用于探针熔解曲线技术中，体现了专利创新点，在其他同型专利中未见报道。

(4)本专利对探针进行修饰改良，包括对探针的5‘端进行修饰，包括硫代磷酸化或者硼酸磷酸化，可防止探针被酶水解，在探针3’端有若干个碱基与靶序列是错配的，可防止探针发生扩增，体现了探针设计的优势及创新点。

本发明和现有专利中利用基因诊断技术检测地贫的对比如表4。

表4

2、本发明对临床样本的检测情况：

采用本发明的试剂盒检测200例临床样本，其检测结果与金标准测序结果对比，准确率为100％；对非本发明试剂盒检测范围的β-地贫和非缺失型α-地贫基因型阳性(β-地贫：130M/N、113M/N和非缺失型α-地贫：49M/N)和阴性样本，本发明试剂盒检测结果均为阴性，阴性符合率为100％，特异性为100％。

3、本发明试剂盒的性能指标：

3.1测定准确性

用21份临床阳性样本和10份临床阴性样本，选择高、中、低3个浓度，每个浓度重复3次，分别用3批产品来检测，分别计算阳性符合率和阴性符合率。结果显示相应的基因型，研究结果与测序结果完全符合，产品阳性符合率和阴性符合率都达100％；

3.2分析灵敏度

使用本发明试剂盒对7种非缺失α-地贫检测位点进行灵敏度分析，每个样本包含7个浓度梯度，确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为2ng/μL；

3.3分析特异性

通过干扰筛查试验，临床正常剂量的枸橼酸钠、EDTA不是本品的干扰物质；服用过去铁胺的病人的样本用本品检测时不影响检测结果，说明去铁胺不是本品的干扰物质；溶血样本(即使是完全溶血)不会干扰本试剂盒检测结果；脂血样本中甘油三酯和黄疸样本中总胆红素的浓度分别为13.8mmol/L和359.28μmol/L，均已达到临床的极高水平，却对本品检测无干扰，所以当甘油三酯≤13.8mmol/L或总胆红素≤359.28μmol/L对本试剂盒的检测结果均无干扰，不是本品的干扰物质；肝素钠是本品的外源性干扰物质，干扰效果评价试验结果表明，按15IU肝素钠抗凝1mL血液比例处理的全血样本不适用于本试剂盒。

用本产品检测7例本产品检测范围外的临床样本，包括1例SMA阴性样本、3例G-6-PD临床样本、1例缺铁性贫血临床样本、1例感染弓形虫的全血样本和1例乙肝病毒DNA临床样本，前6例结果均为阴性，乙肝病毒DNA样本结果为无信号，即7例均无交叉反应。

3.4重复性

不同批号产品，不同人(2人)操作，一天做2次，共做2天，每次试验每个参考品重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测试剂盒中的地贫基因型，结果显示一致。

实施例

本实施例的试剂盒，用于地中海贫血临床患者婚前孕前及产前筛查样本中的全血基因组DNA，能够定性检出中国人群中检出率较高的地贫基因型，包括7种非缺失型α-地贫(α^CSα/、α^WSα/、α^QSα/、α⁵⁹α/、α³⁰α/、α³¹α/和α¹³α/)。

【检验原理】

本试剂盒是基于荧光PCR扩增和熔解曲线分析。

设计特异的PCR引物，扩增获得一定长度的DNA片段，该片段包含了所要检测的基因型。PCR扩增结束后进行熔解曲线分析。

根据熔点值的大小及不同通道出现的熔解峰形状对模板的基因型作出判断。

【主要组成成份】

1、试剂盒主要成份参见下述表5。

表5

说明：试剂盒中不同批号的各组份可以互换使用。

【适用仪器】

本试剂盒适用于带有FAM、ROX、HEX、CY5检测通道且具有熔解曲线分析功能的实时荧光PCR扩增仪，如SLAN96、Bio-Rad CFX96、Rotor-Gene6000、Roche LC480 II。

【检验方法】

PCR按以下条件进行扩增：

【结果判读】

野生型对照在各通道的熔解峰的Tm值范围如下：

反应体系A：FAM通道61.0℃±1℃；ROX通道62.0℃±1℃；HEX通道63.0℃±1℃；CY5通道62.0℃±1℃。

【检验结果的解释】

本产品检测一个样本包括一个PCR反应体系和四个检测通道，即每个样本要查看四个通道的熔解峰情况综合判断样本的基因型，其中：体系中的FAM通道检测α³⁰α/、α³¹α/，体系中的HEX通道检测α^CS、α¹³α/、α⁵⁹α/，反应体系中的ROX通道检测α^QS、α^WS，反应体系中的CY5通道检测内参基因(β-actin，人基因组上的一个保守基因)，在正常检测中均有稳定的内控熔解峰(内控峰)。通过比较待测样本与野生型对照之间熔点(△Tm值)的差异判断样本是否发生突变。当样本熔解峰与野生型对照熔解峰差异(△Tm值)在±1℃以内的即为野生型熔解峰，当差异超过±2℃的即为突变型熔解峰，具体见下表所示，结果判读的熔解峰如图1所示。图1中，横坐标为Tm值，以纵坐标为50时为基准，横坐标的值由低至高依次对应的第一条溶解曲线出现了一个内控熔解峰，对应的第二条溶解曲线出现了一个纯合型熔解峰，对应的第三条溶解曲线出现了一个杂合型熔解峰，对应的第四条溶解曲线出现了一个野生型熔解峰，纵坐标的值为0对应的熔解曲线为NTC。

表6为本发明可检测的突变类型及各突变型在对应通道的△Tm值波动范围表。

表6

【产品性能指标】

1、测定准确性

2、分析灵敏度

使用本发明试剂盒对7种非缺失型α-地贫检测位点进行灵敏度分析，每个样本包含7个浓度梯度，确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为2ng/μL。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 亚能生物技术(深圳)有限公司

<120> 检测非缺失型α地贫基因突变的探针、引物及试剂盒

<130> 2018

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcacgcctc cctggacaat 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

accgttaagc tggagact 18

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccctggagag gtgaggctac 20

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taccccaggc ggcctttat 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ccgacccggg ctcctc 16

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

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ccttccagca gatgtggatc ataa 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gcgggcctgg gccgcactga c 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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gggcccgttg ggaggcccag c 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccgacaagac caacgtcaag g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tccctcccct gctccgaccc 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gctccatcct ggcctcgc 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgtccaccgc aaatgcttct 20

Claims

1.一种检测非缺失型α地贫基因突变的探针，其特征在于，所述探针包括：

2.根据权利要求1所述的检测非缺失型α地贫基因突变的探针，其特征在于，还包括内参探针β-actin-P，其核苷酸序列为如SEQ ID No.6所示。

3.根据权利要求1所述的检测非缺失型α地贫基因突变的探针，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

4.根据权利要求1所述的检测非缺失型α地贫基因突变的探针，其特征在于，所述探针中至少一条探针序列的碱基的3’端进行肽核酸修饰，所述探针中至少一条探针序列的碱基的5’端进行硫代磷酸化修饰。

5.根据权利要求4所述的检测非缺失型α地贫基因突变的探针，其特征在于，对探针αα^T-P1、探针αα^T-P2、探针αα^T-P3、探针αα^T-P4和探针αα^T-P5中至少一条进行所述肽核酸修饰和/或硫代磷酸化修饰，修饰后的核苷酸序列为：

SEQ ID No.1为：5’-TGCACGCCTCCCTGGACAAT-3’；

SEQ ID No.2为：5’-A+CCGTTAAGCTGGAGACT-3’；

SEQ ID No.3为：5’-C+CCTGGAGAGGTGAGGCTAC-3’；

SEQ ID No.4为：5’-TACCCCAGGCGGCCTTTAT-3’；以及

SEQ ID No.5为：5’-CCGACCCGGGCTCCTC-3’。

6.一种检测非缺失型α地贫基因突变的引物，其特征在于，所述引物包括：

用于检测α^WS、α^QS和α^CS位点的上游引物α^T-F和下游引物α^T-R，其核苷酸序列如SEQ IDNo.7-8所示；

7.根据权利要求6所述的检测非缺失型α地贫基因突变的引物，其特征在于，还包括内参上游引物β-actinF和下游引物β-actinR，其核苷酸序列为如SEQ ID No.11-12所示。

8.一种检测非缺失型α地贫基因突变的试剂盒，包括反应液，其特征在于，所述反应液包括权利要求1-5任意一项所述的检测非缺失型α地贫基因突变的探针以及权利要求6-7任意一项所述的检测非缺失型α地贫基因突变的引物。

9.根据权利要求8所述的检测非缺失型α地贫基因突变的试剂盒，其特征在于，所述反应液还包括Hot Star Taq酶、dNTP和10×PCR buffer。

10.根据权利要求8所述的检测非缺失型α地贫基因突变的试剂盒，其特征在于，所述反应液的组分含量为：

水：14.8μL；

10×PCR buffer：2.5μL；

25mM dNTP：0.2μL；

10μM内参上游引物β-actinF：0.1μL；

10μM内参上游引物β-actinR：0.5μL；

10μM上游引物α^T-F：0.5μL；

10μM上游引物α^T-R：0.1μL；

10μM上游引物α^B-F：0.1μL；

10μM上游引物α^B-R：1μL；

10μM探针αα^T-P1：0.7μL；

10μM探针αα^T-P2：0.5μL；

10μM探针αα^T-P3：0.5μL；

10μM探针αα^T-P4：0.3μL；

10μM探针αα^T-P5：0.5μL；

10μM内参探针β-actin-P：0.4μL；

5U/μL Hot Star Taq酶：0.3μL。