CN107090508B - 一种检测基因突变的新型试剂盒 - Google Patents

一种检测基因突变的新型试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN107090508B
CN107090508B CN201710358134.4A CN201710358134A CN107090508B CN 107090508 B CN107090508 B CN 107090508B CN 201710358134 A CN201710358134 A CN 201710358134A CN 107090508 B CN107090508 B CN 107090508B
Authority
CN
China
Prior art keywords
region
mutation
gene
probe
continuous
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710358134.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107090508A (zh
Inventor
魏小元
储慧玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Yaoming Aozhe Medical Laboratory Co ltd
Shanghai Youming Autometric Medical Technology Co ltd
Suzhou Yaoming Zekang Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Suzhou Yaoming Zekang Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Yaoming Zekang Biotechnology Co ltd filed Critical Suzhou Yaoming Zekang Biotechnology Co ltd
Priority to CN201710358134.4A priority Critical patent/CN107090508B/zh
Publication of CN107090508A publication Critical patent/CN107090508A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107090508B publication Critical patent/CN107090508B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种检测基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括：a)带有第一检测标记的非突变区探针，所述非突变区探针能与基因的连续突变区域邻近的非突变区域杂交；b)带有第二检测标记的突变区野生型探针，所述突变区野生型探针能与基因的连续突变区域与野生型序列杂交。通过使用该试剂盒获得所述第一检测标记的第一信号和所述第二检测标记的第二信号的差值，计算突变基因的拷贝数，确定所述基因的连续突变区域中是否存在突变。

Description

一种检测基因突变的新型试剂盒
技术领域
本发明涉及检测基因突变的试剂盒及其方法，特别涉及检测在基因的连续突变区域的基因突变。
背景技术
突变基因的检测对于临床用药及个性化治疗均具有重要的指导意义。例如，包括大肠癌、肺癌、胰腺癌在内的多种癌症普遍存在KRAS突变。临床实验数据显示，KRAS基因突变的肿瘤患者使用抗表皮生长因子受体(EGFR)的药物如西妥昔单抗等进行治疗是无效的，因此，肿瘤患者的KRAS基因的突变状态对是否使用抗EGFR药物具有关键的指导意义。
鉴于KRAS检测的重要性和必要性，现有技术中已经建立了多种技术检测KRAS的突变，如焦磷酸测序法、高分辨率熔解曲线、等位基因特异性PCR，PCR荧光探针法等。一般来说，现有的KRAS突变检测技术包括使用针对其特定突变位点的探针及上、下游引物，该探针直接产生的信号即是待检测样本中该突变的模板信号。
另一方面，在临床诊断中，同一基因在某个连续区域可能具有多个潜在突变位点。例如，KRAS 12和13位密码子属于高频突变位点，24-43％大肠癌含有KRAS突变，其突变位点基本都位于12和13位密码子(其中～82％在12位密码子，～17％在13位密码子)。在实践中，要准确地检测在这样的连续突变区域的突变是非常困难的，因为有很多突变的可能，而针对每种突变都可能需要设计特异性的探针，以确定基因中是否存在任何一种突变。对于每种突变，可以通过单独的反应进行检测，但这样需要进行多次检测反应，耗时耗力。虽然可以在同一个反应中使用多个探针同时检测，但探针之间可能出现相互干扰，从而影响结果的准确性。此外，使用的探针越多，成本也越高。
因此，需要一种新型试剂盒，可以快速、精确地检测基因连续突变区域的突变状态，且成本低廉。本发明的新型试剂盒及其方法解决了该问题。
发明内容
在本发明的一方面，提供了一种试剂盒，包括：
a)带有第一检测标记的非突变区探针，所述非突变区探针能与基因的连续突变区域邻近的非突变区域杂交；
b)带有第二检测标记的突变区野生型探针，所述突变区野生型探针能与基因的连续突变区域与野生型序列杂交；和
c)说明书，所述说明书提供了检测所述基因的连续突变区域中是否存在突变的说明，其中通过对样本进行PCR扩增，用所述第一检测标记的第一信号和所述第二检测标记的第二信号的差值计算突变基因的拷贝数。
在本发明的一个实施例中，所述的试剂盒还包括至少一种选自下组的试剂：
a)DNA聚合酶；
b)核苷酸单体混合物；
c)能够扩增含有所述连续突变区域和所述非突变区域的模板序列的一对引物；和
d)一个以上能够在所述连续突变区域与突变型序列杂交的突变区阻断核酸。
在本发明的一个实施例中，所述的试剂盒能用于检测基因的连续突变区域中是否存在突变，优选检测临床样本中基因连续突变区域中是否存在突变，其中临床样本优选为包含基因突变型和野生型的混合样本。
在本发明的一个具体实施例中，所述PCR为数字PCR。
在本发明的一个实施例中，如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述基因选自由KRAS基因、BRAF基因……所组成的组。
在本发明的一个实施例中，在所述连续突变区域中有至少两个点突变位点，或者至少有一个存在两种突变可能的点突变位点。
在本发明的一个实施例中，所述连续突变区域包含KRAS基因的外显子2中的第12和13个密码子。
在本发明的一个具体实施例中，所述非突变区探针具有SEQ ID N O:1的序列，和/或所述突变区野生型探针具有SEQ ID NO:2的序列。
在本发明的一个具体实施例中，所述连续突变区域包含BRAF基因的第593到第600个氨基酸的编码序列。
在本发明的一个实施例中，所述连续突变区域的长度为50bp以下、40bp以下、30bp以下、20bp以下、或10bp以下。
在本发明的一个实施例中，所述第一检测标记或所述第二检测标记选自由FAM、Tetrachlorofluorescein(TET)、Alexa 488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、E DANS、rhodamine 6G(P6G)、tetramethyirhodamine(TMR)、tetramethy lrhodamine isothiocyanate(TMRITC)、x-rhodamine、Texas red、生物素、和亲和素所组成的组，其中
所述第一检测标记和所述第二检测标记不相同。
本发明的另一方面，提供了一种检测基因的连续突变区域中是否存在突变的方法，其中，该方法的步骤包括：
a)对连续突变区域的DNA样品进行PCR扩增，其中反应混合物包括：
第一检测标记的非突变区探针，所述非突变区探针能与基因的连续突变区域邻近的非突变区域杂交；
第二检测标记的突变区野生型探针，所述突变区野生型探针能与基因的连续突变区域与野生型序列杂交；
b)检测所述第一检测标记的第一信号和所述第二检测标记的第二信号；
c)通过计算所述第一信号和所述第二信号的差值，确定所述基因的所述连续突变区域是否具有突变；
所述方法能用于检测基因的连续突变区域中是否存在突变，优选检测临床样本中基因连续突变区域中是否存在突变，其中临床样本优选为包含基因突变型和野生型的混合样本。
在本发明的一个实施例中，所述反应混合物还包括至少一种选自下组的试剂：
a)DNA聚合酶；
b)核苷酸单体混合物；
c)能够扩增含有所述连续突变区域和所述非突变区域的模板序列的一对引物；和
d)一个以上能够在所述连续突变区域与突变型序列杂交的突变区阻断核酸。
在本发明的一个实施例中，所述PCR为数字PCR。
在本发明的一个实施例中，所述基因选自由KRAS基因、BRAF基因所组成的组。
在本发明的一个实施例中，在所述连续突变区域中有至少两个点突变位点，或者至少有一个存在两种突变可能的点突变位点。
在本发明的一个实施例中，所述连续突变区域包含KRAS基因的外显子2中的第12和13个密码子。
在本发明的一个实施例中，所述非突变区探针具有SEQ ID NO:1的序列，和/或所述突变区野生型探针具有SEQ ID NO:2的序列。
在本发明的一个具体实施例中，所述连续突变区域包含BRAF基因的第593到第600个氨基酸的编码序列。
在本发明的一个实施例中，所述连续突变区域的长度为50bp以下、40bp以下、30bp以下、20bp以下、或10bp以下。
在本发明的一个实施例中，所述第一检测标记或所述第二检测标记选自由FAM、Tetrachlorofluorescein(TET)、Alexa 488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、E DANS、rhodamine 6G(P6G)、tetramethyirhodamine(TMR)、tetramethy lrhodamine isothiocyanate(TMRITC)、x-rhodamine、Texas red、生物素、和亲和素所组成的组，其中
所述第一检测标记和所述第二检测标记不相同。
本发明的另一方面，还提供了一种探针组合物，包含：
a)带有第一检测标记的非突变区探针，所述非突变区探针能与基因的连续突变区域邻近的非突变区域杂交；和
b)带有第二检测标记的突变区野生型探针，所述突变区野生型探针能与基因的连续突变区域与野生型序列杂交。
在本发明的一个实施例中，所述非突变区探针核酸序列为SEQ ID NO:1所示，和/或所述突变区野生型探针核酸序列为SEQ ID NO:2所示。
附图说明
图1示出检测KRAS基因外显子2密码子12-13突变的方法示意图。KRAS基因外显子2具有包含密码子12-13的连续突变区域以及与突变区域邻近的非突变区域。扩增含有连续突变区域和非突变区域的模板序列。通过能够在连续突变区域与野生型序列特异性杂交的突变区野生型探针检测在连续突变区域含有野生型序列的那部分扩增产物的量，并且通过能够与非突变区域特异性杂交的非突变区探针检测检测扩增产物的总量，从而确定基因的连续突变区域是否具有突变。在扩增过程中，可以任选地加入突变区阻断核酸以降低突变区野生型探针和突变序列的非特异性杂交。
图2示出本发明中的核苷酸和氨基酸序列。
如本文所述，术语“基因”是指在本发明中是指编码蛋白的DNA序列，例如，但不限于，存在于细胞基因组中的编码蛋白的DNA序列。本发明的方法可以用于检测任何可能具有连续突变区域的基因，例如但不限于，KRAS基因(NM_004985.4)，NRAS基因(NM_002524.4)，和BRAF基因(NM_004333.4)。
如本文所述，术语“连续突变区域”是指在基因中的一段连续的核苷酸序列，其中含有至少两个点突变位点，或者含有至少一个存在两种突变可能的点突变位点。在某些实施方式中，连续突变区域的长度不超过50bp、不超过40bp、不超过30bp、不超过20bp、或不超过10bp。当含有至少两个点突变位点时，连续突变区域可以是由两个点突变位点为起止端点而界定的一段区域，即连续突变区域的两个端点分别为两个点突变位点。例如，某基因的第30位碱基和第40位碱基可能存在点突变，因此该基因的连续突变区域可以是从第30位碱基开始到第40位碱基结束的、长度为11个碱基的一段连续的核苷酸序列。在某些实施方式中，在连续突变区域中可能存在至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个点突变位点。在这种情况下，在连续突变区域中，除了两个端点以外的中间部份也具有至少一个点突变位点。在某些实施方式中，至少2个(或者至少3个、4个、5个、6个)点突变位点是紧邻的。例如，在某基因的第30位、31位、和32位碱基都可能存在点突变，因此第30、31和32位碱基是紧邻的点突变位点。
如本文所述，术语“点突变”是指从野生型碱基改变为另一个不同的碱基，即突变型碱基。“点突变位点”是指具有点突变可能的一个特定的碱基位置，在这里既可能是野生型碱基也可能是突变型碱基。例如，在某基因的某个点突变位点处(例如第30位碱基)，野生型的碱基是A，但突变型的碱基是G，并且在该点突变位点处通常不会出现C或T碱基。在某些实施方式中，某个点突变位点的野生型碱基可能突变成不止一种的突变型的碱基。例如，在这种情况下，在某个点突变位点处，假设野生型的碱基是A，突变型的碱基可以有两种可能(例如可以是G或C，或者可以是G或T，或者可以是C或T)，或者有三种可能(例如可以是G、C或T)。因此，在连续突变区域中，每个点突变位点至少存在两种或更多种碱基的可能(即，野生型和至少一种突变型)。当连续突变区域含有至少一个存在两种突变可能的点突变位点时，则该连续突变区域可能存在至少三种序列，即一种野生型序列，两种突变型序列。当连续突变区域至少存在两个或者更多个点突变位点时，根据排列组合可知，连续突变区域可能存在多种不同的序列。例如，假设在连续突变区域存在3个点突变位点，当每个点突变位点可能有3种不同的碱基时(例如，1种野生型加两种突变型)，在所述连续突变区域就可能存在9种不同的序列，其中1种是完全野生型序列，另外8种都是具有突变的序列。
在某些实施方式中，所述连续突变区域为KRAS基因的外显子2中的第12和13个密码子。KRAS基因的外显子2的野生型序列如SEQ ID NO:3所示(其中第一个密码子为ATG)(具体序列如图2所示)，外显子2的第12和13个密码子的野生型序列如SEQ ID NO:4所示，其中第12个密码子的序列为ggt，第13个密码子的序列为ggc。在上述第12和13个密码子处的这6个碱基中，存在至少5个点突变位点，即第12个密码子的第1、2、3位碱基，和第13个密码子的第2、3位碱基。在某些点突变位点处，存在两种或以上突变型碱基，例如第12位密码子的第1位碱基处存在3种突变型碱基(即，A、C或T)，第2位碱基处也存在3种突变型碱基(即，A、C或T)。具体如表1所示。
表1.KRAS密码子12和13的示例性的突变
KRAS密码子 突变 氨基酸
密码子12 第1位的g突变为a G12S
密码子12 第1位的g突变为c G12R
密码子12 第1位的g突变为t G12C
密码子12 第2位的g突变为a G12D
密码子12 第2位的g突变为c G12A
密码子12 第2位的g突变为t G12V
密码子13 第2位的g突变为a G13D
密码子12 第3位的t突变成c G12C
密码子12 第2位的g突变成a，且第3位的t突变成c G12D
密码子12 第2位的g突变成t，且第3位的t突变成c G12V
密码子13 第2位的g突变成a，且第3位的c突变成t G13D
在某些实施方式中，所述连续突变区域为BRAF基因的第593到第600个氨基酸的编码序列或其中的含有至少两个点突变的片段。在某些实施方式中，所述连续突变区域是BRAF的D593V、F594L、G595R,L596V、T598I、V599D、V599E、V599K、V599R、V600K、和V600E。示例性的核酸突变请参见表2所示。
表2
Figure BDA0001299650680000081
Figure BDA0001299650680000091
在现有技术中，为检测在所述连续突变区域是否存在突变，通常需要对每种可能的突变分别设计单独的特异性探针，并且都用于检测，才能一一排除或确定在基因样品中是否具有上述任何一种突变。本发明提供了一种全新的方法，使用少至两种的探针即可准确地检测。以KRAS基因为例，如图1所示，本发明的方法使用一条突变区野生型探针检测样品中的突变区的野生序列的信号，和使用一条非突变区探针检测样品中含有突变区的全部序列(既包括在突变区含有野生型序列的那些序列，也包括在突变区含有突变型序列的那些序列)的信号，通过将两者信号相减，实现对突变区的突变序列的全面检测。换言之，只要突变区存在突变序列，不管有几种突变序列，也不管具体是哪种突变序列，本发明的方法都可以检测出突变序列的存在。
本发明的方法或试剂盒涉及DNA扩增的反应混合物，其中含有突变区野生型探针和非突变区探针。探针通常具有适当的长度，例如10-50个核苷酸、10-45个核苷酸、10-40个核苷酸、10-35个核苷酸、10-30个核苷酸、10-25个核苷酸、10-20个核苷酸、或10-15个核苷酸。
如本文所述，术语“突变区野生型探针”是指，当所述连续突变区域的全长由野生型序列组成时，能够在所述连续突变区域的全长范围内与之特异性杂交的核酸探针。“特异性杂交”在本发明中是指，在严谨的条件下专一地与目标靶序列互补结合，而不与不希望的其他序列互补结合。就突变区野生型探针而言，其在严谨的条件下专一地与突变区的全长野生型序列互补结合，而不与突变区的任何一种突变序列互补结合。“严谨的条件”在本发明中是指，在由5×SSPE、5×Denhardt’s溶液、0.5％SDS、和 100μg/mL变性的鱼精DNA组成的溶液中在42℃杂交，然后用包含0.5×SSC和 0.1％SDS的溶液在42℃洗涤。
在某些实施方式中，突变区野生型探针包含与SEQ ID NO:4全长至少80％互补的序列，即与6个碱基中的至少5个互补。在某些实施方式中，突变区野生型探针包含SEQ IDNO:4全长100％互补的序列。在某些实施方式中，突变区野生型探针具有SEQ ID NO:24的序列。在某些实施方式中，突变区野生型探针具有SEQ ID NO:2的序列。
如本文所述，术语“非突变区探针”是指，能够与所述连续突变区域邻近的非突变区域特异性杂交的核酸探针。“非突变区域”在本发明中是指在所述基因中的一段连续的保守核苷酸序列，其在被检测的个体中通常只有一种碱基序列，不存在多于一种的序列变化。例如，对于某个被检测的个体而言，在非突变区域可以只具有野生型序列，或者只具有某一种特定的突变序列而没有野生型序列。非突变区域的位置可以由本领域技术人员综合各方面因素进行选择。通常，在所述基因序列上，非突变区域与所述连续突变区域需要足够邻近，以便能够在同一个扩增子中被扩增，但同时又需要保持一定的间隔距离，以确保突变区野生型探针和非突变区探针能够同时结合在同一个模板分子上，并且不产生不希望的相互干扰，例如干扰对方的结合或干扰对方的信号的发出或检测。突变区域与连续突变区域之间的间隔距离是指，非突变区域与连续突变区域两者彼此最接近的两个碱基之间间隔的碱基个数。在某些实施方式中，非突变区域与连续突变区域之间间隔0-300个碱基，例如，约0-200个碱基、约0-150个碱基、约0-100个碱基、约0-50个碱基、约0-20个碱基、约0-10个碱基、约50-100个碱基、约50-90个碱基、约50-80个碱基、约50-70个碱基、约50-60个碱基、约100-200个碱基、约100-180个碱基、约100-160个碱基、约100-150个碱基、约100-130个碱基、约100-120个碱基、或约200-300个碱基。
在某些实施方式中，非突变区探针与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的等长部分特异性杂交。SEQ ID NO:5是位于KRAS基因的第12和13个密码子的5’上游的50个碱基，SEQ IDNO:6是位于KRAS基因的第12和13个密码子的3’下游的50个碱基。“等长部分”在这里是指在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中的一部分，其长度(即碱基数目)与非突变区探针相同。例如，如果非突变区探针长度为20个核苷酸，那么该探针与SEQ ID NO:5或6中的20个核苷酸的区域特异性杂交。在某些实施方式中，非突变区探针包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的等长部分至少80％(例如，至少80％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)互补的序列。在某些实施方式中，非突变区探针包含与SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的等长部分100％互补的序列。在某些实施方式中，非突变区探针具有SEQ ID NO:1的序列。
核酸探针在本发明中是指带有检测标记的寡核苷酸分子。本发明所述的非突变区探针带有第一检测标记，突变区野生型探针带有第二检测标记。“检测标记”在本发明中是指能够产生检测信号的分子或基团。
检测标记包括，但不限于，荧光分子(例如，参见欧洲专利EP144914)、放射性同位素(例如，参见美国专利US4358535和4446237)、抗体、酶和寡核苷酸(例如，寡核苷酸条形码)。
荧光分子的例子包括但不限于6-carboxyfluorescein(FAM)、Tetrachlorofluorescein(TET)、Alexa(例如Alexa 488,Alexa 532)、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、rhodamine 6G(P6G)及其衍生物(tetramethyirhodamine(TMR),tetramethylrhodamine isothiocyanate(TMRITC),x-rhodamine,Texas red,由位于美国俄勒冈州尤金市的分子探针公司(Molecular Probes,Inc.)生产的商品名为"BODJPY FL"、"BODIPY FL/C3"、"BODIPY EL/C6"、"BODIPY 5-FAM"、"BODIPY TMR"、"BODIPY TR"、"BODIPY R6G"、"BODIPY 564"、"BODIPY 581"的探针及衍生物。
检测标记的示例还可以参见美国专利号5,723,591和5,928,907；WO2011066476和WO2012149042；www.idahotech.com；Gudnason等人，NucleicAcids Res.，35(19)：e127(2007)，其全文通过引用并入本发明。
检测标记可以通过共价键或非共价键连接在寡核苷酸分子上。非共价键包括但不限于氢键、离子键、范德华力和疏水键。例如，在一些实施方式中，检测标记可以通过共价键连接在核苷酸分子上。例如，在合成寡核苷酸分子时可以掺入氨基烯丙基(amino-allyl)UTP，所产生的氨基烯丙基标记的核酸分子可以和含有NHS－酯(NHS-ester)的荧光分子(例如Alexa 488,Alexa 594,Alexa 647(Invitrogen)或Cy3(GE Healthcare))偶联形成共价键连接。
在某些实施方式中，所述第一检测标记或所述第二检测标记选自：FAM、Tetrachlorofluorescein(TET)、Alexa 488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、rhodamine6G(P6G)、tetramethyirhodamine(TMR)、tetramethylrhodamine isothiocyanate(TMRITC)、x-rhodamine、Texas red、生物素、亲和素，其中所述第一检测标记和所述第二检测标记不相同。在某些实施方式中，第一检测标记可产生第一信号，第二检测标记可产生第二信号。本领域技术人员可以根据实际情况选择适当的第一检测标记和第二检测标记，只要第一检测标记的第一信号和第二检测标记的第二信号能够在同一个样品中被独立地且准确地检测即可。例如，在某些实施方式中，第一检测标记是能够通过红色荧光通道检测的荧光分子，例如，Cy5、Alex 594、Alex 633、Alex647、Texas Red、VIC，第二检测标记是能够通过绿色荧光通道检测的荧光分子，例如，6-FAM、Alex 488、FITC。在某些实施方式中，所述第一检测标记和所述第二检测标记分别选自FAM和VIC。在某些实施方式中，所述第一检测标记是FAM，所述第二检测标记是VIC。
在某些实施方式中，所述非突变区探针还带有可淬灭第一信号的第一淬灭剂，和/或所述突变区野生型探针还带有可淬灭第二信号的第二淬灭剂。“淬灭剂”在本发明中是指，当与检测标记在空间上足够靠近时，能够阻止检测标记产生检测信号的分子。当淬灭剂与检测标记距离较远时，淬灭剂不能阻止检测信号的产生。
淬灭分子的例子包括但不限于DDQ-I、DDQ-II、Dabcyl、Eclipse、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、"QSY7"“QSY-21”和"QSY33"(分子探针公司)、Ferrocene及其衍生物、methyl viologen、tetramethylrhodamine(TAMRA)、Minor groovebinding non-fluorescent quencher(MGBNFQ)和N,N'-dimethyl-2,9-diazopyrenium。
在某些实施方式中，所述荧光分子是FAM，所述淬灭分子是MGBNFQ或DDQ-I。在某些实施方式中，所述荧光分子是TAMRA、Cy3、ROX、Cy5，所述淬灭分子是DDQ-II。在某些实施方式中，所述荧光分子是FAM、HEX、ROX、JOE，所述淬灭分子是Dabcyl。在一些实施方式中，所述探针在5'端具有荧光分子FAM或VIC，在3'端具有淬灭分子MGBNFQ。
可以通过本领域公知的方法将淬灭分子连接在突变区野生型探针和/或非突变区探针上。例如，在合成寡核苷酸分子时可以掺入氨基烯丙基(amino-allyl)UTP，所产生的氨基烯丙基标记的核酸分子可以和含有NHS－酯(NHS-ester)的淬灭分子偶联形成共价键连接。又例如，可以在合成寡核苷酸的过程中在3’端通过和淬灭分子(例如Dabcyl)的亚磷酰胺衍生物反应将淬灭分子连接到寡核苷酸上。
在某些实施方式中，当所述非突变区探针是完整的时，所述第一信号被淬灭。在某些实施方式中，当所述突变区野生型探针是完整的时，所述第二信号被淬灭。在某些实施方式中，检测标记和淬灭剂分别连接在探针的5’端和3’端。例如，非突变区探针的5’端连接第一检测标记，3’端连接第一淬灭剂，或者3’端连接第一检测标记，5’端连接第一淬灭剂。再例如，突变区野生型探针的5’端连接第二检测标记，3’端连接第二淬灭剂，或者3’端连接第二检测标记，5’端连接第二淬灭剂。
在某些实施方式中，使用具有5’-3’外切酶活性的聚合酶扩增含有所述连续突变区域和所述非突变区域的模板序列，并在反应混合物中加入所述探针。在扩增过程中，如果所述探针与模板序列杂交，所述探针将会被聚合酶在聚合反应过程中降解，从而使所述探针上的荧光分子与淬灭分子分离，并产生荧光信号(参见美国专利US5210015和US5487972)。
在某些实施方式中，所述反应混合物中可以进一步含有一个或多个能够在所述连续突变区域与突变型序列杂交的突变区阻断核酸。“突变区阻断核酸”在本发明中是指，能够与所述连续突变区域的某种突变型序列特异性杂交的核酸。突变区阻断核酸可以带有或不带有检测标记。通过特异性地结合在连续突变区域的突变型序列，突变区阻断核酸可以阻止或减少突变区野生型探针与突变型序列发生任何不希望的结合。可以根据连续突变区域可能存在的一种或多种突变型序列，相应设计一种或多种突变区阻断核酸。也可以针对容易干扰突变区野生型探针的某种或某几种突变型序列，特定地设计一种或多种突变区阻断核酸，以降低或排除突变型序列的干扰。在某些实施方式中，突变区阻断核酸可以提高检测的特异性和准确性。在某些实施方式中，突变区阻断核酸的序列包含选自SEQ ID NO:9-15中的一种或多种核酸。
本发明的方法涉及的反应混合物中包含含有所述基因的连续突变区域的DNA样品。所述样品可以是从对象采集的任何合适的生物材料，例如体液(如血液)和活检样品(如从疾病影响的部位获取的细胞或组织)。
可以使用本领域已知的方法获取样品中的核酸。可以使用本领域已知的从生物样品中提取核酸的方法(参见，例如Nucleic Acids Isolation Methods，Bowein(编)，American Scientific Publishers(2002))。样品中可以包括分离的DNA，例如分离的基因组DNA或从mRNA在体外反转录形成的cDNA。或者，样品中可以包括未纯化或未扩增的核酸。例如，样品中可以包括分离的细胞或组织。可选地，所述分离的细胞或组织通过预处理释放包含在其中的核酸。在进一步的实施方式中，样品中的核酸可以通过例如PCR或反转录进行扩增。
在某些实施方式中，所述样品来源于疾病患者，所述疾病与在所述连续突变区域的突变相关。在某些实施方式中，所述疾病是肿瘤、癌症或遗传疾病。在某些实施方式中，所述样品来源于肿瘤或癌症的细胞或组织。
本发明的方法涉及的反应混合物中还包含一对引物，所述引物能够扩增含有所述连续突变区域和所述非突变区域的模板序列。
本发明所述的“引物”是指能够和/或用于启动核酸模板的复制的寡聚核苷酸分子，其通常具有7-40个核苷酸、10-38个核苷酸、15-30个核苷酸、15-25个核苷酸，或者17-20个核苷酸。例如，引物可以是长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的寡聚核苷酸。引物可以包含DNA、RNA、核酸类似物、或其任意的组合。示例性引物可以是化学合成的。在本发明所述的一对引物中，其中一条引物可以与基因的5’-3’链的第一位置结合，另一条引物可以与基因的3’-5’链的第二位置结合，当通过DNA扩增反应延伸这对引物时，可以扩增从第一位置开始到第二位置结束的区域，该区域也叫模板序列，扩增得到的核酸分子称为扩增产物。
所述引物能够扩增的目标序列含有所述连续突变区域和所述非突变区域。本领域技术人员能够根据所述连续突变区域和所述非突变区域在基因序列上的具体位置，结合考虑期望的扩增产物的长度，引物设计难易程度等因素，选择出适当的引物序列。在某些实施方式中，扩增产物的长度为100bp-1000bp(例如约100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp)、100bp－1500bp、100bp－2000bp。
在某些实施方式中，所述引物的序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
本发明的方法涉及的反应混合物中还包含DNA聚合酶。“DNA聚合酶”在本发明中是指任何具有使用存在的DNA作为模板催化DNA合成功能的多肽。本领域公知的任何适合DNA合成或复制的聚合酶都可以使用。DNA聚合酶的例子包括，但不限于，Taq DNA聚合酶(例如，野生型酶、Stoffel片段和FastStart聚合酶等)、Pfu DNA聚合酶、S-Tbr聚合酶、Tth聚合酶、Vent聚合酶、或其组合。在一些实施方式中，可以使用一种或多种耐热的聚合酶来完成DNA扩增，例如Taq DNA聚合酶(例如，野生型酶、Stoffel片段和FastStart聚合酶等)、Pfu DNA聚合酶、S-Tbr聚合酶、Tth聚合酶、Vent聚合酶、或其组合。
在某些实施方式中，DNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性。具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶的例子包括，但不限于，E.coli DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶(参见美国专利US4889818)。DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性可以被用来进行定量PCR检测样品中的目标核酸分子(参见美国专利US5210015)。
本发明的方法包括使用所述反应混合物进行DNA扩增。在某些实施方式中，通过聚合酶链式反应(PCR)进行DNA扩增。简单地说，通过使用交替加热和冷却的循环以进行DNA扩增，一个循环通常包括在变性温度下使模板DNA分子解链成单链、在退火温度下使引物与单链的模板DNA分子通过碱基互补结合、和在延伸温度下使DNA聚合酶延伸引物。根据具体的情况不同，退火温度和延伸温度可以相同或不同。
在某些实施方式中，所述扩增通过数字PCR的方法扩增。数字PCR的方法通过最终产物来定量检测样品中的目标核酸分子，而不需要像传统定量PCR方法那样测定扩增曲线。数字PCR的原理是将样品分成数个较小的亚体积(例如，微滴)进行PCR扩增，通过计数含有阳性扩增产物的所述亚体积(例如微滴)的数目，推导出起始样品中的目标核酸分子的拷贝数。关于数字PCR方法的综述，参见例如Pohl等人，Expert Rev.Mol.Diagn.，4(1)：41-7(2004)；Hindson等人，Anal.Chem.2011,83,8604-8610；Pinheiro等人，Anal.Chem.2012,84(2),1003-1011等，其全文在此参考并入。在一些实施方式中，可以使用QX100TM DropletDigital PCR System(QX100TM Droplet Generator，QX100TM Droplet，BIO-RAD)进行数字PCR扩增。
本发明的检测方法或试剂盒还包括检测在扩增产物中所述第一检测标记的第一信号和所述第二检测标记的第二信号。
在扩增过程中，突变区野生型探针和非突变区探针可以分别与单链模板分子上的特定区域结合，形成双链区。当非突变区域被扩增时，非突变区探针产生第一检测信号。当连续突变区域被扩增时，突变区野生型探针产生第二检测信号。例如，当使用具有5'-3'的外切酶活性的DNA聚合酶和具有荧光检测标记和淬灭剂的探针时，DNA聚合酶会在引物延伸到双链区时切断与模板结合的探针，从而使探针中的荧光检测标记和淬灭剂分离，使得淬灭剂无法再淬灭荧光检测标记的信号，因此荧光检测标记能够发出检测信号。
由于每一个模板分子都含有所述非突变区，因此非突变区探针产生的第一信号可以指示扩增产物的总量。由于突变区野生型探针特异性结合连续突变区域的野生型全长序列，因此突变区野生型探针产生的第二信号可以指示在所述扩增产物中在所述连续突变区域含有野生型序列的那部分扩增产物的量。连续突变区域的突变序列，不管其具体是何种突变，也不管有几种不同的突变，都不会与突变区野生型探针特异性结合，因此不会产生第二信号。通过检测第一信号和第二信号，并计算两者的差值，可以确定在基因的所述连续突变区域中是否具有突变。
所述第一信号和第二信号可以通过本领域公知的方法进行检测。例如，在某些实施方式中，第一检测标记是能够通过绿色荧光通道检测的荧光分子，例如，6-FAM、Alex488、FITC，第二检测标记是能够通过红色荧光通道检测的荧光分子，例如，Cy5、Alex 594、Alex 633、Alex 647、Texas Red、VIC。通过不同的荧光通道(例如，绿色荧光通道和红色荧光通道)可以检测PCR反应过程中或最终产物中的第一信号和第二信号。
当使用数字PCR进行DNA扩增时，可以对含有DNA扩增产物的每个亚体积进行检测。通过检测该信号，可确定被检测的亚体积(例如微滴)中是否存在感兴趣的PCR扩增产物，和/或感兴趣的PCR扩增产物的量。可以通过本领域公知的方法检测亚体积(例如微滴)中的可检测信号。例如，可以使用检测器对每个亚体积(例如微滴)进行成像，并将成像结果进行分析。示例的检测/成像装置例如WO2007091228、WO2007091230、WO2008038259、WO2010036352、Zhang等人Nucleic Acids Res.，35(13)：4223-4237(2007)、Wang等人，J.Micromech.Microeng.，15：1369-1377(2005)；Jia等人，38：2143-2149(2005)；Kim等人，Biochem.Eng.J.，29：91-97；Chen等人，Anal.Chem.，77：658-666；Chen等人，Analyst，130：931-940(2005)；Munchow等人，Expert Rev.Mol.Diagn.，5：613-620(2005)；Charbert等人，Anal.Chem.，78：7722-7728(2006)；和Dorfman等人，Anal.Chem，77：3700-3704(2005)中所描述的那些，其全文通过引用并入本发明。还可以对流动的或静态的微滴进行检测。
本发明的检测方法还包括确定所述基因的所述连续突变区域是否具有突变的步骤。根据对第一信号和第二信号的检测结果，可以确定所述基因的所述连续突变区域是否具有突变。如上所述，非突变区探针产生的检测信号为第一信号，指示扩增产物的总量。突变区野生型探针产生的检测信号为第二信号，指示在所述连续突变区域含有野生型序列的那部分扩增产物的量；当第一信号和第二信号基本相当时，可以确定所述连续突变区域不具有突变。当第一信号显著高于第二信号时，可以确定所述连续突变区域具有突变。在某些实施方式中，检测方法还包括将第一信号和第二信号的检测结果同对照(例如，阳性对照和阴性对照)相比较。例如，在检测KRAS突变时，可以使用已知具有KRAS密码子12和13突变的样品作为阳性对照，使用正常人来源的样品作为阴性对照。如何使用对照来确定检测结果的可靠性是本领域常规技术人员已知的。
在某些实施方式中，所述连续突变区域的点突变与疾病相关。例如，24-43％的大肠癌中有KRAS基因突变，其中33.5-34.4％是G12D突变，21.9-24.4％为G12V突变，18.9-19.2％为G13D突变，7.9％是G12C突变，4.9-5.7％是G12S突变，6.2-6.6％是G12A突变。又例如，8-15％的大肠癌中有BRAF基因突变，其中包括D594G突变，D594V突变，G596R突变和V600E突变。
在某些实施方式中，所述连续突变区域的点突变与个体对某种疗法的反应性相关。例如，KRAS密码子12和13突变个体对针对EGFR的抗体药物(如cetuximab/panitumumab)具有降低的敏感性。而BRAF突变个体导致对针对EGFR的抗体药物具有抗性。
本发明还提供了用于诊断个体在基因的连续突变区域中是否具有突变的方法，包括：使用反应混合物进行DNA扩增，所述反应混合物含有：含有来自所述个体的基因的连续突变区域的DNA样品、DNA聚合酶、核苷酸单体混合物、扩增缓冲液、能够与所述连续突变区域邻近的非突变区域特异性杂交的带有第一检测标记的非突变区探针、能够在所述连续突变区域与野生型序列特异性杂交的带有第二检测标记的突变区野生型探针、以及一对引物，其能够扩增含有所述连续突变区域和所述非突变区域的模板序列；检测在扩增产物中所述第一检测标记的第一信号和所述第二检测标记的第二信号，其中所述第一信号指示所述扩增产物的总量，所述第二信号指示在所述扩增产物中在所述连续突变区域含有野生型序列的那部分扩增产物的量；确定所述个体在所述基因的连续突变区域是否具有突变。在某些实施方式中，所述基因是KRAS或BRAF。在某些实施方式中，所述个体被怀疑为或被诊断为患有疾病或状况。在某些实施方式中，所述疾病或状况是癌症。在某些实施方式中，所述癌症是肺癌、大肠癌、胰腺癌和白血病。
本发明还提供了用于识别个体是否对疗法具有反应性的方法，包括：根据前述方法确定所述个体在所述基因的连续突变区域是否具有突变，并确定所述个体对所述疗法是否具有反应性。在某些实施方式中，所述基因是KRAS或BRAF。所述个体被诊断为患有疾病或状况。在某些实施方式中，所述疾病或状况是癌症。在某些实施方式中，所述癌症是肺癌、大肠癌、胰腺癌、白血病、或黑色素瘤。
本发明还提供了核酸探针，包含：能够与所述连续突变区域邻近的非突变区域杂交的带有第一检测标记的非突变区探针；和能够在基因的连续突变区域与野生型序列杂交的带有第二检测标记的突变区野生型探针。在某些实施方式中，突变区野生型探针包含与SEQ ID NO:4全长至少80％互补的序列，即与6个碱基中的至少5个互补。在某些实施方式中，突变区野生型探针包含SEQ ID NO:4全长100％互补的序列。在某些实施方式中，突变区野生型探针包含SEQ ID NO:24的序列。在某些实施方式中，突变区野生型探针包含或具有SEQ ID NO:2的序列。在某些实施方式中，非突变区探针与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的等长部分特异性杂交。在某些实施方式中，非突变区探针包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的等长部分至少80％(例如，至少80％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)互补的序列。在某些实施方式中，非突变区探针包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的等长部分100％互补的序列。在某些实施方式中，非突变区探针具有SEQ ID NO:1的序列。
本领域技术人员可以根据实际情况选择适当的第一检测标记和第二检测标记，只要第一检测标记的第一信号和第二检测标记的第二信号能够在同一个样品中被独立地且准确地检测即可。例如，在某些实施方式中，第一检测标记是能够通过绿色荧光通道检测的荧光分子，例如，6-FAM、Alex 488、FITC，第二检测标记是能够通过红色荧光通道检测的荧光分子，例如，Cy5、Alex 594、Alex 633、Alex 647、Texas Red、VIC。
在某些实施方式中，所述基因是KRAS。在某些实施方式中，所述连续突变区域包含KRAS的外显子2中的第12和13个密码子。KRAS基因的外显子2的野生型序列如SEQ ID NO:3所示，外显子2的第12和13个密码子的野生型序列如SEQ ID NO:4所示。本说明书表1描述了代表性的KRAS密码子12和13突变。
在某些实施方式中，所述基因是BRAF。在某些实施方式中，所述连续突变区域是BRAF的第593到第600个氨基酸的编码序列或其中的含有至少两个点突变的片段。BRAF基因的代表性的突变包括，但不限于，D593V、F594L、G595R,L596V、T598I、V599D、V599E、V599K、V599R、V600K、和V600E。示例的核酸突变可参见表2。
在某些实施方式中，所述核酸探针还带有可以在足够靠近的空间距离内淬灭所述荧光分子的淬灭分子。当所述非突变区探针是完整的时，所述第一信号被淬灭。在某些实施方式中，当所述突变区野生型探针是完整的时，所述第二信号被淬灭。在某些实施方式中，检测标记和淬灭剂分别连接在探针的5’端和3’端。例如，非突变区探针的5’端连接第一检测标记，3’端连接第一淬灭剂，或者3’端连接第一检测标记，5’端连接第一淬灭剂。再例如，突变区野生型探针的5’端连接第二检测标记，3’端连接第二淬灭剂，或者3’端连接第二检测标记，5’端连接第二淬灭剂。
本发明还提供了用于检测基因的连续突变区域中是否存在突变的试剂盒，包含：能够与所述连续突变区域邻近的非突变区域杂交的带有第一标记的非突变区探针；能够在所述连续突变区域与野生型序列杂交的带有第二标记的突变区野生型探针，和说明书，所述说明书提供了用所述非突变区探针和所述突变区野生型探针检测所述基因的连续突变区域中是否存在突变的说明。
在某些实施方式中，所述基因是KRAS。在某些实施方式中，所述连续突变区域是KRAS的外显子2中的第12和13个密码子。KRAS基因的外显子2的野生型序列如SEQ ID NO:3所示，外显子2的第12和13个密码子的野生型序列如SEQ ID NO:4所示，其中第12个密码子的序列为ggt，第13个密码子的序列为ggc。代表性的KRAS密码子12和13突变参见本说明书表1。
在某些实施方式中，所述基因是BRAF。在某些实施方式中，所述连续突变区域是BRAF的第593到第600个氨基酸的编码序列或其中的含有至少两个点突变的片段。
在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包括至少一种标准对照品。标准对照品可以是阳性对照，即在所述连续突变区域中具有突变的对照序列，也可以是阴性对照，即在所述连续突变区域中全部为野生型序列的对照序列。标准对照品可以是分离的DNA分子。在某些实施方式中，所述试剂盒中包括阳性对照和阴性对照。例如，在检测KRAS突变时，可以使用已知具有KRAS密码子12和13突变的样品作为阳性对照，使用正常人来源的样品作为阴性对照。如何使用对照来确定检测结果的可靠性是本领域常规技术人员已知的。
在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包含至少一种选自下组的试剂：DNA聚合酶，核苷酸单体混合物，和能够扩增含有所述连续突变区域和所述非突变区域的模板序列的一对引物。在某些实施方式中，DNA聚合酶为Taq聚合酶。在某些实施方式中，所述引物的序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包含一种或多种突变区阻断核酸。该突变区阻断核酸能够与所述连续突变区域的某种突变型序列特异性杂交的核酸，阻止或减少突变区野生型探针与突变型序列发生任何不希望的结合，从而检测的特异性和准确性。可以根据连续突变区域可能存在的一种或多种突变型序列，相应设计一种或多种突变区阻断核酸。也可以针对容易干扰突变区野生型探针的某种或某几种突变型序列，特定地设计一种或多种突变区阻断核酸，以降低或排除突变型序列的干扰。在某些实施方式中，突变区阻断核酸的序列包含选自SEQ ID NO:9-15的一种或多种核酸。
在某些实施方式中，所述试剂盒不含有能够在所述连续突变区域与突变型序列杂交的突变区阻断核酸。
本发明的优势包括，但不限于，使用少至两种核酸探针、在一个反应中准确地确定在一段具有多种突变可能的连续突变区域中是否存在突变。传统方法检测基因的多种突变时需要进行多个检测反应，并需要针对每一个突变位点分别设计探针。例如，在检测KRAS的第12位和第13位密码子突变时，如果利用传统方法需要对每一种突变设计探针，才能一一排除或确定。探针数量越多，成本越高，而且探针之间的相互干扰越大，对检测结果的准确性不利。而利用本发明提供的方法，只需要一个反应和少至两种探针，就可以检测所有可能的突变。因此，本发明提供的方法与传统方法相比具有成本低，便于实验操作和数据分析等优点。这些优点也将体现在对其他具有多个突变类型的核酸分子的检测中。
以下实施例旨在更好地说明本发明，且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明特定的实施方式在本发明的范围内。本领域熟练技术人员可不添加创造性及不偏离本发明范围而开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的方法做出的多种改动可以仍然包括在本发明范围内。发明人意在将这样的变动包括在本发明的范围内。
实施例1：减法检测对突变阴性的样品的检测
本实施例用减法检测方法对33例正常人样品进行KRAS G12/13位点常见7种突变(G12A/C/D/S/V/R,G13D)的检测。
材料：
样品为33个正常人血液DNA样品，来自志愿者。
方法：
1、混合以下成分：
10μL 2×ddPCR supermix，1μL引物对(序列为SEQ ID NO:7和8)，非突变区探针(CH1)(序列为SEQ ID NO:1，其5’端标记了FAM)和突变区野生型探针(CH2)(序列为SEQ IDNO:2，其5’端标记了VIC)，1μL 7突变区阻断核酸(序列为SEQ ID NOs:9-15)，66ng DNA样本。
2、将混合液加入QX200微滴式数字PCR系统(购自Biorad)的微滴形成槽中，并加入70μL微滴形成油。
3、使用微滴形成仪形成微滴。
4、将40μL反应混合物加入96孔板中。
5、在Bio-Rad C1000PCR仪中使用下述反应：95℃3分钟，1个循环；94℃30秒，62℃60秒，39个循环；72℃10分钟，1个循环；保持在4℃。
结果：
表3：使用减法检测方法检测33例正常人血液DNA样本的检测结果。
Figure BDA0001299650680000251
CH1-CH2是指非突变区探针的信号减去突变区野生型探针的信号得到的差值。
与传统的多探针方法相比，本发明的减法方法的优势在于探针少，信号干扰少。如表3中的数据所示，减法方法的灵敏度能够达到0.1％(即：20/20000*100＝0.1％)。而现有技术中的多探针的商业试剂盒如Biorad的ddPCRTMKRAS Screening Multiplex Kit能够达到的灵敏度为0.2％。由此可见，用本发明的减法的方法检测KRAS基因突变的灵敏度更高，检测结果更准确。在我们检测的45个阴性样品中，全部都被检测为突变阴性，没有假阳性的情况出现。
实施例2：比较减法检测和单一位点多探针法对临床突变样品的检测结果
本实施例比较了减法检测和单一突变位点检测方法对40例临床KRAS G12/13位点常见7种突变(G12A/C/D/S/V/R,G13D)样本的检测结果。
材料：
临床样品为39个病人样本，来自广东省中医院(Guangdong Hospital ofTraditional Chinese Medicine)。
39个样品为已验证过的只含有KRAS单一氨基酸位点突变的样品。在测试的样品中，有四种样品具有G12C单一突变(即，mc140002，mc140059，mc140118，mc140134)，四种样品具有G12V单一突变(即，mc140012，mc140028，mc140035，mc140043)，四种样品具有G12D单一突变(即，mc140005，mc140019，mc140026，mc140045)，四种样品具有G12A单一突变(即，mc14009，mc140060，mc140075，mc140169)，十九种样品具有G13D单一突变(即,mc140067，mc140037，mc1400139，mc140189，mc130067，mc140207，mc140003，mc140061，mc140051，mc140168，mc140076，mc130032，mc130051，mc140177，mc140179，mc140104，mc130047，mc140204，mc140021),三种样品具有G12S单一突变(即，mc140101，mc140122，mc140073)，一种样品具有G12R单一突变(即，mc130053)。
方法：
分别使用本发明的减法检测方法和现有技术的单一突变位点检测方法，对上述39个临床样品检测其中KRAS基因G12/13位点的突变情况，以显示本发明方法的可行性。
1、混合以下成分：
减法检测反应
10μL 2×ddPCR supermix，1μL引物对(序列为SEQ ID NO:7和8)，非突变区探针(CH1)(序列为SEQ ID NO:1，其5’端标记了FAM))和突变区野生型探针(CH2)(序列为SEQ IDNO:2，其5’端标记了VIC))，1μL 7突变区阻断核酸，1.5-2.5μL临床样品，5.5-6.5μL水。
单一突变位点检测
10μL 2×ddPCR supermix，1μL引物对(序列为SEQ ID NO:7和8)和野生型探针(序列为SEQ ID NO:16：TTGGAGCTGGTGGCGTA，其5’端标记了VIC))，1μL突变探针(根据已知的单一突变种类选用对应的突变探针，具体参见表4，每种探针的5’端都标记了FAM)，1.5-2.5μL临床样品，5.5-6.5μL水。
对于每种单一突变位点，使用不同的突变探针进行检测。具体请参见表4。
表4
单一突变种类 突变探针 SEQ ID NO
G12A单一突变 TGGAGCTGCTGGCGT SEQ ID NO:17
G12R单一突变 TTGGAGCTCGTGGCGTA SEQ ID NO:18
G12C单一突变 TTGGAGCTTGTGGCGTA SEQ ID NO:19
G12V单一突变 TTGGAGCTGTTGGCGTA SEQ ID NO:20
G12D单一突变 TGGAGCTGATGGCGT SEQ ID NO:21
G12S单一突变 TTGGAGCTAGTGGCGTA SEQ ID NO:22
G13D单一突变 CTGGTGACGTAGGCA SEQ ID NO:23
突变探针中的下划线表示对应的点突变位点。
2、将混合液加入QX200微滴式数字PCR系统(购自Biorad)的微滴形成槽中，并加入70μL微滴形成油。
3、使用微滴形成仪形成微滴。
4、将40μL反应混合物加入96孔板中。
5、在Bio-Rad C1000PCR仪中使用下述反应：95℃3分钟，1个循环；94℃30秒，62℃60秒，39个循环；72℃10分钟，1个循环；保持在4℃。
结果：
表5
Figure BDA0001299650680000271
Figure BDA0001299650680000281
结果证明，本发明的减法方法可以检测KRAS G12/13位点常见7种类型突变，并且这7个单一突变位点的探针检测结果一致。
由本实施例可见，对于具有不同突变的临床样品，传统的单一突变位点需要根据具体的突变，选择使用相对应的探针(例如请参见表4)，由此检测出其中的突变。而对于未检测过的临床样品，由于不可能预知其中是否存在突变或者存在何种突变，因此需要用各种针对具体突变的探针分别进行检测，才能最终确定样品中是否具有突变。这在临床上需要消耗多种检测探针以及进行多次实验操作，不仅效率低下，而且花费昂贵。相比之下，本发明的减法检测方法不管是否已知样品中的突变，都能够以少至两条固定探针加上合适的引物，准确地检测出样品中是否存在突变，检测结果与特异性的单一探针具有可比性。这使得本发明在临床上具有巨大的优势，大大降低了所需的探针种类，减少了所需的实验次数，同时还确保了准确的实验结果。
序列表
<110> 苏州药明泽康生物科技有限公司
<120> 一种检测基因突变的新型试剂盒
<130> FPI170281-68
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agctgtatcg tcaaggca 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctacgccacc agctccaa 18
<210> 3
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcctgctgaa aatgactgaa tataaacttg tggtagttgg agctggtggc gtaggcaaga 60
gtgccttgac gatacagcta attcagaatc attttgtgga cgaatatgat ccaacaatag 120
ag 122
<210> 4
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggtggc 6
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcctgctgaa aatgactgaa tataaacttg tggtagttgg agct 44
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtaggcaaga gtgccttgac gatacagcta attcagaatc attt 44
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggcctgctga aaatgactga ata 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggtcctgcac cagtaatatg c 21
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acgccagcag ctcca 15
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgccacaag ctccaa 16
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acgccaacag ctcca 15
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acgccatcag ctcca 15
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acgccactag ctccaa 16
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acgccacgag ctccaa 16
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgcctacgtc accag 15
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ttggagctgg tggcgta 17
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tggagctgct ggcgt 15
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ttggagctcg tggcgta 17
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ttggagcttg tggcgta 17
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ttggagctgt tggcgta 17
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tggagctgat ggcgt 15
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ttggagctag tggcgta 17
<210> 23
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ctggtgacgt aggca 15
<210> 24
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gccacc 6

Claims (33)

1.一种试剂盒，包括：
a)带有第一检测标记的非突变区探针，所述非突变区探针能与基因的连续突变区域邻近的非突变区域杂交；
b)带有第二检测标记的突变区野生型探针，所述突变区野生型探针能与基因的连续突变区域的野生型序列杂交；和
c)说明书，所述说明书提供了检测所述基因的连续突变区域中是否存在突变的说明，其中通过对样本进行PCR扩增，用所述第一检测标记的第一信号和所述第二检测标记的第二信号的差值计算突变基因的拷贝数，其中，所述第一检测标记和所述第二检测标记不相同。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中，还包括至少一种选自下组的试剂：
a)DNA聚合酶；
b)核苷酸单体混合物；
c)能够扩增含有所述连续突变区域和所述非突变区域的模板序列的一对引物；和
d)一个以上能够在所述连续突变区域与突变型序列杂交的突变区阻断核酸。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，该试剂盒能用于检测基因的连续突变区域中是否存在突变。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，该试剂盒能用于检测临床样本中基因连续突变区域中是否存在突变。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述临床样本为包含基因突变型和野生型的混合样本。
6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述PCR为数字PCR。
7.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述基因选自KRAS基因或BRAF基因。
8.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，在所述连续突变区域中有至少两个点突变位点，或者至少有一个存在两种突变可能的点突变位点。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其中，所述连续突变区域包含KRAS基因的外显子2中的第12和13个密码子。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其中，所述非突变区探针具有SEQ IDNO:1的序列，和/或所述突变区野生型探针具有SEQ ID NO:2的序列。
11.如权利要求8所述的试剂盒，其中，所述连续突变区域包含BRAF基因的第593到第600个氨基酸的编码序列。
12.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述连续突变区域的长度为50bp以下。
13.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述连续突变区域的长度为40bp以下。
14.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述连续突变区域的长度为30bp以下。
15.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述连续突变区域的长度为20bp以下。
16.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述连续突变区域的长度为10bp以下。
17.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述第一检测标记或所述第二检测标记选自由FAM、Tetrachlorofluorescein、Alexa 488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、rhodamine 6G、tetramethyirhodamine、tetramethylrhodamine isothiocyanate、x-rhodamine、Texas red、生物素和亲和素所组成的组中的标记。
18.一种探针组合物，包含：
a)带有第一检测标记的非突变区探针，所述非突变区探针能与基因的连续突变区域邻近的非突变区域杂交；和
b)带有第二检测标记的突变区野生型探针，所述突变区野生型探针能与基因的连续突变区域的野生型序列杂交；
所述第一检测标记和所述第二检测标记不相同。
19.如权利要求18所述的探针组合物，其中所述基因选自KRAS基因或BRAF基因。
20.如权利要求18所述的探针组合物，其中，所述第一检测标记或所述第二检测标记选自由FAM、Tetrachlorofluorescein、Alexa 488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、rhodamine 6G、tetramethyirhodamine、tetramethylrhodamine isothiocyanate、x-rhodamine、Texas red、生物素和亲和素所组成的组中的标记。
21.如权利要求18所述的探针组合物，其中，
所述非突变区探针核酸序列为SEQ ID NO:1所示，和/或所述突变区野生型探针核酸序列为SEQ ID NO:2所示。
22.如权利要求18至21任一项所述的探针组合物在制备用于检测基因的连续突变区域中是否存在突变的试剂盒中的用途，其中，所述探针组合物可用于对连续突变区域的DNA样品进行PCR扩增，
根据计算检测得到的所述第一信号和所述第二信号的差值，确定所述基因的所述连续突变区域是否具有突变。
23.如权利要求22所述的用途，其中检测基因的连续突变区域中是否存在突变中使用的临床样本为包含基因突变型和野生型的混合样本。
24.如权利要求22所述的用途，其中，所述试剂盒还包括至少一种选自下组的试剂：
a)DNA聚合酶；
b)核苷酸单体混合物；
c)能够扩增含有所述连续突变区域和所述非突变区域的模板序列的一对引物；和
d)一个以上能够在所述连续突变区域与突变型序列杂交的突变区阻断核酸。
25.如权利要求22所述的用途，其中，所述PCR为数字PCR。
26.如权利要求22所述的用途，其中，在所述连续突变区域中有至少两个点突变位点，或者至少有一个存在两种突变可能的点突变位点。
27.如权利要求26所述的用途，其中，所述连续突变区域包含KRAS基因的外显子2中的第12和13个密码子。
28.如权利要求26所述的用途，其中，所述连续突变区域包含BRAF基因的第593到第600个氨基酸的编码序列。
29.如权利要求22所述的用途，其中，所述连续突变区域的长度为50b p以下。
30.如权利要求22所述的用途，其中，所述连续突变区域的长度为40b p以下。
31.如权利要求22所述的用途，其中，所述连续突变区域的长度为30b p以下。
32.如权利要求22所述的用途，其中，所述连续突变区域的长度为20b p以下。
33.如权利要求22所述的用途，其中，所述连续突变区域的长度为10b p以下。
CN201710358134.4A 2017-05-19 2017-05-19 一种检测基因突变的新型试剂盒 Active CN107090508B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710358134.4A CN107090508B (zh) 2017-05-19 2017-05-19 一种检测基因突变的新型试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710358134.4A CN107090508B (zh) 2017-05-19 2017-05-19 一种检测基因突变的新型试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107090508A CN107090508A (zh) 2017-08-25
CN107090508B true CN107090508B (zh) 2020-07-07

Family

ID=59638837

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710358134.4A Active CN107090508B (zh) 2017-05-19 2017-05-19 一种检测基因突变的新型试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107090508B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112301096A (zh) * 2019-07-26 2021-02-02 杭州丹威生物科技有限公司 一种新型核酸探针标记方法
CN110684849A (zh) * 2019-12-05 2020-01-14 苏州绘真医学检验有限公司 基于ddPCR检测人循环肿瘤细胞KRAS基因突变的引物、探针、试剂盒及方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101423866A (zh) * 2007-10-31 2009-05-06 上海长海医院 检测K-ras基因突变的PNA、探针、引物及方法
CN102242211A (zh) * 2011-07-08 2011-11-16 无锡锐奇基因生物科技有限公司 检测突变核酸序列的方法及试剂盒
CN102304581A (zh) * 2011-09-01 2012-01-04 广州好芝生物科技有限公司 用于检测kras基因突变的试剂盒及其检测方法
CN104611427A (zh) * 2015-01-16 2015-05-13 江苏宏泰格尔生物医学工程有限公司 一种as-pcr技术引物设计方法、基因突变检测方法及试剂盒
WO2016041495A1 (en) * 2014-09-16 2016-03-24 Lihpao Life Science Corp. Kit for cancer detection

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110111389A1 (en) * 2001-11-07 2011-05-12 Diagcor Bioscience Incorporation Limited Rapid genotyping analysis for human papillomavirus and the device thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101423866A (zh) * 2007-10-31 2009-05-06 上海长海医院 检测K-ras基因突变的PNA、探针、引物及方法
CN102242211A (zh) * 2011-07-08 2011-11-16 无锡锐奇基因生物科技有限公司 检测突变核酸序列的方法及试剂盒
CN102304581A (zh) * 2011-09-01 2012-01-04 广州好芝生物科技有限公司 用于检测kras基因突变的试剂盒及其检测方法
WO2016041495A1 (en) * 2014-09-16 2016-03-24 Lihpao Life Science Corp. Kit for cancer detection
CN104611427A (zh) * 2015-01-16 2015-05-13 江苏宏泰格尔生物医学工程有限公司 一种as-pcr技术引物设计方法、基因突变检测方法及试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Clinical Relevance of KRAS-Mutated Subclones Detected with Picodroplet Digital PCR in Advanced Colorectal Cancer Treated with Anti-EGFR Therapy;Pierre Laurent-Puig et，al;《Clin Cancer Res》;20140923;第21卷(第5期);第1087-1097页 *
Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay;Roza Bidshahri et，al;《The Journal of Molecular Diagnostics》;20160331;第18卷(第2期);第190-204页 *
用 TaqMan-MGB 荧光探针法检测北京地区幽门螺杆菌A2142G / A2143G 耐药突变;线海鹏等;《临床检验杂志》;20160630;第34卷(第6期);第401-406页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107090508A (zh) 2017-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10968487B2 (en) Oligonucleotides and methods for detecting KRAS and PIK3CA mutations
KR101171635B1 (ko) 변이의 검출 방법 및 그것에 이용하는 키트
US20130323736A1 (en) Polynucleotide primers
CN114085903B (zh) 检测线粒体3243a＞g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法
JP2014500028A (ja) ヒト上皮成長因子受容体遺伝子内の突然変異を検出するための方法及び組成物
CN110438223A (zh) 检测Kras基因点突变的引物、探针及其试剂盒与检测方法
EP2025764B1 (en) Probe for detection of mutation in abl gene and use thereof
CN107090508B (zh) 一种检测基因突变的新型试剂盒
JP2013074888A (ja) ＩＬ２８Ｂ（ｒｓ８０９９９１７）とＩＴＰＡ（ｒｓ１１２７３５４）の変異を検出する方法
KR101784714B1 (ko) 재발 난소암 진단 또는 난소암 재발 예측용 mirna 마커 및 그 용도
CN113930500A (zh) 人pik3ca基因突变的数字pcr检测方法及应用
CN111100924B (zh) 一种用于检测fmr1基因cgg重复数的质控品及其应用和含有该质控品的试剂盒
CN109136367B (zh) 提高braf基因v600e突变的诊断效率的方法
US8367814B2 (en) Assay for BCR/ABL gene rearrangement
CN106811537A (zh) 一种检测表皮生长因子受体基因t790m低频突变引物及其应用
JP6205216B2 (ja) 変異検出用プローブ、変異検出方法、薬効判定方法及び変異検出用キット
CN113930501A (zh) 人egfr基因突变的数字pcr检测方法及应用
CN113897430B (zh) 人idh1/idh2基因突变的数字pcr检测方法及应用
WO2023011624A1 (en) Compositions and methods for fast multiplexed screening and monitoring of npm1 mutations
KR102357260B1 (ko) 마이크로rna를 이용한 당뇨병성 신경병증의 예측 및 진단 방법 및 이를 위한 키트
CN112301096A (zh) 一种新型核酸探针标记方法
KR101998204B1 (ko) 전립선암 진단을 위한 디지털 pcr용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20230026734A (ko) 마이크로rna를 이용한 당뇨병성 신경병증의 예측 및 진단 방법 및 이를 위한 키트
CN113913514A (zh) 人ctnnb1基因突变的数字pcr检测方法及应用
CN113897429A (zh) 人nras基因突变的数字pcr检测方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: 215127 building 30, biomedical industrial park, No. 218, Sangtian street, Suzhou Industrial Park, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee after: SUZHOU YAOMING ZEKANG BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

Address before: 215100 floor 1, building 7, No. 1336, Wuzhong Avenue, Yuexi street, Wuzhong District, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee before: SUZHOU YAOMING ZEKANG BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221025

Address after: Building 30, Biomedical Industrial Park, No. 218, Sangtian Street, Suzhou Industrial Park, Suzhou Area, China (Jiangsu) Pilot Free Trade Zone, Jiangsu Province, 215000

Patentee after: SUZHOU YAOMING ZEKANG BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

Patentee after: SHANGHAI YOUMING AUTOMETRIC MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Patentee after: Shanghai Yaoming aozhe medical laboratory Co.,Ltd.

Address before: 215127 building 30, biomedical industrial park, No. 218, Sangtian street, Suzhou Industrial Park, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee before: SUZHOU YAOMING ZEKANG BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.