CN113897429A - 人nras基因突变的数字pcr检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人NRAS基因突变的数字PCR检测方法及应用。具体地，提供了优选的针对NRAS Q61和NRAS G12所在序列的引物对、扩增方法、核酸探针以及检测体系，进一步还提供了用于检测NRAS基因突变的试剂盒。本发明通过优化的引物对和探针以及相应反应条件，从而可以对不同样本高灵敏度、强特异性地检测NRAS基因突变。

Description

人NRAS基因突变的数字PCR检测方法及应用
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体地，涉及人NRAS基因突变的数字PCR检测方法及应用。
背景技术
大鼠肉瘤病毒癌基因(rat sarcoma,RAS)家族成员编码的三磷酸鸟苷结合蛋白可以激活表皮生长因子受体(EGFR)下游的信号通路,进而调节细胞的生长、分化和凋亡。RAS基因家族成员包括KRAS、NRAS等。
RAS基因的突变可以导致其所编码蛋白的组成性激活。人类结直肠癌中存在一定的RAS突变几率，确定RAS基因状态对于结直肠癌靶向治疗药物的选择具有重要意义。大量研究表明，RAS基因发生突变后，会导致EGFR下游的信号通路异常活化，从而降低EGFR靶向药物(如西妥昔单抗和帕尼单抗)的药效。因此，检测RAS基因(主要包括KRAS、NRAS)的突变状态对于指导结直肠癌患者使用EGFR靶向药物具有重要意义。
然而，在实际检测结直肠癌患者的NRAS基因突变的过程中，仍然面临着检测样本质量等问题。尽管肿瘤组织和肿瘤细胞学样本是突变检测的最佳样本，但此类样本获取难度大。检测血浆中的游离核酸(Circulating free DNA,简称“cfDNA”),又称“液体活检”，避免了需要肿瘤组织的活检，在临床上是一种非常有用的诊断应用。使用液体活检提供了重复采血的可能性，从而允许在肿瘤发生过程中或者癌症治疗期间追踪cfDNA的变化，进而监控病情变化。
然而，采用无细胞的核酸(如cfDNA)作为肿瘤患者中的生物标志物存在一定难度，尤其是应用cfDNA检测准确并特异地检测基因突变目前存在巨大的技术挑战。首先，血液中的cfDNA含量因人而异，而且大部分情况都非常低,而其中肿瘤来源的游离核酸(Circulating tumor DNA,简称“ctDNA”)的质量更是参差不齐、含量高低不一。
不仅如此，cfDNA检测方法特异性有待提高。Douillard等人报道，使用血浆检测EGFR突变与肿瘤组织检测结果的符合度仅为65％。
此外，目前虽然有一些基于cfDNA来检测NRAS基因突变的方法，但是这些方法的灵敏度和特异性尚难以令人满意。
因此，本领域迫切需要开发基于cfDNA的高灵敏度和高特异性检测NRAS基因突变的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于cfDNA的高灵敏度和高特异性检测NRAS基因突变的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测基因突变的试剂，所述试剂选自下组：
(a)用于检测NRAS Q61突变的第一引物对，其中第一引物对包括SEQ ID No:1和2所示的引物；
(b)用于检测NRAS G12突变的第二引物对，其中第二引物对包括SEQ ID No:6和7所示的引物；
(c)上述(a)和(b)的组合。
在另一优选例中，所述的NRAS Q61所在序列位于NG_007572:7949～8055。
在另一优选例中，所述的NRAS Q61的野生型序列的核酸序列如SEQ ID NO.:10所示。
在另一优选例中，所述NRAS Q61K突变指NRAS蛋白氨基酸序列的第61位的谷氨酰胺Q突变为赖氨酸K(即Q61K)。
在另一优选例中，所述NRAS Q61R突变指NRAS蛋白氨基酸序列的第61位的谷氨酰胺Q突变为精氨酸R(即Q61R)。
在另一优选例中，所述NRAS Q61K突变指NRAS基因核酸序列的第181位的胞嘧啶C突变为腺嘌呤A(NRAS c.181C>A)。
在另一优选例中，所述NRAS Q61R突变指，NRAS基因核酸序列的第182位的腺嘌呤A突变为鸟嘌呤G(NRAS c.182A>G)。
在另一优选例中，所述NRAS Q61K突变型核酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在另一优选例中，所述NRAS Q61R突变型核酸序列如SEQ ID NO.:12所示。
在另一优选例中，所述的NRAS G12所在序列位于NG_007572:5727～5818，其核酸序列如SEQ ID NO.:13所示。
在另一优选例中，所述NRAS G12D突变指NRAS蛋白氨基酸序列的第12位的甘氨酸G突变为赖氨酸天冬氨酸D(即G12D)。
在另一优选例中，所述NRAS G12D突变是指NRAS基因核酸序列的第35位的鸟嘌呤G突变为腺嘌呤A(即NRAS c.35G>A)。
在另一优选例中，所述NRAS G12D突变型核酸序列如SEQ ID NO.:14所示。
在另一优选例中，所述试剂还包括：
(a1)与第一引物对配合使用的第一探针，其中所述的第一探针选自下组：SEQ IDNo:3所示的探针、SEQ ID No:4所示的探针、SEQ ID No:5所示的探针、或其组合；和/或
(b1)与第二引物对配合使用的第二探针，其中所述的第二探针选自下组：SEQ IDNo:8所示的探针、SEQ ID No:9所示的探针、或其组合。
在另一优选例中，所述的第一探针和第二探针为单链的核酸探针。
在另一优选例中，所述的核酸探针含有一个或多个锁核苷酸。
在另一优选例中，所述第一探针的结构(5'-3')如式I所示：
Z1-Z2-Z3 I
其中，
Z1为荧光基团；
Z2为含有锁核苷酸或不含有锁核苷酸的特异性互补核酸序列；
Z3为淬灭基团；
“-”为化学键、连接基团、或1-3个核苷酸构成的接头。
在另一优选例中，所述的Z2特异性核酸序列靶向野生型NRAS Q61位点。
在另一优选例中，所述的Z2特异性核酸序列靶向突变型NRAS Q61R位点。
在另一优选例中，所述的Z2特异性核酸序列靶向突变型NRAS Q61K位点。
在另一优选例中，所述的Z2含有锁核苷酸修饰。
在另一优选例中，所述的Z2的序列选自下组：
ACTGTACTCTT+CT+T+GTCCA(SEQ ID No:3)；
ACTGTACTCTTCT+CGTCCAGCTG(SEQ ID No:4)；
ACTGTACTCTTCTT+T+T+CCAGCTG(SEQ ID No:5)；
各式中，“+T”表示锁核苷酸T，“+C”表示锁核苷酸C，“+G”表示锁核苷酸G。
在另一优选例中，所述的荧光基团各自独立地位于所述核酸探针的5'端、3'端和中部。
在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述的5'端、3'端、和/或中部。
在另一优选例中，所述荧光基团包括与DNA探针交联的荧光基团。
在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：FAM、VIC、HEX、FITC、BODIPY-FL、G-Dye100、FluorX、Cy3、Cy5、Texas Red，或其组合。
在另一优选例中，所述淬灭基团选自下组：DABCYL、TAMRA、BHQ 1、BHQ 2、BHQ3、MGB、BBQ-650、TQ1-TQ6、QSY 7carboxylic acid、TQ7、eclipse，或其组合。
在另一优选例中，所述的核酸探针为WTP-NRAS Q61(SEQ ID No:3)。
在另一优选例中，所述的核酸探针为MTP-NRAS Q61R(SEQ ID No:4)。
在另一优选例中，所述的核酸探针为MTP-NRAS Q61K(SEQ ID No:5)。
在另一优选例中，所述第二探针的结构(5'-3')如式II所示：
Z1'-Z2'-Z3' II
其中，
Z1'为荧光基团；
Z2’为含有锁核苷酸或不含有锁核苷酸的特异性互补核酸序列；
Z3'为淬灭基团；
“-”为化学键、连接基团、或1-3个核苷酸构成的接头。
在另一优选例中，所述的Z2'特异性核酸序列靶向野生型NRAS G12位点。
在另一优选例中，所述的Z2'特异性核酸序列靶向突变型NRAS G12D位点。
在另一优选例中，所述的Z2’含有锁核苷酸修饰。
在另一优选例中，所述的Z2'的序列选自下组：
TTCCCAACACCACCTGCTC(SEQ ID No:8)；
TTCCCAACACCA+T+CTGC(SEQ ID No:9)；
各式中，“+T”表示锁核苷酸T，“+C”表示锁核苷酸C。
在另一优选例中，所述的核酸探针为WTP-NRAS G12(SEQ ID No:8)。
在另一优选例中，所述的核酸探针为MTP-NRAS G12D(SEQ ID No:9)。
在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有第一方面所述的用于检测基因突变的试剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有与第一引物对配合使用的第一探针；和/或与第二引物对配合使用的第二探针。
在另一优选例中，所述的第一引物对、第二引物对、第一探针、第二探针如上所述。
在另一优选例中，所述的试剂盒包括SEQ ID No:1和2所示的第一引物对，SEQ IDNo:3、4和5所示的第一探针。
在另一优选例中，所述的试剂盒包括SEQ ID No:6和7所示的第二引物对，SEQ IDNo:8和9所示的第二探针。
在另一优选例中，如第一方面所述的用于检测基因突变的试剂或第二方面所述的试剂盒的用途，即用于制备一诊断产品，所述诊断产品用于评判对象是否适合用EGFR靶向药物进行治疗，或预先评估对象采用EGFR靶向药物的效果。
在另一优选例中，所述的EGFR靶向药物选自下组：如西妥昔单抗、帕尼单抗。
在另一优选例中，所述的产品是针对cfDNA样本进行检测。
在另一优选例中，所述的cfDNA来自对象的血液、血浆、或血清。
在另一优选例中，所述的对象为肿瘤患者。
在另一优选例中，所述的肿瘤为EGFR阳性的肿瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：肠癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、或其组合。
在本发明的第三方面，提供了一种检测待测样本是否含有基因突变的方法，包括步骤：
(S1)提供一PCR反应体系，所述PCR反应体系中含有作为模板的待测样本、以及用于扩增的引物对，所述的引物对选自下组：
(a)用于检测NRAS Q61突变的第一引物对，其中第一引物对包括SEQ ID No:1和2所示的引物；
(b)用于检测NRAS G12突变的第二引物对，其中第二引物对包括SEQ ID No:6和7所示的引物；
(c)上述(a)和(d)的组合；
第一方面所述的检测基因突变的试剂；
(S2)对步骤(S1)的所述PCR反应体系进行PCR反应，从而获得扩增产物；
(S3)对步骤(S2)中产生的扩增产物进行分析，从而获得所述待测样本是否含有基因突变的分析结果。
在另一优选例中，所述的分析结果为定性结果。
在另一优选例中，所述的PCR反应体系为数字PCR反应体系。
在另一优选例中，所述的数字PCR为ddPCR。
在另一优选例中，所述ddPCR中的待检测的靶标核酸分子在微滴中的浓度为1至1×1015拷贝/毫升，较佳地1至1010拷贝/毫升，更佳地1至105拷贝/毫升。
在另一优选例中，步骤(S2)中，所述PCR反应的退火温度为60±2℃，较佳地60±1℃，更佳地60±0.5℃。
在另一优选例中，所述的PCR反应体系中，还含有：
(a1)与第一引物对配合使用的第一探针，其中所述的第一探针选自下组：SEQ IDNo:3所示的探针、SEQ ID No:4所示的探针、SEQ ID No:5所示的探针、或其组合；和/或
(b1)与第二引物对配合使用的第二探针，其中所述的第二探针选自下组：SEQ IDNo:8所示的探针、SEQ ID No:9所示的探针、或其组合。
在另一优选例中，用于检测野生型基因的探针(SEQ ID No:3和SEQ ID No:8)采用相同的第一荧光标记物(如HEX、FAM)。
在另一优选例中，用于检测突变型基因的探针(SEQ ID No:4、5和9)采用相同的第二荧光标记物(如HEX、FAM)，并且第一荧光标记物和第二荧光标记物是不同的。
在另一优选例中，所述的探针中含有锁核苷酸。
在另一优选例中，所述的方法为非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述的方法为体外方法。
在另一优选例中，所述方法检测精确度为0.06％-1％，较佳地为0.0625％-0.08％。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了NRAS Q61 5对引物PCR电泳结果(M：DNA Marker)
图2显示了NRAS G12 5对引物PCR电泳结果(M：DNA Marker)
图3显示了检测NRAS基因Q61R突变Taqman-ddPCR方法的退火温度优化，孔B02,B06,B10代表退火温度梯度60℃、62.5℃、65℃。其中A是FAM通道检测阳性对照(100％突变)的1-D振幅图；B是HEX通道检测阴性对照1-D振幅图
图4：显示了检测NRAS基因Q61K突变Taqman-ddPCR方法的退火温度优化,孔H02,H06,H10代表退火温度梯度60℃、62.5℃、65℃。其中A是FAM通道检测阳性对照的1-D振幅图；B是HEX通道检测阳性对照1-D振幅图
图5显示了检测NRAS基因G12D突变Taqman-ddPCR方法的退火温度优化,孔1,5,9列代表退火温度梯度58℃、60℃、62℃。其中A是FAM通道检测空白对照、阴性对照及阳性对照的1-D振幅图；B是HEX通道检测空白对照、阴性对照及阳性对照的1-D振幅图
图6显示了对于NRAS Q61R基因突变检测浓度的验证。由图可知，本检测方法在所有检测浓度(0.06％-1％)内的线性度都非常好,即本方法的灵敏度达到0.06％
图7显示了对于NRAS Q61K基因突变检测浓度的验证。由图可知，本检测方法在所有检测浓度(0.06％-1％)内的线性度都非常好,即本方法的灵敏度达到0.06％。
图8显示了对于NRAS G12D基因突变检测浓度的验证。由图可知，本检测方法在所有检测浓度(0.06％-1％)内的线性度都非常好,即本方法的灵敏度达到0.06％。
图9显示了病例“MS1117”经数字PCR检测为NRAS阴性。从上至下分别为Q61K、Q61R、G12D、的检测二维图(FAM-HEX通道的2D振幅图)。其中绿色为野生型信号。
图10显示了病例“MS1129”经数字PCR检测NRAS Q61K检测的二维图(FAM-HEX通道的2D图)。其中蓝色和橙色为突变信号，表明了病例“MS1129”经数字PCR检测为NRAS Q61K阳性。
图11显示了病例“MS1326”经数字PCR检测NRAS Q61R检测的二维图(FAM-HEX通道的2D图)。其中蓝色和橙色为突变信号，表明了经数字PCR检测为NRAS Q61R阳性。
图12显示了病例“MS1255”经数字PCR检测NRAS G12D检测的二维图(FAM-HEX通道的2D图)。其中蓝色和橙色为突变信号，表明了经数字PCR检测为NRAS G12D阳性。
图13显示了病例“MS2023”经数字PCR检测为NRAS阳性。FAM-HEX通道的2D图；蓝色和橙色为突变信号。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，尤其是通过优化引物序列和探针的优化，再结合数字PCR平台，可以有效提高基因突变检测效果，并突破了现有基因突变检测技术中病理组织作为起始材料、准确度低、灵敏度低等问题，提供了一种高特异性、高灵敏度、抗干扰能力强地检测NRAS基因突变的方法。在此基础上，本发明人完成了本发明。
具体地，本发明提供了一种针对NRAS Q61R、NRAS Q61K以及NRAS G12D突变基因的检测方法，即通过提供特别优化的2对针对在NRAS Q61和NRAS G12所在序列的引物对和以及针对NRAS Q61R、NRAS Q61K、NRAS G12D突变基因的特别优化的探针，建立数字PCR检测体系，从而定性定量的检测出NRAS基因的突变情况。本发明的方法和试剂用于检测NRAS基因突变时，具有出乎意料的高灵敏和高特异性，并且可以检测不同难度样本。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。
数字PCR(digital PCR)技术
数字PCR(digital PCR)技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，扩增结束后对各个微滴的荧光信号进行分析，有核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
数字PCR与常规的qPCR相比，其能够精确地定量分析和高灵敏度地检测靶核酸分子。分析常规qPCR的结果的方法是模拟方法，其中，所述数字PCR方法，其结果是通过数字方法(因为得到的信号具有“0”或“1”的数值)分析的，具有可分析大体积样本、可同时检测不同样本以及同时进行不同测试的优点。数字PCR技术是一种可使用不具有标准曲线的单分子计数法来绝对定量DNA样本的技术，并且可以通过PCR对每孔单个液滴进行更精确的绝对定量(参见Gudrun Pohl和le-Ming Shih，数字PCR的原理和应用(Principle andapplications of digital PCR)，Expert Rev.Mol.Diagn.4(1),41-47(2004))。数字PCR具有灵敏度高、无需标准曲线即可准确定量、操作简单等优点。
在数字PCR中，含有经制备从而可用于稀释至平均拷贝数目为0.5-1的样本基因模板、扩增引物和荧光探针的各液滴分配到单个孔中，并进行微乳液PCR。然后，显示荧光信号的孔计数为数值“1”，因为具有基因拷贝数目为1的样本分配到所述孔中并且扩增后显示荧光信号，而没有显示信号的孔计数为“0”，因为具有基因拷贝数目为0的样本分配到所述孔中，由于无扩增，不显示荧光信号。采用这种方式，可以实现绝对定量。
引物
引物，是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补。
在本发明中，为了提高检测体系的灵敏度，预先扩增检测体系中对应基因片段，因而设计了对应于突变所在序列的引物。
在一个优选例中，针对NRAS Q61所在序列，分别在NRAS基因Q61位点上下游设计了多对引物，经过实验测试，最终确定了最优的引物对为SEQ ID No:1和2。
在另一优选例中，针对NRAS G12所在序列，分别在NRAS基因G12位点上下游设计了多对引物，经过实验测试，最终确定了最优的引物对为SEQ ID No:6和7。
探针
在本文中，“探针”、“核酸探针”、“基因探针”可以替换，是指一段带有检测标记且顺序已知的、与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：①应是单链，若为双链，必须先行变性处理；②应带有容易被检测的标记。核酸探针可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。本发明中，所述的探针也指一种修饰引物，所述修饰引物的两端或中间带有化学修饰基团，这些化学修饰具有特殊功能包括但不限于：信号指示作用，增强与反应物的连接作用等。
Z1-Z2-Z3 I
其中，
Z1为荧光基团；
Z2为含有锁核苷酸或不含有锁核苷酸的特异性互补核酸序列；
Z3为淬灭基团；
“-”为化学键、连接基团、或1-3个核苷酸构成的接头。
在另一优选例中，所述的Z2特异性核酸序列靶向野生型NRAS Q61位点。
在另一优选例中，所述的Z2特异性核酸序列靶向突变型NRAS Q61R位点。
在另一优选例中，所述的Z2特异性核酸序列靶向突变型NRAS Q61K位点。
在另一优选例中，所述的Z2含有锁核苷酸修饰。
在另一优选例中，所述的Z2的序列选自下组：
ACTGTACTCTT+CT+T+GTCCA(SEQ ID No:3)；
ACTGTACTCTTCT+CGTCCAGCTG(SEQ ID No:4)；
ACTGTACTCTTCTT+T+T+CCAGCTG(SEQ ID No:5)；
各式中，“+T”表示锁核苷酸T，“+C”表示锁核苷酸C，“+G”表示锁核苷酸G。
在另一优选例中，所述的荧光基团各自独立地位于所述核酸探针的5'端、3'端和中部。
在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述的5'端、3'端、和/或中部。
在另一优选例中，所述荧光基团包括与DNA探针交联的荧光基团。
在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：FAM、VIC、HEX、FITC、BODIPY-FL、G-Dye100、FluorX、Cy3、Cy5、Texas Red，或其组合。
在另一优选例中，所述淬灭基团选自下组：DABCYL、TAMRA、BHQ 1、BHQ 2、BHQ3、MGB、BBQ-650、TQ1-TQ6、QSY 7carboxylic acid、TQ7、eclipse，或其组合。
在另一优选例中，所述的核酸探针为WTP-NRAS Q61(SEQ ID No:3)。
在另一优选例中，所述的核酸探针为MTP-NRAS Q61R(SEQ ID No:4)。
在另一优选例中，所述的核酸探针为MTP-NRAS Q61K(SEQ ID No:5)。
在本发明中，针对NRAS G12基因的核酸探针(5'-3')设计为具有如式II所示的结构：
Z1'-Z2'-Z3' II
其中，
Z1'为荧光基团；
Z2’为含有锁核苷酸或不含有锁核苷酸的特异性互补核酸序列；
Z3'为淬灭基团；
“-”为化学键、连接基团、或1-3个核苷酸构成的接头。
在另一优选例中，所述的Z2'特异性核酸序列靶向野生型NRAS G12位点。
在另一优选例中，所述的Z2'特异性核酸序列靶向突变型NRAS G12D位点。
在另一优选例中，所述的Z2’含有锁核苷酸修饰。
在另一优选例中，所述的Z2'的序列选自下组：
TTCCCAACACCACCTGCTC(SEQ ID No:8)；
TTCCCAACACCA+T+CTGC(SEQ ID No:9)；
各式中，“+T”表示锁核苷酸T，“+C”表示锁核苷酸C。
在另一优选例中，所述的核酸探针为WTP-NRAS G12(SEQ ID No:8)。
在另一优选例中，所述的核酸探针为MTP-NRAS G12D(SEQ ID No:9)。
引物和探针的修饰
在本发明中，所述引物的核酸序列包括未修饰的或经修饰的的引物序列。
优选地，本发明人通过对探针用锁核苷酸进行修饰，可以显著提高探针的特异性，从而提高检测结果的灵敏度和特异性。
在本发明的一个优选例中，所述修饰的方式选自：磷酸化(Phosphorylation)、生物素(Biotin)、地高新(Digoxigenin)、内部氨基修饰、5'氨基修饰、3'氨基修饰、巯基(Thiol)、间臂(Spacer)、硫代(Phosphorthioate)、脱氧脲嘧啶(DeoxyUridine，dU)、脱氧次黄嘌呤(deoxyInosine，dI)、或其组合。
磷酸化修饰：5'磷酸化可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应。3'磷酸化可抗3'外切酶消化的相关实验中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应。
生物素修饰：引物生物素标记，可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分离、核酸分离、杂交检测特异性的DNA/RNA序列、离子通道构象变化等。
地高新修饰：地高新经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的C5位置，杂交的地高新探针可以由抗地高新抗体来检测。地高新标记的探针可用于各种杂交反应，如DNA-DNA杂交(Southern blotting)、DNA-RNA杂交(Northern blotting)、斑点杂交(Dotblotting)、克隆杂交、原位杂交以及酶联免疫分析(ELISA)。
内部氨基修饰：主要用C6-dT aminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离，可用于进一步的标记和酶连接(如碱性磷酸酶)，目前提供内部氨基修饰介导的dT-Dabcyl、dT-Biotin和dT-Digoxingenin修饰。
5'氨基修饰：可用于制备功能化的寡核苷酸，广泛应用在DNA芯片(DNAMicroarray)和多重标记诊断系统。目前提供5'C6氨基修饰和5'C12氨基修饰两种，前者可用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物，后者用于亲和纯化基团的连接和一些荧光标记，尤其是当荧光可能会因标记太靠近DNA链而被淬灭时。
3'氨基修饰：目前提供3'C6氨基修饰。它可用于设计新的诊断探针和反义核苷酸，例如5'端可用高度敏感的32P或荧光素标记的同时3'可用氨基修饰以进行其他的连接。此外，3'修饰可以抑制3'外切酶酶解，从而可用于反义实验。
巯基修饰：5'-巯基在很多方面与氨基修饰类似。巯基可用于加附各种修饰如荧光标记物和生物素。例如可以在碘乙酸和马来酰亚胺衍生物存在下来制作巯基连接的荧光探针。5'的巯基修饰主要用5'巯基修饰单体(5'-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite)。用5'-Thiol-Modifier C6-CE单体修饰后必须进行硝酸银氧化以去除保护基(trityl)，而Thiol-Modifier C6 S-S CE单体修饰后须用DTT将二硫键还原成巯基。
间臂修饰：Spacer可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，主要应用于DNA发夹结构和双链结构研究。C3 spacer主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或"替代"一个序列中未知的碱基。3'-Spacer C3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。Spacer 18常用于引进一个强亲水基团。
硫代修饰：硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。您可以选择全硫代，但随着硫代碱基的增加，寡核苷酸的Tm值会降低，为了降低这种这种影响，可以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰，通常可以选择5'和3'各3个碱基进行硫代修饰。
脱氧脲嘧啶修饰：脱氧脲嘧啶可以插进寡核苷酸来增加双链的熔点温度从而增长双链的稳定性。每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧脲嘧啶替代可以增长双链熔点温度1.7℃。
脱氧次黄嘌呤修饰：脱氧次黄嘌呤是一个自然存在的碱基，虽然不是真正意义上的通用碱基，但当与其它碱基结合时，会比其它碱基错配相对更稳定。脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为dI:dC>dI:dA>dI:dG>dI:dT.在DNA聚合酶的催化下，脱氧次黄嘌呤首选与dC结合。
cfDNA
血浆中的游离核酸(Circulating free DNA,简称“cfDNA”),又称“液体活检”，避免了需要肿瘤组织的活检，在临床上是一种非常有用的诊断应用。使用液体活检提供了重复采血的可能性，从而允许在肿瘤发生过程中或者癌症治疗期间追踪cfDNA的变化，进而监控病情变化(Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients)。但是应用cfDNA检测准确并特异地检测基因突变目前存在巨大的技术挑战。首先，血液中的cfDNA含量因人而异，而且大部分情况都非常低,而其中肿瘤来源的游离核酸(Circulating tumorDNA,简称“ctDNA”)质量更是参差不齐、含量高低不一。不仅如此，cfDNA检测方法特异性有待提高。Douillard et al报道，使用血浆检测EGFR突变与肿瘤组织检测结果的符合度仅为65％。
本发明的主要优点包括：
1、灵敏度高：由于本方法采用数字PCR平台，能将反应体系分成约20000个微小反应，理论上能够检测到单个拷贝突变，具有其他技术无法匹敌的灵敏优势。本发明的检测方法通过验证能达到0.06％的最低检测限。
2、特异性强：设计的特异性引物分别针对NRAS基因Q61和NRAS基因G12所在的序列，能特异性扩增目标位置的野生型和突变型模板；设计的特异性探针覆盖突变位点，针对NRAS的野生型(共2条)和突变型分别设计(共3条)，野生型探针5'端有HEX荧光基团修饰，突变型探针5'端有FAM荧光基团修饰，同时，NRAS探针在突变碱基处带有锁核酸(LNA)修饰，大大增强此处核苷酸的结合力，NRAS探针在3'端带有BHQ1，能有效区分一个碱基差异的模板，上述引物和探针的设计大大提高了检测的特异性。
3、对样本的类型与质量要求宽松，抗干扰力强。由于其灵敏度高的特性，本发明适用的样本类型除了一般方法常用的新鲜组织样本、石蜡切片，还可以使用的外周血样本(此样本较容易获得,但DNA含量低且破碎)；并且，由于其数字PCR平台的独特性，即能将反应体系分成约20000个小体系，同时也能将干扰物质分成约20000份，能够大大减少干扰物质对反应的影响，当然也就可以检测更复杂背景的样本。这是其他平台无法做到的。
4、阳性判读方法简单：由于本发明采用的是绝对定量的方法，无须设置对照标准曲线，结果根据荧光的二维图，即可判定是否含有目标突变模板(表1)。
表1.检测结果表
Figure BDA0002571164670000141
Figure BDA0002571164670000151
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
引物、探针和扩增片段的序列
实施例中，使用的引物、探针及扩增的DNA片段的核酸序列信息如表2所示：
表2：引物、探针及DNA片段的核酸序列
Figure BDA0002571164670000152
Figure BDA0002571164670000161
注：“+A”表示锁核苷酸A，“+T”表示锁核苷酸T，“+C”表示锁核苷酸C，“+G”表示锁核苷酸G。
实施例1引物对的筛选
根据NRAS第3外显子序列(Q61位点)，设计5对引物对(引物合成自上海生工生物有限公司)，具体序列如下表3。
表3.筛选用于扩增NRAS Q61的5对引物对
Figure BDA0002571164670000162
Figure BDA0002571164670000171
根据NRAS第2外显子序列(G12位点)，设计5对引物对(引物合成自上海生工生物有限公司)，具体序列如下表4。
表4.筛选用于扩增NRAS G12的5对引物对
Figure BDA0002571164670000172
筛选PCR体系:Taq HS聚合酶0.2ul，10×HS PCR缓冲液2ul，dNTP混合物1.6ul，上游引物1ul，下游引物1ul，tgDNA(人白细胞基因组DNA，作为模板)5ul，水补齐体系至20ul。
筛选PCR程序：95℃10min，30个循环(94℃30s，56℃30s，72℃20s)。
经过PCR筛选，Q61引物对3(Q61-F3/Q61-R3)及G12引物对1(G12-F1/G12-R1)对目的片段扩增效率较高(条带亮)，扩增产物较短，且不产生引物二聚体，整体效果最好，可作为NRAS基因突变检测的引物对。见图1和图2。
实施例2Taqman探针和数字PCR反应程序的优化
在本实施例中，合成了Taqman探针并进行优化，并基于优化的Taqman探针对数字PCR反应程序进行优化。
2.1Taqman探针
在本实施例中，所检测NRAS基因突变为对应于Q61R、Q61K、G12D的核苷酸突变(表5)；
表5：NRAS基因突变信息表
检测位点 突变类型 COSMIC编号 基因变化
Q61R 点突变 COSM584 c.182A>G
Q61K 点突变 COSM580 c.181C>A
G12D 点突变 COSM564 c.35G>A
基于人NRAS的基因组序列和突变位点，设计相应的Taqman探针并进行优化，优化后的Taqman探针含有特定的锁核苷酸(+N)，分别为WTP-Q61、MTP-Q61R、MTP-Q61K、以及WTP-G12和MTP-G12D，探针的具体信息见下表6：
表6.优化后的Taqman探针
Figure BDA0002571164670000181
2.2数字PCR反应程序的优化
基于实施例1确定的最优引物对(SEQ ID No:1和2；SEQ ID No:6和7)和实施例2.1确定的优化的探针，对于数字PCR反应程序进行进一步优化。数字PCR反应程序优化实验，需要综合分析随着退火温度的变化，野生型模板和突变型模板的数字PCR扩增情况。最优的退火温度应满足两个条件：阴性对照(野生型模板)背景干净(FAM通道无微滴)、突变型模板内阳性信号和阴性信号容易区分(FAM通道和HEX通道荧光强度高)。
实验方法如下：
在试剂准备区配置以下PCR体系：2×ddPCR Supermix(No dUTP)11ul，上游引物(Q61-F或G12-F)1.1ul，下游引物(Q61-R或G12-R)1.1ul，探针1(WTP-Q61或WTP-G12)0.55ul，探针2(MTP-Q61R或MTP-Q61K或MTP-G12D)0.55ul，模板5.5ul，加水补齐至22ul。
在样本制备区按照以下顺序加入模板：阴性对照、阳性对照。阴性对照为正常人白细胞基因组(tgDNA)，阳性对照为含NRAS对应突变序列的基因组DNA溶液。
在微滴生成区，按照仪器要求进行微滴生成。
在样本分析区，进行PCR反应并进行分析。
ddPCR优化实验的PCR程序：95℃10min，40个循环{94℃30s，退火温度梯度(60℃、62.5℃、65℃)15s，72℃15s}，98℃10min，升降温速率2℃/s。
完成PCR后，按照仪器及实验要求进行设置，选择FAM/HEX检测通道，开始读板。
结果见图3～图5。其中，FAM通道指示MTP探针检测突变型模板的微滴及其荧光强度(Amplitude)，HEX通道指示WTP探针检测野生型模板的微滴及其荧光强度(Amplitude)。FAM-HEX双阳性的微滴代表既有野生型模板又有突变型模板存在。通过FAM通道的微滴数可以推测数字PCR体系中是否存在突变型模板并可精确计算拷贝数(copies/ul)。
图3～图5的结果表明，60℃退火15s，数字PCR阴性对照无污染、阴性信号和阳性信号之间区分最明显，整体效果较好，为最优退火温度。
实施例3数字PCR法检测NRAS基因突变的灵敏度验证
根据实施例1计算野生型模板拷贝数(copies/ul)、突变型模板基因组拷贝数(copies/ul)和突变率(％)，用TE将二者均稀释至4000copies/ul。将含突变基因组模板中掺入tgDNA，使得突变模板比例分别为0.06％、0.13％、0.25％、0.5％、1％，制作成梯度稀释模板。
验证数字PCR体系：2×ddPCR Supermix(No dUTP)11ul，引物1(Q61-F/G12-F)1.1ul，引物2(Q61-F/G12-F)1.1ul，探针1(WTP-Q61/WTP-G12)0.55ul，探针2(MTP-Q61R/MTP-Q61K/MTP-G12D)0.55ul，模板5.5ul，加水补齐至22ul。
在样本制备区按照以下顺序加入模板：空白对照、阴性对照、梯度稀释模板。空白对照为水，阴性对照为tgDNA，梯度稀释模板为掺入0.06％-1％突变型模板的野生型模板。
按照实施例1相同方法将PCR反应体系生成微滴。按照优化PCR程序进行PCR：95℃10min，40个循环(94℃30s，60℃15s，72℃15s)，98℃10min，升降温速率2℃/s。根据仪器要求开始读板。
数字PCR结果如图6～图8所示。本发明数字PCR法以水或者tgDNA为模板，背景干净，无污染。此外，本发明数字PCR法在野生型模板中掺入0.06％-1％突变型模板，检测野生型模板拷贝数正常，检测突变型模板比例(突变型模板除以总模板乘以100％)与理论比例相符，且呈线性相关，R2值大于0.98。即本发明数字PCR法在0.06％-1％灵敏度区间内，检测值准确，即本发明数字PCR法最低检测灵敏度为0.06％。
实施例4数字PCR法检出患者NRAS突变指导肿瘤靶向药物用药
病例MS1117、MS1129、MS1326、MS1255、MS2023均为EGFR突变KRAS野生结直肠癌Ⅲ期病人。通过采集静脉血，两次离心分离血浆，通过游离核酸抽提试剂盒抽提血浆游离核酸。抽提核酸经Qubit定量。定量后储存于样本制备室-20℃冰箱内。
本发明数字PCR检测体系见实施例2。
在样本制备区按照以下顺序加入模板：空白对照、阴性对照、病例游离核酸、阳性对照(1％)。
按照实施例1相同方法将PCR反应体系生成微滴。按照优化PCR程序进行PCR：95℃10min，40个循环(94℃30s，60℃15s，72℃15s)，98℃10min，升降温速率2℃/s。打开仪器，按照要求进行设置，开始读板。本次NRAS检测以空白对照和阴性对照背景干净，阳性对照拷贝数和突变比例正常。
病例核酸样本检测结果见下表7。
MS1117判读为阴性(见图9)，不含有Q61R突变、Q61K突变、G12D突变，可以考虑使用EGFR抗体类药如西妥昔单抗和帕尼单抗；
MS1129判读为NRAS Q61R阳性(见图10；突变率为0.59％),不建议使用EGFR抗体类药物西妥昔单抗和帕尼单抗；
MS1326判读为NRAS Q61K阳性(见图11；突变率为0.56％),不建议使用EGFR抗体类药物西妥昔单抗和帕尼单抗；
MS1255判读为NRAS G12D阳性(见图12；突变率为0.94％),不建议使用EGFR抗体类药物西妥昔单抗和帕尼单抗；
另外，病例“MS2023”按照三重组合(Q61R、Q61K、G12D)进行检测,结果判读为NRAS突变阳性(见图13，突变率为5.63％)，不建议使用EGFR抗体类药物西妥昔单抗和帕尼单抗
上述病例的具体检测数据见下表7：
表7：病例检测基因突变结果
Figure BDA0002571164670000211
讨论：
目前，检测基因突变的方法主要有：
(1)高分辨率熔解曲线(HRM)。HRM是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析技术。检测敏感度在1-10％左右。然而，由于染料法假阳性高，后期需要测序验证，导致检测周期较长。
(2)探针扩增阻滞突变法(ARMS-qPCR)。利用PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，将有某种点突变的模板与正常模板区分开来，该检测方法的灵敏度高于HRM，约为1％(CN104099422A)。(3)
等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应(CAST-PCR)。CAST-PCR通过一段特异设计的MGB探针来阻止引物与野生型DNA结合，选择性地优先扩增突变型DNA，该检测方法的灵敏度在0.1％-1％左右(专利号CN104099422A)。BarbanoR.etal应用CAST-PCR技术检测临床样本BRAF基因的V600E和V600K突变，其方法的灵敏度为1％(Competitive allele-specificTaqMan PCR(Cast-PCR)is a sensitive,specific and fast method for BRAFV600mutation detection in Melanoma patients)。
综上所述，现有基因突变检测技术大都为染料法或者探针法荧光定量PCR技术，该技术存在灵敏度低、准确率低、阳性判读方法复杂等问题，且对于样本的类型与质量要求高，例如有的方法要求提供组织样本，部分方法可以处理血浆/血清样本但要求为肿瘤三期或者四期病人。
本发明使用了数字PCR(digital PCR)技术，将一个样本分配至几万个相互独立的小微滴，每个微滴分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个微滴的荧光信号进行分析。数字PCR具有灵敏度高、无需标准曲线即可准确定量、操作简单等优点。
本发明针对NRAS Q61R/NRAS Q61K/NRAS G12D突变，开发了一种高灵敏度和高特异性数字PCR方法，与现有技术HRM、Arms-qPCR、CAST-PCR等相比，本发明采用Taqman探针并结合数字PCR法，可解决灵敏度低、特异性差、对样本的类型与质量要求高、阳性判读方法复杂等问题。经验证本发明方法灵敏度最高可达到0.06％，不仅可以准确检测组织、体液样本，还可以处理血浆/血清等难度高的样本。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 铭炽生物科技（上海）有限公司
铭时医疗科技（宁波）有限公司
<120> 人NRAS基因突变的数字PCR检测方法及应用
<130> P2020-0379
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
tgaaacctgt ttgttggaca tac 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
tggcaaatac acagaggaag c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
actgtactct tcttgtcca 19
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
actgtactct tctcgtccag ctg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
actgtactct tcttttccag ctg 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
ggtgtgaaat gactgagtac 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
cagctaatcc agaaccactt t 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(aritificial sequence)
<400> 8
ttcccaacac cacctgctc 19
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
ttcccaacac catctgc 17
<210> 10
<211> 107
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
tgaaacctgt ttgttggaca tactggatac agctggacaa gaagagtaca gtgccatgag 60
agaccaatac atgaggacag gcgaaggctt cctctgtgta tttgcca 107
<210> 11
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
tgaaacctgt ttgttggaca tactggatac agctggaaaa gaagagtaca gtgccatgag 60
agaccaatac atgaggacag gcgaaggctt cctctgtgta tttgcca 107
<210> 12
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
tgaaacctgt ttgttggaca tactggatac agctggacga gaagagtaca gtgccatgag 60
agaccaatac atgaggacag gcgaaggctt cctctgtgta tttgcca 107
<210> 13
<211> 92
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
ggtgtgaaat gactgagtac aaactggtgg tggttggagc aggtggtgtt gggaaaagcg 60
cactgacaat ccagctaatc cagaaccact tt 92
<210> 14
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(aritificial sequence)
<400> 14
ggtgtgaaat gactgagtac aaactggtgg tggttggagc agatggtgtt gggaaaagcg 60
cactgacaat ccagctaatc cagaaccact tt 92
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequece)
<400> 15
aacctgtttg ttggacatac tgg 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
cgcctgtcct catgtattgg 20
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
gtgaaacctg tttgttggac atac 24
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
ccttcgcctg tcctcatgta t 21
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
gatggtgaaa cctgtttgtt gg 22
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
tgtattggtc tctcatggca c 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
cctgtttgtt ggacatactg g 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
attggtctct catggcactg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
aacaggttct tgctggtgtg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
ttagctggat tgtcagtgcg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
ggtttccaac aggttcttgc 20
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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ttccaacagg ttcttgctgg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
tggattagct ggattgtcag t 21

Claims (9)

1.一种用于检测基因突变的试剂，其特征在于，所述试剂选自下组：
(a)用于检测NRAS Q61突变的第一引物对，其中第一引物对包括SEQ ID No:1和2所示的引物；
(b)用于检测NRAS G12突变的第二引物对，其中第二引物对包括SEQ ID No:6和7所示的引物；
(c)上述(a)和(b)的组合。
2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括：
(a1)与第一引物对配合使用的第一探针，其中所述的第一探针选自下组：SEQ ID No:3所示的探针、SEQ ID No:4所示的探针、SEQ ID No:5所示的探针、或其组合；和/或
(b1)与第二引物对配合使用的第二探针，其中所述的第二探针选自下组：SEQ ID No:8所示的探针、SEQ ID No:9所示的探针、或其组合。
3.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括：
(b1)与第二引物对配合使用的第二探针，其中所述的第二探针选自下组：SEQ ID No:8所示的探针、SEQ ID No:9所示的探针、或其组合。
4.如权利要求2所述的试剂,其特征在于，所述第一探针的结构(5'-3')如式I所示：
Z1-Z2-Z3 I
其中，
Z1为荧光基团；
Z2为含有锁核苷酸或不含有锁核苷酸的特异性互补核酸序列；
Z3为淬灭基团；
“-”为化学键、连接基团、或1-3个核苷酸构成的接头。
5.如权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述第二探针的结构(5'-3')如式II所示：
Z1'-Z2'-Z3' II
其中，
Z1'为荧光基团；
Z2’为含有锁核苷酸或不含有锁核苷酸的特异性互补核酸序列；
Z3'为淬灭基团；
“-”为化学键、连接基团、或1-3个核苷酸构成的接头。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1所述的用于检测基因突变的试剂。
7.如权利要求1所述的用于检测基因突变的试剂或权利要求6所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于制备一诊断产品，所述诊断产品用于评判对象是否适合用EGFR靶向药物进行治疗，或预先评估对象采用EGFR靶向药物的效果。
8.一种检测待测样本是否含有基因突变的方法，其特征在于，包括步骤：
(S1)提供一PCR反应体系，所述PCR反应体系中含有作为模板的待测样本、以及用于扩增的引物对，所述的引物对选自下组：
(a)用于检测NRAS Q61突变的第一引物对，其中第一引物对包括SEQ ID No:1和2所示的引物；
(b)用于检测NRAS G12突变的第二引物对，其中第二引物对包括SEQ ID No:6和7所示的引物；
(c)上述(a)和(b)的组合
权利要求1所述的检测基因突变的试剂；
(S2)对步骤(S1)的所述PCR反应体系进行PCR反应，从而获得扩增产物；
(S3)对步骤(S2)中产生的扩增产物进行分析，从而获得所述待测样本是否含有基因突变的分析结果。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法检测精确度为0.06％-1％，较佳地为0.0625％-0.08％。
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