WO2012002447A1 - 変異ポリヌクレオチドの検出方法 - Google Patents

変異ポリヌクレオチドの検出方法 Download PDF

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WO2012002447A1
WO2012002447A1 PCT/JP2011/064937 JP2011064937W WO2012002447A1 WO 2012002447 A1 WO2012002447 A1 WO 2012002447A1 JP 2011064937 W JP2011064937 W JP 2011064937W WO 2012002447 A1 WO2012002447 A1 WO 2012002447A1
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polynucleotide
target region
mutant
detection
mutation
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PCT/JP2011/064937
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英郎 松本
索 宮本
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武田薬品工業株式会社
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a mutated polynucleotide.
  • EGFR human epidermal growth factor receptor
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • CTC peripheral circulating tumor cells
  • a technique for detecting a human gene polymorphism for distinguishing between a wild type gene and a mutant type gene is used in the industry, and an example thereof is a method using the PNA-LNA PCR clamp method.
  • Patent Document 1 As a method for detecting a mutated polynucleotide based on the PNA-LNA PCR clamp method, for example, the method disclosed in Patent Document 1 is known.
  • An object of the present invention is to provide a highly sensitive method for detecting a mutated polynucleotide from which gene mutation information can be obtained from CTC.
  • an object of the present invention is to provide a method capable of easily detecting a mutated polynucleotide of peripheral circulating tumor cells. More specifically, an object of the present invention is to provide a method capable of detecting a mutated polynucleotide by using the whole amount of the polynucleotide solution obtained from a cell sample instead of a part thereof.
  • the present inventors have improved the conventional PNA-LNA PCR clamp method to realize a highly sensitive method for detecting a mutated polynucleotide that can obtain gene mutation information from CTC.
  • the present invention has been completed.
  • Step 1 Extracting a cell sample containing 1 to 10,000 peripheral circulating tumor cells with a proteinase K-containing aqueous solvent to obtain a polynucleotide solution
  • Step 2 Polynucleotide solution obtained in Step 1
  • the reaction solution containing the total amount of is subjected to gene amplification by PCR, and an amplification step that selectively amplifies the detection target region of the mutant polynucleotide that may be contained in the polynucleotide solution
  • Step 3 ( 1) subjecting the reaction solution containing the amplification product obtained in step 2 and (2) a probe, which is an LNA consisting of a base sequence completely complementary to the detection target region of the mutant polynucleotide, to gene amplification by PCR.
  • the mutant polynucleotide is Out detecting step [claim 2]
  • a method for detecting a mutated polynucleotide of a peripheral circulating tumor cell comprising the following steps: Step 1: A cell sample containing 1 to 10,000 peripheral circulating tumor cells is extracted with a proteinase K-containing aqueous solvent to obtain a polynucleotide solution
  • Step 2 (1) obtained in Step 1 A reaction solution containing a total amount of the polynucleotide solution and (2) a clamp primer that is a PNA consisting of a base sequence that is completely complementary to the detection target region of the wild-type polynucleotide corresponding to the mutant polynucleotide is obtained by PCR.
  • Step 3 (1) The amplification product obtained in Step 2 ( 2) the clamp primer, and (3) completely complementary to the detection target region of the mutant polynucleotide Detection that detects the mutant polynucleotide by selectively amplifying the detection target region of the mutant polynucleotide by subjecting a reaction solution containing a probe, which is an LNA consisting of a base sequence, to gene amplification by PCR.
  • a reaction solution containing a probe which is an LNA consisting of a base sequence
  • Claim 4 Item 3. The detection method according to Item 1 or 2, wherein the cell sample is derived from 1 to 10 mL of human blood.
  • the proteinase K-containing aqueous solvent further contains 0.5 to 2 v / v% Tween 20 and has a pH of 7 to 8.
  • the concentration of the clamp primer in the reaction solution is 0.1 to 10 ⁇ M.
  • the method for detecting a mutant polynucleotide of the present invention it is possible to obtain gene mutation information from CTC with high sensitivity and ease. That is, since the present invention enables detection of a mutated polynucleotide of metastatic tumor cells using CTC, genetic testing that is less invasive to patients is possible, and selection of appropriate therapeutic agents for cancer patients and drug discovery are possible. It is expected that patient stratification at the time of clinical trials will be easy.
  • not all of the polynucleotide solution obtained from the cell sample but the entire amount can be used in the PCR method, so that the mutated polynucleotide can be easily detected. it can.
  • polynucleotide refers to a polymer compound in which nucleotides are linearly polymerized (nucleotides are linked like a chain to become a polynucleotide).
  • nucleotide refers to a substance in which a phosphate group is bonded to a nucleoside
  • nucleoside refers to a glycoside bond of a purine base or a pyrimidine base at position 1 of a pentose. It is also a unit that constitutes.
  • the “base sequence” (sometimes simply referred to as “sequence” in the present specification) is, for example, a sequence of bases in nucleic acids or nucleic acid analogs such as genes, primers, and probes. Means.
  • the nucleic acid include DNA and RNA
  • examples of the nucleic acid analog include peptide nucleic acid and LNA (Locked Nucleic Acid).
  • PNA Peptide Nucleic Acid, peptide nucleic acid
  • PNA is a nucleic acid analog having a structure in which 2-aminoethylglycine is a skeletal unit and a nucleobase is bound to this via a methylenecarbonyl group. It is a compound which has this.
  • PNA can specifically and strongly bind to a polynucleotide having a complementary base sequence as compared to a polynucleotide (that is, a normal polynucleotide).
  • PNA includes PNA analogs having such properties (eg, gripNA).
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • LNA monomer means a nucleic acid having two circular structures in which the 2′-position oxygen atom and the 4′-position carbon atom of ribonucleic acid are bridged and analogs thereof.
  • LNA monomers include oxy-LNA, thio-LNA, and amino-LNA.
  • LNA can specifically and strongly bind to a polynucleotide having a complementary base sequence as compared to a polynucleotide (that is, a normal polynucleotide).
  • LNA includes LNA analogs having such properties.
  • PNA-LNA PCR clamp method is a PCR method using nucleic acid analogs PNA and LNA (Locked Nucleic Acid, locked nucleic acid) as primers and probes, respectively.
  • the “PNA-LNA PCR clamp method” is a method for selectively amplifying a mutant gene by using such a property of PNA and LNA as a clamp primer and a mutant probe.
  • the method for detecting a mutated polynucleotide of the present invention is a method for detecting a mutated polynucleotide in peripheral circulating tumor cells.
  • mutant polynucleotide means a polynucleotide having a mutation.
  • “Mutation” is a change in a nucleic acid sequence such as DNA or RNA, and includes terms used in genetics, such as base substitution, insertion, deletion, inversion, duplication, and translocation. .
  • the “mutation” in the present invention refers to a specific property of a peripheral circulating tumor cell polynucleotide, and is not a mutation in a cellular polynucleotide not present in a peripheral circulating tumor cell.
  • the region where the mutation exists may be not only a transcriptional region but also a regulatory region necessary for gene expression such as a promoter. Moreover, the mutation may not cause a change in the function of the gene.
  • peripheral circulating tumor cells refers to tumor cells circulating in the peripheral blood of cancer patients.
  • the “detection target region” of a mutated polynucleotide refers to a region that contains the mutation or part of the mutation to be detected by the method of the present invention.
  • the “detection target region” of the wild-type polynucleotide means a region corresponding to or overlapping with the “detection target region” of the mutant polynucleotide in the wild-type polynucleotide corresponding to the mutant polynucleotide. That is, the “detection target region” of the wild-type polynucleotide does not have the mutation.
  • the sequence of the detection target region may be a sequence of a strand (sense strand) having a sequence encoding genetic information, or a sequence of a strand (antisense strand) having a sequence complementary to the sense side. It may be.
  • mutant polynucleotide for example, an EGFR mutant polynucleotide is preferable.
  • the base number is the base number on the cDNA with A as the first base of the start codon ATG.
  • G719C Point mutation in which 2155th base G encoded by exon 18 is replaced with T.
  • G719S Point mutation in which 2155th base G encoded by exon 18 is replaced with A.
  • E746-A750del-1 A deletion mutation in which 15 bases from base 2235 to base 2249 C encoded by exon 19 are deleted.
  • E746-A750del-2 a deletion mutation in which 15 bases from 2236 base G to 2250 base A encoded by the 19th exon are deleted.
  • L747-A750delT751S Deletion mutation in which 12 bases from 2240 base T to 2251 base A encoded by exon 19 are deleted
  • L747-S752delP753S A deletion mutation in which 16 bases from 2240 base T to 2257 base C encoded by exon 19 are deleted.
  • L747-E740delA750P a deletion mutation in which 9 bases from 2239 base T to 2247 base A encoded by exon 19 are deleted.
  • L747-S752delE746V a deletion mutation in which 18 bases from base 2238 to base 2255 C encoded by exon 19 are deleted.
  • S752-I759del a deletion mutant gene in which 24 bases from 2254th base T to 2277th base C encoded by exon 19 are deleted.
  • L858R Point mutation in which the 2573th base T encoded by exon 21 is replaced with G.
  • L861Q A point mutation in which the 2582th base T encoded by exon 21 is replaced with A.
  • the method for detecting a mutated polynucleotide is a method for detecting a mutated polynucleotide in a peripheral circulating tumor cell, and includes the following steps.
  • Step 1 Extracting a cell sample containing 1 to 10,000 peripheral circulating tumor cells with a proteinase K-containing aqueous solvent to obtain a polynucleotide solution
  • Step 2 Polynucleotide solution obtained in Step 1
  • the reaction solution containing the total amount of is subjected to gene amplification by PCR, and an amplification step that selectively amplifies the detection target region of the mutant polynucleotide that may be contained in the polynucleotide solution
  • Step 3 ( 1) subjecting the reaction solution containing the amplification product obtained in step 2 and (2) a probe, which is an LNA consisting of a base sequence completely complementary to the detection target region of the mutant polynucleotide, to gene amplification by PCR.
  • the mutant polynucleotide is Detecting step of leaving
  • the method for detecting a mutated polynucleotide according to another aspect of the present invention is a method for detecting a mutated polynucleotide in a peripheral circulating tumor cell, and includes the following steps.
  • Step 1 A cell sample containing 1 to 10,000 peripheral circulating tumor cells is extracted with a proteinase K-containing aqueous solvent to obtain a polynucleotide solution
  • Step 2 (1) obtained in Step 1 A reaction solution containing a total amount of the polynucleotide solution and (2) a clamp primer that is a PNA consisting of a base sequence that is completely complementary to the detection target region of the wild-type polynucleotide corresponding to the mutant polynucleotide is obtained by PCR.
  • Step 3 (1) The amplification product obtained in Step 2 ( 2) the clamp primer, and (3) completely complementary to the detection target region of the mutant polynucleotide Detection that detects the mutant polynucleotide by selectively amplifying the detection target region of the mutant polynucleotide by subjecting a reaction solution containing a probe, which is an LNA consisting of a base sequence, to gene amplification by PCR.
  • a probe which is an LNA consisting of a base sequence
  • the second aspect of the present invention is: (I) The reaction solution in step 2 further contains a clamp primer which is a PNA consisting of a base sequence completely complementary to the detection target region of the wild-type polynucleotide corresponding to the mutant polynucleotide, and (ii) The reaction solution in step 3 further comprises the clamp primer, that is, PNA having a base sequence that is completely complementary to the detection target region of the wild-type polynucleotide corresponding to the mutant polynucleotide. This is different from the first aspect.
  • the second aspect of the present invention is a preferred aspect that is encompassed within the scope of the first aspect of the present invention.
  • Step 1 is a polynucleotide solution preparation step in which a cell sample containing 1 to 10,000 peripheral circulating tumor cells is extracted with a proteinase K-containing aqueous solvent to obtain a polynucleotide solution.
  • the cell sample used in Step 1 may be a cell sample containing 1 to 10,000 peripheral circulating tumor cells, but is usually a mammal (human, monkey) that may be affected by cancer. , Rat, mouse, etc., with human being particularly preferred).
  • the volume of the cell sample is not particularly limited, but is preferably 1 to 10 mL in the case of human blood.
  • the blood may be used as it is, or may be treated by a method for suppressing the action of a PCR inhibitor in the blood (for example, phenol extraction), and blood cells separated by a method such as centrifugation may be used as PBS. You may use it, suspending in liquids, such as.
  • the blood may be frozen and stored after being collected from the mammal.
  • a cell sample containing 1 to 10,000 peripheral circulating tumor cells is not only a test sample but also positive if it is a cell sample containing 1 to 10,000 peripheral circulating tumor cells.
  • the present invention is intended to include controls, and the present invention is not limited by whether or not the cell sample has been previously found to contain 1 to 10,000 peripheral circulating tumor cells.
  • a cell sample containing 100 to 10,000 peripheral circulating tumor cells is preferably used as “a cell sample containing 1 to 10,000 peripheral circulating tumor cells”. In the present invention, even mutant cells present in such a cell sample at a very small ratio such as one can be detected with high sensitivity.
  • the proteinase K-containing aqueous solvent used in Step 1 is not particularly limited, but is preferably a buffer solution having a pH of 7 to 8.
  • the amount of the proteinase K-containing aqueous solvent is preferably 5 to 20 ⁇ L, more preferably 10 to 15 ⁇ L.
  • the proteinase K concentration in the proteinase K-containing aqueous solvent may be any concentration at which proteinase K can act, but is usually 50 to 500 ⁇ g / mL.
  • the proteinase K-containing aqueous solvent may contain a surfactant (eg, Tween 20) as an additive.
  • a surfactant eg, Tween 20
  • the concentration is usually 0.5 to 2 v / v%.
  • the proteinase K-containing aqueous solvent further contains 0.5 to 2 v / v% Tween 20 and has a pH of 7 to 8.
  • a commercially available nucleic acid extract may be used as the proteinase K-containing aqueous solvent.
  • Examples of such commercially available nucleic acid extracts include Proteinase K DNA Extraction Solution attached to Pico Pure DNA Extraction Kit (trade name, Arcturus, USA).
  • the method for extracting the polynucleotide is not particularly limited, but is preferably performed by the following method.
  • the cell sample is centrifuged under normal conditions (eg, 15000 rpm (20000 g), 10 minutes, 4 ° C.) in which blood cells settle, and the supernatant is removed. Add proteinase K-containing aqueous solvent to the cells and mix gently to mix the cells.
  • normal conditions eg, 15000 rpm (20000 g), 10 minutes, 4 ° C.
  • the amount of the proteinase K-containing aqueous solvent may vary depending on the amount of blood from which the cell sample is derived, but is usually preferably 5 to 5 for a cell sample derived from 1 to 10 mL of blood (eg, 7.5 mL). 20 ⁇ L is used, more preferably 10-15 ⁇ L.
  • the obtained cell suspension is incubated under conditions that allow proteinase K to sufficiently act (eg, about 65 ° C., 1 day).
  • polynucleotide extract (polynucleotide solution) is allowed to stand under conditions (for example, 95 ° C., 10 minutes) where proteinase K is inactivated.
  • step 2 the reaction solution containing the entire amount of the polynucleotide solution obtained in step 1 is subjected to gene amplification by PCR, and a detection target region of a mutated polynucleotide that may be contained in the polynucleotide solution is determined. This is an amplification process for selective amplification.
  • the total amount may be substantially the entire amount, and does not need to be the entire amount. That is, specifically, the total amount of the polynucleotide solution may be 90 v / v% or more of the polynucleotide solution, for example.
  • the method of the present invention can detect a mutated polynucleotide of peripheral circulating tumor cells with high sensitivity.
  • the reaction solution to be subjected to gene amplification by the PCR method in step 2 is preferably a clamp primer that is a PNA consisting of a base sequence that is completely complementary to the detection target region of the wild-type polynucleotide corresponding to the mutant polynucleotide, Furthermore, it contains.
  • the clamp primer inhibits the amplification of the detection target region of the wild-type polynucleotide during gene amplification by the PCR method, and thus the detection target region of the mutant polynucleotide is selectively amplified.
  • the concentration of the clamp primer in the reaction solution is preferably 0.1 to 10 ⁇ M, more preferably 0.5 to 5 ⁇ M.
  • the base length of the clamp primer may be set to a length that allows specific hybridization to the detection target region, and specifically, it is preferably 10 to 30 bases, more preferably 15 to 20 bases.
  • the base sequence of PNA as a clamp primer used in Step 2 is preferably a sequence represented by the following SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, particularly when the mutation is a mutation of the EGFR gene.
  • the base sequence of PNA is described so as to start at the —NH 2 end (amino end) and end at the —CONH 2 end.
  • the amino terminus of PNA corresponds to the 5 ′ end of the polynucleotide.
  • the gene amplification by the PCR method in the step 2 may be performed according to the gene amplification method and conditions by the normal PCR method.
  • the reaction solution in step 2 further contains ordinary reagents and the like necessary for gene amplification by the PCR method.
  • a reagent include four types of deoxynucleoside triphosphates (dATP, dTTP, dCTP, dGTP: hereinafter, these may be collectively referred to as dNTPs), and a DNA polymerase (eg, Taq) as an enzyme.
  • reagents are available as commercial products. In particular, it is easy to obtain as a kit containing these reagents.
  • the reaction solution in step 2 is usually a buffer solution containing the reagent described above.
  • the “clamp primer” may be designed by a method well known to those skilled in the art using Tm value and the like as an index so that the detection target region can be amplified.
  • Primer 3 software http: // frodo .wi.mit.edu / cgi-bin / primer3 / primer3.cgi
  • the length of the primer is usually 10 to 40 bases, preferably 15 to 30 bases, more preferably 15 to 20 bases.
  • the distance between two primers (forward primer and reverse primer) is usually 50 to 5000 bases.
  • the concentration of the primer in the reaction solution is preferably 0.05 to 10 ⁇ M, more preferably 0.1 to 0.5 ⁇ M.
  • the temperature conditions for gene amplification by the PCR method are not particularly limited, and normal PCR method conditions may be employed.
  • the denaturation temperature is preferably 88 to 98 ° C, more preferably 90 to 97 ° C, More preferably, the temperature is 92 to 96 ° C.
  • the modification time is preferably 1 to 60 seconds, more preferably 2 to 30 seconds, and further preferably 3 to 30 seconds.
  • the temperature for the extension reaction is preferably 45 to 75 ° C, more preferably 50 to 70 ° C, and still more preferably 55 to 65 ° C.
  • the extension reaction time is preferably 5 to 90 seconds, more preferably 10 to 60 seconds, and still more preferably 20 to 40 seconds.
  • the number of cycles under the temperature condition is preferably 35 cycles or more, more preferably 40 cycles or more, and even more preferably 45 cycles or more.
  • the apparatus for performing the amplification reaction is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a thermal cycler.
  • step 3 a reaction solution containing (1) the amplification product obtained in step 2 and (2) a probe which is an LNA consisting of a base sequence completely complementary to the detection target region of the mutant polynucleotide is obtained by PCR. It is a detection step of detecting the mutant polynucleotide by selectively amplifying the detection target region of the mutant polynucleotide by being subjected to gene amplification.
  • the “(1) amplification product obtained in step 2” used in step 3 is preferably diluted 10 to 5000 times.
  • step 3 The gene amplification in step 3 was performed in the same manner as in step 2 except that a probe, which is an LNA consisting of a base sequence completely complementary to the detection target region of the mutant polynucleotide, was added to the reaction solution. can do.
  • a probe which is an LNA consisting of a base sequence completely complementary to the detection target region of the mutant polynucleotide
  • the probe which is the LNA used in Step 3 also functions as a primer for amplifying the detection target region of the mutant polynucleotide, while PNA inhibits amplification of the detection target region of the wild-type polynucleotide, as in Step 2. Therefore, the detection target region of the mutant polynucleotide is selectively amplified.
  • the concentration of the probe in the reaction solution is preferably 0.05 to 1 ⁇ M, more preferably 0.05 to 0.2 ⁇ M.
  • the base length of the probe may be set to a length that allows specific hybridization to the detection target region, and specifically, preferably 10 to 30 bases, more preferably 12 to 22 bases.
  • the probe is preferably used for detecting an amplified mutant polynucleotide.
  • the probe is preferably a radionuclide, a chromogenic substance, a fluorescent substance (eg, FAM, TET, TexasRed, Cy3, Cy5, HEX, TAMRA, ROX, FITC). ) And a quencher (eg, BHQ-1 (BlackQHole Quencher-1), BHQ-2 (Black Hole Quencher-2), Dabcyl) and the like.
  • a single probe may be labeled with both a fluorescent substance and a quenching substance, and in this case, the fluorescence wavelength emitted from the fluorescent substance and the absorption wavelength absorbed by the quenching substance are preferably the same.
  • the labeling site is not particularly limited, but is preferably the 5 'end or 3' end of the probe.
  • the nucleotide sequence of the LNA probe used in Step 3 is particularly when the mutation is the E740-A750del or L858R mutation of the EGFR gene (see Nagai Y. et al., Cancer Res., 65, 7276-7282 (2005)).
  • the sequences represented by the following SEQ ID NOs: 3 to 5 are preferred.
  • At least one (preferably 1 to 3) nucleic acid in these sequences has been replaced with LNA.
  • 6FAM-5 ′ is modified at the 5 ′ end with 6FAM
  • 5TET-5 ′ is modified at the 5 ′ end with 5TET
  • 3′-BHQ1 is modified at the 3 ′ end. Is modified with BHQ1.
  • the + next to the left of the base indicates that the nucleic acid of this base has been replaced with LNA.
  • LNA can be synthesized according to a synthesis method known per se.
  • the method for detecting the amplified mutant polynucleotide is not particularly limited, but it can be preferably carried out by detecting a probe modified so as to be detectable as described above.
  • Reference example 1 In Reference Example 1, A431 cells derived from squamous cell carcinoma, which is a wild-type cell having no mutation in the EGFR gene, Ma-1 cells derived from non-small cell lung cancer having a defect in Exon 19 of the EGFR gene, EGFR gene Non-small cell lung cancer-derived H1975 cells having a T790M type mutation in Exon 20 and an L858R type mutation in Exon21 were used. A431 cells are DMEM medium supplemented with 10% FBS and 1/100 volume PS, and Ma-1 cells and H1975 cells derived from non-small cell lung cancer are RPMI medium supplemented with 10% FBS and 1/100 volume PS. Cultured. The culture was performed in a CO 2 incubator set to 37 ° C. using 5% carbon dioxide gas-95% air as a gas phase.
  • a cell sample for mutation detection was prepared as follows. After washing the cultured cells with PBS, 0.25 vol% Trypsin-1 mmol / L EDTA is added to the extent that the cells cover. After confirming that the cells have detached from the culture dish, a culture solution containing 0.25 vol% Trypsin-1 mmol / L EDTA and an equal amount or more of 10% FBS is added, and the cells are collected. After centrifugation (900 rpm, 3 minutes), the supernatant is removed and the cells are suspended in PBS. The number of suspended cells was counted, and the cells were mixed in 400 ⁇ L of PBS according to Table 1 below to obtain a cell-mixed sample.
  • Comparative Example 1 DNA was extracted from the cell-mixed sample obtained in Reference Example 1 using QIAamp DNA micro kit (QIAGEN) according to the protocol attached to the kit.
  • QIAamp DNA micro kit QIAGEN
  • extraction was performed as follows. (1) 400 ⁇ L of the sample was centrifuged at 8000 rpm, and 360 ⁇ L of the supernatant was removed. (2) To the remaining 40 ⁇ L (cell layer), Buffer ATL 140 ⁇ L and Proteinase K 20 ⁇ L attached to the QIAamp DNA Micro kit were added, stirred with vortex, and incubated at 56 ° C. for 1 hour. (3) 1 ⁇ L of carrier RNA attached to QIAamp DNA Micro kit was added and stirred by vortex. (4) The mixed solution after stirring in (3) above was dispensed into a dedicated 2 mL tube and set in a QIAcube shaker adapter. (5) A reagent bottle rack and a chip rack were set.
  • a QIAcube 1.5 mL collection tube and spin column were set in the rotor adapter.
  • the protocol was started according to the QIAcube simple manual (finished in about 75 minutes).
  • the DNA was eluted with 50 ⁇ L of buffer.
  • DNA is finally extracted with 50 ⁇ L of solution.
  • PCR (the final volume during the reaction was 20 ⁇ L) was amplified using 1 ⁇ L of 50 ⁇ L of the DNA solution and 0.5 ⁇ M each of the first PCR primers (manufactured by OPERON) (first PCR).
  • the temperature conditions for PCR were 94 ° C. for 30 seconds for denaturation, 55 ° C. for 30 seconds for extension reaction, and 40 cycles.
  • the amplified PCR product was diluted 2000 times, and 5 ⁇ L was subjected to PNA-LNA PCR clamp method.
  • the reaction was carried out in a volume of 25 ⁇ L, and in the reaction solution, each second PCR primer (OPERON) 0.2 ⁇ M, LNA probe (Integrated DNA Technologies) 0.1 ⁇ M, PNA (Panagene) 0.5-5 ⁇ M including.
  • the temperature conditions for PCR were 95 ° C for 3 seconds for denaturation, 62 ° C for 30 seconds for extension reaction, and 60 cycles.
  • a quantitative PCR apparatus Smart Cycler II System, Takara Bio Inc.
  • Cy3, Cy5 or FAM was used for the fluorescent labeling of the LNA probe.
  • Results of Comparative Example 1 are shown in Tables 2 and 3.
  • the detection of exon19 deletion is shown in Table 2, and the detection of exon21 substitution is shown in Table 3.
  • Table 2 In the exon 19 deletion (Table 2), there was a tendency that the number of mutant cells was not correctly detected when the number of mutant cells was 10 cells or less, and no mutation could be detected in any total number of cells.
  • exon 21 substitution Table 3
  • the portion (+) where the presence / absence of mutation could be correctly evaluated in one example although it was low in simultaneous reproducibility, it was considered possible to detect mutation by increasing the number of measurements.
  • Example 1 Cells in PBS (cell-mixed sample obtained in Reference Example 1) were centrifuged (15000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.), the supernatant was removed, 5 ⁇ L of PBS was added again, and Pico Pure DNA Extraction Kit was further added. (Arcuturus) 10 ⁇ L of Proteinase K DNA Extraction Solution attached was added and gently stirred to suspend the cells. The suspension was incubated at 65 ° C. for 3 hours and then heated at 95 ° C. for 10 minutes to obtain a DNA extract.
  • PNA represented by SEQ ID NO: 1 due to EGFR gene mutation exon19 deletion (E746-A750 del) which is a gene deletion mutation, or EGFR gene mutation exon21 which is a point mutation For substitution (L858R)
  • PNA represented by SEQ ID NO: 2 was added at a final concentration of 5 ⁇ M, and PCR amplification was performed.
  • the obtained amplified PCR product was diluted 2000 times or 200 times, and 5 ⁇ L was subjected to the PNA-LNA PCR clamp method.
  • mutant cells present at a ratio of 1 preferably 100 to 1000 cells
  • mutant cells that are present in a very small proportion such as one in 100 to 10,000 cells (preferably 100 to 1000 cells) Since it is extremely important to be able to detect correctly, it can be said that the detection method of the present invention has very high clinical utility.
  • Table 6 shows detection of the EGFR gene mutation-exon19 deletion (E746-A750 del)-which is a gene deletion mutation
  • Table 7 shows detection of an EGFR gene mutation-exon21 substitution (L858R)-which is a point mutation.
  • Example 1 was compared Even when compared with Example 1, it was found that the presence or absence of the mutated polynucleotide can be correctly evaluated from the CTC with high sensitivity.
  • the present invention enables detection of genetic mutations in metastatic tumor cells using CTCs that are contained in only about a few in 7.5 mL of cancer patient's blood, so that genetic testing is less invasive to patients. This makes it possible to select appropriate therapeutic agents for cancer patients and easily stratify patients when conducting clinical trials for drug discovery, making cancer treatment more effective. Since it contributes to the reduction of side effects, it has very high clinical utility.
  • the entire amount of the polynucleotide solution obtained from the cell sample can be used in the PCR method, so that the mutated polynucleotide can be easily detected. it can. Furthermore, regarding the implementation of the invention, there is no need for a dedicated device or the like, and it is possible to use equipment and equipment installed in a general clinical laboratory.
  • SEQ ID NO: 1 is the base sequence of the clamp primer.
  • SEQ ID NO: 2 is the base sequence of the clamp primer.
  • SEQ ID NO: 3 is the base sequence of the LNA probe.
  • SEQ ID NO: 4 is the base sequence of the LNA probe.
  • SEQ ID NO: 5 is the base sequence of the LNA probe.

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Abstract

本発明は、ＣＴＣから遺伝子変異情報を入手することが可能な、高感度の遺伝子変異検出法を提供することを目的とする。 以下の工程を含むことを特徴とする末梢循環腫瘍細胞の変異ポリヌクレオチドの検出方法。 工程１：１～１００００個の末梢循環腫瘍細胞を含有する細胞試料を、プロテイナーゼＫ含有水性溶媒で抽出して、ポリヌクレオチド溶液を得るポリヌクレオチド溶液調製工程 工程２：工程１で得られるポリヌクレオチド溶液の全量を含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付し、前記ポリヌクレオチド溶液に含有される可能性がある前記変異ポリヌクレオチドの検出標的領域を選択的に増幅させる増幅工程 工程３：（１）工程２で得られる増幅産物および（２）前記変異ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＬＮＡであるプローブを含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付すことにより、前記変異ポリヌクレオチドの前記検出標的領域を選択的に増幅させて、当該変異ポリヌクレオチドを検出する検出工程

Description

変異ポリヌクレオチドの検出方法
　本発明は、変異ポリヌクレオチドの検出方法に関する。
　遺伝子の異常が様々ながんを引き起こすことが広く知られている。例えば、ヒト上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor、EGFR）の遺伝子（本明細書中、ＥＧＦＲ遺伝子と称する場合がある。）の変異は、多くの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者でＥＧＦＲ遺伝子の変異が確認されていること、およびＮＳＣＬＣ患者ではＥＧＦＲタンパク質の過剰発現が見出されることなどから、ＮＳＣＬＣの発症の一因であると考えられている。がん患者の病変部の遺伝子変異情報を利用し、薬剤を選択・投与することは、がんの治療を効果的なものにすると共に、その副作用の軽減に寄与する。また、がんの遺伝子変異情報は、薬剤を開発するにあたり、臨床試験時の患者の層別化に利用することも可能である。がんの遺伝子変異情報は、例えば、摘出病変の遺伝子検査によって得ることができる。しかし、がんの種類によっては、摘出病変の遺伝子検査は、患者に大きな負担を与えるので、頻回になるほど制限がある場合が多い。
　近年、がん患者の末梢血中に循環している腫瘍細胞、すなわち末梢循環腫瘍細胞（Circulating tumor cells, CTC）の存在が明らかとなり、これが難治性転移疾患に関与していることが報告されている。そこでＣＴＣを利用することにより転移性腫瘍細胞の遺伝子変異情報を入手し、薬剤感受性の確認や創薬の標的にすることが有用と考えられている。すなわち、もし、ＣＴＣを利用した転移性腫瘍細胞の変異ポリヌクレオチドの検出が可能になれば、患者に対する侵襲が少ない遺伝子検査が可能になり、がん患者に対する適切な治療薬の選択や創薬の臨床試験実施時の患者層別化が容易に行えることが期待される。しかし、がん患者の血液中に存在するＣＴＣは非常に少ない（具体的には、がん患者の血液７．５ｍＬ中にＣＴＣは数個程度しか含まれていない）ので、血液中から純度の高いＣＴＣを単離することが困難である。ＣＴＣを利用する変異ポリヌクレオチドの検出のためには、非常に高感度な測定系が必要となるため、ＣＴＣから遺伝子変異情報を入手することは実用レベルでは実現していない。
　一方、野性型と変異型の遺伝子を区別するためのヒト遺伝子多型を検出する技術は産業利用されており、その例としては、ＰＮＡ－ＬＮＡ　ＰＣＲ　クランプ法を利用した方法が挙げられる。
　ＰＮＡ－ＬＮＡ　ＰＣＲ　クランプ法に基づく変異ポリヌクレオチドの検出方法としては、例えば特許文献１に開示された方法が知られている。
特許第４２１６２６６号明細書
　本発明は、ＣＴＣから遺伝子変異情報を入手することが可能な、高感度の変異ポリヌクレオチドの検出法を提供することを目的とする。
　さらに、本発明は、末梢循環腫瘍細胞の変異ポリヌクレオチドを簡便に検出可能な方法を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、細胞試料から得られたポリヌクレオチド溶液の一部でなく全量を用いて、変異ポリヌクレオチドを検出可能な方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討の結果、従来のＰＮＡ－ＬＮＡ　ＰＣＲ　クランプ法を改良することにより、ＣＴＣから遺伝子変異情報を入手することが可能な、高感度の変異ポリヌクレオチドの検出方法を実現し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、下記の項１～項１３等を提供するものである。
［項１］
　以下の工程を含むことを特徴とする末梢循環腫瘍細胞の変異ポリヌクレオチドの検出方法。
工程１：１～１００００個の末梢循環腫瘍細胞を含有する細胞試料を、プロテイナーゼＫ含有水性溶媒で抽出して、ポリヌクレオチド溶液を得るポリヌクレオチド溶液調製工程
工程２：工程１で得られるポリヌクレオチド溶液の全量を含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付し、前記ポリヌクレオチド溶液に含有される可能性がある前記変異ポリヌクレオチドの検出標的領域を選択的に増幅させる増幅工程
工程３：（１）工程２で得られる増幅産物および（２）前記変異ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＬＮＡであるプローブを含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付すことにより、前記変異ポリヌクレオチドの前記検出標的領域を選択的に増幅させて、当該変異ポリヌクレオチドを検出する検出工程
［項２］
　以下の工程を含むことを特徴とする末梢循環腫瘍細胞の変異ポリヌクレオチドの検出方法。
工程１：１～１００００個の末梢循環腫瘍細胞を含有する細胞試料を、プロテイナーゼＫ含有水性溶媒で抽出して、ポリヌクレオチド溶液を得るポリヌクレオチド溶液調製工程
工程２：（１）工程１で得られるポリヌクレオチド溶液の全量、および（２）前記変異ポリヌクレオチドに対応する野生型ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＰＮＡであるクランププライマーを含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付し、前記ポリヌクレオチド溶液に含有される可能性がある前記変異ポリヌクレオチドの前記検出標的領域を選択的に増幅させる増幅工程
工程３：（１）工程２で得られる増幅産物、（２）前記クランププライマー、および（３）前記変異ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＬＮＡであるプローブを含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付すことにより、前記変異ポリヌクレオチドの前記検出標的領域を選択的に増幅させて、当該変異ポリヌクレオチドを検出する検出工程
［項３］
　前記プロテイナーゼＫ含有水性溶媒の容量が、５～２０μＬである前記項１または２に記載の検出方法。
［項４］
　前記細胞試料が１～１０ｍＬのヒト血液に由来する前記項１または２に記載の検出方法。
［項５］
　プロテイナーゼＫ含有水性溶媒が０．５～２ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ２０を更に含有し、かつ７～８のｐＨを有する前記項１または２に記載の検出方法。
［項６］
　前記工程２において、反応液中のクランププライマーの濃度が０．１～１０μＭである前記項２に記載の検出方法。
［項７］
　前記クランププライマーの塩基長が１０～３０塩基である前記項２に記載の検出方法。
［項８］
　前記変異ポリヌクレオチドがＥＧＦＲ変異ポリヌクレオチドである前記項１または２に記載の検出方法。
［項９］
　前記クランププライマーが配列番号１または２で示される塩基配列を有する前記項２に記載の検出方法。
［項１０］
　前記プローブの塩基長が１０～３０塩基である前記項１または２に記載の検出方法。
［項１１］
　前記プローブが配列番号３～５から選択されるいずれかで示される塩基配列を有する前記項１または２に記載の検出方法。
［項１２］
　前記クランププライマーが配列番号１で示される塩基配列を有し、かつ前記プローブが配列番号３または４で示される塩基配列を有する前記項２に記載の検出方法。
［項１３］
　前記クランププライマーが配列番号２で示される塩基配列を有し、かつ前記プローブが配列番号５で示される塩基配列を有する前記項２に記載の検出方法。
　本発明の変異ポリヌクレオチドの検出方法によれば、高感度且つ簡便にＣＴＣから遺伝子変異情報を入手することが可能である。すなわち、本発明はＣＴＣを利用した転移性腫瘍細胞の変異ポリヌクレオチドの検出を可能とするので、患者に対する侵襲が少ない遺伝子検査が可能になり、がん患者に対する適切な治療薬の選択や創薬の臨床試験実施時の患者層別化が容易に行えることが期待される。
　また、本発明の変異ポリヌクレオチドの検出方法によれば、細胞試料から得られたポリヌクレオチド溶液の一部でなく全量をＰＣＲ法に用いることができるため、変異ポリヌクレオチドを簡便に検出することができる。
　＜用語＞
　本明細書中で用いられる用語は、特に記載の無い限り、本発明の属する技術分野における通常の意味で用いられる。
　本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドが直鎖状に重合した高分子化合物（ヌクレオチドが鎖のように連なりポリヌクレオチドになる）をいう。
　本明細書中、「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドにリン酸基が結合した物質をいい、ヌクレオシドとは、五単糖の1位にプリン塩基またはピリミジン塩基がグリコシド結合したものをいい、ＤＮＡやＲＮＡを構成する単位でもある。
　本明細書中、「塩基配列」（本明細書中、単に、「配列」と称する場合がある。）とは、例えば、遺伝子、プライマー、およびプローブなどの核酸または核酸類似体における、塩基の並びを意味する。前記核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられ、前記核酸類似体としては、例えば、ペプチド核酸、およびＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）などが挙げられる。
　本明細書中、「ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid、ペプチド核酸）」は、核酸類似体であって、２－アミノエチルグリシンを骨格単位とし、これにメチレンカルボニル基を介して核酸塩基を結合させた構造を有する化合物である。ＰＮＡは、相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して、ポリヌクレオチド（すなわち、通常のポリヌクレオチド）と比べて特異的、かつ強力に結合することができる。本明細書中、ＰＮＡは、このような性質を有するＰＮＡ類似物（例、ｇｒｉｐＮＡ）を包含する。
　本明細書中、「ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）」は、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの核酸がＬＮＡモノマーに置き換えられた構造を有する化合物である。本明細書中、「ＬＮＡモノマー」は、リボ核酸の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子が架橋した２つの環状構造をもつ核酸およびその類似体を意味する。ＬＮＡモノマーとしては、例えば、オキシ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、およびアミノ－ＬＮＡ等が挙げられる。ＬＮＡは、相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して、ポリヌクレオチド（すなわち、通常のポリヌクレオチド）と比べて特異的、かつ強力に結合することができる。本明細書中、ＬＮＡは、このような性質を有するＬＮＡ類似物を包含する。
　本明細書中、「ＰＮＡ－ＬＮＡ　ＰＣＲ　クランプ法」は、それぞれ核酸類似体であるＰＮＡおよびＬＮＡ（Locked Nucleic Acid、ロックド核酸）をプライマーおよびプローブとして用いたＰＣＲ法である。
　本明細書中、「ＰＮＡ－ＬＮＡ　ＰＣＲ　クランプ法」は、ＰＮＡおよびＬＮＡが有するこのような性質を利用して、クランププライマーおよび変異プローブとして用い、変異遺伝子を選択的に増幅させる方法である。
　以下に、本発明の変異ポリヌクレオチドの検出方法を説明する。
　本発明の変異ポリヌクレオチドの検出方法は、末梢循環腫瘍細胞の変異ポリヌクレオチドの検出方法である。
　本明細書中、「変異ポリヌクレオチド」とは、変異を生じたポリヌクレオチドを意味する。「変異」とは、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸配列の変化であり、遺伝学等で使用される用語、塩基置換、挿入、欠失、逆位、重複、および転座等がこれに包含される。本発明における「変異」とは、末梢循環腫瘍細胞のポリヌクレオチドが特異的に有するものをいい、末梢循環腫瘍細胞にはない細胞のポリヌクレオチドにおける変異ではない。末梢循環腫瘍細胞のポリヌクレオチドが有する変異であれば、変異の存在する領域は転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現上必要な調節領域であってもよい。また、変異は、遺伝子の機能上の変化をもたらさないものであってもよい。
　本明細書中、「末梢循環腫瘍細胞」とは、がん患者の末梢血中に循環している腫瘍細胞をいう。
　本明細書中、変異ポリヌクレオチドの「検出標的領域」とは、前記変異であって、本発明の方法により、検出しようとする変異または変異の一部を含む領域を意味する。また、野生型ポリヌクレオチドの「検出標的領域」とは、変異ポリヌクレオチドに対応する野生型ポリヌクレオチドにおいて、変異ポリヌクレオチドの「検出標的領域」に対応または重複する領域を意味する。すなわち、野生型ポリヌクレオチドの「検出標的領域」は、前記変異を有さない。なお、検出標的領域の配列は、遺伝情報をコードする配列を有する鎖（センス鎖）の配列であってもよいし、センス側に対して相補的な配列を有する鎖（アンチセンス鎖）の配列であってもよい。
　本発明における「変異ポリヌクレオチド」としては、例えば、ＥＧＦＲ変異ポリヌクレオチドが好ましい。
　ＥＧＦＲ遺伝子における変異としては、これまで、以下のものが知られているが、本発明は、これに限定されるものではない。なお、塩基番号は、開始コドンＡＴＧのＡを１番塩基としたｃＤＮＡ上の塩基番号とする。
(1)Ｇ７１９Ｃ：第１８エクソンにコードされる２１５５番塩基ＧがＴに置換した点突然変異。
(2)Ｇ７１９Ｓ：第１８エクソンにコードされる２１５５番塩基ＧがＡに置換した点突然変異。
(3)Ｅ７４６－Ａ７５０ｄｅｌ－１：第１９エクソンにコードされる２２３５番塩基Ｇから２２４９番塩基Ｃまでの１５塩基が欠失した欠失変異。
(4)Ｅ７４６－Ａ７５０ｄｅｌ－２：第１９エクソンにコードされる２２３６番塩基Ｇから２２５０番塩基Ａまでの１５塩基が欠失した欠失変異。
(5)Ｌ７４７－Ａ７５０ｄｅｌＴ７５１Ｓ：第１９エクソンにコードされる２２４０番塩基Ｔから２２５１番塩基Ａまでの１２塩基が欠失した欠失変異
(6)Ｌ７４７－Ｓ７５２ｄｅｌＰ７５３Ｓ：第１９エクソンにコードされる２２４０番塩基Ｔから２２５７番塩基Ｃまでの１６塩基が欠失した欠失変異。
(7)Ｌ７４７－Ｅ７４０ｄｅｌＡ７５０P：第１９エクソンにコードされる２２３９番塩基Ｔから２２４７番塩基Ａまでの９塩基が欠失した欠失変異。
(8)Ｌ７４７－Ｓ７５２ｄｅｌＥ７４６Ｖ：第１９エクソンにコードされる２２３８番塩基Ａから２２５５番塩基Ｃまでの１８塩基が欠失した欠失変異。
(9)Ｓ７５２－Ｉ７５９ｄｅｌ：第１９エクソンにコードされる２２５４番塩基Ｔから２２７７番塩基Ｃまでの２４塩基が欠失した欠失変異遺伝子。
(10)Ｌ８５８Ｒ：第２１エクソンにコードされる２５７３番塩基ＴがＧに置換した点突然変異。
(11)Ｌ８６１Ｑ：第２１エクソンにコードされる２５８２番塩基ＴがＡに置換した点突然変異。
＜第１の態様＞
　本発明の一態様の変異ポリヌクレオチドの検出方法は、末梢循環腫瘍細胞の変異ポリヌクレオチドの検出方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする。
工程１：１～１００００個の末梢循環腫瘍細胞を含有する細胞試料を、プロテイナーゼＫ含有水性溶媒で抽出して、ポリヌクレオチド溶液を得るポリヌクレオチド溶液調製工程
工程２：工程１で得られるポリヌクレオチド溶液の全量を含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付し、前記ポリヌクレオチド溶液に含有される可能性がある前記変異ポリヌクレオチドの検出標的領域を選択的に増幅させる増幅工程
工程３：（１）工程２で得られる増幅産物および（２）前記変異ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＬＮＡであるプローブを含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付すことにより、前記変異ポリヌクレオチドの前記検出標的領域を選択的に増幅させて、当該変異ポリヌクレオチドを検出する検出工程
＜第２の態様＞
　本発明の別の一態様の変異ポリヌクレオチドの検出方法は、末梢循環腫瘍細胞の変異ポリヌクレオチドの検出方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする。
工程１：１～１００００個の末梢循環腫瘍細胞を含有する細胞試料を、プロテイナーゼＫ含有水性溶媒で抽出して、ポリヌクレオチド溶液を得るポリヌクレオチド溶液調製工程
工程２：（１）工程１で得られるポリヌクレオチド溶液の全量、および（２）前記変異ポリヌクレオチドに対応する野生型ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＰＮＡであるクランププライマーを含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付し、前記ポリヌクレオチド溶液に含有される可能性がある前記変異ポリヌクレオチドの前記検出標的領域を選択的に増幅させる増幅工程
工程３：（１）工程２で得られる増幅産物、（２）前記クランププライマー、および（３）前記変異ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＬＮＡであるプローブを含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付すことにより、前記変異ポリヌクレオチドの前記検出標的領域を選択的に増幅させて、当該変異ポリヌクレオチドを検出する検出工程
本発明の第２の態様は、
（ｉ）工程２における反応液が、変異ポリヌクレオチドに対応する野生型ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＰＮＡであるクランププライマーを、更に含有する点、および
（ｉｉ）工程３における反応液が、前記クランププライマー、すなわち、変異ポリヌクレオチドに対応する野生型ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＰＮＡを、更に含有する点で、本発明の第１の態様とは、相異する。
　これから容易に理解されるように、本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の範囲内に包含される、好ましい態様である。
　以下に、本発明の第１の態様の工程１～工程３を説明することによって本発明を説明するとともに、本発明の第２の態様もまた説明する。
＜工程１＞
　工程１は、１～１００００個の末梢循環腫瘍細胞を含有する細胞試料を、プロテイナーゼＫ含有水性溶媒で抽出して、ポリヌクレオチド溶液を得るポリヌクレオチド溶液調製工程である。
　工程１で用いられる細胞試料としては、１～１００００個の末梢循環腫瘍細胞を含有する細胞試料であればよいが、通常は、がんに罹患している可能性がある哺乳動物（ヒト、サル、ラット、マウス等が挙げられるが、特にヒトが望ましい）の血液である。
前記細胞試料の容量は、特に限定されないが、ヒトの血液の場合、１～１０ｍＬであるのが望ましい。当該血液は、そのまま用いてもよく、血液中のＰＣＲ阻害物質の作用を抑制する方法（例えば、フェノール抽出など）で処理してもよく、また、遠心分離等の方法で分離した血液細胞をＰＢＳ等の液に懸濁して用いてもよい。また、血液は、前記哺乳動物からの採取後、冷凍保存したものであってもよい。
　なお、語句「１～１００００個の末梢循環腫瘍細胞を含有する細胞試料」とは、１～１００００個の末梢循環腫瘍細胞を含有している細胞試料であれば、供試サンプルのみならず、ポジティブコントロールも包含することを意図して用いられ、当該細胞試料が、１～１００００個の末梢循環腫瘍細胞を含有することが予め判明しているか否かによって、本発明が限定されるものではない。がん患者のＣＴＣを利用した転移性腫瘍細胞の遺伝子変異を検出する際、臨床上、非常に小さい割合で存在する変異細胞をより正しく検出できることが極めて重要である。本発明では、「１～１００００個の末梢循環腫瘍細胞を含有する細胞試料」として、好ましくは「１００～１００００個の末梢循環腫瘍細胞を含有する細胞試料」が用いられる。本発明では、このような細胞試料に１個のような非常に小さい割合で存在する変異細胞であっても、感度よく検出することができる。
　工程１で用いられるプロテイナーゼＫ含有水性溶媒としては、特に限定されないが、ｐＨ７～８の緩衝液であることが好ましい。
　プロテイナーゼＫ含有水性溶媒の量は、好ましくは５～２０μＬ、より好ましくは１０～１５μＬである。これにより、本発明の方法は、高感度で、末梢循環腫瘍細胞の変異ポリヌクレオチドを検出することができる。
　プロテイナーゼＫ含有水性溶媒中のプロテイナーゼＫ濃度は、プロテイナーゼＫが作用可能な濃度であればよいが、通常５０～５００μg／ｍＬである。
　プロテイナーゼＫ含有水性溶媒は、添加剤として、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０）等を含有していてもよい。プロテイナーゼＫ含有水性溶媒が界面活性剤を含有する場合、その濃度は、通常０．５～２ｖ／ｖ％である。
　本発明では、プロテイナーゼＫ含有水性溶媒が、０．５～２ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ２０を更に含有し、かつ７～８のｐＨを有することが望ましい。
　プロテイナーゼＫ含有水性溶媒として、市販の核酸抽出液を用いてもよい。このような市販の核酸抽出液としては、例えば、Pico　Pure　DNA　Extraction　Kit（商品名、Arcturus社、米国）付属のProteinase　K　DNA　Extraction　Solutionが挙げられる。
　ポリヌクレオチドを抽出する方法は、特に限定されないが、好ましくは、下記の方法により行う。
　細胞試料を、血液細胞が沈降する通常の条件（例、１５０００ｒｐｍ（２００００ｇ）、１０分、４℃）で遠心し、上清を除去する。細胞に、プロテイナーゼＫ含有水性溶媒を加え、緩やかに撹拌して、細胞を混和させる。
　プロテイナーゼＫ含有水性溶媒の量は、細胞試料が由来する血液の量によって、変動しうるが、通常、血液１～１０ｍＬ（例、７．５ｍＬ）に由来する細胞試料に対して、好ましくは５～２０μＬを、より好ましくは１０～１５μＬを用いる。
　得られた細胞懸濁液を、プロテイナーゼＫが十分に作用する条件（例、約６５℃、１日）でインキュベートする。
　得られたポリヌクレオチド抽出液（ポリヌクレオチド溶液）を、プロテイナーゼＫが失活する条件（例、９５℃、１０分）で、放置する。
＜工程２＞
　工程２は、工程１で得られるポリヌクレオチド溶液の全量を含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付し、前記ポリヌクレオチド溶液に含有される可能性がある変異ポリヌクレオチドの検出標的領域を選択的に増幅させる増幅工程である。
　ここで、全量とは、実質的に全量であればよく、完全に全量であることを要しない。すなわち、ポリヌクレオチド溶液の全量とは、具体的には、例えば、ポリヌクレオチド溶液の９０ｖ／ｖ％以上であればよい。これにより、本発明の方法は、高感度で、末梢循環腫瘍細胞の変異ポリヌクレオチドを検出することができる。
　工程２でＰＣＲ法による遺伝子増幅に付される反応液は、好ましくは、変異ポリヌクレオチドに対応する野生型ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＰＮＡであるクランププライマーを、更に含有する。
　当該クランププライマーは、ＰＣＲ法による遺伝子増幅における野生型ポリヌクレオチドの検出標的領域の増幅を阻害するので、変異型ポリヌクレオチドの検出標的領域が選択的に増幅される。
　反応液中のクランププライマーの濃度は、好ましくは０．１～１０μＭ、より好ましくは０．５～５μＭである。
　前記クランププライマーの塩基長は、検出標的領域に特異的にハイブリダイゼーションできる長さに設定すればよく、具体的には、好ましくは１０～３０塩基、より好ましくは１５～２０塩基である。
　工程２で用いられるクランププライマーとしてのＰＮＡの塩基配列は、特に変異がＥＧＦＲ遺伝子の変異である場合、好ましくは、下記の配列番号１または配列番号２で表される配列が好ましい。なお、本明細書中、ＰＮＡの塩基配列は、－ＮＨ２末端（アミノ末端）から始まり、－ＣＯＮＨ２末端で終わるように記載する。ＰＮＡのアミノ末端はポリヌクレオチドの５’末端に対応する。
配列番号１：ＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＴＡＡ
配列番号２：ＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡ
　ＰＮＡは自体公知の合成方法に従って合成することができる。
　工程２におけるＰＣＲ法による遺伝子増幅は、通常のＰＣＲ法による遺伝子増幅の方法及び条件に準じて実施すればよい。
　工程２における反応液は、更に、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に必要な通常の試薬等を含有する。このような試薬としては、例えば、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ：以下、これらをまとめてｄＮＴＰと称する場合がある。）、酵素としてのＤＮＡポリメラーゼ（例、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ）、逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例、Ｔｔｈポリメラーゼ）、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（例、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製））、前記酵素の補因子としてのマグネシウムイオン、プライマーが挙げられる。
　これらの試薬は、市販品にて入手可能である。特に、これらの試薬を含むキットとして入手することが簡便である。
　工程２における反応液は、通常、上述した試薬を含有する緩衝液である。
　前記「クランププライマー」は、検出標的領域の増幅が可能なように、Ｔｍ値などを指標にして、当業者に周知の方法で、設計すればよいが、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３ ｓｏｆｔｗａｒｅ （http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi）等のプライマーデザイン用のソフトウェアを用いて設計することができる。プライマーの長さは、通常、１０～４０塩基、好ましくは１５～３０塩基、より好ましくは１５～２０塩基である。２つのプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）間の距離は、通常５０～５０００塩基である。
　反応液中のプライマーの濃度は、好ましくは、0.05～10μＭ、より好ましくは０．１～０．５μＭである。
　ＰＣＲ法による遺伝子増幅の温度条件としては、特に限定されず、通常のＰＣＲ法の条件を採用すればよいが、変性の温度としては、８８～９８℃が好ましく、９０～９７℃がより好ましく、９２～９６℃が更に好ましい。また、前記変性の時間としては、１～６０秒が好ましく、２～３０秒がより好ましく、３～３０秒が更に好ましい。伸長反応の温度としては、４５～７５℃が好ましく、５０～７０℃がより好ましく、５５～６５℃が更に好ましい。前記伸長反応の時間としては、５～９０秒が好ましく、１０～６０秒がより好ましく、２０～４０秒が更に好ましい。前記温度条件のサイクル数としては、３５サイクル以上が好ましく、４０サイクル以上がより好ましく、４５サイクル以上が更に好ましい。
　増幅反応を行う装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サーマルサイクラーが挙げられる。
＜工程３＞
　工程３は、（１）工程２で得られる増幅産物および（２）前記変異ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＬＮＡであるプローブを含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付すことにより、前記変異ポリヌクレオチドの前記検出標的領域を選択的に増幅させて、当該変異ポリヌクレオチドを検出する検出工程である。
　工程３で用いられる「（１）工程２で得られる増幅産物」は、好ましくは、１０～５０００倍に希釈して用いる。
　工程３における遺伝子増幅は、反応液に、前記変異ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＬＮＡであるプローブを添加することを除いては、工程２と同様にして、実施することができる。
　工程３で用いられるＬＮＡであるプローブは、変異ポリヌクレオチドの検出標的領域を増幅させるプライマーとしても機能し、一方、工程２と同様にＰＮＡは、野生型ポリヌクレオチドの検出標的領域の増幅を阻害するので、変異型ポリヌクレオチドの検出標的領域が選択的に増幅される。
　反応液中のプローブの濃度は、好ましくは０．０５～１μＭ、より好ましくは０．０５～０．２μＭである。
　プローブの塩基長は、検出標的領域に特異的にハイブリダイゼーションできる長さに設定すればよく、具体的には、好ましくは１０～３０塩基、より好ましくは１２～２２塩基である。
　プローブは、増幅された変異ポリヌクレオチドの検出のため、好ましくは、前記プローブを、放射性核種、発色性物質、蛍光物質（例、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＦＩＴＣ）、および消光物質（例、ＢＨＱ－１（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ－１）、ＢＨＱ－２（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ－２）、Ｄａｂｃｙｌ）等による標識によって、修飾される。
　１つのプローブを、蛍光物質及び消光物質の両方が標識してもよく、この場合、蛍光物質から発する蛍光波長と、消光物質が吸収する吸収波長とが、一致することが好ましい。
　標識部位としては、特に制限はないが、プローブの５’末端又は３’末端であることが好ましい。
　工程３で用いられるＬＮＡプローブの塩基配列は、特に変異がＥＧＦＲ遺伝子のＥ７４０－Ａ７５０ｄｅｌもしくはＬ８５８Ｒ変異(Nagai Y.ら, Cancer Res., 65, 7276-7282 (2005)を参照。）である場合、好ましくは、下記の配列番号３～５で表される配列が好ましい。
配列番号３：５’－ＣＴＡＴＣＡＡＡＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣ－３’
配列番号４：５’－ＣＧＣＴＡＴＣＡＡＧＡＣＡＴＣＴＣＣＧ－３’
配列番号５：５’－ＴＴＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣＡＡ－３’
　これらの配列における少なくとも１つ（好ましくは１～３個）の核酸はＬＮＡに置き換えられている。
　なかでも、下記で示される構造を有するＬＮＡプローブが好ましい。
６ＦＡＭ－５’／ＣＴＡＴＣＡＡ＋ＡＡ＋ＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣ／３’－ＢＨＱ１
５ＴＥＴ－５’／ＣＧＣＴＡＴＣＡＡ＋ＧＡ＋ＣＡＴＣＴＣＣＧ／３’－ＢＨＱ１
６ＦＡＭ－５’／ＴＴＴＧＧＣＣ＋ＣＧＣＣＣＡＡ／３’－ＢＨＱ１
　ここで、６ＦＡＭ－５’は、５’末端が６ＦＡＭで修飾されていることを、５ＴＥＴ－５’は、５’末端が５ＴＥＴで修飾されていることを、３’－ＢＨＱ１は、３’末端がＢＨＱ１で修飾されていることを示す。
　また、塩基の左隣の＋は、この塩基の核酸がＬＮＡに置き換えられていることを示す。
　ＬＮＡは自体公知の合成方法に従って合成することができる。
　増幅された変異ポリヌクレオチドの検出方法は、特に限定されないが、好ましくは、上述のように検出可能なように修飾されたプローブを、検出することによって、実施することができる。
　以下に、本発明を参考例、比較例および実施例によって更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．試薬
以下の参考例、比較例および実施例において、試薬（略号を用いる場合がある）は以下のものを使用した。 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
２．機器及び器具
以下の参考例、比較例および実施例において、機器及び器具は以下のものを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
参考例１　
　参考例１においては、ＥＧＦＲ遺伝子に変異を持たない野生型細胞である扁平上皮がん由来のＡ４３１細胞、ＥＧＦＲ遺伝子のＥｘｏｎ　１９に欠損をもつ非小細胞肺がん由来のＭａ－１細胞、ＥＧＦＲ遺伝子のＥｘｏｎ　２０にＴ７９０Ｍ型変異・Ｅｘｏｎ２１にＬ８５８Ｒ型変異をもつ非小細胞肺がん由来のＨ１９７５細胞を用いた。Ａ４３１細胞は１０％ＦＢＳと１／１００容のＰＳを添加したＤＭＥＭ培地で、非小細胞肺がん由来のＭａ－１細胞およびＨ１９７５細胞は１０％ＦＢＳと１／１００容のＰＳを添加したＲＰＭＩ培地で培養した。培養は５％炭酸ガス－９５％空気を気相とし３７℃に設定したＣＯ２インキュベーターで行った。
　変異検出のための細胞サンプルは以下のように調製した。培養した細胞をＰＢＳで洗浄後０．２５　ｖｏｌ％Ｔｒｙｐｓｉｎ－１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡを細胞がカバーする程度添加する。細胞が培養皿よりはがれたことを確認した後に０．２５　ｖｏｌ％Ｔｒｙｐｓｉｎ－１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡと等量以上の１０％ＦＢＳを含む培養液を添加し、細胞を回収する。遠心分離（９００ｒｐｍ，３分）後に上清を取り除き、細胞をＰＢＳに懸濁する。懸濁した細胞の数を計測し、以下の表１にしたがって細胞を４００μＬのＰＢＳ中で混和し細胞混和サンプルとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　比較例１
　参考例１で得た細胞混和サンプルからＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　ｍｉｃｒｏ　ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてキット添付のプロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。
　具体的には、下記のように抽出を実施した。
(1)検体４００μＬを８０００　ｒｐｍで遠心し、上清３６０μＬを除いた。
(2)残り４０μＬ（細胞層）にＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏ　ｋｉｔの添付のＢｕｆｆｅｒ　ＡＴＬ　１４０μＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ　２０μＬを添加し、ｖｏｒｔｅｘによる攪拌したのち、５６℃で１時間インキュベーションした。
(3)ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏ　ｋｉｔ添付のｃａｒｒｉｅｒ　ＲＮＡ　１μＬを添加し、ｖｏｒｔｅｘにより攪拌した。
(4)上記（３）の撹拌後の混合液を専用２ｍＬチューブに分注し、ＱＩＡｃｕｂｅシェーカーアダプターにセットした。
(5)試薬ボトルラック、チップラックをセットした。
(6)ＱＩＡｃｕｂｅ　１．５ｍＬコレクションチューブ、スピンカラムをローターアダブターにセットした。
(7)ＱＩＡｃｕｂｅ簡易マニュアルに従い、プロトコルを開始した（約７５分で終了した）。
(8)ＤＮＡをｂｕｆｆｅｒ　５０μＬで溶出した。
　すなわち、最終的にＤＮＡは５０μＬの溶液で抽出されることになる。このＤＮＡ溶液５０μＬのうちの１μＬと第１ＰＣＲ用プライマー（OPERON社製）各０．５μＭを用いてＰＣＲ（反応時最終容量は２０μＬ）増幅した（第１ＰＣＲ）。ＰＣＲの温度条件は、変性は９４℃、３０秒、伸長反応は５５℃、３０秒、サイクル数は４０サイクルとした。増幅したＰＣＲ産物を２０００倍希釈し、５μＬをＰＮＡ－ＬＮＡ　ＰＣＲ　クランプ法に供した。反応は２５μＬ容量で行い、反応液中には第２ＰＣＲ用プライマー（OPERON社製）各０．２μＭ、ＬＮＡプローブ（Integrated DNA Technologies社製）０．１μＭ、ＰＮＡ（Panagene社製）０．５～５μＭを含む。ＰＣＲの温度条件は、変性は９５℃、３秒、伸長反応は６２℃、３０秒、サイクル数は６０サイクルとした。ＰＣＲ増幅と蛍光検出は定量ＰＣＲ装置（Ｓｍａｒｔ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＩＩ　Ｓｙｓｔｅｍ、タカラバイオ株式会社）を用いた。ＬＮＡプローブの蛍光標識は、Ｃｙ３、Ｃｙ５あるいはＦＡＭを用いた。これらの方法は、公知の文献、Miyazawa Hら, Cancer Sci2008;99(3):595-600.、Tanaka Tら, Cancer Sci2007;98(2):246-52.、およびNagai Yら, Cancer Res 2005;65(16):7276-82の記載を参照して実施した。なお、測定するＥＧＦＲ変異はｅｘｏｎ１９欠失（Ｅ７４６－Ａ７５０　ｄｅｌ）およびｅｘｏｎ２１置換（Ｌ８５８Ｒ）とした。
　比較例１の結果を表２及び３に示す。ｅｘｏｎ１９欠失の検出を表２に、ｅｘｏｎ２１置換の検出を表３に示した。ｅｘｏｎ１９欠失（表２）では変異細胞数が１０細胞以下で正しく検出できない傾向があり、１細胞ではいずれの総細胞数でも変異を検出することが出来なかった。ｅｘｏｎ２１置換（表３）では変異細胞数が５０細胞以下で変異を正しく検出することができないものがあり、１０細胞ではいずれの総細胞数でも変異を検出することが出来なかった。なお変異の有無を１例で正しく評価できている部分（＋）に関しては同時再現性が低いものの測定数を増やすことにより変異の検出ができると可能性があると考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　各Ｎ＝２で実施
　＋＋：変異の有り無しを２例で正しく評価
　＋：変異の有り無しを１例で正しく評価
　－：変異の有り無しを正しく検出できず
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　　各Ｎ＝２で実施
　＋＋：変異の有り無しを２例で正しく評価
　＋：変異の有り無しを1例で正しく評価
　－：変異の有り無しを正しく検出できず
実施例１
　ＰＢＳ中の細胞（参考例１で得た細胞混和サンプル）を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を除いた後５μＬのＰＢＳを再添加し、更に、Ｐｉｃｏ　Ｐｕｒｅ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｒｃｕｔｕｒｕｓ社）付属のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　１０μＬを添加、緩やかに撹拌し、細胞を懸濁させた。懸濁液を６５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間加熱し、ＤＮＡ抽出液を得た。
　得られた抽出液の全量（１５μＬ）に、遺伝子欠失変異であるＥＧＦＲ遺伝子変異ｅｘｏｎ１９欠失（Ｅ７４６－Ａ７５０　ｄｅｌ）のため配列番号１で表されるＰＮＡ、または点変異であるＥＧＦＲ遺伝子変異ｅｘｏｎ２１置換（Ｌ８５８Ｒ）のため配列番号２で表されるＰＮＡを終濃度５μＭで添加し、ＰＣＲ増幅した。得られた増幅したＰＣＲ産物を２０００倍もしくは２００倍希釈し、５μＬをＰＮＡ－ＬＮＡ　ＰＣＲ　クランプ法に供した。
　次に細胞から効率的にＤＮＡを抽出し、１ｓｔＰＣＲ時に５μＭ　ＰＮＡを添加した方法（２０００倍希釈）を用いた結果を以下に示す。遺伝子欠失変異であるＥＧＦＲ遺伝子変異－ｅｘｏｎ１９欠失（Ｅ７４６－Ａ７５０　ｄｅｌ）－の検出を表４に、点変異であるＥＧＦＲ遺伝子変異－ｅｘｏｎ２１置換（Ｌ８５８Ｒ）－の検出を表５に示した。ｅｘｏｎ　１９欠失（表４）では変異細胞数が１細胞で正しく検出できない例があるものの変異の有無を２例中１例で正しく評価できている（＋）ため同時再現性が低いものの測定数を増やすことにより変異の検出ができる可能性があると考えられる。また、総細胞数１０細胞で変異の有無を正しく検出できないもの（－）があった。ｅｘｏｎ２１置換（表５）では変異細胞数が１細胞や１０細胞で変異を検出することができないものがあった（－）。一部では変異細胞数が５００細胞や５０細胞でも２例で正しく評価できないもの（－および＋）があったが、これは同じ総細胞数で変異の数が１００細胞、１０細胞と少なくなっても変異を正しく評価していたため偶発的なエラーと考えられる。その他、変異細胞数が１細胞で変異を２例中１例で検出できているもの（＋）があるが、これに関しては同時再現性が低いものの測定数を増やすことにより変異の検出ができると可能性があると考えられる。いずれの変異に関しても２０００倍希釈により検出感度が向上し、一桁の変異細胞数で変異を検出できる可能性があることがわかった。
　また、表４と前記表２との対比、および表５と前記表３との対比により、本発明の検出方法によれば、細胞サンプルにおける変異の有無をより正しく検出でき、特に100～10000細胞（好ましくは100～1000細胞）に1個の割合で存在する変異細胞をより正しく検出できることが明らかである。がん患者のＣＴＣを利用した転移性腫瘍細胞の遺伝子変異を検出する際には、100～10000細胞（好ましくは100～1000細胞）に1個のような非常に小さい割合で存在する変異細胞をより正しく検出できることが極めて重要であるため、本発明の検出方法は、臨床上の利用性が非常に高いと言える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　各N=2で実施
　＋＋：変異の有り無しを２例で正しく評価
　＋：変異の有り無しを1例で正しく評価
　－：変異の有り無しを正しく検出できず
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　各N=2で実施
　＋＋：変異の有り無しを２例で正しく評価
　＋：変異の有り無しを1例で正しく評価
　－：変異の有り無しを正しく検出できず
　さらに１ｓｔ　ＰＣＲ（５μＭ　ＰＮＡを添加）後の生成物を２００倍希釈してＰＮＡ－ＬＮＡ　クランプ法で測定する方法（２００倍希釈）による結果を以下に示す。遺伝子欠失変異であるＥＧＦＲ遺伝子変異－ｅｘｏｎ１９欠失（Ｅ７４６－Ａ７５０　ｄｅｌ）－の検出を表６に、点変異であるＥＧＦＲ遺伝子変異－ｅｘｏｎ２１置換（Ｌ８５８Ｒ）－の検出を表７に示した。ｅｘｏｎ１９欠失（表６）では変異細胞数が１細胞以下で正しく検出できない例があるものの変異の有無を２例中１例で正しく評価できている（＋）ため同時再現性が低いものの測定数を増やすことにより変異の検出ができる可能性があると考えられる。ｅｘｏｎ２１置換（表７）では変異細胞数が１細胞で変異を検出することができないものがあった（－）。一部では５００細胞や５０細胞でも２例で正しく評価できないもの（＋）があったが、これは同じ総細胞数で変異の数が１００細胞、１０細胞と少なくなっても変異を正しく評価していたため偶発的なエラーと考えられる。その他、変異細胞数が１細胞や１０細胞で変異を２例中１例で検出できているもの（＋）があるが、これに関しては同時再現性が低いものの測定数を増やすことにより変異の検出ができる可能性があると考えられる。２０００倍希釈（表４、５）と比較して大きくはないがわずかに改良が見られ、２００倍希釈で一桁の変異細胞数で変異を検出できる可能性があることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　各N=2で実施
　＋＋：変異の有り無しを２例で正しく評価
　＋：変異の有り無しを1例で正しく評価
　－：変異の有り無しを正しく検出できず
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　　各N=2で実施
　＋＋：変異の有り無しを２例で正しく評価
　＋：変異の有り無しを1例で正しく評価
　－：変異の有り無しを正しく検出できず
　以上より、実施例１は、比較例１と比べても、高感度にＣＴＣから変異ポリヌクレオチドの有り無しを正しく評価できることが判明した。
　以上、本発明によれば、高感度且つ簡便にＣＴＣから遺伝子変異情報を入手することが可能となる。すなわち、本発明は、がん患者の血液７．５ｍＬ中に数個程度しか含まれていないＣＴＣを利用した転移性腫瘍細胞の遺伝子変異の検出を可能とするので、患者に対する侵襲が少ない遺伝子検査が可能になり、がん患者に対する適切な治療薬の選択や創薬の臨床試験実施時の患者層別化が容易に行えることが期待でき、がんの治療をより効果的なものにするとともに、その副作用の軽減に寄与するので、臨床上の利用性が非常に高い。また、本発明の変異ポリヌクレオチドの検出方法によれば、細胞試料から得られたポリヌクレオチド溶液の一部でなく全量をＰＣＲ法に用いることができるため、変異ポリヌクレオチドを簡便に検出することができる。さらに、発明の実施に関しても、専用の装置等を必要とせず、一般的な臨床検査室に設置された機器や機材の利用が可能である。
配列番号１は、クランププライマーの塩基配列である。
配列番号２は、クランププライマーの塩基配列である。
配列番号３は、ＬＮＡプローブの塩基配列である。
配列番号４は、ＬＮＡプローブの塩基配列である。
配列番号５は、ＬＮＡプローブの塩基配列である。

Claims (13)

  1. 　以下の工程を含むことを特徴とする末梢循環腫瘍細胞の変異ポリヌクレオチドの検出方法。
    工程１：１～１００００個の末梢循環腫瘍細胞を含有する細胞試料を、プロテイナーゼＫ含有水性溶媒で抽出して、ポリヌクレオチド溶液を得るポリヌクレオチド溶液調製工程
    工程２：工程１で得られるポリヌクレオチド溶液の全量を含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付し、前記ポリヌクレオチド溶液に含有される可能性がある前記変異ポリヌクレオチドの検出標的領域を選択的に増幅させる増幅工程
    工程３：（１）工程２で得られる増幅産物および（２）前記変異ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＬＮＡであるプローブを含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付すことにより、前記変異ポリヌクレオチドの前記検出標的領域を選択的に増幅させて、当該変異ポリヌクレオチドを検出する検出工程
  2. 　以下の工程を含むことを特徴とする末梢循環腫瘍細胞の変異ポリヌクレオチドの検出方法。
    工程１：１～１００００個の末梢循環腫瘍細胞を含有する細胞試料を、プロテイナーゼＫ含有水性溶媒で抽出して、ポリヌクレオチド溶液を得るポリヌクレオチド溶液調製工程
    工程２：（１）工程１で得られるポリヌクレオチド溶液の全量、および（２）前記変異ポリヌクレオチドに対応する野生型ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＰＮＡであるクランププライマーを含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付し、前記ポリヌクレオチド溶液に含有される可能性がある前記変異ポリヌクレオチドの前記検出標的領域を選択的に増幅させる増幅工程
    工程３：（１）工程２で得られる増幅産物、（２）前記クランププライマー、および（３）前記変異ポリヌクレオチドの検出標的領域に完全に相補的な塩基配列からなるＬＮＡであるプローブを含有する反応液を、ＰＣＲ法による遺伝子増幅に付すことにより、前記変異ポリヌクレオチドの前記検出標的領域を選択的に増幅させて、当該変異ポリヌクレオチドを検出する検出工程
  3. 　前記プロテイナーゼＫ含有水性溶媒の容量が、５～２０μＬである請求項１または２に記載の検出方法。
  4. 　前記細胞試料が１～１０ｍＬのヒト血液に由来する請求項１または２に記載の検出方法。
  5. 　プロテイナーゼＫ含有水性溶媒が０．５～２ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ２０を更に含有し、かつ７～８のｐＨを有する請求項１または２に記載の検出方法。
  6. 　前記工程２において、反応液中のクランププライマーの濃度が０．１～１０μＭである請求項２に記載の検出方法。
  7. 　前記クランププライマーの塩基長が１０～３０塩基である請求項２に記載の検出方法。
  8. 　前記変異ポリヌクレオチドがＥＧＦＲ変異ポリヌクレオチドである請求項１または２に記載の検出方法。
  9. 　前記クランププライマーが配列番号１または２で示される塩基配列を有する請求項２に記載の検出方法。
  10. 　前記プローブの塩基長が１０～３０塩基である請求項１または２に記載の検出方法。
  11. 　前記プローブが配列番号３～５から選択されるいずれかで示される塩基配列を有する請求項１または２に記載の検出方法。
  12. 　前記クランププライマーが配列番号１で示される塩基配列を有し、かつ前記プローブが配列番号３または４で示される塩基配列を有する請求項２に記載の検出方法。
  13. 　前記クランププライマーが配列番号２で示される塩基配列を有し、かつ前記プローブが配列番号５で示される塩基配列を有する請求項２に記載の検出方法。
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