CN108070657A - 一种dna点突变定量检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种DNA点突变定量检测试剂盒，包括如下组分：2条外引物，其脱氧核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、2所示，2条内引物，其脱氧核苷酸序列分别如SEQ ID No.3、4所示；1条PNA探针，其脱氧核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；1条LAN探针，其脱氧核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；1条内标荧光探针，其脱氧核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。本发明的试剂盒通过PNA探针两次对野生型模板的抑制，极大程度地抑制了野生型模板的扩增，解决了PNA钳制不完全的问题。

Description

一种DNA点突变定量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及生物基因检测技术领域，特别涉及一种DNA点突变定量检测试剂盒。
背景技术
常用于临床检测基因突变的方法主要包括Sanger测序法、焦磷酸测序法、限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)等，这些方法灵敏度很低，只能检测大于5％～20％的突变样本，难以满足临床样本的检测需求。实时荧光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)、扩增阻滞突变系统(Amplification RefractoryMutation System，ARMS)、高分辨熔解曲线(High-resolution Melting,HRM)法、突变富集PCR(Mutant Enrichment PCR，mePCR)，低变性温度下的复合PCR扩增法(Coamplificationat lower denaturation temperature PCR，ColdPCR)等方法灵敏度与Sanger测序法比较有较大提高，能够检测大于1％的突变。但这些方法难以实现对含量小于1％的低丰度血浆ctDNA样本的检测，且这些方法均只能对突变进行定性检测，难以实现定量检测。目前灵敏度>1％，且能实现对突变含量的方法主要有数字PCR(Digital-PCR，dPCR)和下一代测序(Next-generation Sequencing，NGs)。数字化PCR是基于单分子PCR方法来进行计数的一种核酸绝对定量方法，目前主要包括BEAMing技术、微滴式(droplet dPCR，ddPCR)和芯片式(chip dPCR，cdPCR)。该方法可检测低至0.01％的基因突变，且可实现突变的绝对定量，但数字化PCR分析样品通量很低，每块芯片上万个反应单元都是针对单一样本的分析，而荧光检测技术的局限性限制了多个芯片的同时检测。此外，数字化PCR昂贵的精密仪器和昂贵的试剂成本也是制约其广泛应用的一个重要原因；下一代测序技术是一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的测序技术，它能将样本中所有基因片段的序列检测出来，然后通过序列判断是否存在基因突变。但高通量测序需要昂贵的测序仪和昂贵的测序试剂，一次测序的成本在1000美元左右，严重限制了它在临床的推广应用。此外，如何解读二代测序得到的海量序列信息，是制约下一代测序技术应用于临床的瓶颈因素。总之，上述方法要么灵敏度低，要么无法定量，要么操作繁琐，成本高等问题。因此，亟需开发一种高灵敏、可定量、简便快速和低成本的基因突变检测新方法。
PNA-LNA钳制PCR(PNA-LNA PCR clamp)是一种新颖的基于PNA钳制反应和LNA探针的突变检测方法，其灵敏度可达1％～0.1％左右，并且操作也十分简便，对仪器也无特殊要求。但该方法也存在两个问题：其一，PNA的钳制反应不完全。不能完全抑制野生型DNA的扩增，导致在检测低丰度突变时容易出现假阳性的结果，导致该方法只能检测>1‰的突变；其二，常规的钳制PCR扩增效率低，对于模板浓度极低的样本容易扩增失败造成假阴性的结果。为此，常采用巢式PCR的方法来提高钳制PCR的扩增强度和特异性，即用两对PCR引物扩增待检测的片段。在钳制PCR之前，用一对外引物进行预扩增，将预扩增的产物稀释后作为钳制PCR扩增模板进行钳制PCR扩增。巢式PCR的优势在于，即使第一次扩增产生了错误片断，第二次在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，这样巢式PCR的扩增特异性极高。此外，通过第一次预扩增，使得第二次扩增的模板浓度高，模板结构变简单，第二轮扩增的效率提高，扩增强度增强。但常规的分两步进行的巢式扩增容易造成样品的交叉污染，产生假阳性的结果。
发明内容
本发明的目的在于解决临床常用基因突变检测方法灵敏度低、检测成本高、难以实现定量等问题，也为了解决PNA-LNA钳制PCR钳制不完全和两步巢式PCR容易污染的问题。本发明创新性地将单管巢式PCR与PNA-LNA钳制PCR相结合，建立一种用于检测EGFR L858R突变位点的定量检测试剂盒。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：一种DNA点突变定量检测试剂盒，包括如下组分：
2条外引物，其脱氧核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、2所示，外引物其扩增产物包含了突变位点，外引物Tm值较高；
2条内引物，其脱氧核苷酸序列分别如SEQ ID No.3、4所示，2条内引物位于上下游外引物的内部，其Tm值较低；
1条PNA探针，其脱氧核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，为野生型位点特异，即只与野生型DNA完全互补(W-PNA)，与突变型DNA有一个碱基的错配；
1条LAN探针，其脱氧核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；为突变型位点特异，即只与突变型完全互补(M-LNA)，与野生型DNA有一个碱基的错配；
1条内标荧光探针，其脱氧核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，其与内引物扩增产物非突变位点序列互补，且不与LNA探针存在重叠序列。
本发明优选的技术方案中，所述的试剂盒还包括高保真Taq酶。
本发明的用于检测EGFR L858R突变位点定量检测试剂盒的使用方法如下：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)将上述的2条外引物和2条内引物、1条PNA探针、1条LAN探针、1条内标荧光探针、高保真Taq酶、高纯水和步骤(1)制备的DNA放入到一个反应体系中；
(3)在上述的反应体系中，以外引物为主进行第一轮PNA钳制反应。扩增时，设置退火温度68℃～72℃，由于外引物Tm值较高，能够与DNA模板互补；对于突变型DNA，W-PNA与突变型DNA之间存在碱基错配，W-PNA探针不能和突变型DNA互补，则突变型DNA能正常被外引物扩增。对于野生型DNA，由于W-PNA探针的抑制延伸作用，无法正常扩增，这样就进行了第一次的PNA钳制反应和突变型DNA的富集；
由于外引物的浓度较低，在10～20个循环的预扩增以后，外引物被消耗完，不会对其后的内引物扩增造成干扰；内引物由于Tm值较低，在高退火温度下不会对外引物扩增造成影响。
(4)在上述的反应体系中，以内引物为主进行第二轮PNA钳制反应，以步骤(3)扩增得到的产物为模板。扩增时，设置退火温度56℃～62℃，这时内引物能和所述模板互补；对于突变型DNA，由于W-PNA与突变型DNA存在错配，在相应退火温度下不能与突变DNA结合，则突变型DNA能正常被内引物扩增。对于野生型DNA，由于W-PNA探针的抑制延伸作用，无法正常扩增，这就第二次抑制了野生型DNA，富集了突变型DNA；
(5)最后，反应体系中的LNA荧光探针与突变型DNA扩增产物结合，并产生荧光，通过荧光信号强弱和标准曲线来监测PCR扩增体系中突变型DNA的含量。优选地，外引物Tm值为68℃～72℃，其扩增产物包含了突变位点。
其中，LNA探针5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有TAMA淬灭基团；内标探针5’端标记有HEX荧光基团，3’端标记有BHQ1淬灭基团。
步骤(3)中，第一轮PNA钳制反应，热循环反应设置为先95℃保持30sec；然后95℃，5sec、再68℃34sec，循环15次。
步骤(4)中，第二轮PNA钳制反应，热循环反应设置为先95℃保持5sec；然后降温到56℃,34sec，一共循环40次。
步骤(1)中，待测样品包括但不限为如组织、全血或血浆的DNA。
步骤(3)中，第一轮PNA钳制反应主要由外引物完成；扩增时，设置较高的退火温度(68℃)，内引物IP-F和IP-R由于Tm值较低(60℃)，无法与DNA模板互补，不会对外引物的扩增造成影响。2条外引物(OP-F、OP-R)和W-PNA探针的Tm值较高(～69℃)能够与DNA模板互补。由于PNA探针具有(1)不能被DNA聚合酶识别作为引物延伸，(2)PNA/DNA的亲和性和热稳定性比DNA/DNA强，(3)PNA/DNA对碱基错配敏感，一个碱基的错配可使Tm值降低8℃～20℃(平均15℃)等三个特点。对于野生型模板，由于PNA探针的抑制延伸(Elongation arrest)作用，无法正常扩增。但对于突变型模板，由于W-PNA探针与之存在一个碱基的错配，PNA/DNA的稳定性降低，在该退火温度下，PNA探针不能和突变型DNA互补，则OP-F、OP-R能对突变型DNA模板进行正常扩增。结果，突变型DNA能正常扩增，野生型DNA扩增被抑制，这样就进行了第一次的PNA钳制反应和突变型DNA的富集。由于外引物的浓度较低，在10～20个循环的预扩增以后，外引物被消耗完，不会对其后的内引物扩增造成干扰。
步骤(4)中，以内引物为主进行第二轮PNA钳制反应；以外引物预扩增的产物为模板，进行内引物扩增。扩增时，设置较低的退火温度(60℃)，这时内引物IP-F和IP-R均能和模板互补。对于第一轮扩增产生的少量野生型DNA模板，由于PNA探针的抑制延伸(Elongation arrest)作用，无法正常扩增。由于PNA不能被DNA聚合酶识别作为引物延伸，野生型DNA的扩增再次被阻止。由于PNA探针与突变型DNA存在错配，在相应退火温度(60℃)下不能与突变DNA结合，也就不会阻碍突变型DNA的扩增，这就第二次抑制了野生型DNA富集了突变型DNA。
步骤(5)中，反应体系中的LNA荧光探针会与突变型DNA扩增产物结合并产生荧光。由于LNA探针为突变型特异，且LNA探针对突变敏感，一个碱基的错配可使Tm值降低3℃～8℃。此外，突变型的LAN探针与野生型的PNA探针存在序列重叠，加入的野生型PNA探针对野生型DNA的高亲和性会阻止突变型LNA探针与野生型DNA的杂交。因此，LNA探针可特异性的检测突变型DNA产物，进一步提高本方法的特异性。内标探针既可以与野生型产物互补，也可以与突变型产物互补。因此，其荧光信号可用来监测PCR扩增体系。
为了解决PNA-LNA钳制PCR和两步巢式PCR存在的问题，本发明建立了一种基于单管巢式PCR和双重肽核酸(PNA)钳制反应的低含量DNA点突变定量检测方法的试剂盒。该试剂盒通过对巢式扩增时内、外引物的Tm差异和热循环温度控制，建立了单管巢式PCR法，解决了两步巢式PCR容易造成污染的问题。并在单管巢式PCR扩增的同时，加入一条与野生型DNA互补的PNA探针和一条突变型互补的LAN探针。通过PNA探针两次对野生型DNA的抑制，极大程度地抑制了野生型DNA的扩增，解决了钳制PCR技术存在的PNA钳制反应不完全的问题。最后通过荧光标记的LNA探针，来特异性的检测巢式PCR的扩增产物。
这样，通过PNA探针两次对野生型模板的抑制，极大程度地抑制了野生型模板的扩增，解决了PNA钳制不完全的问题。同时，利用扩增引物Tm值差异和扩增时退火温度控制，使巢式PCR能在单管中进行，增强了扩增强度和扩增特异性。使拷贝数极低的临床样本(如血浆ctDNA)的扩增成为了可能。最后，通过实时荧光的闭管检测，既实现了实时检测，又避免了样品的交叉污染，还实现了突变的定量。此外，本发明方案只需要普通实时荧光PCR仪器，且在2h内就能得到检测结果，试剂成本低，可实现对样品的快速、低成本检测。总之，本发明的试剂盒，为临床DNA点突变的检测提供一种高灵敏、高特异、简便快速、无污染和低成本的检测新途径。
附图说明
图1为基于单管巢式PCR和双重肽核酸(PNA)钳制反应的突变定量检测方法原理；
图2为本发明的试剂盒来进行检测的热循环设定；
图3利用发明的试剂盒来进行临床样本检测的典型结果；图3.A为发明的试剂盒的标准曲线；图3.B为发明的试剂盒检测EGFR L858R位点在非小细胞肺癌肿瘤组织样本中突变阳性的典型结果；图3.C为发明的试剂盒检测EGFR L858R位点在非小细胞肺癌血浆样本中突变阳性的典型结果；图3.D为发明的试剂盒检测EGFR L858R位点在非小细胞肺癌肿瘤组织样本中突变阴性的典型结果；图3.E发明的试剂盒检测EGFR L858R位点在非小细胞肺癌血浆样本中突变阴性的典型结果；
图4为本发明试剂盒和PNA-LNA钳制PCR法在扩增灵敏度和突变检测灵敏度上的差异；图4A为PNA-LNA钳制PCR法的扩增灵敏度；图4.B为使用本发明试剂盒的扩增灵敏度；图4C为PNA-LNA钳制PCR法的突变检测灵敏度；图4D为使用本发明试剂盒进行突变检测的灵敏度。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据研究者的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
介绍和概述
本发明通过举例而非给出限制的方式来进行说明。应注意的是，在本公开文件中所述的“一”或“一种”实施方式未必是指同一种具体实施方式，而是指至少有一种。
下文将描述本发明的各个方面。然而，对于本领域中的技术人员显而易见的是，可根据本发明的仅一些或所有方面来实施本发明。为说明起见，本文给出具体的编号、材料和配置，以使人们能够透彻地理解本发明。然而，对于本领域中的技术人员将显而易见的是，本发明无需具体的细节即可实施。在其他例子中，为不使本发明费解而省略或简化了众所周知的特征。
将各种操作作为多个分立的步骤而依次进行描述，且以最有助于理解本发明的方式来说明；然而，不应将按次序的描述理解为暗示这些操作必然依赖于顺序。
将根据典型种类的反应物来说明各种实施方式。对于本领域中的技术人员将显而易见的是，本发明可使用任意数量的不同种类的反应物来实施，而不只是那些为说明目的而在这里给出的反应物。此外，也将显而易见的是，本发明并不局限于任何特定的混合示例。
实施例一
本发明建立了一种高灵敏的点突变的检测方法，为了评估本方法对临床样本的检测情况。我们将本方法应用于非小细胞肺癌血浆和组织样本中靶向用药相关的EGFR L858R突变位点进行检测。
EFGR是非小细胞肺癌的常见驱动基因，其突变主要发生在18/19/20/21外显子。EGFR L858R(NCBI索取号:NG_007726.1)是EGFR基因21外显子编码的第858个氨基酸由亮氨酸变成了精氨酸，该突变可引起EGFR下游通路的激活，进而导致肿瘤的发生。易瑞沙(Iressa)和特罗凯(Tarceva)是常见的EGFR酪氨酸激酶抑制剂，也是目前非小细胞肺癌治疗常用的靶向药物。大量研究表明，EGFR L858R是易瑞沙和特罗凯的敏感突变之一，易瑞沙和特罗凯对EGFR L858R突变患者的有效率远远高于EGFR L858R未突变的患者。因此，美国国立综合癌症网络(NCCN)指南和中国卫生部公布的抗肿瘤药物临床应用指导原则均规定，在使用瑞沙(Iressa)和特罗凯等酪氨酸激酶抑制剂前要先对患者EGFR基因的敏感突变(如EGFR L858R)进行检测，根据突变检测结果制定个体化的靶向药物治疗方案。
1.引物与序列：EGFR L858R所需的内、外引物和探针如表1所示，其中，2条外引物为OP-F和OP-R，其序列如SEQ ID No.1、2所示，2条内引物为IP-F和IP-R，其序列如SEQ IDNo.3、4所示，1条PNA探针为W-PNA，其序列如SEQ ID No.5所示，1条LAN探针为M-LNA Probe，其序列如SEQ ID No.6所示；及一内标探针，其序列如SEQ ID No.7所示。
表1.本发明试剂盒检测EGFR L858R所需的引物与探针
2.组织和血浆样本提取。采用The Simgen Circulating Nucleic Acid Kit提取血浆ctDNA样本。采用DNeasy Blood&Tissue Kit提取肿瘤组织中的DNA。
3.试剂配方：50μl反应试剂配方为：Premix ExTaq(Probe)1×，OP-F,OP-R各0.05μM，IP-F,IP-R各0.2μM，参比荧光ROX-II为1×，M-LNA probe为0.6μM，W-PNA为0.8μM，内标探针为0.4μM，ddH2O补足体系到50μl。
4.热循环程序和标准曲线的设置：热循环为：95℃，30sec；15次(95℃，5sec；68℃,34sec)，再40次(95℃，5sec；60℃,34sec)。以105,104,103,102,101的已知拷贝数的EGFR阳性细胞DNA为标曲。
5.样本检测典型结果
对100例肺癌组织样本和100例血浆样本的ctDNA进行了检测，典型结果如图3所示。由图3可知，本发明方法可定量检测EGFR L858R在组织和血浆样本中的突变情况。
实施例二
本发明试剂盒是对PNA-LNA钳制PCR技术的发展和改进，因此将本发明的方法和PNA-LNA钳制PCR技术进行了比较实验。主要比较了这两种方法在扩增灵敏度和突变检测灵敏度方面的差异。
1.本发明实验组和对照组1的引物与序列同实施例一；
2.已知含量的标准品的制备：含有突变型EGFR L858R的NCI-H1975细胞以及含有野生型EGFR L858R的H293T细胞均购自American Type Culture Collection公司(Rockville，美国)；
将细胞中的EGFR L858R野生型和突变型DNA用数字化PCR定量后，分别作为野生型和突变型DNA的已知含量的标准品。将已知浓度的EGFR L858R突变型细胞DNA按10倍递增稀释的方法稀释成104，103，102，101和100的不同浓度作为扩增模板，用来评价扩增灵敏度。在105的EGFR L858R野生型细胞DNA中，分别加入105，104，103，102，101，5和100的EGFR L858R突变型细胞DNA，形成50％(M:W＝105：105)，10％(M:W＝104：105)，1％(M:W＝103：105)，1‰(M:W＝102：105)，0.1‰(M:W＝101：105)，0.05‰(M:W＝5：105)和0.01‰(M:W＝100：105)的野生型和突变型DNA的混合物，用来评价突变检测的灵敏度；
3.试剂配方：
本发明实验组的试剂配方同实施例一；
对照组1PNA-LNA钳制PCR技术配方为：50μl反应试剂配方为：Premix ExTaq(Probe)1×，IP-F,IP-R各0.2μM，参比荧光ROX-II为1×，M-LNA probe为0.6μM，W-PNA为0.8μM，内标探针为0.4μM，ddH2O补足体系到50μl；
4.热循环程序的程序设置：
本发明实验组的热循环程序同实施例一；
对照组1PNA-LNA钳制PCR技术热循环程序为：95℃，30sec；40次(95℃，5sec；60℃,34sec)。
5.本发明实验组方法和对照组1PNA-LNA钳制PCR技术灵敏度比较结果。
结果如图4所示，对于扩增灵敏度，PNA-LNA钳制PCR技术能扩增>10拷贝的模板，低于10拷贝则无法进行准确扩增(图4A)；本发明建立的方法能扩增>1拷贝的模板，扩增灵敏度提高了10倍(图4B)。对于突变检测灵敏度，PNA-LNA钳制PCR技术能检测>1‰的突变，与文献报道一致(图4.C)。本发明建立突变检测方法能检测>0.1‰的突变，突变检测灵敏度提高了10倍(图4D)。可知本方法在灵敏度上与已有方法相比有大幅的提高，可以实现对低拷贝数和低丰度的点突变样本进行检测。
实施例三
为了评估了本发明对临床样本检测的准确性，将本方法检测结果与数字化PCR结果进行了比较。数字化PCR是一种基于单分子PCR方法来进行计数的核酸绝对定量方法，该方法可检测低至0.01％的基因突变，且可实现突变的绝对定量。是目前临床点突变检测领域应用较为广泛的一种方法。为此，我们将本发明试剂盒检测与ddPCR检测结果进行比较，来评价本发明试剂盒检测的准确性。
1.本发明实验组和对照组2的引物与序列同实施例一，
2.组织样本提取方法同实施例一，
3.试剂配方：
本发明实验组的试剂配方同实施例一；
对照组2数字化PCR采用PrimePCRTM ddPCRTM Mutation Assay(EGFR,p.L858R,Human)试剂盒，试剂配方按照该试剂盒的说明书，
4.热循环程序的程序设置：
本发明的热循环程序同实施例一；
对照组2数字化PCR热循环程序按试剂盒说明书的要求设置，
5.本发明方案和ddPCR结果比较。
结果如表1所示。由表1可知，100例肿瘤组织中ddPCR检测到25例EGFR L858R突变，75例EGFR L858R阴性。对于25例ddPCR检测为阳性的样本，而本发明试剂盒检测结果均为阳性。对于75例ddPCR检测结果为阴性的样本，本发明的试剂盒检测结果均为阴性。两者的一致性为100％，如果以ddPCR为金标准方法，则本研究建立的方法的灵敏度为100％，特异性也为100％，表明了本发明的试剂盒能准确的对EGFR L858R位点进行检测。
以上所述具体实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进或替换，这些改进或替换也应当视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州大学附属第一医院
<120> 一种DNA点突变定量检测试剂盒
<160> 7
<210> 1
<211> 26
<212> 外引物OP-F
<213> 人工合成
<400> 1
ctacttggag gaccgtcgct tggtgc 26
<210> 2
<211> 27
<212> 外引物OP-R
<213> 人工合成
<400> 2
cctggtccct ggtgtcagga aaatgct 27
<210> 3
<211> 22
<212> 内引物IP-F
<213> 人工合成
<400> 3
cagcatgtca agatcacaga tt 22
<210> 4
<211> 20
<212> 内引物IP-R
<213> 人工合成
<400> 4
ccttactttg cctccttctg 20
<210> 5
<211> 11
<212> PNA探针
<213> 人工合成
<400> 5
tgggctggcc a 11
<210> 6
<211> 14
<212> LAN探针
<213> 人工合成
<400> 6
6-FAM-ttgggcgggc caaa-TAMRA 14
<210> 7
<211> 23
<212> 内标探针
<213> 人工合成
<400> 7
HEX-tggtattctt tctcttccgc acc-BHQ1 23

Claims (2)

1.一种DNA点突变定量检测试剂盒，包括如下组分：
2条外引物，其脱氧核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、2所示，2条内引物，其脱氧核苷酸序列分别如SEQ ID No.3、4所示；1条PNA探针，其脱氧核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；1条LAN探针，其脱氧核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；1条内标荧光探针，其脱氧核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括高保真Taq酶。
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