CN110669839B

CN110669839B - 一种检测egfr基因t790m突变的人工模拟分子信标与试剂盒

Info

Publication number: CN110669839B
Application number: CN201810712122.1A
Authority: CN
Inventors: 葛猛; 余倩; 潘世让; 王宏伟
Original assignee: Beijing Fuanhua Biotech Co ltd
Current assignee: Beijing Fuanhua Biotech Co ltd
Priority date: 2018-07-03
Filing date: 2018-07-03
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2038-07-03
Also published as: CN110669839A

Abstract

本发明公开了一种检测EGFR基因T790M突变的人工模拟分子信标与试剂盒。本发明公开的检测EGFR基因T790M突变的分子信标的序列为序列表中序列3，该分子信标满足：序列3的第2位为5‑甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第6位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第22位为5‑甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第26位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第13位和第16位均为锁核苷酸残基，序列3的其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基。本发明公开的检测EGFR基因T790M突变的分子信标与方法灵敏高，结果准确，检测速度快，操作简单，结果判读客观，非常适合于在临床中大规模开展。

Description

一种检测EGFR基因T790M突变的人工模拟分子信标与试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种检测EGFR基因T790M突变的人工模拟分子信标与试剂盒。

背景技术

对于肿瘤患者而言，外周血循环肿瘤细胞以及游离肿瘤DNA(ctDNA)可一定程度上反映肿瘤的遗传学特征，而且无创、易获得。外周血中来源于坏死、凋亡肿瘤细胞或外泌体的DNA碎片被称为循环肿瘤DNA(ctDNA)，能在一定程度上克服局部穿刺组织的时间和空间异质性，更好地反应整个肿瘤的遗传学特性，同时其获取简单、能实时检测和监测驱动基因、尤其耐药相关基因变异的特点，且价格低廉，可广泛用于临床实践。近年诸多研究评价了血浆ctDNA用于驱动基因突变检测的临床可行性，其中研究最多且最可能用于临床实践的是EGFR突变检测。目前多项研究结果显示，外周血进行EGFR突变检测，与组织标本的一致性约为70％～85％，敏感性为60％～85％，特异性为92％～100％。因此，基于外周血ctDNA的实时、定量、动态基因检测是肺癌精准治疗的基石。

在临床实践中，对患者进行重复活检并不容易，并且有10％～20％的患者活检样本不能提供足够量的组织进行分子学检测；而基于外周血的微创检测方法可以对ctDNA动力学和耐药的发生进行动态监测，还可能捕捉到肿瘤异质性的信息。尽管ctDNA在血液中的浓度低，所占比例也低，但随着检测技术的不断发展，已有敏感性高检测技术应用于临床研究和实践。EGFR敏感突变NSCLC的获得性耐药机制表现复杂、多样，因此，必须对耐药进行动态检测；其中，T790M突变在EGFR-TKI获得性耐药中占50％～60％。所以，检测是否存在T790M突变对于指导EGFR敏感突变NSCLC患者的治疗非常重要。

目前，用于液体活检的技术主要有ARMS-PCR、BEAMing数字PCR、下一代测序(NGS)等，大多数外周血T790M突变检测技术的敏感性为0.1％-1％。对单一T790M突变而言，ARMS-PCR技术为组织样本常用的检测方法，也有优化为血浆样本的试剂盒，但是ARMS-PCR检测野生型样本普遍存在扩增曲线翘尾现象，容易造成假阳性误判；BEAMing/ddPCR灵敏度高，但是操作繁琐、成本较高；NGS技术对于耐药后的多基因联合检测有较强的优势，但是成本高，周期长。因此，临床上需要一种简便快捷、灵敏度高而又经济实惠的检测外周血中T790M突变的检测方法。

分子信标(Molecular Beacon)在空间结构上呈发夹型，由环状区和茎干区组成，环状区与靶DNA序列互补，长约15-35个核苷酸，茎杆区长约5-7个核苷酸，由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成，分子信标的5′端标记荧光基团(F)，3′端标记淬灭基团(Q)。对于分子信标来说，自由状态时，荧光基团与猝灭基团靠近(约为7-10nm)。此时发生荧光共振能量转移,使荧光基团发出的荧光被猝灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。当分子信标的环状区与序列完全互补的靶DNA杂交形成双链杂交体时，分子信标茎杆区被拉开，荧光基团和猝灭基团距离增大。根据Foerster理论,中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，因此，杂交后，分子信标的荧光几乎100％恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中靶DNA的量成正比(图1)。因此，理想的分子信标比Taqman水解探针更为高效。然而，由于分子信标中与靶序列无关的茎杆区的引入导致分子信标与模板序列之间常会产生一些非特异性相互作用，从而导致背景信号增强，进而影响检测效率。而要消除这种背景信号，就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要求。此外，研究显示分子信标在环状区序列较短时，用于检测基因突变(包括单碱基的错配、缺失或插入突变)效果较好，但实际上，很多时候，由于特定靶序列区的GC含量较低，往往会导致环状区序列过长，从而影响检测效率。因此，得到一个理想的分子信标往往比较困难。

针对碱基的修饰改造也就是人工模拟的非天然核苷酸对的研究发展至今已有近40年的历史，这其中异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸(isoC-isoG)及其衍生物5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸(iso^MeC-isoG)中的人工核苷酸对堪称经典。有关isoC-isoG中的核苷酸对的研究工作最早是由美国著名合成生物学家Benner SA开展的，其团队实现了异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸(isoC-isoG)的人工扩展核酸在体外的复制、转录乃至翻译的整个中心法则。如图2所示，isoC和isoG分别是天然核苷酸C和G的异构体,它们自身可以完美配对，但无法与天然核苷酸之间形成配对。

除了以上人工对碱基结构的改造，还有一大类基于对碱基糖环的改造的非天然核酸，如锁核酸(LNA)。LNA泛指含有一个或多个LNA单体(锁核苷酸)的寡核苷酸序列，是一类近年来迅速发展起来的并且已经在分子诊断、基因治疗等领域得到广泛应用的人工模拟核酸。如图3所示，LNA单体的戊糖环的2’-O和4’-C之间形成了一个亚甲基桥。LNA不改变天然核酸的碱基配对，但相对于天然核酸有着更强的亲和力以及更强的错配识别能力。

发明内容

基于一种新型的基于人工模拟核酸的分子信标，本发明提供了一种新型的检测EGFR基因T790M突变的分子信标与试剂盒。

本发明提供的分子信标的序列为序列表中序列3，所述分子信标满足：

序列3的第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基(iso^MeC)，第6位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基(isoG)，第22位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基(iso^MeC)，第26位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基(isoG)，第13位和第16位均为锁核苷酸残基(+C和+G)，序列3的其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基。

上述分子信标茎环区靶向EGFR基因T790M突变位点。所述T790M突变位点是指序列1中所示的EGFR基因片段中的第73位的C的突变。所述T790M突变具体可为序列2中所示的EGFR基因片段中的第73位的C突变为T。

上述分子信的两端还可标记有荧光基团和淬灭基团。所述荧光基团发出的荧光可被所述猝灭基团吸收。所述荧光基团和所述淬灭基团位于所述基础分子信标的5′末端和3′末端，所述荧光基团和所述淬灭基团的位置可以交换，只要满足自由状态下的基础分子信标中的荧光基团发出的荧光可被淬灭基团淬灭即可。所述荧光基团具体可为FAM、Hex、TET、Cy3或JOE；所述淬灭基团具体可为Dabcyl或TAMRA。

本发明还提供了检测EGFR基因是否含有T790M突变的成套试剂，所述成套试剂由上述分子信标与能从人基因组中扩增得到含有所述分子信标茎环区识别序列的引物对组成。

上述成套试剂中，所述引物对可由序列表中序列1的第21-39位所示的单链DNA和与序列表中序列1的第92-110位互补的单链DNA组成。

上述成套试剂中，所述分子信标与所述引物对均独立包装。所述引物对中的两条单链DNA的摩尔比为1:1。所述成套试剂中所述分子信标与所述引物对的两条单链DNA的摩尔比可为2:5:5。

为解决上述技术问题，本发明还提供了检测EGFR基因是否含有T790M突变的试剂盒，所述试剂盒含有所述分子信标或所述成套试剂。

所述试剂盒还可包括利用分子信标检测DNA所需的其他试剂。所述其他试剂具体可为含有EGFR基因中含有T790M突变位点及其上下游的DNA片段的重组质粒、可检测DNA质量的内控探针和内控引物对、dNTPs、MgCl₂和/或DNA聚合酶。

所述试剂盒具体可由所述分子信标或所述成套试剂与所述其他试剂组成。

所述重组质粒具体可为含有序列表中序列2所示DNA片段的质粒。所述内控引物对可由序列表中序列4和5所示的两条单链DNA组成。所述内控探针的序列可为序列表中序列6。所述内控探针满足：序列6的第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第6位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第27位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基(iso^MeC)，第31位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基(isoG)，序列6的其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基，所述内控探针还标记有所述荧光基团和所述淬灭基团。所述DNA聚合酶可为EX Taq DNA聚合酶。

本发明还提供了检测EGFR基因是否含有T790M突变的方法，所述方法包括：利用所述分子信标或所述成套试剂检测待测样本，根据待测样本中荧光信号的变化确定所述待测样本中EGFR基因是否含有T790M突变。

如所述待测样本的扩增曲线为S型曲线，则所述待测样本的EGFR基因含有或候选含有T790M突变；如所述待测样本的扩增曲线非S型曲线，则所述待测样本的EGFR基因不含或候选不含T790M突变。

所述利用所述分子信标或所述成套试剂检测待测样本具体可利用所述分子信标或所述成套试剂检测所述待测样本的DNA。

在利用所述分子信标或所述成套试剂检测所述待测样本的DNA时，还可先对所述待测样本DNA的质量进行检测，在所述待测样本DNA的质量满足要求时进一步确定所述待测样本中是否含有T790M突变。

所述待测样本具体可为外周血。所述待测样本进一步可为游离肿瘤DNA(ctDNA)。

本发明利用针对EGFR基因T790M突变位点的基于人工模拟核酸的分子信标结合荧光定量PCR技术对EGFR基因T790M突变进行检测，本发明的检测EGFR基因T790M突变的分子信标与方法方便快捷、成本低、具有极高的灵敏度和特异性，低至3个拷贝的突变即可检出。

附图说明

图1为分子信标工作原理。

图2为不同核苷酸对中碱基对的配对方式。其中，R均表示脱氧核苷酸的非碱基部分。

图3为锁核苷酸残基的结构。其中，Base表示碱基。

图4为实施例2的T790M-ANABMB和引物对A1对标准品样本1的检测结果。

图5为实施例2的T790M-ANABMB和引物对A1对标准品样本2的检测结果。

图6为实施例2的对照ARMS-PCR引物和探针对标准品样本2的检测结果。

图7为实施例3的T790M-ANABMB的灵敏度的检测结果。1-5分别为3000、300、30、3拷贝/μL以及NTC的结果。

图8为实施例3的T790M-MB的灵敏度的检测结果。1-5分别为3000、300、30、3拷贝/μL以及NTC的结果。

图9为本发明检测临床样本典型扩增曲线。

图10为对照试剂盒检测临床样本典型扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所用到的EGFR基因无T790M突变野生型DNA片段为：

TGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCT(序列1)。

EGFR基因T790M突变位点及上下游序列为：

TGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCT(序列2)，其中，加粗部分为突变位点。

实施例1、利用EGFR基因T790M的ANAB-MB检测临床样本方法的建立

一、引物对及分子信标的合成

设计并合成能扩增包含EGFR基因T790M突变位点DNA片段的EGFR基因特异性引物对，将该引物对命名为引物对A1，引物对A1由T790M-F和T790M-R组成，其序列如下：

T790M-F:5'-CACGTGTGCCGCCTGCTGG-3'；

T790M-R:5'-GACATAGTCCAGGAGGCAG-3'。

设计并合成基于EGFR基因T790M突变位点上下游序列的含有非天然核苷酸对iso^MeC-isoG和锁核苷酸的ANAB-MB，将其命名为T790M-ANABMB，具体如下：

T790M-ANABMB：

(序列3)。

未经非天然核苷酸修饰的对照分子信标为：

T790M-MB：FAM-CCATCGCAGCTCATCATGCAGCTCCGATGG-Dabcyl。

T790M-ANABMB中，FAM为荧光基团，Dabcyl为淬灭基团；方框部分为茎杆区序列；下划线部分为环状区，可以识别靶序列；加粗部分为对应于EGFR基因T790M突变位点的核苷酸；*G表示非天然核苷酸异鸟嘌呤核苷酸残基(isoG)，*C表示非天然核苷酸5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基(iso^MeC)；+G和+C均为锁核苷酸残基。

二、方法的建立

检测EGFR基因T790M突变的具体步骤如下：以混入阳性质控的重组质粒的血浆游离DNA为模板，采用引物对A1及T790M-ANABMB进行实时荧光定量PCR。荧光定量PCR检测试剂EX Taq DNA聚合酶与dNTPs(含有四种dNTP，每种的含量均相等)、反应缓冲液均为TAKARA公司产品。用于提取血浆游离DNA的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit为凯杰生物技术(上海)有限公司产品。引物对A1及T790M-ANABMB均由北京梓熙生物科技有限公司合成。

1、反应体系与反应条件的优化

反应体系与反应条件优化的基础体系与条件如下：

20μL反应体系：qPCR混合反应液(表1)10μL、T790M-F 1μL(在反应体系中的浓度为0.5μM)、T790M-R 1μL(在反应体系中的浓度为0.5μM)、T790M-isoMB 0.5μL(在反应体系中的浓度为0.2μM)、模板5μL和无核酸酶水2.5μL。

表1、qPCR混合反应液各组分在反应体系中的浓度

组分	浓度
		MgCl<sub>2</sub>	2mM
EX Taq DNA聚合酶	5U/μL
		dNTPs	2.5mM
反应缓冲液	1×

反应体系配好后上机，使用定量PCR仪ABI7500。基础反应条件：95℃预变性10分钟，95℃15秒，62℃40秒，扩增反应44循环，在62℃40秒阶段收集荧光。

(1)引物浓度的优化：在反应体系其它条件相同的情况下，调整引物T790M-F和T790M-R的浓度，引物在反应体系中的浓度分别为0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.8μM和1.0μM。反应条件同上基础反应条件。

结果显示，引物浓度为0.5μM时的反应体系的扩增效果最好，确定反应体系中最佳引物浓度是0.5μM。

(2)探针浓度的优化：在反应体系其他条件相同的情况下，调整T790M-ANABMB的浓度，T790M-ANABMB在反应体系中的浓度分别为0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM和0.5μM。反应条件同上基础反应条件。

结果显示，T790M-ANABMB浓度为0.2μM时的反应体系的扩增效果最好，确定反应体系中T790M-ANABMB最佳浓度是0.2μM。

(3)酶的优化：在反应体系其他条件相同的情况下，使用不同的DNA聚合酶，所用的DNA聚合酶分别为EX Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶，每个反应体系一种DNA聚合酶，各DNA聚合酶在反应体系中的浓度均相同。反应条件同上基础反应条件。

结果显示，EX Taq DNA聚合酶的反应体系的扩增效果最好，确定最佳DNA聚合酶为EX Taq DNA聚合酶。

(4)镁离子浓度的优化：在反应体系其它条件相同的情况下，调整镁离子在反应体系中的浓度，镁离子在反应体系中的浓度分别为0.5mM、1.0mM、2.0mM、3.0mM和4.0mM。反应条件同上基础反应条件。

结果显示，镁离子浓度是2mM时的反应体系的扩增效果最好，确定反应体系中最佳镁离子浓度是2mM。

(5)退火温度的优化：反应体系为基础反应体系，在反应的其他条件相同的情况下，调整退火温度进行梯度PCR(退火温度分别为58℃、60℃、62℃和64℃)。

结果显示，退火温度是62℃时的反应体系的扩增效果最好，确定最佳退火温度是62℃。

由此得到上述基础反应体系即为最佳反应体系，基础反应条件即为最佳反应条件。

2、试剂盒的制备

利用上述引物对A1、T790M-ANABMB以及内控探针、内控引物对、反应缓冲液；dNTPs；MgCl₂溶液；EX Taq DNA聚合酶以及无核酸酶水作为试剂盒的组分，制备检测EGFR基因T790M突变的试剂盒。

其中，内控探针和内控引物对的作用是对提取的DNA质量进行监控，其引物序列分别为：

EGFR-F：5'-CTGGGCATCTGCCTCACC-3'(序列4)；

EGFR-R：5'-TCCCGGACATAGTCCAGGA-3'(序列5)；

EGFR-P：

(序列6)。

该试剂盒还可以包括阳性质控和阴性质控。阳性质控为人工合成的含有T790M突变的EGFR基因片段的重组质粒，该质粒为将大肠杆菌克隆载体pUC57(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)中的EcoRV和SmaI识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的DNA片段得到的重组质粒。阴性质控为无核酸酶水。

3、结果判读

确定待测样本的EGFR基因是否含有T790M突变的方法如下：

若内控管扩增曲线为非S型曲线或Ct＞35，表明该实验失败，需重新提取DNA或更换模板；

若内控管的扩增曲线为S型曲线且Ct≤35，则可根据检测管中的扩增曲线确定待测样本的EGFR基因是否含有T790M突变：如检测管中的扩增曲线为S型曲线，则待测样本的EGFR基因含有T790M突变；如检测管中的扩增曲线非S型曲线，则待测样本的EGFR基因不含T790M突变。

实施例2、实施例1的T790M-ANABMB的特异性

待测样本：标准品样本1和样本2。其中标准品样本1为人工合成的含有T790M突变的EGFR基因片段的重组质粒，该重组质粒为将大肠杆菌克隆载体pUC57(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)中的EcoRV和SmaI识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的DNA片段得到的重组质粒；标准品样本2为人工合成的含有野生型EGFR基因片段的重组质粒，该重组质粒为将大肠杆菌克隆载体pUC57(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)中的EcoRV和SmaI识别序列间的DNA片段替换为序列1所示的DNA片段得到的重组质粒。

将标准品样本1和标准品样本2作为模板，按照实施例1的最佳反应体系和反应条件分别利用实施例1的T790M-ANABMB和引物对A1检测标准品样本1和标准品样本2中的EGFR基因是否含有T790M突变(检测管)。并利用实施例1的内控探针和内控引物对分别替换T790M-ANABMB和引物对A1检测扩增质量(内控管)。

对于标准品样本1，内控管扩增S型曲线且Ct≤35，检测管有扩增S型曲线，表明作为待测样本的样本1的EGFR基因含有T790M突变(即T790M突变阳性，图4)；对于标准品样本2，内控管扩增S型曲线且Ct≤35，检测管无扩增曲线，表明作为待测样本的样本2的EGFR基因不含有T790M突变(即T790M突变阴性，图5)。

同时设计合成对照ARMS-PCR引物和探针，

T790M-Taqman-F：5'-CACCGTGCAGCTCATGAT-3'；

T790M-Taqman-R：5'-AGCCAATATTGTCTTTGTGTTCCC-3'；

T790M-Taqman-P：FAM-CAGCTCATGCCCTTCGGC-BHQ1。

利用对照ARMS-PCR引物和探针检测标准品样本2，结果发现样本2的扩增曲线存在翘尾现象，造成假阳性误判；

引入抑制野生型位点扩增的双脱氧抑制探针T790M-Taqman-Sup后，

T790M-Taqman-Sup:5'-GCAGCTCATCACGCAGCTCATG-ddC3'

翘尾有减弱，但是依然存在(图6)。

说明，实施例1的T790M-ANABMB和引物对A1在检测待测样本的EGFR基因是否含有T790M突变时相比对照ARMS-PCR具有很好的特异性。

实施例3、实施例1的T790M-ANABMB的灵敏度及检测效果

将实施例1的作为阳性质控的重组质粒进行倍比稀释，分别得到浓度分别为3000、300、30、3拷贝/μL的重组质粒溶液。

将上述各重组质粒溶液中的重组质粒作为模板，按照实施例1的最佳反应体系和反应条件利用实施例1的T790M-ANABMB和引物对A1进行检测，并利用不含非天然核苷酸的分子信标T790M-MB进行对比。每个反应体系一种浓度的重组质粒溶液，每种反应体系设置三个重复，以无核酸酶水替换重组质粒溶液作为阴性对照(NTC)。

结果(图7)显示，T790M-ANABMB可以成功检出低至3拷贝的模板；结果表明，实施例1的T790M-ANABMB和引物对A1的灵敏度为3拷贝/μL。对照T790M-MB扩增曲线基线倾斜，导致定量检测结果不可靠(图8)；上述结果表明，实施例1的T790M-ANABMB和引物对A1的灵敏度为3拷贝/μL，明显优于普通的T790M-MB分子信标；与此同时，T790M-ANABMB可以降低基线背景干扰，有利于对结果进行准确判读。

实施例4、利用实施例1中建立的方法和新型分子信标检测临床样本

1、待测临床样本

89例接受EGFR-TKI靶向用药治疗已进展的非小细胞肺腺癌患者(患者均知情同意)的血浆样本，均有完整的临床资料。其中，男女比例为51/38。

2、基于非天然核苷酸对分子信标探针的荧光PCR检测

采用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Cat No:55114)按照说明书提取各样本的血浆游离DNA(测定浓度和纯度，要求浓度大于0.2ng/μL；OD260nm/OD280nm在1.8-2.0之间)。

将各样本的血浆游离DNA作为模板，按照实施例1的最佳反应体系和反应条件利用实施例1的T790M-isoMB和引物对A1进行检测，每个反应体系一种样本的血浆游离DNA，每种反应体系设置三个重复，以无核酸酶水替换血浆游离DNA作为阴性对照。

同时利用对照试剂盒(人类EGFR基因突变检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，武汉友芝友医疗科技有限公司，(国食药监械(准)字2014第3400123号))及数字PCR检测上述各样本中的EGFR基因T790M突变情况。结果如表2所示。

表2、临床样本的检测结果

检测结果显示，以上89例患者中应用本发明检测出46例T790M阳性样本，其余43例为T790M阴性样本，部分检测结果典型扩增曲线见图9；对照试剂盒检测出35例T790M阳性样本，其余54例为T790M阴性样本，对照试剂盒检测结果典型扩增曲线见图10。本发明检测结果与数字PCR检测结果完全相符。本发明检测结果与对照试剂盒检测结果有11例不符，这11例本方法检测均为阳性,数字PCR检测也均为阳性；对照试剂盒检测部分曲线翘尾，基于对照试剂盒的参考ΔCt值，检测结果均应判定为阴性。

上述结果表明应用本发明检测EGFR基因T790M突变的分子信标T790M-ANABMB和引物对A1的灵敏度高，可检测临床样本中的微量突变模板，结果可靠。与数字PCR方法结果阳性符合率为100％，阴性符合率为100％，总体符合率100％。因此，本方法检测灵敏高，结果准确，此外该方法检测速度快，操作简单，结果判读客观，非常适合在临床中大规模开展。

<110> 北京福安华生物科技有限公司

<120> 一种检测EGFR基因T790M突变的人工模拟分子信标与试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

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tggccagcgt ggacaacccc cacgtgtgcc gcctgctggg catctgcctc acctccaccg 60

tgcagctcat cacgcagctc atgcccttcg gctgcctcct ggactatgtc cgggaacaca 120

aagacaatat tggct 135

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<212> DNA

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tggccagcgt ggacaacccc cacgtgtgcc gcctgctggg catctgcctc acctccaccg 60

tgcagctcat catgcagctc atgcccttcg gctgcctcct ggactatgtc cgggaacaca 120

aagacaatat tggct 135

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ccatcggctc atcatgcagc tcgatgg 27

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ctgggcatct gcctcacc 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

tcccggacat agtccagga 19

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

ccatcgagct catgcccttc ggctgccgat gg 32

Claims

1.检测EGFR基因T790M突变的分子信标，其特征在于：所述分子信标的序列为序列表中序列3，所述分子信标满足：

序列3的第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第6位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第22位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第26位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第13位和第16位均为锁核苷酸残基，序列3的其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基。

2.根据权利要求1所述检测EGFR基因T790M突变的分子信标，其特征在于：所述分子信标标记有荧光基团和淬灭基团。

3.成套试剂，由权利要求1或2所述检测EGFR基因T790M突变的分子信标与能从人基因组中扩增得到含有权利要求1或2所述的分子信标茎环区识别序列的引物对组成。

4.根据权利要求3所述的成套试剂，其特征在于：所述引物对由序列表中序列1的第21-39位所示的单链DNA和与序列表中序列1的第92-110位互补的单链DNA组成。

5.检测EGFR基因是否含有T790M突变的试剂盒，含有权利要求1或2所述的分子信标或权利要求3或4所述的成套试剂。