CN105779587A - 用于检测人类nras基因7种突变的探针、引物及试剂盒 - Google Patents

用于检测人类nras基因7种突变的探针、引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测人类NRAS基因7种突变的探针、引物及试剂盒，其中NM1～NM7的7组引物和探针，每组中突变引物能与NRAS基因保守序列结合，突变ARMS引物能与其相应的突变序列特异性结合，扩增突变序列；检测探针能够与扩增片段结合，阻断探针能与突变位点对应的野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异性扩增。本发明采用特异性突变引物和探针阻断技术，可准确检测NRAS基因7种突变类型；建立的实时荧光PCR扩增反应体系的试剂盒方便对NRAS基因突变的快速检测，操作简单，结果易读；检测方法灵敏度高，50拷贝突变能稳定检出；特异性好，20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增，检测能力高达1％。

Description

用于检测人类NRAS基因7种突变的探针、引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测人类NRAS基因7种突变的探针、引物及试剂盒。
背景技术
ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——HRAS、KRAS和NRAS，分别定位在11、12和1号染色体上。功能上Ras蛋白具有分子开关的作用，正常表达下，能够调控细胞生长。发生点突变，过表达或者基因易位等异常情况会导致细胞异常增殖，并最终引发肿瘤形成，超过30％的人类肿瘤存在Ras的突变。作为ras家族的一员，NRAS在结构和功能上都与KRAS具有很多相似性，并随着近年研究的加深，逐渐成为继KRAS之后另一个为临床病情评估和治疗提供重要依据的分子指标。
在非KRAS基因exon2突变的结直肠癌患者中，NRAS基因突变占7.5％(48/641)。临床研究发现，KRAS或KRAS基因突变的结直肠癌患者不能从帕尼单抗治疗中获益。对临床数据进行多因素风险分析，结果显示NRAS突变是黑色素瘤总体生存率的一个独立不良预后因子。
目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30％；实验操作复杂，检测效率低、样品易污染，通常要1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量漏检及假阴性的发生。而不管是染料溶解曲线还是探针溶解曲线法，都无法有效区分同一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂，且容易污染，假阳性率高。
发明内容
为了解决现有的NRAS基因突变检测方法检测效率低、样品易污染、检测时间长、准确性差、区分度困难等问题，本发明提供了用于检测人类NRAS基因7种突变的引物和探针。本发明还提供了含有该引物和探针的试剂盒，实现不限场地的快速准确检测。
本发明提供的用于检测人类NRAS基因7种突变的引物和探针，其核苷酸序列如下：
NM1：G12C突变
突变上游ARMS引物NM1-F：SEQIDNO:1，
突变下游引物NW1-R：SEQIDNO:3，
检测探针NW1-P：SEQIDNO:4，
阻断探针NW1-B：SEQIDNO:5；
NM2：G12D突变
突变上游ARMS引物NM2-F：SEQIDNO:2，
突变下游引物NW1-R：SEQIDNO:3，
检测探针NW1-P：SEQIDNO:4，
阻断探针NW1-B：SEQIDNO:5；
NM3：Q61K突变
突变上游引物NW2-F：SEQIDNO:6，
突变下游ARMS引物NM3-R：SEQIDNO:7，
检测探针NW2-P：SEQIDNO:12，
阻断探针NW2-B：SEQIDNO:13；
NM4：Q61L突变
突变上游引物NW2-F：SEQIDNO:6，
突变下游ARMS引物NM4-R：SEQIDNO:8，
检测探针NW2-P：SEQIDNO:12，
阻断探针NW2-B：SEQIDNO:13；
NM5：Q61R突变
突变上游引物NW2-F：SEQIDNO:6，
突变下游ARMS引物NM5-R：SEQIDNO:9，
检测探针NW2-P：SEQIDNO:12，
阻断探针NW2-B：SEQIDNO:13；
NM6：Q61H突变
突变上游引物NW2-F：SEQIDNO:6，
突变下游ARMS引物NM6-R：SEQIDNO:10，
检测探针NW2-P：SEQIDNO:12，
阻断探针NW2-B：SEQIDNO:13；
NM7：Q61H突变
突变上游引物NW2-F：SEQIDNO:6，
突变下游ARMS引物NM7-R：SEQIDNO:11，
检测探针NW2-P：SEQIDNO:12，
阻断探针NW2-B：SEQIDNO:13；
其中，所述检测探针的核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团。
优选地，上述用于检测人类NRAS基因7种突变的引物和探针，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB。MGB(MinorGrooveBinder)基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针，MGB探针序列可设计得更短，特异性更强。
表1人类NRAS基因7种热点突变
突变名称 氨基酸变化 碱基变化 CosmicID
NM1 G12C c.34G>T 562
NM2 G12D c.35G>A 564
NM3 Q61K c.181C>A 580
NM4 Q61L c.182A>T 583
NM5 Q61R c.182A>G 5842 -->
NM6 Q61H c.183A>T 585
NM7 Q61H c.183A>C 586
上述引物是针对表1所列的7种突变进行检测的特异性引物，其中，ARMS引物，能够与其相应的突变位点序列特异性结合，选择性扩增突变序列；与其对应的另一引物能够与NRAS基因保守序列结合；检测探针能够与扩增片段结合，阻断探针能与突变位点对应的野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异性扩增。
本发明提供的用于检测人类NRAS基因7种突变的试剂盒，包括以上任一所述的用于检测人类NRAS基因7种突变的引物和探针。
优选地，上述用于检测人类NRAS基因7种突变的试剂盒，还包括外控引物和探针，核苷酸序列如下：
外控上游引物NR-F：SEQIDNO:14，
外控下游引物NR-R：SEQIDNO:15，
外控检测探针NR-P：SEQIDNO:16，外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB。其中，NR-F和NR-R用于扩增NRAS基因的保守序列(此段保守序列不同于以上任一突变引物结合扩增的保守序列)；NR-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合。
优选地，上述用于检测人类NRAS基因7种突变的试剂盒，还包括内控引物和探针，核苷酸序列如下：
内控上游引物IC-F：SEQIDNO:17，
内控下游引物IC-R：SEQIDNO:18，
内控检测探针IC-P：SEQIDNO:19，内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE，3’端标记有BHQ1。
其中，IC-F和IC-R为内控上下游引物，扩增matK基因保守序列；IC-P为5’端标记有JOE信号3’端标记BHQ1的检测探针，能与扩增片段结合。
优选地，上述用于检测人类NRAS基因7种突变的试剂盒，还包括阳性对照品和内控品，阳性对照品包括含有7种突变序列基因的质粒NM1质粒～NM7质粒、含有NRAS基因保守序列>gi|568815597:c114709900-114709501段碱基的外控质粒(即NR质粒)和含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒(即IC质粒)，其中NM1质粒和NM2质粒均含有NRAS基因>gi|568815597:c114716301-114715900段碱基序列，NM3质粒～NM7质粒均含有NRAS基因>gi|568815597:c114714200-114713600段碱基序列；内控品为含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒(即IC粒)。
NM1质粒～NM2质粒中的NRAS基因>gi|568815597:c114716301-114715900段碱基序列含有各自突变位点的突变碱基(依次为：c.34G>T，c.35G>A)，NM3质粒～NM7质粒中的NRAS基因>gi|568815597:c114714200-114713600段碱基序列含有各自突变位点的突变碱基(依次为：c.181C>A，c.182A>T，c.182A>G，c.183A>T，c.183A>C)。
优选地，上述用于检测人类NRAS基因7种突变的试剂盒，试剂盒中的反应体系分为8个：
7个检测反应体系，每1个检测反应体系中包括用于检测人类NRAS基因一种突变的引物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH2O；
质控反应体系：包括外控引物和探针、内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH2O；
所述ABpremix为美国应用生物系统公司产品FastAdvancedMasterMix；所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液，缓冲液中含有Mg2+。
本发明还提供了以上所述用于检测人类NRAS基因7种突变的试剂盒的使用方法，首先提取待检样品的基因组DNA，分别加入到各检测反应体系和质控反应体系，进行荧光定量PCR反应；另外设置非模板对照和各突变相应的阳性对照，与待检样品的基因组DNA进行同样的操作；根据Ct值分析检测结果：
含有NM1：G12C(c.34G>T)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于7为野生型，小于等于7为G12C(c.34G>T)突变型阳性；
含有NM2：G12D(c.35G>A)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于7为野生型，小于等于7为G12D(c.35G>A)突变型阳性；
含有NM3：Q61K(c.181C>A)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于7为野生型，小于等于7为Q61K(c.181C>A)突变型阳性；
含有NM4：Q61L(c.182A>T)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9为野生型，小于等于9为Q61L(c.182A>T)突变型阳性；
含有NM5：Q61R(c.182A>G)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于7为野生型，小于等于7为Q61R(c.182A>G)突变型阳性；
含有NM6：Q61H(c.183A>T)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于7为野生型，小于等于7为Q61H(c.183A>T)突变型阳性；
含有NM7：Q61H(c.183A>C)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于7为野生型，小于等于7为Q61H(c.183A>C)突变型阳性；
所述Ct检测为待检样品的基因组DNA在上述7种检测反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值，所述Ct质控为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值。
优选地，以上所述的用于检测人类NRAS基因7种突变的试剂盒的使用方法，荧光定量PCR反应的条件为：
95℃10min；
92℃15sec，58℃1min，共15个循环；
92℃15sec，60℃1min，共30个循环；在60℃时收集信号。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用了特异性突变引物和探针阻断技术，可以检测人类NRAS基因7种突变类型。其中，特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列；在此基础上，阻断探针与野生型序列特异性结合，有效抑制了野生型的非特异性扩增，进一步提高体系的特异性水平，从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。
(2)本发明建立了实时荧光PCR扩增反应体系实现对NRAS基因突变的快速检测；且操作简单，结果易读。其JOE信号Ct值反应了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR反应是否正常，操作过程是否准确)。
(3)本方法灵敏度高，可实现50拷贝突变基因的稳定检出；特异性好，20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增，检测能力高达1％。
附图说明
图1为实施例1中内控(IC)实验结果；
图2为实施例1中非模板对照(NTC)实验结果；
图3为实施例1中阳性对照(STD)样本结果；
图4为实施例1中灵敏度(G12C检测孔)实验结果；
图5为实施例1中精密度(G12D检测孔)实验结果；
图6为实施例2中阴性(野生型)样本实验结果；
图7为实施例2中阳性(Q61K突变)样本实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
1、用于检测人类NRAS基因7种突变的检测试剂盒的引物和探针：
根据NCBI数据库公布的NRAS基因(NCBIReferenceSequence:NM_002524.4)野生型序列，以2号外显子G12C(NM1)和G12D(NM2)突变位点，3号外显子Q61K(NM3)、Q61L(NM4)、Q61R(NM5)、Q61H(NM6)和Q61H(NM7)突变位点为参考，设计特异性NM1突变引物和探针(见表2)、特异性NM2突变引物和探针(见表3)、特异性NM3突变引物和探针(见表4)、特异性NM4突变引物和探针(见表5)、特异性NM5突变引物和探针(见表6)、特异性NM6突变引物和探针(见表7)和特异性NM7突变引物和探针(见表8)。以基因工程构建的突变和野生型质粒为模板，建立了实时荧光PCR突变(Mutation)检测体系，实现对NRAS基因突变的高灵敏度和高特异性检测。
(1)用于人类NRAS基因G12C(NM1)突变检测的特异性引物和探针序列：
表2用于检测G12C(NM1)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
1 NM1-F TTTGGTGGTGGTTTGAGCGT 无
3 NW1-R ACCTCTATGGTGGGATCATATTCAT 无
4 NW1-P AAAGCGCACTGACAAT 5’端FAM，3’端MGB
5 NW1-B TGGTTGGAGCAGGTGG 5’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，NM1-F为突变上游ARMS引物，与G12C(c.34G>T)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；NW1-R为突变下游引物，与NRAS基因保守序列结合；NW1-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；NW1-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与G12C位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(2)用于人类NRAS基因G12D(NM2)突变检测的特异性引物和探针序列：
表3用于检测G12D(NM2)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
2 NM2-F TGGTGGTGGTTGTAGCCGA 无
3 NW1-R ACCTCTATGGTGGGATCATATTCAT 无
4 NW1-P AAAGCGCACTGACAAT 5’端FAM，3’端MGB
5 NW1-B TGGTTGGAGCAGGTGG 5’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，NM2-F为突变上游ARMS引物，与G12D(c.35G>A)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；NW1-R为突变下游引物，与NRAS基因保守序列结合；NW1-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；NW1-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与G12D位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(3)用于人类NRAS基因Q61K(NM3)突变检测的特异性引物和探针序列：
表4用于检测Q61K(NM3)位点的特异性引物和探针组合
其中，NW2-F为突变上游引物，与NRAS基因保守序列结合；NM3-R为突变下游ARMS引物，与Q61K(c.181C>A)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；NW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；NW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与Q61K位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(4)用于人类NRAS基因Q61L(NM4)突变检测的特异性引物和探针序列：
表5用于检测Q61L(NM4)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
6 NW2-F CCACACCCCCAGGATTCTTA 无
8 NM4-R ATCTCACGGCACTGTAGTCTTCAA 无
12 NW2-P CTGTATCCAGTATGTCCAAC 5’端FAM，3’端MGB
13 NW2-B ACTCTTCTTGTCCAGCTGT 5’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，NW2-F为突变上游引物，与NRAS基因保守序列结合；NM4-R为突变下游ARMS引物，与Q61L(c.182A>T)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；NW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；NW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与Q61L位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(5)用于人类NRAS基因Q61R(NM5)突变检测的特异性引物和探针序列：
表6用于检测Q61R(NM5)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
6 NW2-F CCACACCCCCAGGATTCTTA 无
9 NM5-R TTCTCACGGCACTGTTCTCTACTC 无
12 NW2-P CTGTATCCAGTATGTCCAAC 5’端FAM，3’端MGB
13 NW2-B ACTCTTCTTGTCCAGCTGT 5’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，NW2-F为突变上游引物，与NRAS基因保守序列结合；NM5-R为突变下游ARMS引物，与Q61R(c.182A>G)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；NW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；NW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与Q61R位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(6)用于人类NRAS基因Q61H(NM6)突变检测的特异性引物和探针序列：
表7用于检测Q61H(NM6)位点的特异性引物和探针组合
其中，NW2-F为突变上游引物，与NRAS基因保守序列结合；NM6-R为突变下游ARMS引物，与Q61H(c.183A>T)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；NW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；NW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与Q61H位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
(7)用于人类NRAS基因Q61H(NM7)突变检测的特异性引物和探针序列：
表8用于检测Q61H(NM7)位点的特异性引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
6 NW2-F CCACACCCCCAGGATTCTTA 无
11 NM7-R CCTCTCACGGCACTGTAGTCTTAG 无
12 NW2-P CTGTATCCAGTATGTCCAAC 5’端FAM，3’端MGB
13 NW2-B ACTCTTCTTGTCCAGCTGT 5’端双脱氧修饰，3’端MGB
其中，NW2-F为突变上游引物，与NRAS基因保守序列结合；NM7-R为突变下游ARMS引物，与Q61H(c.183A>C)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；NW2-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；NW2-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与Q61H位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
2、质控引物(外控和内控)引物和探针
(1)用于人类NRAS基因突变检测样本质控的外控引物和探针序列：
根据NCBI数据库公布的NRAS基因(NCBIReferenceSequence:NM_002524.4)4号外显子保守序列，设计外控引物和探针(见表9)。以基因工程构建的外控质粒为模板，建立了实时荧光PCR外控(ExternalControl)检测体系，对待测样本基因组DNA的质量和上样量进行质控。
表9用于样本质控的外控引物和探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
14 NR-F CTAATCTCAAACTCCTGGGTTCAAG 无
15 NR-R AGGCTGGGTACAGTGGCTCAT 无
16 NR-P CCTGCAATCTCAGCACT 5’端FAM，3’端MGB
其中，NR-F和NR-R为外控上下游引物，扩增NRAS基因保守序列(>gi|568815597:c114709900-114709501段碱基序列)；NR-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合。
(2)用于实时荧光PCR扩增反应体系内部质控的内控引物和探针序列：
具体的，根据NCBI数据库公布的matK基因(NCBIReferenceSequence:NC_001666.2)保守序列(non-humanDNA)，用PrimerPremier5和PrimerExpress3.0生物信息学软件设计内控引物和探针(见表10)。以基因工程构建的内控质粒为模板，建立了实时荧光PCR内控(InternalControl)检测体系，对实时荧光PCR反应体系和实验操作过程进行质控。
表10用于内部质控的内控引物、探针组合
SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰
17 IC-F TCGTAAGGAATCAAATGCTGGAG 无
18 IC-R CAACGGGTTTACTAATAGGATGCC 无
19 IC-P TCGATACCACAGTCCTTGCAACTCCCC 5’端JOE，3’端BHQ1
其中，IC-F和IC-R为内控上下游引物，扩增matK基因保守序列(位于>gi|11994090:c2400-2001)；IC-P为5’端标记有JOE信号3’端标记BHQ1的检测探针，能与扩增片段结合。
3、本发明的检测人类NRAS基因7种突变的检测试剂盒
实时荧光PCR扩增反应体系设置：本发明方法用8孔实时荧光PCR扩增反应进行NRAS基因7种突变的检测。反应体系1～7(见表12)包含实时荧光PCR突变检测体系和实时荧光PCR内控检测体系，反应体系8(见表12)包含实时荧光PCR外控检测体系和实时荧光PCR内控检测体系。
试剂盒各管内组成成分如下：
表11试剂盒组成成分
其中，NM1质粒含有发生G12C(c.34G>T)碱基变化的NRAS基因片段(>gi|568815597:c114716301-114715900)，NM2质粒含有发生G12D(c.35G>A)碱基变化的NRAS基因片段(>gi|568815597:c114716301-114715900)，NM3质粒含有发生Q61K(c.181C>A)碱基变化的NRAS基因片段(>gi|568815597:c114714200-114713600)，NM4质粒含有发生Q61L(c.182A>T)碱基变化的NRAS基因片段(>gi|568815597:c114714200-114713600)，NM5质粒含有发生Q61R(c.182A>G)碱基变化的NRAS基因片段(>gi|568815597:c114714200-114713600)，NM6质粒含有发生Q61H(c.183A>T)碱基变化的NRAS基因片段(>gi|568815597:c114714200-114713600)，NM7质粒含有发生Q61H(c.183A>C)碱基变化的NRAS基因片段(>gi|568815597:c114714200-114713600)；NR质粒(即外控质粒)含有NRAS基因保守序列(>gi|568815597:c114709900-114709501；IC质粒(即内控质粒)含有matK基因保守序列(>gi|11994090:c2400-2001)。
反应体系组成如下：
表12实时荧光PCR扩增反应体系组成
注：ABpremix全称FastAdvancedMasterMix，购自美国应用生物系统公司；10×buffer(Mg2+Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司。
PCR反应总体积25μL，含19μL的反应体系，1μL的IC模板和5μL的检测模板(阳性对照、非模板对照、质粒模板或待测样本基因组DNA)，IC模板和检测模板可预混。
反应体系1用于人类NRAS基因G12C(NM1)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表2)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系2用于人类NRAS基因G12D(NM2)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表3)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系3用于人类NRAS基因Q61K(NM3)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表4)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系4用于人类NRAS基因Q61L(NM4)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表5)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系5用于人类NRAS基因Q61R(NM5)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表6)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系6用于人类NRAS基因Q61H(NM6)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表7)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系7用于人类NRAS基因Q61H(NM7)突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表8)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
反应体系8用于待测样本的质控。体系包含用于外控基因扩增的外控引物和探针组合(见表9)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表10)。
4、试剂盒检测方法：
(1)获取待测样本基因组DNA
石蜡包埋样本的提取使用QIAampDNAFFPETissueKit(CatNo.56404)。按照说明书提取结直肠癌和黑色素瘤患者组织标本基因组DNA，操作步骤简述如下：
取临床采集的石蜡包埋组织切片(10μm，5-7片)放入1.5ml的离心管中，加入1000μL的二甲苯，涡旋10sec，12000rpm室温离心5min,弃上清(注意不要倒掉沉淀)；加入1000μL无水乙醇，以除去残留的二甲苯，涡旋混匀，12000rpm室温离心5min，弃上清；打开离心管盖，在37℃孵育10-15min，直至乙醇完全蒸发；分别加入180μLbufferATL和20μL蛋白酶K，涡旋混匀，56℃孵育2h左右，直到该组织完全溶解(在孵育过程中可以轻弹重悬，有利与提高提取量)；加入200μLbufferAL，涡旋混匀后加入200μL无水乙醇，再次涡旋震荡；将最后的混合物加入到离心柱上，8000rpm离心1min，弃废液；加入500μLbufferAW1，8000rpm离心1min，弃废液；加入500μLbufferAW2，12000rpm离心3min，弃废液；12000rpm离心1min；将离心柱放置在新的1.5ml离心管中，加入50-100μLbufferAE，室温放置5min，12000rpm离心1min，收集滤液，-20℃保存。
将抽提好的DNA样本，用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量，DNA的浓度要求≥10ng/μL，DNA的质量OD260/280在1.8～2.0之间。定量后，母液-20℃保存。
(2)实时荧光PCR扩增反应：
实时荧光PCR扩增反应基本原理：上述检测探针序列5’端连接荧光基团(FAM、JOE)，3’端连接淬灭基团(MGB、BHQ1)。未进行PCR扩增反应前，检测探针5’端荧光基团与3’端的淬灭基团相互靠近，由于荧光共振能量转移的作用，荧光基团不能发出荧光。随着PCR扩增反应的进行，检测探针在DNA聚合酶的作用下发生水解，5’端荧光基团脱落而与淬灭基团相互分离，进而能发出荧光。通过仪器检测荧光信号的积累可反映待测模板目的片段的起始浓度。在突变检测探针、外控检测探针和阻断探针的3’端连接有MGB(MinorGrooveBinder)基团。MGB基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针，MGB探针序列可设计得更短，特异性更强。
(1)在本发明实时荧光PCR突变检测体系中，对目的基因突变区域进行PCR扩增。其中，特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列；在此基础上，阻断探针与野生型序列特异性结合，有效抑制了野生型的非特异性扩增，进一步提高体系的特异性水平，从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。(2)在本发明实时荧光PCR外控检测体系中，对目的基因保守区域进行PCR扩增。其FAM信号Ct值反映了待测样本基因组DNA的相关信息(DNA质量、纯度及上样量)。(3)在本发明实时荧光PCR内控检测体系中，对非人类基因保守区进行PCR扩增。其JOE信号Ct值反应了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR反应是否正常，操作过程是否准确)。
实时荧光PCR扩增反应：
将样本的基因组DNA用TE(10mmol/L，pH8.0)稀释到2～10ng/μL作为模板，加入到实时荧光PCR扩增反应体系中(见表12)进行扩增。
实时荧光PCR扩增反应条件设置：
表13实时荧光PCR扩增反应条件
最优的，在Stage2阶段(15个循环)，58℃的退火延伸温度，有利于突变模板的富集。在Stage3阶段(30个循环)，60℃的退火延伸温度可以保证更好的扩增特异性。
(3)检测结果分析
根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果：以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值≤25，扩增正常)，以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线，阳性对照FAM信号Ct值≤22，体系性能良好，结果有效)；以外控检测孔FAM信号Ct值作为上样量质控标准(9<Ct质控≤18，Ct质控≤9，说明加入的基因组DNA浓度过高，应稀释后重新检测该样本；Ct质控>18或无扩增曲线，说明加入的基因组DNA浓度过低或存在降解，建议重新提取该样本基因组DNA后进行检测)，以待测样本突变检测孔与外控检测孔FAM信号的△Ct值(△Ct＝Ct检测-Ct质控)作为阴阳性判定标准(见表14)。
表14样本检测结果判定
每次检测需同时进行非模板对照(NTC)实验和阳性对照(STD)实验。
图1为IC检测结果，Ct内控≤25，符合要求；图2为NTC检测结果，反应体系1～8FAM均不起线，符合要求；图3为STD检测结果，反应体系1～8FAM信号均起线且Ct≤22，符合要求。
(4)灵敏度实验
将以现有基因工程技术合成的含有NRAS基因突变序列的7种重组质粒DNA干粉用TE(10mmol/L，pH8.0)复溶，定量后稀释。
取1×103拷贝/μL的7种突变质粒DNA分别进行10倍稀释，稀释2个梯度，然后以3种浓度梯度(1×103拷贝/μL、1×102拷贝/μL和1×101拷贝/μL)的突变质粒DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增反应(见图4)。由图4可见本发明的荧光PCR方法灵敏度高，10拷贝/μL突变基因即可检出。
(5)精密度实验
将以现有基因工程技术合成的含有NRAS基因突变序列的7种重组质粒DNA干粉用TE(10mmol/L，pH8.0)复溶，定量后稀释。以5×101拷贝/μL的7种突变质粒DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增反应(见图5)。由图5可见本发明的实时荧光PCR扩增反应重复性好(20次重复实验结果稳定，CV<5％)。
实施例2
用本发明中人类NRAS基因7种突变检测试剂盒来检测临床采集的组织样本。
本实施例中收集临床病理诊断为结直肠癌或黑色素瘤的患者组织样本，并从中提取基因组DNA。用NRAS基因7种突变检测试剂盒检测待测样本中NRAS基因突变状态。具体步骤如下：
(1)样本基因组DNA提取
石蜡包埋组织样本的提取使用QIAampDNAFFPETissueKit(CatNo.56404)，按说明书提取待测样本基因组DNA，将抽提好的DNA样本，用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量，DNA的浓度要求≥10ng/μL，DNA的质量OD260/280在1.8～2.0之间。将符合要求的基因组DNA用TE(10mmol/L，PH8.0)稀释到2～10ng/μL作为PCR模板，进行实时荧光PCR扩增反应。
(2)实时荧光PCR扩增反应
实时荧光PCR扩增反应条件见表13，按照人类NRAS基因7种突变检测试剂盒说明书进行样本检测。
(3)结果判定
根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果：以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值Ct≤25，扩增正常)，以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线，阳性对照FAM信号Ct值Ct≤22，体系性能良好，结果有效)；以待测样本突变检测孔和外控检测孔FAM信号△Ct值(△Ct＝Ct检测-Ct质控)作为阴阳性判定标准(见表14)。
图6中，Ct质控＝13.9，符合要求；突变检测孔FAM信号均未起线，显示样本检测结果为阴性。
图7中，Ct质控＝13.7，符合要求；NM3突变检测孔FAM信号起线而NM1、NM2、NM4、NM5、NM6和NM7突变检测孔FAM信号均未起线，且Ct检测(NM3)＝16.1，△Ct＝2.4，显示样本检测结果为NM3(Q61K)阳性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCELISTING
<110>武汉海吉力生物科技有限公司
<120>用于检测人类NRAS基因7种突变的探针、引物及试剂盒
<130>
<160>19
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
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<210>2
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tcgataccacagtccttgcaactcccc27

Claims (9)

1.用于检测人类NRAS基因7种突变的引物和探针，其特征在于，核苷酸序列如下：
NM1：G12C突变
突变上游ARMS引物NM1-F：SEQIDNO:1，
突变下游引物NW1-R：SEQIDNO:3，
检测探针NW1-P：SEQIDNO:4，
阻断探针NW1-B：SEQIDNO:5；
NM2：G12D突变
突变上游ARMS引物NM2-F：SEQIDNO:2，
突变下游引物NW1-R：SEQIDNO:3，
检测探针NW1-P：SEQIDNO:4，
阻断探针NW1-B：SEQIDNO:5；
NM3：Q61K突变
突变上游引物NW2-F：SEQIDNO:6，
突变下游ARMS引物NM3-R：SEQIDNO:7，
检测探针NW2-P：SEQIDNO:12，
阻断探针NW2-B：SEQIDNO:13；
NM4：Q61L突变
突变上游引物NW2-F：SEQIDNO:6，
突变下游ARMS引物NM4-R：SEQIDNO:8，
检测探针NW2-P：SEQIDNO:12，
阻断探针NW2-B：SEQIDNO:13；
NM5：Q61R突变
突变上游引物NW2-F：SEQIDNO:6，
突变下游ARMS引物NM5-R：SEQIDNO:9，
检测探针NW2-P：SEQIDNO:12，
阻断探针NW2-B：SEQIDNO:13；
NM6：Q61H突变
突变上游引物NW2-F：SEQIDNO:6，
突变下游ARMS引物NM6-R：SEQIDNO:10，
检测探针NW2-P：SEQIDNO:12，
阻断探针NW2-B：SEQIDNO:13；
NM7：Q61H突变
突变上游引物NW2-F：SEQIDNO:6，
突变下游ARMS引物NM7-R：SEQIDNO:11，
检测探针NW2-P：SEQIDNO:12，
阻断探针NW2-B：SEQIDNO:13；
其中，所述检测探针的核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的用于检测人类NRAS基因7种突变的引物和探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB。
3.用于检测人类NRAS基因7种突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的用于检测人类NRAS基因7种突变的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的用于检测人类NRAS基因7种突变的试剂盒，其特征在于，还包括外控引物和探针，核苷酸序列如下：
外控上游引物NR-F：SEQIDNO:14，
外控下游引物NR-R：SEQIDNO:15，
外控检测探针NR-P：SEQIDNO:16，外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB。
5.根据权利要求4所述的用于检测人类NRAS基因7种突变的试剂盒，其特征在于，还包括内控引物和探针，核苷酸序列如下：
内控上游引物IC-F：SEQIDNO:17，
内控下游引物IC-R：SEQIDNO:18，
内控检测探针IC-P：SEQIDNO:19，内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE，3’端标记有BHQ1。
6.根据权利要求5所述的用于检测人类NRAS基因7种突变的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和内控品，阳性对照品包括含有7种突变序列基因的质粒NM1质粒～NM7质粒、含有NRAS基因保守序列>gi|568815597:c114709900-114709501段碱基的外控质粒和含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒，其中NM1质粒和NM2质粒均含有NRAS基因>gi|568815597:c114716301-114715900段碱基序列，NM3质粒～NM7质粒均含有NRAS基因>gi|568815597:c114714200-114713600段碱基序列；内控品为含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。
7.根据权利要求5所述的用于检测人类NRAS基因7种突变的试剂盒，其特征在于，试剂盒中的反应体系分为8个：
7个检测反应体系：每1个检测反应体系中包括用于检测人类NRAS基因一种突变的引物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH2O；
1个质控反应体系：包括外控引物和探针、内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH2O；
所述ABpremix为美国应用生物系统公司产品FastAdvancedMasterMix；所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液，缓冲液中含有Mg2+。
8.权利要求7所述的用于检测人类NRAS基因7种突变的试剂盒的使用方法，其特征在于，提取待检样品的基因组DNA，分别加入到检测反应体系和质控反应体系，进行荧光定量PCR反应；另外设置非模板对照和阳性对照，与待检样品的基因组DNA进行同样的操作；根据Ct值分析检测结果：
首先需要满足JOE信号Ct值≤25，非模板对照的FAM信号不起线，阳性对照的FAM信号Ct值≤22；9<Ct质控≤18；然后按照△Ct＝Ct检测-Ct质控判定：
含有NM1：G12C(c.34G>T)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于7为野生型，小于等于7为G12C(c.34G>T)突变型阳性；
含有NM2：G12D(c.35G>A)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于7为野生型，小于等于7为G12D(c.35G>A)突变型阳性；
含有NM3：Q61K(c.181C>A)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于7为野生型，小于等于7为Q61K(c.181C>A)突变型阳性；
含有NM4：Q61L(c.182A>T)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于9为野生型，小于等于9为Q61L(c.182A>T)突变型阳性；
含有NM5：Q61R(c.182A>G)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值大于7为野生型，小于等于7为Q61R(c.182A>G)突变型阳性；
含有NM6：Q61H(c.183A>T)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于7为野生型，小于等于7为Q61H(c.183A>T)突变型阳性；
含有NM7：Q61H(c.183A>C)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中FAM信号Ct值差值△Ct大于7为野生型，小于等于7为Q61H(c.183A>C)突变型阳性；
所述Ct检测为待检样品的基因组DNA在上述7种检测反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值，所述Ct质控为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值。
9.根据权利要求8所述的用于检测人类NRAS基因7种突变的试剂盒的使用方法，其特征在于，荧光定量PCR反应的条件为：
95℃10min；
92℃15sec，58℃1min，共15个循环；
92℃15sec，60℃1min，共30个循环；在60℃时收集信号。
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