KR20130099092A

KR20130099092A - 광을 이용한 핵산의 증폭 억제 방법 및 고감도의 선택적 핵산 증폭 방법

Info

Publication number: KR20130099092A
Application number: KR1020137008941A
Authority: KR
Inventors: 히로시 테라사끼; 추네타다 콘노; 미추노부 시마드쯔; 켄조 푸지모토; 타카시 사카모토
Original assignee: 미쓰비시 가가쿠 메디엔스 가부시키가이샤
Priority date: 2010-09-10
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2013-09-05
Also published as: EP2615171B1; CN103080310A; EP2615171A1; WO2012033190A1; US9944979B2; JPWO2012033190A1; US20130177918A1; KR101851382B1; ES2558007T3; JP5795317B2; EP2615171A4

Abstract

핵산 샘플에 있어서, 야생형 핵산군에 미량 혼재하는 변이형 핵산을 검출함에 의해, 신속하고 간편하게, 높은 특이성과 감도를 양립시킨 방법을 제공한다.
본 발명 방법에서는, 표적 부위를 가지는 핵산과, 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브를 공존시켜, 광 조사함에 의해 상기 표적 부위를 가지는 핵산과 상기 클램프 프로브를 광연결시켜, 핵산 증폭법에 의한 표적 부위를 포함하는 검출 영역의 증폭을 억제한다.

Description

광을 이용한 핵산의 증폭 억제 방법 및 고감도의 선택적 핵산 증폭 방법{Method for inhibiting nucleic acid amplification using light and highly sensitive method for selective nucleic acid amplification}

본 발명은 광(光) 연결성 핵산류로 구성된 클램프 프로브(クランププロ-ブ)를 이용하여, 예를 들면, 야생형(野生型) 핵산에 혼재하는 변이형(變異型) 핵산을 선택적으로 검출하는 방법 및 키트(キット), 또한, 350 ~ 380 nm 범위의 파장의 광 조사(照射) 기능을 갖는 핵산 증폭 장치에 관한 것이다.

인간 게놈(ゲノム) 서열의 해독 완료후, 해독된 유전자 정보 진단 등의 의료 분야에 활용하려는 움직임이 활발해지고 있다. 게놈 서열 해독에 이어서 주목 받고있는 것은, 유전자 발현 프로필(プロフィ-ル) 해석이나 유전자 중의 단일(一) 염기 치환 (SNPs) 분석 등이다. 다양한 조건에서 발현되는 유전자의 발현량이나 유전자 변이를 검사하고, 이것에 의해 유전자의 기능이나 유전자와 질환 또는 의약품 감수성(感受性)과의 관련이 밝혀지고 있기 때문에, 축적된 유전자에 관한 정보는, 질병의 진단뿐만 아니라 치료법의 선택에도 이용되고 있다.

그중에서도 단일 염기 다형(一鹽基多型)이나 변이는 질환의 진단이나 리스크 판정 등, 유전자 검사에 있어서 중요한 타겟으로 되고, 당뇨병, 류머티즘(リウマチ), 악성 종양, 정신 질환, 심장병과 다방면에 걸친 분야에서 이용되고 있다. 이 단일 염기 치환의 검출 방법으로서, 지금까지 다양한 방법이 개발되고 있다. 구체적으로 Invader 법, Sniper 법, TaqMan PCR 법, Hybridization Probe 법, SNPIT 법, Pyrominisequencing 법, Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC) 법, MALDI-TOF/MS 법, NanoChip 법 등이 신속하고 높은 처리량(ハイスル-プット)으로 해석하는 방법으로 들 수 있다.

악성 종양 분야에서는, 체내의 특정 분자를 저격하여 그 기능을 억제하는 분자 표적 치료약의 개발이 활발히 이루어지고 있으며, 치료법의 선택에 즈음하여 분자 표적 치료약의 적용을 결정함에 있어서, 단일 염기 치환의 검출이 중요한 검사로서 자리 매김하고있다. 예를 들어, 항암제를 사용하기 전에 EGFR 유전자나 KRAS 유전자의 변이 해석 검사를 실시하는 것이 추천되고 있다. 그것은, 변이의 유무에 따라 약제 효과에 차이가 있기 때문에, 변이를 고려하여 투여하는 것이 지도되고 있기 때문이다. 또한, 이러한 변이의 유무를 사전에 살펴봄으로써, 약제의 유효성 보다도 심각한 부작용을 일으킬 위험성이 크고, 투약 효과가 낮은 환자를 선별하는 목적도 있다. 이 같은 이유에 의해 악성 종양 분야에서는, 특히 단일 염기 치환 검출이 중요한 검사로 되어있다.

그러나 악성 종양과 같은 후발 변이의 검출에서는, 검체 재료의 대부분을 차지하는 정상 세포에 유래하는 야생형의 핵산 분자가 백그라운드(バックグランド)가 되기 때문에, 상기와 같은 해석 수법에서는 단일 염기 치환 등의 변이를 검출할 수 없는 경우가 많다. 이 문제를 해결하기 위해, Scorpion-ARMS 법이나 PNA-LNA PCR Clamping 법 (특허 문헌 1)이 개발되고 있다.

Scorpion-ARMS 법으로는, 변이점(變異点)이 프라이머(プライマ-)의 3' 말단 근방에 위치하도록 변이형의 서열에 따라 조제한 해당(當該) 프라이머와, 타방의 프라이머의 조합에 의해 변이형 분자를 선택적으로 증폭한 산물(産物)을, Scorpion 법이라는 형광 검출법에 의해 해석하는 방법이다. PNA-LNA PCR Clamping 법은, 변이점 상에 설계한 야생형 서열과 상호 보완적인 클램프 프라이머에 의해 야생형 분자를 선택적으로 차단(ブロック)하고, 변이형 LNA를 형광 검출 프로브로 하여 변이 형 분자를 선택적으로 증폭 검출하는 방법이다.

이들 방법은, 모두, 하이브리드(ハイブリッド) 형성한 프라이머나 프로브와 주형(鑄型) 분자의 평형계의 열적 안정성의 차이를 이용하고 있는 것이며, 프라이머나 프로브와 주형 분자가 완전히 상보적인 경우의 하이브리드 형성도, 프라이머 나 프로브와 주형 분자가 1 내지 수(數) 염기, 상보적이 아닌 경우의 불완전한 하이브리드 형성도 그 차이는 열적 안정성의 차이에 불과하다. 그 때문에 양자(兩者)를 구별하는 적절한 조건은 목적의 염기 서열에 따라 다르고, 더 적절한 조건 하에서도 또한 열적 안정성을 변화시키는 조건은 양자에 균등하게 작용한다. 즉, 평형계의 하이브리드 형성의 열적 안정성의 차이만을, 양자의 구별의 원리로 사용하는 한은, 특이성과 감도의 밸런스(バランス)로 타협한 온도 조건을 설정시키는 것을 할 수 없고, 더욱이 설정 가능한 온도 조건의 범위(レンジ) 폭은 매우 좁은 경우가 많아, 그 때문에, 유전자 서열에 의해서는 프로브나 프라이머의 설계가 곤란한 경우가 있었다.

이와 같은 검출 기술의 상황으로부터, 현재의 악성 종양에 있어서 변이 검출 검사에서는 검사 재료의 채취에 엄밀한 제한이 설정되어 있다. 구체적으로는 암 조직으로부터 병리 표본을 제작하고, 염색 표본으로부터 종양 부위를 확인(同定)하고, 연속 절편의 미염색(未染色) 표본으로부터 종양부만을 모으는 것이 권장되고 있다 (대장암 환자에 있어서 KRAS 유전자 변이의 측정에 관한 가이던스(ガイダンス)). 그러나, 종양 부위의 확인에는 조직 형태학의 전문적인 지식이 필요해서 조작이 번잡하고, 그리고 코스트면에서의 부담이 큰 것이 되고 있었다.

이것때문에, 검사의 요건으로서 검사 재료의 채취나 표적 유전자의 염기 서열에 의한 제한을 그다지, 받지 않고, 특이성과 감도를 양립한 검출 방법의 확립이 요구되고 있었다.

특이성과 감도를 양립한 검출 방법으로서, 광연결성(光連結性) 핵산류를 이용한 변이 유전자의 검출법이 개발되고 있다. 예를 들어, 특허 문헌 2에서는, 특정 염기 서열의 표적 핵산을, 상보 사슬(相補鎖)과의 하이브리드 형성 원리로 하면서, 높은 특이성과 감도를 양립시켜 검출하는 방법이 기재되어 있다. 이것은, 표적 핵산에 상보하는 광연결성 핵산류와, 해당 광연결성 핵산류와 광연결 가능한 염기 부분을 3' 말단 또는 5' 말단에 가지는 피광연결성(被光連結性) 핵산류로 구성되며, 그 핵산류 중 어느 일방이 표지 부분을 가지고, 잔여 일방이 기재(基材)에 고정화된 방법에 의한다. 이 방법에 의하면, 동일 사슬 상에 있는 광연결성 핵산류와 피 광연결성 핵산류가, 광연결을 이용하여, 완전한 하이브리드 형성을 한 경우에만 특이적으로 광연결시켜, 표지 부분을 가지는 핵산 분자를, 기재(基材)에 공유 결합으로 고정화할 수 있고, 상보적 이중 사슬을 해리하는 조건에서의 철저한 세정이 가능하게 되며, 높은 특이성과 감도 (S/N 비)를 양립시킬 수 있었다.

그러나, 검출 감도에는 한계가 있고, 이 방법은, 대량의 표적 핵산에 포함된 변이의 유무를 검출하는 목적에는 사용할 수 있지만, 대량의 야생형 핵산에 혼재하는 미량의 변이형 핵산의 검출을 위해서는, 해당 미량의 변이형 핵산의 존재량이 검출 감도 이하인 경우가 많기 때문에, 사용할 수 없다. 또한, 광연결성 핵산류는,동일 사슬의 피연결(被連結) 핵산과 공유 결합되어 버리기 때문에, 검출하고 싶은 표적 핵산에 포함된 변이를 증폭할 수도 없다.

한편, 특허 문헌 3에서는, 먼저 PCR에 의해 표적 핵산을 포함한 시료를 증폭하고, 그에 대해, 특허 문헌 2의 방법을 조합한 것으로, 핵산 샘플 중의 1 또는 2 이상의 표적 뉴클레오티드(ヌクレオチド) 서열을 가지는 핵산을 검출하는 방법이다. 변이형 핵산의 비율이 미량이면, PCR로 증폭 할 수 있었다고 해도, 야생형 핵산과의 함유 비율은 변하지 않고, 시험관 내에서 검출할 수 있는 범위의 증폭에서는, 변이형 핵산이 검출가능하기까지 증폭할 수 없다. 이 방법은, 대량의 표적 핵산에 포함된 변이의 유무를 검출하는 목적에는 사용할 수 있지만, 대량의 야생형 핵산에 혼재하는 미량의 변이형 핵산의 검출을 위해서는 사용할 수 없다. 또한 PCR에 의해 표적 핵산을 포함한 시료를 증폭하기 위해, 어느 정도, 변이형 핵산의 함유 비율이 높으면, 변이형 핵산을 검출할 수 있는 가능성은 있지만, 공정수가 많아서, 번잡하고, 신속한 검사 결과를 요구하는 임상 현장의 요망에 부응할 수 없다.

특허 문헌 1: 특허 제 4216266호 명세서 특허 문헌 2: WO2007/058326호 공보 특허 문헌 3: 특개 2009-213445호 공보

본 발명의 목적은, 핵산 샘플에서, 야생형 핵산군에 미량으로 혼재하는 변이형 핵산을 검출함에 있어, 신속하고 간편하게, 높은 특이성과 감도를 양립시킨 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해, 예의 연구를 거듭한 결과, 야생형 핵산의 서열을 가지는 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브를, 표적 부위의 서열을 가지는 야생형 핵산에 대해서 광연결시킴으로써, 선택적으로 야생형 핵산의 증폭을 막을 수 있음을 발견했다. 즉, 광연결성 클램프 프로브를 이용하여, 완전한 하이브리드 형성한 경우에만 특이적으로 광연결시켜, 핵산 증폭 반응에서의 온도 사이클의 어느 공정에서도 연결을 유지하는, 즉, 비평형 상태로 함으로써, 표적 분자의 핵산 증폭 반응에서의 주형(鑄型)으로서의 역할을 저지할 수 있다. 이것에 의해, 야생형 핵산의 높은 클램핑 (억제) 효과와 변이형 핵산의 선택적 (특이적) 핵산 증폭의 양립을 가능하게 했다.

본 발명은,

[1] 표적 부위를 가지는 핵산과, 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브를 공존시켜, 광 조사함으로써 해당 표적 부위를 가지는 핵산과 상기 클램프 프로브를 광연결시켜, 핵산 증폭법에 의한 표적 부위를 포함하는 검출 영역의 증폭을 억제하는 방법,

[2] (a) 야생형 핵산의 서열을 가지는 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 핵산 샘플을 공존시켜, 클램프 프로브와 표적 부위를 가지는 야생형 핵산 분자를, 특이적으로 하이브리드 형성시키는 공정,

(b) 하이브리드 형성한 클램프 프로브와 표적 핵산 분자에, 광 조사를 실시하여, 광연결시키는 공정,

(c) 상기 공정 (a), (b)의 반응 산물을 핵산 증폭 반응에 제공하는 공정,

(d) 상기 증폭 산물을 해석하는 공정

을 포함하는, 변이형 핵산의 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 선택적으로 증폭시키는 것으로, 상기 변이형 핵산의 유무를 검출하는 변이형 핵산 검출 방법,

[3] (a) 야생형 핵산의 서열을 가지는 표적 부위에 대해서, 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 핵산 샘플을 공존시켜, 클램프 프로브와 표적 부위를 가지는 야생형 핵산 분자를 특이적으로 하이브리드 형성시키는 공정,

(b) 하이브리드 형성한 클램프 프로브와 표적 핵산 분자에, 광 조사를 실시여, 광연결시키는 공정,

(c) 상기 공정 (a), (b)를 핵산 증폭 반응 중에 실시하는 공정,

(d) 상기 증폭 산물을 해석하는 공정

[4] 상기 핵산 증폭법이 PCR 법인, [1] ~ [3]의 어느 하나의 방법,

[5] 상기 핵산 증폭법이 실시간(リアルタイム) PCR 법인, [1] ~ [3] 의 어느하나의 방법,

[6] 상기 클램프 프로브가, 표적 핵산 분자의 센스(センス) 사슬 및/또는 안티센스(アンチセンス) 사슬에 상보적인 서열을 가지는 [1] ~ [3]의 어느 하나의 방법,

[7] 상기 클램프 프로브의 사슬 길이가 7 ~ 30인, [1] ~ [6]의 어느 하나의 방법,

[8] 상기 광 조사가, 350 ~ 380 nm 범위의 파장에 의해 이루어지는 [1] ~ [7]의 어느 하나의 방법,

[9] 상기 광 조사가, 통상의 상보 사슬끼리 결합 및 해리하는 온도 사이클에서 상보 사슬끼리 결합할 수 있는 온도에 있어서 1 회 이상 실시되는, [1] ~ [8]의 어느 하나의 방법,

[10] 상기 광 조사가, 350 ~ 380 nm 범위의 파장의 광 조사 기능을 부여한 핵산 증폭 장치에 의해 실시되는, [1] ~ [9]의 어느 하나의 방법,

[11] 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함 클램프 프로브와, 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 증폭하는 프라이머(プライマ-)를 포함하는, 유전자 증폭법에 의한 표적 부위를 포함하는 검출 영역의 증폭을 억제하는 키트,

[12] 야생형 핵산의 서열을 가지는 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 증폭하는 프라이머를 포함하고, 상기 변이형 핵산의 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 선택적으로 증폭시키는 것으로, 상기 변이형 핵산의 유무를 검출하는 변이형 핵산 검출 키트,

[13] 350 ~ 380 nm 범위의 파장의 광 조사 기능을 가지는 핵산 증폭 장치,

[14] (a) 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 핵산 샘플을 공존시켜, 클램프 프로브와 표적 부위를 가지는 핵산 분자를, 특이적으로 하이브리드 형성시키는 공정,

을 포함하는, 350 ~ 380 nm 범위의 파장의 광 조사 기능을 가지는 핵산 증폭 장치,

[15] (a) 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 핵산 샘플을 공존시켜, 클램프 프로브와 표적 부위를 가지는 핵산 분자를 특이적으로 하이브리드 형성시키는 공정,

(b) 하이브리드 형성된 클램프 프로브와 표적 핵산 분자에, 광 조사를 실시하여, 광연결시키는 공정,

(c) 상기 공정 (a), (b)를 핵산 증폭 반응 중에 실시하는 공정,

을 포함하는, 350 ~ 380 nm 범위의 파장의 광 조사 기능을 가지는 핵산 증폭 장치에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 높은 감도와 특이성을 양립시키고, 핵산 샘플에 혼재하는변이형 핵산의 유무를 신속하게 또한 간편하게 검출할 수 있다.

도 1은 3-시아노비닐카르바졸-1'-β-데옥시리보시드 (CNVK, ３－シアノビニルカルバゾ-ル－１’－β－デオキシリボシド)의 구조식이다.
도 2는 실시예 1에서 실시한, 광연결 반응에 의한 야생형 유전자의 PCR 증폭 억제의 유무를 라이트 사이클라(ライトサイクラ-)를 이용해 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 실시예 2에서 실시한, 광연결 반응에 의한 변이형 유전자의 PCR 증폭 억제의 유무를 라이트 사이클라를 이용해 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 4에서 실시한, PCR 증폭 반응시에 광연결 반응 행한 경우의 변이형 유전자의 선택적 증폭의 유무를 아가로스겔(アガロ-スゲル) 전기 영동에 의해 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 레인(レ-ン) 1은 마커(マ-カ-) (φX174 HaeIII digest)이며, 레인 2는 야생형이며, 레인 3은 변이형이다.
도 5는 실시예 5에서 실시한, 대조로서, PCR 증폭 반응시에 광연결 반응을 하지 않은 경우의 변이형 유전자의 검출 감도를 라이트 사이클라를 이용해 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 실시예 5에서 실시한, 비교예로서, (PCR 증폭 반응시에 광연결 반응없이) PNA-LNA clamp PCR 반응에 의한 변이형 유전자의 검출 감도를 라이트 사이 클라를 이용해 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 실시예 5에서 실시한, PCR 증폭 반응시에 광연결 반응을 행한 경우의 변이형 유전자의 검출 감도를 라이트 사이클라를 이용해 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명에 있어서, DNA, RNA, 핵산, 유전자, 유전자 발현, 코드(コ-ド), 상보, 주형(鑄型), 프로모터(プロモ-タ-), 프로브(プロ-ブ), 프라이머(プライマ-), 하이브리다이제이션(ハイブリダイゼ-ション), PCR 등의 용어의 정의에 관해서는, 현재, 분자 생물학, 유전학, 유전 공학 등에서 널리 일반적으로 사용되는 용어와 같은 의미이다.

본 발명에 있어서, 핵산은, DNA 또는 RNA 또는 후술하는 뉴클레오티드 아날로그(ヌクレオチドアナログ)이면 특별히 한정되는 것이 아니고, 천연의 것이라도 좋고, 합성된 것이어도 좋다. 천연 핵산으로서, 예를 들어, 생물로부터 회수된 게놈 DNA, mRNA, tRNA, rRNA, hnRNA 등이 있다. 또한 합성된 핵산으로서, β-시아노 에틸 포스포로아미다이트(β－シアノエチルホスフォロアミダイト) 법, DNA 고상(固相) 합성법 등의 공지의 화학적 합성법으로 합성된 DNA나, PCR 등의 공지의 핵산 증폭법에 의해 합성된 핵산, 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA 등이 있다.

본 발명에서 「야생형 핵산」은, 변이를 발생하기 이전 핵산을 의미하는 것으로, 그의 전형적인 예는, 변이를 발생하지 않고, 본래의 정상적인 기능을 가지는 유전 정보를 포함하는 핵산이다. 여기서 말하는 유전 정보로는, mRNA, tRNA, rRNA, snRNA 등의 정보를 코드하는 전사 영역뿐만 아니라, 프로모터 등의 유전자 발현 상 필요한 조정 영역을 포함하는 것으로 한다.

본 발명에 있어서 「변이형 핵산」은, 변이를 일으킨 핵산이다. 「변이」는 DNA나 RNA 등의 핵산 서열의 변화이며, 유전학 등으로 사용되는 염기 치환, 삽입, 결실, 역위, 중복, 전좌 등이 해당한다. 상기 변이형 핵산에 있어서, 변이가 존재하는 영역은 전사 영역뿐만 아니라, 프로모터 등의 유전자 발현 상 필요한 조절 영역을 포함하는 것으로 한다. 또한 변이에 의해 변이형 핵산이 기능 상의 변화를 가질 필요는 없다. 또한 「변이」에는, 선천적인 것도 후천적인 것도 포함된다.

본 발명에 있어서 「표적 부위」는, 핵산 서열에서 광연결성 핵산류로 구성된 클램프 프로브의 표적이 되는 부위이며, 상기 클램프 프로브의 전부 또는 일부와 하이브리다이제이션하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 부위의 것이다.

통상의 실시 양태에 있어서 「표적 부위」로는 변이형 핵산에서 변이가 보이는 염기가 존재하는 부위이며, 야생형 핵산을 포함하며, 본 발명에서 검출의 표적으로 하는 부위이다. 예를 들어, 염기 치환이 있는 경우에는 야생형 핵산, 변이형 핵산 모두 상기 염기 치환한 염기가 해당한다. 또한 삽입이 있는 경우에는 변이형 핵산에서는 삽입된 염기가 해당하고, 야생형 유전자에 있어서는 변이형 핵산에서 염기가 삽입된 부위가 해당한다. 또한 결실이 있는 경우에는 변이형 핵산에 있어서는 결실에 의해 염기가 손실된 부위가 해당하고, 야생형 핵산에 있어서는 변이형 핵산에서 잃어버린 염기가 해당한다. 해당 표적 부위의 서열은, 유전 정보를 코드하는 서열을 가지는 사슬 (이하, 센스 사슬로 한다)을 나타내는 것이어도 좋고, 센스 사슬에 상보적인 서열을 가지는 사슬 (이하, 안티센스 사슬이라 한다)을 나타내는 것이어도 좋다.

본 발명에서 「핵산 증폭 반응」은, 공지의 폴리메라아제(ポリメラ-ゼ) 반응을 이용한 주형 핵산의 증폭 반응을 말한다. 또한, 「핵산 증폭 장치」는, 「핵산 증폭 반응」을 수행할 수 있는 장치이다.

본 발명의 증폭 억제 방법은, 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 증폭 가능한 프라이머를 이용하여, 통상의 핵산 증폭법을 실시하는 중에서, 상기 표적 부위의 변이에 기초하여, 1종류의 핵산 (예를 들면, 야생형 핵산)의 증폭을 억제하는 한편, 그것 이외의 핵산 (예를 들면, 변이형 핵산)만을 선택적으로 증폭시키는 방법이다.

본 발명에서는, 야생형 핵산 또는 변이형 핵산의 어느 하나를 증폭 억제의 대상으로 하는 가는, 그 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있으며, 특히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 핵산 샘플 중의 존재비에 큰 편차가 있는 경우, 대량으로 존재하는 핵산 (예를 들면, 야생형 핵산)의 증폭을 억제하고, 미량 존재하는 핵산 (예를 들면, 변이형 핵산)만을 선택적으로 증폭함으로써, 미량 존재하는 핵산의 유무를 검출할 수 있다.

이하, 본 발명에 있어서, 본 방법의 일 양태인, 변이형 핵산의 유무를 검출하는 변이형 핵산 검출 방법에 기초하여 주로 설명하지만, 본 발명 방법의 본질은, 앞서 언급했듯이, 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 증폭 가능한 프라이머를 이용하여, 통상의 핵산 증폭법을 실시하는 가운데, 상기 표적 부위의 변이에 기초하여 1종류의 핵산에 관해서만, 그 증폭을 억제할 수 있는 점에 있다.

본 발명 방법의 제 1 실시 형태로서는,

(a) 야생형 핵산의 서열을 가지는 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 핵산 샘플을 공존시켜, 클램프 프로브와 표적 부위를 가지는 야생형 핵산 분자를 특이적으로 하이브리드(ハイブリッド) 형성시키는 공정,

(d) 상기 증폭 산물을 해석하는 공정

을 포함하는, 변이형 핵산의 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 선택적으로 증폭시킴으로써, 상기 변이형 핵산의 유무를 검출하는 변이형 핵산 검출 방법에 있다.

본 발명 방법의 제 2 실시 형태로서는,

(a) 야생형 핵산의 서열을 가지는 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 핵산 샘플을 공존시켜, 클램프 프로브와 표적 부위를 가지는 야생형 핵산 분자를, 특이적으로 하이브리드 형성시키는 공정,

(c) 상기 공정 (a), (b)를 핵산 증폭 반응 중에 실시하는 공정,

(d) 상기 증폭 산물을 해석하는 공정

이러한 공정에 의해서, 야생형 핵산의 증폭을 억제하고, 선택적으로 변이형 핵산을 증폭함으로써 고감도로 변이형 핵산을 검출할 수 있는 것으로 되고 있다.

이하, 공정별로 설명한다. 또한 공정 (c) 이외는, 제 1의 실시형태와 제 2의 실시형태는 동일하므로, 이하, 주로 제 1의 실시형태에 따라 설명을 한 후, 제 2의 실시형태에 대해서는, 제 1의 실시형태와의 차이점을 들어서 설명한다.

공정 (a)에 있어서, 야생형 핵산의 서열을 가지는 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 핵산 샘플을 공존시키고, 클램프 프로브와 야생형 핵산 서열을 가지는 표적 핵산 분자를, 특이적으로 하이브리드 형성시킨다. 이 반응은 하이브리드 형성에 적합한 통상의 조건 (온도, pH, 염 농도, 완충액 등)에서 할 수 있지만, 반응액 중에 디메틸 술폭시드 (DMSO, ジメチルスルホキシド)나 포름 아미드 등을 추가함으로써 클램프 프로브와 야생형 핵산과의 특이적인 하이브리드 형성을 촉진할 수도 있다. 그러나, 그 후 또는 동시에 진행되는 핵산 증폭 반응을 저해하도록 하는 물질의 혼입을 회피하는 것이 바람직하다. 특히 핵산 증폭 반응과 동시에 실시하는 경우는 핵산 증폭 반응에 적합한 반응 조성인 것이 바람직하다.

공정 (a)에 사용하는 「핵산 샘플」로는, 핵산을 함유하는 샘플이며, 표적 부위를 포함한 핵산을 함유할 가능성이 있는 샘플이면, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 표적 부위를 가지는 야생형 핵산 또는 그의 변이형 핵산의 적어도 일방을 함유할 가능성이 있는 샘플, 더욱 바람직하게는, 그것의 양방을 함유할 가능성이 있는 샘플이다. 예를 들어, 혈액이나 조직 등을 시료로서 시료 중의 모든 세포로부터 얻은 게놈 DNA나 RNA가 해당한다. 이 핵산의 추출은, 페놀/클로로포름법 등의 공지의 수법에 의해 수행할 수 있다. 이 때, 검출 대상인 표적 핵산에 있어서 변이형의 존재 비율은 묻지 않는다. 예를 들어 100 %가 야생형이어도 좋고, 50 %가 야생형이며 나머지 50 %가 변이형이어도 좋다. 또한 해당 핵산 샘플은, 세포로부터 얻은 게놈 DNA이어도 좋고, 세포로부터 조제된 mRNA이어도 좋고, mRNA를 주형으로 하여 역전사 반응을 수행하여 얻은 cDNA이어도 좋다. 또한 클론(クロ-ン)화된 다수의 유전자를 인공적으로 혼합한 것이어도 좋고, 핵산 증폭 반응에 의해 인공적으로 증폭시킨 핵산, 또는 이들의 혼합물이어도 좋다.

본 발명에 사용할 수 있는 광연결성 핵산류로서는, 표적 부위의 핵산 또는 표적 부위 근방의 핵산에 광연결에 의해 크로스링크 가능하면 좋다. 예를 들어, 소라렌(ソラレン) 유도체 (Chang, E. et al. Biochemistry 1991, 30, 8283)나 아미노푸린(アミノプリン) 유도체 (특개 2001-206896)나 4 -티오우라실(４－チオウラシル) 등이 사용될 수 있다. 상기 소라렌 유도체는 5'-AT-3'인 염기 서열의 티민(チミン) 특이적으로 반응하는 성질이 있으며, 아미노푸린 유도체는 서열 의존성은 없지만 시티딘(シチジン) 특이적이기 때문에, 적용 범위에 일정한 제약이 있기 때문에, 그러한 제한이 없는 하기의 광연결성 핵산류가 보다 바람직하다.

사용이 바람직한 제 1의 광연결성 핵산류로서는, 염기 부분으로서, 식 I:

[화학식 1]

(식 중, Ra는 시아노기, 아미드기, 카르복실기, C2 ~ C7의 알콕시 카르보닐기 또는 수소이고, R₁ 및 R₂는, 각각 독립적으로, 시아노기, 아미드기, 카르복실기, C2 ~ C7의 알콕시 카르보닐기 또는 수소이다)

로 표시되는 기를 갖는 핵산류 (Org. Lett., Vol. 10, No. 15, 2008, 특개 2009-254279)를 꼽을 수 있다. 결합된 핵산이 DNA인 경우, 이 식 I로 표시되는 치환 카루바조릴(カルバゾリル)기는, 식 I (a):

[화학식 2]

으로 나타난 바와 같이, 2-데옥시리보스(２－デオキシリボ-ス)의 1위치(位)의 탄소 원자 (C)에, β위치에서 결합하고 있다. 구체적인 예로는, 3-시아노비닐 카루바졸-1'-β-데옥시리보시드 [3-cyanovinylcarbazole-1'-β-deoxyriboside (CNVK)]를 들 수 있다.

또한 사용이 바람직한 제 2의 광연결성 핵산류로서, 식 II:

[화학식 3]

(식 중, R은, -CN, -CONR¹R², 또는-COOR³이며, 관련 R¹ ~ R³는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 알킬기 C_nH_{2n +1} (n ≥ 1)이다. 여기서 n의 상한은 특히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, n은 1 ~ 7, 바람직하게는 1 ~ 5일 수 있다.)

로 표시되는 기를 가지는 핵산류 (Organic & Biomolecular Chemistry 2007, 5, 2583, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 (2005) 1299-1301, 특개 2005-348645)를 들 수 있다. 결합된 핵산이 DNA인 경우, 이 식 II로 표현되는 치환 페녹시(フェノキシ)기는 식 II(a):

[화학식 4]

으로 나타난 바와 같이, 2-데옥시리보스의 1위치(位)의 탄소 원자 (C)에, α위치에서 결합하고 있다. R이, -CN, -COOH, -COOMe인 것이 바람직하고, 특히, -COOH 또는 -COOMe 인 것이 바람직하다.

이러한 식 I이나 식 II로 표시되는 기(基)를 가지는 것으로서 광연결성을 구비한 핵산류로 된다. 이 광연결성의 부여는 DNA이어도 RNA이어도, 또한 뉴클레오티드 아날로그이어도 가능하다. 이러한 광연결성 핵산류는 통상의 핵산의 제조 방법에 준하여 제조할 수 있다.

공정 (a)에 사용되는 「클램프 프로브」로는, 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지며, 그리고, 상기 광연결성 핵산류를 포함하는 핵산류 프로브를 말한다. 해당 클램프 프로브는 상기 식 I 및 II로 표시되는 기(基)를 가진 광연결성 핵산류를 포함하면 좋지만, 식 I로 표시되는 기를 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 상기 클램프 프로브는, DNA이어도 RNA이어도 또한 뉴클레오티드 아날로그이어도 좋다. 본 발명의 변이형 핵산 검출 방법에서는, 상기 클램프 프로브를 가지는 광연결성 핵산류가 야생형 핵산의 표적 부위에 대해서 상보적인 서열인 것을 특징으로 한다. 상기 클램프 프로브의 염기 서열 및 광연결성 핵산류의 위치나 수는 표적 부위의 일부 또는 전부와 특이적으로 하이브리다이제이션하는 것이면, 특별히 한정되는 것이 아니다. 클램프 프로브의 길이는, 구체적인 하이브리다이제이션이 가능하면 특히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 7 염기로부터 30 염기인 것이 바람직하다.

상기 「뉴클레오티드 아날로그」로는, 비천연(非天然)의 뉴클레오티드이며, 천연의 뉴클레오티드인 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)나 리보뉴클레오티드(RNA)와 비슷한 기능을 가진 것을 말한다. 즉, 뉴클레오티드 아날로그는, 뉴클레오티드처럼 인산 디에스테르(リン酸ジエステル) 결합에 의해 사슬을 형성할 수 있고, 또한, 뉴클레오티드 아날로그를 사용하여 형성된 프라이머나 프로브는, 뉴클레오티드만을 이용하여 형성된 프라이머나 프로브와 마찬가지로, PCR나 하이브리다이제이션에 사용할 수있다. 이러한 뉴클레오티드 아날로그로서, 예를 들어, PNA (폴리아미드 뉴클레오티드 유도체), LNA (BNA), ENA (2'-O, 4'-C-Ethylene-bridgednucleic acids) 및 이들의 복합체 등이 있다. 여기서, PNA는, DNA나 RNA의 인산과 5 탄당(炭糖)으로 구성되는 주사슬(主鎖)을 폴리아미드 사슬로 치환한 것이다. 또한, LNA (BNA)는, 리보뉴클레오티드의 2' 부위의 산소 원자와 4' 부위의 탄소 원자가 메틸렌을 통해 결합하고 있는 2 개의 환상(環狀)구조를 가지는 화합물이다.

공정 (a)에 사용되는 클램프 프로브는, 센스 사슬에 대한 것 뿐만 아니라, 안티센스 사슬에 대해서도 조제(調製)하여 사용할 수 있다. 특히 공정 (a)의 핵산 샘플 중의 핵산이 이체(二體) 사슬 DNA인 경우, 양 사슬에 대해서 조제한 클램프 프로브를 동시에 사용하고, 양 사슬의 표적 부위에 광연결시킴에 의해, 후의 공정 (c)에 있어서 야생형 핵산의 핵산 증폭 억제 효과를 증대할 수 있다. 센스 사슬 및 안티센스 사슬 대한 클램프 프로브는, 서로의 클램프 프로브들이 광연결을 일으키지 않는 위치에 광연결성 핵산류를 도입하는 것이 바람직하다.

공정 (b)에 있어서, 하이브리드 형성한 클램프 프로브와 상보 사슬의 야생형 핵산 분자에 대해서 광 조사를 실시하는 것으로써 광연결시킨다. 이 광연결은 인공 염기 부분의 광 반응에 의해 광연결성 핵산류 분자와 표적 핵산 분자와의 사이에, 분자 사이의 공유 결합이 형성되어 발생하기 때문에, 분자 사이의 가교 (크로스 링크)에 해당하는 것이다. 이와 같이 크로스링크가 형성된 분자와 분자는 단순한 열적 안정성만 회합(會合)하는 것은 아니기 때문에, 상보적 이중 사슬이 해리하는 조건에 놓인 경우에도 분리하지 않고 결합하고 있다.

공정 (b)에 있어서 광연결시키는 반응은, 완충 작용이 있는 염(鹽)을 포함 하는 반응 용액 중에서 할 수 있다. 완충 작용이 있는 염으로서는 카코딜산(カコジル酸)염, 인산염, 트리스(トリス)염을 들 수 있다. 완충 작용이 있는 염의 농도는, 5 ~ 250 mmol/L의 범위에 있는 것이 바람직하다. 또한, 알칼리 금속 및/또는 알칼리토류 금속의 염을 포함하는 것이 바람직하다. 알칼리 금속 및/또는 알칼리토류 금속으로서 염화나트륨, 및 염화마그네슘을 들 수 있다. 또한 반응액 중에 DMSO나 포름아미드 등의 유기 용제를 첨가함으로써 클램프 프로브와 야생형 핵산과의 특이적인 광결합 반응을 촉진할 수도 있다. 다만, 그 후 또는 동시에 진행되는 핵산 증폭 반응을 저해하려는 물질의 혼입을 회피하는 것이 바람직하다. 특히 핵산 증폭 반응과 동시에 행하는 경우는 핵산 증폭 반응에 적합한 반응 조성인 것이 바람직하다.

공정 (b)에 있어서 광 조사는, 일반적으로 350 ~ 380 nm의 범위, 바람직하게는 366 nm의 파장을 포함하는 광이 바람직하고, 특히 바람직하게는, 366 nm의 단일 파장의 레이저광이다. 바람직한 실시 양태에서 광 조사에 의한 광반응은 1 초 ~ 수 초 이내가 바람직하다. 그러나, 용기 및 용액의 광투과성을 고려하여 더욱 시간을 들여서 실시할 수도 있다.

공정 (b)에 있어서의 광연결은, 상기와 같이 통상의 하이브리드 형성에 있어서 상보적 이중 사슬이 해리하는 조건에 있어서도 결합을 유지할 수 있기 때문에, 통상의 상보 사슬끼리 결합 및 해리하는 온도 사이클을 마련해, 상보 사슬끼리 결합할 수 있는 온도에서 광 조사를 반복함으로써 클램프 프로브와 크로스링크 (연결) 한 상보 사슬의 야생형 핵산 분자를 축적할 수 있다.

공정 (a), (b)에 이용되는 핵산 샘플이 mRNA 등의 RNA의 경우, 클램프 프로브와 광연결 반응을 실시한 후에, cDNA 합성을 해서 PCR 등의 증폭 반응에 제공할 수도 있고, 1스텝 PCR 등으로 유전자 증폭할 수도 있다. 또한, cDNA 합성한 후, 인비트로 트랜스크립션(インビトロトランスクリプション)법에 의해 RNA 증폭할 수도 있다.

공정 (a), (b)에 이용되는 핵산 샘플이 cDNA 등의 일체(一體) 사슬 DNA인 경우, 클램프 프로브와 광연결 반응을 수행 한 후에, PCR 등의 증폭 반응에 제공할 수 있으며 인비트로 트랜스크립션법에 의해 RNA 증폭할 수도 있다.

공정 (a), (b)에 이용되는 핵산 샘플이 염색체 DNA 등의 이체 사슬 DNA인 경우, 상기 이체 사슬 DNA의 하이브리다이즈(ハイブリダイズ)를 열변성이나 산성 조건 등의 변성 조건에서 처리하고, 일체 사슬 DNA로부터 공정 (a)를 상기의 일체 사슬 DNA의 경우와 마찬가지로 실시할 수 있다.

공정 (c)에 있어서, 광결합 반응을 실시한 핵산 샘플을 주형으로 하고, 증폭 프라이머를 이용하여 핵산 증폭법 (예를 들어, PCR)을 행함에 의해 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 증폭한다. 공정 (c)에서 사용하는 증폭 프라이머는, 변이형 핵산의 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 증폭할 수 있는 프라이머이며, 그것은 동시에, 크랭크 프로브(クランクプロ-プ)가 광연결되기 전의 야생형 핵산에서, 야생형 핵산의 표적 부위를 포함하는 검출 영역도 증폭시킬 수 있는 프라이머이다. 야생형 서열을 가지는 분자는 광 조사에 의해 클램프 프로브와 크로스링크 (연결)하고 있기 때문에, 가교된 염기보다 3' 말측으로의 신장 반응이 진행되지 않고 증폭되지 않는다. 한편, 변이형 서열을 가지는 분자의 대부분은 클램프 프로브와 크로스링크 (연결)하고 있지 않기 때문에, 신장 반응이 일어나고, 그 결과, 선택적인 핵산 증폭이 이루어진다.

핵산 증폭법이 PCR인 경우, 공정 (c)에서 사용되는 증폭 프라이머는, 1 또는 2 이상의 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 (증폭용 뉴클레오티드 서열)을 PCR에 의해 증폭할 수 있는 프라이머이며, 증폭용 뉴클레오티드 서열 을 사이에 끼우는 2 종류의 프라이머이다. 예를 들어, 증폭용 뉴클레오티드 서열의 상류 끝 영역과 상동적(相同的)인 뉴클레오티드 서열을 가지는 포워드 프라이머(フォワ-ドプライマ-)와, 증폭용 뉴클레오티드 서열의 하류 끝 영역과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지는 리버스 프라이머(リバ-スプライマ-)로 구성된 2 종류의 프라이머이어도 좋다. 또한, PCR에 사용된 상기 2 종류의 프라이머의 각 농도는, PCR 산물로서 이체 사슬 핵산을 얻을 수 있는 농도 비율이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 등등 농도로 사용하는 것이 바람직하다.

PCR에 이용되는 이들 프라이머는 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 서열 정보로부터 통상의 방법(常法)에 의해 설계, 합성할 수 있다.

PCR에 이용되는 이들 프라이머는, 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 아날로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상이 인산디에스테르(リン酸ジエステル) 결합에 의해 연결한 것이다. 프라이머의 길이는, 프라이머의 Tm 값, 증폭 뉴클레오티드 서열의 종류 등을 고려하여 적절히 결정할 수 있지만, 10 ~ 100 분자 연결한 것이 바람직하다.

PCR은, 통상 사용되는 시약을 통상 사용되는 양으로 사용하여, 통상 사용되는 프로토콜에 따라, 통상의 방법(常法)에 의해 수행할 수 있다. 또한 PCR에 이용되는 DNA 폴리메라아제는, 통상 PCR에 있어서 사용된 DNA 폴리메라아제이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 내열성 폴리메라아제인 것이 바람직하다.

광 조사에 의한 표적 분자와의 크로스링크에 의해 폴리메라아제의 신장 반응을 저해하기 때문에, 클램프 프로브 자체에 뉴클레아제 활성에 대한 저항성은 필요로하지 않는다. 따라서 뉴클레아제 활성을 갖는 폴리메라아제의 사용도 가능하다. 그러나, 프라이머로서 기능하고 폴리메라아제의 신장 반응이 생길 수 있는 핵산류를 클램프 프로브에 이용하는 경우는, 폴리메라아제에 의한 신장 반응이 일어나는 온도에서 표적 분자로부터 해리하도록 Tm 값을 고려하거나, 클램프 프로브의 3' 말단(未端)에 신장 반응을 저해하는 물질을 수식(修飾)함에 의해 증폭 프라이머로서 기능하지 않도록 하는 것이 바람직하다.

공정 (d)에 있어서, 공정 (c)의 증폭 산물을 해석하는 방법으로서, 이하의 공지 방법을 들 수 있다. 예를 들어, 공정 (c)에서 얻은 증폭 산물을 사용하는 방법으로서는, 해당 증폭 산물에 포함된 변이형 핵산이 기지(旣知, 이미 알려진) 변이인 경우는, 마이크로 어레이(マイクロアレイ)와 같은 기판 분석(アッセイ)을 이용하여 변이형 핵산의 유무를 판정할 수 있다. 또한, RFLP 법을 이용하면, 제한 효소에 의한 소화(消化)의 유무에 의해서 변이형 핵산의 유무를 판정 할 수 있는 경우가 있다. 또는, 표적 부위에 미지(未知, 알 수 없는)의 변이형 핵산이 있다고 생각되는 경우는, 검출 영역의 증폭 산물에 대한 염기 서열을 결정함으로써 변이형 핵산의 유무를 판정할 수 있다.

한편, 예를 들어, 판정하고싶은 변이형 핵산이 알려진 변이인 경우에는, 공정 (c)에서 공지의 실시간 PCR을 실시함에 의해, 변이형 핵산의 유무의 판정 또는 정량(定量)도 할 수 있다. 이에 의해서, 공정 (c)와 공정 (d)를 동시에 실시함으로써, 신속하고 간편하게 변이형 핵산의 유무를 판정할 수 있기 때문에 바람직하다. 실시간 PCR에 의해, 변이형 핵산의 증폭으로 판정을 동시에 실시하는 방법으로는, 특허 문헌 1을 참조할 수 있다.

다음, 제 2의 실시형태에 있어서, 제 1의 실시형태와 다른 점을 들어 설명한다.

제 1의 실시형태와 다른 점은, 공정 (a) 및 공정 (b)를 공정 (c)의 핵산 증폭 반응 중에 실시하는 것이다. 구체적으로는, 예를 들어 PCR 시, 표적 분자와 클램프 프로브가 하이브리드를 형성하도록 하는 온도 조건시 (이른바 공정 (a))에 광을 조사하는 것으로, 표적 핵산과 클램프 프로브가 가지는 광연결 핵산류를 결합시켜 (소위 공정 (b)), 직접 선택으로 변이형 핵산의 증폭을 실시한다.

광의 조사는 1 회 이상 실시하면 좋으나, 증폭 사이클 마다 광 조사를 반복함에 의해, 보다 확실히 야생형 핵산의 증폭을 억제할 수 있기 때문에, PCR 사이클 마다 반복 실시하는 것이 바람직하다. 전체 증폭 사이클에서 광을 조사해도 좋고, 임의의 증폭 사이클에서 조사(照射)를 개시 또는 종료해도 좋다.

공정 (c)에 있어서 PCR 반응 시에도, 통상의 PCR 증폭 반응에 적합한 반응 조성으로 실시할 수 있다. 또한 변이형 핵산의 선택적 증폭 반응을 촉진하기 위해 반응액 중에 DMSO나 포름아미드 등, 하이브라다이즈(ハイブリダイズ) 조건에 영향을 미치는 물질을 추가하는 것도 가능하다.

본 발명의 키트(キット)로서는, 야생형 핵산의 서열을 가지는 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 증폭하는 프라이머를 포함하는, 변이형 핵산의 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 선택적으로 증폭시키는 것으로, 상기 변이형 핵산의 유무를 검출하는 것이다. 또한, 완충액이나 유전자 증폭용의 폴리메라아제 등을 포함 할 수도 있다.

본 발명의 장치로서는, 350 ~ 380 nm 범위의 파장의 광 조사 기능을 갖는 핵산 증폭 장치이다. 상기 핵산 증폭 장치로서는, 본 발명의 반응을 실시할 수 있는 것이며, 공지의 핵산 증폭 기능을 갖추고 있는 것이면 좋고, 바람직하게는, 증폭된 핵산을 정량할 수 있는 실시간 PCR 장치 등을 사용할 수 있다. 이러한 장치에, 350 ~ 380 nm 범위의 파장의 광 조사 기능을 갖추면 좋다.

본 발명의 장치는, 바람직하게는, 본 발명의 제 1 실시 형태의 공정 (a) ~ (c) :

(a) 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 핵산 샘플을 공존시켜, 클램프 프로브와 표적 부위를 가지는 핵산 분자를 특이적으로 하이브리드 형성시키는 공정,

을 실시할 수 있는 프로그램, 및/또는 본 발명의 제 2 실시 형태의 공정 (a) ~ (c) :

(a) 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 핵산 샘플을 공존시켜, 클램프 프로브와 표적 부위를 가지는 핵산 분자를, 특이적으로 하이브리드 형성시키는 공정,

(b) 하이브리드 형성한 클램프 프로브와, 표적 핵산 분자에, 광 조사를 실시여, 광연결시키는 공정,

(c) 상기 공정 (a), (b)를 핵산 증폭 반응 중에 실시하는 공정,

을 실시할 수 있는 프로그램을 포함할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

《실시예 1》

야생형 유전자에 대한 PCR 증폭 억제의 검증

(재료 및 방법)

1. 광연결성 클램프 프로브의 조제

KRAS 유전자 상의 변이점 Gly12 및 Gly13을 표적 부위로 해서, 야생형 서열을 가지는 표적 부위에 하이브다이제이션하는 센스 사슬과 상호 보완적인 클램프 프로브를 설계했다. 동시에 안티센스 사슬 대한 클램프 프로브도 설계하고, 서로의 클램프 프로브들끼리 광연결을 일으키지 않는 위치에 광 응답성 핵산인 3-시아노비닐 카루바졸-1'-β-데옥시리보시드 (CNVK) (특개 2009-254279에 기재된 방법으로 조제. 북륙선단(北陸先端) 대학 과학 기술 대학원 대학, 머티리얼 사이언스 연구과, 후지모토(藤本) 연구실에서 입수)을 도입하여 조제했다. 클램프 프로브의 합성은 파스 머크(ファスマック) 사에 위탁했다. 이들 클램프 프로브의 서열을 표 1에 나타낸다. 또한 CNVK의 구조식을 도 1에 나타낸다.

[표 1]

2. 야생형 KRAS 유전자 단편의 조제

건강한 정상인의 말초 혈액으로부터 통상의 방법에 의해 인간 게놈 DNA를 조제하고, 이것을 주형으로 해서 프라이머 F1 및 R1에 의해 변이점 Gly12 및 Gly13을 포함하는 KRAS 엑손(エクソン) 2의 영역을 통상의 PCR 반응 조건에 의해 증폭했다. PCR 반응에 이용한 프라이머 서열은 다음과 같다.

F1: 5'-AAAGGTACTGGTGGAGTATTTG-3' (서열 번호 1)

R1: 5'-TGAAAATGGTCAGAGAAACC-3' (서열 번호 2)

얻어진 PCR 증폭 산물을 pGEMT easy Vector (프로메가(プロメガ)) 내에, 첨부된 프로토콜에 따라 삽입하여 클로닝(クロ-ニング)했다. 이를 야생형 플라스미드(プラスミド)로 했다. 다음에, 이 플라스미드를 주형으로 해서, 상기 프라이머 세트 F1 및 R1을 사용하여 통상의 PCR 반응 조건에 의해 증폭을 실시하고, 직쇄상(直鎖狀)의 KRAS 야생형 유전자 단편을 얻었다. PCR Purification Kit (퀴아젠(キアゲン))을 이용하여 정제한 후, 이것을 이후의 실험의 주형으로 사용하였다.

3. 야생형 KRAS 유전자 단편에 대한 클램프 프로브의 광연결 반응

1.5 mL 튜브에, 1 nmol/L의 야생형 KRAS 유전자 단편을 2 μL와, 10 μmol/L의 야생형 센스 사슬용 클램프 프로브 (ODN09) 및 야생형 안티센스 사슬용 클램프 프로브 (ODN10)를 각각 2 μL 씩 추가하고, 1 × PCR 버퍼 (10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3), 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl₂, 0.001 % (W/V) gelatin)의 최종 농도로 총량을 20 μL로 했다. 또한 양(兩) ODN을 첨가하지 않고, 그 분량을 멸균수로 치환한 것을 준비했다. 95 ℃로 가온한 히트 블록 중에서 3 분간, 가열 처리한 후, 55 ℃로 가온한 히트 블록에서 3 분간 정치(靜置)하고, UV-LED에 의해, 366 nm 광을 5 초간 조사했다. 또한, 대조로서 366 nm 광을 조사하지 않는 샘플을 동시에 준비했다.

4. 라이트 사이클라를 이용한 PCR 증폭 반응의 확인

상기의 각 조제액 20μL에 80μL의 멸균수를 각각 추가하여 잘 혼합한 후, 그 안에 5μL 씩을 주형으로서 프라이머 NF1 및 NR1 의해 라이트 사이클라 (LightCycler; 로슈(ロッシュ))를 사용하여 PCR 반응을 실시했다. PCR 반응 시약은 Light Cycler Fast Start DNA Master SYBER GreenI (로슈)를 사용했다. 또한, 프라이머의 서열은 다음과 같다.

NF1: 5'-AACCTTATGTGTGACATGTTCTAA-3' (서열 번호 3)

NR1: 5'-GTCCTGCACCAGTAATATGC-3' (서열 번호 4)

(결과, 고찰)

도 2에 그 결과를 나타낸다. 그래프의 세로축은 형광 강도이며, 횡축은 PCR 사이클 수를 나타낸다.

ODN을 첨가하여 광 조사를 실시한 주형 샘플 (4)과 ODN을 첨가하고 광 조사하지 않은 주형 샘플 (3)의 증폭 곡선을 비교하면, 광 조사를 실시한 주형 샘플 CP (크로싱(クロッシング)) 값이 증가했다. 또한 ODN 미첨가 주형 샘플의 증폭 곡선을, 광 조사의 유 (2) 혹은 무 (1)에서 비교하면, 양자의 CP 값은 동일 정도이며, 또한 광 조사하지 않은 주형 샘플의 증폭 곡선을 ODN 첨가의 유 (3) 혹은 무 (1)에 비교하면 양자의 CP 값은 동일 정도였다. 이 때문에, ODN의 첨가나 366 nm의 광 조사를 단독으로 실시하는 것만으로는 PCR에 의한 유전자 증폭 반응은 억제되지 않고, ODN의 존재하에서 366 nm의 광 조사를 수행함에 의해서만 클램프가 형성되고, 그 결과, KRAS 유전자 단편의 증폭 억제가 일어나는 것으로 밝혀졌다. 또한 PCR 반응 전에, 주형 분자에 대해서 클램프를 형성하여 유전자 증폭을 억제할 수 있기 때문에, 통상의 하이브리드 형성에서는 해리하는 온도 조건이어도, 한 번 결합한 ODN과 주형 분자는 해리하지 않는, 즉, 비평형 상태에 있는 것이 확인됐다. 또한, CP 값의 상대 비교로부터 광연결 반응에 의해 당초 주형량(鑄型量)의 약 97 %가 ODN과 광연결을 일으키고 있는 것으로 추량할 수 있었다.

《실시예 2》

변이형 유전자에 대한 PCR 증폭 억제의 검증

(재료와 방법)

1. 변이형 KRAS 유전자 단편의 조제

실시예 1에서 조제한 야생형 플라스미드에, PrimeSTAR (등록 상표) Mutagenesis Basal Kit (타카라바이오(タカラバイオ))를 이용해 Gly12Ser의 변이를 도입했다. 즉, 당해 방법으로, Kras 유전자의 34번 염기 「G」를 「A」로 변이시켰다. 이것을 변이형 플라스미드로 했다. 다음에, 이 플라스미드를 주형으로 하여, 실시예 1의 2에 기재된 프라이머 세트 F1 및 R1을 사용하여 통상의 PCR 반응 조건에 의해 증폭을 행하여, 직쇄상의 Kras 변이형 유전자 단편을 얻었다. PCR Purification Kit (퀴아젠)을 이용하여 정제한 후, 이것을 이후의 실험의 주형으로 사용하였다.

2. 변이형 KRAS 유전자 단편에 대한 클램프 프로브의 광연결 반응

1.5 mL 튜브에, 1 nmol/L의 변이형 KRAS 유전자 단편을 2 μL와, 10 μmol /L의 ODN09 및 ODN10을 각각 2μL 씩 넣고, 1 × PCR 버퍼의 최종 농도에서 총량을 20 μL로 했다. 클램프 프로브의 서열은 실시예 1에 기재된 것과 동일하다. 또한 광연결 반응은 실시예 1의 3과 같은 조건으로 실시했다. 또한, 대조로서 366nm 광의 조사를 행하지 않은 샘플을 준비했다.

3. 라이트 사이클라를 이용한 PCR 증폭 반응의 확인

실시예 1의 4와 마찬가지로 실시했다.

(결과, 고찰)

도 3에 그 결과를 나타낸다. 그래프의 세로축은 형광 강도이며, 횡축은 PCR 사이클 수를 나타낸다.

ODN 공존 하에서 광 조사를 실시한 샘플과 실시하지 않은 샘플의 CP 값이 같은 정도이기 때문에, PCR 증폭 억제는 대부분 인정되지 않았다. 즉, 야생형 서열의 ODN이 변이형 유전자 단편에 대해서 대부분 광연결되지 않기 때문에, 변이형 유전자 단편을 선택적으로 증폭시킬 수 있다는 것이 시사되었다.

《실시예 3》

변이형 선택적 핵산 증폭의 확인

(재료 및 방법)

1. KRAS 야생형 및 변이형 혼합 샘플의 조제

실시예 1 및 2에서 조제한 KRAS 야생형 유전자 단편과 변이형 유전자 단편을 99:1의 비율로 혼합하여, 10⁷카피/μL의 KRAS 유전자 혼합 샘플을 조제했다.

2. 클램프 프로브와의 광연결 반응

조제한 혼합 샘플을 1.5 mL 튜브에 2μL 분주(分注)하고, 클램프 프로브로서 10 μmol/L의 ODN09 및 ODN10 각각 2μL 씩 넣고, 1 × PCR 버퍼의 최종 농도에서 총량을 20μL로 했다. 또한, 클램프 프로브의 서열은 실시예 1에 기재된 것과 동일하다. 또한 광연결 반응은 실시예 1의 3과 같은 조건으로 실시했다.

3. 광연결 반응 후의 PCR 및 PCR 산물의 클로닝

상기에서 얻은 광연결 반응액 20 μL에 80 μL의 멸균수를 가하고, 그 안에 5 μL를 주형으로 하여 실시예 1의 4에 기재한 프라이머 NF1 및 NR1에 의해 통상의 조건에서 35 사이클의 PCR 반응을 실시했다. 이 PCR 산물을 pGEMT easy Vector (푸로메가(プロメガ)) 내에, 첨부된 프로토콜에 따라 삽입하여 클로닝했다. HB101 컴피턴트 셀(コンピテントセル)(타카라바이오)로 형질 전환하고 LB 암피실린 플레이트(アンピシリンプレ-ト)에서 하룻밤, 배양하여 대장균 콜로니(コロニ-)를 형성시켰다.

4. 염기 서열 결정에 의한 야생형/변이형의 혼재비의 확인

100 개의 콜로니를 주형으로 해서, 벡터 서열을 이용한 프라이머 M13F 및 M13R에 의해 통상의 조건에서 PCR 반응을 실시했다. 이 PCR 산물을 주형으로 하여, 다이렉트 시퀀스(ダイレクトシ-クエンス)법에 의해 각 클론의 염기 서열을 결정했다. 또한, 시퀀스 반응에 제공한 프라이머은 SP6 및 T7이며, 시퀀스 반응 시약은 BigDye Terminator V1.1 cycle sequence Kit (어플라이드 바이오 시스템)을 사용했다.

각 primer의 염기 서열은 다음과 같다:

M13F: 5'-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3' (서열 번호 5)

M13R: 5'-TCACACAGGAAACAGCTATG-3' (서열 번호 6)

SP6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3' (서열 번호 7)

T7: 5'-AATACGACTCACTATAGGG-3' (서열 번호 8)

(결과, 고찰)

광 조사 전의 혼재비가 야생형 99/변종형 1 인 샘플이, 광 조사 후에 야생형 87/변종 13으로 상승하고 있는 것이 확인됐다.

《실시예 4》

PCR 증폭 반응시에 광연결을 행한 경우의 변이형 유전자의 선택적 증폭의 확인

(재료와 방법)

1. PCR 반응 용액의 조제

유전자 증폭용 반응액으로서 이하의 PCR용 반응액을 조제하여 사용했다:

PCR 버퍼 (10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3), 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 0.001 % (W/V) gelatin);

200 μmol/L 각 dNTP (= dATP, dTTP, dCTP, dGTP);

0.75 U/μL AmpliTaq Gold (Applied Biosystems 사).

상기 유전자 증폭용 반응액에 증폭 프라이머로서 NF1 및 NR1를 각각 0.2μmol/L 첨가했다. 또한 클램프 프로브로서 ODN09 및 ODN10을 각각 0.4 μmol/L 첨가했다. 단, 증폭 프라이머 및 클램프 프로브의 서열은 실시예 1의 것과 동일하다. 이 유전자 증폭용 반응액에 100 pmol/L의 야생형 KRAS 유전자 단편 및 변이형 KRAS 유전자 단편을 주형으로 하여 1μL 씩, 개별 튜브에 가해서 PCR 반응에 사용했다. 이 반응의 주형으로서 이용한 유전자 단편은 10⁷ 카피에 상당한다.

2. 광연결 반응을 수반하는 PCR 반응의 실시

PCR용 0.2 mL 튜브에 상기 반응 용액 및 주형 유전자 단편을 넣고, PCR을 실시했다. PCR 반응은 94 ℃, 10 분 + (94 ℃, 30 초/ 55 ℃, 30 초/ 72 ℃, 30 초) × 35 사이클 + 72 ℃, 3 분의 조건에서 실시했다. 전체 35 사이클에서, 55 ℃, 30 초 어닐링마다 366 nm 광을 UV-LED에 의해 5 초 동안 조사하여 클램프를 형성시켰다. PCR 후의 반응액은 3 % 아가로스겔을 이용하여 전기 영동을 실시하여, 에티듐 브로마이드(エチジウムブロマイド)에 의한 염색 후, 트랜스 일루미네이터(トランスイルミネ-タ-)에 의해 증폭 산물의 확인을 실시했다.

(결과, 고찰)

도 4에 그 결과를 나타낸다. 야생형 유전자 단편 유래의 PCR 증폭 산물은 전기 영동 후의 에티듐 브로마이드 염색에 의해 그 존재를 확인할 수 없었지만, 변이형 유전자 단편 유래의 PCR 증폭 산물은 그 존재를 확인할 수 있었다. 이 때문에 야생형용 클램프 프로브에 의한 광연결 반응은 단일 염기 치환이라는 경미한 변이의 존재를 식별하고, 야생형 및 변이형 서열에 대한 PCR에 의한 핵산 증폭양에 차이를 발생시키는 것으로 나타났다. 이 높은 특이성을 갖춘 클램프 프로브를 이용함에 의해, 변이형을 선택적이고 그리고 고감도로 검출하는 방법의 확립이 가능하다고 생각된다.

《실시예 5》

PCR 증폭 반응시에 광연결을 실시한 경우의 변이형 유전자의 검출 감도의 확인

(재료와 방법)

1. 광연결성 클램프 프로브의 조제

EGFR 유전자 상의 변이점 Leu858을 표적 부위로 해서, 야생형 서열을 가지는 표적 부위에 하이브리다이제이션하는 센스 사슬과 상보적인 클램프 프로브를 설계했다. 동시에 안티센스 사슬에 대한 클램프 프로브도 설계하고, 서로의 클램프 프로브들이 광연결을 일으키지 않는 위치에 실시예 1에서 기재한 광응답성 핵산인 CNVK를 도입하여 조제했다. 클램프 프로브의 합성은 파스머크(ファスマック)사에 위탁했다. 이들 클램프 프로브의 서열을 표 2에 나타낸다.

[표2]

2. EGFR 엑손 21 영역에서의 야생형 및 변이형 유전자 단편의 조제

건강한 정상인의 말초혈(末梢血)로부터 통상의 방법으로 인간 게놈 DNA를 조제하고, 이것을 주형으로서 프라이머 세트 EGFR 엑손 21F 및 EGFR 엑손 21R 의해 변이점 Leu858을 포함하는 EGFR 엑손 21의 영역을 통상의 PCR 반응 조건에 의해 증폭했다. PCR 반응에 이용한 프라이머 서열은 다음과 같다.

EGFR 엑손 21F: 5'-GCATGAACTACTTGGAGGAC-3' (서열 번호 9)

EGFR 엑손 21R: 5'-ACCTAAAGCCACCTCCTTAC-3' (서열 번호 10)

얻어진 PCR 증폭 산물을 pGEMT easy Vector (푸로메가) 내에, 첨부된 프로토콜에 따라 삽입하여 클로닝했다. 이를 야생형 플라스미드로 했다. 다음에, 이 야생형 플라스미드에 PrimeSTAR (등록 상표) Mutagenesis Basal Kit (타카라바이오)를 이용해 Leu858Arg의 변이를 도입했다. 즉, 당해 방법으로, EGFR 유전자의 2573번 염기 「T」를 「G」로 변이시켰다. 이것을 변이형 플라스미드로 했다.

이 플라스미드를 주형으로 하여, 상기 프라이머 세트 EGFR 엑손 21F 및 EGFR 엑손 21R을 사용하여 통상의 PCR 반응 조건에 의해 증폭을 실시하고, 직쇄상의 EGFR 엑손 21의 야생형 및 변이형 유전자 단편을 얻었다. PCR Purification Kit (퀴아젠)을 이용해 정제했다.

정제한 EGFR 엑손 21의 야생형 및 변이형 유전자 단편의 중량 농도를 NanoDrop spectrophtometer (Thermo Scientific)를 이용하여 측정하고, 증폭 단편 길이를 고려하여 각 유전자 단편의 카피 수를 산출했다. 야생형과 변이형 유전자 단편을 표 3과 같이 혼합하고, 이를 이후의 실험 주형으로 사용하였다.

[표 3]

3. 광연결 반응을 수반하는 PCR에 의한 증폭 반응

실시예 4와 같은 조성으로 유전자 증폭용 반응액을 조제하고, 이것에 증폭 프라이머로서 EGFR 엑손 21NF 및 EGFR 엑손 21NR을 각각 0.2 μmol/L 첨가했다. 이 프라이머 서열은 다음과 같다.

EGFR 엑손 21NF: 5'-CTTGGAGGACCGTCGCTTG-3' (서열 번호 11)

EGFR 엑손 21NR: 5'-CCACCTCCTTACTTTGCCTC-3' (서열 번호 12)

또한 클램프 프로브로서 상기 ODN11 및 ODN12을 각각 0.4 μmol/L 씩, 유전자 증폭용 반응액에 첨가했다.

PCR 용 0.2 mL 튜브에 각 혼합비의 주형 유전자 단편을 4 μL 씩, 개별 튜브에 분주하고, 상기 유전자 증폭용 반응액을 첨가하여 PCR을 실시했다. PCR 반응은 94 ℃, 10 분 + (94 ℃, 30 초/ 55 ℃, 30 초/ 72 ℃, 30 초) × 35 사이클 +72 ℃, 3 분의 조건에서 실시했다. 전체 35 사이클에서 55 ℃, 30 초 어닐링마다 366 nm의 광을 UV-LED에 의해 5 초 동안 조사했다. 또한, 대조로서 366 nm의 광을 조사하지 않는 샘플을 동시에 준비했다.

4. 라이트 사이클라를 이용한 PCR 반응에 의한 카피 수의 확인

3. 항에서 얻은 각 PCR 증폭 산물의 일부를 분취하고, 여기에 멸균수를 넣어 100 ~ 100000 배 희석한 샘플을 조제했다. 이러한 샘플 5μL 씩을 주형으로하여, 프라이머 EGFR 엑손 21NF 및 EGFR 엑손 21NR에 의해, 라이트 사이클라 (LightCycler; 로슈)를 사용하여 PCR 반응을 실시했다. 그 때, 야생형 유전자 단편의 희석계열 (카피 수 = 10³~ 10⁸)를 준비하고, 이를 기준(スタンダ-ド)으로 하여 동시에 PCR 반응에 제공했다. PCR 반응 시약은 Light Cycler Fast Start DNA Master SYBER GreenI (로슈)를 사용했다.

PCR 반응 후, 기준 증폭 곡선으로부터 검량선을 작성하고, 각 샘플의 CP 값에서 샘플 원액의 카피 수를 산출했다. 그 값을 바탕으로, 3. 항에서 얻은 각 PCR 증폭 산물을 각각 10⁶ 카피 / 4μL로 되도록 멸균수로 희석 조제했다.

5. 실시간 정량 PCR용 반응액의 조제

실시간 정량 PCR용 반응액으로서 이하의 시약을 혼합하여 조제하였다. 12.5 μL의 2 × Premix Ex Taq (R)(등록상표) (다카라바이오)에, 증폭 프라이머로서 EGFR 엑손 21NF 및 EGFR 엑손 21NR을 각각 5 pmol 씩 첨가했다. 또한 말단 형광 표지한 변이 검출 프로브를 2.5 pmol 첨가했다. 이 변이 검출 프로브의 서열은 다음과 같다.

L858R 검출 프로브: 5'-(6-FAM) tttggccCgcccaa (BHQ1)-3'

여기서, 서열의 소문자는 DNA를, 대문자 C는 LNA를, 6-FAM은 형광 색소를, BHQ1은 형광 억제 물질을 각각 나타낸다. 당해 변이 검출 프로브의 합성은 IDT사에 위탁했다. 또한 여기에 기술한 본 반응액의 용량은 1 샘플 당의 것이며, 이를 필요양분 조제했다.

6. PNA-LNA clamp PCR용 반응액의 조제

5. 항에서 조제한 실시간 정량 PCR용 반응액에, L858R용 클램프 프로브로서 PNA (L858c)을 12.5 pmol 첨가하여, PNA-LNA clamp PCR용 반응액으로 했다. PNA (L858c)의 서열은 다음과 같다.

PNA (L858c): NH₂-TTTGGCCAGCCCAA-CONH₂

PNA (L858c)의 합성은 파나진(パナジ-ン)사에 위탁했다.

또한, 여기에 기술한 본 반응액의 용량은 1 샘플 당의 것이며, 이를 필요량 분 조제했다.

7. 실시간 정량 PCR에 의한 변이형 유전자 검출 감도의 확인

5. 항에서 조제한 실시간 정량 PCR 반응액에, 3. 항에서 366 nm 광의 방사를 실시한 PCR 증폭 산물을 4. 항에 기재된 방법으로 10⁶ 카피/4 μL로 희석 조제하고, 주형으로서 4 μL 씩 개별 웰(ウェル)에 첨가했다. 최종 액량이 25 μL가 되도록 멸균 증류수로 조제한 후, 라이트 사이클라 LC480 (로슈)를 사용하여 실시간 정량 PCR을 실시했다. 대조로서, 3. 항에서 366 nm 광의 조사를 행하지 않았던 PCR 증폭 산물을 4. 항에 기재된 방법으로 10⁶카피/4 μL으로 희석 조제한 것에 대해서도, 실시간 정량 PCR을 실시했다.

또한, 비교예로서, 6. 항에서 조제한 PNA-LNA clamp PCR용 반응액에, 3. 항에서 366 nm 광의 조사를 행하지 않은 PCR 증폭 산물을 4. 항에 기재된 방법으로 10⁶ 카피/4 μL로 희석 조제하고, 주형으로서 4 μL 씩 개별 웰에 첨가했다. 최종 액량이 25 μL가 되도록 멸균 증류수로 조제한 후, 동시에 실시간 정량 PCR을 실시했다. 또한 본 반응은 95 ℃, 10 초+ (95 ℃, 3 초/56 ℃, 30 초) × 45 사이클의 조건에서 실시했다.

(결과, 고찰)

도 5 ~ 도 7에 그 결과를 나타낸다. 각 그래프의 세로축은 형광 강도이며, 가로축은 PCR 사이클 수를 나타낸다. 도 5는 PCR 증폭 반응시에 광연결 반응을 실시하지 않은 샘플 (대조)이며, 도 6은 PCR 증폭 반응시에 광연결 반응을 실시하지 않은 것에 대해서, PNA-LNA clamp PCR 반응을 실시한 샘플 (비교예)이며, 도 7은 광연결 반응을 실시한 샘플 (본 발명)이다. a로부터 c는, 각 PCR 반응의 주형에 이용한 야생형 유전자와 변이형 유전자의 혼합비를 나타낸다. 즉, a는 100:1, b는 1000:1, c는 야생형 유전자만이다. 도 5에 나타난 바와 같이, 광연결 반응도 PNA-LNA clamp PCR 반응도 실시하지 않은 샘플에서는, 변이형 유전자의 혼재량이 1/100 량 (a)이어도 야생형 유전자만 (c)의 시그날(백그라운드)과의 구별이 거의 되지 않아서, 변이형 유전자를 검출할 수 없었다. 도 6의 PNA-LNA clamp PCR 반응을 실시한 샘플에서는, 변이형 유전자의 혼재량이 1/100량 (a)에서는 검출할 수 있었으나, 1/1000량 (b)에서는 야생형 유전자만 (c)의 시그날과 구별이 되지 않았다. 즉, 변이 유전자의 검출 감도는 1%였다. 한편, 도 7의 366 nm 광의 조사에서 광연결 반응을 실시한 샘플에서는, 변이형 유전자의 혼재량이 1/1000량 (d)이어도, 충분한 검출이 가능하며, 0.1 % 의 검출 감도를 확인할 수 있었다.

이상의 결과로부터, 광연결 반응을 이용한 본 발명에 따르면, EGFR의 유전자 풀(プ-ル)에 혼재하는 점 돌연변이 유전자의 검출은, 그 혼재 비율이 0.1 %이어도 가능한 것이 판명됐다. 서던 블로팅(サザンブロット)이나 다이렉트 시퀀스(ダイレクトシ-クエンス)법 같은 종래의 방법에서는, 신용성이 높은 검출 감도의 한계가 약 10 %인 것과, 비교예로서 동시에 실시한 PNA-LNA clamp PCR법에 의한 본 변이점의 검출 감도는 1 % 였음을 감안하면, 본 발명의 변이 유전자 검출 방법은 매우 높은 감도를 가지고 있다고 할 수 있다.

PNA-LNA clamp PCR법은, PNA (클램프 프로브)와 LNA (변이 검출 프로브)의 경합 효과를 이용하여 변이 검출 감도를 향상하고 있다. 즉 클램프 형성과 검출 반응이 동시에 진행하는 것에 대해, 광연결 반응을 이용한 경우, 본 실시예와 같이 클램프 형성과 검출 반응을 독립적으로 할 수 있고, 경합 반응을 이용하지 않는 통상의 실시간 정량 PCR 등 에서도 고감도 변이 검출이 가능하다. 이런 사실은, 앞의 실시예에서 볼 수 있듯이 광연결성 클램프 프로브와 주형 분자의 결합을 비평형 상태에 있게 함에 의해서 처음으로 가능하게 되는 현상이라고 말할 수 있어, 본 발명의 우위성을 나타내고있다.

[산업상 이용 가능성]

본 발명에 따르면, 높은 특이성과 감도를 양립시키고, 야생형 유전자군에 혼재하는 미량의 변이 유전자의 검출을 실시할 수 있다. 암 발병의 원인으로서 인식되고 있는 기지의 변이나, 약효와의 관련이 시사되고 있는 기지의 변이를 표적으로 하여 본 발명을 실시함으로써, 암의 조기 발견이나 약효 평가에 의한 개별화 의료가 가능하게 된다. 또한 본 발명에 따르면, 변이형 핵산 분자가 미량 밖에 존재하지 않는 암 환자의 혈액 샘플 등으로부터의 검출도 가능하게 될 수 있다. 지금까지는 외과 수술에 의해 조달(調達)한 암 조직이나 생검 샘플(バイオプシ-サンプル)이라는 침습성이 높은 검사 재료만 취급할 수 없었던 것 때문에, 현실적으로 곤란했던 치료 효과의 확인이나 모니터링 검사를 실시 할 수 있도록 되어 산업에 유용하다.

이상, 본 발명을 특정의 태양에 따라 설명했지만, 당업자에게 자명한 변형이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

[서열표 프리 텍스트]

서열표의 서열 번호 5 ~ 8의 각 염기 서열은 프라이머 서열이다.

<110> Mitsubishi Chemical Medience Corporation <120> Method for inhibiting nucleic acid amplification using light and highly sensitive method for selective nucleic acid amplification <130> PI10415 <150> JP 2010-203054 <151> 2010-09-10 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aaaggtactg gtggagtatt tg 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tgaaaatggt cagagaaacc 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aaccttatgt gtgacatgtt ctaa 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gtcctgcacc agtaatatgc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 5 cagggttttc ccagtcacga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 6 tcacacagga aacagctatg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 7 atttaggtga cactatagaa 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 8 aatacgactc actataggg 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gcatgaacta cttggaggac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 acctaaagcc acctccttac 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cttggaggac cgtcgcttg 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ccacctcctt actttgcctc 20

Claims

표적 부위를 가지는 핵산과, 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브를 공존시켜서, 광 조사함에 의해 상기 표적 부위를 가지는 핵산과 상기 클램프 프로브를 광연결시켜, 핵산 증폭법에 의한 표적 부위를 포함하는 검출 영역의 증폭을 억제하는 방법.
(a) 야생형 핵산의 서열을 가지는 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 핵산 샘플을 공존시켜, 클램프 프로브와 표적 부위를 가지는 야생형 핵산 분자를 특이적으로 하이브리드 형성시키는 공정,
(b) 하이브리드 형성한 클램프 프로브와 표적 핵산 분자에, 광 조사를 실시하여, 광연결시키는 공정,
(c) 상기 공정 (a), (b)의 반응 산물을 핵산 증폭 반응에 제공하는 공정,
(d) 상기 증폭 산물을 해석하는 공정
을 포함하는, 변이형 핵산의 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 선택적으로 증폭시킴으로써, 상기 변이형 핵산의 유무를 검출하는 변이형 핵산 검출 방법.
(a) 야생형 핵산의 서열을 가지는 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 핵산 샘플을 공존시켜, 클램프 프로브와 표적 부위를 가지는 야생형 핵산 분자를 특이적으로 하이브리드 형성시키는 공정,
(b) 하이브리드 형성한 클램프 프로브와 표적 핵산 분자에, 광 조사를 실시하여, 광연결시키는 공정,
(c) 상기 공정 (a), (b)를 핵산 증폭 반응 중에 실시하는 공정,
(d) 상기 증폭 산물을 해석하는 공정을
포함하는, 변이형 핵산의 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 선택적으로 증폭시킴으로써, 상기 변이형 핵산의 유무를 검출하는 변이형 핵산 검출 방법.
청구항 1 ~ 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 증폭법이 PCR법인, 방법.
청구항 1 ~ 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 증폭법이 실시간 PCR 법인, 방법.
청구항 1 ~ 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 클램프 프로브가, 표적 핵산 분자의 센스 사슬 및/또는 안티센스 사슬에 상보적인 서열을 가지는, 방법.
청구항 1 ~ 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 클램프 프로브의 사슬 길이가 7 ~ 30인, 방법.
청구항 1 ~ 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 광 조사가 350 ~ 380 nm 범위의 파장에 의해 수행되는, 방법.
청구항 1 ~ 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 광 조사가, 통상의 상보 사슬끼리의 결합 및 해리하는 온도 사이클에서 상보 사슬끼리 결합할 수 있는 온도에서 1 회 이상 실시되는, 방법.
청구항 1 ~ 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 광 조사가 350 ~ 380 nm 범위의 파장의 광 조사 기능을 부여한 핵산 증폭 장치에 의해 수행되는, 방법.
표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 증폭하는 프라미어를 포함한, 유전자 증폭법에 의한 표적 부위를 포함하는 검출 영역의 증폭을 억제하는 키트.
야생형 핵산의 서열을 가지는 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 증폭하는 프라이머를 포함하고, 변이형 핵산의 표적 부위를 포함하는 검출 영역을 선택적으로 증폭시킴으로써, 상기 변이형 핵산의 유무를 검출하는 변이형 핵산 검출 키트.
350 ~ 380 nm 범위의 파장의 광 조사 기능을 가지는 핵산 증폭 장치.
(a) 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함하는 클램프 프로브와, 핵산 샘플을 공존시켜, 클램프 프로브와 표적 부위를 가지는 핵산 분자를, 특이적으로 하이브리드 형성시키는 공정,
(b) 하이브리드 형성한 클램프 프로브와 표적 핵산 분자에 광 조사를 실시하여, 광연결시키는 공정,
(c) 상기 공정 (a), (b)의 반응 산물을 핵산 증폭 반응에 제공하는 공정,
을 포함하는, 350 ~ 380 nm 범위의 파장의 광 조사 기능을 가지는 핵산 증폭 장치.
(a) 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지는 광연결성 핵산류를 포함 클램프 프로브와, 핵산 샘플을 공존시켜, 클램프 프로브와 표적 부위를 가지는 핵산 분자를 특이적으로 하이브리드 형성시키는 공정,
(b) 하이브리드 형성한 클램프 프로브와 표적 핵산 분자에 광 조사를 실시하여, 광연결시키는 공정,
(c) 상기 공정 (a), (b)를 핵산 증폭 반응 중에 실시하는 공정,
을 포함하는, 350 ~ 380 nm 범위의 파장의 광 조사 기능을 가지는 핵산 증폭 장치.