KR102134361B1 - 광응답성 핵산류를 포함한 프로브를 이용한 광연결 방법 - Google Patents

Abstract

광반응성 핵산류를 포함하는 프로브를 사용한 표적 핵산과의 광연결이 정체해 버리는 문제를 극복하고, 광연결 효율을 향상시키는 광연결 방법 및 광연결 키트를 제공한다. 상기 광연결 방법은, 핵산 샘플 중에 존재하는 표적 부위와, 상기 표적 부위에 대해 상보적인 서열을 가지며, 광응답성 핵산류를 포함한 제1 프로브를, 반응 용액 중에서 하이브리드화하고, 광조사함에 의해 광연결시키는 방법으로서, 상기 제1 프로브의 상기 광응답성 핵산류에 기인한 자기 회합을 억제시키는 것을 특징으로 한다. 상기 광연결 키트는 핵산 샘플 중의 표적 부위에 대해 상보적인 서열을 갖는 광응답성 핵산류를 포함하는 제1 프로브, 상기 제1 프로브에 대해, 높은 상보성을 갖는 제2 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

광응답성 핵산류를 포함한 프로브를 이용한 광연결 방법{Photocoupling method using probe containing photoresponsive nucleic acids}

본 발명은 광응답성 핵산류를 포함한 프로브를 사용하여 광연결하는 방법에 관한 것이다.

최근 개개의 환자 맞춤형 치료법인 개별화 의료를 확립하기 위해, 해당 환자의 특정 유전자 다형(多型)과 약제 감수성이나 약제 반응성과의 관계를 밝히는 연구가 제안되고 있다.

특히, 게놈 과학의 진보에 의해, 약물 동태의 해명, 및 약물 반응성에 관여하는 효소, 단백질 등의 유전자 다형의 해명이 급속하게 이루어지고 있다. 인간 게놈 해석에서, 일염기 다형(Single nucleotide polymorphisms:SNPs)이, 가장 빈도가 높은 유전자 다형 마커로 주목 받고 있다. 상기 SNPs는, 다양한 질환이나 약제 반응과의 연관을 밝히기에 유용하다는 것이 이미 알려져있다. 또한 복수의 SNPs를 이용한 하플러 타입(ハプロタイプ) 해석이, 질병 감수성을 해석하는 데 유용한 것도 알려져 있다.

특히 의료 현장에서는, SNPs의 검출 결과를 이용한 질병 이환율(罹患率)의 진단, 효과적인 투여 약제의 선택, 부작용의 예측 등에의 이용 등이 고려되며, 치료 효과의 증대뿐만 아니라 환자의 QOL의 향상으로도 이어질 것으로 기대되고 있다.

이러한 SNPs 부위의 염기를 판별하는, 이른바 타이핑에 대해서는 많은 수법이 보고되고 있다. DNA의 일염기 다형을 타이핑하는 기술로서는 TaqManPCR법이나 Invader법 등이, 일염기의 치환을 식별할 수 있을 정도의 높은 서열 선택성을 가지는 기술로 알려져 있다.

그러나, 악성 종양과 같은 후발 변이의 검출에 있어서는, 검체 재료가 많이 차지하는 정상 세포에서 유래하는 야생형의 핵산 분자가 백그라운드로 되기 때문에, 위와 같은 해석 방법에서는 일염기 치환 등 변이를 고감도로 검출할 수 없는 경우가 많다.

그 때문에, 상기 방법을 대신하는 특히 효과적인 해석 방법으로서, 광응답성 핵산류의 사용이 개시되어 있다. 하이브리드화(ハイブリダイゼ-ション)한 광응답성 핵산류와 표적 핵산은, 특정 파장의 광조사를 실시하여, 광연결을 형성시킬 수 있다. 이 광연결은, 인공 염기 부분의 광반응에 의해, 광응답성 핵산류 분자와 표적 핵산 분자와의 사이에, 분자 사이의 공유 결합이 형성되어 발생한다. 이처럼 광연결된 분자와 분자는, 단순한 열적인 안정성만으로 회합(會合)하고 있는 것은 아니기 때문에, 상보적 이중사슬이 해리하는 조건에 놓인 경우에도, 해리하지 않고 결합하고 있다 (특허 문헌 1).

또한, 광응답성 핵산류의 성질로서, 광연결 반응은 1초 정도로 매우 빠르게 진행하는 것, 완전히 하이브리드화하지 않으면 광연결 되지 않는다는 지견에 입각하여, 광응답성 핵산류를 사용한 변이형 유전자를 검출하는 해석 방법이 개시되어있다 (특허 문헌 2).

특허 문헌 1 및 2에서는, 광응답성 핵산류를 사용한 SNPs의 특정에 대해 개시되어 있지만, 광응답성 핵산류를 포함한 프로브가, 상보적인 서열을 갖는 표적 부위와 하이브리드화할 때 광연결 한다고 하는 지견에 기초하여, 광응답성 핵산류의 사용이 변이형 유전자의 선택적 증폭에 유용한 예를 개시하고 있을 뿐이다.

따라서, 이와 같은 종래의 기술 상식을 감안하면, 광연결에는 광응답성 핵산류를 포함한 프로브와 그의 상보적인 서열을 갖는 표적 부위가 하이브리드화해야 할 필요가 있고, 또한, 광연결은 광응답성 핵산류와 표적 부위 또는 표적 부위 근방의 표적 핵산과 결합함에 의해 형성되기 때문에, 광응답성 핵산류는 상보적인 서열을 갖는 표적 부위 또는 표적 부위 근방의 표적 핵산 서열 밖에 결합하지 않는다고 고려되고 있다.

특허 문헌 1: 특개 2009-254279호 공보 특허 문헌 2: WO2012/033190호 공보

본 발명자들은, 광응답성 핵산류를 포함한 프로브 (즉, 광연결 프로브)가 표적 핵산에 대해 광연결하는 반응에서, 표적 핵산의 양에 관계없이 일정 비율까지만 광연결할 수 없는, 즉, 광연결이 정체되어 버리는 것을 발견하였다. 이 사실을 받아 예의 검토한 결과, 광연결이 정체되어 버리는 요인으로서, 광응답성 핵산류를 포함한 프로브가, 표적 핵산과 광연결 하기 위한 광조사에 의해, 상기 프로브 자신이 자기(自己)의 서열 내에서 광연결해 버리는 것을 발견하였다. 즉, 프로브 내의 광응답성 핵산류와 해당 광응답성 핵산류와 광연결하는 염기가 회합하고 광연결하기 때문에, 표적 부위와 하이브리드화 및/또는 표적 핵산과 광연결 할 수 없는 프로브가 광조사 시간(에너지) 의존적으로 축적되고, 그 결과로, 표적 핵산에 대한 광연결을 정체시키고 있는 것으로 추정되었다.

또한, 종래의 기술 상식에 기초하여 생각하면, 야생형 유전자를 선택적으로 증폭 억제하여, 변이형 유전자를 선택적으로 증폭하는 경우에서, 특허 문헌 2와 같은 광응답성 핵산류를 사용한 광연결 방법의 가장 큰 우위성은, 한 번, 광에 의해 광연결한 표적 핵산은, PCR 반응 공정에서의 열변성 공정에서 개열(開裂)하지 않는 점, 즉, 한 번, 광에 의해 광연결한 표적 핵산을 비평형계에 반입할수 있다는 점에 있었다.

그러나, 본 발명자들은, 광연결 가능한 파장(365nm)의 광을 조사했을 경우에도, 표적 핵산에 대해 광연결될 뿐만 아니라, 해당 표적 핵산에 대해 광연결된 프로브가, 본래 생기는 것 없는 광개열(光開裂) 반응에 의해 일부, 빠져 버리는 것을 발견했다. 즉, 광연결하는 반응과 광연결을 개열시키는 반응이 동시에 일어나는 광평형 상태가, 표적 핵산에 대한 광연결을 정체시키고 있는 요인으로 간주되었다.

본 발명의 목적은, 광응답성 핵산류를 포함한 프로브를 사용한 표적 핵산과의 광연결이 정체되어 버리는 문제를 극복하고, 광연결 효율을 향상시키는 방법, 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하는 방법을 예의 검토한 결과, 광연결 효율의 정체를 회피하기 위해, 반응 용액 중에서, 광응답성 핵산류를 포함한 프로브의 자기 서열 내에서의 광연결을 억제함으로써, 상기 프로브의 유효 농도를 유지하고, 또한, 국소적으로 표적 부위 부근의 광응답성 핵산류를 포함한 프로브의 실질적인 농도를 높임으로써 하이브리드화를 촉진하여, 광연결 효율을 향상시킬 수 있는 것을 발견했다.

즉, 본 발명은 다음의 내용에 관한 것이다.

[1] 핵산 샘플 중에 존재하는 표적 부위와, 상기 표적 부위에 대해 상보적인 서열을 가지며, 광응답성 핵산류를 포함한 제1 프로브를, 반응 용액 중에서 하이브리드화하여, 광조사함으로써 광연결시키는 방법으로서, 상기 제1 프로브 내의 해당 광응답성 핵산류에 기인한 자기 회합을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 광연결 방법.

[2] 상기 제1 프로브에 대해서, 높은 상보성을 갖는 제2 프로브를 공존시킴으로써, 상기 제1 프로브 내의 해당 광응답성 핵산류에 기인한 자기 회합을 억제시키는 것을 특징으로 하는, [1]의 광연결 방법.

[3] 상기 높은 상보성은, 상기 제1 프로브와 상기 제2 프로브가 서로 상보적인 관계에 있으며, 소정의 광연결 조건 하에서, 상기 제1 프로브 중의 해당 광응답성 핵산류의 자기 내에서 광연결하는 염기가, 제2 프로브와 하이브리드화하고 있는, [1] 또는 [2]의 광연결 방법.

[4] 상기 광연결시키는 방법이, 상기 핵산 샘플 중에 존재하는 표적 부위가있는 표적 핵산과, 상기 제1 프로브의 광응답성 핵산류와의 사이에서 광연결시키는, [1] ~ [3]의 어느 하나의 광연결 방법.

[5] 상기 제2 프로브가 광응답성 핵산류를 포함하는, [1] ~ [4] 중 하나의 광연결 방법.

[6] 상기 제1 프로브 및 상기 제2 프로브가 광응답성 핵산류를 포함하고, 상기 제1 프로브 및 상기 제2 프로브의 비상보성 영역에서, 상기 제1 프로브 및/또는 상기 제2 프로브 내에 존재하는 광응답성 핵산류가 자기 내에서 광연결되지 않도록, 상기 제1 프로브 및/또는 상기 제2 프로브에 상보적인 서열을 갖는 제3 프로브를 사용하는, [1] ~ [5] 중 하나의 광연결 방법.

[7] 핵산 샘플 중에 존재하는 표적 부위와, 상기 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 가지며 광응답성 핵산류를 포함하는 제1 프로브와, 상기 표적 부위에 대해 상보적인 서열을 가지며 표적 핵산을 포함하는 제4 프로브와, 반응 용액 중에서 인접하여 배치하도록 하이브리드화시키고, 광조사에 의해 상기 제4 프로브에 존재하는 표적 핵산과 상기 상기 제1 프로브 중의 상기 광응답성 핵산류와의 사이에 광 연결하는 방법에 있어서,

상기 제1 프로브에 대해, 높은 상보성을 갖는 제2 프로브를 공존시킴으로써, 상기 제1 프로브의 자기 내에서의 광연결을 억제시키는 것을 특징으로 하는, [1]의 광연결 방법.

[8] 상기 제1 프로브 내에서의 광응답성 핵산류와 자기 회합하는 핵산을, 상기 광응답성 핵산류와 광연결하지 않는 핵산에 치환한 상기 제1 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는, 상기 제1 프로브의 자기 내에서의 광연결을 억제시키는 것을 특징으로 하는, [1] ~ [7] 중 어느 하나의 광연결 방법.

[9] 상기 광응답성 핵산류와 광연결되지 않는 핵산이 퓨린 염기인, [8]의 광연결 방법.

[10] 상기 광응답성 핵산류와 광연결하지 않는 핵산이, 피리미딘환을 인공적으로 변환한 합성 염기인, [8]의 광연결 방법.

[11] 반응 용액 중에 음(アニオン)이온성 물질이 존재하는, [1] ~ [10] 중 어느 하나의 광연결 방법.

[12] 적어도 한 종류의 광연결 프로브가, 반응 용액 중에 0.1 μmol/L 이상의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는, [1] ~ [11] 중의 어느 하나의 광연결 방법.

[13] [1] ~ [12] 중 어느 하나의 광연결 방법을 사용하는 유전자 해석 방법.

[14] 상기 유전자 해석 방법은, 유전자 검출 방법 또는 핵산 증폭 방법인, [13]의 유전자 해석 방법.

[15] [14]의 핵산 증폭 방법이, 변이형 핵산의 표적 부위를 포함한 증폭용 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 증폭시킴으로써, 상기 변이형 핵산의 유무를 검출하는 것을 특징으로 하는, 변이형 핵산 검출 방법.

[16] 핵산 샘플 중의 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 갖는 광응답성 핵산류를 포함하는 제1 프로브, 상기 제1 프로브에 대해서, 높은 상보성을 갖는 제2 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는, 광연결 키트.

[17] 상기 제1 프로브가, 핵산 샘플 중의 표적 부위의 표적 핵산과 광연결하는 것인, [16]의 광연결 키트.

[18] 또한, 상기 제1 프로브의 해당 광응답성 핵산류와 광연결하는 표적 핵산을 포함하는 제4 프로브를 포함하는, [16]의 광연결 키트.

[19] 상기 제2 프로브가 광응답성 핵산류를 포함하는, [16] ~ [18] 중의 어느 하나의 광연결 키트.

[20] 상기 제1 프로브가, 상기 프로브 내에서 광응답성 핵산류와 자기 회합하는 핵산을, 상기 광응답성 핵산류와 광연결하지 않는 핵산으로 치환한 것인 [16] ~ [19 ] 중의 어느 하나의 광연결 키트.

본 발명에 의하면, 광응답성 핵산류를 사용한 유전자의 해석 방법에 있어서, 표적 부위와 광응답성 핵산류를 포함하는 프로브 사이의 광연결 효율을 향상시키는 것이 가능하다. 즉, 표적 핵산에 대해 특이적이고 효율 좋게 광연결할 수 있어서, 높은 감도와 특이성을 필요로 하는, 대상으로 하는 유전자의 해석 방법에 있어서 효과적이다.

도1은, 광응답성 핵산의 일례인 3-시아노비닐카바졸(CNVK)의 구조식이다.
도2는 EGFR 유전자 상의 엑손21(ex.21) 영역의 일부를 광연결 형성 대상으로서, 광응답성 핵산인 CNVK의 삽입 위치를 5' 말단에 가까운 위치에 삽입하여 설계 한 광연결 프로브에 있어서, 광연결 형성 파장의 광조사와 광연결 개열(開裂) 파장의 광조사를 실시한 샘플을 전기 영동으로 확인한 결과이다.
도3은, EGFR 유전자 상의 엑손21(ex.21) 영역의 일부를 광연결 형성 대상으로서, 광응답성 핵산인 CNVK의 삽입 위치를 5' 말단 보다 중심에 가까운 위치에 삽입하여 설계한 광연결 프로브에 있어서, 광연결 형성 파장의 광조사와 광연결 개열 파장의 광조사를 실시한 샘플을 전기 영동으로 확인한 결과이다.
도4는, EGFR 유전자 상의 엑손21(ex.21) 영역의 일부를 광연결 형성 대상으로서, 광응답성 핵산인 CNVK의 삽입 위치를 3' 말단 보다 중심에 가까운 위치에 삽입하여 설계한 광연결 프로브에 있어서, 광연결 형성 파장의 광 조사와 광연결 개 열 파장의 광조사를 실시한 샘플을 전기 영동으로 확인한 결과이다.
도5는, EGFR 유전자 상의 엑손21(ex.21) 영역의 일부를 광연결 형성 대상으로서, 광응답성 핵산인 CNVK의 삽입 위치를 3' 말단에 가까운 위치에 삽입하여 설계한 광연결 프로브에 있어서, 광연결 형성 파장의 광조사와 광연결 개열 파장의 광조사를 실시한 샘플을 전기 영동으로 확인한 결과이다.
도6은, CNVK의 표적 핵산으로 되지 않은 아데닌(A)만으로 구성된 광연결 프로브에 있어서, 광연결 형성 파장의 광조사를 실시한 샘플을 전기 영동으로 확인한 결과이다.
도7은, CNVK의 표적 핵산으로 되지 않은 구아닌(G)만으로 구성된 광연결 프로브에 있어서, 광연결 형성 파장의 광조사를 실시한 샘플을 전기 영동으로 확인한 결과이다.
도8은, CNVK의 표적 핵산이 되지 않은 아데닌(A), 구아닌(G)만으로 구성된 광연결 프로브에 있어서, 광연결 형성 파장의 광조사를 실시한 샘플을 전기 영동으로 확인한 결과이다.
도9는, EGFR 유전자의 3 개소의 변이를 목적 부위로서 설계한 광연결 프로브이다. 구체적으로는 (1)은 861번째 류신(L861)를 코드하는 핵산 서열을 목적 부위로 하고, (2)는 790번째 트레오닌(スレオニン)(T790)에 해당하는 핵산 서열을 목적 부위로 하고, (3)은 858번째 류신(L858)에 해당하는 핵산 서열을 목적 부위로 하고, 센스 사슬, 안티센스 사슬 각각에 설계한 광연결 프로브와 그의 상보성에 대해 보여주는 도면이다.
도10은, EGFR 유전자의 861번째의 류신(L861)를 코드하는 핵산 서열을 목적 부위로 하고, 센스 사슬, 안티센스 사슬 각각에 대해 광연결 프로브를 설계한 경우에, 광연결 형성 파장의 광조사를 실시한 샘플을 전기 영동으로 확인한 결과이다.
도11은, EGFR 유전자의 790번째 트레오닌(T790)를 코드하는 핵산 서열을 목적 부위로 하고, 센스 사슬, 안티센스 사슬 각각에 대해 광연결 프로브를 설계한 경우에, 광연결 형성 파장의 광조사를 실시한 샘플을 전기 영동으로 확인한 결과이다.
도12는, EGFR 유전자의 858번째 류신(L858)를 코드하는 핵산 서열을 목적 부위로 하여, 센스 사슬, 안티센스 사슬 각각에 대해 광연결 프로브를 설계한 경우에, 광연결 형성 파장의 광조사를 실시한 샘플을 전기 영동으로 확인한 결과이다.
도13은, EGFR 유전자의 790번째 트레오닌(T790)를 코드하는 핵산 서열을 목적 부위로 하여, 센스 사슬, 안티센스 사슬 각각에 대해 광연결 프로브를 설계한 경우, 하이브리드화 온도를 변화시켜 광연결 형성시킨 경우의 광연결 형성 효율을 나타내는 도면이다.
도14는, EGFR 유전자의 790번째 트레오닌(T790)를 코드하는 핵산 서열을 목적 부위로 하여, 센스 사슬, 안티센스 사슬 각각에 대해 광연결 프로브를 설계한 경우에, 하이브리드화 촉진제로서 폴리아크릴산을 첨가하여 4℃에서 하이브리드화시켜 광연결 형성시킨 경우의 광연결 형성 효율을 나타낸 도면이다.
도15는, EGFR 유전자의 790번째 트레오닌(T790)을 코드하는 핵산 서열을 목적 부위로 하여, 센스 사슬, 안티센스 사슬 각각에 대해 광연결 프로브를 설계한 경우에, 하이브리드화 촉진제로서 폴리아크릴산을 첨가하여 50℃에서 하이브리드 화시켜 광연결 형성시킨 경우의 광연결 형성 효율을 나타낸 도면이다.
도16은, EGFR 유전자의 790번째 트레오닌(T790)을 코드하는 핵산 서열을 목적 부위로 하여, 유전자 변이 검출을 실시했을 때의 정량 PCR 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도17은, EGFR 유전자 상의 엑손21(ex.21) 영역의 일부를 광연결 형성 대상으로서, 광응답성 핵산인 CNVK의 삽입 위치를 5' 말단에 가까운 위치에 삽입하고, 더욱 CNVK이 광연결 형성 가능한 피리미딘 염기를 이노신에 치환한 광연결 프로브에 있어서, 광연결 형성 파장의 광조사를 실시한 샘플을 전기 영동으로 확인한 결과이다 .
도18은, EGFR 유전자의 실시예 8-1.에서 설계한 광연결 프로브를 광연결 형성시킨 경우의 광연결 형성 효율을 나타낸 도면이다.
도19는, EGFR 유전자의 엑손21(ex.21) 영역의 861번째 류신(L861)를 코드하는 핵산 서열을 목적 부위로 하여, 센스 사슬, 안티센스 사슬 각각에 대해 설계한 광연결 프로브 및 그의 상보성에 대해 나타낸 도면이다.
도20은, EGFR 유전자의 실시예 10-1.에서 설계한 광연결 프로브를 광연결 형성시킨 경우의 광연결 형성 효율을 나타낸 도면이다.

이하에 있어서, 본 발명의 실시 형태에 대해서 적절히 도면을 참조하여 상세하게 설명하지만, 이용 방법이나 키트 양태에 있어서는 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, DNA, RNA, 유전자 발현, 코드, 주형, 프로모터, 프라이머, PCR, 서열 등의 용어 정의에 대해서는, 현재 분자 생물학, 유전학, 유전 공학 등에서 널리 일반적으로 사용되는 있는 용어와 같은 의미이다.

본 발명에 있어서, 핵산으로는, DNA, RNA 또는 아래의 뉴클레오티드 아날로그이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 천연의 것이라도 좋고, 합성된 것이라도 좋다. 천연 핵산으로서, 예를 들어, 생물에서 회수된 게놈 DNA, mRNA, tRNA, rRNA, hnRNA 등이 있다. 또한 합성된 핵산으로서, β-시아노에틸 포스포로아미다이트(シアノエチルホスフォロアミダイト)법, DNA 고상 합성법 등의 공지의 화학적 합성법으로 합성된 DNA나, PCR 등의 공지의 핵산 증폭법에 의해 합성된 핵산, 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA 등이 있다.

본 발명에 있어서 핵산 샘플로서는, 핵산을 함유하는 샘플이며, 표적 부위를 함유할 가능성이 있는 샘플이면, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 표적 부위를 포함하는 야생형 핵산 또는 그의 변이형 핵산의 적어도 일방을 함유할 가능성이 있는 샘플, 바람직하게는, 그의 양방을 함유할 가능성이 있는 샘플이다. 예를 들어, 혈액이나 조직 등을 샘플로서 샘플 모든 세포에서 얻은 게놈DNA나 RNA가 해당한다. 이 핵산의 추출은, 페놀/클로로포름법 등의 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 이때, 핵산 샘플 중에 있어서 변이형의 존재율은 묻지 않는다. 예를 들어, 100%가 야생형이어도 좋고, 50%가 야생형이고 나머지 50%가 변이형이어도 좋다. 또한, 당해 핵산 샘플은, 세포에서 얻은 게놈DNA이어도 좋고, 세포로부터 제조된 mRNA이어도 좋고, mRNA를 주형으로 해서 역전사 반응을 수행하여 얻은 cDNA이어도 좋다. 또한 클론화된 다수의 유전자를 인공적으로 혼합한 것이어도 좋고, 핵산 증폭 반응에 의해 인공적으로 증폭시킨 핵산 또는 그들의 혼합물이어도 좋다.

본 발명에 있어서 야생형 핵산으로는, 변이를 발생하기 전의 핵산을 의미하는 것으로, 그 전형적인 예는, 변이를 발생하지 않고, 본래의 정상적인 기능을 갖는 유전 정보를 포함하는 핵산이다. 여기서 말하는 유전 정보는, mRNA, tRNA, rRNA, snRNA 등의 정보를 코드하는 전사 영역뿐만 아니라, 프로모터 등의 유전자 발현상 필요한 조절 영역을 포함하는 것으로 한다.

본 발명에 있어서, 변이형 핵산으로는, 변이가 생긴 핵산이다. 변이로서는 DNA나 RNA 등의 핵산 서열의 변화이며, 유전학 등에서 사용되는 염기 치환, 삽입, 결실, 역위, 중복, 전좌 등이 해당한다. 해당 변이형 핵산에서, 변이가 존재하는 영역은 전사 영역뿐만 아니라, 프로모터 등의 유전자 발현 상 필요한 조절 영역을 포함하는 것으로 한다. 또한, 변이에 의해 변이형 핵산이 기능상의 변화를 가질 필요는 없다. 또한, 변이에는 선천적인 것도 후천적인 것도 포함된다.

본 발명에 있어서 표적 부위로는, 핵산 샘플 중에 존재하는 핵산 서열에서, 프로브가 하이브리드화하는 부위이다. 하이브리드화하는 프로브가 광응답성 핵산류를 포함하는 것은 필요로 하지 않고, 상기 핵산 서열과 프로브 사이의 하이브리드화는 그의 서열의 전부 또는 일부와 하이브리드화하는 것을 의미한다. 또한, 표적 핵산과 광응답성 핵산류가 결합하여, 광연결하는 핵산 서열을 갖는 부위를 의미한다. 여기에서, 광연결로는, 광응답성 핵산류를 포함하는 프로브와 표적 핵산이 공유 결합하는 것을 의미한다. 형성된 공유 결합의 형태는, 광응답성 핵산류의 종류에 의해 복수 존재하는 것이 이미 공지이지만, 그의 어느 것도 포함하는 것으로 하며, 특히, 크로스링크형의 공유 결합을 형성하는 경우와, 라이게이션(ライゲ-ション)형의 공유 결합을 형성하는 경우의 양방이 포함된다.

또한 광응답성 핵산류로서는, 광에 반응해서 다른 핵산류와 공유 결합을 형성하여 연결하는 성질이 있는 경우면 좋고, 예를 들면, 후술하는 식 I ~ VII에 의해 나타나는 핵산류를 사용할 수 있다. 후술하는 식 I ~ VII의 광응답성 핵산류는 모두 피리미딘 염기와 공유 결합하는 성질을 가지고 있지만, 상기 광응답성 핵산류와 공유 결합하는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 이러한, 탄소-탄소 이중 결합을 형성하는 염기로서는, 천연에 존재하는 것인 경우에는, 바람직하게는 시토신, 티민, 우라실 등을 포함한 서열이 표적 핵산으로 될 수 있다. 표적 핵산은, 표적 부위 중에 존재하고 있어도 좋고, 본 발명에서 사용되는 광연결 프로브 이외의 프로브에 존재하도록 설계되어 사용하여도 좋다.

또한, 본 발명에서 목적 부위로서는, 변이형 핵산에 있어서 변이가 보이는 염기가 존재하는 부위이며, 야생형 핵산을 포함하여, 본 발명에 있어서 유전자 해석 방법의 대상이 되는 부위이다. 예를 들어, 염기 치환이 있는 경우에는 야생형 핵산, 변이형 핵산 모두 해당 염기 치환한 염기가 해당한다. 또한 삽입이 있던 경우는 변이형 핵산에서는 삽입된 염기가 해당하고, 야생형 유전자에서는 변이형 핵산에서 염기가 삽입된 부위가 해당된다. 또한 결실이 있는 경우에는 변이형 핵산에서는 결실에 의해 염기가 없어진 부위가 해당하고, 야생형 핵산에서는 변이형 핵산에서 잃어버린 염기가 해당한다. 또한 해당 목적 부위는, 본 발명에서 최종적인 해석 대상도 될 수 있다. 예를 들어, 유전 정보를 코딩하는 서열을 갖는 사슬 (이하, 센스 사슬 이라 한다)을 나타내는 것이어도 좋고, 센스 사슬에 대해 상보적인 서열을 갖는 사슬 (이하, 안티센스 사슬 이라 한다)를 나타내는 것이어도 좋다. 또한 유전 정보에 직접 관여하지 않는 서열에서 핵산 서열의 변화도 포함하는 것으로 한다.

해당 광연결 프로브의 염기 서열 및 광응답성 핵산류의 위치나 수는 표적 부위의 일부 또는 전부와 특이적으로 하이브리드화하는 것이 가능하다면, 특별히 한정되지 않는다.

또한, 변이 부분이나 염기의 종류, 광연결 프로브의 길이 등의 상황에 따라서, 표적 부위와 목적 부위와 일치하도록 광연결 프로브를 설계하는 것도 가능하며, 목적 부위로는 적당한 부위에 표적 부위를 설정하여 프로브를 설계할 수도 있다. 표적 부위와 목적 부위가 일치하는 경우에는, 일부 부위만을 중복시키는 것도 가능하고, 전부를 중복시켜 설계하는 것도 가능하다.

본 발명에 사용할 수 있는 광응답성 핵산류로는, 표적 핵산과 광조사에 의해 연결 가능하면 좋다.

예를 들어, 소라렌 유도체 (Chang, E. et al. Biochemistry 1991, 30, 8283)나 아미노퓨린 유도체 (특개 2001-206896)나 4-티오우라실 등이 사용될 수 있다. 상기 소라렌유도체는 5'-AT-3'인 염기 서열의 티민 특이적으로 반응하는 성질이 있고, 또한 아미노퓨린 유도체는 서열 의존성은 없지만 시티딘(シチジン) 특이적인 것이기 때문에, 적용 범위에 일정한 제약이 있기 때문에, 그런 제한이 없는 아래의 광응답성 핵산류가 보다 바람직하다.

사용이 바람직한 제1의 광응답성 핵산류로서, 염기 부분으로, 식 I:

[화 1]

(식 중, Ra는 시아노기, 아미드기, 카르복실기, C2 ~ C7의 알콕시 카르보닐기 또는 수소이고, R₁ 및 R₂는, 각각 독립적으로, 시아노기, 아미드기, 카르복실기, C2 ~ C7의 알콕시 카르보닐기 또는 수소이다)

로 표시되는 기를 갖는 핵산류 (Org. Lett., Vol. 10, No. 15, 2008, 특개 2009-254279호 공보)를 들 수 있다. 결합된 핵산이 DNA인 경우, 이 식 I로 표시되는 치환 카바졸릴기는 식 I(a):

[화 2]

로 나타난 바와 같이, 2-데옥시 리보오스의 1위치의 탄소 원자 (C)에, β위치에서 결합하고 있다. 구체적인 예로는 3-시아노비닐 카바졸-1'-β-옥시리보시드〔3-cyanovinylcarbazole-1'-β-deoxyriboside (^CNVK)]를 들 수 있다.

또한, 사용이 바람직한 제2의 광응답성 핵산류로서, 식 II:

[화 3]

(식 중, R은 -CN, -ＣＯＮＲ^１Ｒ^２, 또는 -ＣＯＯＲ^３이며, 관련 Ｒ^１～Ｒ^３는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 알킬기 C_nH_{2n + 1} (n ≥ 1)이다. 여기에서 n의 상한은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, n은 1 ~ 7, 바람직하게는 1 ~ 5일 수 있다)

로 표시되는 기를 갖는 핵산류 (Organic & Biomolecular Chemistry 2007, 5, 2583, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 (2005) 1299-1301, 특개 2005-348645)를 들 수 있다. 결합된 핵산이 DNA인 경우, 이 식 II로 표시되는 치환 페녹시기는 식 II (a):

[화 4]

와 같이, 2-데옥시 리보오스의 1위치의 탄소 원자 (C)에, α위치에서 결합하고 있다. R이 -CN, -COOH, -COOMe 인 것이 바람직하고, 특히는 -COOH 또는 -COOMe 인 것이 바람직하다.

이러한 식 I이나 식 II로 표시되는 기를 갖는 것으로서 광연결성을 갖춘 핵산류로 된다. 이 광연결성의 부여는 DNA이어도 RNA이어도, 또한 뉴클레오티드 아날로그도 가능하다. 이러한 광응답성 핵산류는 통상의 핵산의 제조 방법에 준하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시예에서, 광응답성 핵산류는 염기 부분으로 다음 식 III:

[화 5]

(단, 식 III에서 Z는 O 또는 NH를 나타내고, X 및 Y 중 적어도 하나는 카르복실기, 저급 알콕시 카르보닐기, 치환 아미드기 및 시아노기로 이루어진 군으로부터 선택된 전자 흡인성기를 나타내고, X와 Y의 나머지 기는 수소 원자를 나타낸다)로 표시되는 기를 가지고 있다. 알콕시카르보닐기에서 알킬기로서는, 탄소수 1 내지 10, 바람직하게는 1로부터 5의 저급 알킬기를 들수 있다. 치환기 X, Y는, 모두가 동시에 동일 또는 다른 전자 흡인기이어도 좋고, 또한 치환기 X, Y의 한쪽만이 전자 흡인기이고, 다른 하나는 수소 원자이어도 좋다. 식 III에서, Z가 O이고, X가 수소 원자이고, Y가 카르복실기, 저급 알콕시 카르보닐기, 치환 아미드기 또는 시아노기인 것이 바람직하다. 특히 바람직한 염기 부분으로서, 5-비닐-2'-데옥시우리딘(デオキシウリジン) 및 5-카르복시비닐-2'-데옥시우리딘을 들 수 있다. 특히 5-카르복시비닐-2'-데옥시우리딘이 바람직하다.

바람직한 실시의 다른 양태에 있어서, 광응답성 핵산류는, 염기 부분으로 다음의 식 IV:

[화 6]

(단, 식 IV에서, R₁은 수소 원자이며, R₂ 및 R₃ 의 적어도 하나가, 카르복실기, 저급 알콕시 카르보닐기, 저급 알케닐기, 저급 알키닐기, 치환 아미드기, 아미드기, 시아노기 및 수소 원자로 이루어진 군으로부터 선택된 기를 나타내고, R₂ 및 R₃의 나머지 기는 수소 원자 또는 시아노기를 나타낸다)로 표시되는 기를 가지고 있다.

R₂ 및 R₃ 중 적어도 하나로서, 카르복실기가 바람직하고, 카르복실기와 수소 원자의 조합은, R₂와 R₃의 조합으로 바람직하다.

R₂ 및 R₃ 중 적어도 하나로서, 저급 알콕시카르보닐기가 바람직하고, 저급 알콕시카르보닐기에서의 알킬 부분으로는, 탄소수 1 ~ 10, 바람직하게는 1 ~ 5, 더욱 바람직하게는 1 ~ 3, 더욱 바람직하게는 1 ~ 2, 특히 바람직하게는 탄소수 1의 저급 알킬을 들 수 있다. 즉, 바람직한 저급 알콕시카르보닐기의 예로는, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 프로폭시카르보닐기 및 부톡시카르보닐기 등을 들 수 있으며, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 및 프로폭시 카르보닐기가 더욱 바람직하고, 메톡시카르보닐기 및 에톡시카르보닐기가 더욱 바람직하고, 메톡시카르보닐기가 특히 바람직하다. 저급 알콕시카르보닐기와 수소 원자의 조합, 특히 메톡시카르보닐기와 수소 원자의 조합은, R₂와 R₃의 조합으로 바람직하다.

R₂ 및 R₃ 중 적어도 하나로서, 저급 알케닐기는 바람직하고, 저급 알케닐기로서는, 탄소수 2 ~ 10, 바람직하게는 탄소수 2 ~ 5, 더욱 바람직하게는 탄소수 2 ~ 3, 특히 바람직하게는 탄소수 2의 저급 알케닐기를 들 수 있다. 저급 알케닐기와 수소 원자의 조합, 특히 비닐기와 수소 원자의 조합은, R₂와 R₃의 조합으로 바람직하다.

R₂ 및 R₃ 중 적어도 하나로서, 저급 알키닐기가 바람직하고, 저급 알키닐기로서는 탄소수 2 ~ 10, 바람직하게는 탄소수 2 ~ 5, 더욱 바람직하게는 탄소수 2 ~ 3, 특히 바람직하게는 탄소수 2의 저급 알키닐기를 들 수 있다. 저급 알키닐기와 수소 원자의 조합, 특히 에티닐기와 수소 원자의 조합은, R₂ 및 R₃의 조합으로 바람직하다.

R₂ 및 R₃ 중 적어도 하나로서, 치환 아미드가 바람직하고, 치환 아미드로서는, 1치환의 N-치환 아미드를 들 수 있고, 바람직한 예로는 N-알킬아미드, N-아미노 알킬아미드를 들 수 있다. 이러한 N-알킬아미드, N-아미노 알킬아미드로는, 탄소수 1 ~ 10, 바람직하게는 탄소수 1 ~ 5, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 ~ 3, 특히 바람직하게는 탄소수 3인 것이며, N-아미노 알킬아미드가 특히 바람직하다. 치환 아미드와 수소 원자의 조합, 특히 N-아미노 (C1 ~ C3 알킬)아미드와 수소 원자의 조합은, R₂와 R₃의 조합으로 바람직하다.

R₂ 및 R₃ 중 적어도 하나로서, 아미드기가 바람직하고, 아미드기와 수소 원자의 조합은, R₂와 R₃의 조합으로 바람직하다. R₂ 및 R₃ 중 적어도 하나로서, 시아노기가 바람직하며, 시아노기와 시아노기의 조합, 및 시아노기와 수소 원자의 조합은, R₂와 R₃의 조합으로 바람직하다.

R₂ 및 R₃ 중 적어도 하나로서, 수소 원자가 바람직하고, 수소 원자를 적어도 1개 포함하는 조합, 및 수소 원자와 수소 원자의 조합은 R₂와 R₃의 조합으로 바람직하다.

바람직한 실시의 다른 양태에 있어서, 광응답성 핵산류는, 염기 부분으로 다음의 식 V:

[화 7]

(단, 식 V에서 R₄는, 수소 원자 또는 저급알킬기이고, R₅ 및 R₆ 중 적어도 하나는, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 저급 알케닐기, 저급 알키닐기, 치환 아미드기, 아미드기, 시아노기 및 수소 원자 이루어진 군으로부터 선택된 기를 나타내고, R₅ 및 R₆의 나머지 기는 수소 원자 또는 시아노기를 나타낸다)로 표시되는기를 가지고 있다.

R₄로는, 수소 원자가 특히 바람직하다.

R₄로는, 저급 알킬기가 바람직하고, 저급 알킬기로는, 탄소수 1 ~ 5, 바람직하게는 탄소수 1 ~ 3, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 ~ 2, 특히 바람직하게는 탄소수 1의 것이다. 이와 같은 저급 알킬기로는 메틸기, 에틸기 및 프로필기 등을 들 수 있으며, 메틸기 및 에틸기가 바람직하고, 특히 메틸기가 바람직하다.

R₅ 및 R₆ 중 적어도 하나로서, 카르복실기가 바람직하고, 카르복실기와 수소 원자의 조합은, R₅ 및 R₆의 조합으로 바람직하다.

R₅ 및 R₆ 중 적어도 하나로서, 저급 알콕시카르보닐기가 바람직하고, 저급 알콕시카르보닐기의 알킬 부분으로는, 탄소수 1 ~ 10, 바람직하게는 1 ~ 5, 더욱 바람직하게는 1 ~ 3, 더욱 바람직하게는 1 ~ 2 특히 바람직하게는 탄소수 1의 저급 알킬을 들 수 있다. 즉, 바람직한 저급 알콕시카르보닐기의 예로는, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 프로폭시카르보닐기 및 부톡시카르보닐기 등을 들 수 있으며, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 및 프로폭시카르보닐기가 더욱 바람직하고, 메톡시카르보닐기 및 에톡시카르보닐기가 더욱 바람직하고, 메톡시카르보닐기가 특히 바람직하다. 저급 알콕시 카르보닐기와 수소 원자의 조합, 특히 메톡시카르보닐기와 수소 원자의 조합은, R₅ 및 R₆의 조합으로 바람직하다.

R₅ 및 R₆ 중 적어도 하나로서, 저급 알케닐기가 바람직하고, 저급 알케닐기로서는, 탄소수 2 ~ 10, 바람직하게는 탄소수 2 ~ 5, 더욱 바람직하게는 탄소수 2 ~ 3, 특히 바람직하게는 탄소수 2의 저급 알케닐기를 들 수 있다. 저급 알케닐기와 수소 원자의 조합, 특히 비닐기와 수소 원자의 조합은, R₅ 및 R₆의 조합으로 바람직하다.

R₅ 및 R₆ 중 적어도 하나로서, 저급 알키닐기가 바람직하고, 저급 알키닐기로로는, 탄소수 2 ~ 10, 바람직하게는 탄소수 2 ~ 5, 더욱 바람직하게는 탄소수 2 ~ 3, 특히 바람직하게는 탄소수 2의 저급 알키닐기를 들 수 있다. 저급 알키닐기와 수소 원자의 조합, 특히 에티닐기와 수소 원자의 조합은, R₅ 및 R₆의 조합으로 바람직하다.

R₅ 및 R₆ 중 적어도 하나로서, 치환 아미드가 바람직하며, 치환 아미드로는, 1치환의 N-치환 아미드를 들 수 있고, 바람직한 예로는 N-알킬아미드, N-아미노알킬아미드를 들 수 있다. 이러한 N-알킬아미드, N-아미노 알킬아미드로는, 탄소수 1 ~ 10, 바람직하게는 탄소수 1 ~ 5, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 ~ 3, 특히 바람직하게는 탄소수 3의 것이며, N-아미노 알킬아미드가 특히 바람직하다. 치환 아미드와 수소 원자의 조합, 특히 N-아미노 (C1 ~ C3 알킬)아미드와 수소 원자의 조합은, R₅ 및 R₆의 조합으로 바람직하다.

R₅ 및 R₆ 중 적어도 하나로서, 아미드기가 바람직하며, 아미드기와 수소 원자의 조합은, R₅ 및 R₆의 조합으로 바람직하다.

R₅ 및 R₆ 중 적어도 하나로서, 시아노기가 바람직하며, 시아노기와 시아노기 조합, 및 시아노기와 수소 원자의 조합은, R₅ 및 R₆의 조합으로 바람직하다.

R₅ 및 R₆ 중 적어도 하나로서, 수소 원자가 바람직하고, 수소 원자를 적어도 1개 포함하는 조합, 및 수소 원자와 수소 원자의 조합은, R₅ 및 R₆의 조합으로 바람직하다.

바람직한 실시의 다른 양태에 있어서, 광응답성 핵산류는 염기 부분으로서 다음 식 VI:

[화 8]

(단, 식 VI에서, R₇은 수소 원자 또는 저급 알킬기이고, R₈ 및 R₉ 중 적어도 하나는, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 저급 알케닐기, 저급 알키닐기, 치환 아미드기, 아미드기, 시아노기 및 수소 원자 이루어진 군으로부터 선택된 기를 나타내고, R₈ 및 R₉의 나머지 기는 수소 원자 또는 시아노기를 나타낸다.)로 표시되는기를 가지고 있다.

R₇로서는, 수소 원자가 특히 바람직하다.

R₇로서는, 저급 알킬기가 바람직하고, 저급 알킬기로는 탄소수 1 ~ 5, 바람직하게는 탄소수 1 ~ 3, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 ~ 2, 특히 바람직하게는 탄소수 1의 것이다. 이와 같은 저급 알킬기로는 메틸기, 에틸기 및 프로필기 등을 들 수 있으며, 메틸기 및 에틸기가 바람직하고, 특히 메틸기가 바람직하다.

R₈ 및 R₉ 중 적어도 하나로서 카르복실기가 바람직하고, 카르복실기와 수소 원자의 조합은 R₈ 및 R₉의 조합으로 바람직하다.

R₈ 및 R₉ 중 적어도 하나로서, 저급 알콕시카르보닐기가 바람직하고, 저급 알콕시카르보닐기의 알킬 부분으로는 탄소수 1 ~ 10, 바람직하게는 1 ~ 5, 더욱 바람직하게는 1 ~ 3, 더욱 바람직하게는 1 ~ 2 특히 바람직하게는 탄소수 1의 저급 알킬을 들 수 있다. 즉 바람직한 저급 알콕시카르보닐기의 예로는 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 프로폭시카르보닐기 및 부톡시카르보닐기 등을 들 수 있으며, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 및 프로폭시카르보닐기가 더욱 바람직하고, 메톡시카르보닐기 및 에톡시카르보닐기가 더욱 바람직하고, 메톡시카르보닐기가 특히 바람직하다. 저급 알콕시카르보닐기와 수소 원자의 조합, 특히 메톡시카르보닐기와 수소 원자의 조합은 R₈ 및 R₉의 조합으로 바람직하다.

R₈ 및 R₉ 중 적어도 하나로서, 저급 알케닐기가 바람직하고, 저급 알케닐기로서는, 탄소수 2 ~ 10, 바람직하게는 탄소수 2 ~ 5, 더욱 바람직하게는 탄소수 2 ~ 3, 특히 바람직하게는 탄소수 2의 저급 알케닐기를 들 수 있다. 저급 알케닐기와 수소 원자의 조합, 특히 비닐기와 수소 원자의 조합은 R₈ 및 R₉의 조합으로 바람직하다.

R₈ 및 R₉ 중 적어도 하나로서, 저급 알키닐기가 바람직하고, 저급 알키닐기로서는 탄소수 2 ~ 10, 바람직하게는 탄소수 2 ~ 5, 더욱 바람직하게는 탄소수 2 ~ 3, 특히 바람직하게는 탄소수 2의 저급 알키닐기를 들 수 있다. 저급 알키닐기와 수소 원자의 조합, 특히 에티닐기와 수소 원자의 조합은 R₈ 및 R₉의 조합으로 바람직하다.

R₈ 및 R₉ 중 적어도 하나로서, 치환 아미드가 바람직하고, 치환 아미드로는 1치환의 N-치환 아미드를 들 수 있고, 바람직한 예로는 N-알킬아미드, N-아미노 알킬아미드를 들 수 있다. 이러한 N-알킬아미드, N-아미노 알킬아미드로는 탄소수 1 ~ 10, 바람직하게는 탄소수 1 ~ 5, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 ~ 3, 특히 바람직하게는 탄소수 3의 것이며, N-아미노 알킬아미드가 특히 바람직하다. 치환 아미드와 수소 원자의 조합, 특히 N-아미노 (C1 ~ C3 알킬)아미드와 수소 원자의 조합은 R₈ 및 R₉의 조합으로 바람직하다.

R₈ 및 R₉ 중 적어도 하나로서, 아미드기가 바람직하고, 아미드기와 수소 원자의 조합은 R₈ 및 R₉의 조합으로 바람직하다.

R₈ 및 R₉ 중 적어도 하나로서 시아노기가 바람직하며, 시아노기 및 시아노기 조합, 및 시아노기와 수소 원자의 조합은 R₈ 및 R₉의 조합으로 바람직하다.

R₈ 및 R₉ 중 적어도 하나로서 수소 원자가 바람직하고, 수소 원자를 적어도 1 개 포함하는 조합, 및 수소 원자와 수소 원자의 조합은 R₈ 및 R₉의 조합으로 바람직하다.

바람직한 실시의 다른 양태에 있어서, 광응답성 핵산류는, 염기 부분으로 다음 식 VII:

[화 9]

(단, 식 VII에서, R₁₀은, 수소 원자 또는 저급 알킬기이고, R₁₁ 및 R₁₂ 중 적어도 하나는, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 저급 알케닐기, 저급 알키닐 기, 치환 아미드기, 아미드기, 시아노기 및 수소 원자 이루어진 군으로부터 선택된기를 나타내고, R₁₁ 및 R₁₂ 의 나머지 기는 수소 원자 또는 시아노기를 나타낸다)로 표시되는 기를 가지고 있다.

R₁₀로서는 수소 원자가 특히 바람직하다.

R₁₀로서는 저급 알킬기가 바람직하고, 저급 알킬기로는 탄소수 1 ~ 5, 바람직하게는 탄소수 1 ~ 3, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 ~ 2, 특히 바람직하게는 탄소수 1의 것이다. 이와 같은 저급 알킬기로는 메틸기, 에틸기 및 프로필기 등을 들 수 있으며, 메틸기 및 에틸기가 바람직하고, 특히 메틸기가 바람직하다.

R₁₁ 및 R₁₂ 중 적어도 하나로서, 카르복실기가 바람직하고, 카르복실기와 수소 원자의 조합은 R₁₁ 및 R₁₂의 조합으로 바람직하다.

R₁₁ 및 R₁₂ 중 적어도 하나로서, 저급 알콕시카르보닐기가 바람직하고, 저급 알콕시카르보닐기의 알킬 부분으로는 탄소수 1 ~ 10, 바람직하게는 1 ~ 5, 더욱 바람직하게는 1 ~ 3, 더욱 바람직하게는 1 ~ 2, 특히 바람직하게는 탄소수 1의 저급 알킬을 들 수 있다. 즉 바람직한 저급 알콕시카르보닐기의 예로는 메톡시 카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 프로폭시카르보닐기 및 부톡시카르보닐기 등을 들 수 있으며, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 및 프로폭시카르보닐기가 더욱 바람직하고, 메톡시 카르보닐기 및 에톡시 카르보닐기가 더욱 바람직하고, 메톡시 카르보닐기가 특히 바람직하다. 저급 알콕시카르보닐기와 수소 원자의 조합, 특히 메톡시 카르보닐기와 수소 원자의 조합은 R₁₁ 및 R₁₂의 조합으로 바람직하다.

R₁₁ 및 R₁₂ 중 적어도 하나로서, 저급 알케닐기가 바람직하고, 저급 알케닐기로서는, 탄소수 2 ~ 10, 바람직하게는 탄소수 2 ~ 5, 더욱 바람직하게는 탄소수 2 ~ 3, 특히 바람직하게는 탄소수 2의 저급 알케닐기를 들 수 있다. 저급 알케닐기와 수소 원자의 조합, 특히 비닐기와 수소 원자의 조합은 R₁₁ 및 R₁₂의 조합으로 바람직하다.

R₁₁ 및 R₁₂ 중 적어도 하나로서, 저급 알키닐기가 바람직하고, 저급 알키닐기로는 탄소수 2 ~ 10, 바람직하게는 탄소수 2 ~ 5, 더욱 바람직하게는 탄소수 2 ~ 3, 특히 바람직하게는 탄소수 2의 저급 알키닐기를 들 수 있다. 저급 알키닐기와 수소 원자의 조합 특히 에티닐기와 수소 원자의 조합은 R₁₁ 및 R₁₂의 조합으로 바람직하다.

R₁₁ 및 R₁₂ 중 적어도 하나로서, 치환 아미드가 바람직하고, 치환 아미드로는 1치환의 N-치환 아미드를 들 수 있고, 바람직한 예로는 N-알킬아미드, N-아미노 알킬아미드를 들 수 있다. 이러한 N-알킬아미드, N-아미노 알킬아미드로는 탄소수 1 ~ 10, 바람직하게는 탄소수 1 ~ 5, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 ~ 3, 특히 바람직하게는 탄소수 3의 것이며, N-아미노 알킬아미드가 특히 바람직하다. 치환 아미드와 수소 원자의 조합, 특히 N-아미노 (C1 ~ C3 알킬)아미드와 수소 원자의 조합은 R₁₁ 및 R₁₂의 조합으로 바람직하다.

R₁₁ 및 R₁₂ 중 적어도 하나로서, 아미드기가 바람직하고, 아미드기와 수소 원자의 조합은 R₁₁ 및 R₁₂의 조합으로 바람직하다.

R₁₁ 및 R₁₂ 중 적어도 하나로서 시아노기가 바람직하며, 시아노기와 시아노기의 조합, 및 시아노기와 수소 원자의 조합은 R₁₁ 및 R₁₂의 조합으로 바람직하다.

R₁₁ 및 R₁₂ 중 적어도 하나로서 수소 원자가 바람직하고, 수소 원자를 적어도 1개 포함하는 조합, 및 수소 원자와 수소 원자의 조합은 R₁₁ 및 R₁₂의 조합으로 바람직하다.

이러한 염기의 바람직한 구조를 아래에서 설명한다. 본 발명에서 사용 가능한 염기는 다음의 예시에 한정되는 것은 아니다.

[화10]

본 발명에 있어서 프로브는, 공지의 함께 결합된 두 개 이상의 뉴클레오티드 서브 유닛 또는 핵산 염기 서브 유닛을 갖는 폴리머를 의미하며, DNA 및/또는 RNA 또는 그의 아날로그를 포함한다.

아날로그는, 비천연 뉴클레오티드이며, 천연 뉴클레오타이드인 디옥시리보 뉴클레오타이드(DNA)와 리보뉴클레오티드(RNA)와 같은 기능을 갖는 것을 말한다. 즉 뉴클레오티드 아날로그는 뉴클레오티드와 마찬가지로 인산 디에스테르 결합으로 사슬을 형성할 수 있고, 또한 뉴클레오티드 아날로그를 이용하여 형성된 프라이머나 프로브는, 뉴클레오티드만을 이용하여 형성된 프라이머나 프로브와 마찬가지로, PCR이나 하이브리드화에 사용할 수 있다.

이러한 뉴클레오티드 아날로그로로서, 예를 들어, PNA (폴리아미드 뉴클레오티드 유도체), LNA(BNA), ENA(2'-O, 4'-C-Ethylene-bridgednucleic acids) 및 이들의 복합체 등이 있다. 여기에서 PNA는, DNA나 RNA의 인산과 5탄당으로 이루어진 주사슬을 폴리아미드 사슬로 치환한 것이다. 또한 LNA(BNA)는, 리보뉴클레오시드의 2'부위의 산소 원자와 4'부위의 탄소 원자가 메틸렌을 통해서 결합하고 있는 2개의 환상 구조를 가지는 화합물이다.

위의 아날로그에 한정되지 않고, 그의 프로브가 하이브리드화 분석 조건하에서 표적 부위와 상보적이며, 안정적으로 하이브리드화할 수 있는 것이면 좋다. 여기에서, 상보적인 서열은, 하이브리드화 조건하에서 안정적인 수소 결합을 형성할 수 있는 염기 서열을 갖는 것을 의미하며, 각 프로브의 핵산 간의 완전한 일치는 요구되지 않는다.

본 발명의 광응답성 핵산류를 포함한 프로브 (즉, 광연결 프로브)는, 상기 프로브에서 적어도 하나의 광응답성 핵산류를 포함한 프로브이며, 상기 광응답성 핵산류를 포함한 프로브는, 표적 부위에 상보적인 서열을 가진다.

본 발명에 있어서 제1 프로브 (이하, 광연결 프로브라고 칭하는 경우가 있다)는, 표적 부위 대해 상보적인 서열을 가지며, 상기 광응답성 핵산류를 포함한 핵산류 프로브를 말한다. 해당 광연결 프로브는 상기 식 I ~ VII로 나타내는 기를 가지는 광응답성 핵산류를 포함하면 좋다.

본 발명의 광연결 방법은, 핵산 샘플 중에 존재하는 표적 부위와, 상기 표적 부위에 대해 상보적인 서열을 가지며, 광응답성 핵산류를 포함하는 제1 프로브를 반응 용액 중에 하이브리드화시키고, 광조사함에 의해 광연결시키는 방법에 있어서, 상기 제1 프로브가 상기 광응답성 핵산류에 기인하는 자기 회합 (즉, 자기 내에서의 광연결)를 억제시키는 것을 특징으로 하는 광연결 방법이다.

본 발명의 광연결 방법의 제1 양태로서는, 핵산 샘플 중의 표적 부위와 상기 표적 부위에 대해 상보적인 서열을 갖는 광응답성 핵산류를 포함하는 제1 프로브를 반응 용액 중에서 하이브리드화시키고, 광조사하여 상기 표적 부위 중에 존재하는 표적 핵산과 상기 제1 프로브 중의 상기 광응답성 핵산류와의 사이에서 광연결하는 크로스링크형의 광연결 방법에 있어서, 상기 제1 프로브에 대해서. 높은 상보성을 갖는 제2 프로브를 공존시킴으로써, 상기 제1 프로브의 자기 내에서의 광연결을 억제시키는 광연결 방법을 들 수 있다.

이것에 의해, 상기 표적 부위 중에 존재하는 표적 핵산과 상기 제1 프로브 사이의 광연결 효율을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 소정의 광연결 조건에서, 표적 부위와 하이브리드화하지 않은 미반응의 상기 제1 프로브에 상기 제2 프로브를 하이브리드화시킴으로써, 상기 제1 프로브가 자기 회합하여 2차 구조를 형성하는 것을 막고, 광조사에 의한 상기 제1 프로브의 자기 내에서의 광연결을 억제한다. 그 결과, 표적 부위에 존재하는 표적 핵산과 광연결하지 않은 미반응의 제1 프로브는 광연결 기능을 유지하고 있기 때문에, 장시간 광조사를 계속하는 것, 또는 변성이나 어닐링 온도 조절 사이클에서 광조사를 여러번 반복하여, 광연결 효율을 향상시킬 수 있다.

상기 높은 상보성은, 광응답성 핵산류를 포함한 상기 제1 프로브와 상기 제2 프로브가 서로 상보적인 관계에 있으며, 소정의 광연결 조건하에서 상기 제1 프로브 중의 상기 광응답성 핵산류가 자기 내에서 광 연결하는 염기가, 상보적인 상기 제2 프로브와 하이브리드화하고 있는 상태를 의미한다. 상기 제2 프로브는 완전 상보적인 관계이어도 좋고, 상기 제1 프로브에 대해 상보적인 것이 바람직하지만, 소정의 광연결 조건 하에서 상기 제1 프로브와 하이브리드화할 수 있으면 완전한 상보 관계는 반드시 필요하다고는 되지 않는다. 예를 들어, 상기 제1 프로브의 서열의 종류나 길이 등의 정보로부터, 상기 제1 프로브를 구성하는 핵산류 염기 중, 자기 내의 광연결에 관여하는 부분이 특정되는 경우, 해당 부분의 염기 이외는 반드시 상보적일 필요는 없다.

여기서, 상기 제1 프로브 중의 광응답성 핵산류는 표적 부위 중의 표적 핵산과 광연결하는 것이기 때문에, 당연히 상기 광응답성 핵산류는 상기 제2 프로브와 광연결하지 않도록 설계하는 것이 필요하다. 따라서, 상기 광응답성 핵산류의 표적 핵산과의 광연결을 저해하지 않도록, 상기 제2 프로브를 설계하는 것도 바람직하다. 예를 들어, 상기 제2 프로브가 하이브리드화함으로써 상기 광응답성 핵산류를 포함하는 제1 프로브의 자기 회합을 억제하면서, 광응답성 핵산류의 결합능을 잃지 않도록 설계할 수 있다.

광응답성 핵산류가 광연결할 수 있는 염기는 공지이나, 당업자라면 시행 착오없이 식별할 수 있다. 예를 들어, 식 I 또는 II로 표시되는 광응답성 핵산류는 시토신, 티민 및 우라실 이라는 피리미딘 염기와 광연결하는 것이 공지이기 때문에, 상기 제2 프로브는 상기 제1 프로브 내의 피리미딘 염기와 상보적인 서열이 되도록 설계하여 사용할 수 있다. 또한, 제2 프로브는, 상기 제1 프로브 중의 상기 광응답성 핵산류가 자기 내에서 광연결할 수 있는 모든 염기와 상보적일 필요는 없고, 적어도 소정의 광연결 조건하에서, 상기 제1 프로브 중의 상기 광응답성 핵산류가 자기 내에서 광연결하는 염기와 상보적이면 좋다.

단, 상기 제2 프로브가 상기 제1 프로브에 대하여 하이브리드화하기 위해서는, 연속한 염기를 필요로 하는 것이 공지이기 때문에, 상기 제2 프로브가 필요에 따라, 상기 제1 프로브 내의 광응답성 핵산류가 자기 내에서 광연결하는 핵산류의 염기 이외와도 상보성을 필요로 하는 것은 자명하다.

또한, 제2 프로브는, 연속한 단수의 서열로서 상기 제1 프로브 자기 내의 광 연결을 억제할 수 있으며, 제1 프로브 내에 존재하는 광응답성 핵산류가 광연결 가능한 핵산과 상보성을 갖는, 비연속적인 복수의 서열로서 사용할 수도 있다. 당업자라면, 공지의 방법에 따라, 해석 방법이나 광연결 조건에 따라서, 하이브리드화 가능한 염기 서열이나 사슬 길이 등을 고려하여, 연속한 단수의 서열에서도 비연속적인 복수의 서열에서도, 적절하게 설계하여 사용하는 것이 가능하다.

광응답성 핵산류는 상기 광응답성 핵산류를 포함하는 프로브의 중앙 부근에 배치하는 것도 가능하지만, 상기 제1 프로브의 말단에 배치할 수도 있다. 이용하는 해석 시스템에서, 사용 가능한 상기 제1 프로브의 사슬 길이가 제한되는 경우 (예를 들어, 하이브리드화 가능한 최소의 사슬 길이 등), 광응답성 핵산류를 상기 제1 프로브의 말단측에 배치함으로써, 상기 제1 프로브와 안정적으로 하이브리드화하도록 상기 제2 프로브를 설계할 수 있다.

또한, 광응답성 핵산류를 말단에 배치함으로써, 상기 광응답성 핵산류의 입체 장애 때문에, 하이브리드화에 의해 상기 말단 염기를 광연결하는 핵산과의 거리를 접근시킬 수 있는 것이 불충분하게 되어, 표적 부위와 광연결하지 못할 가능성이 고려되는 경우에는, 상기 광응답성 핵산류를, 말단 보다도 내측에 도입하는 것이 보다 바람직하고, 나아가서는 말단으로부터 2 ~ 5 염기목에 도입하는 것이 보다 바람직하다.

종래의 기술 상식으로는, 프로브는, 표적 부위 이외와는 상보적 서열을 가지지 않도록 하는 것, 및 프로브가 자기 서열 내에서 이차 구조를 형성하는 것을 막기 위해 프로브 내에 상보적인 서열을 가지지 않도록 하는 것은 물론, 2개 이상의 프로브를 사용하는 경우, 그들 프로브간에 상보적 서열이 적은 것이 프로브 설계에서 중요하다고 되어 있었다.

그러나 본 발명의 광연결 방법에서는, 표적 부위에 상보적인 서열을 가지며, 광 응답성 핵산류를 포함하는 제1 프로브에 대해서, 표적 부위와 경합 관계에 있는, 상기 제1 프로브와 상보성이 높은 제2 프로브를 이용하여, 광연결 효율을 향상시킬 수 있었던 것은 의외의 효과이다.

당업자라면, 상기 광응답성 핵산류를 포함한 제1 프로브가 자기 내에서 광 연결하는 것이 가능한지 아닌지에 대해서, 공지의 방법을 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 소프트웨어를 사용하여 염기의 인접 계산이나 주어진 구조의 유리(遊離) 에너지 계산으로부터, 상기 광결합 프로브의 이차 구조를 예측하고, 자기 내의 광연결에 관여하는 핵산을 선정하는 것도 가능하다. 또한, 후술하는 실시예와 같이, 소정의 광연결 조건에서 자체 내에서 광연결되는지 아닌지를 검토할 수도 있다.

또한, 제2 프로브에 광응답성 핵산류를 포함할 수도 있고, 제2 프로브로서 자기 회합을 억제하는 기능과, 광응답성 핵산류를 포함하는 제1 프로브(광연결 프로브)로서 광연결하는 기능을 갖도록 설계하여 사용할 수도 있다.

광응답성 핵산류를 포함하는 프로브는, 광연결하는 작용을 나타내는 경우에는 제1 프로브로서, 또한 자기 회합을 억제하는 작용을 나타내는 경우에는 제2 프로브로서 호칭되는 경우가 있다. 예를 들어, 표적 부위의 센스 사슬 프로브, 상기 표적 부위의 안티센스 사슬 프로브가 함께 광응답성 핵산류를 포함하는 경우, 상기 센스 사슬 프로브를 제1 프로브로 한 경우에는 해당 안티센스 사슬 프로브는 제2 프로브로 되고, 상기 안티센스 사슬 프로브가 제1 프로브인 경우에는, 상기 센스 사슬 프로브는 제2 프로브로서 기능한다.

이 경우, 상기 제2 프로브는, 상기 표적 부위의 안티센스 사슬의 표적 핵산과 크로스링크형의 광연결을 할 수 있다.

또한, 자기 회합을 억제하는 방법이라면 위의 방법에 한정되지 않고, 다양한 해석 방법에 있어서 본 발명의 광연결 방법을 적절히 변경하여 사용하는 것이 가능하다.

예를 들어, 서열이 단일 사슬인 경우(예: mRNA 등)는, 광응답성 핵산류는 적어도 제1 프로브에 함유되어 있으면 좋지만, 표적 부위가 두개의 사슬인 경우(예 dsDNA 등 )는, 광응답성 핵산류는 제1 프로브 뿐만 아니라, 제2 프로브에도 함유되어 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 야생형 서열을 광연결하고, 변이형 서열을 고감도로 검출하는 경우이며, 또한 핵산 증폭 반응을 수반하는 유전자 해석인 경우는, 야생형 서열의 센스 사슬과 안티센스 사슬의 양 사슬에 광연결함으로써 더욱 고감도로 변이형 서열을 검출, 식별(同定)할 수 있다.

또한, 제1 프로브 및 제2 프로브가 함께 광응답성 핵산류를 가지는(즉, 광 연결 프로브로서 기능하는)경우, 제1 프로브와 제2 프로브의 비상보성 영역에서, 제1 프로브 및/또는 제 2 프로브 내에 존재하는 광응답성 핵산류가 자기 내에서 광연결될 수 없도록, 제1 프로브 및/또는 제2 프로브에 상보적인 서열을 갖는 제3 프로브를 사용할 수도 있다. 제3 프로브는, 상기 제2 프로브의 형태와 동일한 모양으로 설계하여, 사용할 수 있다.

본 발명의 광연결 방법의 제2의 양태로서는, 핵산 샘플 중의 표적 부위와 상기 표적 부위에 대해 상보적인 서열을 갖는 광응답성 핵산류를 포함하는 제1 프로브와, 상기 표적 부위에 대해 상보적인 서열을 가지고 표적 핵산을 포함하는 제4 프로브를 반응 용액중에서 인접하여 배치하도록 하이브리드화시키고, 광조사하여 상기 제4 프로브에 존재하는 표적 핵산과 상기 제1 프로브 중의 상기 광응답성 핵산류와의 사이에서 광연결하는 라이게이션형의 광연결 방법에 있어서, 상기 제1 프로브에 대해서, 높은 상보성을 가지는 제2 프로브를 공존시킴으로써, 상기 제1 프로브 자기 내에서의 광연결을 억제시키는 광연결 방법을 들 수 있다.

상기 제1 프로브에 상보적인 서열을 갖는 제2 프로브를 사용해서, 광응답성 핵산류가 삽입된 말단과는 반대측의 말단에 존재하는 염기와 결합하여 자기 서열 내에서의 회합을 억제하는 것도 가능하다.

상기 라이게이션형 광연결 방법은 WO2007/058326호 공보에 기재된 방법을 본원에 가져와서 사용할 수 있다. 당업자라면 광연결 방법이, 상기 라이게이션형인 것을 제외하고는, 본 발명의 광연결 방법의 제1 양태를, 적절히 변경하여, 상기 제 2 양태를 용이하게 실시할 수 있다. 이러한 라이게이션형의 광응답성 핵산류를 사용한 방법에서는, 상기 제1 프로브는 3' 말단 또는 5'말단에 광응답성 핵산류를 가지고 있으며, 표적 부위에 위의 상기 제1 프로브 및 상기 제4 프로브가 하이브리드화한 경우 이외에도, 상기 제1 프로브 내의 광응답성 핵산류와 피리미딘 염기가 공간적 배치에 의해 근접한 경우에 회합하여 광연결하는 것을 방지하는 사용 방법도 가능하다.

다음에 라이게이션형의 광연결 방법을 상세히 설명한다.

광응답성 핵산류를 포함한 제1 프로브와 표적 핵산을 포함하는 제4 프로브는, 소정의 표적 부위에서, 인접해서 하이브리드화하도록 배치되고, 또한, 광조사에 의해 광연결 가능하도록 인접해서 상기 광응답성 핵산류와 상기 표적 핵산이 배치된다.

이때, 상기 광응답성 핵산류는 제1 프로브의 말단에 위치하도록 설계되는 것이 바람직하다. 또한 제4 프로브는 제1 프로브와 인접한 측의 말단이 광연결 가능한 표적 핵산이 되도록 설계하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 제1 프로브와 제4 프로브가 1염기분의 간격도 없이 근접하고, 양 프로브에 광조사된 때 광연결에 의해 결합된 연속된 하나의 핵산 서열을 구성할 수있는 것이 바람직하다.

광응답성 핵산류를 포함하는 상기 제1 프로브와 표적 핵산을 포함하는 상기 제4 프로브가 광조사에 의해 연결됨으로써, 더욱 안정적인 표적 부위의 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 생성한다.

예를 들어, 광응답성 핵산류로서, 5-카르복시비닐-2'-데옥시우리딘 (CVU로 표기한다)을 갖는 제1 프로브를 사용한 경우, 이 CVU는, 표적 핵산인 피리미딘 염기와 광연결성을 나타내고, 티민의 염기 부분과 탄소-탄소 이중 결합을 형성한다.

표적 부위인 검출 대상인 핵산 서열과, 상기 CVU를 포함한 상기 제1 프로브와 표적 핵산을 포함하는 상기 제4 프로브를 혼합하고 하이브리드화시킨다. 그러자, 염기 서열의 상보성에 따라서, 표적 부위에 대해 상기 제1 프로브와 상기 제4 프로브와의 광연결 가능하도록 인접하여 정렬한다. 이 상태에서 광조사하면 광반응에 의해 광연결되어, CVU와 표적 핵산인 피리미딘 염기가 공유 결합으로 일체로 연결된 상태가 된다.

이러한 라이게이션형의 광연결 방법에는, 위와 같이 제1 프로브와 제4 프로브의 각 말단측에서 광연결 가능한 광응답성 핵산류를 사용하면 좋지만, 예를 들면, 상기 광응답성 핵산류로 식 III ~ VII로 표시되는 화합물을 사용할 수 있다.

상기 제1 양태 또는 상기 제2 양태는 각각 단독으로 실시할 수도 있지만, 상기 제2 양태는 상기 제1 양태와 조합되어 실시할 수도 있다. 예를 들어, 광응답성 핵산류를 포함한 제1 프로브가 크로스링크형의 광연결을 행하고, 광응답성 핵산류를 포함한 제2 프로브가 라이게이션형의 광연결을 행하는 방법, 또는 광응답성 핵산류를 포함한 제1 프로브가 라이게이션형의 광연결하고, 광응답성 핵산류를 포함한 제2 프로브가 크로스링크형의 광연결을 실시하는 방법 등이 있다.

본 발명의 광연결 방법의 제3 양태로서, 상기 광연결 프로브는 표적 부위와 하이브리드화 가능한 한, 소정의 광연결 조건하에서 광연결 프로브 내의 광응답성 핵산류가 자기 회합하는 핵산을, 상기 광응답성 핵산류와 광연결하지 않는 핵산으로 치환한 상기 광연결 프로브를 설계하고, 자기 내의 광연결을 억제시키는 것도 가능하다. 또한 센스 사슬 프로브와 안티센스 사슬 프로브가 프로브 사이에서 광연결하는 것을 방지하기 위해 상기 광응답성 핵산류와 광연결하지 핵산으로 치환하여 프로브를 설계하고, 프로브 사이에서의 광연결을 억제시킬 수도 있다. 예를 들어, 상기 광응답성 핵산류가 CNVK인 경우는 피리미딘 염기로부터 아데닌, 구아닌이나 이노신과 같은 퓨린 염기로 치환하여 실시할 수도 있다. 치환하는 염기의 수는, 표적 부위 또는 프로브 내에 존재하는 피리미딘 염기의 수에 따라 적절히 설정할 수 있다.

또한, 광응답성 핵산류가 CNVK인 경우, 광연결 가능한 염기인, 시토신이나 티민의 피리미딘 고리를 인공적으로 변환한 합성 염기를 사용할 수도 있다. 이 경우, 광조사에 의한 [2+2] 부가 고리화 반응이 일어나지 않도록하는 것으로, 광연결 프로브가 자기 서열 내에서 광 연결하는 것을 억제할 수 있다. 이 경우 사용 가능한 합성 염기로서는, 예를 들면, 피리미딘 고리의 5위 또는 6위의 탄소를 질소로 치환한 5-아조-티민, 6-아조-티민, 5-아조-시토신, 6-아조-시토신 등의 합성 염기 등을 들 수 있다.

상기 제3 형태는 단독으로 실시할 수도 있지만, 상기 제1의 양태 및/또는 상기 제2 양태와 함께 실시할 수도 있다.

당업자라면, 공지의 정보로부터 사용하는 광응답성 핵산류가 어떤 염기를 표적으로 하는가, 어떤 화학 반응기구에 의해 광연결을 할 것인지 등의 성질을 고려하여, 표적이 되는 염기에 대해 치환 또는 수식(修飾)을 실시하여, 합성 염기를 적절하게 사용하는 것이 가능하다.

본 발명의 광연결 방법은, 완충 작용이 있는 염을 포함한 반응 용액 중에서 할 수 있다. 완충 작용이 있는 염으로는, 카코지루산(カコジル酸)염, 인산염, 트리스(トリス)염을 들 수 있다. 완충 작용이 있는 염의 농도는 5 ~ 250 mmol/L의 범위에 있는 것이 바람직하다. 또한, 알칼리 금속 및/또는 알칼리 토류 금속의 염을 포함하는 것이 바람직하다. 알칼리 금속 및/또는 알칼리 토류 금속으로서 염화나트륨 및 염화 마그네슘을 들 수 있다. 또한 반응 용액중에 DMSO나 포름아미드 등의 유기 용제를 첨가함으로써 광응답성 핵산류를 포함하는 프로브와 표적 부위와의 특이적인 광결합 반응을 촉진할 수도 있다. 그러나, 이후 또는 동시에 행해지는 유전자 해석 방법을 저해하도록 하는 물질의 혼입을 피하는 것이 바람직하다. 특히 핵산 증폭 반응과 동시에 실시하는 경우는 핵산 증폭 반응에 적합한 반응 조성인 것이 바람직하다.

본 발명의 광연결 방법에 있어서 광조사는, 일반적으로 350 ~ 380 nm의 범위, 바람직하게는 365 nm의 파장을 포함하는 광이 바람직하고, 특히 바람직하게는 365 nm의 단파장 레이저광이다. 바람직한 실시 양태에서 광조사에 의한 광반응은 1 초 ~ 수 초 이내가 바람직하다. 단, 용기 및 용액의 광투과성을 고려하고 또한 시간을 들여서 실시하는 것도 가능하다.

또한, 상기 광의 조사는 1회 이상 실시하면 좋지만, 복수 반복하여, 광연결 효율을 높일수 있다. 당업자라면 이용하는 유전자 해석 방법에 따라서, 적절히 선택하여 실시할 수 있다. 예를 들어, PCR법에서 증폭 사이클마다에 광조사를 반복해서, 보다 확실하게 야생형 핵산의 증폭을 억제할 수 있다. 전체 증폭 사이클에서 광을 조사하여도 좋고, 임의의 증폭 사이클에서 조사를 시작하거나 종료하여도 좋다.

또한, 표적 핵산에 대해서, 한 번 광연결된 광연결 프로브가, 광조사에 의한 광평형 반응에 의해 개열(開裂)되지 않도록 광조사시의 파장의 선택 및 출력의 선택을 하는 것도 중요하다. 광조사시 파장의 선택 및 출력의 선택에 관해서는, 당업자라면 과도한 검토를 실시하지 않고 선택 가능하다.

또한, 바람직한 다른 실시 양태에 따르면, 국소적으로 상기 프로브 농도를 높임으로써 상기 프로브와 상기 표적 부위와의 회합을 효율적이고 신속화할 수 있으며, 그 결과 광연결 효율을 향상시킬 수 있다.

예를 들어, 핵산은 반응 용액 중에서 음으로 대전((帶電)하기 때문에, 음이온성 물질을 공존시킴으로써, 국소적으로 실질적인 밀도를 높이고, 광연결 효율을 향상시킬 수 있다. 음이온성 물질과 같이 음으로 대전된 물질은, 폴리에틸렌 글리콜이나 덱스트란과 같은 대전하지 않은 비이온성 폴리머에 비해서, 하이브리드화를 촉진하고 광연결 효과를 높이는 것이 가능하다.

이러한 하이브리드화 촉진제로는, 공지의 음이온성 물질이 사용 가능하며, 예를 들면, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 또는 그의 염을 사용할 수 있다. 음이온 성 물질은 광연결이 이루어지는 반응 용액 중에 존재하고 있으면 좋고, 핵산 샘플 중의 대상으로 하는 유전자를 해석하는 유전자 해석 방법에 있어서, 광연결 이외의 반응에 영향을 미치지 않도록, 당업자라면 적절한 농도 범위를 적절하게 검토한 후 결정하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리아크릴산염은 약 0.2 ~ 10% (용량에 대한 무게 백분율 (w/v)로 나타내며, 이하 같음)의 범위가 바람직하고, 0.5 ~ 5% 정도가보다 바람직하다. 폴리메타크릴산염은 약 1.0 ~ 50 %의 범위가 바람직하고, 5 ~ 25 % 정도가 보다 바람직하다.

이들 폴리머의 분자량은, 넓은 범위에 걸쳐 있지만, 약 5,000 ~ 100,000 달톤인 것이 바람직하고, 분자량 약 5,000 ~ 10,000 달톤인 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 하이브리드화 촉진을 목적으로, 동등한 다양한 아크릴산염 공중합체를 사용하는 것도 가능하며, 아크릴산염의 다양한 단독 중합체 및 공중합체이며, 하이브리드화 촉진 특성을 가지는 것으로 예상되는 화합물을 사용할 수 있다.

또한, 상기의 하이브리드화 효율 향상 방법은, 광연결 조건 하에서, 표적 부위와 광응답성 핵산류를 포함하는 프로브의 하이브리드화뿐만 아니라 모든 하이브리드화에서도 유용한 것은, 당업자라면 자명하다.

또한, 본 발명의 광연결에 있어서, 상기 광연결 프로브와 상기 표적 부위와의 회합을 효율적이고 신속하게 함으로써 광연결 효율을 향상시킬 수 있다.

예를 들어, 핵산 샘플 중의 표적 부위를 포함한 핵산 서열의 존재량에 관계없이, 광응답성 핵산류를 포함하는 광연결 프로브의 농도를 높게함으로써, 광연결 효율을 향상시킬 수 있다. 이 경우, 광연결시 프로브 농도는 약 0.1μmol/L 이상인 것이 바람직하고, 약 1μmol/L 이상인 것이 보다 바람직하며, 약 10μmol/L 이상인 것이 가장 바람직하다.

이와 같이 광응답성 핵산류를 포함하는 광연결 프로브가, 자기 서열 내에서 광연결하는 것을 억제하거나, 국소적으로 광연결 프로브의 농도를 높이고 표적 부위에 효과적으로 하이브리드화하기도 함으로써, 광연결 효율을 향상시키는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 광연결 방법은, 공지의, 핵산 샘플 중의 대상으로 하는 유전자를 해석하는 유전자 해석 방법으로 사용할 수 있다. 이것은, 대상으로 하는 유전자의 유무나 그 서열을 식별할뿐만 아니라, 상기 유전자의 정제나 선택적 회수도 포함되는 것은, 당업자라면 설계 변경의 범위 내이다.

상기의 정제나 선택적 회수의 예로서는, 상기 유전자의 정제나 핵산 샘플 중의 표적 핵산류를 포함하는 핵산을 선택적으로 수집하는 전(前)처리 공정을 들 수 있다. 이러한 전처리 공정에서의 사용은, 아래에 언급된 유전자 해석 방법에 있어서 매우 효과적이다. 따라서, 상기 전처리의 뒤를 이어 실시되는 유전자 해석 방법, 유전자 검출 방법에 있어서 고감도로 정확한 해석을 달성하게 되어, 바람직하다.

또한, 본 발명에서 사용가능한 유전자 해석 방법으로는, 공지의 유전자 검출 방법이나 핵산 증폭 방법 등이 사용될 수 있다. 유전자 검출 방법 및 핵산 증폭 방법으로는 다양한 방법이 알려져 있지만, Invader법, Sniper법, TaqMan PCR법, Hybridization Probe법, SNPIT법, Pyrominisequencing법, Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC)법, MALDI-TOF/MS법, NanoChip법 등이 신속하고 높은 처리량으로 해석하는 방법으로서 꼽힌다. 또한, 본 발명에서 사용 가능한 다른 유전자 해석 방법으로는, 예를 들면, 표적 부위에 미지의 변이형 핵산이 있다고 생각되는 경우에, 검출 영역의 증폭산물에 대한 염기 서열을 결정함으로서 변이형 핵산의 유무를 판정할 수 있다.

본 발명의 유전자 검출 방법의 이용으로는, 표적 부위에 대해 상보적으로 광응답성 핵산류를 포함하는 광연결 프로브를 형광 표지한 것을 하이브리드화시키고, 광조사에 의해 상기 표적 핵산과 상기 광연결 프로브 사이에서 광연결시켜, 형광을 검출함으로써, 상기 유전자를 검출하는 방법을 들 수 있다. 당업자라면, 본 발명의 광연결 방법을, 유전자 해석의 목적에 따라 적절하게 변경하여 실시할 수 있으며, 또한 공지의 유전자 검출 방법에 쉽게 사용할 수 있다.

본 발명에서 핵산 증폭 방법으로는, 공지의 중합 효소 반응을 이용한 주형 핵산 증폭 반응을 말하며, 예를 들어, WO2012/033190호 공보에 개시되어 있는 공지의 핵산 증폭 억제 방법에 있어서, 본 발명의 광연결 방법을 이용할 수 있다.

핵산 증폭 방법에 있어서 본 발명의 광연결 방법의 이용으로는, 표적 부위를 포함하는 검출 대상인 핵산 서열(증폭용 뉴클레오티드 서열)을 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여, 공지의 핵산 증폭 방법을 실시할 때에, 검출 대상인 유전자의 핵산의 변이에 기초하여, 어떤 핵산 서열 (예를 들어, 야생형 핵산)의 증폭을 억제하는 한편, 그 이외의 핵산 서열 (예를 들어, 변이형 핵산)만을 선택적으로 증폭 시키는 방법의 이용을 들 수 있다.

야생형 핵산 또는 변이형 핵산의 어느 것을 증폭 억제의 대상으로 하는가는, 그 목적에 따라 적절하게 선택할 수 있으며, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 핵산 샘플 중의 존재비에 큰 편향이 있는 경우, 대량으로 존재하는 핵산 (예를 들어, 야생형 핵산)의 증폭을 억제하고, 미량으로 존재하는 핵산 (예를 들어, 변이형 핵산)만을 선택적으로 증폭함에 의해, 미량으로 존재하는 핵산의 유무를 검출할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 광연결 방법에 의해, 증폭 억제 대상인 야생형 핵산 (표적 부위를 갖는)에 대해, 상기 표적 부위에 상보적인 서열을 가지며, 광응답성 핵산류를 포함하는 제1 프로브를 하이브리드화시키고, 광조사에 의해 상기 표적 핵산과 상기 제1 프로브로 광연결시킴으로써, 상기 야생형 핵산의 증폭을 억제하여, 검출 대상인 변이형 핵산만을 선택적으로 증폭한다.

또한 TaqMan법에서 사용되는 TaqMan 프로브와 같이, 필요에 따라서 형광 물질이나 소광(消光) 물질로 서열 중의 염기를 표지해도 좋다. 변이형 핵산에 대한 TaqMan 프로브 등의 공지의 검출용 프로브를 이용함에 의하여, 대상 핵산의 검출뿐만 아니라 정량(定量)을 할 수도 있다.

또한, 본 발명의 광연결 방법에 의한 특정의 핵산 증폭 억제 방법은, 다른 핵산 증폭 방법과 동시에 할 수도 있고, 핵산 증폭 방법의 전처리 단계로 실시할 수도 있다. 당업자라면 본 발명의 광연결 방법을, 유전자 분석의 목적에 따라 적절하게 변경하여 실시할 수 있으며, 또한 공지의 유전자 증폭 방법에 쉽게 사용할 수 있다.

상기 선택적 핵산 증폭에 사용하는 프라이머는, 변이형 핵산의 증폭용 뉴클레오티드 서열을 증폭할 수 있는 프라이머이며, 그것은 동시에 광응답성 핵산류를 갖는 프로브가 광연결되기 전의 야생형 핵산에서, 야생형 핵산의 증폭용 뉴클레오티드 서열도 증폭할 수 있는 프라이머이다.

야생형 서열을 갖는 분자는 광조사에 의해 광응답성 핵산류를 갖는 광연결 프로브와 광연결하고 있기 때문에, 가교된 염기보다 3'말측으로의 신장(伸張) 반응이 진행되지 않고 증폭되지 않는다. 한편, 변이형 서열을 갖는 분자의 대부분은 광응답성 핵산류를 갖는 광연결 프로브와 광연결하지 않기 때문에, 신장 반응이 일어나고, 그 결과, 선택적인 핵산 증폭이 이루어진다.

핵산 증폭법에 사용 가능한 증폭 프라이머는, 1 또는 2 이상의 표적 부위를 포함한 증폭용 뉴클레오티드 서열을 PCR로 증폭할 수 있는 프라이머이며, 증폭용 뉴클레오티드 서열을 끼우는 2종류의 프라이머이다. 예를 들어, 증폭용 뉴클레오티드 서열의 상류단 영역과 상동적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 포워드 프라이머와, 증폭용 뉴클레오티드 서열의 하류단 영역과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 리버스 프라이머로 이루어진 2종류의 프라이머이어도 좋다. 또한, PCR에 사용된 상기 2종류의 프라이머의 각 농도는, PCR 산물로서 이중 사슬 핵산을 얻을 수 있는 농도비이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 등(等)농도로 이용하는 것이 바람직하다.

PCR에 사용되는 이러한 프라이머는 증폭용 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 서열 정보로부터 통상적인 방법에 의해 설계, 합성할 수 있다. PCR에 사용되는 이러한 프라이머는, 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 아날로그로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상이 인산디에스테르 결합에 의해 연결한 것이다. 프라이머의 길이는, 프라이머의 Tm 값, 증폭 뉴클레오티드 서열의 종류 등을 고려하여 적절히 결정할 수 있지만, 10 ~ 100 분자 연결한 것이 바람직하다.

PCR 반응에 사용되는 시약의 종류, 양, 제조 방법 및 반응 조건 등의 프로토콜은 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다. 또한 PCR에 사용되는 DNA 중합 효소는 통상 PCR에 사용되는 DNA 중합 효소이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 내열성 중합 효소인 것이 바람직하다.

광응답성 핵산류를 갖는 프로브는, 광조사에 의해 표적 부위와의 광연결에 의해 중합 효소의 신장 반응을 저해하기 때문에, 광응답성 핵산류를 갖는 프로브 자체에 뉴클레아제 활성에 대한 저항성은 필요로 하지 않는다. 따라서, 뉴클레아제 활성을 갖는 중합 효소의 사용도 가능하다. 그러나, 광응답성 핵산류를 갖는 프로브가 프라이머로 기능하고, 중합 효소의 신장 반응이 발생할 수 있는 경우는, 중합 효소에 의한 신장 반응이 일어나는 온도에서 표적 분자로부터 해리하도록 Tm 값을 고려하거나, 광응답성 핵산류를 갖는 프로브의 3' 말단에 신장 반응을 저해하는 물질을 수식하여 증폭 프라이머로서 기능하지 않도록하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 광연결 방법을 위해 제1 프로브, 제2 프로브, 제3 프로브, 제4 프로브를 사용하는 경우, 이러한 프로브에 대해서도 마찬가지로, 증폭 프라이머로 기능하지 않도록 Tm 값의 고려하고 그리고 3'말단에 신장 반응을 저해하는 물질을 수식하는 것이 바람직하다.

또한 PCR 반응에서, 통상의 PCR 증폭 반응에 적합한 반응 조성으로 실시할 수 있다. 또한 선택적으로 증폭 반응을 촉진하기 위해 반응액 중에 DMSO와 포름아미드 등, 하이브리드화 조건에 영향을 미치는 물질을 추가하는 것도 가능하다.

본 발명의 광연결 키트는, 본 발명의 광연결 방법을 실시할 수 있도록 구성된다. 구체적으로는, 상기 본 발명의 광연결 방법의 제1 양태, 상기 제2 양태, 상기 제 3 양태 등이 실시된다. 상기 광연결 키트를 구성하는 제1 프로브, 제2 프로브, 제3 프로브, 제4 프로브는, 본 발명의 광연결 방법의 제1 프로브, 제2 프로브, 제3 프로브, 제4 프로브와 같은 것을 의미한다.

본 발명의 제1 광연결 키트로는, 적어도, 핵산 샘플 중의 표적 부위에 대해 상보적인 서열을 가지며, 상기 표적 부위 중의 표적 핵산과 광연결하는 광응답성 핵산류를 포함한 제1 프로브 (광연결 프로브)와, 상기 제1 프로브에 대해, 높은 상보성을 갖는 제2 프로브를 포함한다.

또한 광응답성 핵산류를 포함한 상기 제2 프로브를 포함할 수도 있다. 이 경우, 상기 제2 프로브는 광연결 프로브로도 기능한다.

또한, 광연결 프로브로서 기능하는, 상기 제1 프로브 및/또는 상기 제2 프로브에 상보적인 서열을 갖는 제3 프로브를 포함할 수도 있다.

본 발명의 제2 광연결 키트로는, 적어도, 핵산 샘플 중의 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 갖는 광응답성 핵산류를 포함하는 제1 프로브 (광연결 프로브)와 상기 제1 프로브의 상기 광응답성 핵산류와 광연결하는 표적 핵산을 포함하는 제4 프로브와, 상기 제1 프로브에 대해 높은 상보성을 갖는 제2 프로브를 포함한다.

또한 광응답성 핵산류를 포함하는 상기 제2 프로브를 포함할 수도 있다. 이 경우, 상기 제2 프로브는 광연결 프로브로도 기능한다.

또한, 광연결 프로브로서 기능하는, 상기 제1 프로브 및/또는 상기 제2 프로브에 상보적인 서열을 갖는 제3 프로브를 포함할 수도 있다.

본 발명의 제3 광연결 키트로는, 적어도, 핵산 샘플 중의 표적 부위에 대해서 상보적인 서열을 갖는 광응답성 핵산류를 포함하는 제1 프로브 (광연결 프로브)를 포함하고, 상기 광연결 프로브는, 상기 광연결 프로브 내의 광응답성 핵산류가 자기 회합하는 핵산을, 상기 광응답성 핵산류와 광연결하지 핵산으로 치환하고 상기 광연결 프로브 자기 내의 광연결을 억제시키는 것이다.

본 발명의 광연결 키트에는, 이용하는 유전자 해석 방법에 따라서, 반응 용액, 표지 효소, 핵산 증폭용의 중합 효소, 핵산 증폭용의 프라이머 등을 포함할 수도 있다. 당업자라면 공지 키트의 구성에 따라, 적절히 선택하여 설계할 수 있다.

실시예

이하에서는, 광연결 프로브의 광응답성 핵산류로서 CNVK를 사용하여, 상피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor: EGFR) 유전자 서열의 일부를 표적 부위로 한 경우를 예로 자세한 설명을 하지만, 본 발명의 범위는 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 정신에서 벗어나지 않고 어떠한 수정, 개선 또는 수정을 추가할 수 있는 것은 당업자에게 자명하다.

또한, 본 실시예 중에서, 아미노산 일 문자 표기와 상기 아미노산의 위치 번호로 표시된 표기의 경우에는 야생형을, 원래의 아미노산 일문자 표기와 상기 아미노산 위치 번호 이외에 추가로, 더욱 치환된 아미노산 일문자 표기를 조합하여 표기되는 경우에는 변이형을 나타내는 것으로 한다.

[실시예 1: 광연결 프로브의 자기 서열 내에서의 광연결 확인]

실시예 1-1. 광연결 프로브의 조제

EGFR 유전자의 엑손21 (ex.21) 영역의 일부와 동일 서열의 100mer로 구성된 올리고 뉴클레오티드를 합성하고 (서열 번호 1), 광연결 대상의 주형으로 했다.

[서열 번호 1] 100mer 올리고 뉴클레오티드:

5'-AGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCC

AAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAA-3'(서열 번호 1)

이 합성 올리고 뉴클레오타이드와 하이브리드화 가능한 16mer로 이루어진 광연결 프로브는 다음과 같이 제조하였다. 광연결 프로브로서, 광응답성 프로브 (photo-reactive probe)를 광응답성 핵산류인 3-시아노비닐카바졸-1'-β-옥시리보 시드(CNVK)의 도입 위치를 바꾸어 4종류로 설계했다 (서열 번호 2 ~ 5). 이러한 PREP의 서열을 표 1에 나타낸다. 또한 CNVK의 PREP에 도입 위치를 n으로 나타낸다.

CNVK는 특개 2009-254279호 공보에 기재된 방법에 따라 준비하고, 프로브의 합성은 파스머크(ファスマック) 사에 위탁했다. 또한 CNVK의 구조를 도 1에 나타낸다.

[표 1]

실시예 1-2. 광연결 프로브로의 광조사 처리

실시예 1-1.에서 합성한 각 PREP를 TE에서 100μmol/L에 용해하고, 각 200 pmol을 별도의 0.2mL 튜브에 분취했다. 각각의 샘플에 대해 다음 조건으로 광조사를 실시했다. 또한, 광연결 파장인 365nm의 광조사는 UV-LED 조사기 (ZUV-C30H: 오므론)를, 개열 파장인 312nm의 광조사는 UV 트랜스 일루미네이터 (후나코시)를 사용했다.

조건 1: 광 미(未)조사

각 PREP에 광조사를 실시하지 않는다.

조건 2: 광연결 광조사

각 PREP에 365nm의 광을 실온에서 1 분간 조사한다.

조건 3: 광연결 광조사 + 광연결 개열 광조사

조건 2의 광조사를 실시한 각 PREP에, 312nm의 광을 실온에서 5분간 조사한다.

실시예 1-3. 전기 영동에 의한 평가

광조사 처리의 영향을 보기 위하여, 실시예 1-2.의 조건에서 처리한 각 PREP를 멸균수(滅菌水)로 10μmol/L에 희석후, MultiNA (시마즈 제작소(島津製作所))를 이용하여 마이크로칩 전기 영동을 실시했다. 그의 겔 이미지를 도 2 ~도 5에 나타낸다.

4 종류 모든 PREP에서, 광 연결 파장의 광을 조사함으로써, 전기 영동의 밴드(バンド)가 저분자 측으로 시프트했다. 이것은 분명히 PREP의 콘포메이션이 변화한 것을 시사하고 있다.

또한, 광연결 파장의 광을 조사한 후에 광연결 개열 파장의 광을 조사하면, 저분자 측에 시프트한 밴드가, 광연결 파장의 광을 조사하기 전 (즉, 광 미조사) 밴드의 위치로 돌아가는 것이 확인되었다. 이것은, 자기의 서열 내에서 형성하고 있었던 광연결이 개열하여 원래 상태로 돌아온 것으로 생각된다.

이 현상은, 4 종류 모든 PREP에서 동일하게 확인되기 때문에, 광연결 부위 인 CNVK의 도입 위치에 관계없이 일어난다고 생각됐다.

[실시예 2: 광조사 처리한 광연결 프로브의 광연결 효율의 평가]

실시예 2-1. 광연결 프로브의 조제

평가 대상의 광연결 프로브는, 실시예 1-2.에서 조제한 PREPa. ~ PREPd.를 사용했다.

실시예 2-2. 광연결 프로브의 광연결 반응

0.2mL 튜브에, 표적 부위로 100 pmol/L의 합성 올리고 뉴클레오티드 2μL을 분취하고, 10 μmol/L의 PREP (실시예 1-2. 기재의 각 조건에서 처리한 것) 2μL를 더해, 1 × PCR 버퍼 (10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3), 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl₂, 0.001% (W/V) gelatin)의 최종 농도에서 총량을 20μL로 했다.

이것을 95 ℃에서 5분간 가열 처리하고, 50 ℃에서 5초 동안 정치한 후, 50 ℃에서 UV-LED에 의해 365nm의 광을 30 초 동안 조사했다. 또한, 대조군으로서 광을 조사하지 않는 샘플을 동시에 마련했다.

실시예 2-3. 정량 PCR 반응 용액의 조제와 반응 조건

실시예 2-2.에서 조제한 샘플(대조군 샘플을 포함)의 각 조제액 20μL에 80μL의 멸균수(滅菌水)를 각각 추가하여 잘 혼합한 후, 그 중 5μL씩 주형으로서 프라이머 EGFR Ex. 21F 및 Ex. 21R에 의해 라이트사이클러 (Light Cycler:로슈)를 사용하여 정량 PCR 반응을 실시했다.

PCR 반응 시약에는 Light Cycler Fast Start DNA Master SYBER Green I (로슈)를 사용했다. 또한, 프라이머의 서열은 다음과 같다.

EGFR ex. 21F: 5'-GAACGTACTGGTGAAAACACC-3 '(서열 번호 6)

EGFR ex. 21R: 5'-GCATGGTATTCTTTCTCTTCC-3 '(서열 번호 7)

실시예 2-4. 광연결 효율의 평가

실시예 2-2.에서 광연결 처리를 실시한 샘플과 광연결 처리를 실시하지 않은 대조 샘플을 주형으로, 각각 실시예 2-3.조건에서 정량 PCR 반응을 실시했다. PREP가 광연결한 표적 부위는, 공유 결합에 의해 가교된 곳에서 중합 효소의 신장 반응이 멈추기 때문에, 증폭 반응의 주형으로서 기능하지 않게된다. 따라서, 정량 PCR 반응에서 광연결 처리를 실시하지 않은 대조 샘플보다도 일반적으로 느린 사이클에서 형광 시그날이 일어나서 온다. 따라서 PREP에 의해 광연결된 표적 부위의 양을 다음 식에 따라 산출하고, 광연결 효율로서 표기할 수 있다.

ΔCt = 광연결 처리 후의 표적 부위의 Ct값 - 광연결 처리되지 않은 표적 부위의 Ct값

광연결 효율(%) = (1-2ΔCt) × 100

이렇게하여, 각 PREP의 표적 부위로의 광연결 효율을 평가한 결과를 표 2에 나타낸다.

[표 2]

그 결과, 어느 PREP에서도, 광연결 파장을 1 분간 조사한 후에 있어서는 상당히 광연결 효율이 저하하고 있는 것으로 확인되었다. 또한 개열 파장을 5분간 조사함에 의해, 한 번 잃어버린 광연결 효율이 다시 회복하고, 광연결 가능한 상태로 되어 있는지가 확인되었다.

이 결과에서, PREP에 대해 광연결 파장이 조사되면, PREP의 자기 서열 내에서 광연결되고, 그 결과 PREP의 광연결 기능이 소실된 것으로, 표적 부위에 대한 광연결 효율이 크게 저하한 것으로 생각된다.

또한 자기 서열 내에서 광연결했던 PREP에 대해 광연결 개열 파장인 312nm의 광을 조사하여, 자기 서열 내에서 형성하고 있었던 광연결이 개열하여 원래 상태로 돌아가기 때문에, 저하하고 있었던 광연결 효율이 회복한 것으로 생각된다.

또한, 어느 PREP에서도 광연결 기능의 손실 및 복구가 인정되는 것이므로 PREP에 대한 CNVK의 도입 위치에 관계없이 PREP의 자기 내에서의 광연결 및 개열이 일어나는 것이 시사되었다.

이러한 결과는, 실시예 1에서 광연결 반응 후의 전기 영동 밴드가 시프트하고, 광연결 개열 파장의 광을 조사한 후에 전기 영동 밴드가 원 위치로 돌아온 사실과도 일치하는 것이다.

[실시예 3: 퓨린 염기만으로 구성된 광연결 프로브에서 자기 서열 내에서의 광연결 확인]

광응답성 핵산류인 CNVK는 광연결하지 않은, 퓨린 염기만으로 구성된 PREP를 합성하고, 합성한 각 PREP가 광연결 파장의 광을 조사하여도 자기 서열 내에서 광연결하지 않는 것을 확인했다.

실시예 3-1. 광연결 프로브의 조제

광연결 프로브로서, 퓨린 염기인 아데닌(A) 혹은, 구아닌(G)만으로 구성한 다음 3 종류의 PREP를 준비했다. 합성한 PREP의 서열을 표 3에 나타낸다. 그 때, 광응답성 핵산류인 CNVK의 도입 위치 (X) 및 사슬 길이(16mer)는 통일했다.

[표 3]

실시예 3-2. 광연결 프로브로의 광조사 처리

실시예 3-1.에서 합성한 각 PREP를 TE에서 100 μmol/L에 용해하여, 각 200 pmol을 별도의 0.2mL 튜브에 분취했다. 각각의 샘플에 대해 다음 조건으로 광조사를 실시했다.

또한, 광연결 파장인 365nm의 광조사는 UV-LED 조사기를 사용했다.

조건1: 광 미조사

각 PREP에 광조사를 실시하지 않는다.

조건2: 광연결 광조사

각 PREP에 365nm의 광을 4℃에서 3분간 조사한다.

실시예 3-3. 전기 영동에 의한 평가

광조사 처리의 영향을 보기 위하여, 실시예 3-2.의 조건에서 처리한 각각의 PREP를 멸균수로 10 μmol/L에 희석한 후, MultiNA를 이용하여 마이크로칩 전기 영동을 실시했다. 그의 겔이미지를 도 6 ~ 도 8에 나타낸다.

3 종류 중의 어느 PREP에서도, 광연결 파장의 광을 조사하는 전후에서 전기 영동 밴드에 이동도의 차이는 보이지 않았다. 이 때문에, 퓨린 염기만으로 구성된 PREP는 광응답성 핵산류인 CNVK와 결합 가능한 염기가 프로브의 서열 내에 존재하지 않기 때문에, 자기의 서열 내에서 광연결하지 않았다는 것이 추정되었다.

[실시예 4: 상보 서열을 이용한 광연결 프로브의 자기 서열 내에서의 광연결 억제]

실시예 4-1. 광연결 프로브의 조제

야생형 서열인 EGFR 유전자 상의 790번째 트레오닌(T790), 858번째 류신(L858) 및 861번째 류신(L861)에 해당하는 핵산 서열을 표적 부위로서, EGFR 유전자의 코드 사슬, 즉 센스 사슬에 하이브리드화하는 안티센스 사슬 (AS 사슬)의 광연결 프로브인 PREP를 설계하고, 동시에 EGFR 유전자의 안티센스 사슬에 하이브리드화하는 센스 사슬 (S 사슬)의 광연결 프로브인 PREP도 설계했다. 그 때, 센스 사슬의 PREP와 안티센스 사슬의 PREP의 상보성을 다음의 조합처럼 변화시켜, 서로의 광연결 프로브끼리 광연결하지 않는 위치에 실시예 1에서 기재한 CNVK를 배치했다. 도 9에 광연결 프로브로서 실제로 사용한 PREP의 서열과 그의 상보성에 대한 모식도를 나타낸다. 도면 중의 AS 사슬은 야생형 EGFR 유전자 서열의 센스 사슬과 상보적인 것을 의미하고, S 사슬은 야생형 EGFR 유전자 서열의 안티센스 사슬과 상보적인 것을 의미한다.

(1) L861: 상보성이 낮은 조합의 예

L861 AS 사슬: 5'-CTCTTCCGCACCCAnCAG-3'(서열 번호 11)

L861 S 사슬: 5'-TTGGGCTGGCCAAnCTGC-3'(서열 번호 12)

(2) T790: 상보성이 높은 조합의 예

T790 AS 사슬: 5'-TGAnCTGCGTGATGAG-3'(서열 번호 13)

T790 S 사슬: 5'-CAnCTCATCACGCAGC-3'(서열 번호 14)

(3) L858: 상보성이 (1) 및 (2)의 중간적인 조합의 예

L858 AS 사슬: 5'-CAnTTTGGCCAGCCC-3'(서열 번호 15)

L858 S 사슬: 5'-CAnTTTGGGCTGGCCA-3'(서열 번호 16)

실시예 4-2. 광연결 프로브에 광조사 처리

광연결 프로브로의 광조사 처리는 다음 조건에 따라 실시했다.

조건1: AS 사슬, 광 미조사

실시예 4-1.에서 합성한 EGFR 유전자의 센스 사슬에 하이브리드화하는 AS 사슬의 PREP를 각각 TE에 의해, 10 μmol/L로 조제한 것을 조건1로 했다.

조건2: AS 사슬, 광조사

조건 1과 마찬가지로 조제한 각 AS 사슬의 PREP를, 열 순환기 (어플라이드사 제품)에서 4℃로 한 후, UV-LED 조사기에서 365nm의 광을 3분간 조사한 것을 조건2로 했다.

조건3: S 사슬 및 광 미조사

실시예 4-1.에서 합성한 EGFR 유전자의 안티센스 사슬에 하이브리드화하는 S 사슬의 PREP를 각각 TE에 의해 10 μmol/L로 조제한 것을 조건3으로 했다.

조건4: S 사슬, 광조사

조건3과 같이 조제한 각 S 사슬의 PREP를, 열 순환기에서 4℃로 한 후, UV-LED 조사기에서 365nm의 광을 3분간 조사한 것을 조건4로 했다.

조건5: S 사슬 + AS 사슬 광 미조사

실시예 4-1.에서 합성한 EGFR 유전자의 센스 사슬에 하이브리드화하는 AS 사슬의 PREP과, EGFR 유전자의 안티센스 사슬에 하이브리드화하는 S 사슬의 PREP를 각각 최종 농도에서 10 μmol/L가 되도록 혼합한 것을 조건5로 했다.

조건6: S 사슬 + AS 사슬 광조사

조건5와 마찬가지로 혼합한 각 PREP 용액을, 열 순환기(サ-マルサイクラ-)에서 4 ℃로 한 후, UV-LED 조사기에서 광을 3분간 조사한 것을 조건6으로 했다.

실시예 4-3. 전기 영동에 의한 평가

실시예 4-2.조건에서 조제한 PREP 샘플을, MultiNA를 이용하여 마이크로칩 전기 영동을 실시했다. 그의 겔 이미지를 도 10 ~ 도 12에 나타낸다. 도 10은 (1) L861를 표적 부위로 한 PREP의 조합, 도 11은 (2) T790, 도 12는 (3) L858의 결과이다

(1) L861: 상보성이 낮은 조합

전기 영동의 결과로부터, 상보성이 낮은 조합은, 센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우, 안티센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우 어느 것에도 광조사 처리 후에 밴드 시프트가 인정되어, 자기의 서열 내에서 광연결되어 있는 것이 시사되었다 (도 10의 레인 1 ~ 4).

또한 센스 사슬에 대한 PREP와 안티센스 사슬에 대한 PREP를 혼합한 조건5에서는, 조건1과 조건3에서 보인, 센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우 및 안티센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우와 같은 위치에 밴드가 확인된 것으로부터, 센스 사슬에 대한 PREP와 안티센스 사슬에 대한 PREP과 하이브리드화하지 않는 것으로 고려되었다.

또한, 센스 사슬에 대한 PREP와 안티센스 사슬에 대한 PREP를 혼합하여 광조사한 조건6에서도, 센스 사슬에 대한 PREP에 광조사 처리한 조건2와 안티센스 사슬에 대한 PREP에 광조사 처리한 조건4의 밴드와 같은 위치에서 밴드가 확인되었다.

(2) T790: 상보성이 높은 조합

전기 영동의 결과로부터, 상보성이 높은 조합에서도, 센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우, 안티센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우의 어디에서도 광조사 처리 후에 밴드 시프트가 확인되어, 자기의 서열 내에서 광연결 하고 있음이 시사되었다 (도 11의 레인 1 ~ 4)

또한 센스 사슬에 대한 PREP와 안티센스 사슬에 대한 PREP를 혼합한 조건5에서는, 광조사를 실시하지 않는 조건1의 센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우와, 광 조사를 실시하지 않는 조건3의 안티센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우와는, 다른 위치에 하나의 밴드가 확인된 것으로부터, 센스 사슬에 대한 PREP와 안티센스 사슬에 대한 PREP가 하이브리드화하고 있는 것으로 추정되었다.

또한, 센스 사슬에 대한 PREP와 안티센스 사슬에 대한 PREP를 혼합한 것에 광조사를 실시한 조건6에서는, 광조사 전과 동일한 위치에 밴드가 확인되고, 센스 사슬에 대한 PREP, 안티센스 사슬에 대한 PREP의 광조사에 의한 자기 서열 내에서 광연결한 경우에 검출되는 위치에는, 밴드가 확인되지 않았다.

이 때문에, 광조사시 센스 사슬에 대한 PREP와 안티센스 사슬에 대한 PREP가 하이브리드화하고 있으면, 자기의 서열 내에서 광연결은 일어나지 않는 것이 시사되었다.

(3) L858: 상보성이 (1) 및 (2)의 중간적인 조합

전기 영동의 결과로부터, 상보성이 중간인 조합에서도, 센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우, 안티센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우의 모두에서 광조사 후에 밴드 시프트가 확인되어 자기의 서열 내에서 광연결 하고 있음이 시사되었다 (도 12의 레인 1 ~ 4).

또한 센스 사슬에 대한 PREP와 안티센스 사슬에 대한 PREP를 혼합한 조건5에서는, 광조사를 실시하지 않는 조건1의 센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우와, 광 조사를 실시하지 않는 조건3의 안티센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우와는, 다른 위치에 밴드가 확인된 것으로부터, 센스 사슬에 대한 PREP와 안티센스 사슬에 대한 PREP가 하이브리드화하고 있는 것으로 추정되었다.

또한, 센스 사슬에 대한 PREP와 안티센스 사슬에 대한 PREP를 혼합한 것에 광조사를 실시한 조건6에서는, 광조사 전과는 다른 위치에 2개의 밴드가 확인되었다.

저분자 측의 밴드(아래 밴드)는 센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우, 또는 안티센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우에 광조사하여 자기의 서열 내에서 광연결된 경우의 밴드의 위치와 동일하기 때문에, 센스 사슬에 대한 PREP 또는 안티센스 사슬에 대한 PREP의 자기 회합에 유래하는 밴드라고 생각되었다.

또한 고분자 측의 밴드(위의 밴드)는, 센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우, 안티센스 사슬에 대한 PREP 단독의 경우의, 자기 회합 유래의 밴드와도 다른 위치에 확인되었다. 이 점에서, 센스 사슬에 대한 PREP와 안티센스 사슬에 대한 PREP와 하이브리드화는 유지되고 있지만, 하이브리드화할 수 없는 염기의 부분에서 광연결이 이루어져, 밴드가 시프트한 것으로 생각되었다.

이상으로부터, 상보성이 낮은 PREP를 혼합하여 사용한 경우에는, 센스 사슬에 대한 PREP 또는 안티센스 사슬에 대한 PREP를 각각 단독으로 사용하는 경우에도, 각각의 PREP를 혼합시켜 사용하는 경우에도, PREP가 자기의 서열 내에서 광연결하는 것이 확인되었다.

또한 센스 사슬에 대한 PREP와 안티센스 사슬에 대한 PREP가 중간 정도의 상보성이 있는 경우에도, 하이브리드화하지 않는 염기 중에 CNVK와 광연결 가능한 시토신 또는 티민과 같은 피리미딘 염기가 존재 있으면, 자기의 서열 내에서 광연결 해 버리는 것이 시사되었다.

이 때문에, 광연결 프로브가 자기의 서열 내에서 광연결하는 것을 억제하기 위해서는, 광연결 프로브 간의 상보성을 높게하는 것이 효과적이라고 생각되었다. 또한 CNVK와 광연결 가능한 피리미딘 염기가 상보 사슬에 의해 덮여, CNVK와 결합 가능한 상태로 존재하지 않도록 하는 것이 효과적이라고 생각되었다.

[실시예 5: 상보성이 높은 광연결 프로브를 이용한 광연결의 확인]

실시예 5-1. 광연결 프로브의 조제

T790를 표적 부위로 한, 실시예 4-1.(2)에서 조제한 상보성이 높은 조합인 PREP를 사용했다.

실시예 5-2. EGFR 엑손 20 (ex.20) 영역에서 야생형 유전자 단편의 조제

건강한 정상인의 말초 혈액에서 통상의 방법에 의해 인간 게놈 DNA를 조제하고, 이를 주형으로 프라이머 세트 EGFR ex. 20F 및 EGFR ex. 20R을 사용하여 T790에 해당하는 핵산 서열을 포함하는 EGFR 엑손 20 (ex.20)의 영역을 통상의 PCR 반응 조건에 따라 증폭했다. PCR 반응에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.

EGFR ex. 20F: 5'-CAGAAGCCTACGTGATGG-3 '(서열 번호 17)

EGFR ex. 20R: 5'-ACCTTTGCGATCTGCACAC-3 '(서열 번호 18)

얻어진 PCR 증폭 산물을 pGEMT easy Vector (프로메가)에 첨부된 프로토콜에 따라 삽입하여 클론했다.

이 플라스미드를 주형으로서, 상기 프라이머 세트 EGFR ex. 20F 및 EGFR ex. 20R을 사용하여 통상의 PCR 반응 조건에 따라 증폭하고, PCR Purification Kit (퀴 아젠(キアゲン))를 이용하여 정제함으로써, 선형 사슬 형상의 EGFR ex.20의 야생형 유전자 단편을 얻었다 (서열 번호 19).

PCR Purification Kit (퀴아젠사 제품)를 이용하여 정제된 EGFR ex. 20의 야생형 유전자 단편의 중량 농도를 NanoDrop spectrophtometer (Thermo Scientific)를 이용하여 측정하고, 증폭 단편 길이를 고려하여 각 유전자 단편의 카피(コピ-)수를 산출한 것을, 야생형 핵산으로서 다음의 반응의 검토 주형으로서 사용하였다.

[서열 번호 19] EGFR ex. 20 야생형 단편

5'-CAGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCA

CCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAA

GACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGT-3'(서열 번호: 19)

실시예 5-3. 광연결 반응시의 시약 조성

0.2mL 튜브에 실시예 5-2.에서 조제한 표적 핵산 (1 × 10⁷ 카피/μL)을 2μL와, 10μmol/L로 조제한 실시예 4-1.(2)에 나타낸 T790에 해당하는 핵산 염기를 표적으로 한, T790 AS 사슬 (서열 번호 3) 및 T790 S 사슬 (서열 번호 4)의 PREP를 각각 2μL씩 추가하여, 1 × PCR 버퍼 (10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3), 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl₂, 0.001% (W/V) gelatin)의 최종 농도에서 총량을 20μL로 했다.

실시예 5-4. 광연결 반응시의 조건

실시예 5-3.에서 조제한 핵산 샘플 용액에 대해, 2개의 온도 조건에서 광연결 파장인 365nm의 광조사를 실시했다. 또한 대조군으로 광을 조사하지 않는 샘플을 동시에 마련했다.

조건1: 50℃에서 광조사

95℃에서 3분간 가열 처리 후, 50℃에서 30초간 방치한 후, 50℃에서 광을 30초 동안 조사했다.

조건2: 4℃에서 광조사

95℃에서 3분간 가열 처리 후, 4℃에서 1분간 정치한 후, 4℃에서 30초간 광조사했다.

실시예 5-5. 정량 PCR에 의한 광연결량의 확인

실시예 5-4.에서 광연결 반응을 실시한 각 반응액 20μL에 80μL의 멸균수를 각각 추가하여 잘 혼합한 후, 그 중 5μL씩을 주형으로 라이트 사이클러 (LC 480 Ver2:로슈)를 사용하여 정량 PCR 반응을 실시하였다 .

정량 PCR용 반응액은, 다음의 시약을 혼합하여 제조하고, 1샘플 당의 최종 액량이 25μL가 되도록 멸균수를 첨가하여 제조하였다. 12.5μL의 2 × Premix Ex Taq (등록 상표) (다카라바이오(タカラバイオ))에, 증폭 프라이머로 EGFR ex. 20F 및 EGFR ex. 20R을 각각 5pmol 씩 첨가하였다.

더욱이 말단 형광 표지된 검출 프로브를 2.5 pmol 첨가하였다. 이 검출 프로브의 서열은 다음과 같다.

Total LNA 프로브: 5'-Cy5/CTT + CGGC + TGC + CTC/BHQ2-3'(서열 번호 20)

또한, 서열 중 +는 연속적인 염기가 LNA임을 나타내고, Cy5는 소광제(クエンチャ-)로 되는 형광 색소를, BHQ2은 형광 억제 물질을 각각 나타낸다. 해당 검출 프로브의 합성은 IDT사에 위탁했다.

또한 정량 PCR 반응은 95℃, 10초 + (95℃, 3초/ 58℃, 30초) × 45 사이클의 조건에서 실시했다.

각각의 샘플에 대한 광연결 효율은 실시예 2와 동일하게 정량 PCR로 산출한 ΔCt 값에서 평가했다. 그 결과를 도 13에 나타낸다.

50℃에서 광연결 파장인 365nm의 광조사를 하는 경우, ΔCt가 4 정도로 광을 수차례 조사도 거의 일정한 것에 대해 (도 13에서 검은 원), 4℃에서 실시한 경우에 광을 조사할 때마다 ΔCt가 상승하는 것이 확인되었다 (도 13의 검정 삼각형). 이는 50℃에서 광을 수차례 조사해도 광연결량이 증가하지 않는 것이 대해서, 4 ℃에서는 광을 조사할 때마다 광연결량이 증가하고 있음을 의미한다.

따라서, 4℃에서는, PREP 상보 사슬 사이의 하이브리드화 형성이 유지되고, PREP의 자기 서열 내에서의 광연결이 억제되었기 때문에, 광을 여러 번 조사할 때마다 광연결량이 증가한 반면, 50℃에서는 PREP 상보 사슬 사이의 하이브리드화가 충분히 유지되지 않고, PREP가 자기의 서열 내에서 광연결함으로써, PREP이 주형에 광연결할수 없게 되기 때문에, 광을 여러 번 조사해도 광연결량이 증가하지 않는 것으로 생각되었다.

결국, 광연결 프로브의 자기 서열 내에서의 광연결을 억제하기 위해서는, 광연결 프로브 상보 사슬의 상보성을 높이는 것과, 상보적인 광연결 프로브끼리 (또는 광연결 프로브와 보완적인 제2 프로브)가 충분히 하이브리드화를 형성할 수 있는 온도 조건에서 광을 조사할 필요가 있다.

[실시예 6: 하이브리드화 촉진을 위한 첨가제 검토]

실시예 5의 결과로부터, 50℃에서 광을 조사했을 때는 상호 보완적인 광연결 프로브 끼리의 하이브리드화를 유지하지 못하는 것이 시사되었다. 그래서, 광연결 프로브 사이의 하이브리드화를 촉진할 수 있는 첨가제에 대해 검토를 실시했다. 다양한 검토를 실시했지만, 그 중에서도 효과가 높았던 음성 전하를 가진 고분자 (폴리아크릴산: pAAc)에 관한 결과를 나타낸다.

실시예 6-1. 광연결 프로브의 조제

T790에 해당하는 핵산 서열을 표적으로 한, 실시예 4-1.(2)에서 조제한 상보성이 높은 조합인 PREP를 사용했다.

실시예 6-2. EGFR 엑손 20 (ex.20) 영역에서 야생형 유전자 단편의 조제

건강한 정상인의 말초 혈액을 재료로서, 실시예 5-2.와 같은 방법으로 EGFR ex. 20 영역에서 야생형 유전자 단편을 조제하였다.

실시예 6-3. 광연결 반응시의 시약 조성

0.2mL 튜브에, 실시예 6-2.에서 조제한 ex. 20의 야생형 유전자 단편 (1 × 10⁷ 카피)를 2μL와, 10μmol/L로 조제한 실시예 4-1.(2)에 나타낸 T790에 해당하는 핵산 서열을 표적으로 한, T790 AS 사슬 (서열 번호 13) 및 T790 S 사슬 (서열 번호 14)의 광연결 프로브인 PREP를 각각 2μL와, 10% (w/w) 폴리아크릴산 (pAAc)을 2μL 추가하여, 1 × PCR 버퍼 (10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3), 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl₂, 0.001 % (w/V) gelatin)의 최종 농도에서 총량을 20μL로 했다.

실시예 6-4. 광연결 반응시의 조건

실시예 5-3.에서 조제한 핵산 샘플 용액에 대해 다음 조건으로 광조사를 실시했다. 또한 대조군으로 365nm의 광을 조사하지 않는 샘플을 동시에 마련했다.

조건1: 폴리아크릴산 (pAAc) 첨가한 핵산 샘플 용액에서, 4℃에서 광조사했다.

조건2: 폴리아크릴산 (pAAc) 미첨가 핵산 샘플 용액에서, 4℃에서 광조사했다.

조건3: 폴리아크릴산 (pAAc) 첨가 핵산 샘플 용액에서, 50℃에서 광조사했다.

조건4: 폴리아크릴산 (pAAc) 미첨가 핵산 샘플 용액에서, 50℃에서 광조사했다.

실시예 6-5. 정량 PCR에 의한 광연결량의 확인

실시예 5-4.에서 광조사에 의해 광연결시킨 샘플에서, 정량 PCR을 실시했다. 정량 PCR의 조건은 실시예 5와 동일한 조건에서 실시했다.

각각의 샘플에 대해서, 광연결 효율은 실시예 2와 동일하게 정량 PCR로 산출 한 ΔCt값으로부터 평가했다. 4℃에서 광조사한 결과는 도14에, 50℃에서 광조사한 결과는 도15에 나타낸다.

광연결 파장인 365nm의 광조사 처리를 4℃에서 수행한 경우에는, pAAc을 첨가함으로써 광조사 1 사이클에서의 ΔCt가 증가했다 (도14의 검정 삼각형). 이것은, pAAc을 첨가한 것으로 주형에 대해 PREP가 더 효과적으로 하이브리드화 가능하며, 광조사 1회 당의 광연결량을 증가시켰기 때문이다. 즉, pAAc은 PREP와 주형의 하이브리드화를 촉진시키고 있다.

또한 광 연결 파장인 365nm의 광조사 처리를 50℃에서 한 경우에도, pAAc을 첨가함으로써 ΔCt가 크게 증가했다 (도15의 검정 삼각형). 이것은 광연결 파장인 365nm의 광조사 처리를 4℃에서 한 경우의 결과와 마찬가지로, pAAc에 의해 주형에 대해 PREP 보다 더 효과적으로 하이브리드화 가능해진 것에 추가하여, PREP 상보 사슬 간의 하이브리드화가 촉진되었기 때문에, PREP의 상보 사슬간에 충분한 하이브리드화의 형성이 가능하며, 그 결과 PREP의 자기 서열 내에서의 광연결이 억제된 것으로 생각되었다.

이것으로부터도, 광연결 파장인 365nm의 광 조사 시에 광연결 프로브 상보 사슬 사이의 하이브리드화를 유지하고, 광연결 프로브의 자기 서열 내에서의 광연결을 억제하고, 광연결 프로브를 광연결 가능 같은 상태로 유지하는 것이 광연결 효율을 향상시키는 데 효과적임이 확인되었다.

[실시예 7: 유전자 변이 검출 감도의 확인]

지금까지의 실시예에 나타낸 바와 같이, 광연결 프로브의 자기 서열 내에서의 광연결을 억제하여, 표적 부위와의 광연결 효율을 향상시킬 수 있다는 것을 알았다. 이것을 근거로 유전자 변이 검출 감도에 대한 효과를 검증하기 위해, EGFR 유전자의 T790M을 대상으로 유전자 변이 검출을 실시했다.

실시예 7-1. 변이형 EGFR 유전자 단편의 조제

실시예 5-2.에서 조제한 야생형 플라스미드에, 공지의 방법에 따라, PrimeSTAR (등록 상표) Mutagenesis Basal Kit (다카라바이오)를 이용하여 T790M 변이를 도입했다. 즉, 해당 방법으로, EGFR 유전자의 2639번째 염기를 시토신(C)에서부터 티민(T)으로 변이시켰다. 이것을 변이형 플라스미드로 했다.

다음에, 이 플라스미드를 주형으로, 실시예 4에 기재된 프라이머 세트 EGFR ex. 20F 및 EGFR ex. 20R을 사용하여 통상의 PCR 반응 조건에 따라 증폭을 행하고, 직쇄상의 EGFR 변이형 유전자 단편을 얻었다. 얻어진 변이형 유전자 단편을 PCR Purification Kit을 이용하여 정제한 후, 중량 농도를 NanoDrop spectrophtometer를 이용하여 측정하고, 증폭 단편 길이를 고려하여 각 유전자 단편의 카피 수를 산출한 것을 변이형 핵산으로 하고, 이하의 검토의 주형으로서 이용했다(서열 번호 21).

EGFR ex. 20 변이형 단편

5'-CAGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCA

CCTCCACCGTGCAACTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAA

GACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGT-3'(서열 번호: 21)

실시예 7-2. 변이형 혼입 샘플의 조제

실시예 5-2.로 조정한 야생형 핵산과 실시예 7-1.에서 조제한 변이형 핵산의 혼합비율을 바꾸어 3종류 (변이 1%, 변이 0.1%, 변이 0.01%)조제하여, 변이형 핵산 검출용 샘플로 사용하였다. 사용한 야생형 핵산과 변이형 핵산의 혼합비를 표 4에 나타낸다. 또한 변이형 핵산을 혼합하지 않은 샘플을 변이 0%의 샘플로 하였다. 또한 혼합형은 1μL 당 카피 수를 나타낸다.

[표 4]

실시예 7-3. 광연결 프로브의 조제

T790에 해당하는 핵산 서열을 표적으로 한, 실시예 4-1.(2)에서 조제한 상보성이 높은 조합인 광연결 프로브를 사용했다.

실시예 7-4. 광연결 반응시의 시약 조성

0.2mL 튜브에, 실시예 7-2.에서 조제한 실시예 4-1.(2)에 나타낸 T790에 해당하는 핵산 서열을 표적으로 한, T790 AS 사슬 (서열 번호 13) 및 T790 S 사슬 (서열 번호 14)의 PREP를 각각 2μL와, 10% (w/w) 폴리 아크릴산 (pAAc)을 2μL 추가하여, 1 × PCR 버퍼 (10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3), 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl₂, 0.001 % (W/V) gelatin)의 최종 농도로 총량을 20μL로 했다.

실시예 7-5. 광연결 반응시의 조건

실시예 7-4.에서 조제한 샘플에 대해, UV-LED에 의해 광연결 파장인 365nm의 광조사를 실시했다. 95℃에서 3분간 가열 처리 후, 95℃에서 30초간 유지하고, 50℃에서 5초 동안 정치한 후, 50℃에서 광을 30초간 조사하는 공정을 1 사이클로하여, 합계 10회 반복하였다.

실시예 7-6. 정량 PCR에 의한 광연결량의 확인

실시예 7-5.의 각 조제액 20μL에 80μL의 멸균수를 각각 추가하여 잘 혼합 한 후, 그 중 5μL를 취하고 45μL의 멸균수를 추가했다. 이 중 5μL씩 주형으로 라이트 사이클러를 사용하여 정량 PCR 반응을 실시했다. 또한, 정량 PCR은 실시예 5 및 실시예 6과 동일한 조건으로 실시했다.

그 결과를 도 16에 나타낸다. 도 16에서, a는 변이 1 %, b는 변이 0.1 %, c는 변이 0.01 %, d는 변이 0 %의 결과를 나타낸다. 그래프의 세로축은 형광 강도의 대수(對數) 표시 값이며, 가로축은 PCR 사이클 수이다. 변이형 0 % (야생형만)에 비해, 변이가 혼입되어 있는 경우는 형광 신호가 높아지고 있다. 그 결과, 변이 1 %에서 변이 0.01 %까지 농도 의존적으로 변이를 검출하고 있는 것으로 확인되었다. 이것은, PREP의 자기 서열 내에서 광연결을 억제함으로써, 야생형 서열에 대한 광연결 효율이 향상된 것에 기인하는 것으로 생각된다.

광연결 프로브의 자기 서열 내에서의 광연결을 억제하는 것으로, 지금까지 매우 어려웠던 변이 0.01 %의 존재비에서도 변이형 핵산을 선택적이고 효과적으로 증폭하는 것이 가능하게 되었다.

이상에서 본 방법은 민감하고 정밀하게 변이 유전자를 검출할 수 있음을 보여 주었다.

[실시예 8: 이노신을 도입한 PREP의 평가]

실시예 8-1. 광연결 프로브(PREP)의 조제

광연결 대상의 주형으로는, 실시예 1-1.에서 조제한, EGFR 유전자의 엑손 21 (ex.21) 영역의 일부와 동일 서열의 100mer로 구성된 올리고 뉴클레오티드를 사용했다.

이 합성 올리고 뉴클레오타이드와 하이브리드화 가능한 16mer로 구성된 PREP를 이노신의 도입 위치를 바꾸어 3가지 설계했다 (서열 번호 23 ~ 25). 하나는 이노신을 도입하지 않는 PREP를 비교 대상용의 컨트롤로 설계했다(서열 번호 22). 이러한 PREP의 서열을 표 5에 나타낸다. 또한, 광연결성 핵산류인 CNVK의 PREP로의 도입 위치를 n으로 하고, 이노신의 도입 위치를 I로 나타낸다.

[표 5]

실시예 8-2. PREP로의 광조사 처리

실시예 8-1.에서 합성한 각 PREP를 TE에서 100μmol/L에 용해하고, 각 200pmol을 별도의 0.2mL 튜브에 분취했다. 각각의 샘플에 대해 다음 조건으로 광 조사를 실시했다. 또한, 클램프 형성 파장인 365nm의 광조사는 UV-LED 조사기 (ZUV-C30H: 오므론)을 사용했다.

조건 1: 광 미조사

각 PREP에 대해 광조사를 실시하지 않는다.

조건 2: 클램프 형성 광조사

각 PREP에 365nm의 빛을 4 ℃에서 3 분간 조사한다.

실시예 8-3. 전기 영동에 의한 평가

광조사 처리의 영향을 보기 위하여, 실시예 8-2.의 조건에서 처리한 각각의 PREP를 멸균수로 10 μmol/L에 희석 후, MultiNA (시마즈 제작소)를 이용하여 마이크로칩 전기 영동을 실시했다. 그의 겔 이미지를 도 17에 나타낸다.

이노신을 도입하지 않은 PREP (PREP e), 이노신을 1개 도입한 PREP (PREP f)는 UV 조사 후의 밴드가 저분자 측에 시프트하고 있는 것에 대해서, 이노신을 2개, 3개 도입한 PREP (PREP g., PREP h)는 UV 조사 후의 밴드 시프트를 볼 수 없게 되었다. 이것은 이노신을 도입하지 않은 PREP, 이노신을 1개 밖에 도입하지 않은 PREP는, UV 조사에 의해 명백한 PREP의 콘포메이션 변화가 발생하는 반면, 이노신을 2개, 3개 도입함으로써 PREP의 콘포메이션 변화를 억제하는 것을 보여주고 있다.

이 때문에, PREP 내의 크로스 링크 타겟으로 되는 피리미딘 염기를 이노신과 같은 크로스 링크 타겟이 되지 않는 염기로 치환함으로써, PREP의 자기 서열 내에서의 클램프 형성을 억제할 수 있음이 시사되었다.

[실시예 9: 광조사 처리를 한 PREP의 클램프 형성 효율의 평가]

실시예 9-1. 광연결 프로브 (PREP)의 조제

평가 대상의 PREP는, 실시예 8-1.에서 조제한 PREP e. 과 PREP h. 을 사용했다.

실시예 9-2. PREP의 광연결 반응 (클램프 형성 반응)

0.2mL 튜브에, 표적 부위를 가지는 핵산 서열로서 100 pmol/L의 합성 올리고 뉴클레오티드 2μL을 분취하고, 100 μmol/L의 PREP (실시예 8-2. 기재의 각 조건에서 처리한 것) 2μL를 추가하여, 1 × PCR 버퍼 (10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3), 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl₂, 0.001 % (W/V) gelatin)의 최종 농도에서 총량을 20μL로 했다.

이것을 95℃에서 5분간 가열 처리하고, 45℃에서 5초 동안 정치한 후, 45℃에서 UV-LED는 365nm의 광을 30초 동안 조사했다. 또한 대조군으로 광을 조사하지 않는 샘플을 동시에 마련했다.

실시예 9-3. 정량 PCR 반응 용액의 조제와 반응 조건

실시예 9-2.에서 조제한 샘플(대조군 샘플을 포함)의 각 조제액 20μL에 80μL의 멸균수를 각각 추가하여 잘 혼합한 후, 다시 그 중 5μL씩을 45μL의 멸균수에 섞었다. 혼합한 샘플 내 5μL를 주형으로하여 라이트 사이클러 (LC 480Ver2: 로슈사 제품)를 사용하여 정량 PCR 반응을 실시했다.

정량 PCR용 반응액으로는, 다음의 시약을 혼합하여 제조한, 1샘플 당의 최종 액량이 25μL가 되도록 멸균수를 첨가하여 제조하였다. 12.5μL의 2 × Premix Ex Taq (등록 상표) (다카라 바이오사 제품)에, 증폭 프라이머로 EGFR ex. 21F (서열 번호: 6)와 EGFR ex. 21R (서열 번호: 7)을 각각 5pmol씩 첨가하였다.

또한 말단 형광 표지된 검출 프로브를 2.5pmol 첨가하였다. 이 검출 프로브의 서열은 다음과 같다.

Total LNA 프로브: 5'-Cy5/CAGCATGT + CAAGA + TCACAGA / BHQ_2-3 '(서열 번호 26)

또한, 서열 중 +는 연속적인 염기가 LNA임을 나타내고, Cy5는 형광 색소를, BHQ2은 형광 억제 물질을 각각 나타낸다. 해당 검출 프로브의 합성은 IDT사에 위탁했다.

또한, 정량 PCR 반응은 95℃, 10초 + (95℃, 3초 /56 ℃, 30초) × 45 사이클의 조건에서 실시했다.

각각의 샘플에, 클램프 형성 효율이 실시예 2와 동일하게 정량 PCR로 산출 한 ΔCt 값에서 평가했다. 그 결과를 도 18에 나타낸다.

또한, 프라이머의 서열은 다음과 같다.

EGFR ex. 21F : 5'-GAACGTACTGGTGAAAACACC-3 '(서열 번호 6)

EGFR ex. 21R : 5'-GCATGGTATTCTTTCTCTTCC-3 '(서열 번호 7)

이노신을 도입하지 않은 PREP e. 를 이용한 경우, ΔCt가 4 정도로 UV를 수 차례 조사해도 거의 일정한 반면 (도 18의 삼각형), 이노신을 도입한 PREP h. 를 이용한 경우, UV 조사 횟수를 늘릴 때마다 ΔCt가 증가함을 (도 18의 사각형 표시) 알 수 있다.

이것은, 이노신을 도입하지 않은 PREP는, PREP의 자기 서열 내에서의 클램프 형성이 일어나고, 광을 수 차례 조사해도 PREP의 주형에 대한 클램프 형성량이 증가하지 않았던 것에 대해서, 이노신을 도입한 PREP는, PREP의 자기 서열 내에서의 클램프 형성이 억제되었기 때문에, PREP가 주형에 대해 충분히 클램프 형성 가능 해졌기 때문에 UV 조사 횟수에 따라 클램프 형성량이 증가하는 것으로 생각된다.

즉, PREP의 자기 서열 내에서의 상호 연결 타켓 염기를 이노신과 같은 광연결의 표적 핵산으로 되지 않는 염기로 치환하여, PREP의 자기 서열 내에서의 광연결을 억제할 수 있어, PREP 클램프 형성양을 증가할 수 있음이 나타났다.

[실시예 10: 상보성 높은 PREP를 이용한 클램프 형성의 확인]

실시예 10-1. 광연결 프로브(PREP)의 조제

야생형 서열인 EGFR 유전자의 861번째 류신(L861)에 해당하는 핵산 서열을 표적 부위로서, 실시예 8-1.에서 설계한 PREPe. 서열을 EGFR 유전자 코드 사슬, 즉 센스 사슬에 하이브리드화하는 안티센스 사슬 (AS 사슬)의 PREP로서 (서열 번호 22), 동시에 EGFR 유전자의 안티센스 사슬에 하이브리드화하는 센스 사슬 (S 사슬)의 PREP도 설계했다 (서열 번호 27). CNVK의 도입 위치를 n으로 나타낸다.

L861 AS 사슬 : 5'-GCAnCCAGCAGTTTGG-3 '(서열 번호 22)

L861 S 사슬 : 5'-CTGnCCAAACTGCTGG-3 '(서열 번호 27)

또한, 센스 사슬의 PREP 및 안티센스 사슬의 PREP의 상보성과 완전 상보의 관계이며, 서로의 PREP끼리 광연결하지 않는 위치에 CNVK을 배치하고 그리고 각 PREP의 CNVK가 본래 광연결할 수 있는 표적 핵산을 이노신으로 치환한 PREP를 설계했다. CNVK의 도입 위치를 n으로 하고, 이노신의 도입 위치를 I로 나타낸다.

L861 AS 사슬 : 5'-GCAnCCAGCAGTITGG-3 '(서열 번호 28)

L861 S 사슬 : 5'-CCAAnCTGCTGGGIGC-3 '(서열 번호 29)

도 19에 클램프 프로브로서 실제로 사용한 PREP의 서열과 그의 상보성에 대한 모식도를 나타낸다.

실시예 10-2. EGFR 엑손 21 (ex.21) 영역에서 야생형 유전자 단편의 조제

건강한 정상인의 말초 혈액에서 정상적인 방법으로 인간 게놈 DNA를 조제하고, 이를 주형으로 프라이머 세트 EGFR ex. 21F 및 EGFR ex. 21R을 사용하여, L861에 해당하는 핵산 서열을 포함하는 EGFR 엑손 21 (ex.21)의 영역을 통상의 PCR 반응 조건에 따라 증폭했다. PCR 반응에 사용된 primer 서열은 다음과 같다.

EGFR ex. 21F (out): 5'-GCATGAACTACTTGGAGGAC-3 '(서열 번호 30)

EGFR ex. 21R (out): 5'-ACCTAAAGCCACCTCCTTAC-3 '(서열 번호 31)

얻어진 PCR 증폭 산물을 pGEMT easy Vector (프로메가) 내에, 첨부된 프로토콜에 따라 삽입하여 클론했다.

이 플라스미드를 주형으로, 상기 프라이머 세트 EGFR ex. 21F 및 EGFR ex. 21R을 사용하여 일반적인 PCR 반응 조건에 따라 증폭하고, PCR Purification Kit (퀴아젠사 제품)를 이용하여 정제하여, 직쇄상의 EGFR ex. 21의 야생형 유전자 단편을 얻었다 (서열 번호 32).

PCR Purification Kit (퀴아젠사 제품)를 이용하여 정제된 EGFR ex. 21의 야생형 유전자 단편의 중량 농도를 NanoDrop spectrophtometer (Thermo Scientific)를 이용하여 측정하고, 증폭 단편 길이를 고려하여 각 유전자 단편의 카피 수를 산출한 것을, 야생형 핵산으로서 다음 반응의 검토 주형으로 사용하였다.

[서열 번호 32] EGFR ex. 21 야생형 단편

5'-GCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTG

AAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATA

CCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTGGT-3'(서열 번호 32)

실시예 10-3. 광연결 반응시의 시약 조성

0.2mL 튜브에, 실시예 10-2.에서 조제한 표적 핵산 (1 × 10⁷ 카피/μL)을 2μL와, 100 μmol/L로 조제한, 실시예 10-1.에 나타내는 L861에 해당하는 핵산 염기를 표적으로 한, L861 AS 사슬 (서열 번호 28) 및 L861 S 사슬 (서열 번호 29)의 PREP를 각각 2μL씩 추가하여, 1 × PCR 버퍼 (10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3), 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl₂, 0.001 % (W/V) gelatin)의 최종 농도에서 총량을 20μL로 했다.

실시예 10-4. 광연결 반응시의 조건

실시예 10-3.에서 조제한 핵산 샘플 용액에 대해, 95℃에서 5분간 가열 처리하고, 45℃에서 5초 동안 정치한 후, 45℃에서 UV-LED에 의해 365nm의 광을 30초 동안 조사했다. 또한 대조군으로 광을 조사하지 않는 샘플을 동시에 마련했다.

실시예 10-5. 정량 PCR에 의한 클램프량의 확인

실시예 10-4.에서 광연결 반응을 실시한 각 반응액 20μL에 80μL의 멸균수를 각각 추가하여 잘 혼합한 후, 다시 그 중 5μL씩을 45μL의 멸균수에 혼합했다. 혼합한 샘플 내 5μL를 주형으로 하여 라이트 사이클러 (LC 480Ver2: 로슈사 제품)를 사용하여 정량 PCR 반응을 실시했다.

정량 PCR용 반응액으로는, 다음의 시약을 혼합하여 제조한, 1샘플 당의 최종 액량이 25μL가 되도록 멸균수를 첨가하여 제조하였다. 12.5μL의 2 × Premix Ex Taq (등록 상표) (다카라바이오사 제품)에, 증폭 프라이머로 EGFR ex. 21F 및 EGFR ex. 21R을 각각 5pmol씩 첨가하였다. 또한 말단 형광 표지된 검출 프로브를 2.5 pmol 첨가하였다. 검출 프로브에는, 실시예 9에 기재된 프로브 (서열 번호 26)와 같은 것을 사용하고, 정량 PCR 반응은 실시예 9-2.와 동일한 조건에서 실시했다.

각각의 샘플에 있어서, 클램프 형성 효율은 실시예 2와 동일하게 정량 PCR로 산출한 ΔCt 값에서 평가했다. 그 결과를 도 20에 나타낸다.

기존의 설계 방법에 따라 설계한 PREP (삼각인(三角印))는, UV를 여러 번 조사해도 ΔCt가 일정한 곳에서 포화되어 버리지만, 이노신을 도입하여 완전히 상보적으로 설계한 PREP를 이용하는 것으로 UV 복수 조사하는 것으로 ΔCt을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다.

이것은, PREP 내에 이노신을 도입하며, PREP의 상보성을 높인 것으로 PREP의 자기 서열 내에서 클램프 형성을 억제할 수 있었기 때문이라고 생각된다. 이 점에서도 클램프 형성 파장인 365nm의 광 조사시에 PREP 상보 사슬 사이의 하이브리드화를 유지하고, PREP의 자기 서열 내에서 클램프 형성을 억제하고, PREP를 클램프 형성 가능한 상태로 유지하는 것이 클램프 형성 효율을 향상시키는 데 효과적임이 확인되었다.

(산업상 이용 가능성)

본 발명은 광응답성 핵산류를 포함한 프로브를 이용한, 광연결 효율을 향상시키는 방법에 관한 것으로서, 고감도이며 정밀하게 유전자를 분석할 수 있다. 예를 들어, 대량으로 존재하는 야생형 유전자에 혼재하여 미량으로 존재하는 변이형 유전자를 선택적으로 검출할 때 사용할 수 있다. 또한 기존의 평가 방법으로는 검출이 어려웠던 표적으로하는 핵산이 미량밖에 존재하지 않는 핵산 샘플로부터의 유전자 검출도 가능하게 할 것이다.

또한 이상과 같은 해석이 가능하다는 점은, 수술을 통해 적출된 조직이나 생검 재료와 같은 침습성 높은 검사 재료에 한정되지 않고, 예를 들어 혈액 샘플과 같은 표적으로 하는 핵산이 미량 밖에 존재하지 않는 샘플도 재료로 취급하기 때문에 어려웠던 치료 효과의 확인과 모니터링 검사를 가능하게한다. 이들은 암의 조기 발견과 개별 환자에 대한 약제 감수성 및 약제 응답성을 시작으로 한 약효 평가 등에 적용하기 위한 개별화 의료의 실현을 가능하게 하는 것이다.

이상, 본 발명을 특정 실시예에 따라 설명했지만, 당업자에게 자명한 변형이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

(서열표 프리텍스트)

서열 목록의 서열 번호 2 ~ 5의 각 염기 서열은, 인공적으로 합성한 프로브 서열이며, 각각 PREPa. (6번째의 n은 CNVK), PREPb. (8번째의 n은 CNVK), PREPc. (10번째의 n은 CNVK), PREPd. (12번째의 n은 CNVK)이다. 서열 번호 8 ~ 10의 각 염기 서열은 인공적으로 합성한 프로브 서열이며, 각각 PREP-A (3번째의 n은 CNVK), PREP-G (3번째의 n은 CNVK), PREP-AG (3번째의 n은 CNVK)이다. 서열 번호 11 ~ 16의 각 염기 서열은 인공적으로 합성한 프로브 서열이며, 각각 프로브 L861 AS (15번째 n은 CNVK), 프로브 L861 S (14번째의 n은 CNVK), 프로브 T790 AS (4번째의 n은 CNVK), 프로브 T790 S (3번째 n은 CNVK), 프로브 L858 AS (3번째 n은 CNVK), 프로브 L858 S (3번째 n은 CNVK)이다. 서열 번호 20의 염기 서열은 인공적으로 합성한 프로브 서열이며, Total LNA 프로브 (4 번째의 C, 8 번째의 T, 11 번째의 C는 LNA)이다. 서열 번호 22 ~ 25의 각 염기 서열은 인공적으로 합성한 프로브 서열이며, 각각 PREPe. (4 번째 n은 CNVK), PREPf. (4번째의 n은 CNVK, 14 번째의 n은 이노신) PREPg. (4 번째 n은 CNVK, 13 ~ 14 번째 n은 이노신), PREPh. (4 번째 n은 CNVK, 12 ~ 14 번째 n은 이노신)이다. 서열 번호 26의 염기 서열은 인공적으로 합성한 프로브 서열이며, Total LNA 프로브 (9번째의 C, 14 번째의 T는 LNA)이다. 서열 번호 27 ~ 29의 각 염기 서열은 인공적으로 합성한 프로브 서열이며, 각각 프로브 L861 S (4 번째의 n은 CNVK), 프로브 T861 AS (4 번째의 n은 CNVK, 13 번째의 n은 이노신) 프로브 T861 S (5 번째의 n은 CNVK, 14 번째의 n은 이노신)이다.

<110> LSI Medience Corporation <120> Photocoupling method using probe containing photoresponsive nucleic acids <130> PI10580JP <150> JP 2012-161834 <151> 2012-07-20 <150> JP 2012-270614 <151> 2012-12-11 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 100 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agccaggaac gtactggtga aaacaccgca gcatgtcaag atcacagatt ttgggctggc 60 caaactgctg ggtgcggaag agaaagaata ccatgcagaa 100 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe PREPa. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> "n" is CNVK <400> 2 cagcantttg gccagc 16 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe PREPb. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> "n" is CNVK <400> 3 cccagcantt tggcca 16 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe PREPc. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> "n" is CNVK <400> 4 cacccagcan tttggc 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe PREPd. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> "n" is CNVK <400> 5 cgcacccagc antttg 16 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gaacgtactg gtgaaaacac c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gcatggtatt ctttctcttc c 21 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe PREP-A <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> "n" is CNVK <400> 8 aanaaaaaaa aaaaaa 16 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe PREP-G <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> "n" is CNVK <400> 9 ggnggggggg gggggg 16 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe PREP-AG <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> "n" is CNVK <400> 10 agnagagaga gagaga 16 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe L861 AS <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> "n" is CNVK <400> 11 ctcttccgca cccancag 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe L861 S <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> "n" is CNVK <400> 12 ttgggctggc caanctgc 18 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe T790 AS <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> "n" is CNVK <400> 13 tganctgcgt gatgag 16 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe T790 S <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> "n" is CNVK <400> 14 canctcatca cgcagc 16 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe L858 AS <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> "n" is CNVK <400> 15 cantttggcc agccc 15 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe L858 S <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> "n" is CNVK <400> 16 cantttgggc tggcca 16 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 cagaagccta cgtgatgg 18 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 acctttgcga tctgcacac 19 <210> 19 <211> 190 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 cagaagccta cgtgatggcc agcgtggaca acccccacgt gtgccgcctg ctgggcatct 60 gcctcacctc caccgtgcag ctcatcacgc agctcatgcc 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gtntgg 16 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe L861 S <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> "n" is CNVK <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> i <400> 29 ccaanctgct gggngc 16 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 gcatgaacta cttggaggac 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 acctaaagcc acctccttac 20 <210> 32 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 gcatgaacta cttggaggac cgtcgcttgg tgcaccgcga cctggcagcc aggaacgtac 60 tggtgaaaac accgcagcat gtcaagatca cagattttgg gctggccaaa ctgctgggtg 120 cggaagagaa agaataccat gcagaaggag gcaaagtaag gaggtggctt tggt 174

Claims (20)

1. 핵산 샘플 중에 존재하는 표적 부위와, 상기 표적 부위에 대해 상보적인 서열을 가지며, 광응답성 핵산류를 포함한 제1 프로브를, 반응 용액 중에서 하이브리드화하는 단계; 및
   광조사함에 의해 이들을 광연결시키는 단계를 포함하며,
   상기 제1 프로브에 대해서, 높은 상보성을 갖는 제2 프로브를 공존시킴으로써, 상기 제1 프로브 내의 상기 광응답성 핵산류에 기인한 자기 회합을 억제시키고,
   상기 높은 상보성은, 상기 제1 프로브와 상기 제2 프로브가 서로 상보적인 관계에 있으며, 광조사하는 것에 의하여, 상기 제1 프로브 중의 상기 광응답성 핵산류의 자기 내에서 광연결하는 염기가, 제2 프로브와 하이브리드화하는 상태를 의미하고,
   상기 제2 프로브는 제1 프로브 중의 광응답성 핵산류와 광연결하지 않도록 설계되고,
   상기 광응답성 핵산류는,
   (1) 염기 부분으로, 식 I:
   

   

   
   (식 중, Ra는 시아노기, 아미드기, 카르복실기, C2 ~ C7의 알콕시 카르보닐기 또는 수소이고, R₁ 및 R₂는, 각각 독립적으로, 시아노기, 아미드기, 카르복실기, C2 ~ C7의 알콕시 카르보닐기 또는 수소이다)로 표시되는 기를 갖는 핵산류;
   (2) 염기 부분으로 식 II:
   

   

   
   (식 중, R은 -CN, -ＣＯＮＲ^１Ｒ^２, 또는 -ＣＯＯＲ^３이며, 관련 Ｒ^１~Ｒ^３는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 알킬기 C_nH_{2n + 1} (n ≥ 1)이다)로 표시되는 기를 갖는 핵산류;
   (3) 염기 부분으로 식 III:
   

   

   
   (식 중, Z는 O 또는 NH를 나타내고, X 및 Y 중 적어도 하나는 카르복실기, 저급 알콕시 카르보닐기, 치환 아미드기 및 시아노기로 이루어진 군으로부터 선택된 전자 흡인성기를 나타내고, X와 Y의 나머지 기는 수소 원자를 나타낸다)로 표시되는 기를 가지는 핵산류;
   (4) 염기 부분으로 식 IV:
   

   

   
   (식 중, R₁은 수소 원자이며, R₂ 및 R₃ 의 적어도 하나가, 카르복실기, 저급 알콕시 카르보닐기, 저급 알케닐기, 저급 알키닐기, 치환 아미드기, 아미드기, 시아노기 및 수소 원자로 이루어진 군으로부터 선택된 기를 나타내고, R₂ 및 R₃의 나머지 기는 수소 원자 또는 시아노기를 나타낸다)로 표시되는 기를 가지는 핵산류;
   (5) 염기 부분으로 식 V:
   

   

   
   (식 중, R₄는 수소 원자 또는 저급알킬기이고, R₅ 및 R₆ 중 적어도 하나는, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 저급 알케닐기, 저급 알키닐기, 치환 아미드기, 아미드기, 시아노기 및 수소 원자로 이루어진 군으로부터 선택된 기를 나타내고, R₅ 및 R₆의 나머지 기는 수소 원자 또는 시아노기를 나타낸다)로 표시되는 기를 가지는 핵산류;
   (6) 염기 부분으로서 식 VI:
   

   

   
   (식 중, R₇은 수소 원자 또는 저급 알킬기이고, R₈ 및 R₉ 중 적어도 하나는, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 저급 알케닐기, 저급 알키닐기, 치환 아미드기, 아미드기, 시아노기 및 수소 원자로 이루어진 군으로부터 선택된 기를 나타내고, R₈ 및 R₉의 나머지 기는 수소 원자 또는 시아노기를 나타낸다.)로 표시되는 기를 가지는 핵산류; 및
   (7) 염기 부분으로 식 VII:
   

   

   
   (식 중, R₁₀은 수소 원자 또는 저급 알킬기이고, R₁₁ 및 R₁₂ 중 적어도 하나는, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 저급 알케닐기, 저급 알키닐기, 치환 아미드기, 아미드기, 시아노기 및 수소 원자로 이루어진 군으로부터 선택된 기를 나타내고, R₁₁ 및 R₁₂의 나머지 기는 수소 원자 또는 시아노기를 나타낸다)로 표시되는 기를 가지는 핵산류;
   로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산류인 것을 특징으로 하는, 광연결 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 청구항 1에 있어서, 상기 광연결시키는 방법이 상기 핵산 샘플에 존재하는 표적 부위를 가지는 표적 핵산과, 상기 제1 프로브의 광응답성 핵산류와의 사이에 광연결시키는 것인, 광연결 방법.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 제2 프로브가 광응답성 핵산류를 포함하는 것인, 광연결 방법.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 프로브 및 상기 제2 프로브가 광응답성 핵산류를 포함하고, 상기 제1 프로브와 상기 제2 프로브의 비상보성 영역에서 상기 제1 프로브 및/또는 상기 제2 프로브 내에 존재하는 광응답성 핵산류가 자기 내에서 광연결되지 않도록, 상기 제1 프로브 및/또는 상기 제2 프로브에 상보적인 서열을 갖는 제3 프로브를 사용하는 것인, 광연결 방법.
7. 청구항 1에 있어서, 핵산 샘플에 존재하는 표적 부위와, 상기 표적 부위에 대해 상보적인 서열을 가지고 광응답성 핵산류를 포함하는 제1 프로브와, 상기 표적 부위에 대해 상보적인 서열을 가지며 표적 핵산을 포함하는 제4 프로브를 반응 용액 중에서 인접하여 배치하도록 하이브리드화시키고, 광조사에 의해 상기 제4 프로브에 존재하는 표적 핵산과 상기 제1 프로브 중의 상기 광응답성 핵산류와의 사이에서 광연결하는 방법에 있어서,
   상기 제1 프로브에 대해, 높은 상보성을 갖는 제2 프로브를 공존시킴으로써, 상기 제1 프로브 내의 상기 광응답성 핵산류에 기인한 자기 회합을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 광연결 방법.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 프로브 내에서 광응답성 핵산류와 자기 회합하는 핵산을 상기 광응답성 핵산류와 광연결하지 않는 핵산으로 치환한 상기 제1 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는, 상기 제1 프로브 내의 상기 광응답성 핵산류에 기인한 자기 회합을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 광연결 방법.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 광응답성 핵산류와 광연결하지 않는 핵산이 퓨린 염기인, 광연결 방법.
10. 청구항 8에 있어서, 상기 광응답성 핵산류와 광연결하지 않는 핵산이 피리미딘환을 인공적으로 변환한 합성 염기인, 광연결 방법.
11. 청구항 1에 있어서, 반응 용액에 음이온성 물질이 존재하는, 광연결 방법.
12. 청구항 5에 있어서, 상기 광응답성 핵산류를 포함하는 프로브의 적어도 한 종류가, 반응 용액 중에 0.1 μmol/L 이상의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는, 광연결 방법.
13. 청구항 1 및 청구항 4 내지 12 중 어느 한 항에 기재된 광연결 방법을 사용하는 유전자 해석 방법.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 유전자 해석 방법은 유전자 검출 방법 또는 핵산 증폭 방법인, 유전자 해석 방법.
15. 청구항 14에 기재된 핵산 증폭 방법이, 변이형 핵산의 표적 부위를 포함하는 증폭용 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 증폭시킴으로써, 상기 변이형 핵산의 유무를 검출하는 것을 특징으로하는 변이형 핵산 검출 방법.
16. 핵산 샘플 중의 표적 부위에 대해 상보적인 서열을 갖는 광응답성 핵산류를 포함하는 제1 프로브, 상기 제1 프로브에 대해, 높은 상보성을 갖는 제2 프로브를 포함하고,
    상기 높은 상보성은, 상기 제1 프로브와 상기 제2 프로브가 서로 상보적인 관계에 있으며, 광조사하는 것에 의하여, 상기 제1 프로브 중의 상기 광응답성 핵산류의 자기 내에서 광연결하는 염기가, 제2 프로브와 하이브리드화하는 상태를 의미하고,
    상기 제2 프로브는 제1 프로브 중의 광응답성 핵산류와 광연결하지 않도록 설계되고,
    상기 광응답성 핵산류는,
    (1) 염기 부분으로, 식 I:
    

    

    
    (식 중, Ra는 시아노기, 아미드기, 카르복실기, C2 ~ C7의 알콕시 카르보닐기 또는 수소이고, R₁ 및 R₂는, 각각 독립적으로, 시아노기, 아미드기, 카르복실기, C2 ~ C7의 알콕시 카르보닐기 또는 수소이다)로 표시되는 기를 갖는 핵산류;
    (2) 염기 부분으로 식 II:
    

    

    
    (식 중, R은 -CN, -ＣＯＮＲ^１Ｒ^２, 또는 -ＣＯＯＲ^３이며, 관련 Ｒ^１~Ｒ^３는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 알킬기 C_nH_{2n + 1} (n ≥ 1)이다)로 표시되는 기를 갖는 핵산류;
    (3) 염기 부분으로 식 III:
    

    

    
    (식 중, Z는 O 또는 NH를 나타내고, X 및 Y 중 적어도 하나는 카르복실기, 저급 알콕시 카르보닐기, 치환 아미드기 및 시아노기로 이루어진 군으로부터 선택된 전자 흡인성기를 나타내고, X와 Y의 나머지 기는 수소 원자를 나타낸다)로 표시되는 기를 가지는 핵산류;
    (4) 염기 부분으로 식 IV:
    

    

    
    (식 중, R₁은 수소 원자이며, R₂ 및 R₃ 의 적어도 하나가, 카르복실기, 저급 알콕시 카르보닐기, 저급 알케닐기, 저급 알키닐기, 치환 아미드기, 아미드기, 시아노기 및 수소 원자로 이루어진 군으로부터 선택된 기를 나타내고, R₂ 및 R₃의 나머지 기는 수소 원자 또는 시아노기를 나타낸다)로 표시되는 기를 가지는 핵산류;
    (5) 염기 부분으로 식 V:
    

    

    
    (식 중, R₄는 수소 원자 또는 저급알킬기이고, R₅ 및 R₆ 중 적어도 하나는, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 저급 알케닐기, 저급 알키닐기, 치환 아미드기, 아미드기, 시아노기 및 수소 원자로 이루어진 군으로부터 선택된 기를 나타내고, R₅ 및 R₆의 나머지 기는 수소 원자 또는 시아노기를 나타낸다)로 표시되는 기를 가지는 핵산류;
    (6) 염기 부분으로서 식 VI:
    

    

    
    (식 중, R₇은 수소 원자 또는 저급 알킬기이고, R₈ 및 R₉ 중 적어도 하나는, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 저급 알케닐기, 저급 알키닐기, 치환 아미드기, 아미드기, 시아노기 및 수소 원자로 이루어진 군으로부터 선택된 기를 나타내고, R₈ 및 R₉의 나머지 기는 수소 원자 또는 시아노기를 나타낸다.)로 표시되는 기를 가지는 핵산류; 및
    (7) 염기 부분으로 식 VII:
    

    

    
    (식 중, R₁₀은 수소 원자 또는 저급 알킬기이고, R₁₁ 및 R₁₂ 중 적어도 하나는, 카르복실기, 저급 알콕시카르보닐기, 저급 알케닐기, 저급 알키닐기, 치환 아미드기, 아미드기, 시아노기 및 수소 원자로 이루어진 군으로부터 선택된 기를 나타내고, R₁₁ 및 R₁₂의 나머지 기는 수소 원자 또는 시아노기를 나타낸다)로 표시되는 기를 가지는 핵산류;
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산류인 것을 특징으로 하는 광연결 키트.
17. 청구항 16에 있어서, 상기 제1 프로브가 핵산 샘플 중의 표적 부위의 표적 핵산과 광연결하는 것인, 광연결 키트.
18. 청구항 16에 있어서, 또한 상기 제1 프로브의 상기 광응답성 핵산류와 광연결하는 표적 핵산을 포함하는 제4 프로브를 포함하는, 광연결 키트.
19. 청구항 16에 있어서, 상기 제2 프로브가 광응답성 핵산류를 포함하는, 광연결 키트.
20. 청구항 16 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 프로브가 상기 프로브 내에서 광응답성 핵산류와 자기 회합하는 핵산을 상기 광응답성 핵산류와 광연결하지 않는 핵산으로 치환한 것인, 광연결 키트.
    

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