JPWO2014014106A1 - 光応答性核酸類を含むプローブを用いた光連結方法 - Google Patents
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Abstract
Description
このようなSNPs部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。DNAの一塩基多型をタイピングする技術としては、TaqMan PCR法やInvader法などが、一塩基の置換を識別できるほどの高い配列選択性をもつ技術として知られている。
[1]核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブと、を反応溶液中でハイブリダイゼーションし、光照射することにより光連結させる方法であって、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする、光連結方法。
[2]前記第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることにより、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする、[1]の光連結方法。
[3]前記高い相補性とは、前記第一のプローブと前記第二のプローブとが互いに相補的な関係にあり、所定の光連結条件下で該第一のプローブ中の該光応答性核酸類の自己内で光連結する塩基が、第二のプローブとハイブリダイゼーションしている、[1]又は[2]の光連結方法。
[4]前記光連結させる方法が、前記核酸サンプル中に存在する標的部位が有する標的核酸と、前記第一のプローブの光応答性核酸類との間で光連結させる、[1]〜[3]のいずれかの光連結方法。
[5]前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、[1]〜[4]のいずれかの光連結方法。
[6]前記第一のプローブ及び前記第二のプローブが光応答性核酸類を含み、該第一のプローブと該第二のプローブの非相補性領域において、該第一のプローブ及び/又は該第二のプローブ内に存在する光応答性核酸類が自己内で光連結できないように、該第一のプローブ及び/又は該第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを使用する、[1]〜[5]のいずれかの光連結方法。
[7]核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し光応答性核酸類を含む第一のプローブと、該標的部位に対して相補的な配列を有し標的核酸を含む第四のプローブと、を反応溶液中で隣接して配置するようにハイブリダイゼーションさせ、光照射によって該第四のプローブに存在する標的核酸と該第一のプローブ中の該光応答性核酸類との間で光連結する方法において、
該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、[1]の光連結方法。
[8]前記第一のプローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換した該第一のプローブを使用することを特徴とする、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、[1]〜[7]のいずれかの光連結方法。
[9]前記光応答性核酸類と光連結しない核酸がプリン塩基である、[8]の光連結方法。
[10]前記光応答性核酸類と光連結しない核酸が、ピリミジン環を人工的に変換した合成塩基である、[8]の光連結方法。
[11]反応溶液中にアニオン性物質が存在する、[1]〜[10]のいずれかの光連結方法。
[12]少なくとも一種類の光連結プローブが、反応溶液中に0.1μmol/L以上の濃度で存在することを特徴とする、[1]〜[11]のいずれかの光連結方法。
[13][1]〜[12]のいずれかの光連結方法を使用する遺伝子解析方法。
[14]前記遺伝子解析方法が、遺伝子検出方法又は核酸増幅方法である、[13]の遺伝子解析方法。
[15][14]の核酸増幅方法が、変異型核酸の標的部位を含む増幅用ヌクレオチド配列を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出することを特徴とする、変異型核酸検出方法。
[16]核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含むことを特徴とする、光連結キット。
[17]前記第一のプローブが、核酸サンプル中の標的部位の標的核酸と光連結するものである、[16]の光連結キット。
[18]更に、該第一のプローブの該光応答性核酸類と光連結する標的核酸を含む第四のプローブを含む、[16]の光連結キット
[19]前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、[16]〜[18]のいずれかの光連結キット。
[20]前記第一のプローブが、該プローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換したものである、[16]〜[19]のいずれかの光連結キット。
また、変異箇所や塩基の種類、光連結プローブの長さ等の状況に応じて、標的部位と目的部位とが一致するように光連結プローブを設計することもできるし、目的部位とは頃なる部位に標的部位を設定してプローブを設計することもできる。標的部位と目的部位とが一致する場合には、一部の部位のみを重複させることも可能であるし、全部を重複させて設計することも可能である。
例えば、ソラレン誘導体(Chang, E. et al. Biochemistry 1991, 30, 8283)やアミノプリン誘導体(特開2001−206896)や4−チオウラシル等が使用できる。前記ソラレン誘導体は5’−AT−3’である塩基配列のチミン特異的に反応する性質があり、また、アミノプリン誘導体には配列依存性はないもののシチジン特異的であることから、適用範囲に一定の制約があるため、そのような制限のない下記の光応答性核酸類がより好ましい。
で表される基を有する核酸類(Org. Lett., Vol. 10, No. 15, 2008、特開2009−254279号公報)を挙げることができる。結合される核酸がDNAの場合、この式Iで表される置換カルバゾリル基は、式I(a):
で表される基を有する核酸類(Organic & Biomolecular Chemistry 2007, 5, 2583、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 (2005), 1299-1301、特開2005−348645)を挙げることができる。結合される核酸がDNAの場合、この式IIで表される置換フェノキシ基は、式II(a):
R4としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数1〜5、好ましくは炭素数1〜3、さらに好ましくは炭素数1〜2、特に好ましくは炭素数1のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
R7としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数1〜5、好ましくは炭素数1〜3、さらに好ましくは炭素数1〜2、特に好ましくは炭素数1のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
R10としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数1〜5、好ましくは炭素数1〜3、さらに好ましくは炭素数1〜2、特に好ましくは炭素数1のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
この場合、該第二のプローブは、該標的部位のアンチセンス鎖の標的核酸と、クロスリンク型の光連結をすることができる。
光応答性核酸類を含む第一のプローブと標的核酸を含む第四のプローブは、所定の標的部位において、隣接してハイブリダイゼーションするように配置され、且つ、光照射によって光連結可能なように隣接して該光応答性核酸類と該標的核酸とが配置される。
当業者であれば、公知の情報から使用する光応答性核酸類がどの塩基を標的とするか、どのような化学反応機構により光連結を行うか等の性質を考慮し、標的となる塩基に対して置換もしくは修飾を実施して、合成塩基を適宜使用することが可能である。
上記の精製や選択的回収の例としては、該遺伝子の精製や核酸サンプル中の標的核酸類を含む核酸を選択的に収集する前処理工程が挙げられる。これらの前処理工程における使用は、下記に述べる遺伝子解析方法において極めて有効である。従って、該前処理の後に続いて実施される遺伝子解析方法、遺伝子検出方法において高感度で正確な解析を達成することが可能となり、好ましい。
また、光応答性核酸類を含む該第二のプローブを含むこともできる。この場合、前記第二のプローブは光連結プローブとしても機能する。
更に、光連結プローブとして機能する、前記第一のプローブ及び/又は前記第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを含むこともできる。
また、光応答性核酸類を含む該第二のプローブを含むこともできる。この場合、前記第二のプローブは光連結プローブとしても機能する。
更に、光連結プローブとして機能する、前記第一のプローブ及び/又は前記第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを含むこともできる。
また、本実施例中において、アミノ酸一文字表記と該アミノ酸の位置番号とで示された表記の場合には野生型を、元のアミノ酸位置文字表記と該アミノ酸位置番号に加えて、更に置換されたアミノ酸一文字表記を組合せて表記される場合には変異型をあらわすものとする。
実施例1−1.光連結プローブの調製
EGFR遺伝子上のエクソン21(ex.21)領域の一部と同配列の100merからなるオリゴヌクレオチドを合成し(配列番号1)、光連結対象の鋳型とした。
[配列番号1] 100merオリゴヌクレオチド:
5’−AGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAA−3’(配列番号1)
CNVKは特開2009−254279号公報に記載の方法に従って調製し、プローブの合成はファスマック社に委託した。また、CNVKの構造式を図1に示す。
実施例1−1.にて合成した各PREPをTEにて100μmol/Lに溶解し、各200pmolを別々の0.2mLチューブに分取した。それぞれのサンプルに対して以下の条件にて光照射を実施した。なお、光連結波長である365nmの光照射はUV−LED照射器(ZUV−C30H:オムロン)を、開裂波長である312nmの光照射はUVトランスイルミネーター(フナコシ)を使用した。
各PREPに対して光照射を行わない。
条件2:光連結光照射
各PREPに365nmの光を室温にて1分間照射する。
条件3:光連結光照射+光連結開裂光照射
条件2の光照射を施した各PREPに、312nmの光を室温にて5分間照射する。
光照射処理の影響を見るため、実施例1−2.の条件で処理した各々のPREPを滅菌水で10μmol/Lに希釈後、MultiNA(島津製作所)を用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを図2〜図5に示す。
また、光連結波長の光を照射した後に光連結開裂波長の光を照射すると、低分子側にシフトしたバンドが、光連結波長の光を照射する前(すなわち、光未照射)のバンドの位置に戻ることが確認された。これは、自己の配列内で形成していた光連結が開裂し元の状態に戻ったものと考えられる。
この現象は、4種類すべてのPREPにおいて同様に確認されたことから、光連結部位であるCNVKの導入位置に関係なく起こると考えられた。
実施例2−1.光連結プローブの調製
評価対象の光連結プローブは、実施例1−2.で調製したPREPa.〜PREPd.を使用した。
0.2mLチューブに、標的部位として100pmol/Lの合成オリゴヌクレオチド2μLを分取し、10μmol/LのPREP(実施例1−2.記載の各条件で処理したもの)2μLを加え、1×PCRバッファー(10mmol/L Tris−HCl(pH8.3),50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,0.001%(W/V) gelatin)の終濃度で総量を20μLとした。
これを95℃にて5分間加熱処理し、50℃にて5秒間静置した後、50℃でUV−LEDにより365nmの光を30秒間照射した。なお、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。
実施例2−2.で調製したサンプル(対照サンプルを含む)の各調製液20μLに80μLの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、その内5μLずつを鋳型としてプライマーEGFR Ex.21FおよびEx.21Rによりライトサイクラー(Light Cycler:ロッシュ)を使用して定量PCR反応を実施した。
EGFR ex.21F:5’−GAACGTACTGGTGAAAACACC−3’(配列番号6)
EGFR ex.21R:5’−GCATGGTATTCTTTCTCTTCC−3’(配列番号7)
実施例2−2.で光連結処理を実施したサンプルと光連結処理を実施しなかった対照のサンプルを鋳型として、それぞれ実施例2−3.の条件にて定量PCR反応を実施した。PREPが光連結した標的部位は、共有結合により架橋された箇所でポリメラーゼの伸長反応が止まるため、増幅反応の鋳型として機能しなくなる。従って、定量PCR反応において、光連結処理を実施しなかった対照サンプルよりも通常遅いサイクルにて蛍光シグナルが立ち上がってくる。そのため、PREPにより光連結された標的部位の量を以下の式に従い算出し、光連結効率として表記することができる。
ΔCt=光連結処理後の標的部位のCt値−光連結未処理の標的部位のCt値
光連結効率(%)=(1−2ΔCt)×100
このようにして、各PREPの標的部位への光連結効率を評価した結果を表2に示す。
この結果から、PREPに対して光連結波長が照射されると、PREPの自己配列内で光連結され、その結果、PREPの光連結能が消失したことで、標的部位に対する光連結効率が大きく低下したと考えられる。
さらに、自己の配列内で光連結してしまったPREPに対して光連結開裂波長である312nmの光を照射することで、自己配列内で形成していた光連結が開裂し元の状態に戻ったために、低下していた光連結効率が回復したと考えられる。
また、いずれのPREPにおいても光連結能の消失および回復が認められることからPREPに対するCNVKの導入位置に関わらずPREPの自己内での光連結および開裂が起こることが示唆された。
これらの結果は、実施例1において光連結反応後の電気泳動バンドがシフトし、光連結開裂波長の光を照射した後には電気泳動バンドが元の位置に戻った事実とも一致するものである。
光応答性核酸類であるCNVKとは光連結しない、プリン塩基のみで構成されたPREPを合成し、合成した各PREPが光連結波長の光を照射しても自己配列内で光連結しないことを確認した。
光連結プローブとして、プリン塩基であるアデニン(A)もしくは、グアニン(G)のみで構成した以下の3種のPREPを調製した。合成したPREPの配列を表3に示す。その際、光応答性核酸類であるCNVKの導入位置(X)および鎖長(16mer)は統一とした。
実施例3−1.にて合成した各PREPをTEにて100μmol/Lに溶解し、各200pmolを別々の0.2mLチューブに分取した。それぞれのサンプルに対して以下の条件にて光照射を実施した。
なお、光連結波長である365nmの光照射はUV−LED照射器を使用した。
条件1:光未照射
各PREPに対して光照射を行わない。
条件2:光連結光照射
各PREPに365nmの光を4℃にて3分間照射する。
光照射処理の影響をみるために、実施例3−2.の条件で処理した各々のPREPを滅菌水で10μmol/Lに希釈後、MultiNAを用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを図6〜図8に示す。
実施例4−1.光連結プローブの調製
野生型配列であるEGFR遺伝子上の790番目のスレオニン(T790)、858番目のロイシン(L858)および861番目のロイシン(L861)に該当する核酸配列を標的部位として、EGFR遺伝子のコード鎖、すなわち、センス鎖にハイブリダイゼーションするアンチセンス鎖(AS鎖)の光連結プローブであるPREPを設計し、同時にEGFR遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするセンス鎖(S鎖)の光連結プローブであるPREPも設計した。その際に、センス鎖のPREPとアンチセンス鎖のPREPの相補性を以下の組み合わせのように変化させ、お互いの光連結プローブ同士が光連結しない位置に実施例1で記載したCNVKを配した。図9に光連結プローブとして実際に使用したPREPの配列とその相補性についての模式図を示す。図中のAS鎖は野生型EGFR遺伝子配列のセンス鎖と相補的であることを意味し、S鎖は野生型EGFR遺伝子配列のアンチセンス鎖と相補的であることを意味するものとする。
L861 AS鎖:5’−CTCTTCCGCACCCAnCAG−3’(配列番号11)
L861 S鎖 :5’−TTGGGCTGGCCAAnCTGC−3’(配列番号12)
(2)T790: 相補性が高い組み合わせの例
T790 AS鎖:5’−TGAnCTGCGTGATGAG−3’(配列番号13)
T790 S鎖 :5’−CAnCTCATCACGCAGC−3’(配列番号14)
(3)L858: 相補性が(1)及び(3)の中間的な組み合わせの例
L858 AS鎖:5’−CAnTTTGGCCAGCCC−3’(配列番号15)
L858 S鎖 :5’−CAnTTTGGGCTGGCCA−3’(配列番号16)
光連結プローブへの光照射処理は、以下の条件に従って実施した。
条件1:AS鎖、光未照射
実施例4−1.にて合成したEGFR遺伝子のセンス鎖にハイブリダイゼーションするAS鎖のPREPを各々、TEにより10μmol/Lに調製したものを条件1とした。
条件2:AS鎖、光照射
条件1と同様に調製した各々のAS鎖のPREPを、サーマルサイクラー(アプライド社製)にて4℃にした後、UV−LED照射器にて365nmの光を3分間照射したものを条件2とした。
条件3:S鎖、光未照射
実施例1−1.にて合成したEGFR遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするS鎖のPREPを各々、TEにより10μmol/Lに調製したものを条件3とした。
条件4:S鎖、光照射
条件3と同様に調製した各々のS鎖のPREPを、サーマルサイクラーにて4℃にした後、UV−LED照射器にて365nmの光を3分間照射したものを条件4とした。
条件5:S鎖+AS鎖光未照射
実施例4−1.にて合成したEGFR遺伝子のセンス鎖にハイブリダイゼーションするAS鎖のPREPと、EGFR遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするS鎖のPREPを、それぞれが終濃度で10μmol/Lになるように混合したものを条件5とした。
条件6:S鎖+AS鎖光照射
条件5と同様に混合した各PREP溶液を、サーマルサイクラーにて4℃にした後、UV−LED照射器にて光を3分間照射したものを条件6とした。
実施例4−2.の条件にて調製したPREP試料を、MultiNAを用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを、図10〜図12に示す。図10は(1)L861を標的部位としたPREPの組み合わせ、図11は(2)T790、図12は(3)L858の結果である。
電気泳動の結果より、相補性が低い組み合わせでは、センス鎖に対するPREP単独の場合、アンチセンス鎖に対するPREP単独の場合のいずれも光照射処理後にバンドシフトが認められ、自己の配列内で光連結されていることが示唆された(図10のレーン1〜4)。
また、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPを混合した条件5においては、条件1および条件3において見られた、センス鎖に対するPREP単独の場合及びアンチセンス鎖に対するPREP単独の場合と同じ位置にバンドが認められたことから、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPとはハイブリダイゼーションしていないと考えられた。
さらに、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPを混合し光照射した条件6においても、センス鎖に対するPREPに光照射処理した条件2とアンチセンス鎖に対するPREPに光照射処理した条件4のバンドと同じ位置にバンドが認められた。
電気泳動の結果より、相補性が高い組み合わせにおいても、センス鎖に対するPREP単独の場合、アンチセンス鎖に対するPREP単独の場合のいずれも光照射処理後にバンドシフトが認められ、自己の配列内で光連結していることが示唆された(図11のレーン1〜4)。
また、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPを混合した条件5においては、光照射を行っていない条件1のセンス鎖に対するPREP単独の場合と、光照射を行っていない条件3のアンチセンス鎖に対するPREP単独の場合とは、異なる位置に一本のバンドが認められたことから、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPがハイブリダイゼーションしていることが推察された。
さらに、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPを混合したものに光照射を行った条件6においては、光照射する前と同じ位置にバンドが認められ、センス鎖に対するPREP、アンチセンス鎖に対するPREPの光照射による自己の配列内で光連結した場合に検出される位置には、バンドが認められなかった。
このことから、光照射時にセンス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPがハイブリダイゼーションしていれば、自己の配列内で光連結は起こらないことが示唆された。
電気泳動の結果より、相補性が中間的な組み合わせにおいても、センス鎖に対するPREP単独の場合、アンチセンス鎖に対するPREP単独の場合のいずれも光照射後にバンドシフトが認められ自己の配列内で光連結していることが示唆された(図12のレーン1〜4)。
また、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPを混合した条件5においては、光照射を行っていない条件1のセンス鎖に対するPREP単独の場合と、光照射を行っていない条件3のアンチセンス鎖に対するPREPの単独の場合とは、異なる位置にバンドが認められたことから、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPがハイブリダイゼーションしていることが推察された。
低分子側のバンド(下のバンド)はセンス鎖に対するPREP単独の場合、又はアンチセンス鎖に対するPREP単独の場合に光照射し自己の配列内で光連結された場合のバンドの位置と同じであることから、センス鎖に対するPREP又はアンチセンス鎖に対するPREPの自己会合に由来するバンドと考えられた。
また、高分子側のバンド(上のバンド)は、センス鎖に対するPREP単独の場合、アンチセンス鎖に対するPREP単独の場合の、自己会合由来のバンドとも異なる位置に認められた。このことから、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPとのハイブリダイゼーションは維持されているが、ハイブリダイゼーション出来ない塩基の部分にて光連結が行われ、バンドがシフトしたものと考えられた。
また、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPとが中程度の相補性がある場合でも、ハイブリダイゼーションしていない塩基中にCNVKと光連結可能なシトシン又はチミンのようなピリミジン塩基が存在していると、自己の配列内において光連結してしまうことが示唆された。
このことから、光連結プローブが自己の配列内で光連結することを抑制するためには、光連結プローブ間の相補性を高くすることが効果的であると考えられた。また、CNVKと光連結可能なピリミジン塩基が相補鎖によって覆われ、CNVKと結合可能な状態で存在しないようにすることが効果的であると考えられた。
実施例5−1.光連結プローブの調製
T790を標的部位とした、実施例4−1.(2)で調製した相補性の高い組合せであるPREPを使用した。
健常者の末梢血から通常の方法によりヒトゲノムDNAを調製し、これを鋳型としてプライマーセットEGFR ex.20F及びEGFR ex.20Rを使用してT790に該当する核酸配列を包むEGFRエクソン20(ex.20)の領域を通常のPCR反応条件により増幅した。PCR反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
EGFR ex.20F:5’−CAGAAGCCTACGTGATGG−3’(配列番号17)
EGFR ex.20R:5’−ACCTTTGCGATCTGCACAC−3’(配列番号18)
このプラスミドを鋳型として、前記プライマーセットEGFR ex.20F及びEGFR ex.20Rを使用して通常のPCR反応条件によって増幅を行い、PCR Purification Kit(キアゲン)を用いて精製することで、直鎖状のEGFR ex.20の野生型遺伝子断片を得た(配列番号19)。
PCR Purification Kit(キアゲン社製)を用いて精製したEGFR ex.20の野生型遺伝子断片の重量濃度をNanoDrop spectrophtometer(Thermo Scientific)を用いて測定し、増幅断片長を考慮して各遺伝子断片のコピー数を算出したものを、野生型核酸として以下の反応の検討鋳型として用いた。
5’−CAGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGT−3’(配列番号:19)
0.2mLチューブに、実施例5−2.で調製した標的核酸(1×107コピー/μL)を2μLと、10μmol/Lに調製した、実施例4−1.(2)に示すT790に該当する核酸塩基を標的とした、T790 AS鎖(配列番号3)及びT790 S鎖(配列番号4)のPREPをそれぞれ2μLずつ加え、1×PCRバッファー(10mmol/L Tris−HCl(pH8.3),50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,0.001%(W/V) gelatin)の終濃度で総量を20μLとした。
実施例5−3.で調製した核酸サンプル溶液に対して、2つの温度条件にて光連結波長である365nmの光照射を実施した。なお、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。
条件1:50℃において光照射
95℃にて3分間加熱処理後、50℃にて30秒間静置した後、50℃で光を30秒間照射した。
条件2:4℃において光照射
95℃にて3分間加熱処理後、4℃にて1分間静置した後、4℃で30秒間光照射した。
実施例5−4.で光連結反応を実施した各反応液20μLに80μLの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、その内5μLずつを鋳型としてライトサイクラー(LC 480 Ver2:ロッシュ)を使用して定量PCR反応を実施した。
定量PCR用反応液としては、以下の試薬を混合して調製し、1サンプルあたりの最終液量が25μLになるように滅菌水を加えて調製した。12.5μLの2×Premix Ex Taq(登録商標)(タカラバイオ)に、増幅プライマーとしてEGFR ex.20F及びEGFR ex.20Rをそれぞれ5pmolずつ添加した。
さらに末端蛍光標識した検出プローブを2.5pmol添加した。この検出プローブの配列は以下の通りである。
Total LNAプローブ:5’−Cy5/CTT+CGGC+TGC+CTC/BHQ2−3’(配列番号20)
なお、配列中の+はそれに続く塩基がLNAであることを示し、Cy5はクエンチャーとなる蛍光色素を、BHQ2は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。当該検出プローブの合成はIDT社に委託した。
また、定量PCR反応は95℃,10秒+(95℃,3秒/58℃,30秒)×45サイクルの条件で実施した。
各々の試料について、光連結効率は実施例2と同様に定量PCRで算出したΔCt値から評価した。その結果を図13に示す。
従って、4℃においては、PREP相補鎖間のハイブリダイゼーション形成が維持され、PREPの自己配列内での光連結が抑制されたため、光を複数回照射するたびに光連結量が増加したのに対し、50℃においては、PREP相補鎖間のハイブリダイゼーションが十分に維持されず、PREPが自己の配列内で光連結したことにより、PREPが鋳型に対して光連結できなくなったために、光を複数回照射しても光連結量が増加しないものと考えられた。
つまり、光連結プローブの自己の配列内での光連結を抑制するためには、光連結プローブの相補鎖の相補性を高めることと、相補的な光連結プローブ同士(又は光連結プローブと相補的な第二のプローブと)が十分にハイブリダイゼーションを形成できる温度条件で光を照射する必要がある。
実施例5の結果から、50℃にて光を照射した際には相補的な光連結プローブ同士のハイブリダイゼーションが維持できていないことが示唆された。そこで、光連結プローブ間のハイブリダイゼーションを促進可能な添加剤に関して検討を実施した。種々検討を実施したが、その中でも効果が高かった陰性荷電を持つ高分子(ポリアクリル酸:pAAc)に関しての結果を示す。
T790に該当する核酸配列を標的とした、実施例4−1.(2)で調製した相補性の高い組合せであるPREPを使用した。
健常者の末梢血を材料として、実施例5−2.と同じ方法でEGFR ex.20領域における野生型遺伝子断片を調製した。
0.2mLチューブに、実施例6−2.で調製したex.20の野生型遺伝子断片(1×107コピー)を2μLと、10μmol/Lに調製した、実施例4−1.(2)に示すT790に該当する核酸配列を標的とした、T790 AS鎖(配列番号3)及びT790 S鎖(配列番号4)の光連結プローブであるPREPをそれぞれ2μLと、10%(w/w)ポリアクリル酸(pAAc)を2μL加え、1×PCRバッファー(10mmol/L Tris−HCl(pH8.3),50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,0.001%(W/V) gelatin)の終濃度で総量を20μLとした。
実施例5−3.で調製した核酸サンプル溶液に対して以下の条件で光照射を実施した。なお、対照として365nmの光を照射しないサンプルを同時に用意した。
条件1:ポリアクリル酸(pAAc)添加した核酸サンプル溶液について、4℃で光照射した。
条件2:ポリアクリル酸(pAAc)未添加の核酸サンプル溶液について、4℃で光照射した。
条件3:ポリアクリル酸(pAAc)添加の核酸サンプル溶液について、50℃で光照射した。
条件4:ポリアクリル酸(pAAc)未添加の核酸サンプル溶液について、50℃で光照射した。
実施例5−4.で光照射により光連結させた試料について、定量PCRを行った。定量PCRの条件は実施例5と同一の条件で実施した。
各々の試料について、光連結効率は実施例2と同様に定量PCRで算出したΔCt値から評価した。4℃で光照射した結果については図14に、50℃で光照射した結果については図15に示す。
これまでの実施例に示した通り、光連結プローブの自己配列内での光連結を抑制することで、標的部位との光連結効率を向上することが可能であることが分かった。この事を踏まえ、遺伝子変異検出感度への効果を検証するため、EGFR遺伝子のT790Mを標的として遺伝子変異検出を行った。
実施例5−2.で調製した野生型プラスミドに、公知の方法に従い、PrimeSTAR(登録商標)Mutagenesis Basal Kit(タカラバイオ)を用いてT790Mの変異を導入した。すなわち、当該方法により、EGFR遺伝子の2639番目の塩基をシトシン(C)からチミン(T)に変異させた。これを変異型プラスミドとした。
次に、このプラスミドを鋳型として、実施例4に記載のプライマーセットEGFR ex.20F及びEGFR ex.20Rを使用して通常のPCR反応条件によって増幅を行い、直鎖状のEGFR変異型遺伝子断片を得た。得られた変異型遺伝子断片をPCR Purification Kitを用いて精製した後、重量濃度をNanoDrop spectrophtometerを用いて測定し、増幅断片長を考慮して各遺伝子断片のコピー数を算出したものを変異型核酸とし、以下の検討の鋳型として用いた(配列番号21)。
5’−CAGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAACTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGT−3’(配列番号:21)
実施例5−2.で調整した野生型核酸と実施例7−1.で調製した変異型核酸の混合比率を変えて3種類(変異1%、変異0.1%、変異0.01%)調製し、変異型核酸検出用の試料として用いた。使用した野生型核酸と変異型核酸の混合比を表4に示す。また、変異型核酸を混合しない試料を変異0%の試料とした。また、混合型は1μLあたりのコピー数を示す。
T790に該当する核酸配列を標的とした、実施例1−1.(2)で調製した相補性の高い組合せである光連結プローブを使用した。
0.2mLチューブに、実施例7−2.で調製した実施例4−1.(2)に示すT790に該当する核酸配列を標的とした、T790 AS鎖(配列番号13)及びT790 S鎖(配列番号14)のPREPをそれぞれ2μLと、10%(w/w)ポリアクリル酸(pAAc)を2μL加え、1×PCRバッファー(10mmol/L Tris−HCl(pH8.3),50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,0.001% (W/V) gelatin)の終濃度で総量を20μLとした。
実施例7−4.で調製したサンプルに対して、UV−LEDにより光連結波長である365nmの光照射を実施した。95℃にて3分間加熱処理後、95℃にて30秒間維持し、50℃にて5秒間静置した後、50℃で光を30秒間照射する工程を1サイクルとし、合計10回繰り返した。
実施例7−5.の各調製液20μLに80μLの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、その内5μLを取り45μLの滅菌水を加えた。この内5μLずつを鋳型としてライトサイクラーを使用して定量PCR反応を実施した。なお、定量PCRは実施例5及び実施例6と同一の条件で実施した。
光連結プローブの自己配列内での光連結を抑制することで、これまで非常に難しかった変異0.01%の存在比においても変異型核酸を選択的かつ効果的に増幅することが可能となった。
以上より、本法は高感度かつ高精度に変異遺伝子を検出可能であることが示された。
実施例8−1.光連結プローブ(PREP)の調製
光連結対象の鋳型としては、実施例1−1.で調製した、EGFR遺伝子上のエクソン21(ex.21)領域の一部と同配列の100merからなるオリゴヌクレオチドを使用した。
この合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能な16merからなるPREPをイノシンの導入位置を変えて3種類設計した(配列番号23〜25)。1つは、イノシンを導入しないPREPを比較対象用のコントロールとして設計した(配列番号22)。これらPREPの配列を表5に示す。尚、光連結性核酸類であるCNVKのPREPへの導入位置をnとし、イノシンの導入位置をIとして示す。
実施例8−1.にて合成した各PREPをTEにて100μmol/Lに溶解し、各200pmolを別々の0.2mLチューブに分取した。それぞれのサンプルに対して以下の条件にて光照射を実施した。尚、クランプ形成波長である365nmの光照射はUV−LED照射器(ZUV-C30H:オムロン)を使用した。
条件1:光未照射
各PREPに対して光照射を行わない。
条件2:クランプ形成光照射
各PREPに365nmの光を4℃にて3分間照射する。
光照射処理の影響を見るため、実施例8−2.の条件で処理した各々のPREPを滅菌水で10μmol/Lに希釈後、MultiNA(島津製作所)を用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを図17に示す。
イノシンを導入していないPREP(PREP e.)、イノシンを1箇所導入したPREP(PREP f.)はUV照射後のバンドが低分子側にシフトしているのに対して、イノシンを2個、3個導入したPREP(PREP g.、PREP h.)はUV照射後のバンドシフトが見られなくなった。これは、イノシンを導入していないPREP、イノシンを1個しか導入していないPREPは、UV照射により明らかなPREPのコンフォメーション変化が生じているのに対して、イノシンを2個、3個導入することでPREPのコンフォメーション変化を抑制したことを示している。
このことから、PREP内のクロスリンクターゲットとなるピリミジン塩基をイノシンのようなクロスリンクターゲットとならない塩基に置き換えることで、PREPの自己配列内でのクランプ形成を抑制可能であることが示された。
実施例9−1.光連結プローブ(PREP)の調製
評価対象のPREPは、実施例8−1.で調製したPREP e.とPREP h.を使用した。
0.2mLチューブに、標的部位を有する核酸配列として100pmol/Lの合成オリゴヌクレオチド2μLを分取し、100μmol/LのPREP(実施例8−2.記載の各条件で処理したもの)2μLを加え、1×PCRバッファー(10mmol/L Tris−HCl(pH8.3),50mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,0.001%(W/V)gelatin)の終濃度で総量を20μLとした。
これを95℃にて5分間加熱処理し、45℃にて5秒間静置した後、45℃でUV−LEDにより365nmの光を30秒間照射した。尚、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。
実施例9−2.で調製したサンプル(対照サンプルを含む)の各調製液20μLに80μLの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、更にその内5μLずつを45μLの滅菌水に混合した。混合したサンプルの内5μLを鋳型としてライトサイクラー(LC 480Ver2:ロッシュ社製)を使用して定量PCR反応を実施した。
定量PCR用反応液としては、以下の試薬を混合して調製し、1サンプルあたりの最終液量が25μLになるように滅菌水を加えて調製した。12.5μLの2×Premix Ex Taq(登録商標)(タカラバイオ社製)に、増幅プライマーとしてEGFR ex.21F(配列番号:6)及びEGFR ex.21R(配列番号:7)をそれぞれ5pmolずつ添加した。
さらに末端蛍光標識した検出プローブを2.5pmol添加した。この検出プローブの配列は以下の通りである。
Total LNAプローブ:5’−Cy5/CAGCATGT+CAAGA+TCACAGA/BHQ_2−3’(配列番号26)
尚、配列中の+はそれに続く塩基がLNAであることを示し、Cy5は蛍光色素を、BHQ2は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。当該検出プローブの合成はIDT社に委託した。
また、定量PCR反応は95℃,10秒+(95℃,3秒/56℃,30秒)×45サイクルの条件で実施した。
尚、プライマーの配列は以下の通りである。
EGFR ex.21F:5’−GAACGTACTGGTGAAAACACC−3’(配列番号6)
EGFR ex.21R:5’−GCATGGTATTCTTTCTCTTCC−3’(配列番号7)
これは、イノシンを導入していないPREPは、PREPの自己配列内でのクランプ形成が起き、光を複数回照射してもPREPの鋳型に対するクランプ形成量が増加しなかったのに対し、イノシンを導入したPREPは、PREPの自己配列内でのクランプ形成が抑制されたため、PREPが鋳型に対して十分にクランプ形成可能となったためUV照射回数に応じてクランプ形成量が増加したものと考えられる。
つまり、PREPの自己の配列内でのクロスリンクターゲット塩基をイノシンのような光連結の標的核酸とならない塩基に置換することで、PREPの自己配列内での光連結を抑制でき、PREPのクランプ形成量を増加可能であることが示された。
実施例10−1.光連結プローブ(PREP)の調製
野生型配列であるEGFR遺伝子上の861番目のロイシン(L861)に該当する核酸配列を標的部位として、実施例8−1.で設計したPREP e.の配列をEGFR遺伝子のコード鎖、即ちセンス鎖にハイブリダイゼーションするアンチセンス鎖(AS鎖)のPREPとし(配列番号22)、同時にEGFR遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするセンス鎖(S鎖)のPREPも設計した(配列番号27)。CNVKの導入位置をnとして示す。
L861 AS鎖:5’−GCAnCCAGCAGTTTGG−3’(配列番号22)
L861 S鎖 :5’−CTGnCCAAACTGCTGG−3’(配列番号27)
L861 AS鎖:5’−GCAnCCAGCAGTITGG−3’(配列番号28)
L861 S鎖 :5’−CCAAnCTGCTGGGIGC−3’(配列番号29)
図19にクランププローブとして実際に使用したPREPの配列とその相補性についての模式図を示す。
健常者の末梢血から通常の方法によりヒトゲノムDNAを調製し、これを鋳型としてプライマーセットEGFR ex.21F及びEGFR ex.21Rを使用してL861に該当する核酸配列を包むEGFRエクソン21(ex.21)の領域を通常のPCR反応条件により増幅した。PCR反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
EGFR ex.21F(out):5’−GCATGAACTACTTGGAGGAC−3’(配列番号30)
EGFR ex.21R(out):5’−ACCTAAAGCCACCTCCTTAC−3’(配列番号31)
得られたPCR増幅産物をpGEMT easy Vector(プロメガ)内に、添付のプロトコルに従って挿入しクローニングした。
PCR Purification Kit(キアゲン社製)を用いて精製したEGFR ex.21の野生型遺伝子断片の重量濃度をNanoDrop spectrophtometer(Thermo Scientific)を用いて測定し、増幅断片長を考慮して各遺伝子断片のコピー数を算出したものを、野生型核酸として以下の反応の検討鋳型として用いた。
5’−GCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTGGT−3’(配列番号32)
0.2mLチューブに、実施例5−2.で調製した標的核酸(1×107コピー/μL)を2μLと、100μmol/Lに調製した、実施例10−1.に示すL861に該当する核酸塩基を標的とした、L861 AS鎖(配列番号28)及びL861 S鎖(配列番号29)のPREPをそれぞれ2μLずつ加え、1×PCRバッファー(10mmol/L Tris−HCl(pH8.3),50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,0.001%(W/V)gelatin)の終濃度で総量を20μLとした。
実施例10−3.で調製した核酸サンプル溶液に対して、95℃にて5分間加熱処理し、45℃にて5秒間静置した後、45℃でUV−LEDにより365nmの光を30秒間照射した。尚、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。
実施例10−4.で光連結反応を実施した各反応液20μLに80μLの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、更にその内5μLずつを45μLの滅菌水に混合した。混合したサンプルの内5μLを鋳型としてライトサイクラー(LC 480Ver2:ロッシュ社製)を使用して定量PCR反応を実施した。
定量PCR用反応液としては、以下の試薬を混合して調製し、1サンプルあたりの最終液量が25μLになるように滅菌水を加えて調製した。12.5μLの2×Premix Ex Taq(登録商標)(タカラバイオ社製)に、増幅プライマーとしてEGFR ex.21F及びEGFR ex.21Rをそれぞれ5pmolずつ添加した。さらに末端蛍光標識した検出プローブを2.5pmol添加した。検出プローブには、実施例9に記載のプローブ(配列番号26)と同じものを使用し、定量PCR反応は実施例9−2.と同じ条件で行った。
既存の設計手法により設計したPREP(三角印)は、UVを複数回照射してもΔCtがある一定のところで飽和してしまうが、イノシンを導入し完全相補で設計したPREPを用いることでUV複数回照射するごとにΔCtを増加させることができることが分かる。
これは、PREP内にイノシンを導入し、かつPREPの相補性を高めたことでPREPの自己配列内でのクランプ形成を抑制出来たためと考えられる。このことからもクランプ形成波長である365nmの光照射時にPREP相補鎖間のハイブリダイゼーションを維持し、PREPの自己配列内でのクランプ形成を抑制し、PREPをクランプ形成可能な状態に維持することがクランプ形成効率を向上させることに効果的であることが確認された。
また、以上のような解析が可能になることは、手術により摘出された組織や生検材料のような侵襲性の高い検査材料に限定されず、例えば血液試料のような標的とする核酸が微量にしか存在しない試料をも材料として扱えるため、困難であった治療効果の確認やモニタリング検査を可能にする。これらは、癌の早期発見や、個々の患者について薬剤感受性や薬剤応答性をはじめとした薬効評価等に適用することで、個別化医療の実現を可能とするものである。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (20)
- 核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブと、を反応溶液中でハイブリダイゼーションし、光照射することにより光連結させる方法であって、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする、光連結方法。
- 前記第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることにより、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする、請求項1に記載の光連結方法。
- 前記高い相補性とは、前記第一のプローブと前記第二のプローブとが互いに相補的な関係にあり、所定の光連結条件下で該第一のプローブ中の該光応答性核酸類の自己内で光連結する塩基が、第二のプローブとハイブリダイゼーションしている、請求項1又は2に記載の光連結方法。
- 前記光連結させる方法が、前記核酸サンプル中に存在する標的部位が有する標的核酸と、前記第一のプローブの光応答性核酸類との間で光連結させる、請求項1乃至3のいずれか一項に記載の光連結方法。
- 前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の光連結方法。
- 前記第一のプローブ及び前記第二のプローブが光応答性核酸類を含み、該第一のプローブと該第二のプローブの非相補性領域において、該第一のプローブ及び/又は該第二のプローブ内に存在する光応答性核酸類が自己内で光連結できないように、該第一のプローブ及び/又は該第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを使用する、請求項1乃至5のいずれか一項に記載の光連結方法。
- 核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し光応答性核酸類を含む第一のプローブと、該標的部位に対して相補的な配列を有し標的核酸を含む第四のプローブと、を反応溶液中で隣接して配置するようにハイブリダイゼーションさせ、光照射によって該第四のプローブに存在する標的核酸と該第一のプローブ中の該光応答性核酸類との間で光連結する方法において、
該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、請求項1に記載の光連結方法。 - 前記第一のプローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換した該第一のプローブを使用することを特徴とする、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、請求項1乃至7のいずれか一項に記載の光連結方法。
- 前記光応答性核酸類と光連結しない核酸がプリン塩基である、請求項8に記載の光連結方法。
- 前記光応答性核酸類と光連結しない核酸が、ピリミジン環を人工的に変換した合成塩基である、請求項8に記載の光連結方法。
- 反応溶液中にアニオン性物質が存在する、請求項1乃至10のいずれか一項に記載の光連結方法。
- 少なくとも一種類の光連結プローブが、反応溶液中に0.1μmol/L以上の濃度で存在することを特徴とする、請求項1乃至11のいずれか一項に記載の光連結方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の光連結方法を使用する遺伝子解析方法。
- 前記遺伝子解析方法が、遺伝子検出方法又は核酸増幅方法である、請求項13の遺伝子解析方法。
- 請求項14に記載の核酸増幅方法が、変異型核酸の標的部位を含む増幅用ヌクレオチド配列を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出することを特徴とする、変異型核酸検出方法。
- 核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含むことを特徴とする、光連結キット。
- 前記第一のプローブが、核酸サンプル中の標的部位の標的核酸と光連結するものである、請求項16に記載の光連結キット。
- 更に、該第一のプローブの該光応答性核酸類と光連結する標的核酸を含む第四のプローブを含む、請求項16に記載の光連結キット
- 前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、請求項16乃至18のいずれか一項に記載の光連結キット。
- 前記第一のプローブが、該プローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換したものである、請求項16乃至19のいずれか一項に記載の光連結キット。
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