JP2017112932A - 識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かを判定する方法、核酸誘導体及びキット - Google Patents

Abstract

【課題】識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）であるか否かを判定する方法において、副反応物の生成を抑制する技術を提供する。【解決手段】識別対象の塩基が５ｈｍＣであるか否かを判定する方法であって、核酸試料である第一核酸と、５ｈｍＣ特異的結合基を有する第二核酸と、第一核酸及び第二核酸と相補的な領域を有する第三核酸とをハイブリダイズさせ、前記塩基と前記５ｈｍＣ特異的結合基とを近接させる工程と、前記塩基と前記５ｈｍＣ特異的結合基との結合反応を行い、前記塩基が５ｈｍＣであった場合には、前記第一核酸と前記第二核酸とが結合した第四核酸が生成される工程と、第四核酸が生成された場合には前記塩基が５ｈｍＣであると判定する工程（ｃ）と、を備え、第二核酸の塩基配列のうち、５ｈｍＣ特異的結合基に隣接する少なくとも３塩基がグアニン又はシトシンである、方法。【選択図】図１

Description

本発明は、識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かを判定する方法、核酸誘導体及びキットに関する。

５−ヒドロキシメチルシトシンは修飾核酸の一種であり、シトシンの５位がヒドロキシメチル化されたものである。古くからバクテリオファージ等で存在することが知られてきたが、ヒトに関してもエピジェネティクスな遺伝子の発現抑制に関与する５−メチルシトシンが酵素ＴＥＴ１（Ｔｅｎ Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）により酸化されて生成されることが２００９年に報告された（非特許文献１、２）。

この５−ヒドロキシメチルシトシンは脱メチル化の過程で生じる中間体であると考えられるが、中枢神経系の細胞に多く集中していることから、それ自体がエピジェネティクスな調整に関与している可能性がある（非特許文献３、４）。

しかしながら、現段階において５−ヒドロキシメチルシトシンの役割には不明な点が多く、胚性幹細胞の自己複製能にも影響を与えること等が示されており、今後も研究が進展することにより明らかになっていくものと考えられる。

ヒトなどの哺乳類ゲノム中の５−ヒドロキシメチルシトシンの発見は、生命科学分野に新たな知見をもたらすものであるが、バイサルファイト処理を施して得られたＤＮＡ中の５−メチルシトシンの割合に関するデータに影響を与える可能性が高い。これは５−メチルシトシン検出ためのバイサルファイト処理による塩基変換が５−ヒドロキシメチルシトシンでも同様に起こることに起因し、これまでの研究で得られたデータにおいて５−メチルシトシンとして計上された値に５−ヒドロキシメチルシトシンを含むからである。

このような背景から５−メチルシトシンと５−ヒドロキシメチルシトシンを区別して検出する技術は今後のエピジェネティクス研究において非常に重要なものといえる。

現在開発されている、５−ヒドロキシメチルシトシンの検出方法としては、５−ヒドロキシメチルシトシンを含むＤＮＡに対して酸化還元剤を施した後に、改めてバイサルファイト処理を行うもの（特許文献１）、グリコシルトランスフェラーゼでヒドロキシル基を糖で修飾した後、酵素ＴＥＴ１にて５−メチルシトシンを脱メチル化処理、更にバイサルファイト処理を行うもの（特許文献２）、タングステン酸化剤による５−ヒドロキシメチルシトシン特異的なウラシル誘導体への塩基変換（特許文献３）等が挙げられる。

国際公開第２０１３／０１７８５３号 国際公開第２０１１／１２７１３６号 国際公開第２０１２／１４１３２４号

Kriaucionis S. and Heintz N., The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain., Science, 324, 929-930, 2009. Tahiliani M., et al., Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1., Science, 324, 930-935, 2009. Globisch D., et al., Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates., PLoS ONE, 5, e15367, 2010. Szwagierczak A., et al., Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA., Nucleic Acids Research, 38, e181, 2010.

特許文献１〜３に記載の方法は、ＤＮＡ中の５−ヒドロキシメチルシトシン全てを一括して処理できることから、塩基配列のシーケンシングと組み合わせることにより網羅的な解析が可能となるものである。しかしながら、ある特定の疾病に関連した１〜数箇所程度の局所的な検出を目的とする場合には、余分な情報が多く効率が悪い場合がある。

また、特許文献１及び２に記載の方法は、煩雑なバイサルファイト法に加え、その前段階で酸化還元反応や酵素反応を用いる複雑なものである。反応工程数が増加することにより、貴重なＤＮＡサンプルのロスや検出感度の低下が問題となる場合がある。

研究の進展に伴い５−ヒドロキシメチルシトシンの頻度や出現パターンと疾病やその他の生命現象との関連が明らかになり、ＤＮＡ中の局所的な５−ヒドロキシメチルシトシン検出及び定量が臨床研究の現場で必要になると予想される。

このような背景のもと、発明者らは、以前に、核酸試料中の識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かを判定する新たな方法を開発した。当該方法は、核酸試料である第一核酸と、５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基を有する第二核酸と、前記第一核酸と相補的な領域及び前記第二核酸と相補的な領域を有する第三核酸とをハイブリダイズさせ、前記塩基と前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基とを近接させる工程と、前記塩基と前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基との結合反応を行い、前記塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであった場合には、前記第一核酸と前記第二核酸とが結合した第四核酸が生成される工程と、前記第四核酸の存在を検出し、前記第四核酸が検出された場合には前記塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであると判定するものであった。

しかしながら、発明者らは更に、上記判定方法では、目的反応物である第四核酸以外にも、副反応物として核酸誘導体が生じ、検出感度と定量性への影響が懸念される場合があることを見出した。そこで、本発明は、上記副反応物の生成を抑制する技術を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］核酸試料中の識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かを判定する方法であって、前記核酸試料である第一核酸と、５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基を有する第二核酸と、前記第一核酸と相補的な領域及び前記第二核酸と相補的な領域を有する第三核酸とをハイブリダイズさせ、前記塩基と前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基とを近接させる工程（ａ）と、前記塩基と前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基との結合反応を行い、前記塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであった場合には、前記第一核酸と前記第二核酸とが結合した第四核酸が生成される工程（ｂ）と、前記第四核酸の存在を検出し、前記第四核酸が検出された場合には前記塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであると判定し、前記第四核酸が検出されなかった場合には前記塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンではないと判定する工程（ｃ）と、を備え、前記第二核酸の塩基配列のうち、前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基に隣接する少なくとも３塩基がグアニン又はシトシンである、方法。
［２］前記塩基と前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基との結合がエステル結合である、［１］に記載の方法。
［３］前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基が下記式（１）で表される基である、［１］又は［２］に記載の方法。
［式（１）中、ＡはＯ、Ｓ又はＮＨを表す。］
［４］前記第四核酸は、塩基性条件下で前記第一核酸及び前記第二核酸に開裂する、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記塩基と前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基との結合が配位結合である、［１］に記載の方法。
［６］前記第二核酸が固相上に固定化されている、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記第四核酸の存在が蛍光物質を用いて検出される、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記第四核酸の存在が電気泳動を用いて検出される、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［９］前記第四核酸の存在が電気化学的に検出される、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記第四核酸の存在が紫外線吸収量の測定により検出される、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［１１］下記式（２）で表される核酸誘導体。
［式（２）中、ＡはＯ、Ｓ又はＮＨを表し、Ｒ^１はリボース又はデオキシリボースを表し、Ｒ^４はデオキシリボースを表し、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^５はポリヌクレオチドを表し、Ｒ^２の塩基配列は、５’末端側から少なくとも３塩基がグアニン又はシトシンである。］
［１２］核酸試料中の識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かの判定用キットであって、５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基を有する第二核酸と、前記核酸試料である第一核酸と相補的な領域及び前記第二核酸と相補的な領域を有する第三核酸と、を備え、前記第二核酸の塩基配列のうち、前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基に隣接する少なくとも３塩基がグアニン又はシトシンである、キット。
［１３］前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基が下記式（１）で表される基である、［１２］に記載のキット。
［式（１）中、ＡはＯ、Ｓ又はＮＨを表す。］
［１４］縮合剤を更に備える、［１２］又は［１３］に記載のキット。

本発明によれば、核酸試料中の識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かを判定する方法において、副反応物の生成を抑制する技術を提供することができる。

識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かを判定する方法を説明する模式図である。 実験例１の電気泳動の結果を示す写真である。 実験例２の電気泳動の結果を示す写真である。

＜識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かを判定する方法＞
１実施形態において、本発明は、核酸試料中の識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かを判定する方法であって、前記核酸試料である第一核酸と、５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基を有する第二核酸と、前記第一核酸と相補的な領域及び前記第二核酸と相補的な領域を有する第三核酸とをハイブリダイズさせ、前記塩基と前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基とを近接させる工程（ａ）と、前記塩基と前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基との結合反応を行い、前記塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであった場合には、前記第一核酸と前記第二核酸とが結合した第四核酸が生成される工程（ｂ）と、前記第四核酸の存在を検出し、前記第四核酸が検出された場合には前記塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであると判定し、前記第四核酸が検出されなかった場合には前記塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンではないと判定する工程（ｃ）と、を備え、前記第二核酸の塩基配列のうち、前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基に隣接する少なくとも３塩基がグアニン又はシトシンである方法を提供する。

本実施形態の方法によれば、簡便な操作により、核酸試料中の識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かを正確に識別することができ、副反応物の生成が少ない。本実施形態の方法は、ＤＮＡ中の局所的な５−ヒドロキシメチルシトシンの検出に特化しており、検出効率がよい。また、従来法と比較して反応工程が少ないため、貴重なＤＮＡサンプルのロスも防ぐことができる。

図１は、本実施形態の方法を説明する図である。図中の第一核酸は核酸試料であり、５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かの識別対象の塩基Ｘを有する核酸である。また、第二核酸は５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙを有する核酸であり、前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙに隣接する少なくとも３塩基がグアニン又はシトシンである。ここで、５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙは、第二核酸の５’末端に位置していることが好ましい。また、第三核酸は、第一核酸と相補的な領域及び第二核酸と相補的な領域を有する核酸断片であり、第一核酸及び第二核酸とハイブリダイズすることにより、塩基Ｘと５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとを近接させることができる核酸である。

以下、本実施形態の方法の各工程を説明する。
［工程（ａ）］
図１に示すように、本工程では、第一核酸と第二核酸と第三核酸とをハイブリダイズさせ、塩基Ｘと５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとを近接させる。

核酸試料が２本鎖核酸である場合には、熱変性処理や化学変性処理等により１本鎖化した後に第一核酸として用いるとよい。

第一核酸、第二核酸及び第三核酸のハイブリダイズは、核酸のハイブリダイゼーションを行う一般的な温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の条件下で行うことができるが、後述する工程（ｂ）における第一核酸と第二核酸との結合反応を行う反応溶液と同一の反応溶液中で行うことが好ましい。

上記の反応溶液は、緩衝作用のある塩を含むことが好ましい。反応溶液のｐＨは、６．５〜８．５であることが好ましく、ｐＨ７．０〜８．０であることがより好ましい。また、緩衝作用のある塩の濃度は、５〜２５０ｍＭであることが好ましく、１０〜１００ｍＭであることがより好ましい。緩衝作用のある塩としては、カコジル酸塩、リン酸塩、トリス塩等が挙げられる。

緩衝作用のある塩は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩を含むことが好ましい。アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩としては、例えば塩化ナトリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。緩衝作用のある塩は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。

本明細書において、核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであれば特に限定されず、天然のものであってもよく、合成されたものであってもよい。天然の核酸としては、例えば、動物、植物、微生物、培養細胞等の生体試料から抽出された、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ等が挙げられる。生体試料からの核酸の抽出は、フェノール／クロロホルム法等の公知の方法により行うことができる。

合成された核酸としては、β−シアノエチルホスフォロアミダイト法、ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたＤＮＡ、ＰＣＲ等の公知の核酸増幅法により増幅された核酸、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等が挙げられる。核酸増幅法としては、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＭＡＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法等が挙げられる。

［工程（ｂ）］
本工程では、近接させた塩基Ｘと５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとの結合反応を行う。その結果、塩基Ｘが５−ヒドロキシメチルシトシンであった場合には、第一核酸と第二核酸とが結合した第四核酸が生成される。また、塩基Ｘが５−ヒドロキシメチルシトシン以外の塩基であった場合には、第四核酸は生成されない。図１においては、塩基Ｘが５−ヒドロキシメチルシトシンであるため、第四核酸が生成される。図１中、Ｚは第一核酸と第二核酸との結合部位を表す。

実施例において後述するように、発明者らは、５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基と塩基Ｘとの位置を正確に近接させることが、副反応物の生成の抑制に有効であることを見出した。

このためには、特に５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基の近傍で、第二核酸と第三核酸とのハイブリダイズにより形成される２本鎖核酸の熱的安定性を高めることが有効である。より具体的には、第二核酸の塩基配列のうち、前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基に隣接する少なくとも３塩基をグアニン又はシトシンにするとよい。これにより、副反応物の生成を抑制することができる。

グアニン又はシトシンは、２本鎖核酸の形成時に３つの水素結合を形成するため、２本鎖核酸の形成時に２つの水素結合しか形成しないアデニン、チミン等を用いた場合と比較して熱的安定性をより高めることができる。

第二核酸の塩基配列のうち、前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基に隣接するグアニン又はシトシンの数は、例えば４個であってもよく、例えば５個であってもよく、例えば６個であってもよく、例えば７個であってもよく、例えば８個であってもよく、例えば９個であってもよく、例えば１０個であってもよい。しかしながら、第二核酸は第三核酸と特異的にハイブリダイズする必要があるため、その塩基配列中にグアニン及びシトシン以外の塩基も含むことが好ましい。また、連続するグアニン又はシトシンの数が多くなると、第二核酸自身が二次構造を形成したり、第二核酸同士でハイブリダイズしたりする場合があるため、グアニン又はシトシンの数の上限は例えば２０個以下であってもよく、例えば１５個以下であってもよく、例えば１０個以下であってもよい。

第二核酸と第三核酸とのハイブリダイズにより形成される２本鎖核酸の熱的安定性を高める方法としては、上記の他にも、少なくとも５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基の近傍を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＢＮＡ（架橋化核酸）等の核酸誘導体で構成すること等が挙げられる。

本工程において、塩基Ｘと５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとの結合は、共有結合であってもよく、配位結合であってもよい。

塩基Ｘと５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとが共有結合により結合される場合、当該結合は、例えばエステル結合であってもよい。

塩基Ｘと５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとの共有結合は、上述した工程（ａ）で塩基Ｘと５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとを適切な位置に近接させた後、縮合剤を反応させることにより形成してもよい。

この場合、縮合剤としては、水中で作用することができる脱水縮合剤等が挙げられる。縮合剤は予め反応溶液中に添加していてもよく、工程（ａ）の後に反応溶液中に添加してもよい。

より具体的な縮合剤としては、例えば、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド；エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等のカルボジイミド化合物等が挙げられる。

５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙは、下記式（１）で表される基であってもよい。

式（１）中、ＡはＯ、Ｓ又はＮＨを表す。５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙが上記式（１）で表される基であることにより、上述した工程（ａ）で塩基Ｘと５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとを、両者の特異的な結合に適切な位置に近接させることができる。その結果、塩基Ｘが５−ヒドロキシメチルシトシンであった場合には、塩基Ｘと５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとが結合可能になる。

上記式（１）において、ＡがＯである場合、上記式（１）で表される基は、５−カルボキシビニルウラシルの一部である。

塩基Ｘと５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとの共有結合は、上述した工程（ａ）で塩基Ｘと５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとを適切な位置に近接させた後、５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙ自身の作用による化学結合で形成してもよい。

このような５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとしては、例えばカルボキシル基が挙げられる。

塩基Ｘと５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとが共有結合を形成するのに要する時間は、１秒以上、１０秒以上、３０秒以上、１分間以上、５分間以上、１０分間以上、又は１５分間以上の時間とすることができる。また、６０分間以下、４５分間以下、又は３０分間以下の時間とすることができる。

塩基Ｘと５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとが共有結合を形成するのに要する時間は、１分間〜６０分間であってもよく、１分間〜４５分間であってもよく、５分間〜４５分間であってもよく、５分間〜３０分間であってもよく、１０分間〜３０分間であってもよく、１５分間〜３０分間であってもよい。

［工程（ｃ）］
本工程において、上記の第四核酸の存在を検出し、第四核酸が検出された場合には塩基Ｘが５−ヒドロキシメチルシトシンであると判定し、第四核酸が検出されなかった場合には塩基Ｘが５−ヒドロキシメチルシトシンではないと判定する。

第四核酸の存在は、例えば電気泳動を用いて検出してもよい。より具体的には、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等が挙げられる。この場合、第四核酸に特異的なバンドが検出されるか否かにより、第四核酸の存在を検出することができる。

第四核酸の存在は、例えば蛍光物質を用いて検出してもよい。例えば、第一核酸を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす１組の蛍光色素の一方で標識しておき、第二核酸を、上記蛍光色素の他方で標識しておくことが挙げられる。ここで、ＦＲＥＴを起こす色素分子の組としては特に限定されず、例えばＦＡＭとＴＡＭＲＡ、ＶＩＣとＴＡＭＲＡ等が挙げられる。この場合、第一核酸と第二核酸とが近接すると、上記１組の色素分子が互いに近接し、ＦＲＥＴを起こす。

上記工程（ｂ）において第四核酸が形成されていた場合、例えば反応溶液の温度を上昇させて、ハイブリダイズした第一核酸、第二核酸及び第三核酸を解離させても、第一核酸と第二核酸が結合しているためＦＲＥＴが起こる。これに対し、第四核酸が形成されていなかった場合、第一核酸、第二核酸及び第三核酸を解離させると、第一核酸と第二核酸とが離れ、上記１組の色素分子が互いに離れるため、ＦＲＥＴを起こさなくなる。

したがって、ＦＲＥＴが起こるか否かを検出することにより、第四核酸の存在を検出することができる。

第四核酸の存在は、例えば電気化学的に検出してもよい。例えば、第二核酸を固相上に固定化しておき、本実施形態の方法を実施する。続いて、ハイブリダイズした第一核酸、第二核酸及び第三核酸を解離させ、固相から離れた核酸を洗浄除去する。

この結果、第四核酸が形成されていた場合には、固相表面に第四核酸が残り、第四核酸が形成されていなかった場合には、固相表面に第二核酸が残る。第二核酸と第四核酸とは、核酸の長さが異なるため、この差を電気化学的に検出することにより、第四核酸の存在を検出することができる。

電気化学的な検出としては、例えば、表面電位を測定する方法等が挙げられる。

第四核酸の存在は、例えば紫外線吸収量の測定により検出してもよい。塩基Ｘと５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙとの結合により、５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙの紫外線吸収量が変化する。この紫外線吸収量の変化を検出することにより、第四核酸の存在を検出することができる。

上述した工程（ｂ）における第一核酸と第二核酸との結合は可逆的であってもよい。例えば、図１に示すように、上記の第四核酸は、塩基性条件下で第一核酸及び第二核酸に開裂させることが可能であってもよい。

この場合、上記の第四核酸が塩基性条件下で第一核酸と第二核酸とに開裂するか否かを確認することにより、第一核酸と第二核酸との結合が目的の結合であったか否か、すなわち、対象塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであったか否かを確認することができる。第四核酸が塩基性条件下で第一核酸と第二核酸とに開裂するか否かは、例えば、電気泳動等で確認することができる。

本実施形態の方法において、上記の第二核酸は固相上に固定化されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ等の粒子、スライドガラス等の板状基板、膜等が挙げられる。

＜核酸誘導体＞
１実施形態において、本発明は、下記式（２）で表される核酸誘導体を提供する。式（２）中、ＡはＯ、Ｓ又はＮＨを表し、Ｒ^１はリボース又はデオキシリボースを表し、Ｒ^４はデオキシリボースを表し、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^５はポリヌクレオチドを表し、Ｒ^２の塩基配列は、５’末端側から少なくとも３塩基がグアニン又はシトシンである。

本実施形態の核酸誘導体は、上述した第四核酸に相当する。より具体的には、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５が第一核酸に由来するポリヌクレオチド鎖であり、Ｒ^１、Ｒ^２が第二核酸に由来するポリヌクレオチド鎖である。上述したように、本実施形態の核酸誘導体は、Ｒ^２の塩基配列の５’末端側から少なくとも３塩基がグアニン又はシトシンであるため、副反応物の生成を抑制しつつ生成することができる。

上述した、核酸試料中の識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かを判定する方法において、本実施形態の核酸誘導体が形成されることは、識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであることを示す。

＜キット＞
１実施形態において、本発明は、核酸試料中の識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かの判定用キットであって、５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基を有する第二核酸と、前記核酸試料である第一核酸と相補的な領域及び前記第二核酸と相補的な領域を有する第三核酸と、を備え、前記第二核酸の塩基配列のうち、前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基に隣接する少なくとも３塩基がグアニン又はシトシンである、キットを提供する。

本実施形態のキットは、前記第二核酸の塩基配列のうち、前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基に隣接する少なくとも３塩基がグアニン又はシトシンであるため、核酸試料中の識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かを判定する場合に副反応物の生成を抑制することができる。

本実施形態のキットにおいて、５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基は、下記式（１）で表される基であってもよい。式（１）中、ＡはＯ、Ｓ又はＮＨを表す。

本実施形態のキットは、縮合剤を更に備えていてもよい。縮合剤としては、上述したものと同様のものが挙げられる。

本実施形態のキットにおいて、上記の第二核酸は固相上に固定化されていてもよい。固相としては、上述したものと同様のものが挙げられる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実験例１］
４つの反応チューブに、表１に示す塩基配列を有する、第一核酸（１）、第一核酸（２）、第二核酸（１）、第三核酸（１）、３−モルフォリノプロパンスルフォン酸溶液、ＭｇＣｌ_２溶液及び蒸留水を、それぞれ表２に示す濃度となるように混合した。表１中、「^ｈｍＣ」は５−ヒドロキシメチルシトシンを表し、「^ＣＶＵ」は５−カルボキシビニルウラシルを表す。

第二核酸（１）において、５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基は５−カルボキシビニルウラシル基（より詳細には、５−カルボキシビニルウラシル基のカルボキシル基）である。また、第二核酸（１）の塩基配列のうち、前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基に隣接するグアニン又はシトシンの数は２個である。

続いて、反応チューブ２及び４に、縮合剤である４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（３４０ｍＭ）を２０μＬずつ添加して混合した。また、反応チューブ１及び３に、蒸留水を２０μＬずつ添加して混合した。

続いて、反応チューブ１〜４をサーマルサイクラーにセットし、３７℃で１２時間静置した。その後、反応チューブ１〜４内の試料を、１５％ポリアクリルアミドゲル（モノアクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１９：１）を用いた電気泳動に供し、反応の確認を行った。

図２は、電気泳動の結果を示す写真である。図２のレーン１〜４には、それぞれ上記の反応チューブ１〜４内の試料を電気泳動した。標的（核酸試料）として５−ヒドロキシメチルシトシンを含む第一核酸（１）を用いた反応系がレーン１及び２であり、５−ヒドロキシメチルシトシンを含まない第一核酸（２）を用いた反応系がレーン３及び４である。

図２中、「ａ」で示す位置のバンドは第三核酸に相当する。また、「ｂ」で示す位置のバンドは第一核酸（１）又は第一核酸（２）に相当する。また、「ｃ」で示す位置のバンドは第二核酸（１）に相当する。また、「ｄ」で示す位置のバンドは第四核酸に相当する。また、「ｅ」で示す位置のバンドは第一核酸（１）と第二核酸（１）とが連結した副反応物に相当する。また、「ｆ」で示す位置のバンドは第三核酸（１）と第四核酸とがハイブリダイズしたもの、又は第三核酸と上記の副反応物「ｅ」とがハイブリダイズしたものに相当する。

対照実験として、５−ヒドロキシメチルシトシンを含まない第一核酸（２）を用いた反応系がレーン３及び４である。図２中、「ｇ」で示す位置のバンドは第一核酸（２）と第二核酸（１）とが連結した副反応物に相当する。また、「ｈ」で示す位置のバンドは第三核酸（１）と上記の副反応物「ｇ」とがハイブリダイズしたものに相当する。

これらの結果をまとめると、識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであった第一核酸（１）を反応させた反応チューブ２の試料中のみにおいて、第四核酸の形成が観察された。識別対象の塩基がシトシンであった第一核酸（２）を反応させた反応チューブ４の試料中には、第四核酸の形成は認められなかった。この結果は、本実験例の反応により、識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かを判定することができることを示す。

しかしながら、本実験例においては、副反応物である「ｅ」、「ｆ」、「ｇ」、「ｈ」が生成されることが確認された。これは、第二核酸と第三核酸からなる二本鎖ＤＮＡの末端、特に５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基Ｙを有する修飾塩基^ＣＶＵ近傍の二本鎖構造の熱的安定性が低く、反応系中の温度において揺らぎが生じた結果、反応点がずれて５−ヒドロキシメチルシトシンもしくはシトシンに隣接するグアニンとの連結反応が起こったものと推測された。

［実験例２］
続いて、実験例１の第二核酸（１）の５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基に隣接する５塩基をグアニン又はシトシンに変更した、第二核酸（２）を用いて実験例１と同様の実験を行った。また、第二核酸の塩基配列の変更に対応して第三核酸の塩基配列も変更した。

より具体的には、４つの反応チューブに、表３に示す塩基配列を有する、第一核酸（１）、第一核酸（２）、第二核酸（２）、第三核酸（２）、３−モルフォリノプロパンスルフォン酸溶液、ＭｇＣｌ_２溶液及び蒸留水を、それぞれ表４に示す濃度となるように混合した。表１中、「^ｈｍＣ」は５−ヒドロキシメチルシトシンを表し、「^ＣＶＵ」は５−カルボキシビニルウラシルを表す。

第二核酸（２）において、５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基は５−カルボキシビニルウラシル基（より詳細には、５−カルボキシビニルウラシル基のカルボキシル基）である。また、第二核酸（２）の塩基配列のうち、前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基に隣接するグアニン又はシトシンの数は５個である。

続いて、反応チューブ６及び８に、縮合剤である４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（３４０ｍＭ）を２０μＬずつ添加して混合した。また、反応チューブ５及び７に、蒸留水を２０μＬずつ添加して混合した。

続いて、反応チューブ５〜８をサーマルサイクラーにセットし、３７℃で１２時間静置した。その後、反応チューブ５〜８内の試料を、１５％ポリアクリルアミドゲル（モノアクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１９：１）を用いた電気泳動に供し、反応の確認を行った。また、実験例１の反応チューブ１〜４と同様にして作製した試料も同時に電気泳動に供した。

図３は、電気泳動の結果を示す写真である。図３のレーン１〜４には、それぞれ実験例１の反応チューブ１〜４と同様にして作製した試料を電気泳動した。また、図３のレーン５〜８には、それぞれ上記の反応チューブ５〜８内の試料を電気泳動した。

図３中、「ａ」〜「ｈ」で示す位置のバンドは上述したものと同様である。また、「ｉ」で示す位置のバンドは第一核酸（１）と第二核酸（２）の連結により形成された第四核酸に相当する。また、「ｊ」で示す位置のバンドは第一核酸（１）と第二核酸（２）とが連結した副反応物に相当する。また、「ｋ」で示す位置のバンドは第一核酸（２）と第二核酸（２）とが連結した副反応物に相当する。

その結果、副反応物「ｊ」の生成は、これに対応する副反応物「ｅ」と比較して顕著に抑制されたことが明らかとなった。また、副反応物「ｋ」の生成についても、これに対応する副反応物「ｇ」と比較して抑制されたことが明らかとなった。

以上の結果は、第二核酸の塩基配列において、５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基に隣接するグアニン又はシトシンの数を３個以上にすることにより、第二核酸と第三核酸とのハイブリダイズにより形成される２本鎖核酸の熱的安定性を高め、副反応を抑制できることを示す。

本発明によれば、核酸試料中の識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かを判定する判定方法において、副反応物の生成を抑制する技術を提供することができる。

Ｘ…５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｙ…５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基、Ｚ…結合部位。

Claims (14)

1. 核酸試料中の識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かを判定する方法であって、
   前記核酸試料である第一核酸と、５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基を有する第二核酸と、前記第一核酸と相補的な領域及び前記第二核酸と相補的な領域を有する第三核酸とをハイブリダイズさせ、前記塩基と前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基とを近接させる工程（ａ）と、
   前記塩基と前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基との結合反応を行い、前記塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであった場合には、前記第一核酸と前記第二核酸とが結合した第四核酸が生成される工程（ｂ）と、
   前記第四核酸の存在を検出し、前記第四核酸が検出された場合には前記塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであると判定し、前記第四核酸が検出されなかった場合には前記塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンではないと判定する工程（ｃ）と、を備え、
   前記第二核酸の塩基配列のうち、前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基に隣接する少なくとも３塩基がグアニン又はシトシンである、方法。
2. 前記塩基と前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基との結合がエステル結合である、請求項１に記載の方法。
3. 前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基が下記式（１）で表される基である、請求項１又は２に記載の方法。
   ［式（１）中、ＡはＯ、Ｓ又はＮＨを表す。］
4. 前記第四核酸は、塩基性条件下で前記第一核酸及び前記第二核酸に開裂する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記塩基と前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基との結合が配位結合である、請求項１に記載の方法。
6. 前記第二核酸が固相上に固定化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記第四核酸の存在が蛍光物質を用いて検出される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第四核酸の存在が電気泳動を用いて検出される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記第四核酸の存在が電気化学的に検出される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記第四核酸の存在が紫外線吸収量の測定により検出される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
11. 下記式（２）で表される核酸誘導体。
    ［式（２）中、ＡはＯ、Ｓ又はＮＨを表し、Ｒ^１はリボース又はデオキシリボースを表し、Ｒ^４はデオキシリボースを表し、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^５はポリヌクレオチドを表し、Ｒ^２の塩基配列は、５’末端側から少なくとも３塩基がグアニン又はシトシンである。］
12. 核酸試料中の識別対象の塩基が５−ヒドロキシメチルシトシンであるか否かの判定用キットであって、
    ５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基を有する第二核酸と、
    前記核酸試料である第一核酸と相補的な領域及び前記第二核酸と相補的な領域を有する第三核酸と、を備え、
    前記第二核酸の塩基配列のうち、前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基に隣接する少なくとも３塩基がグアニン又はシトシンである、キット。
13. 前記５−ヒドロキシメチルシトシン特異的結合基が下記式（１）で表される基である、請求項１２に記載のキット。
    ［式（１）中、ＡはＯ、Ｓ又はＮＨを表す。］
14. 縮合剤を更に備える、請求項１２又は１３に記載のキット。