EA027074B1 - СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА Chlamydia trachomatis, ЗОНД НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ), ПРЯМОЙ (ВАРИАНТЫ) И ОБРАТНЫЙ (ВАРИАНТЫ) ПРАЙМЕРЫ ПЦР, ИХ СОДЕРЖАЩИЙ КОМПОНЕНТ ПЦР, СОДЕРЖАЩИЙ ВЫШЕУКАЗАННЫЙ КОМПОНЕНТ НАБОР И СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА Pectobacterium atrosepticum - Google Patents

Abstract

Метод определения генетического материала, происходящего из Chlamydia trachomatis, включающий определение специфичных последовательностей нуклеиновых кислот, с использованием в некоторых случаях специфичных праймеров и зондов (проб) и с определением в некоторых случаях в сочетании генетического материала, происходящего из Pectobacterium atrosepticum, как внутренного контроля; а также связанных продуктов и наборов.

Description

Настоящее изобретение относится к исследованию продуктов, применений и методов, особенно тех, которые включают проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР). Оно более специфично связано с исследованиями СЫатуЛа 1гасЬотаЙ8 и с улучшением контроля ПЦР.

Сведения о предшествующем уровне техники

СЫатуФа (гасНотай8 является для человека облигатным внутриклеточным патогенным организмом. Хламидиозные инфекции - это, как правило, болезни, передающиеся половым путем, и бактерии могут вызывать многочисленные болезненные состояния как у мужчин, так и у женщин. Клинические симптомы включают в себя уретриты, проктиты, трахому, бесплодие, простатиты, воспаление придатка яичка, воспаление шейки матки, воспалительные заболевания тазовых органов и внематочную беременность. Они также патогенны для новорожденных и могут быть причиной глазных и легочных инфекций.

Инфицирование СЫатуФа 1гасЬотаЙ8 - одно из наиболее распространенных по миру заболеваний, передающихся половым путем. По приблизительной оценке, около 2-3 млн человек в Соединенных Штатах инфицировано СЫатуФа. В Соединенном Королевстве, по приблизительным оценкам, каждый десятый из сексуально активных молодых людей в возрасте до 25 лет инфицирован СЫатуФа.

Заболевания, вызванные СЫатуФа 1гасЬотаЙ8, могут быть успешно вылечены с применением антибиотиков, например тетрациклинами, такими как доксициклин или акролидами, такими как азитромицин. Для того чтобы быть уверенным, что назначенное лечение подходит на стадии заболевания, необходимо точно диагностировать инфицирование СЫатуФа 1гасЬотаЙ8. В некоторых странах, например Соединенном Королевстве, запущена национальная программа скрининга на хламидии.

Инфицирующая единица СЫатуЛа (гасНотаО8 называется элементарным телом. Спороподная функция элементарного тела позволяет хламидии выживать в неподходящих условиях окружающей среды в отсутствие клетки-хозяина. Полагают, что элементарное тело является метаболически инертным до тех пор, пока не прикрепляется к клетке-хозяину и не проникает в нее путем эндоцитоза. Определение СЫатуФа (гасНотаО8 возможно методами амплификации нуклеиновых кислот, такими как, например, основанными на полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР может потенциально амплифицировать нуклеиновую кислоту как из инифицированных клеток, так и из элементарных тел.

СЫатуФа (гасНотаО8 содержит генетический материал как в обоих типах хромосом, которые присутствуют в единственных копиях, так и в плазмидах, содержащихся в количестве от 6 до 10 копий на одно элементарное тело. Исторически, предпочитали использовать плазмиды как мишень для амплификации нуклеиновых кислот из-за их многокопийности в элементарных телах и, как допускалось, большей чувствительности тестов, наблюдаемой при амплификации мишеней. Однако пригодность тест-систем, основанных на амплификации нуклеиновых кислот плазмид, вызвала ряд вопросов при открытии шведского варианта СЫатуЛа (гасНотай8. Шведский вариант содержит в плазмиде делецию в 377 пар оснований, и поэтому тест-системы, обычно амплифицирующие в качестве мишени делеционную область, будут давать фальшивый отрицательный результат в случае встречи со шведским вариантом СЫатуЛа (гасНота(18.

Настоящее изобретение основывается на понимании того, что исследование, определяющее последовательности, присутствующие в хромосомах СЫатуЛа 1гасЬота118, является более стабильным, потому что хромосомные гены, как правило, менее подвержены мутациям и, при определенных обстоятельствах, может совсем не работать с плазмидами. Использование в качестве мишени хромосомного гена может быть ожидаемым недостатком, поскольку хромосомные мишени присутствуют в клетке только в единственном числе. Однако авторы настоящего изобретения были удивлены тем, что хромосомные мишени давали предел обнаружения (ЬОП), сравнимый с мишенями-плазмидами.

Тесты амплификации нуклеиновых кислот (ΝΑΑΤ).

Для использования с настоящим изобретением доступен ряд методов для проверки амплификации нуклеиновых кислот (ΝΑΑΤ). Он включает в себя хорошо известную ПЦР, лигазную цепную реакцию (ЛЦР), рекомбиназно-полимеразную амплификацию (ΡΡΑ), амплификацию перестроенных цепей, амплификацию определенных последовательностей нуклеиновых кислот при транскрипции (ΝΑδΒΑ), амплификацию, зависимую от хеликазы и изотермическую амплификацию петлевых участков. Методы ΝΑΑΤ уже широко распространены для определения культур СЫатуЛа (гасНотай^ но эти методы сложны, как минимум, потому, что требуют использования клеток млекопитающих или клеточных культур. Они включают определение нуклеиновых кислот при амплификации ферментами одной или нескольких последовательностей-мишеней в высокоточной и специфичной реакции.

Для подробного изучения ΝΑΑΤ, читатель отсылается по следующим ссылкам, которые включают амплификацию определенных последовательностей нуклеиновых кислот при транскрипции (ΝΑδΒΑ) - Сотр1ои 1. ШсЮс асМ 8сциспсс-Ьа8сб атрййсайоп Nа(и^с. 1991, 350(6313):91-2;

амплификацию, опосредованную транскрипцией, - \УгоЫс\У8к1 1. с! а1. СотраШоп оГ Тгап8сйрйоп

МсШаЮб ЛтрППсайоп апб РСК Α88ау Кс8и118 Ггот Уапоиз ОсиИа1 δрсс^тсη Турс8 Гог Ийссйоп оГ Мусор1азта дсиНайит. 1. СНп. МюгоЫок 2006, 44(9):3306-3312 лигазную цепную реакцию (ЛЦР) ХУюбтапп М. с! а1. Пда8с сНаш гсасйоп (ЬСК) оусгую\у апб Λрр1^са(^оη8. РСК Мс(Ноб8 апб Лрр1^са(^оп8 1994, 3:(4), δ51-64;

- 1 027074 изотермическую амплификацию петлевых участков ДНК - ΝοΙοιηί с1 а1. Ьоор-Мей1а1ей 1ко1кегта1 атрййсайоп оГ ΌΝΆ. ΝιιοΚία Ас1йк. Кек. 2000, 23(12):Е63;

амплификацию, зависимую от хеликазы - УтсеШ М. е1 а1. Нейсаке-йерепйей 1ко1йегта1 ^NΑΑтр1^йсаί^оη ЕМВО Кер. 2004, 5(8) 795-800;

амплификацию перестроенных цепей - §1гапй Й1кр1асетей атрййсайои - ап 1ко1йегта1 ίη \йго Атрййсайои (есййще. \Уа1кег е1 а1. №с1ею Аайк Кек. 1992. 20(7), 1691-1696);

рекомбиназно-полимеразную амплификацию (КРА) - ΌΝΑ АтрППсаОоп апй Ое1есПоп Майе §1тр1е(Ке1аЙуе1у). НоГЕ М. РиЬйс ЫЬг. §ю. 2006, 4(7):е222; апй а1ко и§ Ра1ей 7270981.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

ПЦР - это высокочувствительный метод определения специфичных последовательностей нуклеиновых кислот, включающий амплификацию одного или нескольких участков ДНК - мишеней с применением термостабильного фермента-полимеразы и циклизации температурных условий реакции. В своей простейшей форме цикл ПЦР реакции имеет три стадии:

1) стадия денатурации при температуре около 90-100°С. При росте температуры до этих цифр двухцепочечная ДНК денатурирует или плавится, образуя одноцепочечную форму;

2) стадия отжига праймера обычно при температуре 50-65°С. На этой ступени прямой и обратный праймеры гибридизуются с комплементарными областями любой мишени, присутствующей в растворе;

3) достройка, обычно происходящая при 50-80°С, во время которой в полимеразной цепной реакции используются находящиеся в растворе дезоксинуклеотидтрифосфаты для элонгации З'-концов прикрепившихся праймеров. Как правило, цикл повторяется 25-45 раз.

В соответствии с определенными ПЦР протоколами стадии отжига и достройки могут объединяться, приводя к двуступенчатой структуре цикла: 90-100°С, а затем 50-80°С. Теоретические подсчеты показывают, что единичная молекула-мишень дает за 30 циклов ПЦР 268, 435, 456 копий. Из-за неэффективности амплификации реальное число может быть меньше, тем не менее, ПЦР способна амплифицировать единичную или минорные копии в миллионы раз до количеств, которые могут легко быть обнаружены. В основе ПЦР лежит термостабильная ДНК полимераза, например такая как Тай полимераза, выделенная из термофильной бактерии Тйегтик ас|иаПсик. Вместо Тай ДНК полимеразы могут быть использованы другие термостабильные ДНК полимеразы, например РГп полимераза, выделенная из Ругососсик £шюкик, которая обладает высокоточным копированием, в отличие от Тай полимеразы и потому является более аккуратным ферментом. Обзоры полимеразных цепных реакций встречаются в большинстве популярных молекулярно-биологических учебников, см., например, Рйпщр1ек оГ Оепе Матрйайоп - Ап Шгойисйоп 1о Сепейс Епдшееппд, написанный О1й и Рйтгоке, изданный В1аск\уе11 §аепсе Ый, который упомянут в ссылках. В качестве одного из основных требований для ПЦР рассматривается наличие прямого и обратного праймеров, комплементарных обоим концам целевой последовательности. Реакция амплификации проводится для умножения последовательности между двумя праймерами. Определение амплифицированных ПЦР продуктов проводится любыми неспецифичными методами, задача которых - попросту обнаруживать обычную двухцепочечную нуклеиновую кислоту (например, с использованием краски, включающейся в двухцепочечную ДНК, такой как этидий-бромид или §УВК-зеленый). В противоположность этому, полуспецифическое определение продуктов может быть проведено путем приблизительного определения молекулярного веса продукта, например путем электрофоретического разделения реакционной смеси перед детектированием. Имеется ряд методов определения ДНК специфичных последовательностей, которые обычно включают гибридизацию зонда (пробы) со специфичной последовательностью с регионом амплификации или которые измеряют деградацию зонда конкомитанта с течением амплификации последовательности-мишени, происходящей из-за экзонуклеазной активности, присущей соответствующей полимеразе. Методы определения патогенных организмов, основанные на ПЦР, обычно, обладают преимуществом в виде более быстрого получения результата, нежели более традиционные методы, которые включают манипуляции с культурами и инкубированием на несколько дней. Результаты ПЦР могут быть доступны в течение нескольких часов или даже ранее.

Сущность изобретения

В соответствии с первым аспектом изобретения предоставляется метод определения СЫатуФа 1гасйотайк в приведенных образцах генетического материала, выполненных в виде определения специфичных последовательностей нуклеиновых кислот, представленных в виде, по крайней мере, 10 соседствующих нуклеотидных остатков, показанных в §ЕЦ ГО ΝΟ: 1.

§ЕО ГО ΝΟ: 1: а1даайсаа аЕйадаай ЮддсааПй сд!а!ада1а 1ас1дадс1д ййа1йдс йдйаа!да ЦдШддас асйдйадс айаадсйд дадаййй аддаддсай айсйдда! дсйадда1а сйайддй ааааддаадс айдссдйс 1д1ссдс1дд йсйссйа сйййсй 1ддсайдсс 1с1ддаа1с1 1сс11д1сд1 1с11са1сс1 аадсаааад! аа или комплементарных им, причем последовательность может далее мутировать путем добавления, делеции или замещения до 5 остатков.

В соответствии со вторым аспектом изобретения предоставляется прямой праймер для ПЦР, выполненный в виде последовательности, включающей в себя от 17 до 34 соседних нуклеотидов, отобранных из §ЕО ГО ΝΟ: 15.

§ЕО ГО ΝΟ: 15: 1да1д-д/с-1/а-1/а-1/а-д/с д/с-а/1-сас1ад1с адсайаадс 1аддадай, в котором последовательность может быть в дальнейшем изменена вплоть до 5 добавлений остатков, делеций или замещений ос- 2 027074 татков. Альтернативно, последовательность праймера, производного из 5>ЕЦ ГО N0: 15 может быть короче (предпочтительно между 12 и 22 или 19 и 29 остатков длиной), если предпринимаются шаги по увеличению температуры плавления праймера.

В соответствии с третьим аспектом изобретения предоставляется обратный праймер для ПЦР выполненный в виде последовательности, включающей в себя от 15 до 31 соседних нуклеотидов, отобранных из 8ЕЦ ГО N0: 16.

8ЕЦ ГО N0: 16: ааддаадай ссададдсаа 1дссааадаа аааад!, в котором последовательность может быть в дальнейшем изменена вплоть до 5 добавлений остатков, делеций или замещений остатков. Альтернативно, последовательность праймера, производного из 8ЕЦ ГО N0: 16, может быть короче (предпочтительно между 10 и 20 или 16 и 26 остатков длиной), если предпринимаются шаги по увеличению температуры плавления праймера.

В соответствии с четвертым аспектом изобретения предоставляется зонд нуклеиновой кислоты, выполненный в виде последовательности нуклеиновой кислоты, включающей в себя от 18 до 28 соседних нуклеотидов, отобранных из 8ЕЦ ГО N0: 4.

8ЕЦ ГО N0: 4 ссд!сс1д!с сдс!ддйс1 1ссйасй1 1И или комплементарных им, причем последовательность может в дальнейшем быть мутирована путем добавления, делеции или замещения до 5 остатков.

Альтернативно, последовательность праймера, производного из 8ЕЦ ГО N0: 4, может быть короче (предпочтительно между 13 и 23 остатков длиной), если предпринимаются шаги по увеличению температуры плавления зонда.

В соответствии с пятым аспектом изобретения предоставляется компонент ПЦР, выполненный в виде прямого праймера в соответствии с изобретением и обратного праймера для ПЦР, выполненного в соответствии с изобретением.

В соответствии с шестым аспектом изобретения предоставляется набор, выполненный в виде компонентов ПЦР в соответствии с изобретением и инструкции для выполнения методики в соответствии с изобретением.

В соответствии с седьмым аспектом изобретения предоставляется метод определения Рес1оЬас1епит айокерйсит в приведенных образцах генетического материала, выполненных в виде определения специфичных последовательностей нуклеиновых кислот, содержащихся в хромосомах РссЮЬасЮгинп айокерйсит.

Согласно соответственно восьмому, девятому и десятому аспекту изобретения раздельно предоставляются прямой праймер для ПЦР, который определяется пятым аспектом изобретения как второй прямой праймер для ПЦР, обратный праймер для ПЦР, который определяется пятым аспектом изобретения как второй обратный праймер для ПЦР; и зонд для ПЦР, который определяется пятым аспектом изобретения как второй зонд для ПЦР.

Изобретение также предоставляет компоненты для ПЦР, выполненные в виде одного или более прямых праймеров для ПЦР, обратных праймеров и/или зонда для ПЦР в соответствии с восьмым, девятым и десятым аспектами изобретения в комбинации с одним или более последующими компонентами ПЦР.

Перечень фигур, чертежей и иных материалов

Фиг. 1-3 показывают результаты экспериментов по установлению пределов обнаружения (Ь0И) метода, выполненных на ампликонах 3, 5 и 7 плазмид-мишеней, как описано в примерах.

Фиг. 4-6 показывают результаты экспериментов по установлению пределов обнаружения (Ь0И) метода, выполненных на ампликонах 9, 17 и 18 хромосом-мишеней, как описано в примерах.

Фиг. 7 показывает результаты экспериментов по установлению оптимизации [Мд²+], выполненных на ампликоне 17 хромосом-мишеней, как описано в примерах.

Фиг. 8 показывает результаты экспериментов выполненных на ампликоне 17 хромосом-мишеней, как описано в примере 8.

Фиг. 9 показывает эффект внутренних контрольных праймеров и ДНК на электрохимическую детекцию ампликона СЫатуФа йасйотайк, генерированного с помощью дуплексной ПЦР (пример 9). Полосы ошибок показывают стандартное отклонение (§И) (п=3).

Легенда для каждой полосы внутри каждой группы из 4 дана на фиг. 10. Легенда МЕ 17 праймеры + 200 пг ДНК внутреннего контроля соответствует первой полосе в каждой группе из четырех. Легенда МЕ 17 праймеры без ДНК внутреннего контроля соответствует второй полосе в каждой группе из четырех. Легенда МЕ 17 праймеры и праймеры внутреннего контроля + 200 пг ДНК внутреннего контроля соответствует третьей полосе в каждой группе из четырех. Легенда МЕ17 праймеры и праймеры внутреннего контроля без ДНК внутреннего контроля соответствует четвертой полосе в каждой группе из четырех.

Фиг. 11 показывает электрофоретический гель продуктов амплификации СЫатуФа йасйотайк без набора внутренних контрольных праймеров. Линия 1 = цепь 100 п.о. (пептидных оснований), линия 2-4 = 10000 1РИ реакций, линия 5-7 = 1000 1РИ реакций, линия 8-10 = 100 1РИ реакций, линия 11-13 = 10 1РИ реакций, линия 14-16 = 1 1РИ реакция.

Фиг. 12 так же, как фиг. 11, но линия 1 = цепь 100 п.о., линия 2-4 = нет 1РИ реакций.

- 3 027074

Фиг. 13 и 14 аналогичны фиг. 11 и 12, но для реакций с набором внутренних контрольных праймеров.

Фиг. 15 показывает результаты электрохимической детекции образцов, амплифицированных в дуплексе с использованием наборов праймеров для СЫатуФа 1гаеЬотаЙ8 (СТ, первая полоса каждой пары) 5ЕО ГО N05: 17 и 19 и внутренний контроль (1С, вторая полоса каждой пары). 200 пг внутренней контрольной ДНК добавлено во все образцы. Полоса ошибок показывает стандартное отклонение 8Ό (п=3).

Фиг. 16 показывает результаты сравнительных дуплексных экспериментов, описанных в примере

10.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Определения

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Как указывалось в разделе Уровень техники, ПЦР представляет собой технологию, широко применяемую в молекулярной биологии для амплификации сегмента ДНК путем ίη νίίτο ферментативной репликации. В ходе реакции ДНК, полученная путем более ранней репликации, используется как образец для последующих репликаций. Это приводит к цепной реакции, при которой образец ДНК экспоненциально или почти экспоненциально амплифицируется. ПЦР дает возможность амплифицировать единичную или очень небольшое число копий нуклеиновой кислоты на несколько порядков, получая миллионы или даже более копий, которые становятся легко обнаружимыми. Для проведения основной ПЦР требуются следующие компоненты: а) образец ДНК или целевая последовательность для амплификации; б) пара праймеров; прямой праймер (смысловой праймер), комплементарный области ДНК по 5'-концу последовательности, и обратный праймер (антисмысловой праймер), комплементарный области ДНК по З'-концу целевого участка; в) термостабильная ДНК полимераза, например Тад полимераза; г) деоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ), которые используются как билдинг-блоки, из которых ДНК полимераза синтезирует новую цепочку ДНК; д) подходящий буферный раствор; е) ионы магния или другие подходящие катионы; ж) одновалентные ионы калия или другие подходящие катионы.

Существует множество вариантов ПЦР, например многолокусная ПЦР (мультиплексная ПЦР), которая подразумевает одновременную амплификацию более одной мишени в едином сосуде. Многолокусная ПЦР включает дуплексную и триплексную реакции ПЦР, в которых участвуют десятки наборов праймеров, действующих независимо.

Гнездовая ПЦР представляет собой метод, который может применяться для увеличения специфичности ПЦР амплифицирующей реакции. Два набора праймеров используют в двух последовательных реакциях. Первая пара праймеров используется для получения не полностью специфичных ДНК продуктов. Вместе с этим, первая реакция увеличивает частоту встречаемости целевой последовательности. Вторая реакция является более специфичной и амплифицирует последовательность, заключенную внутри участка, полученного с помощью первого набора праймеров.

Количественная ПЦР (КПЦР) применяется для определения или оценки количества определенной ДНК в пробе. Нормальный процесс ПЦР может быть при некоторых обстоятельствах практически количественным, однако для действительно количественной ПЦР реакция амплификации проводится или рассматриваются результаты реакции амплификации только на стадии экспоненциального увеличения количества продукта, отсекая, таким образом, более позднюю плато стадию амплификации. Количество продукта на экспоненциальной стадии амплификации в значительной степени пропорционально исходному количеству участка. Были разработаны термоциклеры, позволяющие наблюдать за количеством продукта на протяжении амплификации. Один из методов, применяемых в настоящее время, представляет собой количественную ПЦР в реальном времени, который использует флуоресцентно меченые реагенты, такие как δΥΒΚ-зеленый, или флуорофор-меченые зонды ДНК, такие как собственная ТадМап™ система, для определения количества амплифицированного продукта по мере его накопления.

ПЦР с горячим стартом исключает возможные проблемы, когда праймеры при низких температурах могут связываться с неспецифическими участками или даже друг с другом. ПЦР с горячим стартом основана на принципе высвобождения праймеров для гибридизации только тогда, когда температура реакции достаточно высока для того, чтобы исключить или уменьшить неспецифическое связывание праймера. Методика может осуществляться вручную путем нагревания компонентов реакции до температуры денатурации, например до 94°С, перед тем как добавляется полимераза или перед добавлением праймеров. Альтернативно, были разработаны специализированные системы, ингибирующие реакцию до тех пор, пока не поднимется температура, например, путем связывания одного или более компонентов в неактивную форму, а затем высвобождая их после повышения температуры.

ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) представляет собой метод, применяемый для амплификации РНК, в которой ПЦР реакции предшествует реакция с участием обратной транскриптазы для превращения РНК в кДНК. Эти две реакции достаточно совместимы и могут проводиться в одной и той же пробирке и при помощи одних и тех же инструментов циклического температурного воздействия.

Специфичная к метилированию ПЦР или (СМП) включает предварительную обработку мишени ДНК бисульфитом натрия, который превращает неметилированный цитозиновый остаток в урацил, который распознается ДНК праймером как тимин. На модифицированной ДНК проводятся две амплифика- 4 027074 ции, используя набор праймеров, отличающих модифицированные и немодифицированные темплаты. Один набор праймеров распознает ДНК с цитозином и амплифицирует неметилированную ДНК, а другой набор распознает ДНК с урацилом или тимином и амплифицирует метилированную последовательность. Относительное соотношение двух продуктов может использоваться для получения информации о степени метилирования.

Выделение ДНК-мишени СЫашуФа.

СЫашуФа (гасНотаШ содержит генетическую информацию как в хромосоме, так и в плазмиде. Плазмида СЫашуФа (гасНотаОх содержит 8 открытых рамок считывания и поскольку они представлены в нескольких копиях, служит благоприятным объектом для методов определения, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, описанных в предшествующем уровне техники. Однако изобретатели нашли, что многие из этих открытых рамок считывания довольно изменчивы. Как минимум, однонуклеотидный полиморфизм (ОНП) был обнаружен в открытых рамках считывания 2, 4, 7 и 8. Было показано, что открытые рамки считывания 1 и 3 содержат как вставки, так и делеции. Таким образом, было решено, что в соответствии с изобретением ДНК-мишень для определения нуклеиновой кислоты должна происходить из хромосомной последовательности СЫашуФа (гасНотаОх. Было обнаружено, что предполагаемый ген, обозначаемый как БЕЦ ГО N0: 1, упоминаемый здесь как хромосомная последовательность 17 и найденный на хромосоме СЫашуФа (гасНотаШ. является наиболее подходящим для применения в способах изобретения, поскольку он обладает низкой изменчивостью среди выделенных СЫашуФа (гасНотаШ изолятов, имеет низкий уровень гомологии с не-СЫашуФа (гасНотаШ изолятами и может определяться методом ПЦР, поскольку имеет благоприятный предел обнаружения, сравнимый с плазмидными ДНК-мишенями, несмотря на свою уникальную копийность. Более детальный выбор ПЦР праймеров для использования в соответствии с предпочтительными аспектами изобретения показан в примерах.

Предполагается, что хромосомная последовательность 17 представляет собой гипотетический мембраносвязанный белок, который еще не получил официального названия. Его функция не важна для организма настолько, чтобы позволить использовать его в соответствии с настоящим изобретением.

В соответствии с первым аспектом изобретения предлагается метод обнаружения в образце генетического материала из СЫашуФа (гасНотаШ, который включает обнаружение специфичной последовательности нуклеиновой кислоты, включающего по крайней мере 10 последовательных остатков нуклеиновых кислот, заявленных в БЕЦ ГО N0: 1:

БЕЦ ГО N0: 1: а(даа((саа а(а(адаа(а (аддсаа(а( сд(а(ада(а 1ас1дадс1д ((((а(с(дс ((дс(аа(да 1ддШддас ас(ад(садс а(саадс(ад дада((с(с( аддаддса(с а((сс(дда( дс((адда(а с((ас(ддс( ааааддаадс а(сдссд(сс (д(ссдс(дд ((с((сс((а сйййсй (ддса((дсс (с(ддаа(с( (сс((д(сд( (с((са(сс( аадсаааад! аа, или его комплемента; при этом последовательность может быть дополнительно мутирована вплоть до 5 вставок остатков или замен остатков.

В соответствии с определенными вариантами осуществления предпочтительно, чтобы последовательность нуклеиновой кислоты включала по крайней мере 15 последовательных остатков нуклеиновой кислоты из БЕЦ ГО N0: 1.

В соответствии с определенными вариантами осуществления допускается 1, 2, 3 или 4 делеций остатков, замен остатков или вставок остатков. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления замена остатков предпочтительнее делеций остатков или вставке остатков.

В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления последовательность не содержит замен, делеций или вставок остатков. Подобные предпочтительные свойства в отношении дополнительных мутаций применимы ко всем другим аспектам изобретения.

Предпочтительно, если указанное обнаружение специфичной последовательности включает проведения стадии гибридизации нуклеиновой кислоты.

Предпочтительно указанное обнаружение специфичной последовательности включает проведения стадии гибридизации нуклеиновой кислоты с последующей стадией обнаружения гибридизации нуклеиновой кислоты.

Обнаружение гибридизации нуклеиновой кислоты.

Методы обнаружения гибридизации нуклеиновой кислоты включают методы обнаружения гибридизации нуклеиновой кислоты не специфическими способами. Эти методы включают применение интеркалирующего красителя для нуклеиновой кислоты, например, бромида этидия или БУВК-зеленого. Эти красители проявляются в виде флуоресцентных сигналов при связывании с двухцепочечной нуклеиновой кислотой и могут быть обнаружены стандартными методами обнаружения флуоресценции. В соответствии с альтернативными вариантами осуществления метод обнаружения гибридизации нуклеиновой кислоты может представлять собой метод обнаружения специфичных последовательностей, например меченых зондов. Один или более меченый зонд может гибридизовываться с целевой последовательностью специфичным способом или последовательность может быть обнаружены после гибридизации с иммобилизованной комплементарной последовательностью (например, на ДНК наборе или чипе). Зонды нуклеиновых кислот могут содержать флуоресцентную, радиоактивную, ферментативную или в соответствии с определенными вариантами осуществления изобретения электрохимическую метку. Нанесение электрохимической метки, описываемое в настоящем документе, является особенно предпочтительным.

- 5 027074

В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления способ определения в образце генетического материала происходящего из СЫатуФа йасйотайк включает гибридизацию генетического материала происходящего из СЫатуЛа йасйотайк с последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей по крайней мере 15 последовательных остатков нуклеиновой кислоты, содержащихся в 8ЕЦ ГО N0: 4:

8ЕЦ ГО N0: 4: ссд1сс1д!с сдс1ддйс! 1ссйасй1 Й1, или его комплемента; при этом последовательность может быть дополнительно мутирована вплоть до 5 вставок остатков или замен остатков.

В соответствии с определенными вариантами осуществления допускается 1, 2, 3 или 4 делеций остатков, замен остатков или вставок остатков.

В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления способ включает гибридизацию генетического материала, происходящего из СЫатуФа йасйотайк с последовательностью нуклеиновой кислоты включающей последовательность в 8ЕЦ ГО N0: 5:

8ЕЦ ГО N0: 5: с!д!ссдс!д дйсйссй ас!, или его комплемента; при этом последовательность может быть дополнительно мутирована вплоть до 5 вставок остатков или замен остатков.

В соответствии с определенными вариантами осуществления допускаются дополнительные мутации, описанные выше.

В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления обнаружение специфичной последовательности осуществляется после амплификации обнаруживаемой нуклеиновой кислоты с использованием ПЦР, или амплификации, опосредованной транскрипцией (ТМА), или амплификации, основанной на последовательности нуклеиновых кислот (ЦАЗВА), или геликазазависимой амплификации, или рекомбинантной полимеразной амплификации, или амплификации с замещением цепей или изотермической амплификации сформированием петель. С использованием способа обнаружения, при котором специфическое обнаружение выполняется после амплификации обнаруживаемой нуклеиновой кислоты, может быть достигнута большая чувствительность и специфичность метода обнаружения.

Предпочтительно, чтобы последовательность-специфичный способ обнаружения выполнялся после амплификации обнаруживаемой нуклеиновой кислоты с применением ПЦР.

Полимеразная цепная реакция.

Полимеразная цепная реакция включает применение прямого ПЦР праймера и обратного ПЦР праймера. В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления первого аспекта изобретения указанная полимеразная цепная реакция включает применение прямого ПЦР праймера и обратного ПЦР праймера, в которых:

а) указанный прямой ПЦР праймер включает нуклеотидную последовательность, включающую от 17 до 34 (например, от 24 до 34) последовательных нуклеотидных остатков, выбранных из 8ЕЦ ГО N0: 15: 1да1д-д/с-1/а-1/а-1/а-§/с-д/с-а/1-сас1ад1с адса!саадс 1аддадай; и

б) указанный обратный ПЦР праймер включает нуклеотидную последовательность, включающую от 15 до 31 (например, от 21 до 31) последовательных нуклеотидных остатка, выбранных из 8ЕЦ ГО N0: 16: ааддаадай ссададдсаа !дссааадаа аааад!, или когда указанный прямой ПЦР праймер включает последовательность нуклеиновой кислоты, являющейся комплементом обратного праймера, определенного в части б) выше, и указанный обратный ПЦР праймер включает последовательность нуклеиновой кислоты, являющейся комплементом прямого праймера, определенного в части а) выше, в котором последовательность может быть дополнительно мутировавшей вплоть до 5 вставок остатков, делеций остатков или замен остатков.

Например, указанная полимеразная цепная реакция может включать применение прямого ПЦР праймера и обратного ПЦР праймера, в которых:

а) указанный прямой ПЦР праймер включает нуклеотидную последовательность, включающую от 17 до 34 (например, от 24 до 34) последовательных нуклеотидных остатка, выбранных из 8ЕЦ ГО N0: 2: йддасас!а д!садса!са адс!аддада й; и

б) указанный обратный ПЦР праймер включает нуклеотидную последовательность, включающую от 15 до 25 последовательных нуклеотидных остатка, выбранных из 8ЕЦ ГО N0: 3: даадайсса даддсаа!дс сааадааааа;

или когда указанный прямой ПЦР праймер включает последовательность нуклеиновой кислоты, являющейся комплементом обратного праймера, определенного в части б) выше, и указанный обратный ПЦР праймер включает последовательность нуклеиновой кислоты, являющейся комплементом прямого праймера, определенного в части а) выше, в котором последовательность может быть дополнительно мутировавшей вплоть до 5 вставок остатков, делеций остатков или замен остатков.

Дополнительные мутации могут быть такими как определено выше. В определенных вариантах осуществления прямой ПЦР праймер может быть таким, как определено для второго аспекта изобретения, и обратный ПЦР праймер может быть таким, как определено для третьего аспекта изобретения.

- 6 027074

В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления прямой ПЦР праймер включает нуклеиновую кислоту, имеющую последовательность, приведенную в 8ЕО ГО N0: 17, 8ЕО ГО N0: 18 или 8ЕО ГО N0: 6:

8ЕД ГО N0: 6: сас!ад!сад са!саадс!а дд;

8ЕД ГО N0: 17: сааасс!сас 1ад1садса1 саадс!адд;

8ЕД ГО N0: 18: дШддасас 1ад1садса1 саадс!адд; и обратный ПЦР включает нуклеиновую кислоту, имеющую последовательность, приведенную в 8ЕО ГО N0: 19 или 8ЕО ГО N0: 7:

8ЕД ГО N0: 7: Нссададдс аа!дссааад;

8ЕД ГО N0: 19 адаНссада ддсаа!дсса аадааа.

В соответствии с определенными вариантами осуществления один или оба ПЦР праймера могут быть мечены для облегчения обнаружения гибридизации. Метка может быть флуоресцентной, радиоактивной, ферментативно активной или электрохимически активной. Праймер и метка могут быть организованы таким образом, чтобы обнаруживаемый сигнал усиливался после гибридизации или после ослабления экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы, применяемой в ПЦР реакции. Например, метка может пришиваться к ПЦР праймеру, к которому также присоединен гасящий флуоресценцию фрагмент. Деградация ПЦР праймера будет приводить к отделению гасящего флуоресценцию фрагмента и метки друг от друга, таким образом, влияние гасителя флуоресценции на метку будет становиться незначительным.

Зонды нуклеиновой кислоты.

Зонды.

Зонд нуклеиновой кислоты может применяться для обнаружения специфичных последовательностей продуктов ПЦР реакции. Как правило, такие зонды разрабатываются для комплементарного присоединения к матричной последовательности в месте между отжегшимися праймерами. Зонд может быть меченым для облегчения его обнаружения, например, флуорофором, радиоактивной меткой, электрохимически активной меткой или ферментативной меткой. Метка может непосредственно связываться с нуклеиновой кислотой или через участок линкера. Зонды настоящего изобретения особенно подходят для ТадМап ПЦР формата. ТадМап представляет собой метод количественного ПЦР в реальном времени, распространяемый ЫГс Тесйпо1од1е8 1пс. В ТадМап формате проводится измерение в реальном времени продукта накопления ПЦР на протяжении экспериментальной фазы амплификации. Это выполняется для определения порогового цикла, т.е. числа циклов ПЦР, при котором может быть обнаружен пороговый уровень сигнала. ПЦР зонды в ТадМап формате являются флуоресцентно меченными и комплементарны сегменту примерно от 20 до 60 нуклеотидов в матричной ДНК, локализованному между двумя праймерами. Подходящий флуоресцентный зонд для использования в ТадМап системе включает 6-карбоксифлуоресцеин (РАМ) или тетрахлорфлуоресцеин (ТЕТ). ТадМап зонд обычно метится таким флуорофором, а также метится молекулой гасителя флуоресценции, например тетраметилродамином (ТАМКА). Сближенность флуорофора и гасителя флуоресценции ингибирует флуоресценцию флуорохрома. Однако во время фазы удлинения праймера ПЦР реакции Тад полимераза также обнаруживает 5' к 3' экзонуклеазную активность, которая разрушает участок зонда, уже присоединенного к матрице. Деградация зонда высвобождает из него флуорохром. Теперь флуорохром не находится вблизи от гасителя флуоресценции, таким образом, влияние гасителя флуоресценции ослабевает, и испускаемый сигнал флуорофора усиливается и может быть обнаружен.

В соответствии с определенными вариантами осуществления изобретения полимеразная цепная реакция включает применение зонда нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты. Указанная последовательность нуклеиновой кислоты, включающая от 18 до 28 остатка нуклеиновой кислоты, дана в 8ЕД ГО N0: 4: ссд1сс1д1с сдс1дд11с1 !сс!!ас!!! !!!, или ее комплемент, в котором последовательность может быть дополнительно мутировавшей вплоть до 5 вставок остатков, делеций остатков или замен остатков, как это описано выше.

В соответствии с определенными вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, включающая от 19 до 27 остатков нуклеиновой кислоты, дана в 8Е0 ГО N0: 4, более предпочтительно включающая от 20 до 26 остатков нуклеиновой кислоты, более предпочтительно от 21 до 25 остатков нуклеиновой кислоты, более предпочтительно от 22 до 24 остаткоы нуклеиновой кислоты, наиболее предпочтительно 23 остатка нуклеиновой кислоты.

Предпочтительно, если зонд нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, данную в 8ЕД ГО N0: 5: с!д!ссдс!д дНсНссН ас!.

В соответствии с определенными вариантами осуществления зонд нуклеиновой кислоты может быть меченным, например, флуоресцентной, радиоактивной, ферментативной или, что наиболее предпочтительно электрохимически активной меткой. Электрохимически активные метки, раскрываемые в данном документе, являются наиболее предпочтительными.

В соответствии со вторым аспектом изобретения предлагается прямой ПЦР праймер, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 17 до 34 (например, от 24 до 34) последовательных нуклеотидных остатков, выбранных из 8Е0 ГО N0: 15:

- 7 027074

5>ΕΟ ΙΌ N0: 15: 1да1д-д/с-1/а-1/а-1/а-д/с-д/с-а/1-сас1ад1с адсаЮаадс 1аддадай, в котором последовательность может быть дополнительно мутировавшей вплоть до 5 вставок остатков, делеций остатков или замен указанных остатков дополнительными необязательными мутациями, как было определено выше.

В соответствии с определенными вариантами осуществления предлагается прямой ПЦР праймер, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 17 до 27 последовательных нуклеотидных остатков, выбранных из 8Еф ГО N0: 2:

5>Е0 ГО N0: 2: йддасас!а д!садса!са адс!аддада II.

в котором последовательность может быть дополнительно мутировавшей вплоть до 5 вставок остатков, делеций остатков или замен указанных остатков дополнительными необязательными мутациями, как было определено выше.

В соответствии с определенными вариантами осуществления предлагается прямой ПЦР праймер, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 24 до 34 последовательных нуклеотидных остатков, выбранных из 8Еф ГО N0: 20:

5>Е0 ГО N0: 20: 1да1дсааас с!сас!ад!с адса!саадс 1аддадай, в котором последовательность может быть дополнительно мутировавшей вплоть до 5 вставок остатков, делеций остатков или замен указанных остатков дополнительными необязательными мутациями, как было определено выше.

В соответствии с определенными вариантами осуществления предлагается прямой ПЦР праймер, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 24 до 24 последовательных нуклеотидных остатков, выбранных из 8Е0 ГО N0: 21:

5>Е0 ГО N0: 21 : 1да1дд1йд дасас!ад!с адса!саадс 1аддадай, в котором последовательность может быть дополнительно мутировавшей вплоть до 5 вставок остатков, делеций остатков или замен указанных остатков дополнительными необязательными мутациями, как было определено выше.

В соответствии с определенными вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит от 18 до 26, от 19 до 25, от 20 до 24, от 21 до 23, наиболее предпочтительно 22 остатка или от 25 до 33, от 26 до 32, от 27 до 31, от 28 до 30, наиболее предпочтительно 29 остатков. В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления прямой ПЦР праймер включает нуклеиновую кислоту, имеющую последовательность, указанную в 8Еф ГО N0: 17, 8Еф ГО N0: 18 или 8ЕО ГО N0: 6, где

8Е0 ГО N0: 6: сас!ад!сад са!саадс!а дд;

8Е0 ГО N0: 17: сааасс!сас 1ад1садса1 саадсШдд

8Е0 ГО N0: 18: дШддасас 1ад1садса1 саадсШдд.

В соответствии с третьим аспектом изобретения предлагается обратный ПЦР праймер, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 15 до 31 (например, от 21 до 31) последовательных нуклеотидных остатков, выбранных из 8Е0 ГО N0: 16:

8Е0 ГО N0: 16: ааддаадай ссададдсаа (дссааадаа аааадЕ в котором последовательность может быть дополнительно мутировавшей вплоть до 5 вставок остатков, делеций остатков или замен указанных остатков дополнительными необязательными мутациями, как было определено выше.

В соответствии с определенными вариантами осуществления предлагается обратный ПЦР праймер, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 15 до 25 последовательных нуклеотидных остатков, выбранных из 8Еф N0: 3:

8Е0 ГО N0: 3: даадайсса даддсаа1дс сааадааааа, в котором последовательность может быть дополнительно мутировавшей вплоть до 5 вставок остатков, делеций остатков или замен указанных остатков дополнительными необязательными мутациями, как было определено выше.

В соответствии с определенными вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты включает от 22 до 30 последовательных нуклеотидных остатков, выбранных из 8Еф ГО N0: 16, более предпочтительно от 23 до 29, более предпочтительно от 24 до 28, более предпочтительно от 25 до 27, наиболее предпочтительно 26 остатков.

В соответствии с определенными вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты включает от 16 до 24 последовательных нуклеотидных остатков, выбранных из 8Е0 ГО N0: 3, более предпочтительно от 17 до 23, более предпочтительно от 18 до 22, более предпочтительно от 19 до 21, наиболее предпочтительно 20 остатков.

В соответствии с определенными вариантами осуществления число и тип вставок, делеций и замен остатков могут быть такими как определено выше для прямого праймера.

В соответствии с определенными вариантами осуществления обратный ПЦР праймер включает последовательность нуклеиновой кислоты, данную в 8Е0 ГО N0: 19 или 8Еф ГО N0: 7, где

8Е0 ГО N0: 7: йссададдс аа1дссааад;

8Е0 ГО N0: 19: адайссада ддсаа1дсса аадааа.

- 8 027074

В соответствии с четвертым аспектом изобретения предлагается зонд нуклеиновой кислоты, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 18 до 28 нуклеотидных остатков, данных в 8ЕЦ ГО N0: 4:

8Е0 ГО N0: 4: ссд!сс!д1с сдс!ддйс! 1ссйасШ 1й, или его комплемент, в котором последовательность может быть дополнительно мутировавшей вплоть до 5 вставок остатков, делеций остатков или замен остатков.

Число и тип вставок, делеций и замен остатков могут быть такими как определено выше для праймеров изобретения. В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления зонд нуклеиновой кислоты включает от 18 до 27, от 19 до 26, от 20 до 25, от 21 до 24, от 22 до 23, наиболее предпочтительно 23 остатка из 8Е0 ГО N0: 4.

В соответствии с определенными вариантами осуществления зонд нуклеиновой кислоты изобретения включает последовательность нуклеиновой кислоты, данную в 8Е0 ГО N0: 5:

8Е0 ГО N0: 5: с!д!ссдс!д дйсйссй ас!.

В соответствии с пятым аспектом изобретения предлагается ПЦР компонент, включающий прямой ПЦР праймер изобретения и обратный ПЦР праймер в соответствии с изобретением. В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления ПЦР компонент дополнительно включает зонд нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением.

Внутренний контроль.

Обычно тест внутреннего контроля для ПЦР или аналогичный тест состоит из одноцепочечных ДНК олигонуклеотидов. Они могут быть произведены и иммобилизованы на носителе образца или быть добавлены к компоненту ПЦР реакции. Однако способам настоящего изобретения могут предшествовать стадии приготовления образца, которые могут включать очистку элементарных телец или клинически полученных материалов, содержащих СЫашуФа и выделение из них геномной ДНК. Коммерчески доступны ряд способов очистки ДНК и наборы для очистки, например, Рготеда νί/агй 8у8!ет. Эти системы бактериального лизиса и ДНК очистки включают применение раствора, содержащего хаотропную соль, к ДНК, иммобилизованной на мембране, например на кварцевой мембране, с последующим удалением оставшегося лизата и промыванием для удаления примесей. Очищенная бактериальная геномная ДНК затем отщепляется от мембраны и используется в последующем анализе на обнаружение, например, в анализе в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения. Маловероятно, что такие способы очистки также будут одновременно очищать короткие последовательности внутреннего контроля, содержащие одноцепочечные ДНК олигонуклеотиды. Например, Рготеда νί/агй ΚίΙ утверждает, что их протокол очистки имеет порог 50 к.о. Таким образом, изобретатель считает, что будет полезным предложить внутренний контроль, который мог бы очищаться одновременно с геномной ДНК СЫатуФа, содержащейся в образце. Возможным решением было бы применение в качестве внутреннего контроля геномную ДНК другого бактериального вида, с применением такого же лизиса при условиях выделения, который требуется при выделении геномной ДНК СЫатуФа. Исходя из соображений безопасности, источник внутреннего контроля должен в идеале выделяться из непатогенных бактерий. Также он должен в норме не присутствовать у человека, но легко культурироваться в лаборатории. Настоящее изобретение включает применение в качестве внутреннего контроля геномной ДНК, выделенной из Рес!оЬас!етшт а!гокерйсит, поскольку Р.айокерйсит пригодна для культурирования, легкодоступна и выделенная из нее ДНК легко может быть очищена вместе с ДНК, выделенной из СЫатуФа. Она содержит только одну хромосому и имеет множество генов, которые являются уникальными для вида. Более того, не сообщалось ни одного случая человеческой инфекции, которую бы вызывал данный вид (она представляет собой растительный патоген, который вызывает мягкую гниль плодов и черную ножку картофеля в зонах умеренного климата), что означает, что его маловероятно встретить в анатомических участках или в клинических образцах. Во избежание недопониманий, необходимо отметить, что Рес1оЬас1епит айокерйсит был ранее известен как Епуийа сагоЮуога 8иЬ§р. айокерйса. В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления, в соответствии с пятым аспектом изобретения ПЦР компонент дополнительно включает геномную ДНК, полученную из Рес!оЬас!етшт айокерйсшт для использования в качестве внутреннего контроля. Предпочтительно, если он представляет собой штамм АТСС ВАА-672.

ПЦР компонент в соответствии с изобретением предпочтительно включает второй прямой ПЦР праймер и второй обратный ПЦР праймер, в котором указанные праймеры сконструированы таким образом, чтобы гибридизовываться с последовательностью нуклеиновой кислоты, находящейся внутри последовательности нуклеиновой кислоты 8ЕЦ ГО N0: 8:

8Е0 ГО N0: 8: с!ассд!д!а ддд!са!адд сайдасс!с а!ддс!ссас ддаа!сд!дс да!сд!саас !дсдасд!дс сайсасад! дсд!аададс ассдсдаа!с !сдда!ааас ас!ддсасса д!дс!д1асд ссаа!ссада йдсйсйс с!сдс!д!сд ддаадШдд йдаассдда дадсасда!с ссШсс!аа адасдйасс даййсаса йдадддсда аа!сааадда йсссадйс аддсс!д1ас ссд!сд!сад а1аШс1са аШдд1са! 1аасадаа1д дсдйддасд а!с!ссйса сддсада1а! с!сШс!дд с!садддай ййасд!сд адсдд!д!аа !ададсдааа йдссас;

или его комплемент, в котором последовательность может быть дополнительно мутировавшей вплоть до 5 вставок остатков, делеций остатков или замен остатков, число и тип которых таков, как было определено выше по отношению к ПЦР праймерам в соответствии с первым или вторым аспектом изо- 9 027074 бретения.

Второй прямой ПЦР праймер предпочтительно включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 13 до 23 последовательных остатков нуклеиновой кислоты, выбранных из 8ЕО ГО N0: 9:

ЗЕЦ ГО N0: 9: с1сдс1д1сд ддаад111дд йдаассд.

Второй обратный ПЦР праймер предпочтительно включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 15 до 25 последовательных остатков нуклеиновой кислоты, выбранных из 8ЕО ГО N0: 10:

ЗЕЦ ГО N0: 10: асаддсс1да ас1дддаа1с сШдаШс.

Альтернативно, указанный второй прямой ПЦР праймер включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементом к обратному праймеру, который определен выше, и указанный второй обратный ПЦР праймер включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементом к прямому праймеру, который определен выше, в котором последовательность может быть дополнительно мутировавшей вплоть до 5 вставок остатков, делеций остатков или замен остатков, число и тип которых таков, как было определено выше по отношению к ПЦР праймерам в соответствии с первым или вторым аспектом изобретения. Второй прямой ПЦР праймер предпочтительно включает от 14 до 22 последовательных остатков нуклеиновой кислоты, выбранных из ЗЕЦ ГО N0: 9, более предпочтительно от 15 до 21, более предпочтительно от 16 до 20, более предпочтительно от 17 до 19, наиболее предпочтительно 18 последовательных остатков нуклеиновой кислоты, выбранных из 8ЕС) ГО N0: 9.

Второй обратный ПЦР праймер предпочтительно включает от 16 до 24 последовательных остатков нуклеиновой кислоты, выбранных из ЗЕЦ ГО N0: 10, более предпочтительно от 17 до 23, более предпочтительно от 18 до 22, более предпочтительно от 19 до 21, наиболее предпочтительно 20 последовательных остатков нуклеиновой кислоты, выбранных из ЗЕЦ ГО N0: 10.

В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления второй прямой ПЦР праймер включает последовательность нуклеиновой кислоты, данную в ЗЕЦ ГО N0: 11:

ЗЕЦ ГО N0: 11: 1д1сдддаад 111дд11д.

А второй обратный ПЦР праймер включает нуклеиновую кислоту, имеющую последовательность, данную в 8Е0 ГО N0: 12:

8Е0 ГО N0: 12: сс1даас1дд даа1сс111д.

ПЦР компонент в соответствии с определенными вариантами осуществления содержит второй зонд нуклеиновой кислоты, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит от 18 до 28, более предпочтительно от 19 до 27, более предпочтительно от 20 до 26, более предпочтительно от 21 до 25, более предпочтительно от 22 до 24, наиболее предпочтительно 23 остатка нуклеиновой кислоты, данных в ЗЕЦ ГО N0: 13:

8Е0 ГО N0: 13: ддададсасд а1ссс111сс (ааадасдй асс, или его комплемент, в котором последовательность может быть дополнительно мутировавшей вплоть до 5 вставок остатков, делеций остатков или замен остатков, число и тип которых таков, как было определено выше по отношению к первому зонду нуклеиновой кислоты в соответствии с третьим аспектом изобретения.

В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления, зонд нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, данную в ЗЕЦ ГО N0: 14:

8Е0 ГО N0: 14: дсасда1ссс 111сс1ааад асд.

Настоящее изобретение также рассматривает продукты и способы, относящиеся к внутреннему контролю, включающие Рес1оЪас1егшт а1го5срОсит в отсутствие продуктов и способов для обнаружения СЫатуФа 1гасйота115 (например, для применения в качестве внутреннего контроля при обнаружении нуклеиновой кислоты, отличной от нуклеиновой кислоты из СЫатуФа (гасйотайк). В частности, изобретение рассматривает прямой ПЦР праймер и дополнительно рассматривает второй ПЦР праймер, в котором указанный праймер сконструирован для гибридизации с последовательностью матричной нуклеиновой кислоты, находящейся внутри геномной ДНК Рес1оЪас1егшт айокерйсит. Предпочтительно праймера сконструированы для гибридизации с последовательностью матричной нуклеиновой кислоты, находящейся внутри последовательности нуклеиновой кислоты ЗЕЦ ГО N0: 8:

8Е0 ГО N0: 8: с1ассд1д1а ддд1са1адд са11дасс1с а1ддс1ссас ддаа1сд1дс да1сд1саас 1дсдасд1дс са11сасад1 дсд1аададс ассдсдаа1с 1сдда1ааас ас1ддсасса д1дс1д1асд ссаа1ссада йдсйсйс с1сдс1д1сд ддаад111дд 11даассдда дадсасда1с сс111сс1аа адасдйасс даййсаса йдадддсда аа1сааадда йсссадйс аддсс1д1ас ссд1сд1сад а1а111с1са а1йдд1са1 1аасадаа1д дсдйддасд а1с1ссйса сддсада1а1 с1сй1с1дд с1садддай ййасд1сд адсдд1д1аа 1ададсдааа йдссас;

или его комплементом, в котором последовательность может быть дополнительно мутировавшей вплоть до 5 вставок остатков, делеций остатков или замен остатков, число и тип вставок, делеций и замен которых было определено в других местах данного описания.

Дополнительные признаки второго прямого ПЦР праймера и второго обратного ПЦР праймера могут предпочтительно быть такими как определено в документе по отношению к другим аспектам изобре- 10 027074 тения. Изобретение также рассматривает зонд нуклеиновой кислоты для обнаружения Рес1оЪас1егшт айокербсит внутреннего положительного контроля, имеющий признаки, которые были определены по отношению к другим аспектам изобретения. Изобретение также рассматривает способ обнаружения сигнала от внутреннего положительного контроля, включающего Рес1оЪас1егшт аДокерйсит, включающий применение Рес1оЪас1егшт аДокерйсит праймеров, необязательно, зонда и включает любые признаки, описываемые в документе по отношению к другим способам изобретения. Способу обнаружения сигнала от внутреннего положительного контроля, включающего Рес1оЪас1епит аДокерйсит, предпочтительно предшествует способ получения геномной ДНК от РесЮЪасйгшт а1го5ер11сит, включающий лизис целых бактериальных клеток РесЮЪасйгшт аДокерйсит с использованием хаотропных солей и, необязательно, кварцевой мембраны, как описано в документе.

Набор.

В соответствии с шестым аспектом изобретения предлагается набор, включающий ПЦР компонент в соответствии с пятым аспектом изобретения или ПЦР праймер или зонд в соответствии с восьмым, девятым или десятым аспектами, и инструкции для проведения способа в соответствии с первым аспектом изобретения. Набор может содержать дополнительные компоненты, например сосуд для образцов, упаковку, ПЦР ферменты, предшественники для амплификации, пробирки для образцов или инструменты для обнаружения.

Внутренний положительный контроль.

В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления ПЦР компонент пятого аспекта изобретения дополнительно включает геномную ДНК, полученную из Рес1оЪас1егшт аДокерДсшт для применения в качестве внутреннего положительного контроля. Способ обнаружения может быть таким, как описывается в заявке в отношении других аспектов изобретения, или может включать применение соединений или продуктов, описанных в изобретении в отношении других аспектов изобретения. В соответствии с седьмым аспектом изобретения предлагается способ обнаружения в образце генетического материала, происходящего из РесЮЪасйгшт аДокерДсшт, включающий обнаружение специфичной последовательности нуклеиновой кислоты, заключенной в хромосоме Рес1оЪас1епит аДокерйсшт. Указанный способ может включать любой признак, описанный в отношении других аспектов изобретения, и может необязательно дополнительно включать экстракцию геномной ДНК из образца, где указанная геномная ДНК является ДНК Рес1оЪас1егшт аДокерйсшт (необязательно добавляемой к образцу в качестве внутреннего контроля). Указанная экстракция может сопровождать экстракцией геномной ДНК из второго интересующего организма (например, бактериального патогена).

В соответствии с восьмым, девятым и десятым аспектами изобретения соответственно отдельно предлагаются прямые ПЦР праймера, определенные как второй прямой ПЦР праймер в соответствии с пятым аспектом изобретения; обратный ПЦР праймер, определенный как второй обратный ПЦР праймер в соответствии с пятым аспектом изобретения; и ПЦР зонд, определенный как второй ПЦР зонд в соответствии с пятым аспектом изобретения.

Изобретение также предлагает ПЦР компоненты, включающие один или более прямой ПЦР праймер, обратный ПЦР праймер или ПЦР зонд в соответствии с восьмым, девятым или десятым аспектом изобретения в комбинации с одним или более дополнительным компонентом ПЦР реакции. Предпочтительные или необязательные признаки, описываемые в отношении с первого по шестой аспектов изобретения, могут также необязательно включаться с седьмого по десятый аспекты и в другие аспекты изобретения.

Метки.

Зонды и/или праймеры могут быть связаны с меткой для облегчения обнаружения. Такая метка может быть радиоактивной, ферментативно активной, флуоресцентно активной или электрохимически активной.

В соответствии с вариантами осуществления, в которых присутствуют компоненты для обнаружения нуклеиновой кислоты, полученной из СЫашуФа Дасйотайк, а также компоненты для обнаружения нуклеиновой кислоты, полученной из внутреннего положительного контроля, или в которых применяется способ одновременного обнаружения двух нуклеиновых кислот, предпочтительно, когда метки, применяемые для облегчения обнаружения внутреннего положительного контроля, и для обнаружения нуклеиновой кислоты, полученной из СЫашуФа ДасйошаДк, отличаются друг от друга, например они могут представлять собой различные флуорохромы, или они могут представлять собой различные электрохимические вещества или электрохимические метки, обеспечивающие электрохимически различимые свойства.

Настоящее изобретение особенно приспособлено для применения электрохимически меченых зондов и/или праймеров. В частности, электрохимическая метка может включать метку, содержащую металло-карбоциклические пи-комплексы, которые представляют собой органические комплексы с частично или полностью делокализованными пи-электронами. Подходящие маркеры включают маркеры, содержащие сэндвичевые соединения, в которых два карбоциклических соединения параллельны, а также изогнутые сэндвичи (угловые соединения) и моноциклопентадиенилы. Предпочтительными электрохимически активными маркерами являются металлоценильные метки. Более предпочтительны ферроценильные

- 11 027074 метки.

Ферроценильные и металлоценильные метки, применяемые в зондах в соответствии с изобретением, могут успешно заменяться Ν-замещенными ферроценил- или металлоценил-карбоксамидами. Ядра ферроцена или металлоцена, содержащие меченый участок, могут быть незамещенными. При желании, ядро ферроцена или металлоцена может быть замещено одним или более заместителем, природа и положение которых выбрано таким образом, чтобы влиять желаемым образом на окислительновосстановительные свойства ферроценового или металлоценового фрагмента. Ядро ферроцена или металлоцена может дополнительно или альтернативно быть замещено любым циклическим заместителем, незначительно уменьшающим электрохимическую чувствительность метки. Ферроценил- или металлоценил-карбоксамидные фрагменты могут быть связаны через карбоксамидный азот с нуклеотидами или олигонуклеотидами. Связывание с нуклеотидами или олигонуклеотидами предпочтительно через фосфатную группу или через нуклеотидное основание. Оба способа связывания позволяют присоединять метку через любой нуклеотид на всем протяжении олигонуклеотидной цепи. Однако, если связывание осуществляется через фосфатную группу полезно делать это через 3' или 5' терминальную фосфатную группу для того, чтобы минимизировать вероятность того, что эта связь стерически затруднит гибридизацию олигонуклеотида по Уотсону-Крику или повлияет на нуклеазную активность. Согласно прогнозу, связывание через участок основания не затрагивает объединения в пары оснований Уотсона-Крика и меньше мешает такому попарному связыванию.

Следовательно, связывание через основание может быть более удобным для мечения нетерминального сайта олигонуклеотида. Меченый олигонуклеотид может содержать линкерный участок между олигонуклеотидом и фрагментом метки. Предпочтительно, чтобы олигонуклеотиды содержали ферроценовый участок метки, который связан с олигонуклеотидом через участок линкера.

Может применяться любой участок линкера. Подходящие участки линкера могут включать алифатическую цепь, которая может быть линейной или разветвленной, насыщенной или ненасыщенной.

Предпочтительно, если участок линкера представляет собой линейную или разветвленную алифатическую цепь, содержащую от 4 до 20 атомов углерода, предпочтительно от 6 до 16, особенно предпочтительно от 8 до 14, особенно предпочтительно 12 атомов углерода. Алкиленовые цепи могут быть замещены любым заместителем или могут быть прерваны любым атомом или фрагментом при условии, что такой заместитель, атом или фрагмент незначительно уменьшает электрохимическую чувствительность метки. Иллюстрацией ферроценильных меток, которые могут применяться в соответствии с изобретением, представлены формулами Ι-ΙΙΙ. Молекулы с формулой от 1а до 1Уа представляют собой олигонуклеотиды, меченные соответствующими ферроценильными метками. Формула IV иллюстрирует ферроценильную метку, которая может присоединяться через нуклеотидной основание, аминомодифицированное тиминовое основание, которое охватывает формула IV, которая приведена с целью иллюстрации:

- 12 027074

- 13 027074

Ферроцен-меченые зонды могут быть получены любым подходящим способом. Для примера, олигонуклеотид может представлять собой олигонуклеотид, модифицированный путем введения радикала, содержащего концевую аминогруппу. Иллюстрацией таких аминомодифицированных нуклеотидов является нуклеотид формулы V. Затем ферроцен может быть введен по реакции аминомодифицированного нуклеотида со сложным эфиром Ν-гидроксисукцинимида и ферроценкарбоновой кислоты (формула VI) с образованием ферроцен-меченого олигонуклеотида:

В альтернативном способе ферроцен-меченые олигонуклеотиды могут быть получены путем добавления ферроценового фрагменты в ходе твердофазного синтеза олигонуклеотида. Ферроценовые метки могут быть введены в олигонуклеотид в ходе твердофазного синтеза двумя общими способами. Вопервых, прибавление олигонуклеотида по З'-концу олигонуклеотида требует применения подходящей смолы. Такая смола представляет собой меченное ферроценовое производное. Прибавление ферроцена по внутреннему сайту или по 5'-концу олигонуклеотида требует применения связывающего реагента, подходящего для связывания с олигонуклеотидом на твердой смоле, например ферроценильного производного фосфороамидита, например, соответствующего формуле IX или X:

В соответствии с определенными специфическими вариантами осуществления электрохимически активная метка может представлять собой соединение:

Мс-ЫВ'-С(=0)-Х-(Аг)п-(1_)т-В XI в котором Мс представляет собой металлоценильную группу, в которой каждое ядро может быть независимо замещенным или незамещенным;

металлоценильная группа включает ион металла М, выбранный из группы, включающей железо, хром, кобальт, осмий, рутений, никель или титан;

К' представляет собой Н или низший алкил;

X представляет собой либо ΝΚ' либо О;

Аг представляет собой замещенную или незамещенную арильную группу; η представляет собой 0 или 1;

Ь представляет собой линкерную группу; т представляет собой 0 или 1;

К представляет собой фрагмент, который должен быть меченым.

Мс группа может быть замещенной одной или более группой, выбранной из низшего алкила (например, С₁-С₄-алкила), низшего алкила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложноэфирной, амидо или дополнительной металлоценовой группой, низшего алкенила, низшего алкенила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложноэфирной, амидо или дополнительной металлоценовой группой, арила, арила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложноэфирной, амидо или дополнительной металлоценовой группой. Дополнительная металлоценовая группа может быть замещена таким же образом, что и Мс группа, за исключением того, что общее число Мс групп в молекуле изо- 14 027074 бретения предпочтительно не должно превышать четырех. Предпочтительно, когда Мс группа является незамещенной.

Предпочтительно М представляет собой ион, выбранный из железа, осмия или рутения. Наиболее предпочтительно, когда М представляет собой ион железа. Когда М представляет собой ион железа, Мс представляет собой ферроцен.

Низший алкил предпочтительно представляет собой С₁-С₄-алкил.

Предпочтительно, когда К' представляет собой Н. Каждый К' обладает идентичностью, отделяющей его от другого К'.

Предпочтительно, когда X представляет собой ΝΗ.

Аг группа может быть замещена одной или более группами, выбранными из низшего алкила (например, С₁-С₄-алкила), низшего алкила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложноэфирной или амидной группой, низшего алкенила, низшего алкенила, гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложноэфирной или амидной группой, арила, арила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложноэфирной или амидной группой. Предпочтительно, когда Аг группа является незамещенной.

Предпочтительно п=1. Предпочтительно т=1.

Подходящая линкерная группа Ь может включать алифатическую цепь, которая может быть линейной или разветвленной, насыщенной или ненасыщенной. Предпочтительно, когда линкерный фрагмент представляет собой линейную или разветвленную алифатическую цепь, содержащую от 4 до 20 атомов углерода, предпочтительно от 6 до 16, особенно предпочтительно от 8 до 14 атомов, еще более предпочтительно, 12 атомов углерода. Алкиленовые цепи могут быть замещены любым заместителем, или могут прерываться любым атомом или фрагментом, при условии, что такой заместитель, атом или фрагмент не уменьшает значительно электрохимическую чувствительность метки.

Соединение изобретения может включать более одной металлоценовой группы. В соединении изобретения металлоценовая группа может быть замещена любой другой электрохимически активной маркерной группой.

Соединение изобретения может представлять собой соединение, являющееся электрохимически активным, или становящееся электрохимически активным после частичного расщепления.

Предпочтительно, когда фрагмент, который предстоит метить, представляет собой аминокислоту, нуклеотид, олигонуклеотид, полинуклеотид, нуклеозид, сахар, углевод, пептид, белок или производное любой из этих молекул. В предпочтительном варианте осуществления, К представляет собой нуклеотид или олигонуклеотид. Нуклеотид может быть выбран из аденозина, тимидина, гуанозина, цитидина или уридина. Предпочтительно, когда нуклеотид присоединен через группу, присоединенной к рибозной или деоксирибозной группе нуклеотида, например, по 2', 3' или 5' положению. Наиболее предпочтительно, когда нуклеотид присоединен по 3' или 5' положению, например по 5 положению. Предпочтительно, когда присоединение по 2', 3' или 5' положению происходит через атом кислорода или азота.

Метящий реагент может быть присоединен непосредственно или через линкер. Линкер может быть присоединен сначала к метящему реагенту или сначала к молекуле, которую предстоит метить. Если линкер сначала присоединен к к молекуле, которую предстоит метить, он может включать группу, например амино или тиольную группу, которая будет облегчать реакцию нанесения метки. Аминогруппа является предпочтительной. Нуклеотид или олигонуклеотид предпочтительно метится по 3'- или 5'-концу. Олигонуклеотид может быть аминомодифицированным для облегчения реакции нанесения метки. Аминомодифицированные олигонуклеотиды могут быть синтезированы стандартными способами и доступны через множество коммерческих ресурсов, например через О5\ус1 §с1епййс (8ои(йатр(оп, ИК). Аминомодифицированные олигонуклеотиды могут также включать линкерный участок, например модификация может представлять собой введение 5'-аминогексильной или 3'-аминогексильной или 5'-С_Р2-аминогруппы. Меченая интересующая молекула предпочтительно включает линкер.

В случае олигонуклеотида последовательность олигонуклеотидного участка молекулы предпочтительно такова, что молекула может гибридизоваться с комплементарной матричной последовательностью и, таким образом, применяться в качестве зонда в методах молекулярной биологии, например обнаружении одной из нуклеиновых кислот или квалификационных методах, описываемых в данном документе.

Меченые биологические молекулы в соответствии с изобретением могут быть электрохимически активными как в расщепленном, так и в нерасщепленном состоянии. Идеально, если степень электрохимической активности будет изменяться в зависимости от степени расщепления. Формула VIII иллюстрирует возможный способ присоединения нового электрохимически активного маркера к олигонуклеотиду. Молекула формулы VIII может быть получена по реакции 5'-аминогексил-модифицированного олигонуклеотида и молекулы, изображенной формулой VII:

- 15 027074

Детальное описание сложного эфира Ν-гидроксисукцинимида 4-(3'-ферроценилуреидо)-1бензойной кислоты и описание применения указанного соединения для нанесения метки на олигонуклеотиды даны в примерах 7 и 8. Однако специалисту будет ясно, что такая метка может быть присоединена к олигонуклеотиду по любому подходящему положению, и это присоединение не ограничивается 5'концомуказанногоолигонуклеотида. Для деталей синтеза и присоединения вышеуказанной электрохимической метки читатель может обратиться к ЕР 1481 083, который внесен в заявку посредством ссылки.

Применение более коротких праймеров и зондов.

В соответствии с определенными вариантами осуществления всех аспектов изобретения, относящихся к гибридизации, праймеры и зонды могут быть короче, чем те, которые определены выше, в частности, если предпринимаются шаги для увеличения температуры отжига праймера (и заявитель, в частности, подразумевает, что длины 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидных остатков могут быть короче, чем длины и диапазоны, определенные выше).

Применение более коротких праймеров и зондов может быть облегчено применением фрагментов, связывающихся с малой бороздкой, а также блокированных нуклеиновых кислот (также известных как закрытые нуклеиновые кислоты или ЬЫЛ), которые повышают термическую стабильность праймеров и зондов и увеличивают температуру отжига праймеров и зондов.

Применение таких модификаций рассматривается как часть настоящего изобретения в совокупности со всеми аспектами изобретения, изложенными выше, и, в частности, в совокупности с зондами и праймерами, описанными выше, но имеющими длины и диапазоны олигомеров короче на 5 остатков по сравнению с описанными выше. Настоящее изобретение во всех его аспектах подразумевает применение более коротких праймеров и зондов, в которых повышенная термическая стабильность обеспечивается применением фрагментов, связывающихся с малой бороздкой и/или блокированных нуклеиновых кислот, а также эксклюзивное применение праймеров и зондов, имеющих повышенную термическую стабильность, которая обеспечивается применением фрагментов, связывающихся с малой бороздкой и/или блокированных нуклеиновых кислот.

Блокированные нуклеиновые кислоты.

Читатель может обратиться к недавнему обзору, посвященному блокированным нуклеиновым кислотам, опубликованному Беуог' (2005) в 1п1ецга1ей ΏΝΆ 1есйпо1о§1ез 1есйшса1 Ъи11е1т Ьоскей Ыис1е1с Άοίάδ (ЬЫЛз), и ссылкам, данным в нем (которые внесены в описание посредством ссылки). Блокированная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, включающую один или более модифицированных РНК или ДНК нуклеотидных остатка (в комбинации с обычными РНК или ДНК остатками). В модифицированном остатке дополнительный ковалентный мостик соединяет 2' и 3' углеродные атомы и блокирует рибозный сахар, который обычно находится в А-форме РНК или ДНК, в 3'-эндоструктурной конформации. Термин блокированная нуклеиновая кислота включает все нуклеиновые кислоты, включающие блокированные остатки в некотором или во всех положениях остатков. Блокировка может достигаться при помощи химической связи, соединяющей 2' и 3' углеродные атомы в фрагменте сахара. Предпочтительно блокировка достигается с помощью 2'-О, 4'-С метиленового линкера.

Блокированные нуклеиновые кислоты проявляют повышенную термическую стабильность, их температура плавления повышается на 5°С по сравнению с соответствующими ДНК или РНК олигомерами. Благодаря повышенной температуре плавления увеличивается риск того, что праймеры и зонды блокированных нуклеиновых кислот могут образовать шпилькообразные структуры, что препятствует эффективной ПЦР реакции. Следовательно, дизайн хорошего праймера и зонда становится еще более существенным, и в отношении настоящего описания, праймеры и зонды блокированных нуклеиновых кислот, соответствующие описанным в 8Е0 ГО N08: 5, 6, 7, 11, 12 и 14, необязательно укороченные на 1, 2, 3, 4 или 5 остатка по любому концу, являются особенно предпочтительными.

Блокированные нуклеиновые кислоты (БЫЛ) могут быть легко приготовлены и доступны у ряда коммерческих производителей.

Фрагменты, связывающиеся с малой бороздкой.

Изобретение, в соответствии со всеми своими аспектами, также относится к зондам и праймерам, являющимися нуклеиновой кислотой, (включая зонды и праймеры блокированных нуклеиновых кислот) соединенные с фрагментами, связывающимися с малой бороздкой (МОБ).

Фрагменты, связывающимися с малой бороздкой, представляют собой изометрическисформированные группы, которые связываются в малых бороздках двойной спирали, образованной зондом или праймером и матрицей. Они стабилизируют двухцепочечный участок и увеличивают температу- 16 027074 ру плавления и специфичность зонда/праймера, что позволяет укоротить применяемый зонд/праймер. Для подробного описания связывающихся с малой бороздкой фрагментов и способов их присоединения читатель отсылается к Κаΐуаν^η е1 а1. (2000), Шс1ечс АсЫ Кез. 28(2):655-661 и ссылкам оттуда, которые внесены в описание посредством ссылки. Фрагменты, связывающиеся с малой бороздкой, могут быть легко приготовлены и присоединены к праймеру и доступны у ряда коммерческих производителей.

Образцы.

В соответствии с различными аспектами изобретения образцы могут включать клинические образцы, включающие ткани и жидкости, которые не ограничиваются кровью, плазмой, сывороткой, секретами, спермой, семенной плазмой, слезой и слюной. Термин образец также включает производные клинических образцов, например образцы, которые были отфильтрованы, коагулированы, дезинфицированы, облучены или разобщены, а также применяемые медицинские инструменты или одежда, которая ранее находилась в контакте с субъектом. Указанный субъект предпочтительно представляет собой человека.

Примеры

Изобретение будет проиллюстрировано следующими не ограничивающимися примерами.

Пример 1. Селекция ПЦР праймеров.

Нуклеотидный ВЬА8Тп анализ хромосомных ампликонов и праймеров.

Был произведен нуклеотидный ВЬА8Тп анализ 18 идентифицированных хромосомных ампликонов и праймеров. Все проанализированные ампликоны не показали различия в сродстве к СЫатуФа КасНотаНз, за исключением ампликона 18, показавшего сродство с СН1атуборЫ1а типбагит. Набор праймеров не показал какого-либо сродства с другими видами, которое ожидалось при поиске таких коротких последовательностей, однако была ли такая похожесть существенной или нет, становилось явным исключительно при выполнении тестирования.

Пример 2. Начальное тестирование праймеров с использованием симметричной ПЦР.

Плазмидные мишени.

Наборы праймеров были взяты для плазмидных ампликонов 1, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Для скринирования этого набора праймеров применяли симметричную ПЦР с использованием 10000 элементарных тел на реакцию в трехкратно для каждого набора праймеров в соответствии с табл. 1.

Таблица 1

Условия симметричной ПЦР

Реагент	Концентрация	Конечная концентрация	Единичная реакция
Буфер для ПЦР	10Х	1Х	5,0 мкЛ
Хлорид магния	25 мМ	3,0 мМ	6,0 мкЛ
Набор дезоксирибонуклеотидов	50,0 мМ	1,0 мМ	1,0 мкЛ
Прямой праймер	10 мкМ	0,3 мкМ	1,5 мкЛ
Обратный праймер	10 мкМ	0,3 мкМ	1,5 мкЛ
Тац полимераза	10 ед./мкМ	2,5 ед.	1,0 мкЛ
Вода	нет данных	нет данных	32,0 мкЛ
Элементарные тела	(5,000/мкЛ)	10,000 элементарных тел	2,0 мкЛ
Всего	50,0 мкЛ

Отрицательные контроли были включены в трипликаты для каждого набора праймеров. Условия ПЦР были следующими:

1) 94°Сх1 мин,

2) 94°Сх30 с,

3) 58°Сх30 с,

4) 72°Сх1 мин,

- 17 027074

5) повтор стадий 2 - 4x39 циклов,

6) 72°Сх3 мин,

7) 16°С постоянно.

После ПЦР 10 мкл каждого продукта были подвергнуты электрофорезу в 2% агарозном геле с окрашиванием 8αΙονίο\ν. После электрофореза и визуализации геля с использованием УФ-лампы было обнаружено, что при указанных условиях тестирования все наборы праймеров вызывали амплификацию целевых участков индикацией полос в геле. Три набора праймеров, которые давали наибольшую интенсивность полос, соответствовали ампликонам 3, 5 и 7. Негативные реакции не давали полос.

Хромосомные мишени.

Наборы праймеров были взяты для ампликонов 1, 5, 9, 17 и 18. Для скринирования этого набора праймеров применяли симметричную ПЦР с использованием 10000 элементарных тел на реакцию в трехкратно для каждого набора праймеров в соответствии с табл. 1. Отрицательные контроля были включены в трипликаты для каждого набора праймеров. Условия ПЦР были описаны выше.

После ПЦР 10 мкл каждого продукта были подвергнуты электрофорезу в 2% агарозном геле с окрашиванием δαίβνΐβν. После электрофореза и визуализации геля с использованием УФ-лампы было обнаружено, что при указанных условиях тестирования все наборы праймеров вызывали амплификацию целевых участков индикацией полос в геле. Хромосомные наборы праймеров, которые давали наибольшую интенсивность полос соответствовали ампликонам 9 и 19, остальные наборы давали слегка меньшую интенсивность, среди которых выделялся хромосомный ампликон 17, будучи ненамного ярче остальных.

Пример 3. Тестирование предела определения (ЬОЭ) с использованием асимметричной ПЦР и электрохимической детекции.

Плазмидные мишени.

Эксперименты выполнялись для определения предела определения элементарных тел СЫатуШа йасйотайз с использованием набора праймеров 3, 5, 7 в асимметричной ПЦР с последующим добавлением ампликон-специфичной пробы, Т7 экзонуклеазы и электрохимической детекцией конечного продукта. Асимметричные реакции с использованием десятикратных разведений элементарных тел на реакцию от 100000 до 1, проводились трижды для каждого набора праймеров в соответствии с табл. 2.

Таблица 2

Условия асимметричной ПЦР

Реагент	Концентрация	Конечная концентрация	Единичная реакция
Буфер для ПЦР	10Х	1Х	5,0 мкЛ
Хлорид магния	25 мМ	3.0 мМ	6,0 мкЛ
Набор дезоксирибонуклеотидов с дезоксиуридином	50,0 мМ	1,0 мМ	1,0 мкЛ
Прямой праймер	10 мкМ	0,04 мкМ	0,2 мкЛ
Обратный праймер	10 мкМ	0,3 мкМ	1,5 мкЛ
Тац полимераза	2,5 ед./мкЛ	2,5 ед.	1,0 мкЛ
Вода	нет данных	нет данных	23,3 мкЛ
Элементарные тела	меняется	меняется	2,0 мкЛ
Всего	50,0 мкЛ

Отрицательные контроли были включены в трипликаты для каждого набора праймеров. Условия ПЦР были такими же, как в примере 1.

После ПЦР 20 мкл реакции были добавлены к 5 мкл мастер-смеси из табл. 3.

- 18 027074

Таблица 3

Мастер-смесь для электрохимического определения

Реагент	Концентрация	Конечная концентрация	Единичная реакция
Ампликон-специфичная	100 мкМ	3 мкМ	0,75 мкЛ
проба
Т7 экзонуклеаза	10000 ед./мЛ	10 ед.	1,0 мкЛ
Вода	нет данных	нет данных	3,25 мкЛ

Реакции были инкубированы при 37°С 20 мин. Вслед за инкубацией все 25 мкл были измерены вольтаметрически при следующих параметрах Автолаб:

Предварительная обработка: потенциал кондиционирования (V): 0, продолжение 0 с, депозиционный потенциал: 0, продолжение 0 с, время уравновешивания: 0.

Измерение: ячейка после измерения X, время модуляции (>=0,0025): .04, Интервал времени (>=0,105): .1.

Потенциалы: начальный: -0,1, конечный: 0,5, шаг: 0,003, амплитуда модуляции: 0,04995, потенциал покоя (V): 0.

Предварительная обработка: остановка уравновешивания на пороге: нет, порог уравновешивания (А): 0.05.

Другое: число сканирований: 1.

В каждом случае записывалась высота пиков между 150-250 мВ.

Полученные электрохимические данные показаны на фиг. 1-3, 6 и 2с для плазмидных ампликонов 3, 5 и 7 соответственно. Полоса ошибок показывает среднее отклонение (п=3).

Полученные отрицательные величины показаны как нет пика. Позитивные однокопийные трипликаты были отмечены для плазмидных ампликонов 3 и 7, однако только одна позитивная величина из трех была зарегистрирована для плазмидного ампликона 5. Поэтому плазмидный ампликон 5 был удален на этой стадии, а эксперимент для плазмидных ампликонов 3 и 7 повторен снова в трипликате, как указано выше. Новые результаты были крайне похожи на полученные ранее.

Хотя плазмидный ампликон 7 показывал продолжительную высоту пика и казался наилучшим для использования набором праймеров, исключительное право на использование принадлежало экспериментам с использованием асимметричной ПЦР, обработкой Т7 экзонуклеазы и электрохимическим определением для обнаружения СЫатуборййа рпеитошае. Они установили, что набор праймеров для плазмидного ампликона 7 давал положительный сигнал с С.рпеитошае (среднее 88,05 нА) и, таким образом, оказывался неподходящим для использования как набор праймеров, специфичный для СЫатуФа 1гасйотаЙ8. Набор праймеров и зондов (проб) для плазмидного ампликона 3 не давал положительного сигнала и поэтому был отобран в качестве ведущего кандидата для определения плазмид СЫатуФа 1гасйотай5.

Хромосомные мишени.

Эксперименты выполнялись для определения предела определения элементарных тел СЫатуФа 1гасйотаЙ8 с использованием набора праймеров хромосомных ампликонов 9, 17, 18 в асимметричной ПЦР с последующим добавлением ампликон-специфичного зонда (пробы), Т7 экзонуклеазы и электрохимической детекцией конечного продукта. Асимметричные реакции с использованием десятикратных разведений элементарных тел на реакцию от 100000 до 1 проводились трижды для каждого набора праймеров в соответствии с табл. 2. После ПЦР 20 мкл реакции были добавлены к 5 мкл мастер-смеси из табл. 3. Реакции были инкубированы при 37°С 20 мин. Вслед за инкубацией все 25 мкл были измерены вольтаметрически при параметрах Автолаб, указанных выше. В каждом случае записывалась высота пиков между 150-250 мВ.

Полученные электрохимические данные показаны на фиг. 4-6 для хромосомных ампликонов 9, 17 и 18 соответственно. Полоса ошибок показывает среднее отклонение (п=3). Точка отсчета соответствует среднему отрицательному результату.

Данные, наблюдаемые выше, показывают, что у всех тестируемых ампликонов величина пиков не уменьшается до того момента, когда уровень элементарных в реакции не падает до 1000 и ниже. Вслед за этим уровнем у хромосомных ампликонов 8 и 18 уменьшается наполовину при уровне 100 элементарных тел на реакцию. Для хромосомного ампликона 17 это уменьшение несколько меньше. Данные для хромосомного ампликона 9 показывают, что при уровне 10 элементарных тел на реакцию высота пиков приближается к тем которые наблюдалось у негативных образцов. Эти данные показывают, что хромосомный ампликон 17 работает лучше, чем хромосомный ампликон 18, и оба этих ампликона работают луч- 19 027074 ше, чем ампликон 9, особенно в области низких разрешений.

Чтобы улучшить определение в низкоразрешенной области, был использован один из методов, уже однажды примененных изобретателями, - изменение концентрации хлорида магния. Эксперимент был проведен с использованием в реакции конечной концентрации хлорида магния от 2,0 до 5,0 мМ с шагом 0,5 мМ с использованием 10000 элементарных тел в асимметричной ПЦР с последующим добавлением ампликон-специфичной пробы, Т7 экзонуклеазы и электрохимической детекцией конечного продукта. Полученные данные подтвердили, что конечная концентрация 5,0 мМ позволила наблюдать наибольшие пики при указанных условиях. Чтобы подтвердить, что концентрация хлорида магния влияет на все уровни элементарных тел, второй эксперимент по пределу определения был проведен с хромосомным ампликоном 17, используя конечную концентрацию хлорида магния 5,0 мМ. Результаты представлены на фиг. 7. Полоса ошибок показывает среднее отклонение (п=3). Точка отсчета соответствует среднему отрицательному результату.

Данные показывают, что проведение ПЦР с 5,0 мМ хлоридом магния более оптимальны для 1000 элементарных тел, чем для условий от 10,000 до 100,000 элементарных тел на реакцию. При концентрациях от 1000 элементарных тел высота пиков падает до средней величины соответствующей 1 элементарному телу (54,97 нА). Все вместе привело к тому, что наборы праймеров и зондов (проб), соответствующие хромосомному ампликону 17 (8ЕЦ ГО N0: 1), были признаны ведущими кандидатами для идентификации хромосомных мишеней СЫатуЛа йасйотайк. Последовательности прямого и обратного праймеров и зонда указаны в 8ЕО ГО N08: 6, 7 и 5 соответственно.

Пример 4. Верификация внутри и внешневидовой избирательности.

Введение.

Существенно, чтобы исследование на хламидии было высокоспецифичным только для СЫатуЛа йасйотайк и чтобы не было перекрестных реакций с другими видами бактерий или любых других организмов. Во время фазы дизайна праймеров и пробы (зонда), отраженных в примерах 1-3, было показано биоинформатически отсутствие перекрестных реакций, однако было необходимо продемонстрировать это экспериментально на реальных микробных изолятах.

Одновременно с этим было бы также существенным показать, что исследование способно определять все 15 сероваров СЫатуЛа йасйотайк, обитающих в гениталиях, а также способно амплифицировать другие серовары (вызывающие глазные болезни и артриты) с применением набора праймеров из настоящего исследования.

Образцы ДНК, происходящие из набора микроорганизмов, были тестированы с набором как плазмидных, так и хромосомных праймеров, чтобы проверить специфичность (внешневидовую исключительность) ПЦР, и определением конечных продуктов с Т7-пробой.

Чтобы проверить внутривидовую охватываемость, были взяты все 15 сероваров СЫатуЛа йасйотайк (в качестве элементарных тел), из которых выделили ДНК, очистили и проверили ее качество. Три уровня копий ДНК были тестированы с использованием наборов как плазмидных, так и хромосомных наборов праймеров с последующей обработкой пробой Т7 экзонуклеазы с определением конечных продуктов, чтобы установить, что все серовары имели похожий предел определения.

Проверка исключительности.

Набор геномных праймеров был тестирован дважды с набором различных ДНК, описанных во введении. Результаты были представлены в виде измерений после ПЦР и Т7 пробы. Тесты были проведены в сочетании с ПЦР контролями для каждой серии.

Результаты хромосомного ампликона 17.

Наборы праймеров и пробы, соответствующие ампликону 17, были тестированы против перечня геномных ДНК. Результаты двойных экспериментов представлены ниже.

- 20 027074

Вид	Положение пика (мВ)	Высота пика (нА)
Ас1пе1оЬас1ег Ьаитапп	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Ас1пе1оЬас1ег депозрес1ез 9	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Ас1пе1оЬас1ег Ьаегтю1уйсиз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Апаегососсиз 1е1гасНиз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
АгсапоЬас1епит руодепез	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ВасШиз сегеиз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Вас1его1с1е5 1гад|Пз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Вас1его1с1ез 1Ье1аю1атюгоп	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Вас1его1с1е5 уи1да1из	Нет пика	Нет пика

- 21 027074

	Нет пика	Нет пика
ВШс1оЬас{епит Ьгеуе	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Вогс1е£е11а ρβΓΐιΐδδΐδ	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ВигкЬо1с1епа серас1а	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
СКгоЬасЛег άίνβΓδίΐδ	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
СНгоЬасТег Тгеипс1п	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
С1об1пс)1ит άίίίϊοϊΐθ	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
СогупеЬасФепит игеа1у1юит	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Еп1егоЬас1ег аегодепее	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика

- 22 027074

ЕШегососсиз саззеПЛауиз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ЕШегососсиз сЛзраг	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ЕгЯегососсиз даШпагит	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ЕШегососсиз типсИн	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ЕШегососсиз гаТЛпозиз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ЕзсНепсЫа Легтапн	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Ппедо1сЛа тадпа	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
СагбпегеНа уад1паПз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
НаеторИНиз тЛиепгае	Нет пика	Нет пика

- 23 027074

	Нет пика	Нет пика
НаТта аке'|	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
К1еЬз1е11а охуйэса	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
1_ас1оЬасН1из сазе!	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
1_ас1оЬасП1из спзраШз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
1_ас1оЬасШиз даззеп	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Ьас1оЬас|Низ геи1еп	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
из1епа 1ппосиа	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
МоЬПипсиз сигНзи зиЬзр. Но1тези	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика

- 24 027074

МоЬНипсиз тиНепз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
МогахеПа са1аггНаПз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
МогдапеНа тогдапн зиЬзр. Могдапн	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
МогахеПа оз1оепз15	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Рагйоеа адд1отегапз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Рер1оз1гер{ососсиз апаегоЬниз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Ргеуо1е11а Ьма	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Ргорюп1Ьас1епит аспез	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Ргсйеиз гейдеп	Нет пика	Нет пика

- 25 027074

	Нет пика	Нет пика
Зеггайа тагсезсепз зиЬзр. тагсезсепз	196	30
205	20
ЗЫдеНа Яехпеп	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ЗЫде11а δοηηβί	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51арЬу1ососсиз саргЫз зиЬзр. сарй15	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
31арЬу1ососсиз Ьаето1уйсиз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51арЬу1ососсиз Ьот'т13 зиЬзр. Ηοιηΐηίδ	Нет пика	Нет пика
205	17.7
31арЬу1ососсиз 1п1егтесПи5	193	19.6
Нет пика	Нет пика
51арЬуососсиз заргорЬуйсиз зиЬзр. заргорЬу^сиз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика

- 26 027074

51епо1гор1тотопаз таЦорЫПа	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51гер{ососсиз апд1пози5	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ЗЦерЮсоссиз аиз1гаНз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51гер(ососсиз όονίδ	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51гер{ососсиз сопз1е11а1из зиЬзр. сопз1е11а1из	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51гер1ососсиз ериюиз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51гер1ососсиз догбопн	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
3{гер{ососсиз ιτιίΐίδ	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ЗиерЮсоссиз ти1апз	Нет пика	Нет пика

- 27 027074

	Нет пика	Нет пика
5{гер1ососсиз огаНз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51гер1ососсиз рогапиз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51гер1ососсиз зшз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51гер1ососсиз иЬепз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Уегз1гиа еп1егосо1Нюа зиЬзр. еп1егосо1|'{|'са	199	14.5
Нет пика	Нет пика
51гер1ососсиз руодепез	Нет пика	Нет пика
208	14.3
Еп1егоЬас1ег с1оасае	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
1_ас1ососсиз 1асйз	Нет пика	Нет пика
199	16.6

- 28 027074

С1оз1пс1|ит регТппдепз

Нет пика

Нет пика

199

12.2

К1еЬз1е11а рпеитогпае

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Рзеиботопаз аегидтоза

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

ЕзсИеп'сЫа соП

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

РгсДеиз уи1дапз

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Сатру1оЬас1ег соН

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

51арИу1ососсиз аигеиз

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

51гер1ососсиз рпеитогпае

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

51гер1ососсиз с1узда1ас11ае

Нет пика

Нет пика

- 29 027074

Заключение.

Внешневидовая избирательность.

Оба набора праймеров показали отсутствие перекрестного реагирования, демонстрируя, что исследование на Хламидии высокоспецифично.

Проверка на внутривидовую охватываемость.

Элементарные тела из всех 15 сероваров СТгасНотаЕз (А, В, Ва, С, Ώ, Е, Е, О, Η, I, I, К, Ь1, Е2, Е3) были лизированы и их ДНК была очищена и проверена на качество. 50000, 500, 50 и 5 геномных копий каждого серовара были тестированы на внутривидовую охватываемость в ПЦР с использованием наборов праймеров и проб, описанных выше (δΕ^ ГО ΝΟ: 6, 7 и 5). Высота пиков сигналов измерялась после определения конечной точки при использовании Т7 пробы.

Результаты внутривидовой охватываемости для ампликона 17.

- 30 027074

5	193	43,2
50000	190	217
50000	193	188
500	190	115
50	190	128
5	196	15,7
5	190	35,4
50000	193	184
50000	193	198
500	190	125
50	190	93,8
5	196	49,8
5	202	45

- 31 027074

50000	193	146
50000	190	135
500	ΝΡ	ΝΡ
50	196	36,4
5	ΝΡ	ΝΡ
5	ΝΡ	ΝΡ
50000	193	201
50000	193	151
500	193	72,4
50	193	79,3
5	ΝΡ	ΝΡ
5	199	14,2
50000	193	204
50000	190	179
500	196	126
50	199	149

- 32 027074

5	202	36,8
5	ΝΡ	ΝΡ
50000	193	91,1
50000	196	80,5
500	202	38,9
500	199	42,1
5	ΝΡ	ΝΡ
5	202	10,2
50000	196	200
50000	202	246
500	193	64,3
50	205	97,5
5	196	14,3
5	205	17,6

- 33 027074

50000	190	166
50000	190	204
500	193	114
50	190	107
5	196	16,5
5	196	42,3
50000	208	181
50000	193	144
500	196	52,1
50	193	49,2
5	ΝΡ	ΝΡ
5	ΝΡ	ΝΡ
50000	193	181
50000	190	204
500	211	111
50	193	73,5

- 34 027074

	5	ΝΡ	ΝΡ
5	ΝΡ	ΝΡ
1_1	50000	199	188
50000	196	247
500	ΝΡ	ΝΡ
50	199	147
5	193	191
5	196	32,7
1_2	50000	196	200
50000	214	403
500	196	135
50	199	123
5	199	62,5
5	199	68,6
ЬЗ	50000	196	258
50000	199	247
500	193	171
50	193	122
5	199	34,3
5	202	15,4
ПЦР контроли	Позитивный	193	146
Позитивный	193	147
Негативный	ΝΡ	ΝΡ
Негативный	ΝΡ	ΝΡ

Заключение.

Внутривидовая охватываемость.

При использовании набора праймеров (5Е9 ГО ΝΟ: 6 и 8ЕС) ГО ΝΟ: 7) и проб (5Е9 ГО ΝΟ: 5) для геномного ампликона 17 все серовары амплифицируются и определяются электрохимически при присутствии 5 копий, за исключением сероваров ϋ, I и К. Как докладывалось с серотипом О, с использованием наборов праймеров и проб для геномного ампликона 17 было показано, что Ώ способен амплифицироваться, начиная с 50 копий, I - с 50 копий и К - с 50 копий.

- 35 027074

Пример 5. Идентификация и однозначность генов-мишеней Рес1оЬас1ег1ит аДозреИсит для использования в качестве внутреннего контроля.

Геном Рес1оЬас1ег1ит а1гозреИсит размером 5064 тысяч пар оснований ^о. ВХ950851) был загружен с веб-сайта NСВI РиЬтеб (ййр://\\\.псЪгп1т.тк£оу/РиЪМе0/). Геном Рес1оЬас1ег1ит аДозрейсит полностью описан в смысле названия генов, их функции и локализации, включая гипотетические гены. Для исследования было отобрано 3 гена.

Это были гПаН, кодирующий транскрипционный белок-активатор (длиной 489 пар оснований (п.о.) со стартовой позицией в 230144 в обратной ориентации), тдзА, кодирующий метилглоксалсинтетазу (длиной 458 п.о. со стартовой позицией в 2008746 в обратной ориентации), и ген, кодирующий гипотетический белок, обозначенный НР1 (длиной 387 п.о. со стартовой позицией в 143610 в обратной ориентации). Поиск этих генов в программе NСВΓз В1аз1п ййр://ЫазйпсЪгп1т.тй.£оу/В1азйс£17РАОЕ=^с1еоййез&РК0ОКАМ=Ыаз1п&МЕОАВЕА8Т=оп&ВЕА8Т_ РК0ОКАМ8=те§аВ1аз1&РАОЕ_ТУРЕ=В1аз18еагсй&8 110А_1)НГ'А1Л/Г8=оп) с набором фильтров показал, что подобные гены обнаружены только в самой Рес1оЪас1егшт а!гозерйсит и поэтому праймеры, разработанные для амплификации этих генов, не должны амплифицировать участки из других видов и не только бактерий.

Дизайн праймера/пробы.

Последовательность полноразмерного гена была выбрана с использованием программы С1опе Мападег. Функция разработки праймера была настроена таким образом, чтобы отобрать набор праймеров с оптимальной длиной праймера 20 п.о. (приемлемо 18-22 п.о.), амплифицирующих продукт от 90 до 150 п.о. для каждого гена. Критерии, предъявляемые к каждому праймеру, заключались в ОС% от 50 до 60, а температура плавления 50-80°С, количество совпадений на 3'-конце - менее 3, всего менее 7 гомологичных оснований, стабильность - не менее 1,2 ккал на 5'-конце против 3'-конца, по крайней мере одно О или С на 3'-конце, менее 4 оснований для достройки, менее 3 динуклеотидных повторов и отсутствие шпилек при температуре отжига 55°С. Было отобрано три набора праймеров, удовлетворяющих этим критериям, амплифицирующие 124 п.о. в гПаН, 91 п.о. в тдзА и 98 п.о. в НР1. Одноцепочечная ДНК проба была выбрана с использованием программы С1опе Мападег по следующим критериям: в ОС% от 50 до 60, а температура плавления 32-100°С, всего менее 5 гомологичных совпадений, менее 4 оснований для достройки, менее 3 динуклеотидных повторов и отсутствие шпилек при температуре отжига 42°С.

Тестирование праймера/пробы.

Начальная амплификация последовательностей-мишеней.

Три набора праймеров были тестированы, используя ПЦР с геномной ДНК из Рес1оЪас1егшт а!гозреИсит 8СЫ1043, доступного из банка АТСС и имеющего номер доступа ВАА-672. Симметричная ПЦР была поставлена по рецепту, показанному в табл. 4, и при условиях, отраженных в табл. 4 и 5.

Таблица 4

Условия реакции для симметричного тестирования

	Объем/реакция, мкл
Юх Буфер для ПЦР	3
Хлорид магния, 25 мМ	1,8
Набор дезоксирибонуклеотидов, 6мМ	3
Прямой праймер, ЮмкМ	1,5
Обратный праймер, ЮмкМ	1,5
Тая полимераза, 5 единиц/мкл	0,3
(ДНК, 2 нг/мкл)	2
Вода	16,9
Всего	30

- 36 027074

Таблица 5

Условия циклизации ПЦР

После термоциклирования 10 мкл амплифицированной ДНК были разогнаны в 1,5% агарозном геле. После электрофореза гель был сфотографирован в УФ-свете. В качестве сравнения использовали цепь ДНК из 100 п.о., все наборы праймеров амплифицировали продукты с ожидаемой длиной. Предел определения выполнялся трижды с использованием различных количеств геномной ДНК Рес1оЪас1егшт а!гокреИсит. В идентичных ПЦР и при тех же условиях термоциклирования г£аН амплифицировался во всех уровнях, начиная с 2 нг (366468 копий) до 2 пг (366 геномных копий), в то время как тдкА и НР1 детектировались на уровне от 2 нг до 200 фг (37 геномных копий). Негативные контроли были включены.

Пример 6. Симметричная и асимметричная амплификация с использованием электрохимических проб.

Электрохимические пробы в соответствии с каждой из последовательностей трех проб были синтезированы с использованием ферроценовых меток. 2 нг геномной ДНК Рес1оЪас1егшт а1гокреИсит амплифицировались в трехкратных реакциях с набором праймеров, соответствующим г£аН, тдкА и НР1 по рецепту симметричной ПЦР (показанному в табл. 5) или асимметричной ПЦР по рецепту, показанному в табл. 6, при условиях термоциклирования, показанных в табл. 5. Тройные негативные (только вода) контроли были поставлены в тройных реакциях для каждого набора праймеров и каждых условий амплификации.

Таблица 6

Условия ПЦР для асимметрического тестирования

	Объем/реакция мкл
10х Буфер для ПЦР	3
Хлорид магния, 25мМ	1,8
Набор дезоксирибонуклеотидов, 6мМ	3
Праймер, ЮмкМ в избытке*	1,5
Праймер, ЮмкМ не в избытке*	0,2
Тар полимераза, 5 ед./мкл	0,3
(ДНК, 2нг/мкл)	2
Вода	18,2
Всего	30

* Праймеры в избытке: г!аН обратный, тдкА прямой и НР1 обратный.

После симметричной ПЦР 10 мкл каждой реакции были разогнаны в 1,5% агарозном геле для ви- 37 027074 зуализации продукта ПЦР. Это подтвердило присутствие продукта ПЦР.

Подходящая мастер-смесь была приготовлена для каждой ампликон-специфичной пробы 14-151, как показано в табл. 7.

Таблица 7

Мастер-смесь для электрохимического определения

Реагент	Концентрация	Конечная концентрация	Единичная реакция
Ампликон-специфичная проба	100 мкМ	3 мкМ	0,75 мкл
Т7 экзонуклеаза	10000 единиц/мл	10 единиц	1,0 мкл
Вода	нет данных	нет данных	3,25 мкл

После ПЦР 20 мкл реакции были добавлены к 5 мкл мастер-смеси и реакции были инкубированы при 37°С 20 мин. Вслед за инкубацией были измерены электрохимические потенциалы при следующих параметрах Автолаб:

Предварительная обработка: потенциал кондиционирования (V): 0, продолжение: 0 с, депозиционный потенциал: 0, продолжение: 0 с, время уравновешивания: 0.

Измерение: ячейка после измерения X, время модуляции (>=0,0025): .04, интервал времени (>=0,105): .1.

Потенциалы: начальный: -0,1, конечный: 0,5, шаг: 0,003, амплитуда модуляции: 0,04995, потенциал покоя (V): 0.

Предварительная обработка: остановка уравновешивания на пороге: нет, порог уравновешивания (А): 0,05.

Другое: число сканирований: 1.

Среднее (п=3) полученных значений записывалось в табл. 8.

- 38 027074

Таблица 8

Объединенные электрохимические данные, полученные для каждого набора ампликонов/проб

	Положение пика, мВ	Высота пика, нА
Ампликон	Условия	Тип	Среднее	Стан- дартное откло- нение	Коэф- фициент вариа- ции
ИаН	Асиммет ричная ПЦР	Позитивный	194	280,67	19,6	6,98
Негативный	180	39,93	1,85	4,63
тдзА	Асиммет ричная ПЦР	Позитивный	189	206,33	49,2	23,85
Негативный	187	25,77	2,47	9,58
НР1	Асиммет ричная ПЦР	Позитивный	190	611,33	15,37	2,51
Негативный	177	53,7	5,29	9,85

Данные, представленные в табл. 8, ясно показывают, что высота пика при использовании пробы НР1 была больше других пиков при наблюдаемой средней высоте пиков 611,33 нА. При том, что средняя высота пиков негативных результатов составляла 53,7, это дает большую дистанцию между положительными и отрицательными сигналами. При асимметрических реакциях место пика НР1 в позитивных реакциях было таким же, как и в негативных реакциях и давало низкое стандартное отклонение и коэффициент вариации. Наборы ампликонов/проб тдзА давали низкое разрешение, наборы ампликонов/проб г£аН давали хорошее разрешение, однако не такое хорошее, как при наборах НР1. Поэтому набор праймеров/проб НР1 был выбран для постановки внутренних контролей. Отобранный прямой праймер соответствовал БРО ГО N0: 11. Отобранный обратный праймер соответствовал БРО ГО N0: 12. Отобранная проба соответствовала БРО ГО N0: 14.

Пример 7. Внешневидовая исключительность набора праймеров и проб внутреннего контроля.

Введение.

Существенно, чтобы исследование внутренних контролей было высокоспецифичным и чтобы не было перекрестных реакций с другими видами ДНК из образцов пациентов, например человеческой или любых других инфекционных организмов.

Образцы ДНК из линейки бактерий были тестированы против соответствующих внутреннему контролю набора праймеров (БЕР ГО N0: 11 и 12) и пробы (БЕР ГО N0: 14), чтобы проверить внешневидовую исключительность с помощью метода ПНР и Т7 пробы с дальнейшим анализом.

Наборы геномных праймеров были тестированы против перечня геномных ДНК организмов, перечень которых указан в результатах.

Полученные результаты были измерены как высота пиков после ПЦР и определений с пробой Т7 экзонуклеазы. Тесты были выполнены с постановкой контролей в каждой серии экспериментов.

Результаты внутреннего контроля.

Набор праймеров и проб Рес1оЬас1ег1ит а(тозерйсшт был тестирован на образцах ДНК, происходящих из набора микроорганизмов. Результаты двойных экспериментов представлены ниже:

- 39 027074

Вид	Положение пика (мВ)	Высота пика (нА)
Ас1пе{оЬас1ег Ьаитапн	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Ас1пек>Ьас1ег депозрес1ез 9	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Ас1пе1оЬас1ег Ьаето1у1юиз	Нет пика	Нет пика
202	26,0
Апаегососсиз 1е1гаЫиз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
АгсапоЬас1епит руодепез	Нет пика	Нет пика
202	30,2
ВасШиз сегеиз	202	20,3
Нет пика	Нет пика

- 40 027074

Вас1его1с1е5 ТгадШз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Вас1его1с1е5 1Не1аю1атгсгоп	Нет пика	Нет пика
202	35,3
Вас1его1с1е5 уи1да1и2	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
В№с1оЬас1епит Ьгеуе	193	16,8
Нет пика	Нет пика
Вогс1е1е11а ρθιΐιΐδδϊδ	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ВигкИо1с1епа серасиа	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
СИгоЬасДег сПуегзиз	205	19,8
Нет пика	Нет пика
С1оз{псПит сйЯгсНе	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
СогупеЬас1епит игит	Нет пика	Нет пика

- 41 027074

	Нет пика	Нет пика
Еп1егоЬас1ег аегодепез	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Еп1егососсиз саззеПИауиз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Еп1егососсиз сПзраг	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Егбегососсиз даШпагит	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Егбегососсиз типсИи	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Егйегососсиз гаНюозиз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ЕзсЬепсЫа ЬегтапП	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Е|педо1сПа тадпа	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика

- 42 027074

Сагс1пеге11а уадтаНз	211	46,0
Нет пика	Нет пика
НаеторИПиз тЛиепгае	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Найма акте!	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
К1еЬз1е11а охуЮса	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
1.ас1оЬас|11и5 сазе!	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
1_ас4оЬасН1из спзраФз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
1_ас1оЬас|Пиз ρηννριϊ	Нет пика	Нет пика
211	31,4
1_ас1о0асН1из геи1еп	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
из1епа тпосиа	Нет пика	Нет пика

- 43 027074

	211	36,0
МоЬПипсиз сигЬзн 5иЬ5р.Но1те5н	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
МоЬПипсиа тиПепз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
МогахеНа са1аггНаПз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
МогдапеНа тогдапи еиЬбр. Могдапп	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
МогахеНа οείοβπδΐδ	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
МогахеНа тогдап	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
РагДоеа адд1отегапа	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ΡβρΐοδΐΓβρίοοοοοιίδ апаегоЬние	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика

- 44 027074

Ргеуо1е11а Ьма	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
РгорюгнЬас1епит аспез	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
РгоЪэиз геИдеп	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ЗеггаНа тагсезсепззиЬзр. тагсезсепз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ЗЫдеНа Яехпеп	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
5Ыде11а δοηηβϊ	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51арНу1ососсиз сарИ13 зиЬзр. сарШз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
5{арНу1ососсиз Наето1у11си5	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
31арНу1ососсиз Ηοιτιίηίδ	Нет пика	Нет пика

зиЬзр. ΗοιτΓιηίδ

- 45 027074

31арЬу1ососсиз ю^егтесЛиз

51арИуососсиз заргорпубсиз зиЬзр.

заргорЬуйсиз

51епо1горЬотопаз та11орИ|||а

31гер1ососсиз апдтозиз

31гер1ососсиз аизТгаПз

81гер1ососсиз ϋονϊδ

51гер1ососсиз сопз1е11а1из зиЬзр. сопз{е11а1из

31гер1ососсиз едитиз

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

214

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

Нет пика

37,9

Нет пика

Нет пика

Нет пика

- 46 027074

51гер1ососсиз ροΓόοηίί	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
31гер1ососсиз ιηίίίδ	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51гер1ососсиз птЛапз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51гер1ососсиз огаНз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
31гер1ососсиз рогсйпиз	Нет пика	Нет пика
217	39,8
51гер1ососсиз зшз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51гер1ососсиз иЬепз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Уегз1'т'а егДегосоПОса зиЬзр. еп1ег осоНОса	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51гер1ососсиз руодепез	Нет пика	Нет пика

- 47 027074

	Нет пика	Нет пика
Еп1егоЬас1ег с1оасае	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
1_ас1ососси5 1асй5	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ΟΙοδίπάΐιιιτι регМпдепз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
К1еЬ51е11а рпеитогнае	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Рзеиботопаз аегид1поза	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
ЕзсИеп'сМа соН	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Ргсйеиз уи1дапа	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Сатру1оЬас1ег соН	Нет пика	Нет пика
245	24,3

- 48 027074

51арИу1ососсиз аигеиз	224	39,2
Нет пика	Нет пика
51гер1ососсиз рпеитогиае	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51гер1ососсиз 0узда1асйае	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Ното зар1епз	199	19,6
Нет пика	Нет пика
ΝθίδθΓπβ допоггКоеае	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
СапсЛс1а а1Ьюапз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
51гер1ососсиз ада1асйае	236	17,9
220	41,9
ТпсНотопаз уадтаНз	Нет пика	Нет пика
Нет пика	Нет пика
Мусор1азта депйаПит	208	10,9

- 49 027074

Пример 8. Дальнейший тест праймера и пробы хромосомного ампликона 17 против СН1атуФа 1гасНотаЙ8.

Мастер-смесь для ПЦР была приготовлена, как описано ниже.

Мастер-смесь была разделена на аликвоты по 12,5 мкл. ДНК, экстрагированная из 1,000, 100, 10 и 0 С.1гасНотай8 элементарных тел, добавлялась в объеме 12,5 мкл. Образцы затем инкубировались для достижения активности УДГ и их денатурировали с последующей ПЦР, как описано ниже.

- 50 027074

Ступень цикла	Температура	Продолжение
1	37	10 минут
2	94	10 минут
3	94	30 секунд
4	58	45 секунд
5	72	60 секунд
6	Возвращение к ступени 3, повтор 39 раз
7	72	7 минут

Амплифицированные образцы были использованы как мишени для последующих исследований с использованием 0,8 единиц Т7 экзонуклеазы 4и 9 мкМ специфичной пробы с последовательностью 8Е^ ГО N0: 5 (конечная концентрация в реакции). Каждый образец был исследован троекратно. Детекционная смесь была получена объединением.

Материалы	1х	ЗОх
МЕ17 проба	1,125	33,75
Т7 экзонуклеаза	0,2	6,0

1,325 мкл каждой детекционной смеси было добавлено к 11,175 мкл каждого амплифицированного образца троекратно и помещено на 20 мин при 37°С перед вольтамперметрическим анализом со свежими электродами при следующих Ли1о1аЪ:

Предварительная обработка: потенциал кондиционирования (V): 0, продолжение: 0 с, депозиционный потенциал: 0, продолжение: 0, время уравновешивания: 0.

Измерение: ячейка после измерения X, время модуляции (>=0,0025): .04, интервал времени (>=0,105): .1.

Потенциалы: начальный: -0,1, конечный: 0,5, шаг: 0,003, амплитуда модуляции: 0,04995, потенциал покоя (V): 0.

Предварительная обработка: остановка уравновешивания на пороге: нет, порог уравновешивания (А): 0,05.

Другое: число сканирований: 1.

Записывались высота пика и точное положение пика при локализации от 150 до 200 мВ. Результаты показаны на фиг. 8.

Представленные данные доказательно демонстрируют преимущества применения раскрытых праймеров, проб и методов в синглексных (§т§1ех) реакциях, поскольку в вышеперечисленных экспериментах не было попыток использовать дуплексной ПЦР, в которых СЫатуФа 1гасйотаИ§ и внутренние контроли амплифицировались вместе в одной пробирке при последующей детекции каждого ампликона. Поэтому были поставлены следующие эксперименты.

Пример 9. Первое испытание дуплекса.

Раскрытие метода.

Обе синглексные реакции, описанные выше, были повторены, но с добавлением набора праймеров специфичных для второго аналита и ДНК второго аналита.

Результаты.

Было обнаружено в дуплексной реакции нечто понижающее высоту пиков для мишеней хламидии. Эффект можно увидеть на фиг. 9 в эксперименте, где набор хламидийных хромосомных праймеров МЕ17 был испытан с или без набора праймеров внутреннего контроля и с или без 200 пг ДНК внутреннего контроля. Фиг. 4 ясно показывает, что амплификация С.1гасйотаИ§ в присутствии набора праймеров внутреннего контроля и без ДНК внутреннего контроля отрицательно влияет на электрохимический сигнал, определяющий пробу С.1гасйотаИ§. Тот же эксперимент был выполнен с использованием внутренней контрольной пробы, чтобы электрохимически определить внутренний контрольный ампликон. Полученные данные представлены на фиг. 10.

Фиг. 10 демонстрирует неожиданно сильное уменьшение электрохимического сигнала внутреннего контроля, ожидаемого для синглексной ПЦР с применением внутренних контрольных праймеров и

- 51 027074

200 пг хромосомной внутренней контрольной молекулы-мишени, когда, как правило, наблюдался пик более 1000 нА. Это любопытные данные, поскольку в других дуплексных исследованиях не было помех при применении хромосомной ДНК-мишени с внутренним контролем. Суммируя данные, можно сказать, что наборы праймеров или СТгасйошайз или внутреннего контроля не функционируют в дуплексе СТгасйошайз - внутренний контроль. Эти данные были подтверждены при выполнении экспериментов с использованием симметричной ПЦР, амплифицирующей СЛгасйошайз с или без набора праймеров внутреннего контроля при визуализации продуктов на агарозном геле. Фотографии геля показаны ниже на фиг. 11 и 12 (только набор праймеров СТгасйошайз) и на фиг. 13 и 14 (набор праймеров СТгасйошайз с набором внутренних контрольных праймеров).

С другой стороны, когда были включены внутренние контрольные праймеры в аналогичную ПЦР, определение понизилось до уровня 1000 ΙΡυ/реакция, показывая, что наличие набора праймеров внутреннего контроля уменьшает эффективность амплификации СЛгасйошайз ΙΡυ на три порядка (определено гель-электрофорезом).

Были проведены дальнейшие эксперименты с симметричной ПЦР и ампликонами, детектируемыми в геле после электрофореза для того, чтобы повысить качество вышеописанного, чтобы определить который из праймеров внутреннего контроля мешает амплификации ДНК СЛгасйошайз. Этот эксперимент показал, что при амплификации СЛгасйошайз в присутствии прямого внутреннего контрольного праймера, ампликон правильного молекулярного веса уменьшился до уровня 10 СТгасйошайз ΙΡυ/реакцию. Однако, когда в реакцию был включен обратный внутренний контрольный праймер, предел обнаружения СЛгасйошайз увеличился до 10000 ΙΡυ/реакцию. Фотография геля также подтвердила, что в условиях ПЦР при использовании набора праймеров СЛгасйошайз и обратного праймера внутреннего контроля формируется сильный праймер-димер, идентифицируемый жирной низкомолекулярной полосой на геле.

Биоинформатический анализ обратного праймера внутреннего контроля и прямого и обратного праймеров СЛгасйошайз показал, что последние 5 п.о. на 3'-конце как прямого праймера внутреннего контроля, так и обратного праймера СЛгасйошайз были комплементарны, образовывая праймер-димеры, наблюдаемые на агарозном геле, и с трудом амплифицируя целевые последовательности в дуплексной реакции. Последовательности указаны ниже ' - ТТССАСАСССААТОССАААС-3 ' - С. йасЬотайз обратный ' - 6ТТТССТААСССТСААСТСС- 5 ' - 1С прямой

В соответствии с выдвинутой гипотезой похожесть последовательностей объясняла низкую амплификацию и детектирование СТгасйошайз в дуплексных реакциях, содержащих обратный праймер внутреннего контроля из-за образования праймер-димеров во время термоциклирования.

Предложенное решение проблемы предлагало изменить последовательность праймеров, с удалением 3' гомологии без редизайна. Было решено изменить обратный праймер СЛгасйошайз, поскольку существующий набор праймеров внутреннего контроля работал хорошо в настоящем дуплексном исследовании при использовании других ДНК-мишеней. Прямой праймер СЛгасйошайз был существенно корректирован с точки температуры плавления, а длина обратного праймера была увеличена за счет добавленных оснований. Новые прямой и обратный праймеры СТгасйошайз имели следующие последовательности:

Новый СТ прямой праймер: 5 ' -сааассйсас 1ад1садса1 саадс1адд-3 ' (5ЕО Ю ΝΟ: 17)

Новый СТ обратный праймер: 5 ' -адайссада ддсаа1дсса аадааа-3 ' (ЗЕО Ю ΝΟ: 19) дополнительных п.о., которые были добавлены к 5'-концу прямого СТ праймера, предполагали удлинение 5'-конца в соответствии с последовательностью геномной ДНК СТгасйошайз, для которой и разрабатывались праймеры. Однако ошибки в дизайне праймеров приводили к тому, что эти 7 п.о. фактически были комплементарны тем, которые предполагали включить. Тем не менее, это все равно приводило к достижению цели сближения температур плавления праймеров с сохранением перформанса, изначально наблюдаемого со старым прямым праймером СТгасйошайз (5Е9 ΙΓ) N0: 6).

Хотя эти 7 некомплементарных оснований были ошибочно добавлены к 5'-концу прямого праймера вместо 7 комплементарных оснований, ряд экспериментов был проведен с целью проверки нового набора праймеров СТгасйошайз в дуплексной реакции с ДНК внутреннего контроля и прямым и обратным праймерами. Вначале, симметричной ПЦР была проверена совместимость праймеров с последующим анализом ампликонов с помощью электрофореза в агарозном геле. С удивлением обнаружено, что эксперименты с новыми прямым и обратным праймерами СТгасйошайз изменили предел обнаружения до уровня 1 ΙΡυ, эквивалентно отраженного на фиг. 6а, Ь. Когда праймеры внутреннего контроля были добавлены в реакционную смесь, предел обнаружения изменился до 10 ΙΡυ (показано, что электрохимические эксперименты детектируют до 1 ΙΡυ). Эти улучшения наблюдаются на фиг. 7а, Ь. Дальнейшие экс- 52 027074 перименты тестировали способность набора новых праймеров С’ДгасНотаЦк и набора праймеров внутреннего контроля асимметрически амплифицировать 2 хромосомных ДНК-мишени при использовании дуплекс-реакции, с последующей электрохимической детекцией. Эти данные показаны на фиг. 8 Данные, показанные на фиг. 8, демонстрируют, что набор модифицированных праймеров С.(гасНота(1к, в сочетании с существующим набором праймеров внутреннего контроля, способен коамплифицировать в дуплексной ПЦР мишени с последующим определением мишеней электрохимическими методами.

Пример 10. Второе испытание дуплекса.

Дополнительные эксперименты были выполнены, чтобы оценить свойства удлиненного прямого праймера С.(гасНота(1к, который полностью комплементарен ДНК-мишени (8ЕЦ ГО N0: 18).

Результаты.

При использовании в ПЦР с обратным праймером 8ЕЦ ГО N0: 19 и пробой 8ЕЦ ГО N0: 5, в сочетании с предпочтительными внутренними контролями, прямой праймер 8ЕЦ ГО N0: 18 работает так же, как и прямой праймер 8ЕЦ ГО N0: 17. Фиг. 16 показывает сравнимые дуплексные эксперименты с использованием 3 мастер-смесей ПЦР. СТ обозначает величину С.йасйотайк, 1С показывает величину внутреннего контроля, 1РИ = инфекционная единица.

Реакции внутреннего контроля проводились с использованием праймеров 8ЕЦ ГО N0: 11 и 12 и пробы 8ЕЦ ГО N0: 14 повсюду. Мастер-смесь А использовала праймеры 8ЕЦ ГО N08; 6 и 7 и пробу 8ЕЦ ГО N0: 5 для С’ДгасНотаЦк и показала предел обнаружения от 10,000 до 1,000 1РИ.

Мастер-смесь В использовала праймеры 8ЕЦ ГО N08: 17 и 19 и пробу 8ЕЦ ГО N0: 5 для С’ДгасНотаЦк и показала предел обнаружения от 10 до 1 1РИ. Мастер-смесь С использовала праймеры 8ЕЦ ГО N08: 18 и 19 и пробу 8ЕЦ ГО N0: 5 для С’ДгасНотаЦк и показала предел обнаружения от 10 до 1 1Ри Данные, представленные в примерах 9 и 10, демонстрируют, что реакция амплификации нуклеиновых кислот с использованием прямых праймеров СДгасйотайк 8ЕЦ ГО N0: 17 и 18 и обратного праймера 8ЕЦ ГО N0: 19 особенно подходит для использования с внутренней контрольной нуклеиновой кислотой и амплифицирования в дуплексных реакциях. Хорошее качество амплификации с праймерами, имеющими последовательность 8ЕЦ ГО N0: 17, особенно удивительно, поскольку его последовательность не полностью комплементарна его мишени.

- 53 027074

Перечень последовательностей < 110 > Этлас Дженетикс Лимитид < 120> Способ обнаружения генетического материала СЫатусйа Насйотайз, зонд нуклеиновой кислоты (варианты), прямой (варианты) и обратный (варианты) праймеры ПЦР, их содержащий компонент ПЦР, содержащий вышеуказанный компонент набор и способ обнаружения генетического материала Рес1оЬас1епит айозерйсшт <130> 14308 У/о <160> 21 <170> Патентная версия 3.5 <210> 1 <211> 252 <212> ДНК < 213 > СЫатусйа 1 гасйотайз <400> 1 а1§ааПсаа а1а1а&аа1а 1১саа1а1 с§1а1а£а1а 1ас1£а§с1£ 11«а1с1§с 60

П^сиаШа 1§£т§£ас ас1а£1са£с а!саа§с1а§ §а§а11с1с1 а££а§£са1с 120 аисс1£§а1 £сИа££а1а с11ас1§§с1 ааа১аа§с а!с§сс§1сс 1§1сс§с1§§ 180

ПсПссПа сШШсП 1££са11£сс 1с1§§аа1с11сси§1с§11с11са1сс1 240 аа§саааа§1 аа 252 <2Ю> 2 <211> 32 <212> ДНК < 213 > Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ПЦР

- 54 027074 <400> 2

П£§асас1а £1са£са1са а£с1১а§а П 32 <2Ю> з <211> зо <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ПЦР <400> 3 §аа£аЦсса £а§§саа1£с сааа^ааааа 30 <210> 4 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Детектируемый зонд <400> 4 сс£1ссЦДс 1ссЦасШ Ш 33 <210> 5 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Детектируемый зонд

- 55 027074 <400> 5 с1§1сс£с!§ дПсИссП ас1 23 <210> 6 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ПЦР <400> 6 сас1ад1сад са1саа§с1а §§ 22 <210> 7 <211> 20 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ПЦР <400> 7

11сса£а§§с аа1§ссааа§ 20 <210> 8 <211> 387 <212> ДНК <213> Рес1оЬас1епит айозерйсит <400> 8 с1асс§1£1а §вд1са1а§в саДдасс1с а1§дс1ссас д§аа1с§1дс §а1сд1саас 60

- 56 027074

1£с£ас§1£с саИсаса§1 §с£1ааёа§с асс§с§аа1с 1с§§а1ааас ас1§§сасса

120 ё1§с1§1ас§ ссаа!сса§а Н^сИсНс с1с§с1§1с§ §£аа§Ш§§ и§аасс§£а

180

Ва§сас§а1с ссШссГаа а§ас§Дасс §аШ1саса 11§а§§§с§а аа1саа১а

240

ИсссавПс а§£сс1£1ас сс§1с§1саё а1аШс1са аШ££1са11ааса§аа1£

300 §с£и§ёас§ аШссНса с§§са§а1а1 οΐοΐίΐεΐ§§ с1с১§аи ППасёЮё

360 а§с££1£1аа 1а§аёс§ааа П§ссас

387 <210> 9 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ПЦР <400> 9 с1с§с1£1с§ ё§аа§Шёё и§аасс§ 28 <210> ю <211> 30 <212> ДНК < 213 > Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ПЦР <400> 10 аса££сс1§а ас1£££аа1с сШ^аШс 30

- 57 027074 <210> 11 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ПЦР <400> 11

1£1с££ёаае 18 <210> 12 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ПЦР <400> 12 сс1§аас1££ §аа1ссШё 20 <210> 13 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Детектируемый зонд <400> 13 §£а§а£сасё аЮссШсс 1ааа§ас§Ц асс 33

- 58 027074 <210> 14 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Детектируемый зонд <400> 14 §сас§а1ссс Шсс1ааа§ ас§ 23 <210> 15 <211> 39 <212> ДНК < 213 > Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ПЦР <400> 15

1§а1§5\\А\АУ8 5лусас1а§1с а§са!саа§с 1১а§аи 39 <210> 16 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223 > Праймер ПЦР <400> 16 а১аа§аП сса§а£§саа 1£ссааа§аа аааа§1 36

- 59 027074 <210> 17 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ПЦР <400> 17 сааасс1сас 1а§1са§са1 саа£с1а£§ 29 <210> 18 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ПЦР <400> 18 §т§£асас 1а§1са§са1 саа§с1а£§ 29 <210> 19 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ПЦР <400> 19 а§аПссаёа ££саа1§сса аа§ааа 26

- 60 027074 <210> 20 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ПЦР <400> 20

1§а1§сааас с1сас1а§1с а§са1саа£с 1а§£а§а11 39 <210> 21 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер ПЦР <400> 21

1ёа1§§т§ §асас1а§1с а§са1саа§с 1১а§аЦ 39

- 61 027074

Claims (34)

1. Способ обнаружения в исследуемом клиническом образце генетического материала СЫатуФа йасйотаШ, включающий обнаружение гибридизацией специфичной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидных остатков последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ: 1, охватываемой формулой

8ЕЦ ГО ΝΟ: 1: а!даайсаа а!а!адаа!а !аддсаа!а! сд!а!ада!а !ас!дадс!д ййа!с!дс йдс!аа!да 1ддй1ддас ас!ад!садс а!саадс!ад дадайс!с! аддаддса!с айсс!дда! дсйадда!а сйас1ддс! ааааддаадс акдссдкс 1дксдс1дд йсйссйа сйййсй 1ддсайдсс 1с1ддаак1 ксйдкд! кйсакс! аадсаааад! аа, или ее комплемента с возможным содержанием по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков.

2. Способ по п.1, в котором обнаруживают гибридизованную последовательность нуклеиновой кислоты.

3. Способ по п.1, в котором указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидных остатков последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ: 1.

4. Способ по п.3, который включает гибридизацию генетического материала СЫатуЛа йасйотаШс последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидных остатков последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ: 4, охватываемой формулой

8ЕЦ ГО ΝΟ: 4: ссд!сс!д!с сдс!ддйс! 1ссйас1й 1й, или ее комплемента с возможным содержанием по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков.

5. Способ по п.4, который включает гибридизацию генетического материала СЫатуЛа 1гас1ютаШ с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность §ЕЦ ГО ΝΟ: 5, охватываемую формулой

8ЕЦ ГО ΝΟ: 5: с!д!ссдс!д дйсйссй ас!, или ее комплемента с возможным содержанием по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков.

6. Способ по п.1, который включает гибридизацию генетического материала СЫатуЛа 1гасйотаЙ8 с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной зондом нуклеиновой кислоты, содержащим по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидных остатков последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ: 4, охватываемой формулой

8ЕЦ ГО νΟ: 4: ссд!сс!д!с сдс!ддйс! 1ссйас1й 1й, или ее комплемента с возможным содержанием по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков, при этом указанный зонд нуклеиновой кислоты содержит фрагмент, связывающийся с малой бороздкой, или представляет собой блокированную нуклеиновую кислоту.

7. Способ по любому из пп.1-6, в котором перед обнаружением специфичной последовательности проводят амплификацию последовательности нуклеиновой кислоты, определяемой посредством полимеразной цепной реакции, или амплификацию, опосредованную транскрипцией, или амплификацию, основанную на последовательности нуклеиновых кислот, или геликаза-зависимую амплификацию, или рекомбинантную полимеразную амплификацию, или амплификацию с замещением цепей, или изотермическую амплификацию с формированием петель.

8. Способ по п.7, в котором обнаружение специфичной последовательности включает полимеразную цепную реакцию.

9. Способ по п.8, в котором полимеразная цепная реакция включает использование прямого праймера ПЦР и обратного праймера ПЦР, причем прямой праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 17 до 34 последовательных нуклеотидных остатков последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ: 15, охватываемой формулой

8ЕЦ ГО ΝΟ: 15: 1да1д-д/с-1/а-1/а-1/а-д/с-д/с-а/1-сас1ад!с адса!саадс 1аддадай, а обратный праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 15 до 31 последовательных нуклеотидных остатков последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ: 16, охватываемой формулой

8ЕЦ ГО ΝΟ: 16: ааддаада!! ссададдсаа !дссааадаа аааад!, или прямой праймер ПЦР содержит последовательность нуклеиновой кислоты, являющейся комплементом обратного праймера ПЦР, включающего последовательность нуклеиновой кислоты, содержащей от 15 до 31 последовательных нуклеотидных остатков последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ: 16, а обратный праймер ПЦР содержит последовательность нуклеиновой кислоты, являющейся комплементом прямого праймера ПЦР, включающего последовательность нуклеиновой кислоты, содержащей от 17 до 34 последовательных нуклеотидных остатков последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ: 15, при этом вышеуказанные последовательности нуклеиновой кислоты имеют возможное содержание по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков.

- 62 027074

10. Способ по п.9, в котором указанный прямой праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, выбранную из группы, включающей §ЕЦ ГО N0: 17, §ЕЦ ГО N0: 18 и §ЕЦ ГО N0: 6, охватываемые формулами:

8ЕЦ ГО N0: 6: сас!ад!сад са!саадс!а дд,

8ЕЦ ГО N0: 17: сааасс!сас 1ад1садса1 саадсШдд,

8ЕЦ ГО N0: 18: дШддасас 1ад1садса1 саадсШдд, указанный обратный праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 19 и 8ЕЦ ГО N0: 7, охватываемые формулами:

8ЕЦ ГО N0: 7: йссададдс аа1дссааад,

8ЕЦ ГО N0: 19: адайссада ддсаа1дсса аадааа.

11. Способ по п.8 или 10, в котором полимеразная цепная реакция включает использование зонда нуклеиновой кислоты, включающего последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 18 до 28 нуклеотидных остатков последовательности 8Е0 ГО N0: 4, охватываемой формулой

8Е0 ГО N0: 4: ссд1сс1д1с сдШддйс! 1ссйасШ Ш, или ее комплемента с возможным содержанием по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков.

12. Способ по п.11, в котором указанный зонд нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность 8Е0 ГО N0: 5, охватываемую формулой

8Е0 ГО N0: 5: с1д1ссдс1д дйсйссй ас!.

13. Способ по п.8, в котором полимеразная цепная реакция включает использование прямого праймера ПЦР и обратного праймера ПЦР, причем прямой праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 12 до 29 или от 19 до 29 последовательных нуклеотидных остатков последовательности 8ЕЦ ГО N0: 15, охватываемой формулой

8ЕЦ ГО N0: 15: 1да1д-д/с-1/а-1/а-1/а-д/с-д/с-а/1-сас1ад1с адса!саадс 1аддада11, а обратный праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 16 до 26 последовательных нуклеотидных остатков последовательности 8ЕЦ ГО N0: 16, охватываемой формулой

8ЕЦ ГО N0: 16: ааддаадай ссададдсаа (дссааадаа аааадЕ или прямой праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой комплемент к обратному праймеру ПЦР, включающему последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 16 до 26 последовательных нуклеотидных остатков последовательности 8Е0 ГО N0: 16, а обратный праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой комплемент к прямому праймеру ПЦР, включающему последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 12 до 29 или от 19 до 29 последовательных нуклеотидных остатков последовательности 8Е0 ГО N0: 15, при этом указанные последовательности нуклеиновой кислоты имеют возможное содержание по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замен остатков, а указанные праймеры включают фрагмент, связывающийся с малой бороздкой, или представляют собой блокированные нуклеиновые кислоты.

14. Прямой праймер ПЦР, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 17 до 34 последовательных нуклеотидных остатков последовательности 8ЕЦ ГО N0: 15, охватываемой формулой

8ЕЦ ГО N0: 15: 1да1д-д/с-1/а-1/а-1/а-д/с-д/с-а/1-сас1ад1с адса!саадс 1аддада11, с возможным содержанием по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков.

15. Прямой праймер ПЦР по п.14, который включает последовательность нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 17, 8ЕЦ ГО N0: 18 и 8ЕЦ ГО N0: 6, охватываемых формулами:

8Е0 ГО N0: 6: сас1ад1сад са!саадс!а дд,

8ЕЦ ГО N0: 17: сааасс!сас 1ад1садса1 саадс!адд,

8ЕЦ ГО N0: 18: дШддасас 1ад1садса1 саадс!адд.

16. Обратный праймер ПЦР, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 15 до 31 последовательных нуклеотидных остатков последовательности 8ЕЦ ГО N0: 16, охватываемой формулой

8Е0 ГО N0: 16: ааддаадай ссададдсаа (дссааадаа аааад!, с возможным содержанием по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков.

17. Обратный праймер ПЦР по п.16, который включает последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 19 или 8ЕЦ ГО N0: 7, охватываемых формулами:

8Е0 ГО N0: 7: йссададдс аа!дссааад,

8Е0 ГО N0: 19: адайссада ддсаа!дсса аадааа.

- 63 027074

18. Зонд нуклеиновой кислоты, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 18 до 28 нуклеотидных остатков последовательности 8ЕЦ ГО N0: 4, охватываемой формулой

5>ЕЦ ГО N0: 4: ссд!сс!д!с сдс!ддйс! 1ссйасШ Ш, или ее комплемента с возможным содержанием по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков.

19. Зонд по п.18, который включает последовательность нуклеиновой кислоты, представленную последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 5, охватываемую формулой

5>ЕЦ ГО N0: 5: с!д!ссдс!д дйсйссй ас!.

20. Прямой праймер ПЦР, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 19 до 29 последовательных нуклеотидных остатков последовательности 8ЕЦ ГО N0: 15, охватываемой формулой

8ЕЦ ГО N0: 15: 1да1д-д/с-1/а-1/а-1/а-д/с-д/с-а/1-сас1ад1с адса!саадс 1аддадай, или обратный праймер ПЦР, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 16 до 26 последовательных нуклеотидных остатков последовательности 8ЕЦ ГО N0: 16, охватываемой формулой

8ЕЦ ГО N0: 16: ааддаадай ссададдсаа !дссааадаа аааад!, или зонд нуклеиновой кислоты, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 13 до 23 последовательных нуклеотидных остатков последовательности 8ЕЦ ГО N0: 4, охватываемой формулой

5>ЕЦ ГО N0: 4: ссд!сс!д!с сдс!ддйс! 1ссйас1й 1й, или ее комплемента с возможным содержанием по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков, при этом указанный прямой праймер ПЦР, указанный обратный праймер ПЦР и указанный зонд нуклеиновой кислоты включают фрагмент, который связывается с малой бороздкой или в котором указанный прямой праймер ПЦР, указанный обратный праймер ПЦР и указанный зонд нуклеиновой кислоты представляют собой запертые нуклеиновые кислоты.

21. Прямой праймер ПЦР по любому из пп.14, 15 или 20, обратный праймер ПЦР по любому из пп.16, 17 или 20 или зонд нуклеиновой кислоты по любому из пп.18-20, которые соединены с электрохимически активной меткой.

22. Компонент ПЦР, включающий прямой праймер ПЦР по любому из пп.14, 15 или 20 и обратный праймер ПЦР по любому из пп.16, 17 или 20.

23. Компонент по п.22, который дополнительно включает зонд нуклеиновой кислоты по любому из пп.18-20.

24. Компонент по п.22 или 23, который дополнительно включает геномную ДНК Рес1оЪас1егшт айокерйсшт, которую используют в качестве внутреннего положительного контроля.

25. Компонент по п.24, в котором указанная Рес1оЪас1егшт айокерйсшт представляет собой штамм АТСС ВАА-672.

26. Компонент по любому из пп.22-25, который дополнительно включает второй прямой праймер ПЦР и второй обратный праймер ПЦР, выполненные с возможностью гибридизации с последовательностью матричной нуклеиновой кислоты, содержащейся в последовательности нуклеиновой кислоты 8ЕЦ ГО N0: 8, охватываемой формулой

8ЕЦ ГО N0: 8: с!ассд!д1а ддд!са!адд сайдасс!с а!ддс!ссас ддаа!сд!дс да!сд!саас !дсдасд!дс сайсасад! дсд!аададс ассдсдаа!с !сдда!ааас ас!ддсасса д!дс!д1асд ссаа!ссада йдсйсйс с!сдс!д!сд ддаадШдд йдаассдда дадсасда!с ссШсс!аа адасдйасс даййсаса йдадддсда аа!сааадда йсссадйс аддсс!д!ас ссд!сд!сад а!аШс!са аШдд1са! !аасадаа!д дсдйддасд аШссйса сддсада!а! с!сШс1дд с!садддай ййасд!сд адсдд!д!аа !ададсдааа йдссас, или ее комплемента с возможным содержанием по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков.

27. Компонент по п.26, в котором второй прямой праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 13 до 23 последовательных нуклеотидных остатка последовательности 8ЕЦ ГО N0: 9, охватываемой формулой

8ЕЦ ГО N0: 9: с!сдс!д!сд ддаадШдд йдаассд, а второй обратный праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 15 до 25 последовательных нуклеотидных остатков последовательности 8ЕЦ ГО N0: 10, охватываемой формулой

8ЕЦ ГО N0: 10: асаддсс!да ас!дддаа!с сШдаШс, или второй прямой праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой комплемент к обратному праймеру, включающему последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 15 до 25 последовательных нуклеотидных остатка последовательности 8ЕЦ ГО N0: 10, а второй обратный праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой комплемент к прямому праймеру ПЦР, включающему последовательность

- 64 027074 нуклеиновой кислоты, содержащую от 13 до 23 последовательных нуклеотидных остатков последовательности §ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 9, причем указанные последовательности нуклеиновой кислоты имеют возможное содержание по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков.

28. Компонент по п.27, в котором второй прямой праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты §ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 11, охватываемую формулой §ЕЦ ГО νΟ: 11: 1д1сдддаад Шддйд, а второй обратный праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты §ЕЦ ГО ΝΟ: 12, охватываемую формулой §ЕЦ ГО νΟ: 12: сйдаайдд дайссШд.

29. Компонент по п.26, в котором второй прямой праймер ПЦР или второй обратный праймер ПЦР, не определенные ниже, являются такими, как они определены в п.28, при этом второй прямой праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 8 до 18 последовательных нуклеотидных остатков последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ: 9, охватываемой формулой §ЕЦ ГО ΝΟ: 9: сйдйдйд ддаадШдд йдаассд, а второй обратный праймер ПЦР включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от 10 до 20 последовательных нуклеотидных остатков последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ: 10, охватываемой формулой §ЕЦ ГО ΝΟ: 10: асаддсйда айдддаай сШдаШс, с возможным содержанием по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков, при этом указанные вторые праймеры включают фрагмент, связывающийся с малой бороздкой, или представляют собой запертые нуклеиновые кислоты.

30. Компонент по любому из пп.24-29, в котором полимеразная цепная реакция включает использование второго зонда нуклеиновой кислоты, включающего последовательность нуклеиновой кислоты, содержащей от 18 до 28 нуклеотидных остатков последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ: 13, охватываемой формулой §ЕЦ ГО ΝΟ: 13: ддададсасд айссШсс 1ааадасдй асс, или ее комплемента с возможным содержанием по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков.

31. Компонент по п.30, в котором зонд нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты §ЕЦ ГО ΝΟ: 14, охватываемую формулой §ЕЦ ГО ΝΟ: 14: дсасдайсс Шсс1ааад асд.

32. Компонент по любому из пп.24-29, в котором полимеразная цепная реакция включает использование второго зонда нуклеиновой кислоты, включающего последовательность нуклеиновой кислоты, содержащей от 13 до 23 нуклеотидных остатков последовательности §ЕЦ ГО ΝΟ: 13, охватываемой формулой §ЕЦ ГО ΝΟ: 13: ддададсасд айссШсс 1ааадасдй асс, или ее комплемента с возможным содержанием по большей мере 5 мутаций, выбранных из группы, включающей вставки остатков, делеции остатков и замены остатков, при этом указанный зонд нуклеиновой кислоты включает фрагмент, связывающийся с малой бороздкой, или представляет собой блокированную нуклеиновую кислоту.

33. Набор, включающий компонент ПЦР по любому из пп.22-32 и инструкцию осуществления способа по любому из пп.1-13.

34. Способ обнаружения генетического материала внутреннего контроля Рес1оЬас1епит айокерйсшт, включающий обнаружение специфичной последовательности нуклеиновой кислоты, заключенной в хромосоме Рес1оЬас1епит айокерйсшт.

- 65 027074

Плазмидный ампликон 3 - Предел определения (Ь0О)

Плазмидный ампликон 5 - Предел определения (Ь0О)

Плазмидный ампликон 7 - Предел определения (Ь0О)

Элементарных тел/ реакцию

Фиг. 3

- 66 027074

Хромосомный ампликон 9 - Предел определения (1.00)

Хромосомный ампликон 17 - Предел определения (1,01))

Хромосомный ампликон 18 - Предел определения (1.0Ι))

- 67 027074

Хромосомный ампликон 17 - Предел определения (ΌΟΌ) при использовании конечной концентрации хлорида магния 5,0 мМ МдС1₂

Хромосомный ампликон 17 - Предел определения (ΌΟΌ) при использовании конечной концентрации хлорида магния 5,0 мМ МдС1₂

И Репликат1 □ Репликат2

Полосы ошибок показывают стандартное отклонение (п=3) Фиг. 8

Фиг. 9

0 МЕ17 праймеры + 200пг ДНК внутреннего контроля □ МЕ17 праймеры без ДНК внутреннего контроля ρη МЕ17 праймеры и праймеры внутреннего контроля ^ш + 200пг ДНК внутреннего контроля 0 МЕ17 праймеры и праймеры внутреннего контроля без ДНК внутреннего контроля

- 68 027074

Фиг. 10

0 МЕ17 праймеры + 200пг ДНК внутреннего контроля □ МЕ17 праймеры без ДНК внутреннего контроля щ МЕ17 праймеры и праймеры внутреннего контроля + 200пг ДНК внутреннего контроля □ МЕ17 праймеры и праймеры внутреннего контроля без ДНК внутреннего контроля

Фиг. 11

Фиг. 12

- 69 027074

Фиг. 13

Фиг. 14

Электрохимическое определение образцов, амплифицированных в дуплексной ПЦР с использованием праймеров для С. ТгасНотаОз и праймеров внутреннего контроля. 200 пг ДНК внутреннего контроля было добавлено ко всем образцам. Полоса ошибок показывает стандартное отклонение (п=3).

Средняя высота электрохимического пика (нА)

Фиг. 15

- 70 027074

1-η Состояние ^ш праймера _π С. ТгасИотайз ^и потенциал

Фиг. 16