JP2017509324A - エラーのないｄｎａシークエンシング - Google Patents
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Abstract
本発明は、エラーのないＤＮＡシークエンシングの新規方法に関する。さらに、本発明は、固定配列、ランダム化配列、制限ヌクレアーゼ認識部位および／または制限部位、ならびにプライマー結合部位を含む、４部分オリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、ＤＮＡ配列解析、細胞系統樹の生成またはコピー数の評価のための方法における、本発明の方法によって得られたシークエンス済みＤＮＡ断片の使用にも関する。
Description
本発明は、エラーのないＤＮＡシークエンシングの新規方法に関する。さらに、本発明は固定配列、ランダム化配列、制限ヌクレアーゼ認識部位および／または制限部位、ならびにプライマー結合部位を含む、４部分オリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、ＤＮＡ配列解析、細胞系統樹の生成またはコピー数の評価のための方法における、本発明の方法によって得られたシークエンス済みＤＮＡ断片の使用にも関する。
特許出願、製造元のマニュアルおよび科学刊行物を含めたいくつかの文献が本明細書で引用される。これらの文献の開示は、本発明の特許性に関連するとは見なされないものの、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。より具体的には、すべての参考文献は、それぞれの個々の文献が参照により組み込まれることを具体的かつ個々に示されるのと同じ程度に、参照により組み込まれる。
実施前の分子診断、癌の早期発見および核酸バイオマーカーベースの長期的な療法応答モニタリングなどの臨床適用は、分子解析にとって十分な質の高いＤＮＡの量を提供するために、正確な試料調製および全ゲノム増幅法を必要とする。単一細胞のＤＮＡまたは全ゲノムの増幅に特に有用なＤＮＡ増幅方法は、ＷＯ００／１７３９０に記載されている。しかし、全ゲノム増幅および試料調製は、ＤＮＡ配列にエラーが導入される傾向がある。したがって、単一細胞からの正確な配列の評価は、シークエンシングエラーの高いバックグラウンドレベルによって妨害される。したがって、方法的に導入されるシークエンスエラーを正しくモニターおよび評価する方法が確立される必要がある。この目標を達成するための最も重要な要件は、ＤＮＡ配列を、それらが実験操作前にあった通りに、単一細胞から正確に取得することである。現在のアプローチは、各ＤＮＡ配列の相補ＤＮＡ鎖情報を使用して、元の二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖に存在しないすべての変化を補正する。
次世代シークエンシングアプローチにおいて、シークエンスエラー由来のノイズを真の遺伝的変異から分離するために、感度が著しく異なる、様々な基本的に異なるカテゴリーのアプローチが使用されている。第１のカテゴリーのアプローチは、もっぱらバイオインフォマティクス解析からなり、標準的な次世代シークエンシングデータセットの重要な下流解析に相当する。例えば、DePristo et al., (2011)Nature Genetics 43(5):491-8およびその中の引用参考文献を参照されたい。たいていの変異配列コーラーは、Ｂａｙｅｓｉａｎのアルゴリズムに基づいて築かれ、公知の多型率およびシークエンシングエラーが与えられる特定の位置における特定の変異についての検出確率を組み込む。全ゲノムおよびエキソームシークエンシングについては、変異コールの精度をさらに増すために、より洗練された、アライメント後の手順が開発された。変異コールより前のインデル周辺の局所的再アライメント、塩基クオリティースコアの再キャリブレーションおよび適応型エラーモデリングのための新しい方法は、偽陽性変異の特定を可能にする。単一細胞ゲノムに由来するシークエンシングデータについて、この配列解析パイプラインを適合させること、およびそのパフォーマンスを評価することは、現在、単一細胞ゲノミクスにおける大きな課題をもたらす。第２のカテゴリーは、シークエンスされるゲノム断片に直接的に結合されるランダムタグ配列の使用に基づく非コンピューター的アプローチを含む。これらの技術開発は、例えば、ディープシークエンシングによって腫瘍組織にしばしば見つかるような、不均一な細胞集団におけるまれな変異の検出に主に焦点が合わせられた。次世代シークエンシングによるまれな突然変異の検出は、Schmitt et al. (2012)PNAS 109(36):14508-13およびＷＯ２０１３／１４２３８９によって記載された。シークエンシング精度は、増幅する前に、二本鎖ゲノム分子の両鎖に、ランダムな相補的二本鎖ＤＮＡアダプターを付加することによって達成される。同じシークエンシングタグを共有するすべてのシークエンシングリードを、一本鎖コンセンサス配列に統合することができる。さらに、相補鎖に由来するすべてのシークエンシングリードは、デュプレックス配列と呼ばれる二本鎖コンセンサス配列の作出を可能にする相補的なタグ配列によって、特定される。真の遺伝的変異は、逆の一本鎖コンセンサス中の同じヌクレオチドにおける完全一致を特徴とする。
Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳと呼ばれるさらなるアプローチが、Kinde et al.(2011)PNAS 108(23):9530-5によって記載された。このアプローチは、２つの基本ステップからなる。第１に、各ＤＮＡ鋳型へ独自の識別子を割り当て、第２に、独自にタグ付けされた各鋳型の増幅である。Schmitt et al.と異なって、Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳは相補鎖からの情報を使用しない。
バーコード化アダプター（Ｔ／Ａクローニングまたは平滑末端ライゲーションのいずれかによってライゲーションされる）を使用して試料起源を特定するさらなるアプローチが公開された。しかし、どのアプローチもエラー補正アプローチを含んでいない。ＷＯ２０１２／０４２３７４に記載されているように、第１のアプローチは、二本鎖ＤＮＡ断片の平滑末端にライゲーションされる二本鎖ＤＮＡアダプターを使用する。以下にさらに記載するように、二本鎖アダプター分子を使用するこれらの技法は、少ない量の核酸分子、特にＤＮＡ、特に単一細胞または単一ＤＮＡ分子のＤＮＡを増幅およびシークエンスすることができない。
同様に、さらなる公知のアプローチは、部分的に二本鎖のＤＮＡアダプター、いわゆるＹ−アダプターの使用を含む。そのような技法は、アダプターの二量体化を最小限にするために、アダプターライゲーションより前にｄＡテーリングを必要とする。さらに、例えばMonson-Miller et al. (2012)BMC Genomics 13:72のように、制限酵素で作製した二本鎖ＤＮＡをＹ−アダプターライゲーションに使用することができる。この方法は、試料特定のために、短いバーコード配列（４塩基）の使用を含む。しかし、これらの技法は、シークエンシングエラーの特定および／または突然変異解析のために、相補ＤＮＡ鎖に含まれる重複性配列情報に依拠することができない。
ＤＮＡシークエンシングのための反復的および再生的な方法が、Jones (1997)BioTechniques 22:938-946およびＵＳ０８／７４２，７５５によって提供される。この方法は、ＩＩ型制限酵素、特にＦｏｋ ＩまたはＢｓｅ ＲＩを使用する制限酵素消化を含む。認識部位は、アダプター配列中に含まれる。各ＰＣＲサイクルに続いて、アダプターが標的ＤＮＡから切断されて、ＰＣＲのためのプライマー結合部位が失われることになる。１塩基をシークエンスするのに１サイクルのＰＣＲが実施され、すなわち、少ない量のＤＮＡからの著しい試料増幅は、反復的ライゲーション−増幅サイクルを用いてのみ可能である。したがって、この方法は、少ない量のＤＮＡに適さない。
少ない量のＤＮＡを含む試料において、または少ない量の核酸分子、特に単一細胞の核酸分子／ＤＮＡを含む試料において、核酸配列の特定を可能にする従来技術のアプローチはない。実際に、本明細書の上記のすべての公知のアプローチは、大量のＤＮＡに限定される。これは、特に、例えばＷＯ２０１３／１４２３８９に記載されるようなデュプレックスシークエンシングは、ライゲーションにアダプターを使用し、これが細胞ＤＮＡへ大量に加えられるという事実による。過剰の二本鎖アダプター分子は、ＰＣＲインヒビターを生成する。したがって、少ない量のＤＮＡを、記載されたアプローチを使用して首尾よく増幅することができない。他の技法は、突然変異および／またはシークエンシングエラーを特定するために、複数の試料および／または確率ベースのバイオインフォマティクスアプローチからの情報を必要とする。したがって、少ない量の投入核酸分子／ＤＮＡ、特に単一細胞のＤＮＡからもエラーのない配列情報を提供するシークエンシング方法が必要である。
したがって、本発明の根底にある技術的問題は、核酸分子の改善されたエラーのないシークエンシング方法を提供することである。
以下で、本明細書で規定され、特許請求の範囲において特徴づけられる実施形態によって、この技術的問題の解決法を提供する。
したがって、本発明は、以下：
核酸分子のエラーのないシークエンシング方法であって：
（ａ）核酸分子を含む試料を用意するステップ；
（ｂ）同様の長さの核酸分子断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼで核酸分子を消化するステップであり、
前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または
前記制限エンドヌクレアーゼが３’突出をもたらすことができ、前記核酸分子断片において突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化される、ステップ；
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを前記核酸分子断片にアニーリングするステップであり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記核酸分子断片のそれぞれの５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含む、ステップ；
（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記核酸分子断片にライゲーションするステップ；
（ｅ）生成された突出をフィルインするステップ；
（ｆ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の配列に結合する配列を含む第３のオリゴヌクレオチドを使用して、前記核酸分子断片を増幅するステップ；ならびに
（ｇ）前記増幅核酸分子断片をシークエンシングするステップ
を含む、方法に関する。
核酸分子のエラーのないシークエンシング方法であって：
（ａ）核酸分子を含む試料を用意するステップ；
（ｂ）同様の長さの核酸分子断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼで核酸分子を消化するステップであり、
前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または
前記制限エンドヌクレアーゼが３’突出をもたらすことができ、前記核酸分子断片において突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化される、ステップ；
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを前記核酸分子断片にアニーリングするステップであり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記核酸分子断片のそれぞれの５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含む、ステップ；
（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記核酸分子断片にライゲーションするステップ；
（ｅ）生成された突出をフィルインするステップ；
（ｆ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の配列に結合する配列を含む第３のオリゴヌクレオチドを使用して、前記核酸分子断片を増幅するステップ；ならびに
（ｇ）前記増幅核酸分子断片をシークエンシングするステップ
を含む、方法に関する。
特に、本発明は以下のことに関する：
１．エラーのないＤＮＡシークエンシング方法であって、
（ａ）ＤＮＡを含む試料を用意するステップ；
（ｂ）同様の長さのＤＮＡ断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化するステップであり、
前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または
前記制限エンドヌクレアーゼが３’突出をもたらすことができ、前記ＤＮＡ断片において突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化される、ステップ；
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングするステップであり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含む、ステップ；
（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；
（ｅ）生成された突出をフィルインするステップ；
（ｆ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の配列に結合する配列を含む第３のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＤＮＡ断片を増幅するステップ；ならびに
（ｇ）前記増幅したＤＮＡ断片をシークエンシングするステップ
を含む、方法。
１．エラーのないＤＮＡシークエンシング方法であって、
（ａ）ＤＮＡを含む試料を用意するステップ；
（ｂ）同様の長さのＤＮＡ断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化するステップであり、
前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または
前記制限エンドヌクレアーゼが３’突出をもたらすことができ、前記ＤＮＡ断片において突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化される、ステップ；
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングするステップであり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含む、ステップ；
（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；
（ｅ）生成された突出をフィルインするステップ；
（ｆ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の配列に結合する配列を含む第３のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＤＮＡ断片を増幅するステップ；ならびに
（ｇ）前記増幅したＤＮＡ断片をシークエンシングするステップ
を含む、方法。
２．前記第３のオリゴヌクレオチドがプライマーである、項目１に記載の方法。
３．前記第２のオリゴヌクレオチドが、部位特異的エンドヌクレアーゼの制限部位を含む第４の配列をさらに含む、項目１に記載の方法。
４．前記第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドである、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
５．前記エンドヌクレアーゼが、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＴＦＯヌクレアーゼまたはｔａｒｇｅｔｒｏｎである、項目３に記載の方法。
６．前記エンドヌクレアーゼがＩ−ＳｃｅＩまたはＩ−ＣｅｕＩである、項目３または５に記載の方法。
７．ステップ（ｅ’）をさらに含み、前記ステップ（ｅ’）においてエキソヌクレアーゼが加えられる、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
８．前記エキソヌクレアーゼが、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ／ＲＮＡ分子を分解する酵素である、項目７に記載の方法。
９．前記エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼＩ、マングビーンヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴまたはＲｅｃＪｆである、項目７または８に記載の方法。
１０．前記ＤＮＡが、（ｉ）単一細胞のゲノムまたはトランスクリプトーム、（ｉｉ）単一細胞の染色体、（ｉｉｉ）単一細胞のエキソソームもしくは他の微小胞からの核酸、または（ｉｖ）項目（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つの材料の断片または亜画分を含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
１１．前記単一細胞が、法医学、生殖医学または再生医学で使用される生物材料から得られる、項目１０に記載の方法。
１２．前記単一細胞が、腫瘍細胞、血液細胞、骨髄穿刺液からの細胞、リンパ節から得られる細胞および／または顕微解剖された組織から得られる細胞、胚の卵割球もしくは胚盤胞、精細胞、羊水から得られる細胞、血液から得られる細胞または頬スワブから得られる細胞である、項目１０または１１に記載の方法。
１３．前記腫瘍細胞が、播種性腫瘍細胞、循環性腫瘍細胞または腫瘍生検からの細胞である、項目１２に記載の方法。
１４．前記血液細胞が末梢血細胞または臍帯血から得られる細胞である、項目１２に記載の方法。
１５．前記ＤＮＡが、（ｉ）１つより多くの単一細胞のＤＮＡ、（ｉｉ）１つより多くの単一細胞の無細胞胎児ＤＮＡ、（ｉｉｉ）癌患者の血清および／もしくは血漿中の１つより多くの単一細胞の無細胞ＤＮＡ、または（ｉｖ）項目（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つの材料の断片または亜画分を含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
１６．前記無細胞ＤＮＡが、体液からのＤＮＡ物質を含む、項目１５に記載の方法。
１７．ステップ（ａ’）をさらに含み、前記ステップ（ａ’）において、前記ＤＮＡが、人工の制限部位またはタグの導入によって修飾される、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
１８．ステップ（ａ’’）をさらに含み、前記ステップ（ａ’’）において、ＤＮＡがプロテイナーゼで消化される、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
１９．前記プロテイナーゼが熱不安定である、項目１８に記載の方法。
２０．前記プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである、項目１８または１９に記載の方法。
２１．ステップ（ａ’’’）をさらに含み、前記ステップ（ａ’’’）において、プロテイナーゼが熱不活性化される、項目１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
２２．ステップ（ｂ）で使用される前記制限エンドヌクレアーゼが４〜６個の規定された塩基を有するモチーフを認識する、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
２３．ステップ（ｂ）で使用される前記制限エンドヌクレアーゼがコンセンサス配列のＴＴＡＡを認識する、項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
２４．ステップ（ｂ）で使用される前記制限エンドヌクレアーゼがＭｓｅｌまたはそのアイソシゾマーである、項目１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
２５．前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第１のオリゴヌクレオチドより長い、項目１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
２６．前記第１のオリゴヌクレオチドが４〜１５個のヌクレオチドを含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが３０〜６０個のヌクレオチドを含む、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
２７．前記ランダム化配列が３〜２４個のヌクレオチドを含む、項目１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
２８．前記第１のオリゴヌクレオチドが配列５’−ＴＡＡＣＴＧＡＣｄｄ−３’を含み、および／または前記第２のオリゴヌクレオチドが配列番号１に示される配列を含み、および／または前記第３のオリゴヌクレオチドが配列番号２に示される配列を含む、項目１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
２９．前記第１のオリゴヌクレオチドが配列５’−ＴＡＡＣＴＧＡＣｄｄ−３’を有し、および／または前記第２のオリゴヌクレオチドが配列番号１に示される配列を有し、および／または前記第３のオリゴヌクレオチドが配列番号２に示される配列を有する、項目１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
３０．ステップ（ｃ’）をさらに含み、前記ステップ（ｃ’）において、前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記ＤＮＡ断片とは別に、互いにハイブリダイズし、前記ＤＮＡ断片に加えられる、項目１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
３１．第１のオリゴヌクレオチドの最後の３’ヌクレオチドがｄｄ−ヌクレオチドである、項目１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
３２．本質的に前記単一細胞の全核ゲノムからのＤＮＡ断片が増幅される、項目１０〜３１のいずれか１項に記載の方法。
３３．前記単一細胞が化学固定にかけられている、項目１０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
３４．ステップ（ｆ’）をさらに含み、前記ステップ（ｆ’）において、ホーミングエンドヌクレアーゼが加えられる、項目３〜３３のいずれか１項に記載の方法。
３５．前記ホーミングエンドヌクレアーゼによって制限処理した後に、断片をライゲーションすることをさらに含む、項目３４に記載の方法。
３６．ライゲーションした断片が全ゲノムシークエンシングにかけられる、項目３５に記載の方法。
３７．ステップ（ａ）〜（ｆ）が１つの反応器で行われる、項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
３８．ＤＮＡ配列解析、細胞系統樹の生成またはコピー数の評価のための方法における、項目１〜３７のいずれか１項に記載の方法によって得られたシークエンス済みＤＮＡ断片の使用。
３９．ＤＮＡ配列解析のための方法が、全ゲノムシークエンシング、全エキソームシークエンシング、全レギュロームシークエンシング、シークエンシングベースのメチル化解析、シークエンシングベースのブレークポイント検出、ＣｈＩＰシークエンシングまたはターゲットシークエンシングおよびそれらの変形である、項目３８に記載の使用。
４０．固定配列、ランダム化配列、制限ヌクレアーゼ認識部位および／または制限部位、ならびにプライマー結合部位を含む４部分オリゴヌクレオチドであって、前記固定配列が４〜１５個のヌクレオチドを含み、前記ランダム化配列が３〜２４個のヌクレオチドを含み、前記制限ヌクレアーゼ認識部位がホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、４部分オリゴヌクレオチド。
４１．前記４部分オリゴヌクレオチドがプライマーである、項目４０に記載の４部分オリゴヌクレオチド。
４２．前記制限ヌクレアーゼ認識部位および／または制限部位ならびに前記プライマー結合部位が１つの配列に含まれる、項目４０または４１に記載の４部分オリゴヌクレオチド。
４３．前記固定配列がＧＴＣＡＧＴを含み、ならびに／または前記制限ヌクレアーゼ認識部位および／または制限部位が配列番号３を含み、ならびに／または前記プライマー結合部位が配列番号４を含む、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の４部分オリゴヌクレオチド。
４４．前記固定配列がＧＴＣＡＧＴを含み、または前記制限ヌクレアーゼ認識部位もしくは制限部位が配列番号３を含み、または前記プライマー結合部位が配列番号４を含む、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の４部分オリゴヌクレオチド。
４５．前記固定配列がＧＴＣＡＧＴを含み、前記制限ヌクレアーゼ認識部位または制限部位が配列番号３を含み、前記プライマー結合部位が配列番号４を含む、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の４部分オリゴヌクレオチド。
４６．配列番号１４、５または１２を含む、項目３９〜４２のいずれか１項に記載の４部分オリゴヌクレオチド。
したがって、本発明は、エラーのないＤＮＡシークエンシングの新規かつ独創的な方法を提供する。添付の実施例から明らかなように、本明細書で提供されるエラーのないシークエンシング方法は、特に、エラーのないＤＮＡ解析より前にＤＮＡシークエンシングステップを含むエラーのないＤＮＡ解析を含む。少ない量のＤＮＡは、本発明の方法で用いられる出発材料として好ましい。特に、本発明は、単一細胞または単一ＤＮＡ分子のエラーのないＤＮＡシークエンシングの新規かつ独創的な方法を提供する。特に少ない量のＤＮＡにおける、本明細書で提供されるエラーのないＤＮＡシークエンシング方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を用意するステップ；（ｂ）同様の長さのＤＮＡ断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化するステップであり、前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または前記制限エンドヌクレアーゼが３’突出をもたらすことができ、前記ＤＮＡ断片において突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化される、ステップ；（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングするステップであり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含む、ステップ；（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；（ｅ）生成された突出をフィルインするステップ；（ｆ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の配列に結合する配列を含む第３のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＤＮＡ断片を増幅するステップ；ならびに（ｇ）前記増幅したＤＮＡ断片をシークエンシングするステップを含む。
本発明によれば、第２のオリゴヌクレオチドは、第４の配列をさらに含むことができ、第４の配列は、エンドヌクレアーゼ、好ましくはホーミングエンドヌクレアーゼの制限部位を含む。
驚いたことに、二本鎖アダプターの代わりに一本鎖オリゴヌクレオチドを使用することによって、ＰＣＲインヒビターおよび／または自己ライゲーションしたアダプター、すなわち、他のアダプター分子に結合し、ライゲーションを受けるアダプター分子の生成が回避されることが、本発明者らによって発見された。少ない量の標的ＤＮＡに対する、アダプターの高いライゲーション効率を達成するために、標的ＤＮＡの量を超えてアダプター分子を加えることが必要とされる。次いで、二本鎖アダプターは、標的ＤＮＡへのＰＣＲプライマーの結合を妨害し、これは相補的配列の濃度が過度に高いことによる。この過剰なアダプター分子によって、少量の標的ＤＮＡの使用ができなくなり、標的ＤＮＡは、標的ＤＮＡの著しい喪失なしにアダプター−標的ＤＮＡ混合物から精製することができない。それとは対照的に、本発明は、出発材料として使用されるＤＮＡの量と無関係な方法を提供する。特に、本発明の方法は、特に少ない量の標的ＤＮＡ（単一細胞のＤＮＡおよび／または単一ＤＮＡ分子と同じくらい低くてもよい）のエラーのないシークエンシングを可能にする。
さらに、驚いたことに、３つのオリゴヌクレオチドを使用することによって、出発材料として使用されるＤＮＡの量と無関係でエラーのないシークエンシングが可能になることが、本発明者らによって発見された。より具体的には、従来技術の方法は、例えば少ない量のＤＮＡのエラーのないシークエンシングを提供することができない。それとは対照的に、本明細書に提供する方法は、任意の量のＤＮＡ、特に単一細胞のＤＮＡおよび／または単一ＤＮＡ分子のＤＮＡ配列を増幅し、得るようにデザインされている。本明細書に提供する方法は、真の突然変異特定し、配列を補正するために、増幅し、シークエンスしたＤＮＡのシークエンシングエラーを除去するために使用することもできる。これは、３つのオリゴヌクレオチドを使用することによって達成される。特に、第１のオリゴヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼによって断片化されたＤＮＡ試料の生成された３’および／または５’突出に部分的に相補的である。ＤＮＡ断片の突出に結合する場合は、第１のオリゴヌクレオチドも突出を生成し、すなわち、第１のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ断片の３’および／または５’突出より長い。第２のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドに部分的に相補的な、本明細書では固定配列ともいう第１の配列を含む、３〜４つの機能的部分／配列を含み、これは、第１のオリゴヌクレオチドによって生成された突出に第２のオリゴヌクレオチドを結合させ、それによって、ＤＮＡ−オリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチド複合体が形成される。したがって、第１のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドを標的ＤＮＡに導く。驚いたことに、第１のオリゴヌクレオチドの使用は、各標的ＤＮＡ断片への第２のオリゴヌクレオチドのライゲーション効率を増大させる。固定配列は様々なものでよいが、第１のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を含む必要がある。第２のオリゴヌクレオチドの結合後、第２のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ断片に共有結合する一本鎖ライゲーションが行われる。第１のオリゴヌクレオチドは、好ましく該ＤＮＡにライゲーションされない。これは、５’−リン酸末端なしのオリゴヌクレオチドを合成することによって達成することができる。
さらに、第２のオリゴヌクレオチドの第２の配列は、各オリゴヌクレオチド−ＤＮＡ複合体に独自に印を付けるためのバーコード／識別子として使用されるランダム化配列を含む。バーコードの長さは変動する可能性がある。特に、バーコードの長さは生成されたＤＮＡ断片の数によって変わり得る。さらなるステップでは、ライゲーションした第２のオリゴヌクレオチドによって生成された突出は、ポリメラーゼ反応によってフィルインされる。第２のオリゴヌクレオチドは、第３のオリゴヌクレオチドを結合させるようにデザインされている第３の配列をさらに含む。したがって、第３のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドの第３の配列に相補的である。第３のオリゴヌクレオチドは、次いで配列が得られる全試料表示の効率的なＰＣＲベースの増幅を可能にするようにデザインされている。したがって、第３のオリゴヌクレオチドはＰＣＲ増幅のプライマーとして働く。
用語「配列」は、核酸分子または２つ以上のユニット（ヌクレオチド）長である核酸分子の任意の部分についての配列情報を指す。この用語は、核酸分子それ自体またはその適切な部分への言及として使用することもできる。
核酸分子配列情報は、核酸分子中の連続したヌクレオチド塩基に関する。例えば、核酸分子が塩基アデニン、グアニン、シトシン、チミンもしくはウラシルまたはそれらの化学的類似体を含む場合、核酸分子配列は、対応する連続した文字Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵによって表すことができ、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
核酸分子の配列を決定するために使用される例示的な非限定方法は、例えば、核酸のシークエンシング方法（例えば、サンガージデオキシシークエンシング）、超並列シークエンシング方法、例えばピロシークエンシング、リバースダイターミネーター、プロトン検出、リン酸基結合蛍光ヌクレオチドである。
特に、従来のサンガーベースのジデオキシヌクレオチドシークエンシング方法または例えばＲｏｃｈｅ（４５４技術）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ技術）、ＡＢＩ（Ｓｏｌｉｄ技術）またはＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＭＲＴ技術）によって市販されているものなどの新規な超並列シークエンシング方法（「次世代シークエンシング」）を用いることのいずれかに、得られたＰＣＲ産物をかけることができる。公的に利用可能な配列データベースを用いる比較によって、またはＳＩＦＴおよびＰｏｌｙＰｈｅｎなどのインシリコバイオインフォマティクスツールで実行される機能喪失型および／または機能獲得型の予測アルゴリズムによって、突然変異を配列リードから特定することができる。特に、突然変異は、医療適用に関連する／決定的であるような当技術分野で公知の突然変異であり得る。あるいは、突然変異は、酵素検出反応法、蛍光法、質量分析法または他の方法のいずれかを使用して検出することができる分子タグのアレル特異的な取り込みによって特定することができる。Vogeser (2007)Dtsch Arztebl 104 (31-32), A2194-200を参照されたい。
用語「エラーのない」シークエンシングは、試料処理、例えば、ＤＮＡ単離、増幅および／またはシークエンシングの間に導入される技術的エラーを、高度に除くことを可能にするアプローチを指す。ランダム化されたバーコード／識別子を使用して、それぞれ別々のアレルが独自の配列タグによって、両端で標識される。２つの相補ＤＮＡ鎖のコンセンサス配列を決定することができるので、ライゲーションされた２つのバーコードに隣接する配列を容易に追跡することができる。同じ二本鎖ＤＮＡ断片の一本鎖コンセンサス配列間の任意のヌクレオチドで相補性がないことは、技術的エラーとして認識されるべきである。しかし、用語「エラーのない」は、技術的エラーの完全な除去ではなく、むしろ無視できるレベルへのその頻度の低減を指すことを当業者であれば容易に理解するであろう。特に、本発明の方法で用いられる出発材料として、単一細胞ＤＮＡまたは単一ＤＮＡ分子を使用する場合、ＤＮＡの増幅は、本発明の方法を使用するエラー補正によって後で除去することができるエラーを導入することを当業者であれば認識するであろう。本明細書でも提供されるような、より多くの量の出発材料、例えば組織から抽出されるＤＮＡは、ＤＮＡシークエンシングの前にＤＮＡ増幅を必要としない可能性があることから、ＤＮＡシークエンシングにおけるエラー率が低減される可能性があり、このようなエラーも本発明の方法を使用して補正することができる。
本発明による用語「ランダム化配列」は、各位置が任意のヌクレオチドであるという独立したおよび等しい確率を有する、ヌクレオチドの配列として理解されるものとする。ランダムヌクレオチドは、任意の順序での、ヌクレオチド、例えばＧ、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕまたはそれらの化学的類似体のうちのいずれかであり得：Ｇはグアニルヌクレオチドを表し、Ａはアデニルヌクレオチドを表し、Ｔはチミジルヌクレオチドを表し、Ｃはシチジルヌクレオチドを表し、Ｕはウラシルヌクレオチドを表すと理解される。公知のオリゴヌクレオチド合成法は、ヌクレオチドＧ、Ａ、Ｃ、ＴまたはＵの不等な出現に本質的につながり得ることを当業者であれば認識するであろう。例えば、合成は、ランダム化されたＤＮＡ配列において、ヌクレオチド、例えばＧの過剰出現につながり得る。これは、ヌクレオチドの等しい出現に基づいて予想されるように、独自のランダム配列の数の減少につながり得る。しかし、本発明の方法で使用される第２のオリゴヌクレオチドに含まれる独自のランダム配列の全体的な数は、概して、各標的ＤＮＡ断片をはっきりと特定するのに十分であることを当業者であれば十分認識している。これは、当業者はまた、ランダム化配列の長さは、ＤＮＡ断片化によって生じる断片の数に応じて変動し得るという事実を認識しているためである。期待されるＤＮＡ断片数は、制限エンドヌクレアーゼの切断部位数および標的ＤＮＡの長さから導くことができる。したがって、公知の標準的なオリゴヌクレオチド合成法におけるヌクレオチドの不等なカップリング効率に起因する、本発明の方法で使用される第２のオリゴヌクレオチドのランダム化配列におけるヌクレオチドの潜在的な不等な出現は、当技術分野で一般的知識に基づいて、当業者であれば容易に考慮することができる。特に、独自のランダム化配列の数を増やすためにランダム化配列の長さを伸ばすことができることを、当業者であれば十分認識している。
用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩および温度条件下での、塩基対形成によるポリヌクレオチドの自然な結合を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子の間の相補性は、核酸のほんの数個のヌクレオチドが互いに結合している場合は「部分的」であり、一本鎖分子の間に完全な相補性が存在する場合は完全であり得る。核酸鎖の間の相補性度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して著しい影響を有する。これは、核酸鎖の間の結合に依存する増幅反応において特に重要である。本発明によって使用される場合、用語「同様の長さのＤＮＡ断片」は、統計学的なレベルで匹敵する長さのサイズを有する断片を示す。匹敵する長さのＤＮＡ断片は、例えば、約５０＋／−５ｂｐ〜約４ｋｂｐ＋／−０．４ｋｂｐの断片である。好ましくは生成されたＤＮＡ断片の長さの範囲は、有利には、約５０ｂｐ〜約４ｋｂｐの間である。より長いまたはより短い長さのＤＮＡ断片も使用することができるが、これらは、上記で定義されたサイズ範囲の断片よりも少ない程度で増幅または出現され得る。ＤＮＡ断片は、好ましくは、直線的および／または指数関数的な増幅に適する。好ましくは、ＤＮＡ断片は、＜３ｋｂｐのサイズを有し、より好ましくは、前記ＤＮＡ断片は約１０００ｂｐの平均長を有し、約１００〜４００ｂｐの断片が特に好ましい。
本明細書で使用する場合、用語「５’突出」および「３’突出」は、例えば、制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの互い違いの切断によってもたらされ、それぞれ、ＤＮＡ上に一本鎖突出５’末端を、またはＤＮＡ上に一本鎖突出３’末端を示す、５’リン酸基または３’ヒドロキシル基を意味する。
用語「増幅する」は、ヌクレオチドの特定配列の反復的な複製を指し、これは、前記ヌクレオチドの特定配列の量の増大をもたらし、多数の同一のまたは本質的に同一の（すなわち、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、さらにいっそう好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％、例えば９９．９％同一の）核酸分子またはその一部の生成を可能にする。そうした方法は、当技術分野で十分に確立されている；Sambrook et al. “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2nd edition 1989, CSH Press, Cold Spring Harborを参照されたい。様々な増幅方法を適用することができ、これらは、例えば、ローリングサークル増幅（例えば、Liu, et al.,“Rolling circle DNA synthesis: Small circular oligonucleotides as efficient templates for DNA polymerases,” J. Am. Chem. Soc. 118:1587-1594 (1996).に）、等温増幅（例えば、Walker, et al.,”Strand displacement amplification--an isothermal, in vitro DNA amplification technique”, Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6 (1992)に）、リガーゼ連鎖反応（例えば、Landegren, et al.,“A Ligase-Mediated Gene Detection Technique,” Science 241:1077-1080, 1988に、またはWiedmann, et al.,“Ligase Chain Reaction (LCR)--Overview and Applications”, PCR Methods and Applications (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1994)pp. S51-S64.に）である。しかし、ポリメラーゼ連鎖反応増幅が好ましい。いくつかの好ましい増幅方法を示すと、これらとしては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびその改変、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が挙げられる。
用語「アニーリングする」または「ハイブリダイズする」および「アニーリング」または「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン・クリック塩基対形成を介して複合体を形成するのに十分に相補的であるヌクレオチド配列の間の複合体形成を指す。本発明に関して、互いに「相補的である」もしくは互い「と相補的である」または互いに「ハイブリダイズする」もしくは互いに「アニーリングする」核酸配列は、意図された目的を果たすのに十分に安定な「ハイブリッド」または「複合体」を形成することができるはずであるか、または形成する。ハイブリダイゼーションまたはアニーリングおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸鎖間の結合強度）は、当技術分野で周知である多くの因子の影響を受け、因子には、例えば、核酸間の相補性度、塩濃度などの条件によって影響を及ぼされる関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ（融解温度）、他の成分の存在（例えば、ポリエチレングリコールまたはベタインの有無）、ハイブリダイズする鎖のモル濃度および核酸鎖のＧ：Ｃ含量が含まれる。
本発明の方法は、エラーのないＤＮＡシークエンシングを可能にする。増幅および／またはシークエンシングが最終的なシークエンシング結果にエラーを導入することは当技術分野で周知である。これは、特に、使用されるポリメラーゼの天然のエラー率および／またはシークエンシング中の塩基の同一性のあいまい性が原因である。エラーを特定するための最も良い方法は、二本鎖ＤＮＡ分子の重複する配列情報を使用することである。これは、増幅および／またはシークエンシング中にＤＮＡ試料の同じ位置にエラーが導入される確率が極めて低いからである。本明細書に提供する方法は、各一本鎖ＤＮＡ分子／断片に独自の識別子／バーコードを加えることにより二本鎖ＤＮＡ分子の重複性配列情報を使用することによって、そのようなエラーの特定を可能にする。したがって、各二本鎖ＤＮＡ分子／断片は、それぞれ、５’末端の両方または３’末端の両方のいずれかにおいて、独自の識別子／バーコードでタグ付けされる。その後のフィルイン反応は、標的ＤＮＡの各部位において２つの異なるバーコードでタグ付けされた一本鎖ＤＮＡ分子の生成を導く。より具体的には、各一本鎖標的ＤＮＡ分子を、標的ＤＮＡにライゲーションされた断片である第２のオリゴヌクレオチドのバーコードおよび標的ＤＮＡ断片の相補鎖にライゲーションされた第２のオリゴヌクレオチドのバーコードの相補的配列でタグ付けする。したがって、二本鎖ＤＮＡ断片の両方の一本鎖ＤＮＡ分子は、それぞれ各一本鎖ＤＮＡの５’および３’末端に結合している、両方のバーコード配列に基づいて明確に特定することができる。第１ステップでは、３’および５’末端のバーコードによって配列をソートする。第２ステップでは、相補的なバーコードを介して最初の二本鎖ＤＮＡ分子の相補鎖を特定する。それによって、特に、試料調製、例えば増幅および／またはシークエンシングの間に導入されたエラーを特定することが可能であり、それにより、例えば、腫瘍細胞のアレルにおける真の突然変異を特定することが可能である。個々の患者の腫瘍細胞における真の突然変異の信頼できる特定によって、効率的な個別化された標的癌療法を開発および／または改善することが可能になり得る。ＤＮＡ分子の突然変異の特定に加えて、本発明の方法を標的ＤＮＡ分子の修飾、例えばメチル化、特にシトシンのメチル化のエラーのない特定に使用することができる（Laird 2010 Nature Reviews Genetics 11, 191-203）。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドでも、ＲＮＡオリゴヌクレオチドでも、ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドでもよい。特に、オリゴヌクレオチドは、それぞれ、リボ核酸ヌクレオチドおよび／またはデオキシリボ核酸ヌクレオチドから部分的にまたは完全に構成されてもよい。本発明の一実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの第２の配列は、リボ核酸ヌクレオチドからなる。したがって、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ組成物の第２のオリゴヌクレオチドを二本鎖ＤＮＡ断片の一本鎖分子にライゲーションした後に、ＲＮＡ依存性および／またはＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成特性を有する酵素を添加することによって、ライゲーションした第２のオリゴヌクレオチド部位で組成物ＤＮＡ：ＤＮＡ−ＲＮＡ：ＤＮＡ−ＤＮＡ：ＤＮＡの二本鎖ＤＮＡ断片が生成される。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中のホスホジエステル結合を特異的に加水分解し、遊離の第２のオリゴヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ部分を消化するリボヌクレアーゼを添加することによって、反応物中のすべてのＲＮＡ配列を除去し、それによって、第２のオリゴヌクレオチドおよび第３のオリゴヌクレオチドの部位に内部ギャップを有する二本鎖断片を作出する。二本鎖ＤＮＡ断片中に生じたギャップは、反応物中に既に存在しているＤＮＡポリメラーゼによって埋められる。リガーゼの添加は、第２のオリゴヌクレオチドの伸長部分を第２のオリゴヌクレオチドの固定配列に共有結合的に連結する。
本発明の第２のオリゴヌクレオチドは、制限酵素の、例えばホーミングエンドヌクレアーゼの部位特異的なモチーフを含むことができる第４の配列をさらに含んでもよい。それにより、第４の配列は、第２と第３の配列の間または第３の配列内に位置するのが好ましい。したがって、第２のオリゴヌクレオチドの第４の配列の存在は、オリゴヌクレオチド結合部位、すなわち、ＤＮＡシークエンシングに必要とされない第３の配列を除去することによって、増幅産物の長さを短くすることを可能にする。これによって、増幅産物の短縮の結果、細胞または試料由来のより長いＤＮＡ断片シークエンシングが可能になる。制限酵素部位は、シークエンシングアダプターを高い効率でライゲーションするために、または次世代シークエンシング技術、例えば全ゲノムシークエンシングアプローチのための増幅後にＤＮＡ断片を連結するために、使用することができる。
本明細書で使用する場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」は、特異的なヌクレオチド配列で、またはその近傍で二本鎖ＤＮＡを切断することができる酵素を指す。制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、（認識部位で）配列特異的にＤＮＡに結合することができ、結合部位またはその近傍でＤＮＡを切断する。ある種の制限酵素（例えばＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、異なる結合および切断ユニットを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素のＦｏｋ Ｉは、一方の鎖のその認識部位から９ヌクレオチド、および他方の鎖のその認識部位から１３ヌクレオチドの場所で、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号；ならびにLi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4275-4279, 1992; Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2764-2768, 1993; Kim et al., J. Biol. Chem., 269:31,978-31,982, 1994b; Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:883-887, 1994aを参照されたい。
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ０７／０１４，２７５に記載されている。他の制限酵素も分離可能な結合および切断ドメインを含み、これらは、本開示により意図される。例えば、Roberts et al., Nucleic Acids Res., 31:418-420, 2003を参照されたい。
標的ＤＮＡの標的部位を有する任意のヌクレアーゼを、本明細書に開示される方法で使用することができる。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼは非常に長い認識配列を有し、それらのいくつかは、統計に基づくと、ヒトサイズのゲノム中に１回存在する可能性が高い。
本発明の方法のステップ（ｆ’）における使用に適する例示的ホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。これらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfort et al., Nucleic Acids Res., 25:3379-3388, 1997; Dijon et al., Gene, 82:115-118, 1989; Perler et al., Nucleic Acids Res., 22:1125-1127, 1994; Jasin, Trends Genet., 12:224-228, 1996; Gimble et al., J. Mol. Biol., 263:163-180, 1996; Argast et al., J. Mol. Biol., 280:345-353, 1998およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。
たいていのホーミングエンドヌクレアーゼの切断の特異性はそれらの認識部位に対して絶対的ではないが、その部位は、単一コピーのその認識部位を含む細胞でホーミングエンドヌクレアーゼを発現させることによって、哺乳類サイズのゲノムあたりの単一の切断現象を得ることができる、十分な長さのものである。非天然の標的部位に結合するようにホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性を操作することができることも報告された。例えば、Chevalier et al., Molec. Cell, 10:895-905, 2002; Epinat et al., Nucleic Acids Res., 31:2952-2962, 2003; Ashworth et al., Nature, 441:656-659, 2006; Paques et al., Current Gene Therapy, 7:49-66, 2007を参照されたい。
さらに、本発明は、第１、第２、第３および第４の配列を含む４部分オリゴヌクレオチドを提供する。第１の配列は、固定配列を含み、第２の配列はランダム化配列を含み、第３の配列はプライマー結合部位を含み、第４の配列は制限ヌクレアーゼ認識部位および／または制限部位を含む。本発明によれば、固定配列は好ましくは約４〜１５個のヌクレオチドを含み、ランダム化配列は好ましくは約３〜２４個のヌクレオチド含み、制限ヌクレアーゼ認識部位は好ましくはホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位を含む。４部分オリゴヌクレオチドは、以下の好ましい５’から３’の順序の４配列／部分を有する：５’末端、続いてプライマー結合部位（第３の配列）または制限部位（第４の配列）、続いてプライマー結合部位または制限部位（最も５’側の配列の選択に依存する）、続いてランダム配列（第２の配列）、続いて固定配列（第１の配列）、続いて３’末端。
本発明による用語「オリゴヌクレオチド」には、例えばＤＮＡ（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡなどの任意の核酸分子が含まれる。当技術分野で公知の核酸模倣分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの合成的または半合成的誘導体および混合ポリマーがさらに含まれる。本発明によるそのような核酸模倣分子または核酸誘導体としては、ホスホロチオエート核酸、ホスホルアミデート核酸、２’−Ｏ−メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）（Braasch and Corey, Chem Biol 2001, 8: 1を参照されたい）などが挙げられる。ＬＮＡは、リボース環が２’−酸素および４’−炭素の間のメチレン結合に束縛されるＲＮＡ誘導体である。当業者であれば容易に認識するように、これらは、さらなる非天然のまたは誘導体のヌクレオチド塩基を含むことができる。
さらに、本発明は、本発明の核酸分子を特異的に増幅することができるオリゴヌクレオチドに関する。したがって、本発明の目的の範囲内で、オリゴヌクレオチドは、増幅の起点として働くことでき得、すなわちプライマーとして働くことができ得る。特に、第３の本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくはＰＣＲ増幅のプライマーとして働く。前記オリゴヌクレオチドは、核酸分子の１つの鎖のある領域に相補的であるオリゴリボ−またはデゾキシリボヌクレオチドを含むこともできる。本発明によれば、用語「プライマー」は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を可能にするように、核酸分子の相補性領域に対して、互いに向かって逆方向にある１対のプライマーを指すこともできることを、当業者であれば容易に理解すると思われる。プライマーの精製は、一般に、本発明の方法におけるその／それらの使用より前に想定される。そのような精製ステップは、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）またはＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を含むことができ、当業者に知られている。
プライマー、特に第３の本発明のオリゴヌクレオチドと関連して使用される場合、用語「特異的に」は、本明細書に記載のような所望の核酸分子のみが増幅されることを意味する。したがって、本発明によるプライマーは、好ましくは、この分子に特有の核酸分子領域に結合するプライマーである。本発明による１対のプライマーに関して、対の１つプライマーが上記の意味で特異的であること、または対の両方のプライマーが特異的であることが可能である。
プライマーの３’−ＯＨ末端はポリメラーゼによって使用されて、ヌクレオチドの連続的な取り込みによって伸長する。本発明のプライマーまたはプライマー対は、例えば、当業者に公知の方法に従って、鋳型ＤＮＡに対するプライマー伸長実験で使用することができる。好ましくは、本発明のプライマーまたはプライマー対は、鋳型ＤＮＡ、好ましくはゲノムＤＮＡに対する増幅反応に使用される。用語「鋳型ＤＮＡ」は、上記で定義されたような標的ヌクレオチド配列を含む、任意の供給源またはヌクレオチド組成物のＤＮＡ分子またはその断片を指す。プライマーまたはプライマー対は、当技術分野で知られているように、ハイブリダイゼーション実験に使用することもできる。好ましくは、プライマーまたはプライマー対は、本発明の核酸分子の配列に対応する配列を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応で使用される。プライマーの長さは、様々なパラメーターに起因することが知られている（Gillam, Gene 8 (1979), 81-97; Innis, PCR Protocols: A guide to methods and applications, Academic Press, San Diego, USA (1990)）。好ましくは、プライマーは、標的ヌクレオチド配列の特異的な領域のみにハイブリダイズまたは結合すべきである。標的ヌクレオチド配列の１領域のみに統計的にハイブリダイズするプライマーの長さは、以下の式：（１／４）ｘ（式中、ｘはプライマーの長さである）によって計算することができる。しかし、相補的な鋳型鎖に正確に一致するプライマーは、少なくとも９塩基対の長さでなければならず、さもないと、安定な二本鎖を生成することができないことが知られている（Goulian, Biochemistry 12 (1973), 2893-2901）。コンピューターベースのアルゴリズムを、ＤＮＡを増幅することができるプライマーをデザインするのに使用できることも想定される。プライマーまたはプライマー対を標識することも想定される。標識は、例えば、３２Ｐ、３３Ｐまたは３５Ｓなどの放射性標識でもよい。本発明の好ましい実施形態では、標識は、非放射性標識、例えば、ジゴキシゲニン、ビオチンおよび蛍光色素または色素である。
本明細書で使用する場合、用語「フィルインする（filling in）」または「フィルイン（fill-in）」は、ＤＮＡ合成反応が３’ヒドロキシル末端で開始されて相補鎖の埋め合わせることを意味する。このＤＮＡ合成反応は、好ましくは、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、ｄＵＴＰならびに／またはそれらの化学的類似体）の存在下で行われる。Ｔａｑポリメラーゼなどの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが使用されることが多く、当業者に周知である。
本発明の好ましい実施形態では、本発明の第２のオリゴヌクレオチドの第４の配列は、部位特異的エンドヌクレアーゼの制限部位を含む。その際、めったに切断しないエンドヌクレアーゼの制限部位が好ましい。より具体的には、一般的にはヒトゲノムＤＮＡを非常にまれに切断する、またはヒトゲノム中にまれに存在する核酸配列の部位特異的な切断を可能にする、天然のまたは操作された合成のエンドヌクレアーゼの、または天然のもしくは操作された酵素の制限部位が好ましい。操作された制限酵素は、ヒトゲノムに存在しないが、人為的に導入された配列を部位特異的に認識することができ得る。エンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＴＦＯヌクレアーゼまたはｔａｒｇｅｔｒｏｎであり得る。エンドヌクレアーゼがＩ−ＳｃｅＩまたはＩ−ＣｅｕＩであることが好ましい。したがって、Ｉ−ＳｃｅＩまたはＩ−ＣｅｕＩを使用する場合は、それぞれ、エンドヌクレアーゼに認識される制限部位が、５’−ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ−３’または５’−ＴＡＡＣＴＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＴＡＧＣＧＡＡ−３’であることが好ましい。
部位特異的エンドヌクレアーゼは、本発明の方法のステップ（ｇ）より前に、すなわち、増幅した核酸分子、好ましくはＤＮＡをシークエンシングするより前に、加えることができる。部位特異的エンドヌクレアーゼを、ステップ（ｆ）の後に、ステップ（ｆ’）において加えることが好ましい。したがって、本発明の方法がステップ（ｆ’）をさらに含むことが好ましく、ステップ（ｆ’）において部位特異的エンドヌクレアーゼ、特にホーミングエンドヌクレアーゼを加える。部位特異的エンドヌクレアーゼがホーミングエンドヌクレアーゼ、より好ましくはＩ−ＳｃｅＩまたはＩ−ＣｅｕＩのいずれかであることが好ましい。
本発明の方法は、エキソヌクレアーゼの添加をさらに含むことができる。エキソヌクレアーゼは特異的な認識部位を有さないので、フィルイン反応の後、人工配列が加えられた標的ＤＮＡは、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって消化され得ない二本鎖ＤＮＡからなる。したがって、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼは、ライゲーションされていないオリゴヌクレオチド配列のみに影響を及ぼす。特に、過剰な一本鎖核酸分子、例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡを分解するために、エキソヌクレアーゼを加えることができる。特に、増幅より前に本発明の方法で使用される第１のおよび過剰な第２のオリゴヌクレオチドを分解するために、エキソヌクレアーゼを加えることができる。したがって、本発明の方法のステップ（ｆ）より前にエキソヌクレアーゼを加えることが好ましい。より具体的には、本発明の方法がステップ（ｅ’）をさらに含むことが好ましく、ステップ（ｅ’）において、エキソヌクレアーゼを加える。エキソヌクレアーゼの添加は、増幅の間の望まれない副産物を回避する。好ましくは、エキソヌクレアーゼは、一本鎖核酸分子を５’から３’の方向に分解するが、任意の他の核酸分子に作用しないか、一本鎖核酸分子を３’から５’の方向に分解するが、任意の他の核酸分子に作用しない。エキソヌクレアーゼによって認識される制限部位が、エキソヌクレアーゼＩ、マングビーンヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴまたはＲｅｃＪｆのものであることが好ましい。一本鎖ＤＮＡ分子からのヌクレオチドの除去がエキソヌクレアーゼＩまたはＲｅｃＪｆによって触媒されることが最も好ましい。
いかなるＤＮＡ試料も本発明の方法に使用することができるが、使用されるＤＮＡ試料が、（ｉ）単一細胞のゲノムまたはトランスクリプトーム、（ｉｉ）単一細胞の染色体、（ｉｉｉ）単一細胞のエキソソームもしくは他の微小胞からの核酸、または（ｉｖ）項目（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つの材料の断片もしくは亜画分を含むことが好ましい。
本発明の方法で使用される単一細胞は、法医学、生殖医学または再生医学で使用される生物材料から得ることができる。したがって、単一細胞は、腫瘍細胞、血液細胞、骨髄穿刺液からの細胞、リンパ節からの細胞および／または顕微解剖された組織から得られる細胞、胚の卵割球もしくは胚盤胞、精細胞、羊水から得られる細胞または頬スワブから得られる細胞であり得る。腫瘍細胞が播種性腫瘍細胞、循環性腫瘍細胞または腫瘍生検からの細胞であることが好ましい。血液細胞が末梢血細胞または臍帯血から得られる細胞であることがさらに好ましい。ＤＮＡ試料が、（ｉ）単一細胞のゲノムまたはトランスクリプトーム、（ｉｉ）単一細胞の染色体、（ｉｉｉ）単一細胞のエキソソームもしくは他の微小胞からの核酸、または（ｉｖ）項目（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つの材料の断片もしくは亜画分からなることが特に好ましい。
本発明の別の態様では、ＤＮＡ試料は、（ｉ）１つより多くの単一細胞ＤＮＡ、（ｉｉ）１つより多くの単一細胞の無細胞胎児ＤＮＡ、（ｉｉｉ）血清および／または血漿中の１つより多くの単一細胞の無細胞ＤＮＡ、（ｉｖ）項目（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つの材料の断片または亜画分を含むこともできる。ＤＮＡ試料はまた、１つより多くの単一細胞ＤＮＡ、１つより多くの単一細胞の無細胞胎児ＤＮＡ、または癌患者の血清および／もしくは血漿中の１つより多くの単一細胞の無細胞ＤＮＡからなってもよい。ＤＮＡ試料は、１つより多くの単一細胞、特に２つ以上の単一細胞から得ることができる。ＤＮＡ試料は、２〜５０００個の単一細胞から得られることが好ましい。
さらに、本発明の方法で使用されるＤＮＡは修飾されていてもよい。特に、本発明の方法に使用されるＤＮＡは、人工の制限部位またはタグの導入によって修飾され得る。本発明の方法で使用されるＤＮＡへの修飾は、ＤＮＡを増幅するより前に行われることが好ましい。特に、本発明の方法は、ステップ（ａ’）をさらに含み、ステップ（ａ’）において、人工の制限部位および／またはタグを導入することによってＤＮＡを修飾することが好ましい。
本発明の方法で使用される単一細胞および／または１つより多くの単一細胞は、いかなる起源でもよい。それら／それは、生物材料の様々な供給源から得ることができる。単一細胞の起源として使用される生物材料は、例えば、法医学、生殖医学または再生医学で使用され得る。本発明の方法で使用される１つの単一細胞または複数の単一細胞は、播種性腫瘍細胞、循環性腫瘍細胞、末梢血細胞、骨髄穿刺液からの細胞、腫瘍生検からの細胞、臍帯血から得られる細胞、リンパ節から得られる細胞および／または顕微解剖された組織から得られる細胞、胚の卵割球もしくは胚盤胞、精細胞、羊水から得られる細胞または頬スワブから得られる細胞または極体であることが好ましい。
本発明の方法は、ステップ（ｂ）より前に、特にステップ（ａ）の後に、ステップ（ａ’’）をさらに含むことができ、ここでは、ＤＮＡを含む前記試料をプロテイナーゼで消化する。プロテイナーゼは熱不安定でもよく、化学的な不活性化などの他の手段によって失活させられてもよい。好ましくは、前記プロテイナーゼは熱不安定である。したがって、前記プロテイナーゼは、ステップ（ａ’’’）で熱不活性化されてもよい。前記プロテイナーゼがプロテイナーゼＫであることが特に好ましい。
本発明の方法は、ＤＮＡメチル化解析のステップを含むこともできる。エピジェネティックなメカニズムが、正常な発達、老化および様々な疾患状態の間に重要な役割を果たすことが知られている。そうした疾患は、癌、多発性硬化症、糖尿病および／または統合失調症を含めたヒト疾患であり得る。腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域に位置するＣｐＧアイランドの過剰メチル化は、癌における遺伝子不活性化に対するよくあるメカニズムとしてしっかりと確立されている（Hansen et al. 2011. Nat. Genet. 43,768-775）。シトシンの５’炭素のメチル化は、一次ＤＮＡ配列に影響を及ぼさないが、遺伝子発現調節において重要な役割を果たす二次的な相互作用に影響を及ぼす、エピジェネティックな修飾形態である。異常なＤＮＡメチル化は、転写を抑制し、続いて、遺伝子発現を抑制する可能性がある。本発明の方法と同様のメチル化解析は、標的ＤＮＡの選択的修飾を含むことができる。そうした修飾は、メチル化依存的制限酵素（ＭＤＲＥ）またはメチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）、好ましくはＭＤＲＥの添加を含むことができる。標的ＤＮＡの選択的修飾は、メチル化ヌクレオチドと非メチル化ヌクレオチドを選択的に区別することができる化学薬剤の添加を含むこともできる。特に、本発明と同様のメチル化解析は、本発明の方法のエラーのないシークエンシングを使用して後で読み取りされ得るメチル化シトシンを選択的に特定することができる。例えば、亜硫酸水素塩による処理は、非メチル化シトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換するが、メチル化シトシンは転換されないことが知られている（Frommer et al. 1992. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 89, 1827-1831）。後亜硫酸水素塩による処理に続くＤＮＡシークエンシングは、メチル化されたヌクレオチド、特にシトシンを特定するのに使用することができる。ＭＤＲＥでの処理はＤＮＡ断片のメチル化依存的制限処理につながるが、ＭＳＲＥでの処理は制限処理のメチル化依存的阻害につながる。ＭｓｅＩ制限処理に加えてＭＤＲＥ／ＭＳＲＥ制限処理に続くＤＮＡシークエンシングは、メチル化されたヌクレオチド、特にシトシンを特定するのに使用することができる。したがって、本発明は、本発明の方法に対するさらなるステップとして、標的ＤＮＡを選択的に修飾するステップ、特に、標的ＤＮＡに含まれるメチル化ヌクレオチドと非メチル化ヌクレオチドを区別するステップを含む、エラーのないＤＮＡメチル化解析方法を提供する。一実施形態では、本発明は、本発明の方法のステップ（ｇ）より前に、亜硫酸水素塩でＤＮＡを処理するステップを含む、ＤＮＡメチル化解析のエラーのない方法を提供する。したがって、本発明は、以下のステップを含む方法を提供する：
（ａ）ＤＮＡを含む試料を用意するステップ；
（ｂ）メチル化核酸残基を選択的に修飾する薬剤、特に亜硫酸水素塩を前記ＤＮＡに加えるステップ；
（ｃ）同様の長さのＤＮＡ断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化するステップであり、
前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または
前記制限エンドヌクレアーゼが３’突出をもたらすことができ、前記ＤＮＡ断片において突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化される、ステップ；
（ｄ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングするステップであり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含む、ステップ；
（ｅ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；
（ｆ）生成された突出をフィルインするステップ；
（ｇ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の配列に結合する配列を含む第３のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＤＮＡ断片を増幅するステップ；
（ｈ）前記増幅したＤＮＡ断片をシークエンシングするステップ；ならびに
（ｉ）メチル化核酸残基を特定するステップ（ここでは、ステップ（ｂ）において、亜硫酸水素塩が薬剤として使用される場合、シトシン（Ｃ）が前記ＤＮＡ試料のメチル化残基に相当し、ウラシル（Ｕ）が前記ＤＮＡ試料の非メチル化残基に相当する）。
（ａ）ＤＮＡを含む試料を用意するステップ；
（ｂ）メチル化核酸残基を選択的に修飾する薬剤、特に亜硫酸水素塩を前記ＤＮＡに加えるステップ；
（ｃ）同様の長さのＤＮＡ断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化するステップであり、
前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または
前記制限エンドヌクレアーゼが３’突出をもたらすことができ、前記ＤＮＡ断片において突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化される、ステップ；
（ｄ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングするステップであり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含む、ステップ；
（ｅ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；
（ｆ）生成された突出をフィルインするステップ；
（ｇ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の配列に結合する配列を含む第３のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＤＮＡ断片を増幅するステップ；
（ｈ）前記増幅したＤＮＡ断片をシークエンシングするステップ；ならびに
（ｉ）メチル化核酸残基を特定するステップ（ここでは、ステップ（ｂ）において、亜硫酸水素塩が薬剤として使用される場合、シトシン（Ｃ）が前記ＤＮＡ試料のメチル化残基に相当し、ウラシル（Ｕ）が前記ＤＮＡ試料の非メチル化残基に相当する）。
標的ＤＮＡに含まれるメチル化ヌクレオチドおよび非メチル化ヌクレオチドを選択的に区別するために、その後にＤＮＡ配列解析をともなうＤＮＡ調製のエラーのない方法も、メチル化依存的制限酵素（ＭＤＲＥ）またはメチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）、好ましくはＭＤＲＥの添加を含むメチル化解析も含むことが好ましい。標的ＤＮＡ断片を増幅するより前に、すなわち本発明の方法のステップ（ｆ）より前に、ＭＤＲＥまたはＭＳＲＥ、好ましくはＭＤＲＥを加えることがさらに好ましい。好ましくは、本発明の第２のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ断片にライゲーションした後、すなわち本発明の方法のステップ（ｄ）の後に、ＭＤＲＥまたはＭＳＲＥを加える。しかし、制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化する、すなわち本発明の方法のステップ（ｂ）とともにまたはそれより前に、ＭＤＲＥまたはＭＳＲＥを加えることも意図される。
ＭＤＲＥまたはＭＳＲＥ、好ましくはＭＤＲＥの添加に続いて、各ＤＮＡ断片を独自に特定し、本明細書で提供されるエラーのないＤＮＡ解析を可能にするために、生成されたＤＮＡ断片を本発明の第２のオリゴヌクレオチドとライゲーションする。本発明の方法において使用するのに好ましいＭＤＲＥおよびＭＳＲＥの例は、それぞれ、特に、ＦｓｐＥＩ、ＭｓｐＪＩ、ＬｐｎＰＩおよびＡｃｃＩＩ、ＨｐａＩＩ、ＤｐｎＩである。
したがって、本発明は以下のステップを含む方法を提供する：
（ａ）ＤＮＡを含む試料を用意するステップ；
（ｂ）同様の長さのＤＮＡ断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化するステップであり、
前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または
前記制限エンドヌクレアーゼが３’突出をもたらすことができ、前記ＤＮＡ断片において突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化される、ステップ；
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングするステップであり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含む、ステップ；
（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；
（ｅ）前記ライゲーションしたＤＮＡ断片をＭＤＲＥまたはＭＳＲＥ、好ましくはＭＤＲＥで消化するステップ；
（ｆ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングし、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含む、ステップ；
（ｇ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；
（ｈ）生成された突出をフィルインするステップ；
（ｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の配列に結合する配列を含む第３のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＤＮＡ断片を増幅するステップ；ならびに
（ｊ）前記増幅したＤＮＡ断片をシークエンシングするステップ。
（ａ）ＤＮＡを含む試料を用意するステップ；
（ｂ）同様の長さのＤＮＡ断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化するステップであり、
前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または
前記制限エンドヌクレアーゼが３’突出をもたらすことができ、前記ＤＮＡ断片において突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化される、ステップ；
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングするステップであり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含む、ステップ；
（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；
（ｅ）前記ライゲーションしたＤＮＡ断片をＭＤＲＥまたはＭＳＲＥ、好ましくはＭＤＲＥで消化するステップ；
（ｆ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングし、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含む、ステップ；
（ｇ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；
（ｈ）生成された突出をフィルインするステップ；
（ｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の配列に結合する配列を含む第３のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＤＮＡ断片を増幅するステップ；ならびに
（ｊ）前記増幅したＤＮＡ断片をシークエンシングするステップ。
ステップ（ｂ）における本発明の方法の特定の用途で本発明によって使用される制限エンドヌクレアーゼは、４〜６個の規定された塩基を有するモチーフを認識することが特に好ましい。そのようなエンドヌクレアーゼは、その認識部位に４つの異なヌクレオチドを有する酵素、例えばＭｓｅｌ、付加的なゆらぎ塩基が制限部位内にある酵素、例えばＡｐｏｌなどを含む。好ましくは、ステップ（ｂ）における本発明の方法の特定の用途で本発明によって使用される制限エンドヌクレアーゼは、コンセンサス配列のＴＴＡＡを認識する。
制限エンドヌクレアーゼがＭｓｅｌまたはそのアイソシゾマーであることが、本発明の方法にとって、特に本発明の方法のステップ（ｂ）にとって最も好ましい。
本発明の方法のステップ（ｂ）で使用される制限エンドヌクレアーゼが認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断することができる制限エンドヌクレアーゼでないことが、さらに好ましい。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ Ｉは、一方の鎖のその認識部位から９ヌクレオチド、および他方の鎖のその認識部位から１３ヌクレオチドの場所で、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。したがって、本発明の方法のステップ（ｂ）で使用される制限エンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼでないことが好ましい。
本発明のさらなる態様では、本発明の方法で使用される第２のオリゴヌクレオチドは第１のオリゴヌクレオチドより長い。第１のオリゴヌクレオチドに対して過剰な長さの第２のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドへの第２のオリゴヌクレオチドの結合／ハイブリダイゼーション、特に、第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列への第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列、すなわち固定配列の結合／ハイブリダイゼーションを調節する。さらに、第２のオリゴヌクレオチドがＤＮＡ断片にライゲーションした後に、第１のオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチド−ＤＮＡ複合体から解離することが好ましい。したがって、結合／ハイブリダイゼーションが、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列、すなわち固定配列への第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列の特異的結合を可能にするように最適化され、その結合／ハイブリダイゼーションが、オリゴヌクレオチド−ＤＮＡ複合体からの第１のオリゴヌクレオチドの解離を可能にするように最適化されることが好ましい。好ましくは、第１のオリゴヌクレオチドは約４〜１５個のヌクレオチドを含み、第２のオリゴヌクレオチドは約３０〜６０個のヌクレオチドを含む。
ランダム化配列、すなわち第２のオリゴヌクレオチドの第２の配列の長さは、独自のバーコード／識別子の所望の数に依存し、その結果、変動し得る。さらに、本発明の方法で使用される第２のオリゴヌクレオチドの第２の配列、すなわち第２のオリゴヌクレオチドのランダム化配列が、約３〜２４個のヌクレオチドを含むことが好ましい。本発明の方法で使用される第２のオリゴヌクレオチドの第２の配列、すなわち第２のオリゴヌクレオチドのランダム化配列が、少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個、最も好ましくは少なくとも５個のヌクレオチドを含むことがより好ましい。
本発明によれば、第１のオリゴヌクレオチドは、好ましくはヌクレオチドＴおよびＡを含む、ＤＮＡ断片の生成された突出に相補的である第１の配列、第２のオリゴヌクレオチドの固定配列に相補的である第２の配列を含み、これは解析される各試料によって異なり、４〜１５個のヌクレオチド、および５’−リン酸末端を有さないヌクレオチド、好ましくはヌクレオチドＣを好ましくは含む。
第２のオリゴヌクレオチドの固定配列のバリエーション、したがって、第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列のバリエーションは、試料識別子（ＳＩＤ）として各試料と関連づける固定配列に基づいて、試料の明確な特定を可能にする。これは、他の標本由来の多数のリード内において、特定の試料に関する配列リードの明確な特定を可能にし、これによって、１回のシークエンシングランにおいて複数の試料の平行解析が可能になる。したがって、より多くの独立に増幅した試料を同時にシークエンシング処理することがきるので、これは、より高い試料処理能力を可能にする。さらに、ＳＩＤを使用してシークエンシングファイルを構文解析し、それによって、配列を１つの試料に明瞭に割り当てることができる。前もってソートされた配列によって、より迅速な患者試料の評価が可能になる。
本発明の特定の一実施形態では、本発明の方法で使用される第１のオリゴヌクレオチドが、配列５’−ＴＡＡＣＴＧＡＣｄｄ−３’と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９５％、もしくは最も好ましくは１００％同一の配列を含むこと、および／または本発明の方法で使用される第２のオリゴヌクレオチドが、配列番号１に示される配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９５％、もしくは最も好ましくは１００％同一の配列を含むこと、および／または本発明の方法で使用される第３のオリゴヌクレオチドが、配列番号２に示される配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９５％、もしくは最も好ましくは１００％同一の配列を含むことが好ましい。
本発明のさらなる実施形態では、本発明の方法で使用される第１のオリゴヌクレオチドが、配列５’−ＴＡＡＣＧＡＣｄｄ−３’に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９５％、もしくは最も好ましくは１００％同一の配列を含むこと、および／または本発明の方法で使用される第２のオリゴヌクレオチドが、配列番号６で示す配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９５％、もしくは最も好ましくは１００％同一の配列を含むこと、および／または本発明の方法で使用される第３のオリゴヌクレオチドが、配列番号２に示される配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９５％、もしくは最も好ましくは１００％同一の配列を含むことが好ましい。
本発明の方法で使用される第１のオリゴヌクレオチドが配列５’−ＴＡＡＣＴＧＡＣｄｄ−３’を有すること、および／または本発明の方法で使用される第２のオリゴヌクレオチドが配列番号１に示される配列を有すること、および／または本発明の方法で使用される第３のオリゴヌクレオチドが配列番号２に示される配列を有することが最も好ましい。
本発明のさらなる態様では、本発明の方法で使用される第１および第２のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡとは別に、互いにハイブリダイズすることができる。特に、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを、本発明の方法のステップ（ｄ）より前に、すなわちライゲーションより前に、特に本発明の方法のステップ（ｃ）の後に、ＤＮＡまたはＤＮＡ断片に加えることができる。したがって、本発明の方法がステップ（ｃ’）をさらに含み、ステップ（ｃ’）において、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ断片とは別に、互いにハイブリダイズし、ＤＮＡ断片に加えられることが好ましい。
本発明の方法で使用される第１のオリゴヌクレオチドを、前記オリゴヌクレオチドの最後の３’ヌクレオチドがジデオキシ（ｄｄ）−ヌクレオチドであるという点で、さらに修飾することができる。
本発明の方法は、本質的に細胞の全核ゲノムの増幅および／またはエラーのないＤＮＡ解析、好ましくは本質的に単一細胞の全ゲノムの増幅を可能にする。当業者に理解されるように、全ゲノム増幅は本質的に全ゲノムが増幅される方法を指すが、必ずしも、ゲノムに存在する各ヌクレオチドが増幅される増幅方法を言及することに限らない。しかし、本発明の方法が、細胞の全ゲノム、好ましくは単一細胞の全ゲノムを増幅することが好ましい。
本発明の方法で使用される単一細胞は、化学固定にかけてあってもよい。化学固定は、ホルマリンおよび／またはアセトンを使用する固定を含むことができる。
本発明によれば、ホーミングエンドヌクレアーゼを、本発明の方法のステップ（ｇ）より前に、特に本発明の方法のステップ（ｆ）の後に加えることができる。したがって、本発明の方法がステップ（ｆ’）をさらに含み、ステップ（ｆ’）において、ホーミングエンドヌクレアーゼが加えられることが好ましい。その際、前記ホーミングエンドヌクレアーゼがＩ−ＳｃｅＩまたはＩ−ＣｅｕＩであることが好ましい。
本発明の方法は、１つの反応器で行うことができる。特に、本発明の方法のステップ（ａ）〜（ｆ）を１つの反応器で行うことができる。しかし、部位特異的エンドヌクレアーゼ反応（ステップｆ’）、好ましくはホーミングエンドヌクレアーゼ反応は、別の反応器で行うことが好ましい。
本発明の好ましい実施形態では、エラーのないＤＮＡシークエンシング方法は、（ａ）単一細胞ＤＮＡを含む試料を用意するステップ；（ｂ）同様の長さのＤＮＡ断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化するステップであり、前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または３’突出であり、前記ＤＮＡ断片において突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化され、前記制限エンドヌクレアーゼがコンセンサス配列のＴＴＡＡを認識する、ステップ；（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングし、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含む、ステップ；（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；（ｅ）生成された突出をフィルインするステップ；（ｆ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の配列に結合する第１の配列を含む第３のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＤＮＡ断片を増幅するステップ；ならびに（ｇ）前記増幅したＤＮＡ断片をシークエンシングするステップを含む。
本発明の一実施形態では、エラーのないＤＮＡシークエンシング方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を用意するステップ；（ｂ）同様の長さのＤＮＡ断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化するステップであり、前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または３’突出であり、前記ＤＮＡ断片において突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化され、前記制限エンドヌクレアーゼがコンセンサス配列のＴＴＡＡを認識する、ステップ；（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングし、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが核酸配列５’−ＴＡＡＣＴＧＡＣｄｄ−３’を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが配列番号１に記載の核酸配列を含む、ステップ；（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；（ｅ）生成された突出をフィルインするステップ；（ｆ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の配列に結合する第１の配列を含む第３のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＤＮＡ断片を増幅し、前記第３のオリゴヌクレオチドが配列番号２に記載の核酸配列を含む、ステップ；ならびに（ｇ）前記増幅したＤＮＡ断片をシークエンシングするステップを含む。
本発明の別の実施形態では、エラーのないＤＮＡシークエンシング方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を用意するステップ；（ｂ）同様の長さのＤＮＡ断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化するステップであり、前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または３’突出であり、前記ＤＮＡ断片において突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化され、前記制限エンドヌクレアーゼがＭｓｅＩまたはそのアイソシゾマーである、ステップ；（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングし、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが核酸配列５’−ＴＡＡＣＴＧＡＣｄｄ−３’を有し、前記第２のオリゴヌクレオチドが配列番号１に記載の核酸配列を有するステップ；（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；（ｅ）生成された突出をフィルインするステップ；（ｆ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の配列に結合する第１の配列を含む第３のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＤＮＡ断片を増幅し、前記第３のオリゴヌクレオチドが配列番号２に記載の核酸配列を有するステップ；ならびに（ｇ）前記増幅したＤＮＡ断片をシークエンシングするステップを含む。
本発明のさらなる実施形態では、エラーのないＤＮＡシークエンシング方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を用意するステップ；（ｂ）同様の長さのＤＮＡ断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化するステップであり、前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または３’突出であり、前記ＤＮＡ断片において突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化され、前記制限エンドヌクレアーゼがＭｓｅＩまたはそのアイソシゾマーである、ステップ；（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングし、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２、第３および第４の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第４の配列が部位特異的エンドヌクレアーゼの制限部位を含む、ステップ；（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；（ｅ）生成された突出をフィルインするステップ；（ｅ’）エキソヌクレアーゼを加えるステップ；（ｆ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の配列に結合する第１の配列を含む第３のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＤＮＡ断片を増幅するステップ；（ｆ’）部位特異的エンドヌクレアーゼを加えるステップ；ならびに（ｇ）前記増幅したＤＮＡ断片をシークエンシングするステップを含む。
本発明は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を用意するステップ；（ａ’’）例えばプロテイナーゼＫのようなプロテイナーゼでＤＮＡを消化するステップ；（ａ’’’）プロテイナーゼを熱不活性化させるステップ；（ｂ）同様の長さのＤＮＡ断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化するステップであり、前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または３’突出であり、前記ＤＮＡ断片において突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化され、前記制限エンドヌクレアーゼがＭｓｅＩまたはそのアイソシゾマーであり得る、ステップ；（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングし、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが第２におよび第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化されたＲＮＡ配列を含む、ステップ；（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；（ｅ）逆転写酵素および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを加えることによって、生成された突出をフィルインするステップ；（ｅ’’）リガーゼを加えるステップの場合に、（ｅ’）例えばＲＮＡｓｅ ＨおよびＲＮＡｓｅのようなＲＮＡ消化酵素を加えるステップ；（ｆ）前記ＤＮＡ断片を増幅するステップ；ならびに（ｇ）前記増幅したＤＮＡ断片をシークエンシングするステップを含む、エラーのないＤＮＡシークエンシング方法に関する。
本発明はさらに、本発明の方法によって得られたシークエンス済みＤＮＡ断片の使用に関する。特に本発明は、本発明の方法によって得られた配列情報の使用に関する。配列情報は、例えば、ＤＮＡ配列解析、細胞系統樹の生成またはコピー数の評価のための方法において使用することができる。特に、本発明の方法によって得られた配列情報は、全ゲノムシークエンシング、全エキソームシークエンシング、全レギュロームシークエンシング、シークエンシングベースのメチル化解析、シークエンシングベースのブレークポイント検出、ＣｈＩＰシークエンシング、またはターゲットシークエンシングなどのＤＮＡ配列解析のための方法において使用することができる。本発明の方法は、投入核酸、好ましくはＤＮＡの量が強く制限されている場合に、すなわち単一細胞ＤＮＡまたはその画分の場合に、上記のアプローチのすべてに特に有用である。さらに、本発明の方法は、野生型（未変化）の発現プロファイル／エピジェネティックプロファイル／遺伝子型を示す配列のバックグラウンドに隠されたまれな配列変異体（すなわち、転写物、転写変異体／アイソフォーム、スプライシング中間体、エピジェネティックな変化の異常部位、点突然変異、インデルならびに他の配列変異および／または突然変異）を探索するための、ディープシークエンシングアプローチを含めたハイスループットシークエンシングアプローチに特に有用であり得る。さらに、本発明の方法によって生成された配列情報は、標的ＤＮＡ内のメチル化部位を特定するのに使用することができる。
本発明はまた、第１、第２、第３および第４の配列を含む４部分オリゴヌクレオチドであって、第１の配列が固定配列を含み、第２の配列がランダム化配列を含み、第３の配列がプライマー結合部位を含み、第４の配列が制限ヌクレアーゼ認識部位および／または制限部位を含む、４部分オリゴヌクレオチドを提供する。本発明によれば、固定配列は好ましくは約４〜１５個のヌクレオチドを含み、ランダム化配列は好ましくは約３〜２４個のヌクレオチド含み、制限ヌクレアーゼ認識部位および／または制限部位は好ましくはホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位および／または制限部位である。
本発明のオリゴヌクレオチドの制限ヌクレアーゼ認識部位および／または制限部位は、好ましくはランダム化配列の５’側に位置する。制限ヌクレアーゼ認識部位および／または制限部位ならびにプライマー結合部位、すなわち本発明のオリゴヌクレオチドの第３および第４の配列は同一であり、かつ／または重複していることがさらに好ましい。制限ヌクレアーゼ認識部位および／または制限部位ならびにプライマー結合部位、すなわち本発明のオリゴヌクレオチドの第３および第４の配列は、１００パーセント同一であり、かつ重複していることが最も好ましい。
本発明の４部分オリゴヌクレオチドが、配列ＧＴＣＡＧＴおよび／もしくはランダム化配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９５％、もしくは最も好ましくは１００％同一の配列を含む固定配列、ならびに／または配列番号３で示す配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９５％、もしくは最も好ましくは１００％同一の配列を含む制限ヌクレアーゼ認識部位、ならびに／または配列番号４で示す配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９５％、もしくは最も好ましくは１００％同一の配列を含むプライマー結合部位を含むことが好ましい。したがって、本発明の４部分オリゴヌクレオチドが、配列番号５で示す配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９５％、もしくは最も好ましくは１００％同一の配列を含むことが好ましい。本発明の４部分オリゴヌクレオチドが、配列番号１２で示す配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９５％、もしくは最も好ましくは１００％同一の配列を含むことも好ましい。
本発明の４部分オリゴヌクレオチドが、配列ＧＴＣＡＧＴを有する固定配列、ならびに／またはランダム化配列、ならびに／または制限ヌクレアーゼ認識部位および／もしくは配列番号３で示す配列を有する制限部位、ならびに／または配列番号４で示す配列を有するプライマー結合部位を含むことが最も好ましい。したがって、本発明の４部分オリゴヌクレオチドが配列番号５で示す配列を有することが好ましい。４部分オリゴヌクレオチドが配列番号１２で示す配列を有することも好ましい。
本発明の４部分オリゴヌクレオチドが、固定配列および／またはランダム化配列および／または制限エンドヌクレアーゼ認識部位および／またはプライマー結合部位を含み、プライマー結合部位が、配列番号１３で示す配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９５％、もしくは最も好ましくは１００％同一の配列を有することが最も好ましい。したがって、本発明の４部分オリゴヌクレオチドが、配列番号１４で示す配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９５％、もしくは最も好ましくは１００％同一の配列を含むことが最も好ましい。
別段定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等の方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。矛盾がある場合には、定義を含めて本明細書を優先する。さらに、材料、方法および実施例は例示に過ぎず、制限を意図したものではない。
本発明の方法および技法は、別段指示がない限り、当技術分野で周知であり、本明細書全体を通して引用され議論される様々な一般的参考文献およびより特定の参考文献に記載されているような従来の方法に従って、一般に行われる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)、およびHarlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)を参照されたい。
図面および前述の説明において本発明を例示し、詳細に説明したが、そうした例示および説明は、例示的または代表的であり、制限するものではないとみなすべきである。変更および修正を、以下の特許請求の範囲の範囲および趣旨内で当業者が行うことができることを理解していると予想される。特に、本発明は、上記および下記の様々な実施形態の特徴の任意の組み合わせを有する、さらなる実施形態を包含する。
本発明はまた、それぞれ図に示されるすべてのさらなる特徴を包含するが、これらは、上記または下記の説明に記載されていない場合もある。さらに、図および説明に記載されている実施形態の個々の代替物およびそれらの特徴の個々の代替物は、本発明の他の態様の主題から放棄され得る。
さらに、特許請求の範囲において、単語「含む」は、他の要素またはステップを排除せず、不定冠詞「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」は、複数を排除しない。単一のユニットは、特許請求の範囲に記載されるいくつかの特徴の機能を果たし得る。属性または値に関連する用語「本質的に」、「約」、「およそ」などはまた、特に、それぞれ、属性を正確に、または値を正確に定義する。特許請求の範囲におけるいかなる参照符号も、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
本発明を、以下の図によっても例示する。
別段指示がない限り、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Sambrook, Russell“Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)に記載されているような、確立された組換え遺伝技術方法を使用した。
エラーのないＤＮＡシークエンシングの方法のデザイン
本方法の極めて重要な構成要素は、単一ＤＮＡ分子の増幅ならびに人為的結果の突然変異の特定および除去を可能にするオリゴヌクレオチドのデザインである。これらのオリゴヌクレオチドは、ライゲーションを介して単一ＤＮＡ分子に結合する。人為的結果の突然変異の除去は、（例えば、単一細胞における）試料の操作前に二本鎖のＤＮＡ分子を形成した相補ＤＮＡ鎖の特定に基づく。したがって、目的のＤＮＡ分子に付加されるオリゴヌクレオチドは、ライゲーション部位で二本鎖分子を形成する。話を簡単にするために、エラーのないシークエンシングのためのこれらのアダプターを形成するオリゴヌクレオチドを、デュプレックスシークエンシングオリゴヌクレオチドロングおよびデュプレックスシークエンシングオリゴヌクレオチドショートそれぞれについて、ＤＳＬまたはＤＳＳと呼んだ。両方のオリゴヌクレオチドの配列について、図１に概要を示す。両方のオリゴヌクレオチドは、部分的に互いに相補的であり、オリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチドデュプレックスの形成を可能にし、これは、ライゲーション媒介ＰＣＲアプローチにおいてアダプターとして使用される（図１）。デュプレックス構造では、ＤＳＳオリゴヌクレオチドは５’−突出を形成し、これは、制限エンドヌクレアーゼによってゲノム表示に導入される制限部位と対応し、（制限酵素ＭｓｅＩについては、これらの塩基はＴＡである）これによって、ＰＣＲ−アダプターのより効率的なライゲーションが可能になる。残りの塩基は、ＤＳＬオリゴヌクレオチドに相補的である。本発明者らは、相補的配列の長さを示すために、下付きのｍ（ＤＳＳｍ）を使用する。ＤＳＳオリゴヌクレオチドは、重合ステップ中のその伸長を防止するために、ジデオキシヌクレオチドを含むことができる（図１）。ＤＳＬオリゴヌクレオチドは３〜４つの部分からなる。３’−末端の配列は、ＤＳＳオリゴヌクレオチドとのオリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチドデュプレックスの形成に関与する固定配列である。これは変動する可能性があり、例えば特定の個体の細胞をタグ付けするために、様々な同一性のオリゴヌクレオチドを生成するのにも使用される（この場合、ＤＳＳオリゴヌクレオチドが相補的配列を有する必要があることに注意）。ＤＳＬオリゴの中央セクションはランダム化配列を含み、これは、標的ＤＮＡにライゲーションされる反応において、各オリゴヌクレオチドに独自に印を付けるバーコードとして使用される。バーコードの長さは変動する可能性がある。ここでの実施例については、本発明者らはランダム塩基の数を示すために、下付きのｎ（ＤＳＬｎ）を加える。第３の、オリゴヌクレオチドの最も５’側に位置する配列は、制限酵素に対する部位特異的なモチーフ、例えば、Ｉ−ＳｃｅＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼの部位特異的なモチーフを含むことができる。ＤＳＬｎオリゴヌクレオチドのこの５’−末端は、全試料表示の効率的なＰＣＲベースの増幅を可能にするようにデザインされている。
本方法の極めて重要な構成要素は、単一ＤＮＡ分子の増幅ならびに人為的結果の突然変異の特定および除去を可能にするオリゴヌクレオチドのデザインである。これらのオリゴヌクレオチドは、ライゲーションを介して単一ＤＮＡ分子に結合する。人為的結果の突然変異の除去は、（例えば、単一細胞における）試料の操作前に二本鎖のＤＮＡ分子を形成した相補ＤＮＡ鎖の特定に基づく。したがって、目的のＤＮＡ分子に付加されるオリゴヌクレオチドは、ライゲーション部位で二本鎖分子を形成する。話を簡単にするために、エラーのないシークエンシングのためのこれらのアダプターを形成するオリゴヌクレオチドを、デュプレックスシークエンシングオリゴヌクレオチドロングおよびデュプレックスシークエンシングオリゴヌクレオチドショートそれぞれについて、ＤＳＬまたはＤＳＳと呼んだ。両方のオリゴヌクレオチドの配列について、図１に概要を示す。両方のオリゴヌクレオチドは、部分的に互いに相補的であり、オリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチドデュプレックスの形成を可能にし、これは、ライゲーション媒介ＰＣＲアプローチにおいてアダプターとして使用される（図１）。デュプレックス構造では、ＤＳＳオリゴヌクレオチドは５’−突出を形成し、これは、制限エンドヌクレアーゼによってゲノム表示に導入される制限部位と対応し、（制限酵素ＭｓｅＩについては、これらの塩基はＴＡである）これによって、ＰＣＲ−アダプターのより効率的なライゲーションが可能になる。残りの塩基は、ＤＳＬオリゴヌクレオチドに相補的である。本発明者らは、相補的配列の長さを示すために、下付きのｍ（ＤＳＳｍ）を使用する。ＤＳＳオリゴヌクレオチドは、重合ステップ中のその伸長を防止するために、ジデオキシヌクレオチドを含むことができる（図１）。ＤＳＬオリゴヌクレオチドは３〜４つの部分からなる。３’−末端の配列は、ＤＳＳオリゴヌクレオチドとのオリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチドデュプレックスの形成に関与する固定配列である。これは変動する可能性があり、例えば特定の個体の細胞をタグ付けするために、様々な同一性のオリゴヌクレオチドを生成するのにも使用される（この場合、ＤＳＳオリゴヌクレオチドが相補的配列を有する必要があることに注意）。ＤＳＬオリゴの中央セクションはランダム化配列を含み、これは、標的ＤＮＡにライゲーションされる反応において、各オリゴヌクレオチドに独自に印を付けるバーコードとして使用される。バーコードの長さは変動する可能性がある。ここでの実施例については、本発明者らはランダム塩基の数を示すために、下付きのｎ（ＤＳＬｎ）を加える。第３の、オリゴヌクレオチドの最も５’側に位置する配列は、制限酵素に対する部位特異的なモチーフ、例えば、Ｉ−ＳｃｅＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼの部位特異的なモチーフを含むことができる。ＤＳＬｎオリゴヌクレオチドのこの５’−末端は、全試料表示の効率的なＰＣＲベースの増幅を可能にするようにデザインされている。
増幅を可能にするために、以下のステップを使用する：
１）ＤＳＬおよびＤＳＳのアダプターの形成
２）アダプターのライゲーション；ここでの実施例において、ＤＳＬは共有結合的にライゲーションするが、ＤＳＳはしない。その後、より短いＤＳＳオリゴヌクレオチドは、重合中の軽度の変性ステップにおいて塩基対形成から遊離される（ステップ３）。
３）ＤＳＬオリゴヌクレオチドの相補的配列の重合（フィルイン反応）。このステップの間、二本鎖バーコードとしてバーコードが生成されている。
４）ＤＳＬオリゴヌクレオチドの５’領域のＰＣＲ−プライマー結合領域に結合する第３のオリゴヌクレオチドが、増幅に使用される。
１）ＤＳＬおよびＤＳＳのアダプターの形成
２）アダプターのライゲーション；ここでの実施例において、ＤＳＬは共有結合的にライゲーションするが、ＤＳＳはしない。その後、より短いＤＳＳオリゴヌクレオチドは、重合中の軽度の変性ステップにおいて塩基対形成から遊離される（ステップ３）。
３）ＤＳＬオリゴヌクレオチドの相補的配列の重合（フィルイン反応）。このステップの間、二本鎖バーコードとしてバーコードが生成されている。
４）ＤＳＬオリゴヌクレオチドの５’領域のＰＣＲ−プライマー結合領域に結合する第３のオリゴヌクレオチドが、増幅に使用される。
エラーのないＤＮＡシークエンシングの方法の概要
その後のエラーのないシークエンシングを可能にする遺伝的表示の調製に使用される手順は、以下のステップからなっていた：
（ａ）ＤＮＡ物質被包する細胞構造およびタンパク質を除去することによるＤＮＡへのアクセス（一般的には、タンパク分解酵素、すなわちプロテイナーゼＫおよび／または界面活性剤を使用して行われる）。
（ｂ）（フリークエントカッティング制限酵素；ここではＭｓｅＩ）を使用する、ＤＮＡ物質の消化。
（ｃ）ＤＳＬｎおよびＤＳＬｍオリゴヌクレオチドのアニーリング。
（ｄ）検査下での、ＤＮＡ物質へのＤＳＬｎ−ＤＳＬｍオリゴヌクレオチドデュプレックスのライゲーション。
（ｅ）任意に：エキソヌクレアーゼもしくは他の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）特異的な酵素またはＤＮＡ／ＲＮＡオリゴの場合はＲＮＡｓｅ Ｈを使用する、未結合（ＤＳＬ／ＤＳＳ）オリゴヌクレオチドの消化。
（ｆ）ＤＳＬｎオリゴヌクレオチドの５’−プライマー結合領域と配列が同一であるユニバーサルプライマー（ここではＤＳＰＣＲと呼ばれる）を使用する、標的ゲノム表示の増幅。
その後のエラーのないシークエンシングを可能にする遺伝的表示の調製に使用される手順は、以下のステップからなっていた：
（ａ）ＤＮＡ物質被包する細胞構造およびタンパク質を除去することによるＤＮＡへのアクセス（一般的には、タンパク分解酵素、すなわちプロテイナーゼＫおよび／または界面活性剤を使用して行われる）。
（ｂ）（フリークエントカッティング制限酵素；ここではＭｓｅＩ）を使用する、ＤＮＡ物質の消化。
（ｃ）ＤＳＬｎおよびＤＳＬｍオリゴヌクレオチドのアニーリング。
（ｄ）検査下での、ＤＮＡ物質へのＤＳＬｎ−ＤＳＬｍオリゴヌクレオチドデュプレックスのライゲーション。
（ｅ）任意に：エキソヌクレアーゼもしくは他の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）特異的な酵素またはＤＮＡ／ＲＮＡオリゴの場合はＲＮＡｓｅ Ｈを使用する、未結合（ＤＳＬ／ＤＳＳ）オリゴヌクレオチドの消化。
（ｆ）ＤＳＬｎオリゴヌクレオチドの５’−プライマー結合領域と配列が同一であるユニバーサルプライマー（ここではＤＳＰＣＲと呼ばれる）を使用する、標的ゲノム表示の増幅。
完全なプロトコールまたはその選択された部分を、様々な種類の試料、例えば、単一細胞、多数の単一細胞、無細胞ＤＮＡ、エキソソームＤＮＡ、化学的に固定された組織標本（すなわちホルマリン固定されたパラフィン包埋組織試料）などに使用することができる。
エキソヌクレアーゼの添加なしで処理される試料。
単一細胞を健康な個体の末梢血から単離したか、ＯＥ−１９食道癌細胞の接着細胞培養から収集した。単一細胞を１．０μＬのＰＢＳに採取し、２．０μＬのプロテイナーゼＫ消化緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓアセテート、ｐＨ７．５、１０ｍＭ Ｍｇアセテート、５０ｍＭ Ｋアセテート（０．２μＬの１０×Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ−Ｂｕｆｆｅｒ−Ｐｌｕｓ緩衝液）；０．６７％Ｔｗｅｅｎ ２０；０．６７％Ｉｇｅｐａｌ；０，６７ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）を含む反応チューブに移した。プロトコールのその後のすべてのステップは、加熱したリットを有するＰＣＲ装置中で行った。プロテイナーゼＫ消化を４２℃で１０時間行い、続いて不活性化ステップを８０℃で１０分間行った。次に、単一細胞ＤＮＡを、０．２μＬの１０×Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ−Ｂｕｆｆｅｒ−Ｐｌｕｓ緩衝液、１０ＵのＭｓｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＨ２Ｏを５．０μＬの全量に加えることによって、ＭｓｅＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）制限エンドヌクレアーゼによる消化にかけた。この制限消化を３７℃で３時間行い、６５℃で５分間熱不活性化した。ライゲーション媒介ＰＣＲのためのアダプターの調製は、ＤＳＬｎオリゴヌクレオチドとＤＳＳｍオリゴヌクレオチドのアニーリングによって達成した。この目的のために、０．５μＬの各オリゴヌクレオチドの１００μＭ原液を１．０μＬのＨ２Ｏと混合した。アニーリングを６５℃で開始し、１５℃に下がるまで１℃／分の勾配で連続的に低下する温度で続けた。アニーリングしたオリゴヌクレオチドに０．５μＬのＤＳＰＣＲオリゴヌクレオチド［１００μＭ原液］、１μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）および１μＬのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ；Ｒｏｃｈｅ）を加えた。続いて、前もって混合したオリゴヌクレオチド／ＡＴＰ／リガーゼ混合物を断片化したＤＮＡ表示に添加し、１５℃で一晩ライゲーションした。その後のＰＣＲ反応を、３μＬのＰＣＲ緩衝液（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅ Ｂｕｆｆｅｒ １、Ｒｏｃｈｅ）、２μＬのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）、５ＵのＰｗｏ／Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（ＰｏｌＭｉｘ，Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅ Ｂｕｆｆｅｒ １、Ｒｏｃｈｅ）およびＨ２Ｏを５０μＬの全量に添加してから開始し、ＰＣＲ装置中で４７サイクルにわたって行った。一次ＰＣＲで使用されるサイクリング手順の詳細について、図１４で概要を示す。
単一細胞を健康な個体の末梢血から単離したか、ＯＥ−１９食道癌細胞の接着細胞培養から収集した。単一細胞を１．０μＬのＰＢＳに採取し、２．０μＬのプロテイナーゼＫ消化緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓアセテート、ｐＨ７．５、１０ｍＭ Ｍｇアセテート、５０ｍＭ Ｋアセテート（０．２μＬの１０×Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ−Ｂｕｆｆｅｒ−Ｐｌｕｓ緩衝液）；０．６７％Ｔｗｅｅｎ ２０；０．６７％Ｉｇｅｐａｌ；０，６７ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）を含む反応チューブに移した。プロトコールのその後のすべてのステップは、加熱したリットを有するＰＣＲ装置中で行った。プロテイナーゼＫ消化を４２℃で１０時間行い、続いて不活性化ステップを８０℃で１０分間行った。次に、単一細胞ＤＮＡを、０．２μＬの１０×Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ−Ｂｕｆｆｅｒ−Ｐｌｕｓ緩衝液、１０ＵのＭｓｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＨ２Ｏを５．０μＬの全量に加えることによって、ＭｓｅＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）制限エンドヌクレアーゼによる消化にかけた。この制限消化を３７℃で３時間行い、６５℃で５分間熱不活性化した。ライゲーション媒介ＰＣＲのためのアダプターの調製は、ＤＳＬｎオリゴヌクレオチドとＤＳＳｍオリゴヌクレオチドのアニーリングによって達成した。この目的のために、０．５μＬの各オリゴヌクレオチドの１００μＭ原液を１．０μＬのＨ２Ｏと混合した。アニーリングを６５℃で開始し、１５℃に下がるまで１℃／分の勾配で連続的に低下する温度で続けた。アニーリングしたオリゴヌクレオチドに０．５μＬのＤＳＰＣＲオリゴヌクレオチド［１００μＭ原液］、１μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）および１μＬのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ；Ｒｏｃｈｅ）を加えた。続いて、前もって混合したオリゴヌクレオチド／ＡＴＰ／リガーゼ混合物を断片化したＤＮＡ表示に添加し、１５℃で一晩ライゲーションした。その後のＰＣＲ反応を、３μＬのＰＣＲ緩衝液（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅ Ｂｕｆｆｅｒ １、Ｒｏｃｈｅ）、２μＬのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）、５ＵのＰｗｏ／Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（ＰｏｌＭｉｘ，Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅ Ｂｕｆｆｅｒ １、Ｒｏｃｈｅ）およびＨ２Ｏを５０μＬの全量に添加してから開始し、ＰＣＲ装置中で４７サイクルにわたって行った。一次ＰＣＲで使用されるサイクリング手順の詳細について、図１４で概要を示す。
エキソヌクレアーゼ処理を含む試料調製。
３〜１８個のランダム塩基を有するバーコードを含むことによって、それぞれの得られる配列が独自的であるような方法で、単一または少数の、細胞の基本的にすべてのライゲーションしたＤＮＡ分子に印が付けられる。したがって、独自のバーコードが失われるか、増幅効率が悪いかのいずれかの理由で、ＤＳＬオリゴヌクレオチドをＰＣＲオリゴヌクレオチドとして使用することができない。さらに、インタクトなバーコードを有するＤＳＬオリゴヌクレオチドは、望まれないランダムプライミング現象によって、ＰＣＲ反応に負の影響を及ぼす可能性がある。
３〜１８個のランダム塩基を有するバーコードを含むことによって、それぞれの得られる配列が独自的であるような方法で、単一または少数の、細胞の基本的にすべてのライゲーションしたＤＮＡ分子に印が付けられる。したがって、独自のバーコードが失われるか、増幅効率が悪いかのいずれかの理由で、ＤＳＬオリゴヌクレオチドをＰＣＲオリゴヌクレオチドとして使用することができない。さらに、インタクトなバーコードを有するＤＳＬオリゴヌクレオチドは、望まれないランダムプライミング現象によって、ＰＣＲ反応に負の影響を及ぼす可能性がある。
ＤＳＬオリゴヌクレオチドの望まれない結合を防止するために、フィルイン反応の後および試料の指数関数的増幅の前に、エキソヌクレアーゼステップを加えることができる。手順のこの実施形態では、プロテイナーゼＫ消化およびＭｓｅＩ消化のステップは、不変のままであった。オリゴヌクレオチド配列のアニーリングは、０．５μＬの１０×Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ−Ｂｕｆｆｅｒ−Ｐｌｕｓ緩衝液、０．５μＬのＤＳＬｎおよびＤＳＳｍオリゴヌクレオチド（各１００μＭ）ならびに１．５μＬのＨ２０からなっていた。手順の先のバリエーションと同様に、アニーリングを６５℃で開始し、１５℃に下がるまで１℃／分の勾配で連続的に低下する温度で続けた。続いて、アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、ＭｓｅＩ消化産物と混合し、１５℃で一晩ライゲーションした。その後の一次ＰＣＲ反応を、３．０μＬのＰＣＲ緩衝液（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅ Ｂｕｆｆｅｒ １、Ｒｏｃｈｅ）、２μＬのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）、５ＵのＰｗｏ／Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（ＰｏｌＭｉｘ，Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅ Ｂｕｆｆｅｒ １、Ｒｏｃｈｅ）および３４．０μＬのＨ２Ｏを添加することにより構築した。フィルインステップ（６８℃で３分）に続いて、０．５μＬのエキソヌクレアーゼＩ（２０Ｕ／μＬ）を添加して、未結合オリゴヌクレオチドを除去した。エキソヌクレアーゼ消化を３７℃で３０分間行い、８５℃で１５分間熱不活性化した。次に、０．５μＬのＤＳＰＣＲオリゴヌクレオチド（１００μＭ）を添加し、ＰＣＲを開始した。使用されるサイクリング手順の仕様について、図１５に概要を示す。
エラーのないシークエンシングのための試料のクオリティーコントロール。
全ゲノム増幅（ＷＧＡ）のクオリティーを予測する代替アッセイを以前に開発した。このアッセイを確立するために、それぞれ個々の細胞についてＷＧＡのクオリティーを評価するためのメタフェーズＣＧＨ、アレイＣＧＨおよびアレルドロップアウト率を使用した。手短に述べると、Ａｍｐｌｉ１（商標）を用いる、単一細胞ＤＮＡの信頼できるかつ均一な全ゲノム増幅を評価するための適切な試験を考案するために、以下の実験を行った。乳癌および前立腺癌の患者骨髄から、ならびに黒色腫患者のリンパ節から単離した単一の播種性癌細胞（ＤＣＣ）の７２個のＷＧＡ産物を、現行の単一細胞ＷＧＡバイオバンクから選択した。３つの腫瘍型のそれぞれから、以前のＣＧＨ実験（ｎ＝３６）においてヒト染色体上で首尾よくハイブリダイズした１２個のＤＣＣ、およびＣＧＨ実験で失敗した３×１２個のＤＣＣを選択した。２３９ｂｐ〜１９３６ｂｐに及ぶ、異なる染色体領域に位置しかつ異なる断片長のＭｓｅＩ制限断片に対する、８つの異なるオリゴヌクレオチド対をデザインした。すべての選択したＤＣＣに対する、８つのオリゴヌクレオチド対を用いる特異的なＰＣＲを行い、公知のＣＧＨの結果を有する結果を相関させた。単一細胞のＷＧＡ産物が少なくとも２／３のマーカーについて陽性であった場合、３つのオリゴヌクレオチド対が、９４％の特異性および９７％の感度で、好結果のメタフェーズＣＧＨ実験を予測できることが分かった（図２）。
全ゲノム増幅（ＷＧＡ）のクオリティーを予測する代替アッセイを以前に開発した。このアッセイを確立するために、それぞれ個々の細胞についてＷＧＡのクオリティーを評価するためのメタフェーズＣＧＨ、アレイＣＧＨおよびアレルドロップアウト率を使用した。手短に述べると、Ａｍｐｌｉ１（商標）を用いる、単一細胞ＤＮＡの信頼できるかつ均一な全ゲノム増幅を評価するための適切な試験を考案するために、以下の実験を行った。乳癌および前立腺癌の患者骨髄から、ならびに黒色腫患者のリンパ節から単離した単一の播種性癌細胞（ＤＣＣ）の７２個のＷＧＡ産物を、現行の単一細胞ＷＧＡバイオバンクから選択した。３つの腫瘍型のそれぞれから、以前のＣＧＨ実験（ｎ＝３６）においてヒト染色体上で首尾よくハイブリダイズした１２個のＤＣＣ、およびＣＧＨ実験で失敗した３×１２個のＤＣＣを選択した。２３９ｂｐ〜１９３６ｂｐに及ぶ、異なる染色体領域に位置しかつ異なる断片長のＭｓｅＩ制限断片に対する、８つの異なるオリゴヌクレオチド対をデザインした。すべての選択したＤＣＣに対する、８つのオリゴヌクレオチド対を用いる特異的なＰＣＲを行い、公知のＣＧＨの結果を有する結果を相関させた。単一細胞のＷＧＡ産物が少なくとも２／３のマーカーについて陽性であった場合、３つのオリゴヌクレオチド対が、９４％の特異性および９７％の感度で、好結果のメタフェーズＣＧＨ実験を予測できることが分かった（図２）。
このアッセイを、１９９９年から２００８年の間に単離され、そのＤＮＡが増幅された１００個の二倍体非癌細胞のコホートで検証した。選択した３つのオリゴヌクレオチド対によって、ＣＧＨ解析を可能にすることが予測された、単一細胞の２２個のＷＧＡ産物、および失敗すると予想された、単一細胞の１０個のＷＧＡ産物を選択した。ＣＧＨのパフォーマンスは、３２のケースすべてで正確に予測された。後に、ＫＲＡＳ遺伝子のしばしば突然変異を受けるコドン１２／１３を包含する１９２ｂｐの長いＭｓｅＩ制限断片上に位置し、単離した細胞のゲノム完全性を予測するための４マーカー多重ＰＣＲアッセイ（Ａｍｐｌｉ１（商標）ＱＣキット）をデザインする第４のＰＣＲオリゴヌクレオチド対を含めた。
次いで、手動で操縦するマイクロマニピュレータを使用して、男性ドナーの末梢血から８８個の単一単核細胞を単離し、ゲノムＤＮＡを増幅し、増幅のクオリティーを、新しく単離した未固定の細胞に基づいて、Ａｍｐｌｉ１（商標）ＱＣキットを用いて評価した。結果は、８３／８８（９４．３％）の細胞が２つまたは３つのＱＣバンドを示すことを示した（図３）。
最終的なＱＣアッセイは、バンドが増幅しない場合、０のゲノム完全性指数（ＧＩＩ）を割り当て；１つのバンドが増幅する場合１を割り当て；２つのバンドが増幅される場合２を割り当て；３つのバンドが増幅される場合３を割り当て；４つバンドが増幅される場合４を割り当てる（図３）。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステムによって単離した、患者からの循環性腫瘍細胞でＧＩＩを試験した。すべての細胞を、いくつかの下流の解析、すなわちｑＰＣＲ、標的化サンガーシークエンシングおよびａＣＧＨによって調査した。さらに、このアッセイは、試料のクオリティーを評価するのに完全に適していた。
多重ＰＣＲベースのＱＣ−アッセイを使用して、エラーのないシークエンシングのための試料のクオリティーを判定した。この反応は、ヒトゲノム中の３つの異なる座位の存在を評価する。この多重反応の陽性率は複数の下流の適用の成功率と相関するので、これは、好結果の全ゲノム増幅の代用マーカーとして使用することができる。
試料調製のクオリティーおよびパフォーマンスをさらに評価するために、試料調製中に導入されるバイアスに起因するアレルドロップアウト（ＡＤＯ）率を解析した。この目的のために、４つの異なるＳＮＰマーカーを選択し、試験シリーズに含まれるすべての標本においてヘテロ接合として試験し、ＲＦＬＰ−ＰＣＲアッセイにおいて、試料におけるそれらの存在について試験した。
エラーのないシークエンシングのための試料調製手順の最適化。
最適なオリゴヌクレオチドデザインの決定。
ＤＳＬオリゴヌクレオチドの望まれないプライミングは、ＤＳＬオリゴヌクレオチドの３’固定配列の長さとバーコードの長さの比に依存する。３’固定配列が短いほど、Ｔａｑポリメラーゼ伸長に極めて重要である塩基の３’結合が弱くなる。バーコードが長いほど、ＰＣＲ中に、十分に相補的なＤＳＬオリゴヌクレオチドがＤＮＡ−アダプター生成物に結合する機会が低くなる。したがって、短いバーコードは、短い固定配列とともにより良く機能し得、固定配列が長いほど、長いバーコードを必要とし得る。
最適なオリゴヌクレオチドデザインの決定。
ＤＳＬオリゴヌクレオチドの望まれないプライミングは、ＤＳＬオリゴヌクレオチドの３’固定配列の長さとバーコードの長さの比に依存する。３’固定配列が短いほど、Ｔａｑポリメラーゼ伸長に極めて重要である塩基の３’結合が弱くなる。バーコードが長いほど、ＰＣＲ中に、十分に相補的なＤＳＬオリゴヌクレオチドがＤＮＡ−アダプター生成物に結合する機会が低くなる。したがって、短いバーコードは、短い固定配列とともにより良く機能し得、固定配列が長いほど、長いバーコードを必要とし得る。
ＤＳＳｍオリゴヌクレオチドの長さが一次ＰＣＲのパフォーマンスにどのように影響するかを試験するため、それぞれ、ＴＴＡＡモチーフを再構成する２つの塩基に加えて５または６塩基の長さを有する、オリゴヌクレオチドの２つの変異体、ＤＳＳ５およびＤＳＳ６を試験した。
２つのオリゴヌクレオチドの組み合わせ、ＤＳＬ１２−ＤＳＳ６およびＤＳＬ９−ＤＳＳ５を、健康な男性ドナーの１０個の単一細胞および２つの細胞プールについて試験した。多重ＰＣＲを使用して、両方のオリゴヌクレオチドデュプレックスのパフォーマンスを評価した（図５）。
ＱＣアッセイの結果は、ＤＳＬ１２とＤＳＳ６からなるアダプターが、再現性よく高クオリティーのＰＣＲ産物をもたらし、一方ＤＳＬ９−ＤＳＳ５の利用は、あまり適さないように思われることを示す（図５Ａ〜Ｂ）。ＤＳＬ１２／ＤＳＳ６を使用する単一細胞ゲノムの包括的な増幅が、ａＣＧＨ実験で確認された（図５Ｃ〜Ｄ）。このため、ＤＳＬ１２−ＤＳＳ６オリゴヌクレオチドの組み合わせのみを用いて、さらなる実験を行った。
一次ＰＣＲ中のオリゴヌクレオチドのアニーリングに対する最適温度の決定。
アダプター媒介性ＰＣＲのパフォーマンスをさらに最適化するために、一次ＰＣＲのサイクリング条件を試験した。ＤＳＬｎオリゴヌクレオチドのランダム化されたタグの取り込みは、異なるオリゴヌクレオチド変異体の可変性アニーリングキネティクスをもたらした。したがって、アニーリング条件の適切な選択は、ＰＣＲの成功に極めて重要であり得る。最適な設定を見つけるために、３つの異なるアニーリング温度、すなわち５７℃、６０℃および６３℃を試験した。単一細胞試料を改変一次ＰＣＲで処理した。その後のＳＮＰ解析は、使用したアニーリング温度と無関係で、匹敵するアレルドロップアウト率を示した（図６）。これは、このプロトコールが、アレル消失がめったになく、単一細胞ゲノムを完全に増幅することができることを示唆する。したがって、ゲノムのカバー度は優れているように思われる。
アダプター媒介性ＰＣＲのパフォーマンスをさらに最適化するために、一次ＰＣＲのサイクリング条件を試験した。ＤＳＬｎオリゴヌクレオチドのランダム化されたタグの取り込みは、異なるオリゴヌクレオチド変異体の可変性アニーリングキネティクスをもたらした。したがって、アニーリング条件の適切な選択は、ＰＣＲの成功に極めて重要であり得る。最適な設定を見つけるために、３つの異なるアニーリング温度、すなわち５７℃、６０℃および６３℃を試験した。単一細胞試料を改変一次ＰＣＲで処理した。その後のＳＮＰ解析は、使用したアニーリング温度と無関係で、匹敵するアレルドロップアウト率を示した（図６）。これは、このプロトコールが、アレル消失がめったになく、単一細胞ゲノムを完全に増幅することができることを示唆する。したがって、ゲノムのカバー度は優れているように思われる。
しかし、多重ＰＣＲを使用するＰＣＲ産物のクオリティー評価は、アニーリング温度の増大は、一次ＰＣＲに対してわずかに負の影響があることを明らかにした（図７）。一次ＰＣＲ中に５７℃のアニーリング温度を使用した場合に、試料は最高のクオリティーを示した（図７）。したがって、この設定をさらなる実験に使用した。
さらなるエキソヌクレアーゼ処理
既に言及したように、一次ＰＣＲにおける未結合のＤＳＬｎオリゴヌクレオチドの存在は、いくつかの下流の適用を、または時折、増幅反応の効率を妨害する可能性がある。これを防止するために、フィルイン反応と一次ＰＣＲにおける制限断片の指数関数的増幅の開始との間に導入されるエキソヌクレアーゼＩ消化ステップの効果を試験した。このアプローチを使用することによって、試料のゲノム表示のＰＣＲベースの増幅を進める前に、未結合オリゴヌクレオチドを除くことを試みた。エキソヌクレアーゼＩを用いる最初の試験は、この酵素は、ＰＣＲ反応において二本鎖ＤＮＡ画分に影響を及ぼさず、未結合ＰＣＲアダプターの除去を可能にすることを示した（図８）。
既に言及したように、一次ＰＣＲにおける未結合のＤＳＬｎオリゴヌクレオチドの存在は、いくつかの下流の適用を、または時折、増幅反応の効率を妨害する可能性がある。これを防止するために、フィルイン反応と一次ＰＣＲにおける制限断片の指数関数的増幅の開始との間に導入されるエキソヌクレアーゼＩ消化ステップの効果を試験した。このアプローチを使用することによって、試料のゲノム表示のＰＣＲベースの増幅を進める前に、未結合オリゴヌクレオチドを除くことを試みた。エキソヌクレアーゼＩを用いる最初の試験は、この酵素は、ＰＣＲ反応において二本鎖ＤＮＡ画分に影響を及ぼさず、未結合ＰＣＲアダプターの除去を可能にすることを示した（図８）。
単一細胞由来アンプリコンへのバーコード導入の直接的証明。
ＭｓｅＩ制限断片が実際にバーコードで印を付けられたか実証するために、ＤＳＬ１２オリゴヌクレオチドを使用して生成された単一細胞試料からランダムに選択された３つの制限断片をシークエンスした。個々の断片を単離するために、サイズ選択した（３００ｂｐより大きい断片のみ）単一細胞ゲノム表示をｐＧＥＭ Ｔ−Ｅａｓｙベクターにクローニングした。これらのコンストラクトで大腸菌（E.coli）細菌を形質転換し、比色Ｘ−Ｇａｌベースで形質転換コロニーを選択した後、さらなる試験のために、３つのコロニーをランダムに選択した。プラスミドＤＮＡの単離の際に、その後のシークエンシングによって、ＤＳＬ１２オリゴヌクレオチドおよびその相補的配列に隣接してヒトゲノムを持つ配列が明らかになった（図８）。予想通り、ランダム化されたバーコード配列は３つのすべての断片について異なっており、これによって、本発明者らの新しいアプローチは単一細胞ＤＮＡ由来のゲノム表示における個々の制限断片の独自のタグ付けを可能にすることが証明される（図９）。同様に、固定された患者タグ配列およびＩ−ＳｃｅＩ部位を取得することができる。
ＭｓｅＩ制限断片が実際にバーコードで印を付けられたか実証するために、ＤＳＬ１２オリゴヌクレオチドを使用して生成された単一細胞試料からランダムに選択された３つの制限断片をシークエンスした。個々の断片を単離するために、サイズ選択した（３００ｂｐより大きい断片のみ）単一細胞ゲノム表示をｐＧＥＭ Ｔ−Ｅａｓｙベクターにクローニングした。これらのコンストラクトで大腸菌（E.coli）細菌を形質転換し、比色Ｘ−Ｇａｌベースで形質転換コロニーを選択した後、さらなる試験のために、３つのコロニーをランダムに選択した。プラスミドＤＮＡの単離の際に、その後のシークエンシングによって、ＤＳＬ１２オリゴヌクレオチドおよびその相補的配列に隣接してヒトゲノムを持つ配列が明らかになった（図８）。予想通り、ランダム化されたバーコード配列は３つのすべての断片について異なっており、これによって、本発明者らの新しいアプローチは単一細胞ＤＮＡ由来のゲノム表示における個々の制限断片の独自のタグ付けを可能にすることが証明される（図９）。同様に、固定された患者タグ配列およびＩ−ＳｃｅＩ部位を取得することができる。
ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドの使用
ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドの使用も想定される。そうした方法は、以下のステップを含む：
１）無細胞ＤＮＡのプロテアーゼ消化；
２）例えばＭｓｅＩを使用する制限処理；
３）アダプターライゲーション。ここでは、第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡからなる第１の配列、ＲＮＡからなる第２の配列およびＤＮＡからなる第３の配列を含むＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。したがって、第２のオリゴヌクレオチドのランダム配列は、ＲＮＡからなる；
４）二本鎖を生成するための、逆転写酵素＋（熱安定性の）ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドの添加。これによって、ライゲーションした第２のオリゴヌクレオチドにおいてＤＮＡ：ＤＮＡ−ＲＮＡ：ＤＮＡ−ＤＮＡ：ＤＮＡ分子が作出される。したがって、ランダム化配列ＲＮＡ鎖に対する相補ＤＮＡ鎖が作出される；
５）ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖ハイブリッドを消化するためのＲＮＡｓｅ Ｈの添加；
６）第１および第２のオリゴヌクレオチドで作られている遊離アダプターの一本鎖ＲＮＡを消化する目的の場合の、ＲＮＡｓｅの添加；
７）ライゲーションした第２のオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列を除去した後、第２のオリゴヌクレオチドの残りのＤＮＡ部分を、ＤＮＡポリメラーゼによって再び連結する；
８）第２のオリゴヌクレオチドの伸長部分を第２のオリゴヌクレオチドの固定領域と連結するための、リガーゼ添加；
８）残りのＰＣＲ試薬の添加；
９）第３のオリゴヌクレオチドの添加。ＲＮＡｓｅステップが効率的である場合、ＰＣＲプライマーが反応の間に作出される。したがって、そこでＲＮＡｓｅステップが効率的である場合、第３のオリゴヌクレオチドを加える必要がない。
ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドの使用も想定される。そうした方法は、以下のステップを含む：
１）無細胞ＤＮＡのプロテアーゼ消化；
２）例えばＭｓｅＩを使用する制限処理；
３）アダプターライゲーション。ここでは、第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡからなる第１の配列、ＲＮＡからなる第２の配列およびＤＮＡからなる第３の配列を含むＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。したがって、第２のオリゴヌクレオチドのランダム配列は、ＲＮＡからなる；
４）二本鎖を生成するための、逆転写酵素＋（熱安定性の）ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドの添加。これによって、ライゲーションした第２のオリゴヌクレオチドにおいてＤＮＡ：ＤＮＡ−ＲＮＡ：ＤＮＡ−ＤＮＡ：ＤＮＡ分子が作出される。したがって、ランダム化配列ＲＮＡ鎖に対する相補ＤＮＡ鎖が作出される；
５）ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖ハイブリッドを消化するためのＲＮＡｓｅ Ｈの添加；
６）第１および第２のオリゴヌクレオチドで作られている遊離アダプターの一本鎖ＲＮＡを消化する目的の場合の、ＲＮＡｓｅの添加；
７）ライゲーションした第２のオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列を除去した後、第２のオリゴヌクレオチドの残りのＤＮＡ部分を、ＤＮＡポリメラーゼによって再び連結する；
８）第２のオリゴヌクレオチドの伸長部分を第２のオリゴヌクレオチドの固定領域と連結するための、リガーゼ添加；
８）残りのＰＣＲ試薬の添加；
９）第３のオリゴヌクレオチドの添加。ＲＮＡｓｅステップが効率的である場合、ＰＣＲプライマーが反応の間に作出される。したがって、そこでＲＮＡｓｅステップが効率的である場合、第３のオリゴヌクレオチドを加える必要がない。
全ゲノム増幅（ＷＧＡ）への適用
本発明の方法で生成されたＷＧＡのパフォーマンスを、単一細胞ＷＧＡ産物のクオリティーを試験するように特にデザインされている多重ＰＣＲアッセイを使用して評価した；Polzer et al. (2014)EMBO Mol Med. Oct 30;6(11):1371-86を参照されたい。この試験は、ＷＧＡ産物における４遺伝子座（ＫＲＡＳ、Ｄ５Ｓ２１１７、ＫＲＴ１９およびＴＰ５３）の存在を評価する。４配列（４陽性バンド）のすべての存在は、高クオリティーの産物の指標となる。反対に、対照ＰＣＲにおける任意の産物の欠如は、ＷＧＡ産物のクオリティーが悪いことを示す。比較として、Jones (1997)BioTechniques 22:938-946によって、およびＵＳ０８／７４２，７５５に記載されているように、プロトコールを行った。以下では、従来技術に記載されているプロトコール、すなわち、Jones (1997)BioTechniques 22:938-946およびＵＳ０８／７４２，７５５を（Ａ）として示し、一方、本発明の方法を使用して行った実験は、（Ｂ）として言及する。
本発明の方法で生成されたＷＧＡのパフォーマンスを、単一細胞ＷＧＡ産物のクオリティーを試験するように特にデザインされている多重ＰＣＲアッセイを使用して評価した；Polzer et al. (2014)EMBO Mol Med. Oct 30;6(11):1371-86を参照されたい。この試験は、ＷＧＡ産物における４遺伝子座（ＫＲＡＳ、Ｄ５Ｓ２１１７、ＫＲＴ１９およびＴＰ５３）の存在を評価する。４配列（４陽性バンド）のすべての存在は、高クオリティーの産物の指標となる。反対に、対照ＰＣＲにおける任意の産物の欠如は、ＷＧＡ産物のクオリティーが悪いことを示す。比較として、Jones (1997)BioTechniques 22:938-946によって、およびＵＳ０８／７４２，７５５に記載されているように、プロトコールを行った。以下では、従来技術に記載されているプロトコール、すなわち、Jones (1997)BioTechniques 22:938-946およびＵＳ０８／７４２，７５５を（Ａ）として示し、一方、本発明の方法を使用して行った実験は、（Ｂ）として言及する。
ＤＮＡ試料の提供
Jones (1997)BioTechniques 22:938-946およびＵＳ０８／７４２，７５５に記載されている方法を本発明の方法と比較した。両方の方法を使用して、出発材料の量を変動させて１３個の試料を増幅した。正常なドナーからの単一の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、１０個のＰＢＬの３つのプールおよび１００個のＰＢＬの３つのプールを有する５反応物を、それぞれの容器中で２連で同時に溶解して、二本鎖ゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を遊離させた。
Jones (1997)BioTechniques 22:938-946およびＵＳ０８／７４２，７５５に記載されている方法を本発明の方法と比較した。両方の方法を使用して、出発材料の量を変動させて１３個の試料を増幅した。正常なドナーからの単一の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、１０個のＰＢＬの３つのプールおよび１００個のＰＢＬの３つのプールを有する５反応物を、それぞれの容器中で２連で同時に溶解して、二本鎖ゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を遊離させた。
ＤＮＡの制限処理
（Ａ）Jones (1997)BioTechniques 22:938-946およびＵＳ０８／７４２，７５５に記載されている方法に従って、単離ＤＮＡを、切断部位がその認識部位とは別個の制限酵素（ここではＢｓｅ ＲＩ）で消化し、それによって、使用した酵素の制限部位に対応する一本鎖突出配列を有する二本鎖分子を作出した。制限処理に続いて、製造者によって提供される情報に従って酵素を失活させた。この実験の設定では、Ｂｓｅ ＲＩの濃度は、単一細胞ＤＮＡ、１０個のＰＢＬおよび１００個のＰＢＬの細胞プール由来のＤＮＡについて、それぞれ、約０．１５１Ｕ／ｐｇ ＤＮＡ、約０，０１５Ｕ／ｐｇ ＤＮＡおよび約０，００１Ｕ／ｐｇ ＤＮＡ（１ユニットは、５０μＬの全反応量において３７℃で１時間で１μｇのλＤＮＡを消化するのに必要とされる酵素量と定義される）。制限消化は、５μＬの反応量で３７℃で３時間行った。
（Ｂ）同時に、本明細書に記載のように、すなわち、単一細胞ＤＮＡ、１０個のＰＢＬおよび１００個のＰＢＬの細胞プール由来のＤＮＡについて、それぞれ、約１．５Ｕ／ｐｇ ＤＮＡ、約０．１５Ｕ／ｐｇ ＤＮＡおよび約０．０１５Ｕ／ｐｇ ＤＮＡの濃度（１ユニットは、５０μＬの全反応量において３７℃で１時間で１μｇのλＤＮＡを消化するのに必要とされる酵素量と定義される）でＭｓｅＩ制限酵素を使用して、単離ＤＮＡを処理した。制限消化は、５μＬの反応量で３７℃で３時間行った。
（Ａ）Jones (1997)BioTechniques 22:938-946およびＵＳ０８／７４２，７５５に記載されている方法に従って、単離ＤＮＡを、切断部位がその認識部位とは別個の制限酵素（ここではＢｓｅ ＲＩ）で消化し、それによって、使用した酵素の制限部位に対応する一本鎖突出配列を有する二本鎖分子を作出した。制限処理に続いて、製造者によって提供される情報に従って酵素を失活させた。この実験の設定では、Ｂｓｅ ＲＩの濃度は、単一細胞ＤＮＡ、１０個のＰＢＬおよび１００個のＰＢＬの細胞プール由来のＤＮＡについて、それぞれ、約０．１５１Ｕ／ｐｇ ＤＮＡ、約０，０１５Ｕ／ｐｇ ＤＮＡおよび約０，００１Ｕ／ｐｇ ＤＮＡ（１ユニットは、５０μＬの全反応量において３７℃で１時間で１μｇのλＤＮＡを消化するのに必要とされる酵素量と定義される）。制限消化は、５μＬの反応量で３７℃で３時間行った。
（Ｂ）同時に、本明細書に記載のように、すなわち、単一細胞ＤＮＡ、１０個のＰＢＬおよび１００個のＰＢＬの細胞プール由来のＤＮＡについて、それぞれ、約１．５Ｕ／ｐｇ ＤＮＡ、約０．１５Ｕ／ｐｇ ＤＮＡおよび約０．０１５Ｕ／ｐｇ ＤＮＡの濃度（１ユニットは、５０μＬの全反応量において３７℃で１時間で１μｇのλＤＮＡを消化するのに必要とされる酵素量と定義される）でＭｓｅＩ制限酵素を使用して、単離ＤＮＡを処理した。制限消化は、５μＬの反応量で３７℃で３時間行った。
ＰＣＲアダプター
（Ａ）（Jones (1997)BioTechniques 22 (5), 938-946の表２で示されるような、およびＵＳ０８／７４２，７５５の実施例２に列挙されるような）アダプターセット１に対応するアダプターを、それぞれが固定ヌクレオチドを上側鎖の３’−末端の位置に保有する４つの異なるアダプターを使用する代わりに、３’−末端の位置に２つの仮想塩基（Ｎ）を呈する上側鎖を有する１つのみのアダプターを使用したことを除いては、Jones et al.の刊行物の材料および方法の章に記載されているように生成した。
（Ａ）（Jones (1997)BioTechniques 22 (5), 938-946の表２で示されるような、およびＵＳ０８／７４２，７５５の実施例２に列挙されるような）アダプターセット１に対応するアダプターを、それぞれが固定ヌクレオチドを上側鎖の３’−末端の位置に保有する４つの異なるアダプターを使用する代わりに、３’−末端の位置に２つの仮想塩基（Ｎ）を呈する上側鎖を有する１つのみのアダプターを使用したことを除いては、Jones et al.の刊行物の材料および方法の章に記載されているように生成した。
アダプターのアニーリング
（Ａ）Jones DH et al., BioTechniques 22 (5), 938-946に記載されている手順に従って、上側鎖および下側鎖のオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、二本鎖アダプターを生成した。
（Ｂ）同時に、本発明の第１および第２のオリゴヌクレオチドを、以下のプロトコールを使用してアニーリングした：ステップ１−８０℃で３０秒、続いてステップ２−インキュベーションステップ６５℃で１分間、およびステップ３：一定勾配の温度で１５℃まで冷却（１℃／分の勾配）。
（Ａ）Jones DH et al., BioTechniques 22 (5), 938-946に記載されている手順に従って、上側鎖および下側鎖のオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、二本鎖アダプターを生成した。
（Ｂ）同時に、本発明の第１および第２のオリゴヌクレオチドを、以下のプロトコールを使用してアニーリングした：ステップ１−８０℃で３０秒、続いてステップ２−インキュベーションステップ６５℃で１分間、およびステップ３：一定勾配の温度で１５℃まで冷却（１℃／分の勾配）。
アダプターのライゲーション
両方の実験について、アダプターを、１μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）および５ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で制限酵素消化産物にライゲーションした。
両方の実験について、アダプターを、１μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）および５ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で制限酵素消化産物にライゲーションした。
ＰＣＲ増幅
（Ａ）アダプターセット１に対して特異的なプライマーによって、ライゲーションした二本鎖分子を増幅し、ここでは、配列は、特定タグとして働くアダプターの上側鎖の配列と相同であった。
（Ｂ）オリゴヌクレオチド２に対して特異的なプライマーによって、ライゲーションした二本鎖分子を増幅し、ここでは、オリゴヌクレオチド２の末端部は、プライマー結合タグとして働く。すなわち、本発明の方法で使用される第３のオリゴヌクレオチドを使用して、ライゲーションした二本鎖分子を増幅した。
（Ａ）アダプターセット１に対して特異的なプライマーによって、ライゲーションした二本鎖分子を増幅し、ここでは、配列は、特定タグとして働くアダプターの上側鎖の配列と相同であった。
（Ｂ）オリゴヌクレオチド２に対して特異的なプライマーによって、ライゲーションした二本鎖分子を増幅し、ここでは、オリゴヌクレオチド２の末端部は、プライマー結合タグとして働く。すなわち、本発明の方法で使用される第３のオリゴヌクレオチドを使用して、ライゲーションした二本鎖分子を増幅した。
評価
両方の方法のＷＧＡに対する適合性を、ＱＣ２多重ＰＣＲアッセイ（Polzer et al 2014; EMBO Molecular Medicine (2014)6,1371-1386）によって評価した。
両方の方法のＷＧＡに対する適合性を、ＱＣ２多重ＰＣＲアッセイ（Polzer et al 2014; EMBO Molecular Medicine (2014)6,1371-1386）によって評価した。
結果
Jones DH, BioTechniques 22:938-946およびＵＳ０８／７４２，７５５に記載されている方法によって増幅したすべての試料における多重ＰＣＲアッセイの否定的な結果は、このアプローチは全ゲノム増幅に適さず、その結果、全ゲノムのエラーのないシークエンシングをもたらすことができないことを示す。したがって、その中で記載されている方法の適用は、選択され、（例えば、ＰＣＲによって）前もって増幅されたゲノム座位のシークエンシングのみに限定されて、全ゲノム解析用ではない。
Jones DH, BioTechniques 22:938-946およびＵＳ０８／７４２，７５５に記載されている方法によって増幅したすべての試料における多重ＰＣＲアッセイの否定的な結果は、このアプローチは全ゲノム増幅に適さず、その結果、全ゲノムのエラーのないシークエンシングをもたらすことができないことを示す。したがって、その中で記載されている方法の適用は、選択され、（例えば、ＰＣＲによって）前もって増幅されたゲノム座位のシークエンシングのみに限定されて、全ゲノム解析用ではない。
それとは対照的に、本発明の方法を使用して生成されたＷＧＡ産物へ適用した場合に得られた多重アッセイの肯定的な結果は、この技術が全ゲノム配列表示の全ゲノム増幅に適することを示す。さらに、本発明の方法は、続いて、全ゲノムのエラーのないシークエンシングに使用することができる。図１８に示すように、本発明の方法によって、当業者は、少ない量の出発材料しか存在しない試料からＤＮＡを増幅し、続いて、配列情報を取得することが可能になる。特に、本発明の方法は、本明細書で提供されるような方法を使用してその配列情報が次いで取得され得る、単一細胞のＤＮＡを増幅することができる。
単一細胞ＤＮＡのエラーのないシークエンシング
本発明の方法で使用される第２のオリゴヌクレオチドの一部としてバーコード／識別子としてのランダム化配列を使用するエラー補正の実行可能性を実証するために、２つの実験を行った。このために、アダプターを含むランダム化配列を、単一細胞またはＦＡＣＳでソートしたヒト染色体２２のいずれかからの、約６ｐｇのＭｓｅＩ消化ＤＮＡにライゲーションした。その後、ＭｓｅＩ断片をＡｍｐｌｉ１（商標）を使用して増幅し、続いて、Ｒｏｃｈｅ ＧＳ ４５４ ＦＬＸ＋プラットフォームでシークエンスした。
本発明の方法で使用される第２のオリゴヌクレオチドの一部としてバーコード／識別子としてのランダム化配列を使用するエラー補正の実行可能性を実証するために、２つの実験を行った。このために、アダプターを含むランダム化配列を、単一細胞またはＦＡＣＳでソートしたヒト染色体２２のいずれかからの、約６ｐｇのＭｓｅＩ消化ＤＮＡにライゲーションした。その後、ＭｓｅＩ断片をＡｍｐｌｉ１（商標）を使用して増幅し、続いて、Ｒｏｃｈｅ ＧＳ ４５４ ＦＬＸ＋プラットフォームでシークエンスした。
実験の設定
（ａ）単一細胞由来のＤＮＡを抽出した；
（ｂ）制限酵素としてＭｓｅＩを使用して、このＤＮＡ試料を消化した；
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを生成された突出にアニーリングした。続いて、ランダム化配列を含む第２のオリゴヌクレオチドを、第１のオリゴヌクレオチドにアニーリングした；
（ｄ）第２のオリゴヌクレオチドをＭｓｅＩ断片の末端にライゲーションした；
（ｅ）ライゲーションした第２のオリゴヌクレオチドによって生成された突出をフィルインした；
（ｆ）第２のオリゴヌクレオチドの第３の配列に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、断片を増幅した；
（ｆ’）第２のオリゴヌクレオチドがホーミングエンドヌクレアーゼ、すなわちＳｃｅＩの切断部位を含んでいたので、増幅に続いて増幅断片を切断した；
（ｇ）切断断片を末端修復し、Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＲａｐｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔに提供されるＹ−アダプターにＴ／Ａ−ライゲーションした。ＧＳ ４５４ ＦＬＸ＋プラットフォームでのシークエンシングを、４５４シークエンシングシステム方法のマニュアルＸＬＲ７０シリーズに記載されているように行った。
（ａ）単一細胞由来のＤＮＡを抽出した；
（ｂ）制限酵素としてＭｓｅＩを使用して、このＤＮＡ試料を消化した；
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを生成された突出にアニーリングした。続いて、ランダム化配列を含む第２のオリゴヌクレオチドを、第１のオリゴヌクレオチドにアニーリングした；
（ｄ）第２のオリゴヌクレオチドをＭｓｅＩ断片の末端にライゲーションした；
（ｅ）ライゲーションした第２のオリゴヌクレオチドによって生成された突出をフィルインした；
（ｆ）第２のオリゴヌクレオチドの第３の配列に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、断片を増幅した；
（ｆ’）第２のオリゴヌクレオチドがホーミングエンドヌクレアーゼ、すなわちＳｃｅＩの切断部位を含んでいたので、増幅に続いて増幅断片を切断した；
（ｇ）切断断片を末端修復し、Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＲａｐｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔに提供されるＹ−アダプターにＴ／Ａ−ライゲーションした。ＧＳ ４５４ ＦＬＸ＋プラットフォームでのシークエンシングを、４５４シークエンシングシステム方法のマニュアルＸＬＲ７０シリーズに記載されているように行った。
シークエンシング
方法は４５４ＦＬＸプラットフォームを使用して行ったが、代替のシークエンシング方法を使用することができることを当業者であれば認識するであろう。
方法は４５４ＦＬＸプラットフォームを使用して行ったが、代替のシークエンシング方法を使用することができることを当業者であれば認識するであろう。
解析
シークエンス済みＤＮＡ断片の解析は、ランダム化配列の特定およびその後のアダプタートリミングを必要とした。社内のＪＡＶＡプログラムを使用して両方を行った。
シークエンス済みＤＮＡ断片の解析は、ランダム化配列の特定およびその後のアダプタートリミングを必要とした。社内のＪＡＶＡプログラムを使用して両方を行った。
手短に言えば、スミス−ウォーターマンアルゴリズムの改変ｂｉｏｊａｖａの実行に基づいて、第２のオリゴヌクレオチドの配列をリード内で特定し；ランダム化配列をリードヘッダーに書き、アダプター配列を切り取り、一方、ＭｓｅＩ制限部位（「ＴＴＡＡ」）を保持した。アダプター、したがってランダム化配列も特定できなかったリード（すべてのリードの１〜３．５％）を捨てた。さらに、アダプタートリミングの後に２０ｂｐ未満の長さを有するリードを捨てた（アダプターが特定されたすべてのリードの０．７〜４．３％）。非ヒト種からの混入リード配列のスクリーニングによって混入がないことが明らかになったので、標準設定でＢＷＡ ｍｅｍアルゴリズム（Li and Durbin, Bioinformatics 2009 Jul 15;25(14):1754-60）を使用して、トリミングしたリードをヒトゲノムアセンブリー１９に対して直接マップした。本発明の方法を使用してシークエンシングエラーおよび真の突然変異／ＳＮＰを区別する能力を例示するために、少なくとも１２のリードカバー度を有するそれらのゲノム領域を特定した。次いでこれらを、同一のランダム化配列を有する少なくとも８リードが存在する領域について、さらに選別した。得られたデータセットから、推定上のＳＮＰ／突然変異／シークエンシングエラーを含む４領域をランダムに選択した。示されるアライメントについて、同じランダム化配列を含むすべてのリードを使用した。
結果
参照ゲノムの同じ位置に対して整列させたリードのランダム化配列を使用すると、シークエンシング−／増幅エラー、一塩基多型と真の突然変異とを正確に区別することが可能になった。ランダム化配列を共有するリードのすべての群において、参照からの単一ヌクレオチド変異は、ランダム化配列の一群に特異的であることが分かった（図１９ａ〜ｄ）。
参照ゲノムの同じ位置に対して整列させたリードのランダム化配列を使用すると、シークエンシング−／増幅エラー、一塩基多型と真の突然変異とを正確に区別することが可能になった。ランダム化配列を共有するリードのすべての群において、参照からの単一ヌクレオチド変異は、ランダム化配列の一群に特異的であることが分かった（図１９ａ〜ｄ）。
Claims (18)
- エラーのないＤＮＡシークエンシング方法であって、
（ａ）ＤＮＡを含む試料を用意するステップ；
（ｂ）同様の長さのＤＮＡ断片を得るのに適した条件下で、制限エンドヌクレアーゼで前記ＤＮＡを消化するステップであり、
前記制限エンドヌクレアーゼが５’突出をもたらすことができ、前記突出の末端ヌクレオチドがリン酸化されるか、または
前記制限エンドヌクレアーゼが３’突出をもたらすことができ、前記ＤＮＡ断片において前記突出の末端ヌクレオチドがヒドロキシル化される、ステップ；
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にアニーリングするステップであり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の配列が、前記ＤＮＡ断片のそれぞれ５’または３’突出に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの第２の配列が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の配列に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２および第３の配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の配列がランダム化配列を含む、ステップ；
（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片にライゲーションするステップ；
（ｅ）生成された突出をフィルインするステップ；
（ｆ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の配列に結合する配列を含む第３のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＤＮＡ断片を増幅するステップ；ならびに
（ｇ）前記増幅したＤＮＡ断片をシークエンシングするステップ
を含む、方法。 - 前記第２のオリゴヌクレオチドが、部位特異的エンドヌクレアーゼの制限部位を含む第４の配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１または２に記載の方法。
- ステップ（ｅ’）をさらに含み、前記ステップ（ｅ’）においてエキソヌクレアーゼが加えられる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記エキソヌクレアーゼが、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ分子を分解する酵素である、請求項４に記載の方法。
- 前記ＤＮＡが、（ｉ）単一細胞のゲノムまたはトランスクリプトーム、（ｉｉ）単一細胞の染色体、（ｉｉｉ）単一細胞のエキソソームもしくは他の微小胞からの核酸、または（ｉｖ）項目（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つの材料の断片もしくは亜画分を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＤＮＡが、（ｉ）１つより多くの単一細胞のＤＮＡ、（ｉｉ）１つより多くの単一細胞の無細胞胎児ＤＮＡ、（ｉｉｉ）癌患者の血清および／もしくは血漿中の１つより多くの単一細胞の無細胞ＤＮＡ、または（ｉｖ）項目（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つの材料の断片もしくは亜画分を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記制限エンドヌクレアーゼがＭｓｅＩまたはそのアイソシゾマーである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ランダム化配列が３〜２４個のヌクレオチドを含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドが配列５’−ＴＡＡＣＴＧＡＣｄｄ−３’を有し、および／または前記第２のオリゴヌクレオチドが配列番号１に示される配列を有し、および／または前記第３のオリゴヌクレオチドが配列番号２に示される配列を有する、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドの最後の３’ヌクレオチドがｄｄ−ヌクレオチドである、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（ｆ’）をさらに含み、前記ステップ（ｆ’）においてホーミングエンドヌクレアーゼが加えられる、請求項２から１１のいずれか１項に記載の方法。
- ＤＮＡ配列解析、細胞系統樹の生成またはコピー数の評価のための方法における、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法によって得られたシークエンス済みＤＮＡ断片の使用。
- ＤＮＡ配列解析のための方法が、全ゲノムシークエンシング、全エキソームシークエンシング、全レギュロームシークエンシング、シークエンシングベースのメチル化解析、シークエンシングベースのブレークポイント検出、ＣｈＩＰシークエンシング、またはターゲットシークエンシングおよびそれらの変形である、請求項１３に記載の使用。
- 固定配列、ランダム化配列、制限ヌクレアーゼ認識部位および制限部位、ならびにプライマー結合部位を含む４部分オリゴヌクレオチドであって、前記固定配列が４〜１５個のヌクレオチドを含み、前記ランダム化配列が３〜２４個のヌクレオチドを含み、前記制限ヌクレアーゼ認識部位がホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、４部分オリゴヌクレオチド。
- 前記固定配列がＧＴＣＡＧＴを含み、前記制限ヌクレアーゼ認識部位が配列番号３を含み、前記プライマー結合部位が配列番号４を含む、請求項１５に記載の４部分オリゴヌクレオチド。
- 配列番号５または１２を含む、請求項１５または１６に記載の４部分オリゴヌクレオチド。
- 配列番号１４を含む、請求項１５に記載の４部分オリゴヌクレオチド。
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