CN102985559A

CN102985559A - 用于检测沙眼衣原体的检验

Info

Publication number: CN102985559A
Application number: CN2010800639975A
Authority: CN
Inventors: 大卫·皮尔斯; 马克·恩赖特
Original assignee: Atlas Genetics Ltd
Current assignee: Binx Health Ltd
Priority date: 2009-12-17
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2030-12-17
Also published as: CN102985559B; BR112012017061A2; JP2013514076A; WO2011073675A2; AU2010332523B2; AU2010332523A1; EA201200907A1; EP2513331B1; US9982312B2; US20130209998A1; EA027074B1; CA2784474A1; WO2011073675A3; GB0922097D0; EP2513331A2

Abstract

本发明涉及一种检测来源于沙眼衣原体的遗传物质的方法，该方法包括检测特定的核酸序列，所述方法任选地使用特异性引物和探针，并且任选地结合对来源于黑腐坚固杆菌的遗传物质进行检测，该遗传物质作为内对照；本发明还涉及相关的产品和试剂盒。

Description

用于检测沙眼衣原体的检验

技术领域

本发明涉及检验产品、用途和方法，特别是与聚合酶链式反应（PCR）有关的那些。更具体而言，本发明涉及对沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）的检验以及改进的PCR对照。

背景技术

沙眼衣原体是专性的人类细胞内病原体。衣原体感染是普遍的性传播疾病，该细菌可以在男性和女性中引起多种病状。临床症状包括尿道炎、直肠炎、沙眼、不孕不育、前列腺炎、附睾炎、子宫颈炎、盆腔炎症性疾病（PID）以及宫外孕。它还是能够引起眼睛和肺部感染的新生儿病原体。

沙眼衣原体感染是世界范围最普遍的性传播疾病之一。据估计，美国有2-3百万个体感染有衣原体。在英国，据估计，25岁以下的性活跃年轻人中有十分之一感染有衣原体。

利用抗生素（例如，诸如强力霉素之类的四环素，或者诸如阿奇霉素之类的大环内脂类抗生素）能够成功地治疗沙眼衣原体感染。为了确保及时地提供恰当的治疗，需要准确的诊断沙眼衣原体感染。在诸如英国等一些国家，已经启动了筛查衣原体的国家计划。

沙眼衣原体的感染单位为原体（EB）。EB作为“孢状”体，其目的是允许衣原体在宿主细胞外的非支持性环境下的存活。EB被认为是代谢惰性的，直到其粘附到并且被易感宿主细胞吞噬。可以利用核酸扩增的方法来检测沙眼衣原体，例如，基于聚合酶链式反应（PCR）的方法。PCR有可能扩增来自被感染细胞以及EB中的核酸。沙眼衣原体在其染色体和质粒中均含有遗传物质，每个EB中染色体以单拷贝存在，质粒以6至1 0个拷贝存在。通常，由于质粒在每个EB中为多拷贝，并且由于推测通过检测基于质粒的靶标能够获得更高的灵敏度，质粒被用作核酸扩增试验的优选靶标。然而，在发现沙眼衣原体瑞典变种之后，质粒核酸扩增试验检测体系的适用性已成为问题。瑞典变种在质粒中包含377个碱基对的缺失，因此当遇到沙眼衣原体瑞典变种时，以缺失区域为靶标的检测体系将会提供假阴性结果。

本发明基于实现这样的检验，其检测可能更加稳定地存在于沙眼衣原体染色体中的序列，因为染色体基因通常突变较少，并且在某种情况下质粒可能会完全丢失。可以预想以染色体中的基因作为靶标是不利的，因为在每个细胞中染色体靶标仅以单拷贝的形式存在。然而，本发明的发明人惊奇地发现，染色体靶标可以提供与质粒靶标相当的检测限（LOD）。

核酸扩增试验（NAAT）

有大量适合本发明使用的核酸扩增试验（NAAT）法。它们包括公知的PCR、连接酶链式反应（LCR）、链置换扩增（SDA）、重组酶-聚合酶扩增（RPA）、转录介导的扩增、核酸序列依赖性扩增（NASBA）、解旋酶依赖性扩增以及环介导等温扩增。NAAT法很大程度上取代了沙眼衣原体的培养检测法，这不仅是因为培养法需要使用哺乳动物细胞或组织培养，从而增加了复杂性。NAAT法以高灵敏度序列特异性的方式，利用酶来扩增一种或多种靶序列，从而进行核酸检测。

关于NAATs进一步的细节，读者可以参阅以下参考文献，这里以引用的方式将其内容并入本文：

核酸序列依赖性扩增（NASBA）

-Compton J.Nucleic acid sequence-based amplification

Nature 1991:350(6313):91-2

转录介导的扩增

-Wroblewski J.等，Comparison of Transcription Mediated

Amplification and PCR Assay Results from Various Genital

Specimen Types for Detection of Mycoplasma genitalium.J.Clin.

Microbiol.2006:44(9):3306-3312

连接酶链式反应

-Wiedmann M.等，Ligase chain reaction(LCR)overview andApplications.PCR Methods and Applications 19943(4)S51-64环介导的等温DNA扩增

-Notomi等，Loop-Mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids.Res.200023(12):E63

解旋酶依赖性扩增

-Vincent M.等，Helicase-dependent isothermal DNAAmplification EMBO Rep.20045(8)795-800

链置换扩增

-Strand displacement amplification-an isothermal in vitroAmplification technique.Walker等，Nucleic Acids Res.1992.20(7)1691-1696

重组酶聚合酶扩增（RPA）

-DNA Amplification and Detection Made Simple(Relatively).Hoff.M.Public Libr.Sic.2006:4(7):e222；以及美国专利US7270981。

聚合酶链式反应（PCR）

PCR是以高敏感度序列特异性的方式，利用热稳定聚合酶并且循环进行反应的温度条件来检测核酸的方法。

最简单形式的PCR反应经过三个阶段的循环：i）在大约90-100℃的温度下进行的变性阶段。在此高温下，双链DNA变性或“解链”以形成单链DNA，ii）在50-65℃的典型温度下进行引物退火。此步骤中，正向引物和反向引物与存在于溶液中的任意靶标的互补区域杂交，以及iii）通常在50-80℃下进行的延伸阶段，在此过程中，聚合酶链式反应利用溶液中的三磷酸脱氧核苷酸来延伸引物的3′端。通常，该循环进行25-45次。根据某些PCR方案，退火步骤和延伸步骤可以合并，从而使样品经过90℃至100℃区间，之后50℃至80℃区间的两步程序。理论计算显示，30个循环的PCR反应可以将单个靶分子扩增268,435,456倍。因为扩增反应的效率低，实际的扩增可能比这少，但尽管如此，PCR反应通常仍然可以将单个或者极少数的靶分子扩增数百万倍，从而使靶分子更加容易被检测。PCR反应依赖于热稳定DNA聚合酶，例如，分离自嗜热菌属水生栖热菌（Thermus aquaticus）的Taq聚合酶。其它的热稳定DNA聚合酶可以取代Taq，例如分离自激烈热火球古菌（Pyrococcus furiosus）的Pfu聚合酶，其具有Taq聚合酶所没有的校对活性，因此是保真度更高的酶。

在大部分分子生物学教科书中都能找到聚合酶链式反应的综述，参见（例如）以引用方式并入本文的《基因操作原理-基因工程导论》（Old和Primrose著，Blackwell Science公司）。有大量不同的“PCR程式（PCR format）”。作为基本要求，PCR反应需要被设计为与靶序列的各一侧分别杂交的正向引物和反向引物。扩增反应针对两个引物之间的插入序列进行。可以用非特异的方式来检测扩增的PCR产物，所述方式只检测双链核酸的存在（例如，使用插入双链DNA的染料，例如溴化乙锭或SYBR-green）。可选的是，可以通过（例如）在检测之前先对反应产物进行电泳来分析产物的近似分子量，从而对产物进行半特异性检测。可选的是，有大量的序列特异性检测方法，其通常使序列特异性核酸探针与扩增区域杂交，或者使用核酸聚合酶的核酸外切酶活性，并且测量伴随靶序列的扩增而发生的探针的降解。与通常需要培养和孵育很多天的更传统的方法相比，基于PCR法的病原体检测通常具有更快得出结果的优点。PCR的结果可以在几个小时或更短的时间内得到。

发明内容

根据本发明的第一个方面，提供了一种在样品中检测来源沙眼衣原体的遗传物质的方法，该方法包括核酸序列的序列特异性检测，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1或其互补序列中的至少10个连续的核苷酸残基；

SEQ ID NO:1：atgaattcaa atatagaata taggcaatat cgtatagatatactgagctg ttttatctgc ttgctaatga tggtttggac actagtcagcatcaagctag gagattctct aggaggcatc attcctggat gcttaggatacttactggct aaaaggaagc atcgccgtcc tgtccgctgg ttcttccttacttttttctt tggcattgcc tctggaatct tccttgtcgt tcttcatcctaagcaaaagt aa；

其中所述序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变。

根据本发明的第二个方面，提供了一种包含这样的核酸序列的正向PCR引物，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:15中的个数介于17个至34个之间的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:15：tgatg-g/c-t/a-t/a-t/a-g/c-g/c-a/t-cactagtcagcatcaagc taggagatt；

可供选择的是，如果采取提高引物退火温度的措施，则来自SEQID NO:15的序列可以更短（长度优选介于12个至22个残基之间，或者19个至29个残基之间）。

根据本发明的第三个方面，提供了一种包含这样的核酸序列的反向PCR引物，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:16中的个数介于15个至31个之间的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:16：aaggaagatt ccagaggcaa tgccaaagaa aaaagt；

可供选择的是，如果采取提高引物退火温度的措施，则来自SEQID NO:16的序列可以更短（长度优选介于10个至20个残基之间，或者16个至26个残基之间）。

根据本发明的第四个方面，提供了一种包含这样的核酸序列的核酸探针，所述核酸序列包含SEQ ID NO:4或其互补序列中所提供的个数介于18个至28个之间的核酸残基；

SEQ ID NO:4：ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt；

可供选择的是，如果采取提高探针退火温度的措施，则来自于SEQ ID NO:4的探针序列可以更短（长度优选介于13个残基至23个残基之间）。

根据本发明的第五个方面，提供了一种PCR组分，其包含根据本发明的正向PCR引物和根据本发明的反向PCR引物。

根据本发明的第六个方面，提供了一种试剂盒，其包括根据本发明的PCR组分，以及进行根据本发明的方法的说明书。

根据本发明的第七个方面，提供了一种在样品中检测来源于黑腐坚固杆菌（Pectobacterium atrosepticum）的遗传物质的方法，该方法包括对包含在黑腐坚固杆菌的染色体中的核酸序列进行序列特异性检测。

分别根据本发明的第八个、第九个和第十个方面，其分别提供了在本发明的第五个方面中定义为“第二正向PCR引物”的正向PCR引物；在本发明的第五个方面中定义为“第二反向PCR引物”的反向PCR引物；以及在本发明的第五个方面中定义为“第二PCR探针”的PCR探针。

本发明还提供了包含本发明第八个、第九个或第十个方面所述的任意一种或多种正向PCR引物、反向PCR引物、或者PCR探针的PCR组分，与PCR反应的一种或多种其它组分结合。

附图说明

图1a至1c示出了对实施例所述的质粒靶标扩增子3、5和7进行检测限（LOD）测定实验的结果。

图2a至2c示出了对实施例所述的染色体靶标扩增子9、17和18进行检测限（LOD）测定实验的结果。

图2d示出了对实施例所述的染色体扩增子17[Mg²⁺]优化实验的结果。

图3示出了实施例8所述的染色体扩增子17的实验结果。

图4示出了内对照引物和内对照DNA对采用双重PCR产生的沙眼衣原体扩增子的电化学检测的影响（实施例9）。误差棒（errorbar）表示标准偏差（SD）（n=3）。各个四柱组中的每个误差棒的图例与图5中的相同。图例“ME17引物+20pg IC DNA”对应于每个四柱组中第一个柱。图例“ME17引物，无IC DNA”对应于每个四柱组中第二个柱。图例“ME17和IC引物+200μgIC DNA”对应于每个四柱组中第三个柱。图例“ME17和IC引物，无IC DNA”对应于每个四柱组中第四个柱。

图6a示出了沙眼衣原体扩增产物的电泳凝胶，没有设置内对照引物组。电泳条带1=100bp ladder；电泳条带2至4=10,000IFU反应；电泳条带5至7=1,000IFU反应；电泳条带8至10=100IFU反应；电泳条带11至13=10IFU反应；电泳条带14至16=1IFU反应。

图6b与图6a相同，但电泳条带1=100bp ladder，电泳条带2至4=无IFU反应。

图7a和图7b与图6a和图6b相同，但反应包含内对照引物组。

图8示出了使用沙眼衣原体（CT，每对的第一个柱）引物SEQID NOs：17和19以及内对照（IC，每对的第二个柱）引物组进行双重扩增的样品的电化学检测结果。所有情况都加入了200pg内对照DNA。误差棒表示标准偏差（n=3）。

图9示出了实施例10所述的比较双重实验的结果。

具体实施方式

定义

聚合酶链式反应（PCR）

如背景技术部分所述，PCR是在分子生物学中广泛使用的技术，其通过体外酶复制来扩增DNA片段。关于反应过程，早期复制所产生的DNA用作后期复制的模板。这开始了这样的链式反应，其中DNA模板以指数或近似指数的方式扩增。通过PCR，可以将核酸的单个或者极少数的拷贝扩增几个数量级，从而产生更容易被检测到的数以百万计或更多的拷贝。最基本的PCR设置需要以下组分；i）待扩增的DNA模板或者靶标；ii）一对引物；与靶区域5′末端的DNA区域互补的正向引物，以及与靶区域3′末端的DNA区域互补的反向引物；iii）热稳定的DNA聚合酶，例如Taq聚合酶；iv）脱氧核苷三磷酸（dNTPs）。这些被用作DNA聚合酶用以合成新的DNA链的基本物质；v）适当的缓冲溶液；vi）镁离子或其它合适的阳离子；vii）一价钾离子或其它合适的阳离子。

存在很多PCR变化形式，例如，多重PCR涉及在单个样品容器中同时扩增一种以上的靶标。多重PCR包括双重和三重PCR反应，其涉及多达一打的独立地发挥作用的引物组。

巢式PCR是能够提高PCR扩增反应的特异性的技术。两组引物用于两轮连续的反应。在第一轮反应中，使用一对引物以非完全特异的方式产生DNA产物。然而，第一轮反应增加了靶序列实物。第二轮反应更加特异，其扩增嵌入第一组引物之间的序列。

定量PCR（QPCR）用于测量或估计样品中靶DNA的具体数量。在一些情况下，普通的PCR过程可以被近似的定量，但真正的定量PCR的目的是，只在产物数量真正以指数式增长的阶段进行扩增反应或者考察扩增反应的结果，由此避开了后来的扩增平台期。扩增指数阶段的产物数量与靶标的起始数量更加成比例。已经开发出了可以监控扩增时的产物数量的热循环仪。目前所采用的一种方法是实时定量PCR，其使用荧光染料（例如SYBR-green）或包含荧光基团的DNA探针（例如有专利的TaqMan^TM体系）在扩增过程中测量扩增产物的数量。

热启动PCR避免了一个可能发生的问题，在低温时，引物会和非特异性位点相结合，甚至引物间互相结合。热启动PCR是基于这样的原理，只有当反应温度足够高的时候，用于杂交的引物才会释放，由此来防止或者减少非特异性的引物结合。这项技术可以在加入聚合酶或者在加入引物之前，手动地将反应组分加热到变性温度，例如94℃。可供选择的是，已经开发出专用的体系，其通过（例如）结合一种或多种通过升温才得以释放的非活性形式的组分，从而抑制反应直到温度得到升高。

反转录PCR（RT-PCR）是用于扩增RNA的方法，其中在PCR反应之前利用反转录酶将RNA转化为cDNA。这两个反应有足够的相容性，从而它们能在同一个管中进行，并且能在同一个热循环设备中进行。

甲基化特异性PCR（或MSP）涉及使用亚硫酸氢钠对靶DNA进行预处理，将未甲基化的胞嘧啶单元转化为尿嘧啶，该尿嘧啶被DNA引物识别为胸腺嘧啶。使用引物组对经修饰的DNA进行两种扩增，所述引物组能够区分经修饰的模板和未经修饰的模板。一组引物组识别具有胞嘧啶的DNA，并且扩增之前未甲基化的DNA；另一组引物识别具有尿嘧啶或胸腺嘧啶的DNA，从而扩增甲基化的靶标。两种扩增的相对比例可以用于获得有关甲基化程度的信息。

衣原体靶序列的选择

沙眼衣原体在染色体和质粒中都含有遗传信息。沙眼衣原体的质粒包含8个开放阅读框，而且因为它以多个拷贝数存在，其是现有的NAAT检测法的受人青睐的靶标。然而，发明人发现那些开放阅读框中的许多都具有很大的变异性。至少在开放阅读框2、4、7、8中检测到单核苷酸多态性（SNPs）。开放阅读框1和3显示含有插入和缺失。因此决定本发明的核酸检测的靶序列应当来自于沙眼衣原体的染色体序列。SEQ ID NO:1中被鉴定的假定基因在此被称为染色体序列17，并且发现其存在于沙眼衣原体的染色体上，发现该假定基因最适合应用于本发明所述的方法中，因为它在沙眼衣原体分离株之间具有低变异性，与非沙眼衣原体分离株具有低水平的同源性，并且尽管它是单一拷贝，但仍然能通过PCR检验令人惊奇地被检测到，并且有好的检测限（LOD），该检测限至少与质粒靶标一样好。实施例中提供了选择用于本发明的优选方面的PCR引物的进一步详细说明。

染色体序列17被认为是假定的膜结合蛋白，但是还没有得到官方的命名。它在机体中的功能并不重要，但应关注其已经被证实的用于本发明的适用性。

根据本发明的第一个方面，提供了一种在样品中检测来源于沙眼衣原体的遗传物质的方法，包括核酸序列的序列特异性检测，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1或其互补序列中的至少10个连续的核酸残基；

根据一些实施方案，优选的是，核酸序列包含SEQ ID NO:1中的至少15个连续的核酸残基。

根据一些优选的实施方案，可以有1、2、3、或4个残基的缺失、替换或添加。根据一些优选的实施方案，残基的替换优选于残基的缺失和残基的增加。根据一些优选的实施方案，没有残基的替换、缺失或增加。有关进一步突变的相似优选特征适用于本发明的其他方面。

优选的是，所述序列特异性缺失包括进行核酸杂交的步骤。

优选的是，所述序列特异性缺失包括进行核酸杂交的步骤，之后进行核酸杂交检测的步骤。

核酸杂交的检测

检测核酸杂交的方法包括以非序列特异性方式检测核酸杂交的方法。这些方法包括使用插入核酸的染料，例如，溴化乙锭或SYBR-Green。当这些染料结合到双链核酸上时，它们的荧光信号会增强，从而可以通过标准荧光探测系统检测到。根据可供选择的实施方案，检测核酸杂交的方法可以是序列特异性方法，例如，标记探针。一种或多种标记探针能够以序列特异性方式与靶序列杂交，或者靶序列可以通过与固定化的互补序列（例如，在DNA阵列或“芯片”上）杂交而被检测到。核酸探针可以是荧光标记的、放射标记的、酶标记的，或者根据本发明的一些优选实施方案，可以是电化学标记的。特别优选这样的电化学标记法，其使用本文所公开的电化学标记物。

根据一些优选实施方案，在样品中检测来源于沙眼衣原体的遗传物质的方法包括，使来源于沙眼衣原体的遗传物质与核酸序列杂交，所述核酸序列包含SEQ ID NO:4或其互补序列中的至少15个连续的核酸残基；

SEQ ID NO:4：ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt；

其中所述序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变。根据一些实施方案，有1、2、3、或4个残基的添加、缺失或者替换。

根据一些优选实施方案，所述方法包括使来源于沙眼衣原体的遗传物质与这样的核酸序列杂交，所述核酸序列包含SEQ ID NO:5或其互补序列中的序列；

SEQ ID NO:5：ctgtccgctg gttcttcctt act；

其中所述核酸序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变。

根据一些优选的实施方案，进一步的突变如上所述。

根据一些优选的实施方案，利用PCR、转录介导的扩增、核酸序列依赖性扩增（NASBA）、解旋酶依赖性扩增、重组酶聚合酶扩增、链置换扩增、或环介导等温扩增进行所述核酸的扩增，然后进行序列特异性检测。通过使用其中序列特异性检测是基于扩增待测核酸的检测方法，该检测方法可以获得较高的敏感度和特异性。

优选的是，序列特异性检测方法基于对待测核酸进行扩增，该扩增利用PCR进行。

聚合酶链式反应

聚合酶链式反应涉及使用正向PCR引物和反向PCR引物。根据本发明第一个方面的一些优选实施方案，所述聚合酶链式反应涉及使用正向PCR引物和反向PCR引物，其中：

a）所述正向PCR引物包含这样的核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:15中的个数介于17个至34个之间（例如个数介于24个至34个之间）的连续核苷酸残基；

并且

b）所述反向PCR引物包含这样核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:16中的个数介于15个至31个之间（例如个数介于21个至31个之间）的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:16：aaggaagatt ccagaggcaa tgccaaagaa aaaagt；

或者其中所述正向PCR引物包含这样的核酸序列，该核酸序列为上述部分b）中所限定的反向引物的互补序列，并且所述反向PCR引物包含这样的核酸序列，该核酸序列为上述部分a）中所限定的正向引物的互补序列；其中所述序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变。

例如，所述聚合酶链式反应可以涉及使用正向PCR引物和反向PCR引物，其中；

a）所述正向PCR引物包含这样的核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:2中的个数介于17个至27个之间的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:2：ttggacacta gtcagcatca agctaggaga tt；

并且

b）所述反向PCR引物包含这样核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:3中的个数介于15个至25个之间的连续核苷酸残基；

a)SEQ ID NO:3：gaagattcca gaggcaatgc caaagaaaaa；

进一步的突变可以如上文所述。在一些实施方案中，正向PCR引物可以如本发明的第二个方面所限定的那样，反向PCR引物可以如本发明的第三个方面所限定的那样。

根据一些优选的实施方案，正向PCR引物包含具有在SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:6中所提供的序列的核酸；

SEQ ID NO:6：cactagtcag catcaagcta gg；

SEQ ID NO:17：caaacctcac tagtcagcat caagctagg；

SEQ ID NO:18：gtttggacac tagtcagcat caagctagg；

并且反向PCR引物包含具有在SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:7中所提供的序列的核酸；

SEQ ID NO:7：ttccagaggc aatgccaaag；

SEQ ID NO:19：agattccaga ggcaatgcca aagaaa。

根据一些实施方案，PCR引物中的一者或者两者可以被标记，从而帮助杂交的检测。标记物可以是荧光标记物、放射性标记物、酶活性标记物或者电化学活性标记物。可以这样设置引物和标记物，使其检测信号在杂交之后或在降解之后增强，所述降解通过PCR反应中所使用的DNA聚合酶的外切酶活性进行。例如，标记物可以被应用到PCR引物中，该引物上还添加了淬灭基团。PCR引物的降解会导致淬灭基团与标记物彼此分离，并且标记物上的淬灭剂的淬灭活性会降低。

核酸探针

探针

核酸探针可以用于以序列特异性方式检测PCR反应的产物。通常，这种探针被设计为在引物退火的位置之间的位置与靶序列退火。可以标记探针来帮助检测，例如，荧光基团、放射性标记物、电化学活性标记物或者酶标记物。标记物可以直接或者通过连接基团与核酸连接。本发明所述探针特别适合TaqMan PCR程式。TaqMan是可购自Life Technologies公司的实时定量PCR方法。在TaqMan程式中，对扩增实验阶段的PCR产物的积聚进行实时测量。这是为了确定临界循环次数，即检测到达信号临界水平处的PCR循环数。Taqman程式中的PCR探针是被荧光标记的，并且与DNA模板在两个引物之间的大约20个至60个核苷酸的片段互补。适用于Taqman体系的荧光标记物包括6-羧基荧光素（FAM）或四氯荧光素（TET）。Taqman探针通常标记有上述荧光基团，并且还标记有淬灭分子，例如四甲基罗丹明（TAMRA）。荧光基团和淬灭剂的紧密接近会抑制荧光染料的荧光。然而在PCR反应的引物延伸阶段，Taq聚合酶也表现出5′至3′核酸外切酶活性，其可以降解已经与模板退火的探针部分。探针降解从而释放出荧光染料。荧光染料不再与淬灭剂紧密接近，于是淬灭效果降低，荧光染料所释放出的荧光型号增强，由此可以被检测到。

根据本发明的一些实施方案，聚合酶链式反应涉及使用包含这样的核酸序列的核酸探针，所述核酸序列包含SEQ ID NO:4或其互补序列中所提供的个数介于18个至28个之间的核酸残基；

SEQ ID NO:4：ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt；

其中所述序列可以通过上述至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变。

根据一些实施方案，所述核酸序列包含SEQ ID NO:4中所提供的个数介于19个至27个之间的核酸残基，更优选个数介于20个至26个之间的核酸残基，进一步优选个数介于21个至25个之间的核酸残基，更进一步优选个数介于22个至24个之间的核酸残基，最优选为23个核酸残基。

优选的是，核酸探针包含SEQ ID NO:5中所提供的核酸序列；

SEQ ID NO:5：ctgtccgctg gttcttcctt act。

根据一些实施方案，核酸探针可以带有（例如）荧光标记物、放射性标记物、酶标记物、或更加优选为电化学活性标记物。特别优选为本文所公开的电化学活性标记物。

根据本发明的第二个方面，提供了包含这样的核酸序列的正向PCR引物，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:15中的个数介于17个至34个之间（例如24个至34个之间）的连续核苷酸残基；

其中所述序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变，所述进一步突变如上文所述是任选的。

根据一些实施方案，提供了包含这样的核酸序列的正向PCR引物，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:2中的个数介于17个至27个之间的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:2：ttggacacta gtcagcatca agctaggaga tt；

根据一些实施方案，提供了包含这样的核酸序列的正向PCR引物，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:20中的个数介于24个至34个之间的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:20：tgatgcaaac ctcactagtc agcatcaagc taggagatt；

根据一些实施方案，提供了包含这样的核酸序列的正向PCR引物，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:21中的个数介于24个至24个之间的连续核苷酸残基。

SEQ ID NO:21：tgatggtttg gacactagtc agcatcaagc tagg agatt；

根据一些实施方案，所述核酸序列包含个数介于18个至26个之间、19个至25个之间、20个至24个之间、21个至23个之间的残基，最优选为22个残基（或者个数介于25个至33个之间、26个至32个之间、27个至31个之间、28个至30个之间的残基），最优选为29个残基。根据一些优选的实施方案，正向引物包含具有SEQID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:6中所提供的序列的核酸；

SEQ ID NO:6：cactagtcag catcaagcta gg；

SEQ ID NO:17：caaacctcac tagtcagcat caagctagg；

SEQ ID NO:18：gtttggacac tagtcagcat caagctagg。

根据本发明的第三个方面，提供了包含这样的核酸序列的反向PCR引物，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:16中的个数介于15个至31个之间（例如21个至31个之间）的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:16：aaggaagatt ccagaggcaa tgccaaagaa aaaagt；

根据一些实施方案，提供了包含这样的核酸序列的反向PCR引物，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:3中的个数介于15个至25个之间的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:3：gaagattcca gaggcaatgc caaagaaaaa；

根据一些实施方案，核酸序列包含选自SEQ ID NO:16中的个数介于22个至30个之间的连续核苷酸残基。更加优选个数介于23个至29个之间，更优选个数介于24个至28个之间，更加优选个数介于25个至27个之间的残基，最优选为26个残基。

根据一些实施方案，核酸序列包含选自SEQ ID NO:3中的个数介于16个至24个之间的连续核苷酸残基。更加优选介于17个至23个之间，更优选介于18个至22个之间，更加优选介于19个至21个之间的残基，最优选为20个残基。

根据一些实施方案，残基的添加、缺失、替换的数量和类型可以参照上文正向PCR引物中所述的那样。

根据一些优选的实施方案，反向PCR引物包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:7中所提供的核酸序列；

SEQ ID NO:7：ttccagaggc aatgccaaag；

SEQ ID NO:19：agattccaga ggcaatgcca aagaaa。

根据本发明的第四个方面，提供了包含这样的核酸序列的核酸探针，所述核酸序列包含SEQ ID NO:4或其互补序列中所提供的个数介于18个至28个之间的核酸残基；

SEQ ID NO:4：ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt；

残基的添加、缺失、替换的数量和类型可以参照上文本发明的引物中所述的那样。根据一些优选的实施方案，所述核酸探针包含来自SEQ ID NO:4中的个数介于18个至27个之间，19个至26个之间，20个至25个之间，21个至24个之间，22个至23个之间的残基，最优选为23个残基。

根据一些优选的实施方案，本发明的核酸探针包含SEQ ID NO:5中所提供的核酸序列；

SEQ ID NO:5：ctgtccgctg gttcttcctt act。

根据本发明的第五个方面，提供了一种PCR组分，其包含本发明的正向PCR引物和反向PCR引物。根据一些优选的实施方案，PCR组分还包含本发明所述的核酸探针。

内对照

通常PCR检验或相似检验的内对照由单链DNA寡核苷酸组成。这些内对照可以简单的制备并固定到样品载体上，或加入PCR反应组分中。但是，在本发明的方法之前，可以进行样品制备步骤，其可以包括纯化原体或纯化临床上获得的含衣原体的材料，以及纯化它们的基因组DNA。许多市售可得的DNA纯化方法和试剂盒都是可用的，例如Promega Wizard体系。这些细菌裂解和DNA纯化体系涉及使用含离液盐的溶液，使DNA与膜（例如，硅基膜）结合，之后去除其余的裂解物，并清洗以除去杂质。之后从膜上回收纯化的细菌基因组DNA，从而用于下游的检测检验，例如根据本发明的第一个方面所述的检验。这种纯化方法不大可能共纯化基于短的单链DNA寡核苷酸的内对照序列。例如，Promega Wizard试剂盒声明它们的纯化方案的截留量为50kb大小。因此发明人认识到，提供可以与样品中的衣原体基因组DNA共纯化的内对照是有利的。可能的解决方案是，使用来自与另一细菌物种的基因组DNA作为内对照，该基因组DNA是在分离衣原体的基因组DNA所需的分离条件下，使用相同的裂解液而得到。出于安全考虑，理想的是内对照的来源应该来自非致病菌。此外，其应当通常不容易在人体中发现，并且容易在实验室中培养。本发明涉及使用来源于黑腐坚固杆菌（Pectobacterium atrosepticum）的基因组DNA作为内对照。这是因为黑腐坚固杆菌是可培养的、广泛可得的，并且从其分离出的DNA易于与来自于衣原体的DNA进行共纯化。它只有一条染色体并且具有许多在该物种中独有的基因。此外，没有关于人类感染此物种（该物种是植物病原体，可以导致温带马铃薯的软腐病（soft rot）和黑胫病（black leg））的报道案例，这意味着不大可能在解剖部位或临床样品中发现该物种。为了避免疑虑，应当指出，黑腐坚固杆菌以前被称为胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种（Erwinia carotovora subsp.Atroseptica）。根据一些优选的实施方案，根据本发明的第五个方面，PCR组分还包含作为阳性内对照的来自黑腐坚固杆菌的基因组DNA。优选的是，其为菌株ATCCBAA-672。

本发明的PCR组分优选包含第二正向PCR引物和第二反向PCR引物，其中所述引物被设计为与存在于SEQ ID NO:8或其互补的核酸序列中的核酸序列杂交；

SEQ ID NO:8：ctaccgtgta gggtcatagg cattgacctc atggctccacggaatcgtgc gatcgtcaac tgcgacgtgc cattcacagt gcgtaagagcaccgcgaatc tcggataaac actggcacca gtgctgtacg ccaatccagattgcttcttc ctcgctgtcg ggaagtttgg ttgaaccgga gagcacgatccctttcctaa agacgttacc gattttcaca ttgagggcga aatcaaaggattcccagttc aggcctgtac ccgtcgtcag atatttctca atttggtcattaacagaatg gcgttggacg atctccttca cggcagatat ctctttctggctcagggatt ttttacgtcg agcggtgtaa tagagcgaaa ttgccac；

其中所述序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变，其数量和类型如上文本发明的第一个和第二个方面的PCR引物中所述的那样。

第二正向PCR引物优选包含这样的核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:9中的个数介于13个至23个之间的连续核酸残基；

SEQ ID NO:9：ctcgctgtcg ggaagtttgg ttgaaccg；

第二反向PCR引物优选包含这样的核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:10中的个数介于15个至25个之间的连续核酸残基；

SEQ ID NO:10：acaggcctga actgggaatc ctttgatttc；

可供选择的是，所述第二正向PCR引物包含这样的核酸序列，该核酸序列为上述反向引物的互补序列，并且所述第二反向PCR引物包含这样的核酸序列，该核酸序列为上述正向引物的互补序列；其中所述序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变，其数量和类型如上文本发明的第一个和第二个方面的PCR引物中所述的那样。第二正向PCR引物优选包含选自SEQ ID NO:9中的个数介于14个至22个之间的连续核酸残基，更优选介于15个至21个之间，更加优选介于16个至20个之间，更加优选介于17个至19个之间，最优选为选自SEQ ID NO:9中的18个连续的核酸残基。

第二反向PCR引物优选包含选自SEQ ID NO:10中的个数介于16个至24个之间的连续的核酸残基，更优选介于17个至23个之间，更加优选介于18个至22个之间，更加优选介于19个至21个之间，最优选为选自SEQ ID NO:10中的20个连续的核酸残基。

根据一些优选的实施方案，第二正向PCR引物包含SEQ ID NO:11中所提供的核酸序列；

SEQ ID NO:11：tgtcgggaag tttggttg；

并且，第二反向PCR引物包含具有SEQ ID NO:12中所提供的序列的核酸。

SEQ ID NO:12：cctgaactgg gaatcctttg。

根据一些实施方案，PCR组分包含具有这样的核酸序列的第二核酸探针，所述核酸序列包含SEQ ID NO:13或其互补序列中所提供的个数介于18个至28个之间的核酸残基，更加优选介于19个至27个之间，更加优选介于20个至26个之间，更加优选为介于21个至25个之间，更加优选介于22个和24个之间，最优选为23个核酸残基；

SEQ ID NO:13：ggagagcacg atccctttcc taaagacgtt acc；

其中所述核酸序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变，其类型和数量如上文本发明的第三个方面所述的第一核酸探针中所述的那样。

根据一些优选的实施方案，核苷酸探针包含SEQ ID NO:14中所提供的核酸序列；

SEQ ID NO:14：gcacgatccc tttcctaaag acg。

在当检测沙眼衣原体的产物和方法不在的情况下，本发明还涉及关于包含黑腐坚固杆菌的内对照的产物和方法（即用作检测来源于沙眼衣原体以外的核酸的内对照）。具体而言，本发明涉及正向PCR引物，还涉及第二PCR引物，其中所述引物被设计为与黑腐坚固杆菌基因组DNA中所发现的靶核酸序列杂交。优选的是，引物被设计为与核酸序列SEQ ID NO:8或其互补序列中所发现的靶核酸序列杂交；

其中所述序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变，添加、缺少或替换的类型和数目如本说明书其它地方所述的那样。

第二正向PCR引物和第二反向PCR引物的进一步的特征可以优选如本发明其它方面中所定义的那样。本发明还设计了一种用于检测黑腐坚固杆菌阳性内对照的核酸探针，该核酸探针具有本发明其它方面所定义的特征。本发明还设计了一种检测来自包含黑腐坚固杆菌的阳性内对照的信号的方法，包括使用黑腐坚固杆菌引物、任选的探针，并且结合本文所公开的其它方法的任意特征。优选在检测来自包含黑腐坚固杆菌的阳性内对照的信号的方法之前，进行这样的方法：利用上文所述的离液盐和任选的硅基膜，从含有完整的黑腐坚固杆菌细菌细胞裂解物中获得基因组DNA。

试剂盒

根据本发明的第六个方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含根据本发明第五个方面所述的PCR组分，或根据本发明第八个、第九个或第十个方面所述PCR引物或探针，以及进行本发明第一个方面所述方法的说明书。试剂盒可以含有进一步的组分，例如样品容器、包装、PCR酶、扩增前体、样品管或者检测工具。

阳性内对照

根据一些优选的实施方案，本发明的第五个方面所述PCR组分还包含用作阳性内对照的来源于黑腐坚固杆菌的基因组DNA。检测方法可以如本发明其它方面所述，或者可以涉及使用本发明其它方面所述的化合物或产物。

根据本发明的第七个方面，提供了一种在样品中检测来自于黑腐坚固杆菌的遗传物质的方法，包括对包含在黑腐坚固杆菌的染色体中的核酸序列进行序列特异性检测。所述方法可以包括本发明其它方面所公开的任意特征，并且可以任选地进一步包括从样品中提取基因组DNA，所述基因组DNA为黑腐坚固杆菌的基因组DNA（任选地引入样品中作为内对照）。所述提取可以伴随从第二目标生物体（例如病原菌）中提取基因组DNA。

分别根据本发明的第八个、第九个和第十个方面，分别各自提供了正向PCR引物，该正向PCR引物根据本发明的第五个方面被定义为“第二正向PCR引物”；反向PCR引物，该反向PCR引物根据本发明的第五个方面被定义为“第二反向PCR引物”；PCR探针，该PCR探针根据本发明的第五个方面被定义为“第二PCR探针”。

本发明还提供了PCR组分，其包含根据本发明的第八个、第九个、或第十个方面所述的任意一种或多种正向PCR引物、反向PCR引物或PCR探针，以及PCR反应的一种或多种其它组分。

本发明的第一个至第六个方面所述的优选或任选特征可以任选地并入本发明的第七个至第十个方面以及其它方面。

标记物

可以将探针和/或引物连接到标记物上，从而帮助它们的检测。标记物可以是放射性的、酶活性的、荧光活性的或电化学活性的。根据以下实施方案，其中具有用于检测来源于沙眼衣原体的核酸的组分，也具有用于检测来源于阳性内对照的核酸的组分的实施方案，或者其中具有同时检测两种核酸的方法的实施方案，所述标记物用于帮助检测阳性内对照和检测来自于沙眼衣原体的核酸，该标记物优选能够彼此区分开，例如，它们可以是不同的荧光染料，或者它们可以是不同的电化学活性剂或能够提供电化学可区分活性的电化学活性标记物。

本发明特别适合使用电化学标记的探针和/或引物。特别地，电化学标记物可以包括含有金属-碳环π配合物的那些，它们为带有部分或全部离域π电子的有机配合物。合适的标记物包括包含夹层化合物（其中两个碳环平行）、以及包含弯曲夹层化合物（角状化合物）（bent sandwiches（angular compounds））和单环戊二烯的那些。优选的是，电化学活性标记物为金属茂基标记物。更加优选为二茂铁基标记物。

用于本发明的探针的二茂铁基和金属茂基可以有利地为N-取代的二茂铁甲酰胺或金属茂甲酰胺。构成标记部分的二茂铁环或金属茂环可以是未被取代的。如果需要，二茂铁环或金属茂环可以被一个或多个取代基取代，选择所述取代基的性质和位点从而按所需的方式来影响二茂铁或金属茂部分的氧化还原特性。二茂铁环或金属茂环可以额外地被任意环状取代基取代，或作为替代的方式被任意环状取代基取代，这些取代基不会显著降低标记物的电化学敏感性。二茂铁甲酰胺或金属茂甲酰胺部分可以通过氨甲酰氮与核苷酸或寡核苷酸连接。优选通过核苷酸的磷酸基团或碱基来与核苷酸或寡核苷酸连接。两种连接方法均允许通过寡核苷酸的长度方向上的任意核苷酸而连接标记物。然而，如果通过磷酸基团进行连接，则可有利地通过3′或5′末端的磷酸基团进行连接，从而将该连接在空间上阻碍寡核苷酸的沃森-克里克（Watson-Crick）杂交或影响核酸酶活性的可能性降到最低。预计通过不参与沃森-克里克碱基配对的碱基区域进行连接几乎不会对所述碱基配对造成破坏。因此通过碱基进行的连接可能更适合在非末端寡核苷酸位点进行标记。标记寡核苷酸可以在寡核苷酸和标记部分之间具有接头部分。优选地，被标记的寡核苷酸具有二茂铁基标记部分，其通过接头部分连接到寡核苷酸上。

可以使用任意合适的接头部分。合适的接头部分可以包含脂肪链，所述脂肪链可以是直链或支链的，饱和的或非饱和的。有利的是，接头部分是具有4至20个碳原子的直链或支链脂肪链，优选具有6至16个碳原子，特别优选具有8至14个碳原子，更加特别优选为12个碳原子。亚烷基链可以被任意取代基取代，或者可以被任意原子或基团中断，这些任意的取代基、原子或基团不会显著降低标记物的电化学敏感性。本发明可以使用的二茂铁基标记物的示例为式I至III中所示的那些。式Ia至IIIa的分子是被相应的二茂铁基标记物所标记的寡核苷酸。式IV示出了可以通过核苷酸碱基连接的二茂铁基标记物，为了示例的目的，式IV中包含氨基修饰的胸腺嘧啶碱基。

可以用任意合适的方法制备二茂铁标记的探针。例如，寡核苷酸可以是通过引入具有末端氨基的基团而修饰的寡核苷酸。这种氨基修饰的核苷酸的示例为式V的经修饰的核苷酸。之后可以通过使经氨基修饰的核苷酸与二茂铁羧酸的N-羟基-琥珀酰亚胺酯反应，来引入二茂铁，从而获得二茂铁标记的寡核苷酸。

在可供选择的方法中，可以通过在固相寡核苷酸合成过程中加入二茂铁基团来制备二茂铁标记的寡核苷酸。可以通过两种常用方法在固相合成时在寡核苷酸中引入二茂铁标记物：首先，在寡核苷酸的3′端添加寡核苷酸需要使用合适的树脂。该树脂标记有二茂铁衍生物。在寡核苷酸内部位点或5′端添加二茂铁需要使用这样的偶联剂，所述偶联剂适合与固相载体连接的寡核苷酸偶联，例如二茂铁基衍生的亚磷酰胺，例如式IX或X所示。

根据一些特定的实施方案，电化学活性标记可以是下列化合物：

Mc-NR’-C(＝O)-X-(Ar)_n-(L)_m-R XI

其中

-Mc是金属茂基，其中每个环可以独立地被取代或未被取代，

-金属茂基包含选自由铁、铬、钴、锇、钌、镍或钛所构成的组中的金属离子M，

-R′为H或低级烷基，

-X为NR′或O，

-Ar为被取代的或未被取代的芳基，

-n为0或1，

-L为连接基团，

-m为0或1，并且

-R表示待标记的部分。

Mc基团可以被选自以下基团中的一种或多种基团取代，这些基团为低级烷基（例如C1至C4烷基）；被羟基、卤素、氰基、氧代基、氨基、酯基、酰胺基或其它金属茂基取代的低级烷基；低级烯基；被羟基、卤素、氰基、羰基、氨基、酯基、酰胺基或其它金属茂基取代的低级烯基；芳基；被羟基、卤素、氰基、氧代基、氨基、酯基、酰胺基或其它金属茂基取代的芳基。除了本发明分子中的Mc基团的总数优选不超过4个的情况，所述其它金属茂基可以按与Mc基团相同的方式被取代。优选的是，Mc基团是未被取代的。

优选的是，M是选自铁、锇、钌中的离子。最优选的是，M为铁离子。当M为铁离子时，Mc为二茂铁。

低级烷基优选为C1至C4烷基。优选地，R’为H，各R’具有与其它R’相区分的特性。

优选的是，X为NH。

Ar基可以被选自以下基团中的一种或多种基团取代，这些基团为低级烷基（例如C1至C4烷基）；被羟基、卤素、氰基、氧代基、氨基、酯基或酰胺基所取代的低级烷基；低级烯基；被羟基、卤素、氰基、氧代基、氨基、酯基或酰胺基取代的低级烯基；芳基；被羟基、卤素、氰基、氧代基、氨基、酯基或酰胺基取代的芳基。优选的是，Ar基是被未取代的。

优选n=1。优选m=1。

合适的连接基团L可以包含脂肪链，其为直链或支链的，饱和或不饱和的。有利的是，接头部分为具有4至20个碳原子的直链或支链的脂肪链，并且优选具有6至16个碳原子，特别优选具有8至14个碳原子，更特别优选具有12个碳原子。亚烷基链可以被任意取代基取代，或者可以被任意原子或基团中断，这些任意的取代基、原子或基团不会显著降低标记物的电化学敏感性。

本发明的化合物可以包含一个以上的金属茂基。在本发明的化合物中，金属茂基可以被任意其它电化学活性标记基团取代。所述化合物可以是电化学活性的化合物，或者是在部分断裂后变为电化学活性的化合物。

优选的是，待标记的部分为氨基酸、核苷酸、寡核苷酸、多聚核苷酸、核苷、糖、碳水化合物、肽、蛋白质或这些分子中任意一个的衍生物。在优选的实施方案中，R为核苷酸或寡核苷酸。核苷酸可以选自腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷或尿苷。优选的是，所述核苷酸在例如2′、3′或5′位上通过连接在该核苷酸的核糖或脱氧核糖基团上的基团而连接。最优选的是，核苷酸在3′或5′位上连接，例如在5′位上。优选的是，在2′、3′或5′位的连接是通过氧原子或氮原子进行的。

标记试剂可以直接连接或通过接头连接。接头可以首先被连接到标记试剂或待标记的分子上。如果接头首先被连接到待标记的分子上，则它可以包含可有助于标记反应的基团，例如，氨基或硫醇基。氨基是优选的。

优选标记核苷酸或寡核苷酸的3′或5′端。寡核苷酸可以被氨基修饰，从而有助于标记反应。氨基修饰的寡核苷酸可以通过标准技术合成，并且可以购自广泛的商业资源，如从Oswel Scientific公司（英国南安普顿市）购买。氨基修饰的寡核苷酸还可以添加接头部分，例如，可以添加5′氨基己基或3′氨基己基或5′-C12氨基进行修饰。所需的被标记的分子优选包含接头。

在寡核苷酸的情况中，分子的寡核苷酸部分的序列优选是这样的，所述序列使该分子能够与互补靶序列杂交，从而能被用作分子生物学技术（例如，本说明书中所公开的核酸检测或定量技术之一）中的探针。

本发明的被标记的生物学分子在酶切消化（digest）状态或未经消化状态下都可以是电化学活性的。理想的是，电化学活性的程度会根据消化的程度而变化。

式VIII示出了将新的电化学活性标记物连接到寡核苷酸上的可能的方式。式VIII的分子可以通过使5′氨基己基修饰的寡核苷酸与式VII所示的分子反应而获得。

实施例7和8提供了4-(3′-二茂铁基脲基)-1-苯甲酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯的详细说明，以及使用所述化合物标记寡核苷酸的详细说明。然而，对技术人员来说，显而易见的是，所述标记物可以连接到寡核苷酸的任意合适的位点上，并且连接并不局限于所述寡核苷酸的5′端。关于上述电化学标记物的合成与连接的详细说明，读者可参见EP1481083，这里以引用方式将其内容并入本文。

较短的引物和探针的使用

根据本发明所有关于杂交的方面的一些实施方案，引物和探针可以比上述规定的那些要短，尤其是当采取了提高引物退火温度的措施的时候（并且申请人具体探讨了较上文所具体公开的长度和范围短1、2、3、4、5个核苷酸残基的长度）。

小沟结合部分和锁核酸（也称为LNA）可以增加引物和探针的热稳定性，也可以提高引物或探针的退火温度，因此使用小沟结合部分和锁核酸可以使较短的引物和探针的使用变得容易。设计使用这种修饰作为本发明的一部分，其与上述本发明所公开的所有方面是相关联的，特别是与上述公开的探针和引物是相关联的，但是不与那些较上文所指定的长度和范围短5个残基的低聚物相关联。本发明在所有方面都涉及组合使用热稳定性（通过使用小沟结合部分和/或锁核酸而促进）增加的较短的引物和探针和本文所述的热稳定性（通过使用小沟结合部分和/或锁核酸而促进）没有增加的引物和探针；还涉及单独使用热稳定性（通过使用小沟结合部分和/或锁核酸而促进）增加的引物和探针。

锁核酸

关于锁核酸的近期综述，读者请参阅Devor(2005)IntegratedDNA technologiestechnical bulletin《Locked Nucleic Acids(LNAs)》及其引用的参考文献（这里以引用的方式将它们的内容并入本文）。

LNA是包含一个或多个被修饰的RNA或DNA核苷酸残基（与正常DNA或RNA残基结合）的核酸。在修饰残基中，额外的共价桥连接2′和3′碳，并且将3′内桥结构构象中的核糖“锁住”，其一般可见于A型RNA和DNA。

术语LNA包括所有这样的核酸，其包含某些或所有残基位点都被锁住的残基。锁可以通过任意连接糖基的2′和3′碳的化学桥而获得。优选的是，在2′-O，4′-C亚甲基连接处形成锁。

LNAs表现出增加的热稳定性，解链温度较相应的DNA或RNA寡聚物要升高大约5℃。由于解链温度升高，因此会增加LNA引物和探针形成发夹结构的风险，所述发夹结构不利于进行有效的PCR反应。因此，良好的引物和探针设计变得更加重要，并且本申请的对应于SEQ ID NOs:5、6、7、11、12和14中所公开的LNA引物和探针（任选地在任一末端截短1、2、3、4、5个残基）是特别优选的。

LNAs可以容易地制备，也可以从许多供应商处购买。

小沟结合部分

本发明的所有方面还涉及结合到小沟结合（MGB）部分上的核酸探针和引物（包括LNA探针和引物）。

MGB部分是等轴形状的基团，其连接到探针或引物与靶标之间所形成的双螺旋的小沟上。它们使双链区稳定，并且提高解链温度和探针/引物的特异性，允许使用较短的探针/引物。关于MGB部分和连接方法的详细说明，读者可以参阅Katyavin等，(2000)Nucleic AcidRes.28(2):655-661以及其所引用的参考文献（这里以引用的方式将它们的内容并入本文）。小沟结合部分可以容易的制备并连接到引物和探针上，也可以从许多供应商处购买。

样品

根据本发明的各个方面，样品可以包括临床样品，其包括组织和体液，所述体液不限于血液、血浆、血清、分泌物、精液、精液浆、泪水和唾液。术语“样品”也包括临床样品的衍生品，例如，经过过滤、凝结、消毒、照射或分离的样品，还可以是之前与受试者接触而使用过的医疗设备和敷料。所述受试者优选为人类。

实施例

本发明将通过下列非限制性实施例来进行说明。

a）实施例1-PCR引物的选择

染色体扩增子和引物的Blastn分析

对所鉴定的沙眼衣原体的18个染色体扩增子进行Blastn分析。除了染色体扩增子18显示与鼠类动物嗜衣原体（Chlamydophilamuridarum）有相似性以外，所有经分析的扩增子均未显示任何除沙眼衣原体范围以外的命中片段（hit）。这些短序列未显示出与其它物种的一定程度的相似性，这在使用引物组搜索相似性时是期望的，但只有进行了排他性试验后才能得知这是否重要。

b）实施例2-使用对称PCR对引物进行初步试验

质粒靶标

获得了质粒扩增子1、3、4、5、6、7和8的引物组。为了筛选这些引物组，根据下表1，对每个引物组进行对称PCR反应，每个反应使用10,000EB，设置三个重复。

表1：对称PCR反应设置

每个引物组的三个重复都包括阴性反应。PCR反应条件如下：

1.94℃×1分钟

2.94℃×30秒

3.58℃×30秒

4.72℃×1分钟

5.重复步骤2至4，进行39个循环

6.72℃×3分钟

7.16℃保温

PCR之后，各产物取10μL在Safeview染色的2%琼脂糖凝胶上跑电泳。在电泳和利用UV灯使凝胶可视化之后，发现在所试验的条件下，凝胶上出现的条带表明所有引物组都能扩增靶区域。三个引物组质粒扩增子3、5和7提供了最高的条带强度。阴性反应显示为没有条带。

染色体靶标

获得了扩增子编号1、5、9、17和18的引物组。为了筛选这些引物组，根据上表1，对每个引物组进行对称PCR反应，每个反应使用10,000EB，设置三个重复。每个引物组的三个重复都包括阴性反应。PCR反应条件如上文所述。

PCR之后，各产物取10μL在Safeview染色的2%琼脂糖凝胶上跑电泳。在电泳并利用UV灯使凝胶可视化之后，发现在所试验的条件下，凝胶上出现的条带表明所有引物组都能扩增靶区域。扩增子9和19的染色体引物组提供了最高的条带强度，其余的引物组显示出稍弱的强度，其中染色体扩增子17较其它的稍好。

c）实施例3-利用不对称PCR和电化学检测进行检测限（LOD）的测定

质粒靶标

在不对称PCR中使用质粒3、5、7的引物组，之后添加扩增子特异性探针，利用T7核酸外切酶进行消化，并且进行电化学终点检测，从而通过实验来确定沙眼衣原体EB的LOD。根据下表2，对每个引物组进行不对称PCR反应，每个反应使用进行从100,000至1的10倍稀释的EB，设置三个重复。

表2：不对称PCR反应设置

每个引物组的三个重复都包括阴性反应。PCR反应条件如上文实施例1中所述。

PCR之后，将20μL反应体系加入下表3中的5μL混合液（mastermix）中。

反应物	浓度	终浓度	单次反应
				扩增子特异性探针	100μM	3μM	0.75μL
T7核酸外切酶	10,000U/mL	10U	1.0μL
				dH₂O	n/a	n/a	3.25μL

表3：电化学检测混合液

在37℃下孵育反应体系20分钟。孵育之后，使用下列Autolab参数对全部25μL反应体系进行伏安法测定。

预处理：预处理电位（V）：0，施加时间：0秒，沉积电位：0，施加时间：0，平衡时间：0，

测量：测量后是否关闭电极的输出：X，调制周期（>=0.0025）：.04，取样间隔（>=0.105）：.1,

电位：起始：-0.1，最终：0.5，阶跃：0.003，调制幅度：0.04995，等候电位：0，

预处理：是否在达到条件时停止平衡步骤：不，取消平衡过程的条件（A）：0.05，

其它：扫描循环数：1。

在每种样品中，记录150-250mV之间的峰高。

所获得的质粒扩增子3、5和7的电化学数据分别在图1a、1b、1c和2c中示出。误差棒示出了标准偏差（n=3）。

所获得的阴性值为“无峰”阴性结果。质粒扩增子3和7的三个重复均记录到单拷贝阳性结果，而质粒扩增子5的三个重复中只记录到一个阳性值。因此，质粒扩增子5在此阶段被排除，重复进行质粒扩增子3和7的实验，如上所述，还是三个重复。这些结果与上文所获得的结果高度相似。

虽然质粒扩增子7显示出持续的峰高，并且表现为最适合用作质粒引物组，但利用肺炎嗜衣原体（Chlamydophila pneumoniae）进行了采用不对称PCR的排他性实验、T7外切酶消化以及电化学检测。由此确定了质粒扩增子7的引物组对肺炎嗜衣原体提供阳性信号（平均值为88.05nA），因此不适合用作沙眼衣原体特异性引物组。质粒扩增子3的引物和探针组没有显示出这种阳性信号，因此被选择作为检测沙眼衣原体质粒的首选。

染色体靶标

在不对称PCR中使用染色体扩增子9、17、18的引物组，之后加入扩增子特异性探针，利用T7核酸外切酶进行消化，并且进行电化学终点检测，从而通过实验来确定沙眼衣原体EB的LOD。根据上表2，对每个引物组进行不对称PCR反应，每个反应依次使用从100,000至1的10倍稀释的EB，设置三个重复。PCR之后，将20μL反应体系加入上表3所示的5μL混合液中。在37℃下孵育反应体系20分钟。孵育之后，使用上述参数对全部25μL反应体系进行伏安法测定。在每种样品中，记录150-250mV之间的峰高。

所获得的染色体扩增子9、17和18的电化学数据分别在图2a、2b和2c中示出。误差棒示出了标准偏差（n=3）。误差棒表示所获得的阴性值的平均值。

以上获得的数据表明，对所有所试验的扩增子而言，直到每反应所使用的EB低于1,000EB的水平时，峰高才会下降。在该水平之下，对染色体扩增子8和18而言，在100EB/反应的水平下，峰高下降大约一半。对染色体扩增子17而言，这种下降稍小。染色体扩增子9的数据显示，在每反应10EB的水平下，峰高与在阴性样品中所看到的那些相似。这些数据表明，染色体扩增子17比染色体扩增子18好，并且在低水平端判别方面，这两种扩增子比染色体扩增子9好。

为了提高在低水平端的检测，发明人所成功使用的一种方法是改变MgCl₂的浓度。每个不对称PCR反应使用10,000EB，每个反应的MgCl₂终浓度为2.0mM至5.0mM，增量为0.5mM，之后添加探针、进行T7消化和电化学测量，从而完成了本实验。所得数据表明，在所试验的条件下，5mM的MgCl₂终浓度使得能够获得最大的峰高。为了证明该MgCl₂浓度适用于所有EB水平，利用染色体扩增子17，以5.0mM的MgCl₂进行了第二次LOD实验。结果在图2d中示出。误差棒显示了标准偏差（n=3）。数据点线表示所获得的阴性值的平均值。

该数据显示，与每反应使用10,000或100,000EB相比，当每反应使用1,000EB时，使用5.0mM MgCl₂进行PCR提供了最佳效果。在1,000EB水平之下，在1EB时峰高下降到平均值为54.97nA。综合考虑以上结果，选择染色体扩增子17（SEQ ID NO:1）的引物和探针组作为沙眼衣原体染色体靶标检测的首选。正向引物、反向引物和探针的序列分别如SEQ ID NOs:6、7和5中所示。

d）实施例4-排他性和包容性验证

引言

必要的是，衣原体检验只对沙眼衣原体高度特异，并且与其它细菌物种或任何其它生物没有明显的交叉反应性。在实施例1至3所概述的引物和探针设计阶段，生物信息学上显示没有交叉反应性，然而，必须使用真实的微生物分离菌在实验水平上证明这一点。

与此相反，还必须表明该检验能够检测沙眼衣原体的所有15个遗传血清型，并且必须知道其它哪种血清型（导致眼睛或关节炎疾病的那些）也能够被检验引物组扩增。

利用PCR和探针-T7末端检测，对来源于一组细菌的DNA样品检测质粒和基因组引物，从而检测特异性（排他性）。

为了验证包容性，获得了所有15种沙眼衣原体血清型（EB），并且对DNA进行提取、纯化和定量。然后使用质粒和基因组引物组检测DNA拷贝的三个水平，之后进行探针-T7核酸外切酶末端检测，从而确定是否所有血清型都具有相似的LOD。

排他性试验

对引言中所给出的一系列DNA进行基因组引物组检测，每组设置两个重复。在PCR和探针-T7检测之后，测量信号峰高的输出。试验分批进行，并且所试验的各批次都使用PCR对照。

染色体扩增子17的结果

对一系列基因组DNA检测了以染色体扩增子17为靶标的引物和探针。以下示出重复实验的结果：

总结-排他性

显示无交叉反应性的两种引物组表明衣原体检验是高度特异性的。

包容性试验

将所获得的所有15种沙眼衣原体血清型（A、B、Ba、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L1、L2、L3）的EB进行裂解，并且对它们的DNA进行纯化和定量。在使用上文所列出的引物和探针（SEQID NOs:6和7和5）的PCR反应中，检测了各血清型的50,000、500、50或5个基因组拷贝水平的包容性。在使用探针-T7进行末端检测之后，测量信号峰高。

染色体扩增子17的包容性结果

总结-包容性

使用染色体扩增子17的引物（SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7）和探针（SEQ ID NO:5）组，除血清型D、J和K以外，所有血清型都能够在5个拷贝的水平得到扩增，并且能够通过电化学法检测到。使用染色体扩增子17的引物和探针组，这些与血清型G一起被报告，并且表明D能够在50个拷贝的水平得到扩增，J能够在50个拷贝的水平得到扩增，K能够在50个拷贝的水平得到扩增。

e）实施例5-黑腐坚固杆菌靶基因用作内对照的区分度和唯一性

从NCBI Pubmed网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/）下载5.064Mb的黑腐坚固杆菌基因组（登录号BX950851）。黑腐坚固杆菌基因组完整地注释有基因名、功能和基因组定位，并且包括假设基因。选择三个基因进行研究。

这些基因是rfaH（起始于碱基对位点230144，长度为489bp，反向取向，其编码转录活化蛋白）、mgsA（起始于碱基对位点2008746，长度为458bp，反向取向，其编码甲基乙二醛合成酶）和HP1（起始于碱基对位点143610，长度为387bp，反向取向，其编码假设蛋白的基因）。利用NCBI的Blastn程序，将过滤条件设置为完整核苷酸集合（full nucleotide collection），对这些基因进行查询（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Nucleotides&PROGRAM=blastn&MEGABLAST=on&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on），这确定了所发现的命中片段（hit）只在黑腐坚固杆菌自身中存在，这说明设计用于扩增这些基因的某些区域的引物应该不会扩增来源于其它属（不限于细菌）的区域。

引物/探针设计

使用Clone Manager程序从基因组中选出全长基因序列。使用该程序的引物设计功能选择最佳长度为20个碱基（18-22碱基是可接受的）的引物组，从各基因中扩增个数介于90bp至150bp之间的产物。适用于每条引物的标准为，GC%介于50-60%之间，Tm为50-80℃，3′末端少于3个配对，相邻的同源碱基少于7个，5′端相对于3′端的稳定性大于或等于1.2kcal，3′端至少有一个G或C，连续的重复碱基少于4个（less than four base runs），二核苷酸重复序列少于3个，并且退火温度为55℃时不产生发夹结构。基于这些标准，发现三组引物组，分别从rfaH扩增124bp，从mgsA扩增91bp，以及从HP1扩增98bp。使用Clone Manager程序，用下列标准设计单链DNA探针：GC%为50-60%，Tm为32-100℃，相邻的同源碱基少于5个，连续的重复碱基少于4个，二核苷酸重复序列少于3个，退火温度为42℃时不产生发夹结构。

引物/探针检测

靶序列的初步扩增

利用黑腐坚固杆菌菌株SCRI1043的基因组DNA（登录号为BAA-672的ATCC保藏细菌）进行PCR，对三组引物组进行检测。使用下表的反应条件进行对称PCR，循环条件如下表4和表5所示。

	体积/反应，μL
		10×PCR缓冲液	3
MgCl₂，25mM	1.8
		dNTPs，6mM	3
正向引物，10μM	1.5
		反向引物，10μM	1.5
Taq聚合酶，5U/μL	0.3
		（DNA，2ng/μL）	2
dH₂O	16.9

总量	30

表4：对称检测的PCR反应条件

循环步骤	温度	时间
			1	94℃	1分钟
2	94℃	20秒
			3	58℃	20秒
4	72℃	20秒
			5	进入步骤2，39个循环
6	72℃	3分钟
			7	16℃	保温

表5：PCR循环条件

热循环之后，将10μl扩增PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上跑电泳。电泳之后，在UV灯下对凝胶拍照。使用100bp DNA ladder作为参照，所有引物组在这些条件下扩增了所需产物。在相同的PCR反应和循环条件下，使用不同量的黑腐坚固杆菌基因组DNA进行检测限实验，设置三个重复，从而确定，在DNA总量从2ng（366,468个拷贝）降至2pg（366个基因组拷贝）的所有水平下，rfaH得到扩增，而mgsA和HP 1在从2ng降至200fg（37个基因组拷贝）的所有水平下被检测到。合适地包括有阴性对照。

f）实施例6-对称和不对称扩增以及使用电化学探针进行检测

针对三个探针序列中的每个序列，采用荧光标记物合成了电化学探针。在对称PCR条件（上表5所示）或采用表6（下面）所示的反应条件的不对称PCR条件下（两者均使用上表5所示的循环条件），使用rfaH、mgsA和HP1引物组扩增了2纳克黑腐坚固杆菌基因组DNA，设置三个重复反应。对各扩增条件的各引物组，进行了三组阴性（仅为水）对照，设置三个重复。

	体积/反应，μL
		10×PCR缓冲液	3
MgCl₂，25mM	1.8
		dNTPs，6mM	3
引物，10μM过量^*	1.5
		引物，10μM不过量^*	0.2
Taq聚合酶，5U/μL	0.3
		（DNA，2ng/μL）	2
dH₂O	18.2

总量	30

表6：不对称测试的PCR反应条件

*过量的引物为rfaH反向引物、mgsA正向引物和HP 1反向引物

仅对对称PCR而言，每个反应取10μl在1.5%的琼脂糖凝胶上跑电泳，从而使PCR产物的大小可视化。这证实了PCR产物的存在。

如下表7所示，对各扩增子-特异性14-151探针制备合适的混合液。

反应物	浓度	终浓度	单一反应
				扩增子-特异性探针	100μM	3μM	0.75μL
T7核酸外切酶	10,000U/mL	10U	1.0μL
				dH₂O	n/a	n/a	3.25μL

表7：电化学检测的混合液

将5微升合适的探针混合物加入20μl PCR产物中，将混合物在37℃下孵育20分钟。孵育之后，采用下列Autolab参数，以电化学法测量电化学电势。

测量：测量后是否关闭电极的输出：X，调制周期（>=0.0025）：.04，取样间隔（>=0.105）：.1，

其它：扫描循环数：1。

由电化学读数而获得的平均值（n=3）数据在下表8中示出。

表8：针对各扩增子/探针组所获得的电化学数据总结

表8所示数据清晰地表明，与所有其它所检测的探针相比，使用HP1探针所获得的峰高较高，并且获得了611.33nA的平均峰高。结合53.7的平均阴性峰高，能够最大可能地区分阳性和阴性信号。阳性HP1样品在不对称条件下的峰值位置是相同的，并且阴性HP 1样品在不对称条件下给出了低的标准偏差和变异系数。mgsA扩增子/探针组的区分度差，rfaH扩增子/探针组提供了良好的区分度，但这与在HP1组中所见到的不是一个等级。因此，选择HP 1引物/探针组作为内对照用途。所选的正向引物对应于SEQ ID NO:11。所选的正向引物对应于SEQ ID NO:12。所选探针对应于SEQ ID NO:14。

d）实施例7-内对照探针和引物组的排他性验证

引言

必须的是，内对照检验具有高度特异性，并且与患者样品中可能存在的其它DNA（例如，人类DNA和传染性生物的核酸）不具有明显的交叉反应性。

利用PCR和探针-T7核酸外切酶末端检测，对来源于一组细菌的DNA样品检测内对照引物（SEQ ID NOs:11和12），从而检测特异性（排他性），探针序列如SEQ ID NO:14中所示。

对结果中所列出的一系列DNA进行基因组引物组检测，设置两个重复。在PCR和探针-T7核酸外切酶检测之后，测量信号峰高的输出。试验分批进行，并且所试验的各批次都使用PCR对照。

内对照结果

对一系列基因组DNA检测了以黑腐坚固杆菌为靶标的引物和探针。以下示出重复实验的结果：

实施例8-对沙眼衣原体的染色体扩增子17引物和探针组的进一步测试

将下列材料混合以制备PCR混合液：

材料	体积（μL）
		10×PCR缓冲液	2.5
MgCl₂（25mM）	5.0
		dUTPs混合物	0.5
ME17正向引物（SEQ ID NO:6）	0.1
		ME17反向引物（SEQ ID NO:7）	0.75
UDG	0.25
		Taq聚合酶	0.25
分子生物学等级的H₂O	3.15

将混合液分成12.5μl的等分试样。向12.5μl体积中加入从1,000、100、10和0的沙眼衣原体EB中提取的DNA。之后孵育样品以产生UDG活性，并且进行变性，然后进行下述PCR：

在以下检验中，将扩增样品用作检测靶标，所述检验使用了0.8U T7核酸外切酶和9μM具有SEQ ID NO:5的序列的特异性探针（最终反应浓度）。各样品的检验设置三个重复。

混合下列材料制备检测混合物：

从每个检测混合物中取1.325μl加入11.175μl的各扩增样品中，设置三个重复，置于37℃下孵育20分钟，之后采用下列Autolab参数在新制的电极上进行伏安法分析：

电位：起始：-0.1，最终：0.5，阶跃：0.003,调制幅度：0.04995，等候电位：0，

其它：扫描循环数：1。

记录了位于大约150-200mV处的峰的峰高和峰值位置。

结果在图3中示出。

同时，上述实施例中的数据提供证据证明，所公开的引物、探针和方法在用于“单一”反应时是有利的，因为上述实验不涉及双重PCR试验，在所述双重PCR中，沙眼衣原体和内对照反应一起进行，并且分别被标记，从而能够在一只管中检测这两种靶标，于是进行了以下进一步的实施例。

实施例9-双重试验1

方法概述

重复进行上文详细描述的两种优化的“单一”反应，但添加了对第二分析物特异的引物组和该靶标分析物DNA。

结果

据发现，双重反应混合物中的某种物质降低了衣原体靶标的电化学峰高。这种效果可以从图4的实验中得知，其中在存在和缺乏内对照引物组，并且具有和不具有200pg内对照DNA的条件下，对ME17衣原体染色体引物组进行实验。图4清晰地显示出，在存在内对照引物组，而不是仅存在内对照DNA时，沙眼衣原体的扩增会不利地影响利用沙眼衣原体探针进行检测所获得的电化学信号。使用内对照探针进行相同的实验，从而用电化学法检测内对照扩增子。所获数据显示在图5中。

图5显示了“单一”PCR所预期的内对照电化学信号的剧烈减少，所述“单一”PCR包含内对照引物和200pg染色体内对照靶分子，其中通常可以观察到超过1,000nA的峰高。考虑到在其它双重试验中，没有观察到靶标染色体DNA与内对照之间的干扰，这些数据是令人奇怪的。总之，这些数据指出，沙眼衣原体引物组或内对照引物组不作用于沙眼衣原体/内对照双重检验。这些数据通过进行以下实验来验证，该实验在具有和不具有内对照引物组的条件下，采用对称PCR来扩增沙眼衣原体，并且使用琼脂糖凝胶电泳作为检测方法。下面的图6a和6b（只有沙眼衣原体引物组）以及图7a和7b（沙眼衣原体引物组和内对照引物组）显示了凝胶照片。

当另外的同样的PCR反应中包含有内对照引物组时，检测水平仅可能降至1,000IFU/反应，表明内对照引物组会降低沙眼衣原体IFU的扩增效率三个对数级水平（如凝胶电泳所确定的那样）。

进行进一步的对称PCR实验（利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增子）来改进上述方法，从而确定了哪个内对照引物对沙眼衣原体检测有干扰。该实验显示，当在存在内对照正向引物的情况下扩增沙眼衣原体时，观察到正确分子量的扩增产物的水平下降至10沙眼衣原体IFU/反应。然而，当沙眼衣原体的扩增中包含内对照反向引物时，沙眼衣原体扩增的检测限升高至10,000IFU/反应。凝胶照片也表明，在使用沙眼衣原体引物组和内对照反向引物的PCR条件下，会形成强的引物二聚体（如凝胶上的粗的低分子量条带所示）。

对内对照反向引物以及沙眼衣原体的正向和反向引物的生物信息学分析显示，内对照正向引物与沙眼衣原体反向引物的3′端的5个末端碱基是互补的，这解释了在琼脂糖凝胶上所观察到的引物二聚体，以及在双重扩增中的差的表现。序列相似性显示如下：

5′-TTCCAGAGGCAATGCCAAAG-3′-沙眼衣原体rv

：：：：：

3′-GTTTCCTAAGGGTCAAGTCC-5′-IC fw

由于在热循环过程中形成了引物二聚体，导致在包含内对照反向引物的双重反应中对沙眼衣原体的扩增和检测较差，猜测序列相似性是上述表现的原因。

决定不通过移除引物的3′同源部分来重新设计引物。由于内对照引物组在目前使用其它DNA靶标的双重检测中表现良好，因此决定重新设计沙眼衣原体反向引物。沙眼衣原体正向引物必须随之修改为反向引物的Tm（其由于所添加的碱基而升高）。新的沙眼衣原体正向和反向引物具有以下序列：

新CT正向引物：5'-caaacctcac tagtcagcat caagctagg-3'（SEQID NO:17）

新CT反向引物：5'-agattccaga ggcaatgcca aagaaa-3'（SEQID NO:19）

添加到CT正向引物5′端的7个额外的碱基对旨在成为沙眼衣原体染色体DNA链序列（针对其设计引物）的5′端的延伸。然而，引物设计中的错误意味着这七个额外的碱基实际上与想要包含的部分互补。然而，这似乎达到了使每个引物的Tm彼此相近的目的，同时保留了之前所观察到的“旧的”沙眼衣原体正向引物（SEQ ID NO:6）的性能。

虽然这7个非互补性碱基代替了7个互补性碱基而被错误地添加到正向引物的5′端，但是仍然使用内对照DNA和正向及反向引物在双重反应中检测新的沙眼衣原体引物组，从而进行了实验。首先，利用对称PCR检测引物的相容性，利用琼脂糖凝胶电泳分析所产生的扩增子。令人惊奇地是，该实验表明，新的沙眼衣原体正向和反向引物提供了1IFU的检测限，这与在图6a/b中所观察到的相同。当将内对照引物加入该反应混合物中时，利用电泳的检测限略微增加至10IFU（在电化学实验中，显示检测到1IFU）；这提高了在图7a/b中所观察到的结果。进一步的实验检测了新的沙眼衣原体引物组和内对照引物组通过双重反应对这两种靶染色体DNA进行不对称扩增的能力，之后进行电化学检测。这些数据在图8中示出。

图8所示的数据表明，当与已有的内对照引物组组合时，经修饰的沙眼衣原体引物组使得能够利用双重PCR对这些靶标进行共扩增和电化学检测。

实施例10-双重试验2

进行另外的实验以评价与靶DNA完全互补的延长的沙眼衣原体正向引物（SEQ ID NO:18）的性能。

结果

当在双重PCR反应中使用反向引物SEQ ID NO:19和探针SEQID NO:5以及优选的内对照时，发现SEQ ID NO:18起到与SEQ IDNO:17正向引物一样好的作用。图9示出了使用3种PCR混合液的双重实验比较组。“CT”表示沙眼衣原体的值，“IC”表示内对照的值，“IFU”=感染单位。

内对照反应由始至终使用引物SEQ ID NOs:11和12，以及探针SEQ ID NO:14。

对于沙眼衣原体反应，混合液A使用引物SEQ ID NOs:6和7，以及探针SEQ ID NO:5，并且显示出介于10,000IFU和1,000IFU之间的检测限。

对于沙眼衣原体反应，混合液B使用引物SEQ ID NOs:17和19，以及探针SEQ ID NO:5，并且显示出介于10IFU和1IFU之间的检测限。

对于沙眼衣原体反应，混合液C使用引物SEQ ID NO:18和19，以及探针SEQ ID NO:5，并且显示出介于10IFU和1IFU之间的检测限。

实施例9和10中的数据表明，使用沙眼衣原体正向引物SEQ IDNOs:17和18以及反向引物SEQ ID NO:19的核酸扩增反应特别适合在双重反应中与内对照核酸一起使用，并且进行本发明的扩增。具有SEQ ID NO:17的序列的引物具有良好的表现，但特别令人惊奇的是，其序列与其靶标的不完全互补。

Claims

1.一种在样品中检测来源于沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatis）的遗传物质的方法，该方法包括对核酸序列进行序列特异性检测，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1或其互补序列中的至少10个连续的核苷酸残基；

SEQ ID NO:1：atgaattcaa atatagaata taggcaatat cgtatagata

tactgagctg ttttatctgc ttgctaatga tggtttggac actagtcagc

atcaagctag gagattctct aggaggcatc attcctggat gcttaggata

cttactggct aaaaggaagc atcgccgtcc tgtccgctgg ttcttcctta

cttttttctt tggcattgcc tctggaatct tccttgtcgt tcttcatcct

aagcaaaagt aa；

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述序列特异性检测包括进行核酸杂交步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述序列特异性检测包括进行核酸杂交步骤，之后进行核酸杂交检测步骤。

4.根据权利要求2或3所述的方法，所述核酸序列包含SEQ IDNO:1中的至少15个连续的核苷酸残基。

5.根据权利要求4所述的方法，该方法包括使来源于沙眼衣原体的遗传物质与这样的核酸序列杂交，所述核酸序列包含SEQ ID NO:4或其互补序列中的至少15个连续的核苷酸残基；

SEQ ID NO:4：ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt；

6.根据权利要求5所述的方法，该方法包括使来源于沙眼衣原体的遗传物质与这样的核酸序列杂交，所述核酸序列包含SEQ ID NO:5或其互补序列中的序列；

SEQ ID NO:5：ctgtccgctg gttcttcctt act；

7.根据权利要求2或3所述的方法，该方法包括使来源于沙眼衣原体的遗传物质与这样的核酸探针杂交，所述核酸探针包含SEQID NO:4或其互补序列中的至少10个连续的核苷酸残基；

SEQ ID NO:4：ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt；

其中所述序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变，并且其中所述核酸探针包含小沟结合部分或其中所述核酸探针为锁核酸（LNA）。

8.根据权利要求1至7中任意一项所述的方法，其中对所述待测核酸进行扩增后进行所述序列特异性检测方法，利用聚合酶链式反应、转录介导的扩增、核酸序列依赖性扩增（NASBA）、解旋酶依赖性扩增、重组酶聚合酶扩增、链置换扩增、或环介导等温扩增对所述待测核酸进行扩增。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述序列特异性检测方法包括聚合酶链式反应。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述聚合酶链式反应涉及使用正向PCR引物和反向PCR引物，并且其中：

a）所述正向PCR引物包含这样的核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:15中的个数介于17个至34个之间的连续核苷酸残基；

并且

b）所述反向PCR引物包含这样核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:16中的个数介于15个至31个之间的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:16：aaggaagatt ccagaggcaa tgccaaagaa aaaagt；

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述正向PCR引物包含具有在SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:6中所提供的序列的核酸；

SEQ ID NO:6：cactagtcag catcaagcta gg；

SEQ ID NO:17：caaacctcac tagtcagcat caagctagg；

SEQ ID NO:18：gtttggacac tagtcagcat caagctagg；

并且其中所述反向PCR引物包含具有在SEQ ID NO:19或SEQID NO:7中所提供的序列的核酸；

SEQ ID NO:7：ttccagaggc aatgccaaag；

SEQ ID NO:19：agattccaga ggcaatgcca aagaaa。

12.根据权利要求9或11所述的方法，其中所述聚合酶链式反应涉及使用具有这样的核酸序列的核酸探针，所述核酸序列包含SEQID NO:4或其互补序列中所提供的个数介于18个至28个之间的核酸残基；

SEQ ID NO:4：ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt；

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸探针包含SEQID NO:5中所提供的核酸序列；

SEQ ID NO:5：ctgtccgctg gttcttcctt act。

14.根据权利要求9所述的方法，其中所述聚合酶链式反应涉及使用正向PCR引物和反向PCR引物，并且其中：

a）所述正向PCR引物包含这样的核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:15中的个数介于12个至29个之间或19个至29个之间的连续核苷酸残基；

并且

b）所述反向PCR引物包含这样的核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:16中的个数介于16个至26个之间的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:16：aaggaagatt ccagaggcaa tgccaaagaa aaaagt；

或者其中所述正向PCR引物包含这样的核酸序列，该核酸序列为上述部分b）中所限定的反向引物的互补序列，并且所述反向PCR引物包含这样的核酸序列，该核酸序列为上述部分a）中所限定的正向引物的互补序列；其中所述序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变，并且其中所述引物包含小沟结合部分或其中所述引物为锁核酸（LNA）。

15.一种包含这样的核酸序列的正向PCR引物，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:15中的个数介于17个至34个之间的连续核苷酸残基；

16.根据权利要求15所述的正向PCR引物，其包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:6中所提供的核酸；

SEQ ID NO:6：cactagtcag catcaagcta gg；

SEQ ID NO:17：caaacctcac tagtcagcat caagctagg；

SEQ ID NO:18：gtttggacac tagtcagcat caagctagg。

17.一种包含这样的核酸序列的反向PCR引物，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:16中的个数介于15个至31个之间的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:16：aaggaagatt ccagaggcaa tgccaaagaa aaaagt；

18.根据权利要求15所述的反向PCR引物，其包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:7中所提供的核酸序列；

SEQ ID NO:7：ttccagaggc aatgccaaag；

SEQ ID NO:19：agattccaga ggcaatgcca aagaaa。

19.一种包含这样的核酸序列的核酸探针，所述核酸序列包含SEQ ID NO:4或其互补序列中所提供的个数介于18个至28个之间的核酸残基；

SEQ ID NO:4：ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt；

20.根据权利要求19所述的核酸探针，其包含SEQ ID NO:5中所提供的核酸序列；

SEQ ID NO:5：ctgtccgctg gttcttcctt act。

21.一种包含这样的核酸序列的正向PCR引物，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:15中的个数介于19个至29个之间的连续核苷酸残基：

其中所述序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变；

或者一种包含这样的核酸序列的反向PCR引物，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:16中的个数介于16个至26个之间的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:16：aaggaagatt ccagaggcaa tgccaaagaa aaaagt；

或者一种包含这样的核酸序列的核酸探针，所述核酸序列包含SEQ ID NO:4或其互补序列中所提供的个数介于13个至23个之间的核酸残基；

SEQ ID NO:4：ccgtcctgtc cgctggttct tccttacttt ttt；

并且其中所述正向PCR引物、所述反向PCR引物和所述核酸探针包含小沟结合部分，或者其中所述正向PCR引物、所述反向PCR引物和所述核酸探针为锁核酸（LNA）。

22.根据权利要求15、16或21所述的正向PCR引物，根据权利要求17、18或21所述的反向PCR引物，或者根据权利要求19、20或21所述的核酸探针，其中所述正向PCR引物、所述反向PCR引物或所述核酸探针与电化学活性标记物结合。

23.一种PCR组分，其包含权利要求15、16或21中所限定的正向PCR引物，以及权利要求17、18或21中所限定的反向PCR引物。

24.根据权利要求23所述的PCR组分，其还包含权利要求19、20或21中所限定的核酸探针。

25.根据权利要求23或24所述的PCR组分，其还包含用作阳性内对照的来源于黑腐坚固杆菌（Pectobacterium atrosepticum）的基因组DNA。

26.根据权利要求25所述的PCR组分，其中所述黑腐坚固杆菌为ATCC BAA-672菌株。

27.根据权利要求23至26中的任意一项所述的PCR组分，其还包含第二正向PCR引物和第二反向PCR引物，其中所述引物被设计为与包含于SEQ ID NO:8或其互补的核酸序列中的靶核酸序列杂交；

SEQ ID NO:8：ctaccgtgta gggtcatagg cattgacctc atggctccac

ggaatcgtgc gatcgtcaac tgcgacgtgc cattcacagt gcgtaagagc

accgcgaatc tcggataaac actggcacca gtgctgtacg ccaatccaga

ttgcttcttc ctcgctgtcg ggaagtttgg ttgaaccgga gagcacgatc

cctttcctaa agacgttacc gattttcaca ttgagggcga aatcaaagga

ttcccagttc aggcctgtac ccgtcgtcag atatttctca atttggtcat

taacagaatg gcgttggacg atctccttca cggcagatat ctctttctgg

ctcagggatt ttttacgtcg agcggtgtaa tagagcgaaa ttgccac；

28.根据权利要求27所述的PCR组分，其中：

a.所述第二正向PCR引物包含这样的核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:9中的个数介于13个至23个之间的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:9：ctcgctgtcg ggaagtttgg ttgaaccg；

并且

b.所述第二反向PCR引物包含这样的核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:10中的个数介于15个至25个之间的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:10：acaggcctga actgggaatc ctttgatttc；

或者其中所述第二正向PCR引物包含这样的核酸序列，该核酸序列为上述部分b）中所限定的反向引物的互补序列，并且所述第二反向PCR引物包含这样的核酸序列，该核酸序列为上述部分a）中所限定的正向引物的互补序列；其中所述序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变。

29.根据权利要求28所述的PCR组分，其中所述第二正向PCR引物包含具有SEQ ID NO:11中所提供的序列的核酸；

SEQ ID NO:11：tgtcgggaag tttggttg；

并且其中所述第二反向PCR引物包含具有SEQ ID NO:7中所提供的序列的核酸；

SEQ ID NO:12：cctgaactgg gaatcctttg。

30.根据权利要求27所述的PCR组分，其中下述未限定的所述第二正向PCR引物或所述反向PCR引物如权利要求29所限定的那样，但其中所述引物中的至少一种为：

a）包含这样的核酸序列的第二正向PCR引物，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:9中的个数介于8个至18个之间的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:9：ctcgctgtcg ggaagtttgg ttgaaccg；

并且

b）包含这样的核酸序列的所述第二反向PCR引物，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:10中的个数介于10个至20个之间的连续核苷酸残基；

SEQ ID NO:10：acaggcctga actgggaatc ctttgatttc；

其中所述核酸序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变，并且其中所述引物包含小沟结合部分，或者其中所述引物为锁核酸（LNA）。

31.根据权利要求25至30中任意一项所述的PCR组分，其中所述聚合酶链式反应涉及使用包含这样的核酸序列的第二核酸探针，所述核酸序列包含SEQ ID NO:13或其互补序列中所提供的个数介于18个至28个之间的核酸残基；

SEQ ID NO:13：ggagagcacg atccctttcc taaagacgtt acc；

32.根据权利要求31所述的PCR组分，其中所述核酸探针包含SEQ ID NO:14中所提供的核酸序列；

SEQ ID NO:14：gcacgatccc tttcctaaag acg。

33.根据权利要求25至30中任意一项所述的PCR组分，其中所述聚合酶链式反应涉及使用包含这样的核酸序列的第二核酸探针，所述核酸序列包含SEQ ID NO:13或其互补序列中所提供的个数介于13个至23个之间的核酸残基；

SEQ ID NO:13：ggagagcacg atccctttcc taaagacgtt acc；

其中所述核酸序列可以通过至多5个残基的添加、缺失或替换而发生进一步突变，并且其中所述核酸探针包含小沟结合部分，或者其中所述核酸探针为锁核酸。

34.一种包含权利要求23至33中的任意一项所述PCR组分的试剂盒以及进行权利要求1至14中的一者所述方法的说明书。

35.一种在样品中检测来源于黑腐坚固杆菌的遗传物质的方法，该方法包括对黑腐坚固杆菌的染色体中所包含的核酸序列进行序列特异性检测。