BRPI0517131B1 - Métodos para simplificar ácidos nucléicos microbiais por modificação química de citosinas - Google Patents

Abstract

métodos para simplificar ácidos nucléicos microbiais por modificação química de citosinas. refere-se o presente invento a um método para a simplificação de um genoma microbial ou ácido nuclélco microbial, compreendendo tratar o genoma ou ácido nucléico microbial com um agente que modifica a citosina para formar um derivado de ácido nucléico microbial e amplificar o derivado de ácido nucléico microbial para produzir uma forma simplificada de genoma ou ácido nucléico microbial.

Description

[001] Refere-se o presente invento a ensaios de detecção de ácido nucléico para a detecção de microorganismos. O presente invento também se refere a métodos para tratamento químico de ácidos nucléicos para reduzir a complexidade dos genomas microbiais combinado com o uso de ligantes específicos para a detecção microbial.

[002] Vários procedimentos estão disponíveis no presente para a detecção de ácidos nucléicos e moléculas específicas. Estes procedimentos dependem tipicamente da hibridização dependente de seqüência entre o ácido nucléico alvo e as sondas de ácido nucléico que podem variar em comprimento de oligonucleotídeos curtos (20 bases ou menos) até seqüências de muitas quilobases (kb).

[003] A detecção molecular de microrganismos da arte anterior requer a identificação de sequências de ácidos nucleicos característicos únicas que existem no genoma microbiano nativo e o uso dessas sequências únicas como um meio para a detecção direta do microrganismo. O documento WO 1998/20157 é um exemplo típico de tal estratégia. Se, no entanto, não houver sequências únicas em um genoma microbiano, esse microorganismo não poderá ser detectado pela abordagem molecular da técnica anterior. Os presentes inventores descobriram que, tratando o ácido nucleico microbiano com um agente que modifica a citosina em uracil para formar ácido nucleico microbiano derivado e, por exemplo, amplificando o ácido nucleico microbiano derivado, é possível formar um ácido nucleico simplificado contendo características únicas e caracterizadoras, sequências de ácidos nucleicos que podem ser usados para identificar indiretamente um microorganismo presente em uma amostra.

[004] O documento WO 1998/20157 é direcionado a um método que utiliza sondas e/ou iniciadores de amplificação que são específicos, onipresentes e sensíveis para determinar a presença e/ou quantidade de ácidos nucleicos de um gene de resistência a antibióticos bacterianos de espécies bacterianas e/ou fúngicas selecionadas em uma amostra. Cada um dos ácidos nucleicos nativos de ocorrência natural compreende uma região alvo selecionada hibridizável com as sondas ou iniciadores. A amostra é contatada com as sondas ou iniciadores e a presença e/ou quantidade de sondas hibridizadas ou produtos amplificados é detectada.

[005] O método mais amplamente usado para amplificação de seqüências específicas dentre uma população de seqüências de ácidos nucléicos é o da reação em cadeia da polimerase (PCR) (Dieffenbach, C. e Dveksler, G. eds. PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY). Neste método de amplificação, os oligonucleotídeos, geralmente de 20 a 30 nucleotídeos de comprimento em fitas complementares de DNA e numa das extremidades da região a ser amplificada, são usados para preparar a síntese do DNA em DNA de fita simples desnaturado. Os ciclos sucessivos de desnaturação, hibridização do preparado e síntese de fita de DNA usando DNA polimerases termoestáveis permite a amplificação exponencial das seqüências entre os preparados. As seqüências de RNA podem ser amplificadas primeiro pela cópia usando transcriptase reversa para produzir uma cópia complementar do DNA (cDNA). Os fragmentos amplificados do DNA podem ser detectados por uma variedade de meios incluindo eletroforese em gel, hibridização com sondas marcadas, uso de preparadores marcados que permitem a identificação subseqüente (p.ex. por um ensaio de enzima ligada), e o uso de preparados fluorescentemente marcados que produzem um sinal com a hibridização com o DNA alvo (p.ex. sistemas Beacon e TaqMan).

[006] Da mesma forma que a PCR, várias outras técnicas foram desenvolvidas para a detecção e amplificação de seqüências específicas de nucleotídeos. Um exemplo é a reação em cadeia de ligase (1991, Barany, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 189-193).

[007] Um outro exemplo é a amplificação isotérmica que foi primeiramente descrita em 1992 (Walker, G.T., Little, M.C., Nasdeau, J.G. e Shank, D., Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396, 1992) e denominada de Amplificação por Deslocamento de Fita (Strand Displacement Amplification - SDA). Desde então, várias tecnologias de amplificação isotérmicas foram descritas incluindo a Amplificação Mediada por Transcrição (TMA) e a Amplificação Baseada em Seqüência de Ácidos Nucléicos (NASBA) que usa uma RNA polimerase para copiar as seqüências RNA mas não o DNA genômico correspondente (Guatelli, J.C., Whitfield, K.M., Kwoh, D.Y., Barringer, K.J., Richmann, D.D., e Gingeras, T.R., Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. PNAS 87: 1874-1878 (1990); Kievits, T., van Gemen, B., van Strijp, D., Schukkink, R., Dircks, M., Adriaanse, H., Malek, L., Sooknanan, R., Lens, P., NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for diagnosis of HIV-1 infection, J. Virol. Methods, 1991 Dec., 35(3): 273-86).

[008] Outras técnicas isotérmicas baseadas em DNA incluem Amplificação de Círculo Rolante (RCA) em que a DNA polimerase estende um iniciador voltado para um gabarito circular (Fire, A., e Xu, S.Q., Rolling replication of short circles. PNAS 92: 4641-4645 (1995), Amplificação por ramificação (RAM) que usa uma sonda circular para detecção do alvo (Zhang, W., Cohenford, M., Lentrichia, B. Isenberg, H.D., Simson, E., Li, H., Yi, J., Zhang, D.Y., Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study. J. Clin. Microbiol., 2002, Jan; 40(1):128-32) e mais recentemente, Amplificação isotérmica de DNA Dependente de Helicase (HDA), que usa a enzima helicase para desenrolar as fitas de DNA em vez do calor (Vincent, M., Xu, Y., Kong, H., Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004 Aug; 5(8): 795:800).

[009] Recentemente, foram descritos métodos isotérmicos de amplificação de DNA (Walker, G.T., Little, M.C., Nadeau, J.G. e Shank, D., Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396, 1992). As técnicas de amplificação tradicionais se baseiam nos ciclos continuados de desnaturação e renaturação das moléculas-alvo em cada ciclo da reação de amplificação. O tratamento térmico do DNA resulta em um certo grau de cisalhamento das moléculas de DNA, assim, quando o DNA estiver limitado tal como no isolamento do DNA de um pequeno número de células de um blastócito em desenvolvimento, ou particularmente nos casos em que o DNA já está numa forma fragmentada, tal como em seções de tecido, blocos parafínicos e amostras antigas de DNA, este ciclo de aquecimento-resfriamento poderia danificar adicionalmente o DNA e resultar em perda de sinais de amplificação. Os métodos isotérmicos não se baseiam na contínua desnaturação do gabarito de DNA para produzir moléculas de fita única para servir como gabarito para amplificação adicional, mas na cisão enzimática de moléculas de DNA por endonucleases de restrição específicas a uma temperatura constante.

[0010]A técnica denominada Amplificação por Deslocamento de Fita (SDA) baseia- se na capacidade de certas enzimas de restrição de cortar as fitas não modificadas de DNA hemi-modificado e a capacidade de uma polimerase deficiente de exonuclease 5'-3' de estender e deslocar a fita a jusante. A amplificação exponencial é então alcançada pelas reações de acoplamento senso e anti-senso em que o deslocamento de fita da reação senso serve como gabarito para a reação anti-senso (Walker, G.T., Little, M.C., Nadeau, J.G., e Shank, D., Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396, 1992). Tais técnicas foram usadas para a amplificação bem-sucedida de Mycobacterium tuberculosis (Walker, G.T., Little, M.C., Nadeau, J.G., e Shank, D., Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396, 1992), HIV-1, Hepatitis C e HPV-16 (Nuovo, G.J., 2000), Chlamydia trachomatis (Spears, P.A., Linn, P., Woodard, D.L. e Walker, G.T., Simultaneous Strand Displacement Amplification and Fluorescence Polarization Detection of Chlamydia trachomatis, Anal. Biochem., 247: 130-137, 1997).

[0011]Até hoje, o uso de SDA depende de nucleotídeos fosforotioato modificados a fim de produzir um DNA hemi-fosforotioato duplex que seja resistente à clivagem enzimática na fita modificada, resultando em corte em vez de digestão para acionar a reação de deslocamento. Recentemente, entretanto, várias enzimas de "corte" foram projetadas. Estas enzimas não cortam o DNA da forma tradicional, mas produzem um corte em uma das fitas de DNA. As enzimas de "corte" incluem N.Alw1 (Xu, Y., Lunnen, K.D. e Kong, H., Engineering a nicking endonuclease N.Alw1 by domain swapping. PNAS 98: 12990-12995, 2001), N.BstNB1 (Morgan, R.D., Calvet, C., Demeter, M., Agra, R., Kong, H., Characterization of specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNB1. Biol. Chem. 2000, Nov, 381(11):1123-5) e Mly1 (Besnier, C.E., Kong, H., Converting Mly1 endonuclease into a nicking enzyme by changing its oligomerization state. EMBO Rep. 2001 Sep, 2(9): 782-6. Epub 2001 Aug 23). O uso de tais enzimas simplificaria assim o procedimento SDA.

[0012]Em adição, a SDA foi aperfeiçoada pelo uso de uma combinação de enzimas de restrição termoestáveis (Ava1) e exo-polimerase termo-estável (Bst polimerase). Esta combinação tem mostrado aumentar a eficiência da amplificação da reação de uma amplificação da ordem de 108 para uma amplificação da ordem de 1010 de modo que seja possível, usando esta técnica, a amplificação de cópias únicas de moléculas. O fator de amplificação resultante usando a combinação de polimerase/enzima termoestáveis é da ordem de 109 (Milla, M.A., Spears, P.A., Pearson, R.E. e Walker, G.T., Use of the Restriction Enzyme Ava1 and Exo-Bst Polymerase in Strand Displacement Amplification Biotechniques, 1997, 24:392-396).

[0013]Até hoje, todas as técnicas de amplificação isotérmica de DNA exigem que a molécula gabarito de DNA com dupla fita seja desnaturada antes do início da amplificação. Em adição, a amplificação só é iniciada uma vez a partir de cada evento iniciador.

[0014]Para detecção direta, o ácido nucléico alvo é mais freqüentemente separado com base no tamanho por eletroforese em gel e transferido para um suporte sólido antes da hibridização com uma sonda complementar à seqüência alvo (Southern e Northern blotting). A sonda pode ser um ácido nucléico natural ou análogo tal como um ácido nucléico peptídeo (PNA) ou ácido nucléico travado (LNA) ou ácido nucléico intercalante (INA) a sonda pode ser rotulada diretamente (p.ex. com 32P) ou pode ser usado um procedimento de detecção indireta. Os procedimentos de detecção indireta se baseiam na incorporação de uma "etiqueta" na sonda, tal como uma biotina ou uma digoxigenina, e a sonda é então detectada por meios tais como conversão de substrato ligado a enzima ou quimioluminescência.

[0015]Um outro método para a detecção direta de ácidos nucléicos que tem sido amplamente usado é a hibridização "sanduíche". Neste método, uma sonda de captura é acoplada a um suporte sólido e o ácido nucléico alvo, em solução, é hibridizado com a sonda ligada. O ácido nucléico alvo não ligado é lavado e o ácido nucléico ligado é detectado usando uma segunda sonda que hibridiza com as seqüências alvo. A detecção pode usar os métodos direto ou indireto, como delineado acima. Exemplos de tais métodos incluem o sistema de detecção de sinal de "DNA ramificado", um exemplo que usa o princípio de hibridização sanduíche (1991, Urdea, M.S., et al., Nucleic Acids Symp. Ser., 24, 197-200). Uma área que cresce rapidamente que usa a hibridização de ácidos nucléicos para detecção direta de seqüências de ácidos nucléicos é aquela das microarranjos de DNA (DNA microarrays) (2002, Nature Genetics, 32, [Supplement]; 2004, Cope, L.M., et al., Bioinformatics, 20, 323-331; 2004, Kendall, S.L., et al., Trends in Microbiology, 12, 537-544). Neste processo, as espécies de ácidos nucléicos individuais, que podem variar de pequenos oligonucleotídeos (tipicamente de 25 meros no sistema Affymetrix) até oligonucleotídeos mais longos (tipicamente de 60 meros nas plataformas Applied Biosystems e Agilent), a seqüências ainda maiores tais como clones de DNA, são fixados a um suporte sólido num padrão de grada ou fotolitograficamente sintetizados sobre um suporte sólido. Uma população de ácidos nucléicos etiquetados ou rotulados é então hibridizada com o arranjo e o nível de hibridização de cada ponto do arranjo é quantificado. Mais freqüentemente, os ácidos nucléicos radiativamente ou fluorescentemente rotulados (p.ex., cRNAs o cDNAs) são usados para hibridização, embora outros sistemas de detecção possam ser empregados, tais como quimioluminescência.

[0016]Uma área que cresce rapidamente que usa a hibridização de ácido nucléico para detecção direta de seqüências de ácidos nucléicos é aquela de microarranjo de DNA (Young, R.A., Biomedical Discovery with DNA arrays. Cell, 102: 9-15, 2000; Watson, A., New tools. A new breed of high tech detectives. Science 289: 850-854, 2000). Neste processo, as espécies individuais de ácidos nucléicos, que podem variar de oligonucleotídeos a seqüências mais longas tais como clones de DNA complementar (cDNA), são fixados a um suporte sólido num padrão de grade. Uma população de ácidos nucléicos etiquetados ou rotulados é então hibridizada com o arranjo e o nível de hibridização de cada ponto do arranjo é quantificado. Mais freqüentemente, os ácidos nucléicos radiativamente ou fluorescentemente rotulados (p.ex., cDNAs) são usados para hibridização, embora outros sistemas de detecção possam ser empregados.

[0017]Os métodos tradicionais para detecção de microorganismos tais como bactérias, leveduras e fungos incluem cultura dos microorganismos em meio nutriente seletivo e então a classificação dos microorganismos com base no tamanho, formato, produção de esporos, características tais como reações bioquímicas ou enzimáticas e propriedades de manchamento específicas (tais como o manchamento Gram), como visto sob microscopia de luz convencional. As espécies virais devem crescer em tecidos ou células especializadas e então classificadas com base na sua estrutura e tamanho determinados por microscopia eletrônica. Uma desvantagem principal de tais técnicas é que nem todos os microorganismos irão crescer sob cultura convencional ou condições celulares, limitando a utilidade de tais abordagens. Com bactérias, por exemplo, tais como Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae (todos que causam meningite e dentre os quais o N. meningitidis causa ambas meningite e a meningococcemia fulminante), todas as três espécies são difíceis de cultivar. Garrafas de cultura em sangue são rotineiramente examinadas a cada dia por sete dias, e a sub-cultura é necessária.

[0018]O H. influenzae requer meio especial contendo ambos dinucleotídeos nicotinamida adenina e hemina e crescimento em placas de Agar chocolate. As culturas em sangue exigem tripticase de broto de soja ou BHI e a adição de vários aditivos tais como polianetolsulfonato de sódio. Para microorganismos tais como Clostridium botulinum, que causa envenenamento alimentar grave e hipotonia, a identificação da toxina envolve a injeção de extratos alimentares ou sobrenadantes de cultura em camundongos e a visualização dos resultados após 2 dias. Em adição, a cultura de microorganismos potenciais em meio especial leva uma semana. A enterotoxina de Staphilococcus aureus (causa de envenenamento alimentar bem como de infecções de pele, infecções sanguíneas, pneumonia, osteomielite, artrite e de abcessos no cérebro) é detectada em quantidades mínimas por absorção seletiva da toxina via resinas de troca iônica ou aglutinação em látex usando anticorpos monoclonais. Seu parente, S. epidermis, leva a infecções de sangue e contamina equipamentos e superfícies em hospitais e máquinas e utensílios de saúde.

[0019]Os microorganismos não virais também podem ser classificados com base em suas propriedades metabólicas tais como a produção de aminoácidos específicos ou metabólitos durante as reações de fermentação em substratos tais como glicose, maltose ou sacarose. Alternativamente, os microorganismos podem ser tipados com base em sua sensibilidade aos antibióticos. Os anticorpos específicos a antígenos da superfície das células ou proteínas excretadas tais como toxinas também são usados para identificar ou tipar microorganismos. Entretanto, todos os métodos acima são baseados na cultura do microorganismo antes do teste subseqüente. A cultura dos microorganismos é cara e consome tempo, e também pode sofrer contaminação ou o crescimento exagerado de microorganismos menos exigentes. As técnicas também são relativamente brutas pelo fato de que muitos testes devem ser feitos na mesma amostra a fim de se alcançar um diagnóstico definitivo. A maioria dos microorganismos não pode crescer prontamente em meios comuns, e, portanto, eles caem abaixo dos níveis de detecção quando uma população tipicamente misturada de espécies diferentes de microorganismos está presente na desordem ou em associação com organismos superiores.

[0020]Outros métodos para a detecção e identificação de microorganismos patogênicos são baseados na abordagem sorológica em que os anticorpos são produzidos em resposta à infecção com o microorganismo. Os meningococos, por exemplo, são classificáveis com base nas diferenças estruturais dos seus polissacarídeos capsulares. Estes têm diferentes antigenicidades, permitindo a determinação de cinco sorogrupos particulares (A, B, C, Y e W-135). Os ensaios ELISA ou RIA podem avaliar a produção de tais anticorpos. Ambos métodos detectam a presença de anticorpos específicos produzidos pelo animal hospedeiro durante o curso da infecção. Estes métodos sofrem a desvantagem de levar algum tempo para um anticorpo ser produzido pelo animal hospedeiro, e assim as infecções muito recentes são freqüentemente não diagnosticadas. Em adição, o uso de tais ensaios não pode diferenciar confiavelmente entre infecções passadas e ativas.

[0021]Mais recentemente, houve muito interesse no uso de métodos moleculares para a diagnose de doenças infecciosas. Estes métodos oferecem a detecção sensível e específica de microorganismos patogênicos. Exemplos de tais métodos incluem o sistema de detecção de sinal "DNA ramificado". Este método é um exemplo que usa o princípio de hibridização sanduíche (Urdea, M.S., et al., Branched DNA amplification multimers for sensitive, direct detection of human HIV and hepatitis viruses. Nucleic Acids Symp. Ser., 1991, 24, 197-200).

[0022]Um outro método para a detecção e classificação de bactérias é a amplificação de seqüências ribossomais 16S. A seqüência 16S rRNA foi relatada como sendo um alvo adequado para uso em ensaios de amplificação PCR para a detecção de espécies bacteriais numa variedade de amostras clínicas ou ambientais e tem sido freqüentemente usada para identificar vários microorganismos específicos porque os genes 16S rRNA mostram polimorfismos específicos das espécies (Cloud, J.L., Neal, H., Rosenberry, R., Turenne, C.Y., Jama, M., Hillyard, D.R. e Carroll, K.C., 2002, J. Clin. Microbiol., 40, 400-406). Entretanto, a cultura pura de bactérias é exigida e depois da amplificação PCR a amostra ainda deve ser seqüenciada ou hibridizada em um dispositivo do tipo microarranjo para determinar as espécies (Fukushima, M., Kakinuma, K., Hayashi, H., Nagai, H., Ito, K., Kawaguchi, R., J. Clin. Microbiol., 2003 Jun, 41(6), 2605-15). Tais métodos são caros, demorados e de trabalho intensivo.

[0023]Os inventores desenvolveram novos métodos para detectar microorganismos que podem ser adaptados para a detecção geral ou para ensaios de classificação inicial para quaisquer espécies microbiais.

[0024]Num aspecto geral, o presente invento se refere a reduzir a complexidade da composição de base de um genoma microbial ou ácido nucléico tratando o ácido nucléico microbial com um agente que modifica a citosina e amplificar o ácido nucléico tratado para produzir uma forma simplificada do genoma ou ácido nucléico.

[0025]Em um primeiro aspecto, o presente invento provê um método para a simplificação de um genoma microbial ou de um ácido nucléico microbial, compreendendo: - tratar o genoma microbial ou ácido nucléico com um agente que modifica a citosina para formar um ácido nucléico microbial derivado; e - amplificar o ácido nucléico microbial derivado para produzir uma forma simplificada do genoma microbial ou ácido nucléico.

[0026]Num segundo aspecto, o presente invento provê um método para produzir uma molécula específica de ácido nucléico microbial, compreendendo: - tratar uma amostra contendo DNA microbial com um agente que modifica citosina para formar um ácido nucléico microbial derivado; e - amplificar pelo menos parte do ácido nucléico microbial derivado para formar uma molécula de ácido nucléico simplificada tendo um número total reduzido de citosinas em comparação com o ácido nucléico microbial não tratado, em que a molécula de ácido nucléico simplificada inclui uma seqüência de ácidos nucléicos específica para um microorganismo ou para um tipo de microorganismo.

[0027]Num terceiro aspecto, o presente invento provê um método para produzir uma molécula específica de ácido nucléico microbial compreendendo: - obter uma seqüência de DNA de um microorganismo; - formar uma forma simplificada da seqüência de DNA microbial executando uma conversão da seqüência de DNA microbial pela alteração de cada citosina em timina para que a forma simplificada do DNA microbial compreenda substancialmente as bases adenina, guanina e timina; e - escolher uma molécula específica de ácido nucléico microbial a partir da forma simplificada do DNA microbial.

[0028]Num quarto aspecto, o presente invento provê uma molécula específica de ácido nucléico microbial obtida pelo método de acordo com o terceiro aspecto do presente invento.

[0029]Num quinto aspecto, o presente invento provê o uso do método de acordo com o terceiro aspecto do presente invento para obter sondas ou iniciadores para ligar ou amplificar a molécula específica de ácido nucléico microbial num teste ou ensaio.

[0030]Num sexto aspecto, o presente invento provê sondas ou iniciadores obtidos pelo quinto aspecto do presente invento.

[0031]Num sétimo aspecto, o presente invento provê um método para detectar a presença de um microorganismo numa amostra, compreendendo: - obter o DNA microbial de uma amostra suspeita de conter o microorganismo; - tratar o ácido nucléico microbial com um agente que modifica citosina para formar um ácido nucléico microbial derivado; - prover iniciadores capazes de permitir a amplificação da molécula específica de ácido nucléico microbial para o ácido nucléico microbial derivado; - executar uma reação de amplificação no ácido nucléico microbial derivado para formar um ácido nucléico simplificado; e - ensaiar para a presença de um produto ácido nucléico amplificado contendo a molécula específica de ácido nucléico microbial específica, em que a detecção da molécula específica de ácido nucléico microbial é indicativa da presença do microorganismo na amostra.

[0032]Se o genoma ou ácido nucléico microbial for o DNA, ele pode ser tratado para formar um DNA derivado que é então amplificado para formar uma forma simplificada de DNA.

[0033]Se o genoma ou ácido nucléico microbial for RNA ele pode ser convertido em DNA antes de tratar o genoma microbial ou ácido nucléico. Alternativamente, o RNA microbial pode ser tratado para produzir uma molécula derivada de RNA que é então convertida numa molécula derivada de DNA antes da amplificação. Os métodos de conversão de RNA em DNA são bem conhecidos e incluem o uso de transcriptase reversa para formar um cDNA.

[0034]O genoma microbial ou ácido nucléico pode ser obtido a partir de fagos, vírus, viróides, bactérias, fungos, algas, protozoários, espiroquetas ou organismos unicelulares.

[0035]O genoma microbial ou ácido nucléico pode ser escolhido dentre um ácido nucléico codificador de proteína, ácido nucléico codificador de não proteína, regiões de genes ribossomais de microorganismos procariontes ou eucarióticos unicelulares. Preferencialmente, as regiões de genes ribossomais são 16S ou 23S em procariontes e 18S e 28S no caso de microorganismos eucarióticos unicelulares. O agente pode ser escolhido dentre bissulfito, acetato ou citrato. Preferencialmente, o agente é bissulfito de sódio.

[0036]Preferencialmente, o agente modifica uma citosina em uma uracila em cada fita do DNA genômico microbial complementar de duas fitas, formando duas moléculas de ácido nucléico derivadas mas não complementares. Numa forma preferida, a citosina é não metilada como é tipicamente encontrado num ácido nucléico.

[0037]Preferencialmente, o ácido nucléico microbial derivado tem um número total reduzido de citosinas em comparação com o genoma microbial não tratado ou ácido nucléico.

[0038]Preferencialmente, a forma simplificada do genoma microbial ou ácido nucléico tem um número total reduzido de citosinas em comparação com o genoma microbial não tratado ou ácido nucléico correspondentes.

[0039]Numa forma preferida, o ácido nucléico microbial derivado contém substancialmente as bases adenina (A), guanina (G), timina (T) e uracila (U) e têm substancialmente o mesmo número total de bases do genoma microbial não tratado ou ácido nucléico correspondentes.

[0040]Numa outra forma preferida, a forma simplificada do genoma microbial ou do ácido nucléico compreende substancialmente as bases adenina (A), guanina (G) e timina (T).

[0041]Preferencialmente, a amplificação é executada por quaisquer meios adequados tais como reação em cadeia de polimerase (PCR), amplificação isotérmica ou amplificação de sinal.

[0042]O método de acordo com o segundo aspecto do presente invento pode adicionalmente compreender: - detectar a molécula específica de ácido nucléico microbial.

[0043]Numa forma preferida, a molécula específica de ácido nucléico microbial é detectada ao: - prover um ligante detector capaz de se ligar a uma região alvo na molécula específica de ácido nucléico microbial e permitir um tempo suficiente para que o ligante detector ligue-se à região alvo; e - medir a ligação do ligante detector à região alvo para detectar a presença da molécula específica de ácido nucléico microbial.

[0044]Numa outra forma preferida de realização, a molécula específica de ácido nucléico microbial é detectada separando-se um produto de amplificação e visualizando o produto separado. Preferencialmente, o produto de amplificação é separado por eletroforese e é detectado pela visualização de uma ou mais bandas sobre um gel.

[0045]Preferencialmente, a molécula específica de ácido nucléico microbial não ocorre naturalmente no microorganismo.

[0046]Numa forma preferida, a molécula específica de ácido nucléico microbial tem uma seqüência de ácidos nucléicos indicativa de um nível taxonômico do microorganismo. O nível taxonômico do microorganismo inclui, mas não se limita a, família, gênero, espécie, cepa, tipo ou a diferentes populações a partir das mesmas ou diferentes populações geográficas ou bentônicas.

[0047]Numa forma preferida do método de acordo com o terceiro aspecto do presente invento, as formas simplificadas de duas ou mais seqüências de DNA microbial são obtidas e as duas ou mais seqüências são comparadas para obter pelo menos uma molécula específica de ácido nucléico microbial.

[0048]Numa forma preferida do sétimo aspecto do presente invento, as moléculas de ácido nucléico são detectadas ao: - prover um ligante detector capaz de se ligar a uma região da molécula de ácido nucléico e permitir tempo suficiente para o ligante detector ligar-se à região; e - medir a ligação do ligante detector à molécula de ácido nucléico para detectar a presença da molécula de ácido nucléico.

[0049]Numa outra forma preferida, as moléculas de ácido nucléico são detectadas pela separação de um produto de amplificação e visualização do produto separado.

[0050]Em situações em que o microorganismo não tem um genoma DNA ou o genoma microbial ou ácido nucléico é RNA, por exemplo um RNA vírus, o genoma viral RNA pode ser primeiro convertido em cDNA a fim de tratar o DNA com o agente. O RNA também pode ser tratado e o RNA derivado é convertido em DNA antes da amplificação.

[0051]Preferencialmente, o ácido nucléico derivado substancialmente contém as bases adenina (A), guanina (G), timina (T) e uracila (U) e tem substancialmente o mesmo número total de bases do ácido nucléico microbial não modificado correspondente. Importante, a molécula de ácido nucléico derivada não contém citosina (C), com a condição de que o DNA microbial não foi metilado em qualquer citosina.

[0052]Preferencialmente, o ácido nucléico derivado amplificado substancialmente contém as bases A, T e G e tem substancialmente o mesmo número total de bases do ácido nucléico derivado correspondente (um ácido nucléico microbial não modificado). O ácido nucléico derivado amplificado é chamado de ácido nucléico simplificado.

[0053]Numa forma preferida, a molécula específica de ácido nucléico microbial tem uma seqüência de ácidos nucléicos indicativa do nível taxonômico do microorganismo. O nível taxonômico do microorganismo inclui família, gênero, espécie, cepa, tipo, ou diferentes populações a partir das mesmas ou diferentes populações geográficas ou bentônicas. No caso de bactérias, pode-se adotar o esquema geralmente reconhecido, tal como Bactéria, Proteobacteria, Betaproteobacteria, Neisseriales, Neisseriaceae, Neisseria. As populações diferentes podem ser polimórficas para alterações únicas de nucleotídeos ou variação que existe em moléculas de DNA que existem numa forma intracelular dentro de um microorganismo (plasmídeos ou fagomídeos) ou regiões cromossomais polimórficas de genomas de microorganismos tais como ilhas de patogenicidade.

[0054]O presente invento também pode ser usado para reconhecer a fluidez de genomas microbiais e virais, e pode ser usado para reconhecer a natureza quimérica de genomas virais, que podem estar em pedaços independentes, e portanto cepas recém surgidas surgem da reclassificação de regiões genômicas de diferentes animais, por exemplo novas cepas de influenza humano como quimeras de segmentos que são recolhidos de outros genomas virais de mamíferos ou de aves.

[0055]Será apreciado que o método possa ser executado in silico a partir de seqüências conhecidas de ácidos nucléicos de microorganismos em que uma ou mais citosinas nas seqüências originais é convertida em timina para obter o ácido nucléico simplificado. A identidade da seqüência pode ser determinada a partir das seqüências convertidas. Tal método in silico imita as etapas de tratamento e de amplificação.

[0056]Quando uma molécula específica de ácido nucléico microbial tiver sido obtida para qualquer dado microorganismo por este método, podem ser projetadas sondas ou iniciadores para garantir a amplificação da região de interesse numa reação de amplificação. Assim, quando as sondas ou iniciadores tiverem sido projetados, será possível executar ensaios clínicos ou científicos nas amostras para detectar um dado microorganismo num dado nível taxonômico.

[0057]A molécula específica de ácido nucléico microbial pode ser única ou ter um alto grau de similaridade com um nível taxonômico. Uma vantagem do presente invento é a capacidade de simplificar bastante as diferenças básicas potenciais entre, ou dentre, níveis taxonômicos, por exemplo, de um microorganismo a uma molécula única ou moléculas que tem similaridade de seqüência próxima. Os iniciadores específicos ou o número reduzido de iniciadores de degeneração podem ser usados para amplificar a molécula específica de ácido nucléico microbial numa dada amostra.

[0058]Para DNA de fita dupla que contém citosinas, a etapa de tratamento resulta em dois ácidos nucléicos derivados (um para cada fita complementar), cada qual contendo as bases adenina, guanina, timina e uracila. Os dois ácidos nucléicos derivados são produzidos têm preferencialmente nenhuma citosina mas ainda tem o mesmo número total de bases e comprimento de seqüência da molécula de DNA original não tratada. De modo importante, os dois ácidos nucléicos derivados não são complementares um ao outro para formar um gabarito de topo e fundo para amplificação. Uma ou mais das fitas pode ser usada como alvo para amplificação para produzir a molécula de ácido nucléico simplificada. Durante a amplificação dos ácidos nucléicos derivados, as uracilas na fita de topo (ou na fita de fundo) são substituídas por timinas na forma simplificada amplificada correspondente do ácido nucléico. Enquanto a amplificação continua, a fita de topo (e/ou de fundo se amplificada) será diluída enquanto cada nova fita complementar terá apenas bases adenina, guanina, timina.

[0059]Será apreciado que este aspecto do presente invento também inclui moléculas de ácido nucléico tendo seqüências complementares à molécula específica de ácido nucléico microbial, e moléculas de ácido nucléico que podem hibridizar, preferencialmente sob condições limitadas, na molécula específica de ácido nucléico microbial.

[0060]O presente invento pode usar sondas ou iniciadores que são indicativos de tipos representativos de microorganismos que podem ser usados para determinar se qualquer microorganismo está presente numa dada amostra. Sondas específicas de tipos microbiais adicionais podem ser usadas para realmente detectar ou identificar um dado exemplo de tipo, subtipo, variante e genótipo de microorganismo.

[0061]Quando uma molécula específica de ácido nucléico microbial tiver sido obtida ou identificada para qualquer dado microorganismo, sondas ou iniciadores podem ser projetados para garantir a amplificação da região de interesse numa reação de amplificação. É importante notar que ambas as fitas de um genoma tratado e assim convertido (denominado a seguir "ácido nucléico derivado") podem ser analisadas para projeto de iniciador, uma vez que o tratamento ou conversão leva a assimetrias de seqüência, e portanto são exigidas diferentes seqüências de iniciador para a detecção das fitas de topo e de fundo do mesmo lócus (também conhecidas como fitas "Watson" e "Crick"). Assim, há duas populações de moléculas, o genoma convertido como existe imediatamente após a conversão, e a população de moléculas que resulta após o ácido nucléico derivado ser replicado por meios enzimológicos convencionais (PCR) ou por métodos tais como amplificação isotérmica. Os iniciadores são tipicamente projetados para a fita de topo por conveniência, mas os iniciadores também podem ser gerados para a fita de fundo. Assim, será possível executar ensaios clínicos ou científicos nas amostras para detectar um dado microorganismo.

[0062]Os iniciadores ou sondas podem ser projetados para permitir que regiões específicas de ácidos nucléicos derivados sejam amplificadas. Numa forma preferida, os iniciadores causam a amplificação da molécula específica de ácido nucléico microbial.

[0063]Num sétimo aspecto, o presente invento provê um kit para detectar uma molécula específica de ácido nucléico microbial compreendendo iniciadores ou sondas de acordo com o quinto aspecto do presente invento juntamente com um ou mais reagentes ou componentes para uma reação de amplificação.

[0064]Preferencialmente, o microorganismo é escolhido dentre fagos, vírus, viróides, bactérias, fungos, algas, protozoários, espiroquetas, organismos unicelulares ou quaisquer outros microorganismos, não importando como são classificados, tal como o Kingdom Protoctista by Margulis, L., et al., 1990, Handbook of Protoctista, Jones and Bartlett, Publishers, Boston - USA, ou os microorganismos que estão associados aos humanos, como definido em Harrisons Principles of Internal Medicine, 12th Edition, editado por J D Wilson et al., McGraw Hill Inc., bem como as edições posteriores. Ele também inclui todos os microorganismos descritos em associação com as condições humanas definidas em OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man, www.ncbi.gov.

[0065]O microorganismo pode ser um patógeno, um organismo de uma amostra ambiental de ocorrência natural, transportado pela água ou pelo ar (ou um organismo que existe ou é transportado em um meio líquido ou gasoso), na forma madura ou de esporos, extra ou intracelularmente, ou associado com uma forma de vida quimérica, ou existindo ectocomensalmente entre duas ou mais formas de vida, tal como um micróbio associado com um líquen ou um micróbio associado com um filme bacterial.

[0066]É possível testar a presença de vírus RNA ou viróides convertendo-se primeiro seu genoma RNA em um cDNA via transcrição reversa e então modificando o cDNA pelo reagente. Isto supera o problema de qualquer metilação existente nas citosinas em vírus RNA, pois a transcriptase reversa irá copiá-las como se fossem citosinas regulares.

[0067]Preferencialmente, o agente modifica a citosina não metilada em uracila que é então substituída como uma timina durante a amplificação do ácido nucléico derivado. Preferencialmente, o agente usado para modificar citosina é bissulfito de sódio. Também podem ser usados no método objeto do presente invento outros agentes que modificam similarmente a citosina não metilada, mas não a citosina metilada. Exemplos incluem, mas não se limitam a, bissulfito, acetato ou citrato.

[0068]Preferencialmente, o agente é bissulfito de sódio, um reagente que em presença de água modifica citosina em uracila.

[0069]O bissulfito de sódio (NaHSO3) reage prontamente com a dupla ligação 5,6 da citosina para formar um intermediário de reação citosina sulfonada que é suscetível a desaminação, e na presença de água origina um sulfito de uracila. Se necessário, o grupo sulfito pode ser removido sob condições de branda alcalinidade, resultando na formação da uracila. Assim, potencialmente todas as citosinas serão convertidas em uracilas. Quaisquer citosinas metiladas, entretanto, não podem ser convertidas pelo reagente modificador devido à proteção pela metilação.

[0070]O presente invento pode ser adaptado para auxiliar a contornar alguns dos problemas emergentes revelados pela enorme variação genômica inesperada entre isolados das mesmas espécies bacteriais (2005, Tettelin, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 102, 13950-13955; Genome analysis of multiple pathogenic isolates of Streptococcus agalacticiae: implications for the microbial "pangenome"). Todos os isolados destas espécies bacteriais tinham um genoma "central" de genes codificadores de proteínas que representa aproximadamente 80% do total de genes, mais um genoma dispensável consistindo de genes codificadores de proteínas parcialmente compartilhados e específicos de cepas. Tratando os genes 23S presentes dentro de uma população bacterial pelos métodos de acordo com o presente invento, os inventores podem lidar com um componente codificador de não proteínas central que está presente em todos os isolados bacteriais.

[0071]O presente invento é adequado para ensaios clínicos, ambientais, forenses, de guerra biológica ou científicos para microorganismos em que a identidade inicial acima ou em nível de espécies é útil, a fim de primeiro determinar o grupo geral ao qual pertence o organismo. Os exemplos incluem, mas não se limitam a, diagnose de doença em qualquer organismo (seja ele vertebrado, invertebrado, procariótico ou eucariótico, p.ex., doenças de plantas e animais domésticos, doenças de fontes alimentares humanas tais como fazendas de peixes e fazendas de ostras), classificação ou amostragem de fontes ambientais sejam elas naturais ou contaminadas, determinação de contaminação de culturas celulares ou de ovos fertilizados in vitro para produção de blastócitos humanos em clínicas de fertilização in vitro ou para criação de animais. A detecção de microorganismos em configurações forenses ou em contextos de guerra biológica é de particular importância.

[0072]Por toda a presente descrição, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreende", ou suas variações tais como "compreendem" ou "compreendendo", devem ser entendidas para implicar a inclusão de um elemento mencionado, inteiro ou parte, ou grupo de elementos, inteiros ou partes, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou parte, ou grupo de elementos, inteiros ou partes.

[0073]Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que tenham sido incluídos na presente descrição é meramente para fins de prover um contexto para o presente invento. Ela não deve ser tomada como uma admissão de que qualquer uma destas ou todas estas matérias formam parte do estado da técnica de base ou eram de conhecimento geral comum no campo relevante ao presente invento como existia na Austrália antes do desenvolvimento do presente invento.

[0074]A fim de que o presente invento seja mais claramente compreendido, serão descritas formas preferidas de realização com referência aos seguintes desenhos e exemplos.

[0075]A fig. 1 mostra o alinhamento de parte do gene iga de Neisseria meningitidis e Neisseria gonorrhoeae antes e depois da simplificação genômica. Como pode ser visto, antes da simplificação genômica, um total de 512 combinações de sondas seria necessário para a detecção universal de espécies Neisseria (similaridade de seqüência de 74%) comparadas com apenas 2 combinações após a simplificação para formar um ácido nucléico derivado (similaridade de seqüência de 97%) (os números de SEQ ID são listados após cada seqüência).

[0076]A fig. 2 mostra o uso de sondas INA para aumentar ainda mais a similaridade de seqüência das seqüências simplificadas, uma vez que as sondas INA podem ser de tamanho mais curto que o das sondas oligonucleotídeo padrão. A combinação do procedimento de simplificação genômica com as sondas INA permite a seleção e uso de sondas com similaridade de seqüência de 100% com a seqüência alvo (os números de SEQ ID são listados após cada seqüência).

[0077]A fig. 3 mostra a simplificação genômica para diferenciar entre espécies próximas usando alinhamentos do gene iga de Neisseria e Haemophilus. Como pode ser visto, o método de acordo com o presente invento permite a simplificação do material genômico a fim de produzir sondas específicas para as espécies. Em adição, embora simplificando o DNA genômico, ele ainda permite a diferenciação entre Neisseria e as espécies próximas Haemophilus (os números de SEQ ID são listados após cada seqüência).

[0078]A fig. 4 mostra o alinhamento do gene tuf de estreptococos antes e depois da simplificação genômica em 10 espécies diferentes de estreptococos. Antes do tratamento, seria necessária uma combinação de 12288 sondas para a iniciação universal do gene tuf. Após a simplificação genômica, seria necessário só 64 combinações de sondas para a detecção universal. Em adição, a similaridade de seqüência antes da simplificação é de apenas 67,5% que aumenta para 85% após a simplificação (os números de SEQ ID são listados após cada seqüência).

[0079]A fig. 5 mostra o alinhamento dos genes da enterotoxina de estafilococos antes e depois da simplificação genômica. Antes do tratamento com bissulfito, seria necessário um total de 1536 combinações de sondas para a iniciação universal do gene da enterotoxina de estafilococos. Após a simplificação genômica, seria necessário só 64 combinações de sondas para a detecção universal (os números de SEQ ID são listados após cada seqüência).

[0080]A fig. 6 mostra o alinhamento do gene neuraminidase de grupos A e B de várias cepas de Influenza antes e depois da simplificação genômica. Antes do tratamento, seria necessário um total de 2048 combinações de sondas para a iniciação universal do gene neuraminidase de grupos A e B. Após a simplificação genômica, seria necessário só 48 combinações de sondas para a detecção universal. Em adição, a similaridade de seqüência antes da simplificação é de apenas 50%, que aumenta para 75% após a simplificação (os números de SEQ ID são listados após cada seqüência).

[0081]A fig. 7 mostra o alinhamento do gene VP4 de Rotavirus antes e depois da simplificação genômica. Antes do tratamento, seria necessário um total de 512 combinações de sondas para a iniciação universal do gene VP4 do Rotavirus. Após a simplificação, seria necessário só 32 combinações de sondas para a detecção universal (os números de SEQ ID são listados após cada seqüência).

[0082]A fig. 8 mostra os produtos de amplificação obtidos por PCR a partir das regiões do gene ribossomal 23S genomicamente simplificado de bactérias Gram positivas e Gram negativas, com os amplicons apropriados sendo detectados como bandas de comprimento específicos por eletroforese em agarose gel. A seta indica o tamanho esperado dos amplicons com relação aos marcadores de tamanho padrão obtidos na trilha marcadora (M). O uso de iniciadores específicos para bactérias Gram negativas revela bandas somente nas seis trilhas Gram negativas (painel superior). O uso de iniciadores específicos para bactérias Gram positivas revela bandas somente nas seis trilhas Gram positivas (painel inferior).

[0083]A fig. 9 mostra os produtos de amplificação obtidos por PCR a partir das regiões do gene ribossomal 23S genomicamente simplificado de E. coli (trilha 1) e K. penumoniae (trilha 3). A especificidade da amplificação é ilustrada pela ausência de produtos de amplificação das 10 espécies remanescentes de bactérias.

[0084]A fig. 10 mostra o produto de amplificação obtido por PCR a partir das regiões do gene ribossomal 23S genomicamente simplificado usando iniciadores específicos para Neisseria.

[0085]A fig. 11 mostra o produto de amplificação obtido por PCR a partir de um gene codificador de proteína a partir da região genomicamente simplificada do gene recA de E. coli. A especificidade do amplicon é ilustrada pela presença do amplicon recA de E. coli e de sua ausência a partir das outras 11 espécies de bactéria.

[0086]A fig. 12 mostra os produtos de amplificação obtidos por PCR a partir das regiões de gene ribossomal 23S genomicamente simplificadas usando iniciadores específicos para estafilococos.

[0087]A fig. 13 mostra os produtos de amplificação obtidos por PCR a partir das regiões de gene ribossomal 23S genomicamente simplificadas usando iniciadores específicos para estreptococos.

[0088]A fig. 14 mostra os produtos de amplificação obtidos por PCR a partir de um gene codificador de proteína a partir da região genomicamente simplificada do gene recA de Staphylococcus epidermidis. As duas bandas (com setas) representam amplicons de transferência da primeira rodada (banda superior) e segunda rodada (banda inferior) de amplificações PCR.

[0089]A fig. 15 mostra a detecção de amplicons usando iniciadores específicos com alvo nos genes ribossomais 23S genomicamente simplificados de Chlamydia trachomatis.

[0090]A fig. 16 mostra seqüências de seqüências rDNA 23S normais e genomicamente simplificadas de Staphylococcus epidermidis (o número de SEQ ID é listado após cada seqüência).

[0091]A fig. 17 mostra seqüências genomicas e genomicamente simplificadas do gene recA de E. coli (o número de SEQ ID é listado após cada seqüência).

Modos de execução do presente invento Definições

[0092]A expressão "simplificação genômica" como usada aqui significa que o ácido nucléico genômico (ou outro) é modificado a partir de ser compreendido de quatro bases adenina (A), guanina (G), timina (T) e citosina (C) para conter substancialmente as bases adenina (A), guanina (G), timina (T) mas ainda tendo substancialmente o mesmo número total de bases.

[0093]A expressão "ácido nucléico derivado" como usada aqui significa um ácido nucléico que contenha substancialmente as bases A, G, T e U (ou alguma outra base não-A, G ou T ou entidade similar a base) e tenha substancialmente o mesmo número total de bases do ácido nucléico microbial não modificado correspondente. Substancialmente todas as citosinas do DNA microbial foram convertidas em uracila durante o tratamento com o agente. Será apreciado que as citosinas alteradas, tais como por metilação, não sejam necessariamente convertidas em uracila (ou alguma outra base não-A, G ou T ou entidade similar a base). Como o ácido nucléico microbial tipicamente não contém citosina metilada (ou outras alterações em citosinas) a etapa tratada converte preferencialmente todas as citosinas. Preferencialmente, a citosina é modificada em uracila.

[0094]A expressão "ácido nucléico simplificado" como usada aqui significa o produto ácido nucléico resultante obtido após amplificar o ácido nucléico derivado. A uracila no ácido nucléico derivado é então substituída como uma timina (T) durante a amplificação do ácido nucléico derivado para formar a molécula de ácido nucléico simplificada. O produto resultante tem substancialmente o mesmo número de bases totais do ácido nucléico microbial não modificado correspondente, mas é substancialmente composto de uma combinação de três bases (A, G e T).

[0095]A expressão "seqüência simplificada" como usada aqui significa a seqüência de ácido nucléico resultante obtida após amplificar o ácido nucléico derivado para formar um ácido nucléico simplificado. A seqüência simplificada resultante tem substancialmente o mesmo número de bases totais da seqüência de ácido nucléico microbial não modificada mas é substancialmente composta de uma combinação de três bases (A, G e T).

[0096]A expressão "seqüência não convertida" como usada aqui significa a seqüência de ácido nucléico do ácido nucléico microbial antes do tratamento e amplificação. Uma seqüência não convertida tipicamente é a seqüência do ácido nucléico microbial que ocorre naturalmente.

[0097]O termo "modifica" como usado aqui significa a conversão de uma citosina em um outro nucleotídeo. Preferencialmente, o agente modifica a citosina não metilada em uracila para formar um ácido nucléico derivado.

[0098]A expressão "agente que modifica citosina" como usada aqui significa um agente que é capaz de converter a citosina em uma outra entidade química. Preferencialmente, o agente modifica citosina em uracila que é então substituída por timina durante a amplificação do ácido nucléico derivado. Preferencialmente, o agente usado para modificar citosina é bissulfito de sódio. Também podem ser usados no método do presente invento outros agentes que similarmente modificam citosina mas não citosina metilada. Os exemplos incluem, mas não se limitam a, bissulfito, acetato ou citrato. Preferencialmente, o agente é bissulfito de sódio, um reagente que na presença de condições aquosas acídicas, modifica citosina em uracila. O bissulfito de sódio (NaHSO3) reage prontamente com a dupla ligação 5,6 da citosina para formar um intermediário de reação citosina sulfonada que é suscetível a desaminação, e na presença de água origina um sulfito de uracila. Se necessário, o grupo sulfito pode ser removido sob condições alcalinas brandas, resultando na formação de uracila. Assim, potencialmente todas as citosinas serão convertidas em uracilas. Quaisquer citosinas metiladas, entretanto, não podem ser convertidas pelo reagente modificador devido à proteção por metilação. Será apreciado que a citosina (ou qualquer outra base) poderia ser modificada por meios enzimáticos para alcançar um ácido nucléico derivado como ensinado pelo presente invento.

[0099]Há dois métodos genéricos amplos pelos quais as bases em ácidos nucléicos podem ser modificadas: químico e enzimático. Assim, a modificação para o presente invento também pode ser executada por enzimas de ocorrência natural, ou por enzimas artificialmente construídas a relatar ou por enzimas selecionadas. O tratamento químico, tal como a metodologia por bissulfito, pode converter citosina em uracila via etapas químicas apropriadas. Similarmente, as deaminases de citosina, por exemplo, podem executar uma conversão para formar um ácido nucléico derivado. O primeiro relato de deaminases de citosina de nosso conhecimento é o de 1932, Schmidt, G., Z. physiol. Chem., 208, 185 (vide também 1950, Wang, T.P., Sable, H.Z., Lampen, J.O., J. Biol. Chem., 184, 17-28, Enzymatic deamination of cytosines nucleosides). Neste trabalho mais recente, a deaminase de citosina não foi obtida isenta de outras núcleo-deaminases, entretanto, Wang et al. foram capazes de purificar tal atividade de levedura e E. coli. Assim, qualquer conversão enzimática de citosina para formar um ácido nucléico derivado que resulte por fim na inserção de uma base durante a próxima replicação naquela posição, que seja diferente de uma citosina, irá produzir um genoma simplificado. A conversão química e enzimática para produzir um derivado seguido de um genoma simplificado são aplicáveis em qualquer núcleo-base, seja ele purinas ou pirimidinas em ácidos nucléicos de microorganismos de ocorrência natural.

[00100] A expressão "forma simplificada do genoma ou ácido nucléico" como usada aqui significa que o genoma ou ácido nucléico, seja de ocorrência natural ou sintético, que usualmente contém as quatro bases comuns G, A, T e C, agora consistem em grande parte de somente três bases, G, A e T uma vez que a maioria dos Cs no genoma foi convertida em Ts pelos procedimentos de modificação química apropriada e subseqüente amplificação. A forma simplificada do genoma significa que a complexidade genômica relativa é reduzida de uma fundação de quatro bases para uma composição de três bases.

[00101] A expressão "entidade similar a base" como usada aqui significa uma entidade que é formada por modificação de uma citosina. Uma entidade similar a base pode ser reconhecida por uma polimerase DNA durante a amplificação de um ácido nucléico derivado e a polimerase leva um A, G ou T a ser posto na fita de DNA complementar recém-formada na posição oposta à da entidade similar a base no ácido nucléico derivado. Tipicamente, a entidade similar a base é uracila que foi modificada a partir de citosina no ácido nucléico microbial não tratado. Exemplos de entidades similares a base, incluem qualquer núcleo-base, seja ela purina ou pirimidina.

[00102] A expressão "redução da complexidade relativa" como usada aqui se refere ao comprimento da sonda, a saber o aumento no comprimento médio da sonda que é necessário para alcançar a mesma especificidade e nível de hibridização de uma sonda para um lócus específico, sob um dado conjunto de condições moleculares em dois genomas do mesmo tamanho, em que o primeiro genoma é "como tal" e consiste das quatro bases G, A, T e C, enquanto que o segundo genoma é de exatamente o mesmo comprimento mas algumas citosinas (idealmente todas as citosinas) foram convertidas em timinas. O lócus sob teste está na mesma localidade no genoma original não convertido bem como no genoma convertido. Na média, uma sonda de 11 meros terá um local único em que irá hibridizar perfeitamente em um genoma regular de 4194304 bases consistindo das quatro bases G, A, T e C (411 = 4194304). Entretanto, um tal genoma regular de 4194304 bases foi convertido por bissulfito ou por outros meios adequados, este genoma convertido é agora composto de apenas três bases e é claramente menos complexo. Entretanto, a conseqüência desta diminuição da complexidade genômica é que a sonda previamente única de 11 meros não mais tem um único local ao qual ela pode hibridizar dentro do genoma simplificado. Há agora muitos outros locais equivalentes possíveis de seqüências de 11 bases que surgiram de novo como conseqüência da conversão por bissulfito. Agora será exigida uma sonda de 14 meros para encontrar e hibridizar com o lócus original. Embora pareça inicialmente contra-intuitivo, exige-se assim um comprimento aumentado de sonda para detectar o local original em que agora está um genoma simplificado de três bases, porque mais do genoma se parece igual (ele tem mais seqüências similares). Assim, a complexidade genômica relativa (ou simplicidade do genoma de três bases), significa que se deve projetar sondas mais longas para encontrar o local único original.

[00103] A expressão "redução da complexidade genômica relativa" como usada aqui pode ser medida pelos comprimentos aumentados de sonda capazes de serem específicas a micróbios se comparadas com o DNA não modificado. Este termo também incorpora o tipo de seqüências de sondas que são usadas na determinação da presença de um microorganismo. Estas sondas podem ter espinhas dorsais não convencionais, tais como aquelas de PNA ou LNA ou adições modificadas a uma espinha dorsal tais como aquelas descritas em INA. Assim, um genoma é considerado como tendo uma complexidade relativa reduzida, independentemente da sonda ter componentes adicionais tais como pseudonucleotídeos intercalados, tal como em INA. Os exemplos incluem, mas não se limitam a, DNA, RNA, ácido nucléico travado (LNA), ácido nucléico peptídeo (PNA), MNA, ácido nucléico altritol (ANA), ácido nucléico hexitol (HNA), ácido nucléico intercalado (INA), ácido nucléico ciclohexanila (CNA) e suas misturas e seus híbridos, bem como as suas modificações no átomo de fósforo, tais como mas não limitadas a fosforotioatos, metilfosfolatos, fosforamiditos, fosforoditiatos, fosforoselenoatos, fosfotriésteres e fosfoboranoatos. Os nucleotídeos que não ocorrem naturalmente incluem mas não se limitam aos nucleosídeos compreendidos dentre DNA, RNA, PNA, INA, HNA, MNA, ANA, LNA, CeNA, TNA, (2'-NH)-TNA, (3'-NH)-TNA, α-L-Ribo-LNA, α-L-Xilo-LNA, β-D-Xilo-LNA, α-D- RiboLNA, [3.2.1]-LNA, biciclo-DNA, 6-amino-biciclo-DNA, 5-epi-biciclo-DNA, α- biciclo-DNA, triciclo-DNA, biciclo[4.3.0]-DNA, biciclo[3.2.1]-DNA,biciclo[4.3.0]amida-DNA, β-D-ribopiranosil-NA, α-L-lixopiranosil-NA, 2'-R-RNA, α-L- RNA ou α-D-RNA, β-D-RNA. Em adição, podem ser usados compostos sem fósforo para ligar aos nucleotídeos tais como, mas não limitados a metiliminometila, formacetato, tioformacetato e grupos de ligação compreendendo amidas. Em particular, ácidos nucléicos e análogos de ácidos nucléicos podem compreender um ou mais pseudonucleotídeos intercaladores (IPN). A presença de IPN não é parte da descrição de complexidade para moléculas de ácidos nucléicos, nem a espinha dorsal é parte da complexidade, tal como em PNA.

[00104] Por "INA" entende-se um ácido nucléico intercalante de acordo com os ensinamentos dos pedidos de patente internacional WO 03/051901, WO 03/052132, WO 03/052133 e WO 03/052134 (Unest A/S), aqui incorporados por referência. Um INA é um oligonucleotídeo ou análogo de oligonucleotídeo compreendendo uma ou mais moléculas de pseudonucleotídeo intercalador (IPN).

[00105] Por "HNA" entende-se um ácido nucléico como por exemplo descrito por Van Aetschot et al., 1995.

[00106] Por "MNA" entende-se ácidos nucléicos como descrito por Hossain et al., 1998.

[00107] "ANA" se refere aos ácidos nucléicos descritos por Allert et al., 1999.

[00108] "LNA" podem ser qualquer molécula LNA como descrito no pedido de patente internacional WO 99/14226 (Exiqon), preferencialmente LNA é escolhido dentre as moléculas descritas no resumo do pedido de patente internacional WO 99/14226. Mais preferencialmente, LNA é um ácido nucléico como descrito em Singh et al., 1998, Koshkin et al., 1998 ou Obika et al., 1997."PNA" se refere a ácidos nucléicos peptídeos como por exemplo descrito por Nielsen et al., 1991.

[00109] "Redução de complexidade relativa", como usado aqui, não se refere à ordem em que as bases ocorrem, tal como qualquer diferença de complexidade matemática entre uma seqüência que seja ATATATATATATAT (SEQ ID NO: 1) versus uma de mesmo comprimento que é AAAAAAATTTTTTT (SEQ ID NO: 2), nem se refere aos dados de re-associação original de tamanhos relativos de genomas (e por inferência, complexidades genômicas), introduzidos na literatura científica por Warning, M. & Britten, R.J., 1966, Science, 154, 791-794; e Britten, R.J. e Kohne, D.E., 1968, Science, 161, 529-540, e referências mais recentes que se originam dos relatórios do Carnegie Institution of Washington Yearbook.

[00110] "Complexidade genômica relativa", como usado aqui, refere-se a uma posição inalterada de bases em dois genomas que é acessada por sondas moleculares (ambos genomas original e não convertido têm bases em posições invariantes de 1 a n. No caso dos 3 bilhões de pares de bases haplóides do genoma humano de uma fêmea humana particular, as posições invariantes são definidas como sendo de 1 a n, em que n é 3.000.000.000. Se na seqüência de 1 a n a iésima base for um C no genoma original, então a iésima base será um T no genoma convertido.

[00111] A expressão "ácido nucléico genômico", como usada aqui, inclui RNA microbial (procarionte e eucarionte unicelular), DNA, ácido nucléico codificador de proteína, ácido nucléico codificador de não-proteína, e regiões de genes ribossomais de microorganismos procariontes e eucariontes unicelulares.

[00112] A expressão "genoma microbial", como usada aqui, cobre os ácidos nucléicos cromossomais e extracromossomais, bem como residentes temporários daquele genoma, tais como plasmídeos, bacteriófagos e elementos móveis no sentido mais amplo. O "genoma" tem um componente nuclear como exemplificado por S. galactiae, bem como possivelmente tendo elementos codificadores e não- codificadores que variam entre isolados diferentes.

[00113] A expressão "DNA microbial derivado", como usada aqui, inclui DNA obtido diretamente de um microorganismo ou obtido indiretamente pela conversão do RNA microbial em DNA por qualquer um dos métodos conhecidos ou adequados tais como o da transcriptase reversa.

[00114] O termo "microorganismo", como usado aqui, inclui fagos, vírus, viróides, bactérias, fungos, algas, protozoários, espiroquetas, organismos unicelulares ou qualquer outro microorganismo, não importando como são classificados, tal como o Kingdom Protoctista por Margulis, L., et al., 1990, Handbook of Protoctista, Jones and Bartlett, Publishers, Boston, USA, ou microorganismos que são associados com humanos, como definido em Harrisons Principles of Internal Medicine, 12th Edition, editado por J. D. Wilson et al., McGraw Hill Inc., bem como edições posteriores. Ele também inclui todos os microorganismos descritos em associação com as condições humanas definidas em OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man, www.ncbi.gov.

[00115] A expressão "molécula específica de ácido nucléico microbial", como usada aqui, significa uma molécula que tenha sido determinada ou obtida usando o método de acordo com o presente invento que tenha uma ou mais seqüências específicas a um microorganismo.A expressão "nível taxonômico do microorganismo", como usada aqui, inclui família, gênero, espécie, cepa, tipo ou populações diferentes da mesma ou de diferentes populações geográficas ou bênticas. Enquanto no caso de bactérias, é usado o esquema geralmente reconhecido: Bactéria, Proteobactéria; Betaproteobactéria; Neisseriales; Neisseriaceae; Neisseria. As populações diferentes podem ser polimórficas para alterações de um único nucleotídeo ou variação que existe nas moléculas de DNA que existem numa forma intracelular dentro de um microorganismo (plasmídeos ou fagomídeos), ou regiões cromossomais polimórficas de genomas de microorganismos tais como ilhas de patogenicidade. É reconhecida a fluidez dos genomas microbial e viral, e inclui a natureza quimérica dos genomas virais, que podem estar em peças independentes de ácidos nucléicos. Portanto, cepas recém surgidas da reordenação de regiões genômicas de animais diferentes, p.ex., novas cepas de influenza humano como quimeras de segmentos que são obtidos de outros genomas virais mamíferos ou de aves.

[00116] A expressão "similaridade de seqüência próxima", como usada aqui, inclui a definição acima de complexidade de seqüência relativa e comprimentos de sonda como medida.

MATERIAIS e MÉTODOS Extração de DNA

[00117] Em geral, o DNA microbial (ou RNA viral) pode ser obtido de qualquer fonte adequada. Os exemplos incluem, mas não se limitam a, culturas celulares, culturas de caldo, amostras ambientais, amostras clínicas, fluidos corporais, amostras líquidas, amostras sólidas tais como um tecido. O DNA microbial das amostras pode ser obtido de acordo com os procedimentos padronizados. Um exemplo de uma extração adequada é como segue. A amostra de interesse é posta em 400 μL de hidrocloreto de guanidínio 7M, 5 mM de EDTA, 100 mM de Tris/HCL pH 6,4, 1% Triton-X-100, 50 mM e proteinase K (Sigma), 100 μg/mL de tRNA de levedura. A amostra é homogeneizada a fundo com um pilão descartável de 1,5 mL e deixada por 48 horas a 60oC. Após a incubação, a amostra é submetida a cinco ciclos de congelamento/degelo de gelo seco por 5 minutos/95oC por 5 minutos. A amostra é então turbilhonada e dilatada em uma microcentrífuga por 2 minutos para peletizar os fragmentos celulares. O sobrenadante é removido para um tubo limpo, diluído para reduzir a concentração de sal e então extraído com fenol:clorofórmio, precipitado com etanol e resuspenso em 50 μL de 10 mM Tris/0,1 mM EDTA.

[00118] Especificamente, as extrações de DNA de bactérias Gram positivas e Gram negativas crescidas em placas de ágar padrão (com as exigências nutricionais específicas a cada espécie) foram realizadas como segue.

[00119] Para a extração de DNA a partir de bactérias Gram negativas, o protocolo foi como segue: a) usando um palito de dentes esterilizado, as colônias bacteriais foram raspadas da placa de cultura para um tubo de centrífuga esterilizado de 1,5 mL. b) 180 μL de tampão de extração tiocianato de guanidínio (7M de tiocianato de guanidínio, 5 mM de EDTA pH 8,0, 40 mM de Tris/HCl pH 7,6, 1% Triton-X- 100) foram adicionados e a amostra foi misturada para re-suspender as colônias bacteriais. c) 20 μL (20 mg/mL) de Proteinase K foram adicionados e as amostras foram bem misturadas. d) as amostras foram incubadas a 55oC por 3 horas para causar a lise das células. e) 200 μL de água foram adicionados a cada amostra e as amostras foram misturadas por pipetagem sutil. f) 400 μL de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) foram adicionados e as amostras foram turbilhonadas por 2 x 15 segundos. g) as amostras foram então dilatadas em uma microcentrífuga a 14000 rpm por 4 minutos. h) a fase aquosa foi removida para um tubo limpo de centrífuga de 1,5 mL. i) 400 μL de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) foram adicionados e as amostras foram turbilhonadas por 2 x 15 segundos. j) as amostras foram então dilatadas em uma microcentrífuga a 14000 rpm por 4 minutos. k) a fase aquosa foi removida para um tubo limpo de centrífuga de 1,5 mL. l) 800 μL de etanol 100% foram adicionados a cada amostra, a amostra foi brevemente turbilhonada e então deixada a -20oC por 1 hora. m) as amostras foram dilatadas numa microcentrífuga a 14000 rpm por 4 minutos a 4oC. n) os péletes de DNA foram lavados com 500 μL de etanol 70%. o) as amostras foram dilatadas numa microcentrífuga a 14000 rpm por 5 minutos a 4oC, o etanol foi descartado e os péletes foram secados ao ar por 5 minutos. p) finalmente o DNA foi re-suspenso em 100 μL de 10 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0. q) a concentração do DNA e a pureza foram calculados medindo-se a absorbância da solução em 230, 260, 280 nm. Para a extração de DNA a partir de bactérias Gram positivas, o protocolo foi como segue: a) usando um palito de dentes esterilizado, as colônias bacteriais foram raspadas da placa de cultura para um tubo de centrífuga esterilizado de 1,5 mL. b) 180 μL de 20 mg/mL de Lysozyme (Sigma) e 200 μg de Lysostaphin (Sigma) foram adicionados a cada amostra e as amostras foram suavemente misturadas para re-suspender as colônias bacteriais. c) as amostras foram incubadas a 37oC por 30 minutos para degradar a parede celular. d) as amostras foram então processadas e o DNA foi extraído de acordo com o protocolo do QIAamp DNA mini-kit para bactérias Gram positivas.

[00120] Extração de DNA a partir de amostras de citologia de pacientes: a) a amostra foi agitada vigorosamente pela mão para re-suspender quaisquer células sedimentadas e para garantir a homogeneidade da solução. b) 4 mL das células re-suspensas foram transferidos para um tubo de centrífuga Costar de 15 mL. c) os tubos foram centrifugados a 3000 x g por 15 minutos. d) o sobrenadante foi cuidadosamente decantado e descartado sem perturbar o material celular peletizado. e) as células peletizadas foram re-suspensas em 200 μL de tampão de lise (100 mM Tris/HCl pH 8,0, 2 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 0,5% Triton-X-100) e bem misturados até que a solução se tornasse homogênea. f) 80 μL da amostra foram transferidos para uma placa de preparação de amostra de 96 cavidades. g) 20 μL de proteinase K foram adicionados e a solução foi incubada a 55oC por 1 hora (este procedimento resulta na lise celular).

[00121] Extração do DNA a partir de amostras de urina:

[00122] O DNA foi extraído a partir de um volume inicial de 1 mL de urina de acordo com o QIAamp UltraSensTM Vírus Handbook.

[00123] Tratamento das amostras de DNA com bissulfito:

[00124] O tratamento com bissulfito foi executado de acordo com o kit de modificação de bissulfito MethylEasyTM High Throughput DNA (Human Genetic Signatures, Austrália), vide também abaixo.

[00125] Surpreendentemente, foi descoberto pelos presentes inventores que não há necessidade de separar o DNA microbial das outras fontes de ácidos nucléicos, por exemplo quando há DNA microbial numa amostra de células humanas. A etapa de tratamento pode ser usada para uma vasta mistura de diferentes tipos de DNA e ainda pode ser identificado pelo presente invento um ácido nucléico microbial específico. Estima-se que os limites de detecção numa mistura complexa de DNA sejam aqueles da detecção padrão por PCR que podem ser baixados até uma única cópia da molécula de ácido nucléico alvo.

Amostras

[00126] Qualquer amostra adequada pode ser usada para o presente invento. Os exemplos incluem, mas não se limitam a, culturas microbiais, amostras clínicas, amostras veterinárias, fluidos biológicos, amostras de cultura de tecidos, amostras ambientais, amostras de águas, efluentes. Como o presente invento é adaptável para detectar qualquer microorganismo, esta lista não deve ser considerada como exaustiva.

Kits

[00127] O presente invento pode ser implementado na forma de vários kits, ou combinações de kits, e instanciado em termos de plataformas manuais, semi- automatizadas ou completamente robóticas. Numa forma preferida, os kits MethyEasyTM ou HighThroughput MethylEasyTM (Human Genetic Signatures Pty Ltd, Austrália) permitem a conversão de ácidos nucléicos em 96 ou 384 placas usando uma plataforma robótica tal como EpMotion.

Tratamento com bissulfito

[00128] Um exemplo de protocolo para o tratamento efetivo de ácido nucléico com bissulfito é exibido abaixo. O protocolo resulta na retenção de substancialmente todo o DNA tratado. Este método também é chamado aqui de método das assinaturas genéticas humanas (Human Genetic Signatures - HGS). Será apreciado que os volumes ou quantidades de amostra ou de reagentes podem ser variados.

[00129] O método preferido para o tratamento com bissulfito pode ser encontrado no pedido de patente US 10/428310 ou PCT/AU2004/000549, incorporados aqui por referência.

[00130] A 2 μg de DNA, que pode ser pré-digerido com enzimas de restrição adequadas se assim desejado, foram adicionados 2 μL (1/10 em volume) de NaOH 3M (6 g em 50 mL de água, recém preparada), num volume final de 20 μL. Esta etapa desnatura as moléculas de DNA de dupla fita numa forma de fita única, uma vez que o reagente bissulfito reage preferencialmente com moléculas de fita única. A mistura foi incubada a 37oC por 15 minutos. A incubação em temperaturas acima da temperatura ambiente também pode ser usada para melhorar a eficiência da desnaturação.

[00131] Após a incubação, 208 μL de metabissulfito de sódio 2 M (7,6 g em 20 mL de água com 416 mL de NaOH 10 N; BDH AnalaR #10356.4K; recém preparada) e 12 μL de quinol 10 mM (0,055 g em 50 mL de água, BDH AnalR #103122E; recém preparada) foram adicionados em sucessão.

[00132] O quinol é um agente redutor e ajuda a reduzir a oxidação dos reagentes. Outros agentes redutores também podem ser usados, por exemplo, ditiotreitol (DTT), mercaptoetanol, quinona (hidroquinona), ou outros agentes redutores adequados. A amostra foi sobreposta com 200 μL de óleo mineral. A sobreposição de óleo mineral evita a evaporação e oxidação dos reagentes, mas não é essencial. A amostra foi então incubada de um dia para o outro a 55oC.

[00133] Alternativamente, as amostras podem ser postas em ciclo térmico como segue: incubada por cerca de 4 horas ou de um dia para o outro como segue: etapa 1, 55oC / 2 h em equipamento PCR; etapa 2, 95oC / 2 min. A etapa 1 pode ser realizada em qualquer temperatura de cerca de 37oC até cerca de 90oC e pode variar em duração de 5 minutos a 8 horas. A etapa 2 pode ser realizada em qualquer temperatura de cerca de 70oC até cerca de 99oC e pode variar em duração de cerca de 1 segundo até 60 minutos, ou mais.

[00134] Após o tratamento com metabissulfito de sódio, o óleo foi removido e 1 μL de tRNA (20 mg/mL) ou 2 μL de glicogênio foram adicionados se a concentração do DNA estivesse baixa. Estes aditivos são opcionais e podem ser usados para melhorar o rendimento do DNA obtido pela co-precipitação com o DNA alvo, especialmente quando o DNA estiver presente em baixas concentrações. O uso de aditivos como suporte para precipitação mais eficiente de ácidos nucléicos é geralmente desejado quando a quantidade de ácido nucléico for < 0,5 μg.

[00135] Um tratamento de limpeza com isopropanol foi realizado como segue: 800 μL de água foram adicionados à amostra, misturados e então 1 mL de isopropanol foi adicionado. A água ou tampão reduz a concentração do sal bissulfito no vaso de reação até um nível em que o são não se precipita juntamente com o ácido nucléico alvo de interesse. A diluição é de geralmente 1/4 a 1/1000, desde que a concentração do sal seja diluída abaixo de uma faixa desejada, como descrito aqui.

[00136] A amostra foi misturada novamente e deixada a 4oC por um mínimo de 5 minutos. A amostra foi dilatada numa microcentrífuga por de 10 a 15 minutos e os péletes foram lavados 2 vezes com EtOH 70%, turbilhonando em cada vez. Este tratamento de lavagem remove quaisquer sais residuais que tenham precipitado com os ácidos nucléicos.

[00137] O pélete foi deixado a secar e então foi re-suspenso num volume adequado de T/E (10 mM Tris/0,1 mM EDTA) pH 7,0 a 12,5, tal como 50 μL. O tampão em pH 10,5 foi considerado particularmente efetivo. A amostra foi incubada a de 37oC a 95oC por de 1 min a 96 h, o necessário para suspender os ácidos nucléicos.

[00138] Um outro exemplo de tratamento com bissulfito pode ser encontrado no pedido de patente internacional WO 2005/021778 (incorporado aqui por referência) que provê métodos e materiais para a conversão de citosina em uracila. Em algumas formas de realização, um ácido nucléico, tal como gDNA, é reagido com bissulfito e com um catalisador poliamina, tal como uma triamina ou tetra-amina. Opcionalmente, o bissulfito compreende bissulfito de magnésio. Em outras formas de realização, um ácido nucléico é reagido com bissulfito de magnésio, opcionalmente na presença de um catalisador poliamina e/ou de um catalisador amina quaternária. Também são providos kits que podem ser usados para executar os métodos de acordo com o presente invento. Será apreciado que estes métodos também sejam adequados para o presente invento na etapa de tratamento.

Amplificação

[00139] As amplilficações PCR foram realizadas em misturas de reação de 25 μL contendo 2 μL de DNA genômico tratado com bissulfito, usando o Promega PCR Master Mix, 6 ng/μL de cada um dos iniciadores. Foram usados iniciadores aninhados específicos de fita para a amplificação. A primeira rodada de amplificações PCR foi executada usando os iniciadores PCR 1 e 4 (vide abaixo). Em seguida à primeira rodada de amplificação, 1 μL do material amplificado foi transferido para a segunda rodada de pré-misturas PCR contendo os iniciadores PCR 2 e 3 e o amplificado como anteriormente descrito.

[00140] As amostras dos produtos PCR foram amplificadas num termociclador ThermoHybaid PX2 sob as seguintes condições: 1 ciclo de 95oC por 4 minutos, seguido de 30 ciclos de 95oC por 1 minuto, 50oC por 2 minutos e 72oC por 2 minutos; 1 ciclo de 72oC por 10 minutos.

Amplificação multiplexada

[00141] Se for exigida a amplificação multiplexada para a detecção, a seguinte metodologia pode ser executada.

[00142] Um μL de DNA tratado com bissulfito é adicionado aos seguintes componentes em um volume de reação de 25 μL, x1 Qiagen multiplex master mix, de 5 a 100 ng de cada INA ou iniciador oligonucleotídeo de 1a rodada, de 1,5 a 4,0 mM de MgSO4, 400 μM de cada dNTP e de 0,5 a 2 unidades da mistura de polimerase. Os componentes são postos em ciclo num termociclador de tampa quente como segue. Tipicamente, pode haver até 200 seqüências individuais de iniciadores em cada reação de amplificação.

[00143] Uma segunda rodada de amplificação é então realizada em uma alíquota de 1 μL da primeira rodada de amplificação que é transferida para um tubo de reação da segunda rodada contendo a mistura de reação de enzimas e os iniciadores apropriados da primeira rodada. O ciclo é então realizado como acima.

Iniciadores

[00144] Qualquer iniciador adequado de PCR pode ser usado no presente invento. Um iniciador tipicamente tem uma seqüência complementar a uma seqüência que será amplificada. Os iniciadores são tipicamente oligonucleotídeos, mas podem ser análogos a oligonucleotídeos.

Sondas

[00145] A sonda pode ser qualquer molécula adequada de ácido nucléico ou de análogo a ácido nucléico. Exemplos incluem, mas não se limitam a, DNA, RNA, ácido nucléico travado (LNA), ácido nucléico peptídeo (PNA), MNA, ácido nucléico altritol (ANA), ácido nucléico hexitol (HNA), ácido nucléico intercalante (INA), ácido nucléico ciclohexanil (CNA) e suas misturas e seus híbridos, bem como as modificações nos seus átomos de fósforo, tais como mas não limitadas a fosforotioatos, metilfosfolatos, fosforamiditos, fosforoditioatos, fosforoselenoatos, fosfotriésteres e fosfoboranoatos.

[00146] Os nucleotídeos de ocorrência não natural incluem, mas não se limitam a, os nucleotídeos compreendidos dentre DNA, RNA, PNA, INA, HNA, MNA, ANA, LNA, CNA, CeNA, TNA, (2'-NH)-TNA, (3'-NH)-TNA, α-L-Ribo-LNA, α-L-Xilo- LNA, β-D-Xilo-LNA, α-D-RiboLNA, [3.2.1]-LNA, biciclo-DNA, 6-amino-biciclo-DNA, 5-epi-biciclo-DNA, α-biciclo-DNA, triciclo-DNA, biciclo[4.3.0]-DNA, biciclo[3.2.1]- DNA, biciclo[4.3.0]amida-DNA, β-D-ribopiranosil-NA, α-L-lixopiranosil-NA, 2'-R- RNA, α-L-RNA ou α-D-RNA, β-D-RNA. Em adição, podem ser usados compostos sem fósforo para ligar aos nucleotídeos, tais como, mas não limitados a, metiliminometila, formacetato, tioformacetato e grupos de ligação compreendendo amidas. Em particular, ácidos nucléicos e análogos de ácidos nucléicos podem compreender um ou mais pseudonucleotídeos intercaladores.

[00147] Preferencialmente, as sondas são DNA ou oligonucleotídeos de DNA contendo um ou mais INA formando IPNs internos.

Eletroforese

[00148] A eletroforese das amostras foi realizada de acordo com o guia do usuário do sistema E-gel (www.invitrogen.doc).

Métodos de Detecção

[00149] Existem numerosos sistemas de detecção possíveis para determinar o estado da amostra desejada. Será apreciado que qualquer sistema ou método conhecido para detectar moléculas de ácidos nucléicos possa ser usado no presente invento. Os sistemas de detecção incluem, mas não se limitam a: I. Hibridização de DNA apropriadamente marcado em um dispositivo do tipo micro-arranjo que poderia selecionar de 10 a >200.000 componentes individuai. Os arranjos poderiam ser compostos de arranjos de INAs, PNAs ou de nucleotídeos ou de nucleotídeos modificados sobre qualquer superfície sólida adequada tal como vidro, plástico, mica, nylon, conta, conta magnética, conta fluorescente ou membrana; II. Sistemas de detecção do tipo Southern blot; III. Sistemas de detecção PCR padrão tais como gel de agarose, leituras fluorescentes tais como a análise Genescan. Ensaios de hibridização sanduíche, reagentes de manchamento de DNA tais como brometo de etídio, Syber Green, detecção de anticorpos, dispositivos do tipo leitor de placas ELISA, fluorímetros; IV. Quantificação PCR em tempo-real de fragmentos genômicos amplificados específicos ou múltiplos ou qualquer variação destes. V. Quaisquer dos sistemas de detecção descritos no pedido de patente WO 2004/065625 tais como contas fluorescentes, conjugados de enzimas, contas radioativas e similares. VI. Qualquer outro sistema de detecção utilizando uma etapa de amplificação tal como reação em cadeia de ligase ou tecnologias de amplificação isotérmica de DNA tais como Amplificação por Deslocamento de Fita (SDA). VII. Sistemas de detecção multi-fóton. VIII. Eletroforese e visualização em géis. IX. Qualquer plataforma usada ou que pode ser usada para detectar ácidos nucléicos.

Ácidos Nucléicos Intercalantes

[00150] Os ácidos nucléicos intercalanetes são polinucleotídeos de ocorrência não natural que podem hibridizar em ácidos nucléicos (DNA e RNA) com especificidade de seqüência. Os INA são candidatos a alternativa/substitutos para as sondas de ácidos nucléicos em ensaios de hibridização baseados em sondas porque eles exibem várias propriedades desejáveis. Os INA são polímeros que hibridizam em ácidos nucléicos para formar híbridos que são mais estáveis termodinamicamente que um ácido nucléico/complexo de ácido nucléico de ocorrência natural correspondente. Eles não são substratos para as enzimas que são conhecidas por degradar peptídeos ou ácidos nucléicos.

[00151] Portanto, os INA deveriam ser mais estáveis em amostras biológicas, bem como ter uma validade maior que os fragmentos de ácidos nucléicos de ocorrência natural. Diferente da hibridização de ácido nucléico que é muito dependente da força iônica, a hibridização de um INA com um ácido nucléico é bastante independente da força iônica e é favorecida em condições de baixa força iônica sob condições que desfavorecem fortemente a hibridização de ácido nucléico de ocorrência natural em ácido nucléico. A força de ligação do INA é dependente do número de grupos intercalantes projetados dentro da molécula bem como das interações usuais das ligações de hidrogênio entre bases empilhadas de modo específico numa estrutura de dupla fita. A discriminação da seqüência é mais eficiente para DNA reconhecido por INA que para DNA reconhecido por DNA.

[00152] Preferencialmente, o INA é o fosforamidito de (S)-1-O-(4,4'- dimetoxitrifenilmetil)-3-O(1-pirenilmetil)-glicerol.

[00153] Os INA são sintetizados pela adaptação de procedimentos padrão de síntese de oligonucleotídeos num formato que é comercialmente disponível. A definição completa de INA e de sua síntese pode ser encontrada em WO 03W51901, WO 03/052133 e WO 03/052134 (Unest A/S), incorporada aqui por referência.

[00154] Há, de fato, muitas diferenças entre as sondas INA e as sondas padrão de ácido nucléico. Estas diferenças podem ser convenientemente separadas em diferenças biológicas, estruturais e físico-químicas. Como discutido acima e abaixo, estas diferenças biológicas, estruturais e físico-químicas podem levar a resultados imprevisíveis ao tentar usar sondas INA em aplicações em que os ácidos nucléicos tipicamente têm sido empregados. Esta não equivalência de composições diferentes é freqüentemente observada no campo da química.

[00155] Com referência às diferenças biológicas, os ácidos nucléicos são materiais biológicos que desempenham um papel central na vida das espécies viventes como agentes de transmissão e expressão genética. Suas propriedades in vivo são bem compreendidas. O INA, entretanto, é uma molécula totalmente artificial recentemente desenvolvida, concebida na mente de químicos e feita usando química orgânica sintética. Ele não tem função biológica conhecida.

[00156] Estruturalmente, o INA também difere dramaticamente dos ácidos nucléicos. Embora ambos possam empregar nucleobases comuns (A, C, G, T e U), a composição destas moléculas é estruturalmente diversa. As dorsais de RNA, DNA e INA são compostas de unidades de repetição de fosfodiéster-ribose e 2- desoxirribose. O INA difere do DNA ou do RNA por ter uma ou mais moléculas planas anexadas via uma molécula de ligação ao polímero. As moléculas planas se intercalam entre as bases na fita de DNA complementar oposta ao INA numa estrutura de dupla fita.

[00157] As diferenças físico-químicas entre INA e DNA ou RNA também são substanciais. O INA liga-se ao DNA complementar mais rapidamente que as sondas de ácidos nucléicos se ligam à mesma seqüência alvo. Diferente dos fragmentos de DNA ou RNA, o INA se liga fracamente ao RNA a menos que os grupos intercalantes estejam situados em posições terminais. Por causa das fortes interações entre os grupos intercalantes e as bases na fita de DNA complementar, a estabilidade do complexo INA/DNA é maior que aquela de um complexo análogo DNA/DNA ou RNA/DNA.

[00158] Diferente de outros ácidos nucléicos tais como fragmentos de DNA ou RNA ou PNA, o INA não exibe propriedades de auto-agregação ou ligação.

[00159] Como o INA hibridiza em ácidos nucléicos com especificidade de seqüência, os INA são candidatos úteis para o desenvolvimento de ensaios baseados em sondas e são particularmente adaptados para kits e ensaios de classificação. As sondas INA, entretanto, não são o equivalente de sondas de ácidos nucléicos. Conseqüentemente, quaisquer métodos, kits ou composições que poderia melhorar a especificidade, sensibilidade e confiabilidade de ensaios baseados em sondas seria útil na detecção, análise e quantificação de amostras contendo DNA. O INA tem as propriedades necessárias para esta finalidade.

RESULTADOS

[00160] A detecção de microorganismos (tais como cepas bacteriais, virais ou fungais) é freqüentemente dificultada por um grande número de cepas individuais de microorganismos dentro daquela espécie.

[00161] Os princípios gerais in silico do invento são ensinados usando as bactérias Neisseria miningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus sp e Staphylococcus (Figuras de 1 a 5). Os princípios gerais do presente invento são ensinados usando o vírus Influenza e o Rotavirus (Figuras 6 e 7).

[00162] Os dados bioquímicos gerais para ensinar e suportar o presente invento são descritos nas figuras de 8 a 18 usando bactérias clinicamente relevantes Gram positivas bem como Gram negativas.

Bactérias

[00163] A fig. 1 mostra uma região de 34 nucleotídeos do gene iga protease em N. meningitides e o lócus correspondente em N. gonorrhoeae (uma vez que estas regiões existem nos seus genomas bacteriais naturais) (classificação completa: Bactéria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Neisseria meningitides, Z2491 Serogrupo A, e características completas de lócus: iga, IgA1 protease; GeneID 906889. Locus Tag NMA0905; RefSeq # NC_003116.1; PMID 10761919; Parkhill, J. et al., 2000, Nature, 404, 502-506). Há 74% de similaridade de seqüência entre estas duas seqüências de 34 nucleotídeos de Neisseria. Os iniciadores baseados em PCR feitos para amplificar estas regiões em ambas as espécies bacteriais exigiriam iniciadores degenerados com 512 combinações possíveis. A seqüência comum usada por parte da amplificação PCR seria a seqüência de 34 nucleotídeos GYAATYW AGGYCGYCTY GAAGAYTAYAAYATGGC (SEQ ID NO: 3) em que o código padrão para designar posições diferentes é dado abaixo: N = A, G, T ou C; D = A, G ou T; H = A, T ou C; B = G, T ou C; V = G, A ou C; K = G ou T; S = C ou G; Y = T ou C; R = A ou G; M = A ou C e W = A ou T.

[00164] Entretanto, quando o DNA bacterial destas duas espécies é tratado com o reagente bissulfito (resultando na conversão de citosinas em timinas), as seqüências de ocorrência natural são convertidas em seqüências derivadas que não têm potencial de codificação e não existem na natureza. As seqüências derivadas são agora 97% similares. Os iniciadores baseados em PCR designados para permitir a amplificação PCR de ambos estes lócus bacteriais num único teste exigem agora somente duas combinações de iniciadores. A combinação seria baseada na seqüência GTAATTW AGGTTGTTTT GAAGATTATAATATGGT (SEQ ID NO: 4), em que somente a base na posição 7 é uma adenina ou uma timina (marcada como W). Assim, a conversão por bissulfito reduz a complexidade genômica relativa de 512 a 2 tipos de iniciador. Esta redução massiva simplifica a amplificação do mesmo lócus a partir de espécies bacteriais relacionadas.

[00165] Vantagens adicionais surgem do uso opcional de sondas INA para amplificar regiões dessas duas espécies de bactérias, novamente usando o mesmo lócus. A fig. 2 ilustra a mesma região de 34 nucleotídeos dos genes iga de N. meningitides e N. gonorrhoeae como mostrado na fig. 1, com a demonstração adicionada da extensão em que o comprimento e a complexidade da sonda podem ser ainda mais reduzidos usando sondas INA. Uma seqüência INA curta de 16 meros AGGYCGYCTY GAAGAY (SEQ ID NO: 5) exigiria 16 combinações possíveis de iniciadores para detectar esta região, mas após a conversão com bissulfito, uma única seqüência de iniciador, AGGTTGTTTT GAAGAT (SEQ ID NO: 6) seria suficiente. A vantagem da molécula INA é que, devido aos pseudonucleotídeos intercalantes que são incorporados em sua espinha dorsal, a hibridização ao lócus correto é muito mais facilmente distinguida da ligação não específica, devido à Tm aumentada do INA com relação ao oligonucleotídeo padrão. Será apreciado, entretanto, que os oligonucleotídeos padrão ainda funcionem adequadamente.

[00166] Quando espécies bacteriais proximamente aparentadas causam sintomas clínicos similares, o DNA convertido por bissulfito pode novamente ser usado para projetar sondas mais simples para testar a presença de tipos bacteriais específicos. A fig. 3 mostra os alinhamentos de DNA do gene iga em três espécies bacteriais, uma das quais, Haemophilus influenzae é de um grupo taxonômico diferente. O tratamento por bissulfito do DNA bacterial resultou num número muito menor de combinações de sondas. Esta comparação ilustra a importância de ser capaz de testar espécies não aparentadas em um teste. Ambas N. meningitides e H. influenzae causam meningite, então é vantajoso ser capaz de verificar em um teste todos os micróbios que causam os mesmos sintomas clínicos.

[00167] A análise de um grande número de espécies bacteriais diferentes a partir do mesmo grupo taxonômico é novamente facilitada pelo presente invento. A fig. 4 mostra um segmento de 40 nucleotídeos do gene tuf em 10 espécies bacteriais do grupo Streptococcus a saber S. oralis, S. mitis, S. dysgalactiae, S. cristatus, S. gordoni, S. parauberis, S. pneumoniae, S. bovis, S. vestivularis e S. uberis. Esta região tem aproximadamente 68% de similaridade de seqüência entre as 10 espécies e requer 12.288 combinações de iniciadores a fim de simultaneamente testar as 10 espécies no teste único. A seqüência convertida por bissulfito entre estas espécies tem 85% de similaridade de seqüência e agora requer somente 64 combinações possíveis de iniciadores.

[00168] A análise de cepas diferentes pertencentes à mesma espécie bacterial também é simplificada pelo presente invento. A fig. 5 ilustra um segmento de 23 nucleotídeos do gene se da enterotoxina de Staphylococcal aureus. A seqüência natural desta região de gene tem somente 56% de similaridade de seqüência entre todas as 7 cepas e requer 1536 combinações de iniciadores, enquanto que a seqüência convertida por bissulfito tem 74% de similaridade de seqüência e requer somente 64 combinações de iniciadores.

Análise do ácido nucléico viral e redução da complexidade genômica relativa

[00169] O princípio da redução da complexidade genômica relativa também pode ser aplicado em grupos virais, tais como o vírus influenza que tem um genoma DNA, bem como aos grupos virais que têm genomas RNA (uma vez que o RNA pode ser convertido em DNA por transcriptase reversa e então conseqüentemente, tratado com bissulfito). Para ilustrar a aplicação para detecção viral, foram usados o gene neuraminidase de cepas de vírus influenza (família Orthomyxoviridae), e o gene VP4 codificador de proteína de superfície de cepas do rotavírus (família Reoviridae), ambos vírus tendo um genoma RNA segmentado.

[00170] A taxonomia dos vírus influenza é complexa, com tipos A, B e C por exemplo sendo baseados em características antigênicas, e com subtipos adicionais sendo baseados no local de origem, ano de isolamento, número do isolado e subtipo. Isto reforça a necessidade em primeira instância de ser capaz de identificar os vírus influenza como um grupo, e somente então passar a analisar níveis sub-sub-classificação.

[00171] A taxonomia dos rotavírus também é complexa. O número de serotipos de rotavírus é grande, sendo reconhecidos dois serotipos principais, os serotipos P e G. Há minimamente 14 serotipos G diferentes e sua detecção inequívoca é de importância na medicina pediátrica. Estima-se que em torno da idade de três anos, aproximadamente cada criança ao redor do mundo já foi infectada pelo menos uma vez pelo rotavírus, mesmo que estas infecções possam ser subclínicas e terem apenas efeitos brandos sobre o trato gastrointestinal.

[00172] As conseqüências da infecção pelo influenza em nível clínico são bem conhecidas, com morbidade e mortalidade significativa quase todo inverno. Entretanto, pode haver complicações secundárias massivas após a infecção, especialmente por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae e Staphylococcus aureus. É muito claramente vantajoso ser capaz de simultaneamente analisar simultaneamente ambas infecções virais e bacteriais uma vez que podem surgir complicações pneumonares a partir das características misturadas de infecções bacteriais e virais, e o tratamento antibiótico imediato pode ser uma terapia efetiva.

[00173] A redução da complexidade genômica relativa em 9 cepas diferentes de influenza é mostrada na fig. 6. Uma região de 20 nucleotídeos do gene neuraminidase do vírus influenza é mostrada na sua forma DNA. Há 50% de similaridade de seqüência entre estes 9 isolados. Após a conversão por bissulfito, a similaridade de seqüência aumentou para 75%. Na sua forma original, seriam exigidas 2048 combinações possíveis de iniciadores para analisar estas 9 cepas, enquanto que após a conversão por bissulfito, são necessárias somente 48 combinações de iniciadores.

[00174] A redução da complexidade genômica relativa no gene VP4 de 3 cepas diferentes de rotavírus é mostrada na fig. 7. Uma região de 20 nucleotídeos do gene VP4 tem 52% de similaridade de seqüência antes da conversão e 74% após a conversão. O número de combinações de iniciadores reduz de 512 a 32.

[00175] Os dados moleculares que suportam a abordagem in silico da simplificação dos genomas microbiais como meio de detecção de microorganismos são ilustrados nas figuras de 8 a 15 usando espécies microbiais clinicamente relevantes que são freqüentemente encontradas em hospitais e em unidades de teste de patologias.

[00176] É uma vantagem distinta e um imperativo clínico a detecção rápida dos microorganismos contaminantes, se a decisão inicial poderia ser feita entre a presença de bactérias Gram positivas ou Gram negativas numa amostra. O método aqui descrito prove um tal teste usando os genes ribossomais 23S de espécies bacteriais diferentes para gerar um conjunto de iniciadores que permite a detecção de bactérias Gram positivas ou Gram negativas usando tais iniciadores em genomas simplificados via uma reação de amplificação. As seqüências 23S são ideais para tais distinções de alto nível, uma vez que elas ocorrem em todas as espécies bacteriais, diferente de algumas seqüências codificadoras de proteínas que são adições opcionais a alguns genomas bacteriais, como visto no exemplo anterior da S. galactiae. Muitas seqüências microbiais codificadoras de proteína são como "flotsam" e "jetsam" genômico, e sua utilidade reside na diferenciação entre categorias taxonômicas de nível inferior tais como cepas, tipos ou isolados microbiais diferentes, ou no caso dos vírus, entre tipos diferentes ou mutações recém surgidas. As seqüências genômicas normal e simplificada de ambos estes componentes, os genes RNA ribossomais codificadores de não proteína, e o gene recA codificador de proteína de bactérias são dados nas figuras 15 e 16, respectivamente. As seqüências iniciadoras usadas para realizar as reações de amplificação para os amplicons bacteriais 23S são dadas na Tabela 1. As seqüências iniciadoras usadas para realizar as reações de amplificação dos amplicons recA são dadas na Tabela 2. Todos os iniciadores são feitos para o DNA tratado por bissulfito e são mostrados na orientação de 5' para 3'.

[00177] A Tabela 1 mostra seqüências de iniciadores bacteriais adequados usados na amplificação do DNA simplificado por bissulfito a partir do gene RNA ribossomal 23S usando alinhamentos para gerar iniciadores para a detecção de bactérias Gram positivas (Pos) e Gram negativas (Neg). Em adição, foram projetados iniciadores para a detecção específica de Mycoplasma spp (Myc), Staphylococcus spp (Staph), Streptococcus spp (Strep), Neisseria spp (NG), Chlamydia (CT), e Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae (EC).

[00178] Os seguintes símbolos designam as seguintes adições de bases: N = A, G, T ou C; D = A, G ou T; H = A, T ou C; B = G, T ou C; V = G, A ou C; K = G ou T; S = C ou G; Y = T ou C; R = A ou G; M = A ou C e W = A ou T.

[00179] Todos os iniciadores foram usados em seqüências de DNA simplificadas por bissulfito.Tabela 1 - Iniciadores bacteriais

[00180] A Tabela 2 mostra as seqüências de iniciadores bacteriais usadas para amplificar o DNA simplificado do gene recA codificador de proteína usando alinhamentos de Staphylococcus aureus (SA), Staphylococcus epidermidis (SE), Serratia marscesens (SM), Escherichia coli (EC) e Yersinia enterocolitica (YE) para tipagem bacterial única.Tabela 2 - Seqüências de iniciadores bacteriais usados na amplificação de DNA simplificado a partir do gene recA codificador de proteína

[00181] A Tabela 1 mostra as seqüências de iniciadores bacteriais usadas na amplificação de DNA simplificado por bissulfito a partir do gene RNA ribossomal 23S usando múltiplos alinhamentos para gerar iniciadores ótimos para a detecção de bactérias Gram positivas (Pos) e Gram negativas (Neg). Em adição, também foram projetados iniciadores para a detecção específica de grupos de espécies bem como para espécies individuais. As designações para estes grupos de iniciadores bacteriais são como segue: Escherichia coli e Klebsiela pneumoniae (EC), Neisseria spp (NG), Chlamydia (CT), Mycoptasma spp (Myc), Streptococcus spp (Strep) e Staphylococcus spp (Staph). As sub-designações F e R referem-se respectivamente aos iniciadores de avanço e retrocesso. Em adição, onde mais de uma base possível fosse necessária numa dada posição do nucleotídeo, a degeneração da base é dada pelo seguinte código: N = A, G, T ou C; D = A, G ou T; H = A, T ou C; B = G, T ou C; V = G, A ou C; K = G ou T; S = C ou G; Y = T ou C; R = A ou G; M = A ou C e W = A ou T. Para reiterar, todos os iniciadores usados no presente invento são baseados em seqüências de DNA simplificadas por bissulfito.

[00182] A Tabela 2 mostra seqüências de iniciadores bacteriais usadas na amplificação de DNA simplificado por bissulfito do gene recA codificador de proteína usando alinhamentos de Staphylococcus aureus (SA), Staphylococcus epidermidis (SE), Serratia marscesens (SM), Escherichia coli (EC) e Yersinia enterocolitica (YE) para tipagem bacterial única.

[00183] A fig. 8 mostra os produtos de amplificação obtidos por PCR a partir das regiões do gene ribossomal 23S simplificado de bactérias Gram positivas e Gram negativas, com os amplicons apropriadamente dimensionados sendo detectados como bandas de comprimento específico por eletroforese em gel de agarose. A seta indica o tamanho esperado dos amplicons com relação aos marcadores de tamanho padrão da trilha marcadora (M). O uso de iniciadores específicos para bactérias Gram negativas revela bandas somente nas seis trilhas Gram negativas de 1 a 6 (painel superior), para Escherichia coli, Neisseria gonorrheae, Klebsiela pneumoniae, Moraxela catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa e Proteus vulgaris. O uso de iniciadores específicos para bactérias Gram positivas revela bandas somente nas seis trilhas Gram positivas, de 7 a 12 (painel inferior), para Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus xylosis, Streptococcus pneumoniae e Streptococcus haemolyticus.

[00184] A fig. 9 mostra os produtos de amplificação obtidos por PCR a partir das regiões do gene ribossomal 23S simplificado designados para detectar amplicons a partir de somente duas espécies bacteriais Gram negativas (neste exemplo) E. coli e K. pneumoniae. A especificidade da metodologia de amplificação é ilustrada pela presença de amplicons nas trilhas 1 e 3, representando E. coli e K. pneumoniae, e a ausência de produtos de amplificação na trilha 2, bem como nas trilhas de 4 a 12, estas 10 trilhas vazias representando as 10 espécies de bactérias restantes usadas no teste.

[00185] A fig. 10 mostra os produtos de amplificação obtidos por PCR a partir das regiões do gene ribossomal 23S simplificado usando iniciadores específicos para somente um grupo bacterial, Neisseria. A especificidade da metodologia de simplificação genômica é ilustrada pela presença de um amplicon somente na trilha 2, representando Neisseria gonorrheae, e a ausência de produto de amplificação na trilha 1, bem como nas trilhas de 3 a 12, estas 11 trilhas vazias representando as 11 espécies de bactérias restantes usadas no teste.

[00186] Para a análise de espécies microbiais individuais, os genes que codificam proteínas também podem ser usados onde apropriado, com a condição de que cepas diferentes do microorganismo não sejam polimórficas para a presença/ausência da seqüência genética em questão.

[00187] A fig. 11 ilustra o uso de iniciadores do gene bacterial recA de E. coli. A especificidade do amplicon é ilustrada pela presença do amplicon de tamanho correto na trilha 1 e de sua ausência das trilhas restantes de 2 a 12, representando outras 12 espécies de bactéria.

[00188] Os dados da fig. 12 ilustram adicionalmente a especificidade dos iniciadores que revelam a filiação a um grupo bacterial maior, tal como Estafilococos. Os produtos de amplificação obtidos por PCR a partir das regiões do gene ribossomal 23S simplificado usando iniciadores específicos para Estafilococos revelam amplicons somente nas trilhas 8, 9 e 10, representando Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus e Staphylococcus xylosis. A ausência de um produto de amplificação nas trilhas de 1 a 7, bem como nas trilhas 11 e 12, atesta a especificidade da reação. As 9 trilhas vazias representam as 9 espécies de bactérias não-Estafilococo usadas no teste.

[00189] A fig. 13 mostra os produtos de amplificação obtidos por PCR a partir das regiões do gene ribossomal 23S simplificado usando iniciadores específicos para a bactéria Estreptococo. Os produtos de amplificação obtidos por PCR a partir das regiões do gene ribossomal 23S simplificado usando iniciadores específicos para a bactéria Estreptococo revelam amplicons somente nas trilhas 11 e 12, representando Streptococcus pneumoniae e Streptococcus haemolyticus. A ausência de produto de amplificação nas trilhas de 1 a 10 revela a especificidade da reação. Estas 10 trilhas vazias representam as 10 espécies de bactérias não- Estreptococo usadas no teste.

[00190] A fig. 14 mostra os produtos de amplificação obtidos por PCR a partir das regiões genomicamente simplificadas do gene recA de Staphylococcus epidermidis (trilha 8). As duas bandas (indicadas por setas) representam os amplicons de transporte da primeira rodada (banda superior) e segunda rodada (banda inferior) de amplificações PCR. A ausência de amplicons nas trilas de 1 a 7 e de 9 a 12 mostra a especificidade do método e enfatiza o ponto em que os genes que codificam proteínas podem ser usados em circunstâncias particulares em vez dos componentes não codificadores do genoma, para obter a detecção de apenas uma espécie bacterial.

[00191] A fig. 15 mostra a detecção de amplicons usando iniciadores específicos para os genes ribossomais 23S genomicamente simplificados de clamídia. As reações PCR foram executadas em duplicata devido às baixas quantidades de DNA de partida. A trilha número 5 tinha DNA extraído da urina de um indivíduo sabidamente negativo. A presença de uma banda em qualquer uma das duplicatas foi considerada uma reação positiva para a presença de DNA de clamídia.

[00192] A fig. 16 mostra a seqüência de nucleotídeos normal do gene RNA ribossomal 23S de E. coli e a mesma seqüência após a simplificação genômica, onde para fins ilustrativos, todas as citosinas foram substituídas por timinas.

[00193] A fig. 17 mostra a seqüência de nucleotídeos normal do gene recA de E. coli e a mesma seqüência após a simplificação genômica, onde para fins ilustrativos, todas as citosinas foram substituídas por timinas.

[00194] Em resumo, o DNA tratado com bissulfito a partir de fontes microbiais, quando amplificado usando iniciadores genomicamente simplificados, sejam eles oligonucleotídeos ou ácidos nucléicos modificados tais como INAs, proporciona um sistema de detecção não superado para encontrar microorganismos de qualquer tipo dentro de uma amostra, seja aquela amostra a partir de material clínico humano ou em um outro extremo, a partir de uma fonte ambiental tal como água contaminada. O presente invento foi demonstrado para uma ampla gama de espécies bacteriais diferentes, e para um vírus clinicamente relevante. A detecção de microorganismos eucariontes unicelulares tais como a levedura Saccharomyces cerevisiae ou seus aparentados é uma simples extensão do método. Ela requer fontes de seqüência genômica similares, tais como as seqüências ribossomais 18 ou 28S, ou como mostrado, seqüências codificadoras de proteínas que são específicas para uma dada espécie, tipo, cepa, mutação ou polimorfismo.

[00195] As implicações práticas do sistema de detecção de acordo com o presente invento também são importantes. Enquanto os princípios descritos em detalhes aqui foram demonstrados usando PCR para a amplificação, as leituras podem ser geradas via qualquer metodologia conhecida do estado da técnica. Com a ênfase atual em sistemas de detecção de micro-arranjos, pode-se ser capaz de detectar uma gama ainda maior de microorganismos usando DNA simplificado genomicamente, uma vez que o tratamento com bissulfito reduz a complexidade genômica e portanto permite que mais classes de microorganismos sejam testadas em micro-arranjos com números menores de detectores (características).

[00196] Se, por exemplo, um micro-arranjo tivesse que ser construído para detectar mais ou menos 250.000 microorganismos diferentes em um teste, a metodologia atual não poderia prover uma plataforma de detecção prática adequada, uma vez que ela estaria inundada pelas limitações físicas da plataforma de detecção. Entretanto, com a simplificação genômica, um pequeno micro- arranjo poderia detectar mais ou menos 1000 categorias bacteriais de alto nível diferentes. Os positivos a partir de tal teste poderiam ser então avaliados usando um outro arranjo, simplesmente contendo representantes daqueles grupos que foram positivos no teste inicial.

[00197] Será apreciado pelos técnicos da área que várias variações e/ou modificações podem ser feitas no presente invento como mostrado nas formas de realização específicas sem fugir ao espírito ou escopo do presente invento como amplamente descrito. As presentes formas de realização são, portanto, para serem consideradas em todos os aspectos como ilustrativas e não restritivas.

Claims (31)

1. Método para obter um ácido nucléico microbial específico de um genoma microbial ou de um ácido nucléico microbial, caracterizado por compreender: - reduzir a complexidade do genoma microbial ou do ácido nucléico microbial gerando uma forma simplificada do genoma microbial ou do ácido nucléico microbial em que substancialmente todas as posições naturalmente ocupadas pelas citosinas são ocupadas por uracila ou timina; e - obter um ácido nucléico microbial específico a partir da forma simplificada do ácido nucléico.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender converter RNA microbial em DNA antes de executar o método.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender executar o método em RNA microbial para produzir uma molécula de RNA simplificada e então converter o RNA simplificado para formar uma molécula de DNA simplificada.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por a citosina ser ocupada por uracila.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por a citosina ser ocupada por timina.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por o genoma ou ácido nucléico microbial ser tratado com um agente escolhido dentre bissulfito, acetato ou citrato que modifica a citosina para uracila.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por o genoma ou ácido nucléico microbial ser tratado com um agente escolhido dentre bissulfito, acetato ou citrato que modifica a citosina para uracila e por compreender amplificar o ácido nucléico microbial tratado para produzir um genoma microbial ou um ácido nucléico microbial tendo uma complexidade reduzida.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a amplificação ser realizada por reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificação isotérmica ou amplificação de sinal.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 8, caracterizado por o agente ser bissulfito de sódio.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado por o ácido nucléico microbial específico compreender uma ou mais sequências de nucleotídeos únicas a um microorganismo.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado por o genoma ou ácido nucléico microbial ser obtido a partir de fagos, vírus, viróides, bactérias, fungos, algas, protozoários, espiroquetas ou organismos unicelulares.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado por o genoma ou ácido nucléico microbial ser escolhido dentre ácidos nucléicos que codificam proteínas, ácidos nucléicos que codificam não-proteínas, regiões de genes ribossomais de microorganismos procariontes ou eucarióticos unicelulares.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por as regiões de genes ribossomais serem 16S ou 23S em microorganismos procariontes e 18S e 28S em microorganismos eucarióticos unicelulares.

14. Método para obter ou identificar uma sequência específica de ácidos nucléicos microbiais de um genoma microbial ou de um ácido nucléico microbial, caracterizado por compreender: - obter a sequência de ácido nucléico do genoma microbial ou do ácido nucléico microbial - reduzir a complexidade de bases da sequência de ácido nucléico trocando substancialmente todas as citosinas na sequência por timinas para formar uma sequência simplificada de ácido nucléico contendo substancialmente somente bases escolhidas dentre adenina (A), guanina (G) e timina (T); e - obter ou identificar uma sequência específica de ácido nucléico microbial a partir da sequência simplificada de ácido nucléico.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por uma sequência específica de ácido nucléico microbial conter uma ou mais sequências únicas a um microorganismo.

16. Método, de acordo com a reivindicação14 ou 15, caracterizado por o genoma ou ácido nucléico microbial ser obtido a partir de fagos, vírus, viróides, bactérias, fungos, algas, protozoários, espiroquetas ou organismos unicelulares.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 14 a 16, caracterizado por o genoma ou ácido nucléico microbial ser escolhido dentre ácidos nucléicos que codificam proteínas, ácidos nucléicos que codificam não-proteínas, regiões de genes ribossomais de microorganismos procariontes ou eucarióticos unicelulares.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por as regiões de genes ribossomais serem 16S ou 23S em microorganismos procariontes e 18S e 28S em microorganismos eucarióticos unicelulares.

19. Método para selecionar uma sequência de uma molécula específica de ácido nucléico microbial, de acordo com reivindicação 1, caracterizado por compreender: - obter uma sequência de DNA de um microorganismo; - formar uma forma simplificada de sequência de DNA microbial executando uma conversão da sequência de DNA microbial pela troca de cada citosina por timina de modo que a forma simplificada do DNA microbial compreenda substancialmente as bases adenina, guanina e timina, em que a conversão imita a ação de um agente que converte citosina em uracila; e - selecionar uma molécula específica de ácido nucléico microbial a partir da forma simplificada do DNA microbial.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a conversão ser executada in silico.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado por as formas simplificadas de duas ou mais sequências de DNA microbial serem obtidas e as duas ou mais sequências são comparadas para se obter pelo menos uma molécula específica de ácido nucléico microbial.

22. Uso do método conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 19 a 21, caracterizado por ser para obter sondas ou preparados para se ligar a ou amplificar a molécula específica de ácido nucléico microbial em um teste ou ensaio.

23. Método para detectar a presença de um microorganismo numa amostra, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender: - tratar um ácido nucléico microbial na amostra com um agente que modifica a citosina para uracila para formar um ácido nucléico microbial tratado; - prover preparados capazes de permitir à amplificação de uma molécula específica de ácido nucléico microbial até o ácido nucléico microbial tratado; - executar uma reação de amplificação no ácido nucléico microbial tratado para formar um ácido nucléico simplificado; e - testar para a presença de um produto ácido nucléico amplificado contendo a molécula específica de ácido nucléico microbial desejada, em que a detecção da molécula específica de ácido nucléico microbial desejada é indicativa da presença do microorganismo na amostra.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o microorganismo ser escolhido dentre fagos, vírus, viróides, bactérias, fungos, algas, protozoários, espiroquetas ou organismos unicelulares.

25. Método, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado por o agente ser escolhido dentre bissulfito, acetato ou citrato.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o agente ser bissulfito de sódio.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 26, caracterizado por a amplificação ser executada por reação em cadeia de polimerase (PCR), amplificação isotérmica ou amplificação de sinal.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 27, caracterizado por a molécula específica de ácido nucléico microbial desejada ser detectada por PCR em tempo real.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 27, caracterizado por a molécula específica de ácido nucléico microbial desejada ser detectada por um sistema de detecção de microarray.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 27, caracterizado por as moléculas de ácido nucléico desejadas serem detectadas por: - prover um ligante detector capaz de se ligar a uma região da molécula de ácido nucléico desejado e permitir um tempo suficiente para o ligante detector ligar-se à região; e - medir a ligação do ligante detector à molécula de ácido nucléico para detectar a presença da molécula de ácido nucléico desejado.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 27, caracterizado por as moléculas de ácido nucléico desejado serem detectadas pela separação de um produto de amplificação e visualização do produto separado.

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