ES2399054T3 - Métodos para simplificar ácidos nucleicos microbianos mediante modificación química de citosinas - Google Patents

Abstract

Un método para detectar un microorganismo que comprende: reducir la complejidad de un genoma microbiano o de un ácido nucleico microbiano mediante la generaciónde una forma derivada del genoma microbiano o de una forma derivada del ácido nucleico microbiano en elque las posiciones ocupadas naturalmente por citosinas están ocupadas por uracilos en la forma derivadadel genoma microbiano o forma derivada del ácido nucleico microbiano mediante el tratamiento del genomamicrobiano o un ácido nucleico microbiano con un agente seleccionado entre bisulfito, acetato o citrato quemodifica la citosina a uracilo; donde la forma derivada del genoma microbiano o la forma derivada del ácido nucleico microbianocontienen un ácido nucleico que es específico para un microorganismo que tiene el genoma microbiano o elácido nucleico microbiano, y detectar el ácido nucleico específico microbiano, en donde la detección del ácido nucleico específicomicrobiano es indicativa de la presencia de un microorganismo que tiene el genoma microbiano o el ácidonucleico microbiano.

Description

Métodos para simplificar ácidos nucleicos microbianos mediante modificación química de citosinas

Campo técnico

La invención se refiere a análisis de detección de ácidos nucleicos para la detección de microorganismos. La invención también se refiere a métodos para el tratamiento químico de los ácidos nucleicos para reducir la complejidad de los genomas microbianos combinados con el uso de ligandos específicos para la detección microbiana.

Técnica anterior

En la actualidad se encuentran disponibles diversos procedimientos para la detección de moléculas de ácido nucleico específicas. Estos procedimientos dependen típicamente de la hibridación dependiente de la secuencia entre el ácido nucleico diana y sondas de ácido nucleico que pueden tener una longitud que varía de oligonucleótidos cortos (20 bases o menos) a secuencias de muchas kilobases (kb).

El método más ampliamente utilizado para la amplificación de secuencias específicas dentro de una población de secuencias de ácido nucleico es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Dieffenbach, C y Dveksler, G. eds. PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Plainview NY). En este método de amplificación, se utilizan oligonucleótidos, generalmente de 20 a 30 nucleótidos de longitud en cadenas de ADN complementarias y en cada extremo de la región que se va a amplificar, para cebar la síntesis de ADN sobre ADN de hebra sencilla desnaturalizado. Ciclos sucesivos de desnaturalización, hibridación de cebadores, y síntesis de hebras de ADN usando ADN polimerasas termoestables permiten la amplificación exponencial de las secuencias entre los cebadores. Las secuencias de ARN se pueden amplificar por medio de una primera copia utilizando la transcriptasa inversa para producir una copia de ADN complementario (ADNc). Se pueden detectar fragmentos de ADN amplificados mediante una variedad de métodos, incluyendo la electroforesis en gel, la hibridación con sondas marcadas, el uso de cebadores etiquetados que permiten la identificación posterior (por ejemplo, mediante un análisis con enzima ligada), y el uso de cebadores marcados con fluorescencia que dan lugar a una señal tras la hibridación con el ADN diana (por ejemplo, sistemas de Beacon y TaqMan).

Junto con la PCR, se ha desarrollado una variedad de técnicas distintas para la detección y amplificación de secuencias de nucleótidos específicas. Un ejemplo es la reacción en cadena de la ligasa (1991, Barany, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 189-193).

Otro ejemplo es la amplificación isotérmica que se describió por primera vez en 1992 (Walker GT, Little MC, Nadeau JG y Shank D. Isotermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396 (1992) y se denominó amplificación con desplazamiento de la hebra (SDA). Desde entonces, se han descrito otras diversas tecnologías de amplificación isotérmica incluyendo Amplificación Mediada por Transcripción(TMA) y Amplificación Basada en Secuencias de Ácido Nucleico (NASBA) que utilizan una ARN polimerasa para copiar secuencias de ARN pero no el ADN genómico correspondiente (Guatelli JC, Whitfield KM, Kwoh DY, Barringer KJ, Richmann DD y Gingeras TR. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. PNAS 87: 1874-1878 (1990): Kievits T, van Gemen B, van Strijp D, Schukkink R, Dircks M, Adriaanse H, Malek L, Sooknanan R, Lens P. NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection. J Virol Methods. 1991 Dec; 35(3):273-86).

Otras técnicas isotérmicas basadas en el ADN incluyen la amplificación mediante círculo rodador (RCA) en la que una ADN polimerasa prolonga un cebador dirigido a un molde circular (Fire A y Xu SQ. Rolling replication of short circles. PNAS 92: 4641-4645 (1995), Ramificación-Amplificación (RAM) que utiliza una sonda circular para la detección de la diana (Zhang W, Cohenford M, Lentrichia B, Isenberg HD, Simson E, Li H, Yi J, Zhang DY. Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study. J Clin Microbiol. 2002 Jan; 40(1):128-32.) y más recientemente, amplificación de ADN isotérmica dependiente de helicasa (HDA), que utiliza una enzima helicasa para desenrollar las hebras de ADN en lugar de calor (Vincent M, Xu Y, Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004 Aug; 5(8):795-800.)

Recientemente, se han descrito métodos de amplificación isotérmica de ADN (Walker GT, Little MC, Nadeau JG y Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392396 (1992). Las técnicas tradicionales de amplificación se basan en ciclos continuos de desnaturalización y renaturalización de las moléculas diana en cada ciclo de la reacción de amplificación. El tratamiento térmico del ADN da como resultado un cierto grado de cizallamiento de las moléculas de ADN, con lo que cuando el ADN es limitante como en el aislamiento de ADN a partir de un pequeño número de células de un blastocisto en desarrollo, o en particular en los casos en los que el ADN está ya en una forma fragmentada, por ejemplo en secciones de tejido, bloques de parafina y muestras de ADN antiguas, este ciclo de calentamiento-enfriamiento adicional podría dañar el ADN y dar como resultado la pérdida de señales de amplificación. Los métodos isotérmicos no se basan en la desnaturalización continua del ADN molde para producir moléculas de hebra sencilla que sirvan como moldes a partir de una amplificación adicional, sino en la formación de mellas enzimáticas de moléculas de ADN mediante endonucleasas de restricción específicas a una temperatura constante.

La técnica denominada amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) se basa en la capacidad de ciertas enzimas de restricción para formar una mella en la hebra de ADN hemi-modificada y la capacidad de una polimerasa carente de exonucleasa 5'-3' para ampliar y desplazar la hebra aguas abajo. La amplificación exponencial se consigue a continuación mediante el acoplamiento de reacciones efectoras y antisentido en las que el desplazamiento de la hebra de la reacción efectora sirve como molde para la reacción antisentido (Walker GT, Little MC, Nadeau JG y Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396 (1992). Dichas técnicas se han utilizado para la amplificación satisfactoria de Mycobacterium tuberculosis (Walker GT, Little MC, Nadeau JG y Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396 (1992), HIV-1, Hepatitis C and HPV-16 Nuovo G. J., 2000), Chlamydia trachomatis (Spears PA, Linn P, Woodard DL y Walker GT. Simultaneous Strand Displacement Amplification and Fluorescence Polarization Detection of Chlamydia trachomatis. Anal. Biochem. 247: 130-137 (1997).

El uso de SDA hasta la fecha ha dependido de nucleótidos modificados con fosforotioato con el fin de producir un dúplex de ADN-hemi-fosforotioato que en la hebra modificada sería resistente a la escisión por la enzima, dando como resultado la formación enzimática de mellas en lugar de la digestión para conducir la reacción de desplazamiento. Recientemente, sin embargo, se han diseñado varias enzimas "nickasa". Estas enzimas no cortan el ADN de la manera tradicional sino que producen una mella en una de las hebras de ADN. Las enzimas "nickasa" incluyen N.Alw1 (Xu Y, Lunnen KD y Kong H. Engineering a nicking endonuclease N.Alw1 by domain swapping. PNAS 98: 12990-12995 (2001), N.BstNB1 (Morgan RD, Calvet C, Demeter M, Agra R, Kong H. Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNBI. Biol Chem. 2000 Nov; 381(11):1123-5.) y Mly1 (Besnier CE, Kong H. Converting Mlyl endonuclease into a nicking enzyme by changing its oligomerization state. EMBO Rep. 2001 Sep;2(9):782-6. Epub 2001 Aug 23). El uso de tales enzimas simplificaría de ese modo el procedimiento SDA.

Además, la SDA se ha mejorado mediante el uso de una combinación de una enzima de restricción estable al calor (Ava1) y una Exo-polimerasa estable al Calor (polimerasa Bst). Se ha demostrado que esta combinación aumenta la eficiencia de amplificación de la reacción de una amplificación de 108 veces a una amplificación de 1010 veces de manera que es posible, usando esta técnica, la amplificación de moléculas únicas de copia única. El factor de amplificación resultante usando la combinación polimerasa/enzima estable al calor es del orden de 109 (Milia M. A., Spears P. A., Pearson R. E. y Walker G. T. Use of the Restriction Enzyme Ava1 and Exo-Bst Polymerase in Strand Displacement Amplification Biotechniques 1997 24:392-396).

Hasta la fecha, todas las técnicas de amplificación de ADN isotérmica requieren que la molécula ADN molde de doble hebra inicial se desnaturalize antes de la iniciación de la amplificación. Además, la amplificación sólo se inicia una vez de cada evento de cebado.

Para la detección directa, el ácido nucleico diana se separa muy comúnmente basándose en su tamaño mediante electroforesis en gel y se transfiere a un soporte sólido antes de la hibridación con una sonda complementaria a la secuencia diana (transferencia Southern y Northern). La sonda puede ser un ácido nucleico natural o análogo, tal como ácido peptidonucleico (PNA) o ácido nucleico cerrado (LNA) o ácido nucleico intercalante (INA). La sonda puede marcarse directamente (por ejemplo con 32P) o se puede utilizar un procedimiento indirecto de detección. Los procedimientos indirectos por lo general dependen de la incorporación a la sonda de una "etiqueta" tal como biotina

o digoxigenina y la sonda se detecta a continuación por medios tales como la conversión de sustrato unido a la enzima o la quimioluminiscencia.

Otro método para la detección directa de ácido nucleico que se ha utilizado ampliamente es hibridación "sándwich". En este método, una sonda de captura se acopla a un soporte sólido y el ácido nucleico diana, en disolución, se hibrida con la sonda unida. El ácido nucleico diana no unido se elimina mediante lavado y el ácido nucleico unido se detecta usando una segunda sonda que hibrida con las secuencias diana. La detección puede utilizar métodos directos o indirectos como se ha esbozado anteriormente. Los ejemplos de tales métodos incluyen el sistema de detección de señal "ADN ramificado", un ejemplo que utiliza el principio de hibridación sándwich (1991, Urdea, M. S., et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 24, 197-200). Un área de rápido desarrollo que utiliza hibridación de ácido nucleico para la detección directa de secuencias de ácido nucleico es la de las micromatrices de ADN, (2002, Nature Genetics, 32, [Suplemento]; 2004, Cope, L.M., et al., Bioinformatics, 20, 323-331; 2004, Kendall, S.L., et al., Trends in Microbiology, 12, 537-544). En este procedimiento, las especies individuales de ácido nucleico, que pueden variar de oligonucleótidos cortos (típicamente, de 25 unidades en el sistema Affymetrix), a oligonucleótidos más largos, (típicamente de 60 unidades en Applied Biosystems y plataformas Agilent), a secuencias aún más largas, tales como clones de ADNc, se fijan a un soporte sólido en un patrón de cuadrícula o se sintetizan fotolitográficamente en un soporte sólido. A continuación se hibrida una población de ácido nucleico etiquetada o marcada con la matriz y se cuantifica el nivel de hibridación en cada punto en la matriz. Más comúnmente, se utilizan ácidos nucleicos marcados radiactivamente o fluorescentemente (por ejemplo ARNc o ADNc) para la hibridación, aunque se pueden emplear otros sistemas de detección, tales como la quimioluminiscencia.

Un área de rápido crecimiento que utiliza hibridación de ácido nucleico para la detección directa de secuencias de ácido nucleico es la de las micromatrices de ADN (Young RA Biomedical discovery with DNA arrays. Cell 102: 9-15 (2000); Watson A New tools. A new breed of high tech detectives. Science 289:850-854 (2000)). En este procedimiento, las especies individuales de ácido nucleico, que puede variar de oligonucleótidos a secuencias más largas, tales como clones de ADN complementario (ADNc), se fijan a un soporte sólido en un patrón de cuadrícula. Una población de ácido nucleico etiquetado o marcado se hibrida a continuación con la matriz y se cuantifica el nivel de hibridación con cada punto de la matriz. Muy comúnmente, se utilizaron para la hibridación ácidos nucleicos marcados radiactivamente o fluorescentemente (por ejemplo, ADNc), aunque se emplearon otros sistemas de detección.

Los métodos tradicionales para la detección de microorganismos tales como bacterias, levaduras y hongos, incluyen el cultivo de microorganismos en medios de nutrientes selectivos clasificando a continuación los microorganismos basándose en el tamaño, la forma, la producción de esporas, caracteres tales como las reacciones bioquímicas o enzimática y las propiedades específicas de tinción (tales como la tinción de Gram) como se observa al microscopio óptico convencional. Las especies virales tienen que ser cultivadas en tejidos o células especializados, después clasificadas en función de su estructura y tamaño determinados mediante microscopía electrónica. Un inconveniente principal de tales técnicas es que no todos los microorganismos crecerán bajo condiciones convencionales de cultivo

o de células que limitan la utilidad de tales enfoques. Con bacterias, por ejemplo, tales como Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae (que causan todas meningitis y entre las cuales N. meningitidis causa tanto meningitis como meningococcemia fulminante) las tres especies son difíciles de cultivar. Se examinan frascos de hemocultivo rutinariamente todos los días durante un máximo de siete días, y se requiere el subcultivo. H. influenzae requiere un medio especial que contiene dinucleótido de nicotinamida y adenina y hemina y el crecimiento en placas de agar chocolate. Los cultivos de sangre requieren caldo de tripticasa de soja o de infusión de cerebro-corazón y la adición de varios aditivos tales como polianetolsulfonato sódico. Para los microorganismos, tales como Clostridium botulinum, que provoca intoxicación alimentaria grave y síndrome de bebé hipotónico, la identificación de la toxina implica la inyección de extractos de alimentos o sobrenadantes de cultivo en ratones y la visualización de los resultados después de 2 días. Además, el cultivo del microorganismo potencial en medios especiales lleva una semana. La enterotoxina de Staphylococcus aureus (una causa de intoxicación alimentaria, así como infecciones de la piel, infecciones de la sangre, neumonía, osteomielitis, artritis y abscesos cerebrales) se detecta en cantidades diminutas por la absorción selectiva de la toxina a través de resinas de intercambio iónico o de aglutinación de látex pasiva inversa usando anticuerpos monoclonales. Su pariente, S. epidermis, conduce a infecciones de la sangre y contamina los equipos y superficies en hospitales y máquinas y aparatos sanitarios.

Los microorganismos no virales también pueden clasificarse en base a sus propiedades metabólicas tales como la producción de aminoácidos o metabolitos específicos durante las reacciones de fermentación en sustratos tales como glucosa, maltosa o sacarosa. Alternativamente, los microorganismos se pueden tipificar basándose en su sensibilidad a los antibióticos. También se utilizan anticuerpos específicos para antígenos de la superficie celular o proteínas excretadas tales como toxinas para identificar o tipificar microorganismos. Sin embargo, todos los métodos anteriores se basan en el cultivo del microorganismo antes de su posterior ensayo. El cultivo de microorganismos es caro y consume mucho tiempo y también puede verse afectado por contaminación o proliferación de microorganismos menos exigentes. Las técnicas son también relativamente rudimentarias ya que se deben realizar muchas pruebas en la misma muestra con el fin de llegar a un diagnóstico definitivo. La mayoría de los microorganismos no pueden ser cultivados fácilmente en medios conocidos, y por lo tanto, caen por debajo de los niveles de detección cuando una población mixta típica de las diferentes especies de microorganismo está presente en la naturaleza o asociada con organismos superiores.

Otros métodos para la detección e identificación de microorganismos patógenos se basa en el enfoque serológico en el que se producen anticuerpos en respuesta a la infección por el microorganismo. Los meningococos, por ejemplo, pueden clasificarse sobre la base de las diferencias estructurales en sus polisacáridos capsulares. Estos tienen antigenicidades diferentes, que permiten la determinación de cinco serogrupos principales, (A, B, C, Y y W-135). Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA) o el radioinmunoanálisis (RIA) pueden evaluar la producción de tales anticuerpos. Ambos métodos detectan la presencia de anticuerpos específicos producidos por el animal anfitrión durante el curso de la infección. Estos métodos tienen el inconveniente de que se necesita algo de tiempo para que el animal anfitrión produzca un anticuerpo, de este modo a menudo se pasan por alto infecciones muy tempranas. Además, el uso de dichos análisis no es capaz de diferenciar de manera fiable entre una infección pasada y una activa.

Más recientemente, ha habido mucho interés en el uso de métodos moleculares para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Estos métodos ofrecen la detección sensible y específica de microorganismos patógenos. Los ejemplos de tales métodos incluyen el sistema de detección de señales de "ADN ramificado". Este método es un ejemplo que utiliza el principio de hibridación sándwich (Urdea MS et al. Branched DNA amplification multimers for the sensitive, direct detection of human HIV and hepatitis viruses. Nucleic Acids Symp Ser. 1991; (24):197-200).

Otro método para la detección y clasificación de las bacterias es la amplificación de secuencias de ARN ribosómico 16S. Se ha informado que el ARNr 16S es una diana adecuada para su uso en análisis de amplificación mediante PCR para la detección de especies bacterianas en una variedad de muestras clínicas o ambientales, y con frecuencia se ha utilizado para identificar varios microorganismos específicos debido a que los genes del ARNr 16S muestran polimorfismos específicos de la especie (Cloud, J. L., H. Neal, R. Rosenberry, C. Y. Turenne, M. Jama, D.

R. Hillyard, y K. C. Carroll. 2002. J. Clin. Microbiol. 40:400-406). Sin embargo, se requieren cultivos puros de bacterias y después de la amplificación mediante PCR la muestra todavía tiene que ser secuenciada o hibridada a un dispositivo de tipo micro-matriz para determinar la especie (Fukushima M, Kakinuma K, Hayashi H, Nagai H, Ito K; Kawaguchi R. J Clin Microbiol. 2003 Jun; 41(6):2605-15). Tales métodos son costosos, requieren tiempo y trabajo intensivo.

Los autores de la presente invención han desarrollado nuevos métodos para la detección de microorganismos que pueden ser adaptados a la detección general o análisis iniciales de escrutinio para cualquier especie microbiana.

Descripción de la invención

En un aspecto general, la presente invención se refiere a la reducción de la complejidad de la determinación básica de un genoma microbiano o de un ácido nucleico mediante el tratamiento del ácido nucleico microbiano con un agente que modifica la citosina y la amplificación del ácido nucleico tratado para producir una forma simplificada del genoma o ácido nucleico.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la simplificación de un genoma microbiano o de un ácido nucleico microbiano que comprende:

tratar el genoma o el ácido nucleico microbianos con un agente que modifica la citosina para formar un ácido nucleico microbiano derivado, y

amplificar el ácido nucleico microbiano derivado para producir una forma simplificada del genoma o del ácido nucleico microbianos.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una molécula de ácido nucleico específica microbiana que comprende:

tratar una muestra que contiene ADN derivado microbiano con un agente que modifica la citosina para formar ácido nucleico microbiano derivado, y

amplificar al menos una parte del ácido nucleico microbiano derivado para formar una molécula de ácido nucleico simplificada que tiene un número total reducido de citosinas en comparación con el correspondiente ácido nucleico microbiano sin tratamiento, en donde la molécula de ácido nucleico simplificada incluye una secuencia de ácido nucleico específica para un microorganismo o un tipo de microorganismo.

En un tercer aspecto, la presente descripción proporciona un método para producir una molécula ácido nucleico específica microbiana que comprende:

obtener una secuencia de ADN de un microorganismo;

formar una forma simplificada de la secuencia de ADN microbiano mediante la realización de una conversión de la secuencia de ADN microbiano, cambiando cada citosina a timina de manera que la forma simplificada del ADN microbiano comprenda sustancialmente las bases adenina, guanina y timina; y

seleccionar una molécula de ácido nucleico específica microbiana a partir de la forma simplificada del ADN microbiano.

En un cuarto aspecto, la descripción proporciona una molécula de ácido nucleico específica microbiana obtenida mediante el método de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención.

En un quinto aspecto, la descripción proporciona el uso del método de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención para obtener sondas o cebadores para unir o amplificar la molécula de ácido nucleico específica microbiana en un ensayo o análisis.

En un sexto aspecto, la descripción proporciona sondas o cebadores obtenidos mediante el quinto aspecto de la presente invención.

La presente invención proporciona un método para detectar la presencia de un microorganismo en una muestra, que comprende:

obtener ADN microbiano a partir de una muestra que se sospecha que contiene el microorganismo;

tratar el ácido nucleico microbiano con un agente que modifica la citosina para formar un ácido nucleico microbiano derivado;

proporcionar cebadores capaces de permitir la amplificación de una molécula de ácido nucleico microbiana específica deseada para el ácido nucleico microbiano derivado;

llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico microbiano derivado para formar un ácido nucleico simplificado, y

analizar la presencia de un producto de ácido nucleico amplificado que contiene la molécula de ácido nucleico microbiana específica deseada, en donde la detección de la molécula de ácido nucleico microbiana específica deseada es indicativa de la presencia del microorganismo en la muestra.

Si el genoma o el ácido nucleico microbiano es ADN, éste se puede tratar para formar un ADN derivado que se amplifica a continuación para formar una forma simplificada de ADN.

Si el genoma o el ácido nucleico microbiano es ARN, éste se puede convertir en ADN antes del tratamiento del genoma o del ácido nucleico microbiano. Alternativamente, el ARN microbiano se puede tratar para producir una molécula de ARN derivada que después se convierte en una molécula de ADN derivada antes de la amplificación. Los métodos de conversión de ARN en ADN son bien conocidos e incluyen el uso de la transcriptasa inversa para formar un ADNc.

El genoma o ácido nucleico microbianos se puede obtener a partir del fago, virus, viroides, bacterias, hongos, algas, protozoos, espiroquetas, o organismo unicelular.

El genoma o ácido nucleico microbianos se pueden seleccionar entre ácido nucleico que codifica una proteína, ácido nucleico que no codifica una, las regiones de genes ribosomales de procariotas o de microorganismos eucarióticos unicelulares. Preferiblemente, las regiones de genes ribosomales son 16S o 23S en procariotas y 18S y 28S en el caso de los microorganismos eucarióticos unicelulares. El agente se puede seleccionar entre bisulfito, acetato o citrato. Preferiblemente, el agente es bisulfito de sodio.

Preferiblemente, el agente modifica una citosina a un uracilo en cada hebra del ADN genómico microbiano de doble hebra complementario formando dos moléculas de ácido nucleico microbiano derivadas, pero no complementarias. En una forma preferida, la citosina no está metilada como se encuentra típicamente en el ácido nucleico microbiano.

Preferiblemente, el ácido nucleico microbiano derivado tiene un número total reducido de citosinas en comparación con el genoma o ácido nucleico microbianos no tratados correspondientes.

Preferiblemente, la forma simplificada del genoma o ácido nucleico microbianos tiene un número total reducido de citosinas en comparación con el genoma o ácido nucleico microbianos no tratados correspondientes.

En una forma preferida, el ácido nucleico microbiano derivado contiene sustancialmente bases adenina (A), guanina (G), timina (T) y uracilo (U) y tiene sustancialmente el mismo número total de bases que el genoma o ácido nucleico microbianos no tratados correspondientes.

En otra forma preferida, la forma simplificada del genoma o ácido nucleico microbianos se compone sustancialmente de las bases adenina (A), guanina (G) y timina (T).

Preferiblemente, la amplificación se lleva a cabo mediante cualquier medio adecuado tal como reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación isotérmica, o amplificación de la señal.

El método de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención puede comprender adicionalmente:

detectar la molécula de ácido nucleico específica microbiana.

En una forma preferida, la molécula de ácido nucleico específica microbiana se detecta:

proporcionando un ligando detector capaz de unirse a una región diana de la molécula de ácido nucleico específica microbiana y dejando tiempo suficiente para que el ligando detector se una a la región diana e; y

midiendo la unión del ligando detector a la región diana para detectar la presencia de la molécula de ácido nucleico específica microbiana.

En otra forma preferida, la molécula de ácido nucleico específica microbiana se detecta mediante la separación de un producto de amplificación y la visualización del producto separado. Preferiblemente, el producto de amplificación se separa mediante electroforesis y se detecta mediante la visualización de una o más bandas en un gel.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico específica microbiana no se produce naturalmente en el microorganismo.

En una forma preferida, la molécula de ácido nucleico específica microbiana tiene una secuencia de ácido nucleico indicativa del nivel taxonómico del microorganismo. El nivel taxonómico del microorganismo incluye, pero no está limitando a, familia, género, especie, cepa, tipo o diferentes poblaciones de las mismas o diferentes poblaciones geográficas o bentónicas.

En una forma preferida del método de acuerdo con tercer aspecto de la presente descripción, se obtienen las formas simplificadas de dos o más secuencias de ADN microbiano y se comparan las dos o más secuencias para obtener al menos una molécula de ácido nucleico específica microbiana.

En una forma preferida de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico se detectan:

proporcionando un ligando detector capaz de unirse a una región de la molécula de ácido nucleico y permitiendo un tiempo suficiente para que el ligando detector se una a la región; y

midiendo la unión del ligando detector a la molécula de ácido nucleico para detectar la presencia de la molécula de ácido nucleico.

En otra forma preferida, las moléculas de ácidos nucleicos se detectan mediante la separación de un producto de amplificación y la visualización del producto separado.

En situaciones en las que el microorganismo no tiene un genoma de ADN o el genoma o ácido nucleico microbianos son ARN, por ejemplo, un virus ARN, el ARN del genoma viral puede ser convertido primero en ADNc con el fin de tratar el ADN con el agente. El ARN también se puede tratar y el ARN derivado se convierte en ADN antes de la amplificación.

Preferiblemente, el ácido nucleico derivado contiene sustancialmente las bases adenina (A), guanina (G), timina (T) y uracilo (U) y tiene sustancialmente el mismo número total de bases que el ácido nucleico microbiano no modificado correspondiente. Es importante destacar que la molécula de ácido nucleico derivado no contiene sustancialmente citosina (C), con la condición de que el ADN microbiano no esté metilado en ninguna de las citosinas.

Preferiblemente, el ácido nucleico derivado amplificado contiene sustancialmente las bases A, T y G y tiene sustancialmente el mismo número total de bases que el correspondiente ácido nucleico derivado (y ácido nucleico microbiano no modificado). El ácido nucleico derivado amplificado se denomina ácido nucleico simplificado.

En una forma preferida, la molécula de ácido nucleico específica microbiana tiene una secuencia de ácido nucleico indicativa del nivel taxonómico del microorganismo. El nivel taxonómico del microorganismo puede incluir familia, género, especie, cepa, tipo o diferentes poblaciones de las mismas o diferentes poblaciones geográficas o bentónicas. En el caso de las bacterias los autores de la presente invención se pueden adherir al esquema generalmente reconocido, por ejemplo Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Neisseria. Las diferentes poblaciones pueden ser polimórficas para cambios de un único nucleótido o una variación que existe en moléculas de ADN que existen en una forma intracelular dentro de un microorganismo (plásmidos o fagémidos), o regiones cromosómicas polimórficas de los genomas de microorganismos tales como islas de patogenicidad.

La presente invención también se puede utilizar para reconocer la fluidez de los genomas microbianos y virales, y se puede utilizar para reconocer la naturaleza quimérica de los genomas virales, que pueden estar en piezas independientes, y por lo tanto surgen cepas recién derivadas de la redistribución de regiones genómicas de diferentes animales, por ejemplo, nuevas cepas de la gripe humana como quimeras de segmentos que son recogidas a partir de otros genomas virales de mamífero o de ave.

Se apreciará que el método puede llevarse a cabo in silico a partir de secuencias conocidas de ácidos nucleicos de los microorganismos en los que una o más citosinas en las secuencias originales se convierte en timina para obtener el ácido nucleico simplificado. La identidad de secuencia se puede determinar a partir de las secuencias convertidas. Tal método in silico imita las etapas de tratamiento y amplificación.

Cuando una molécula de ácido nucleico específica microbiana ha sido obtenida para cualquier microorganismo dado mediante este método, las sondas o cebadores pueden ser diseñados para asegurar la amplificación de la región de interés en una reacción de amplificación. Por lo tanto, cuando se hayan diseñado las sondas o cebadores, será posible llevar a cabo análisis clínicos o científicos sobre las muestras para detectar un microorganismo dado a un nivel taxonómico dado.

La molécula de ácido nucleico específica microbiana puede ser única o tener un alto grado de similitud dentro de un nivel taxonómico. Una ventaja de la presente invención es la capacidad para simplificar en gran medida las diferencias de bases potenciales entre, o dentro de, los niveles taxonómicos, por ejemplo, de un microorganismo, a una molécula única o a moléculas que tienen una íntima similitud de secuencia. Se pueden utilizar cebadores específicos o un número reducido de cebadores degenerados para amplificar la molécula de ácido nucleico específica microbiana en una muestra dada.

Para el ADN de doble hebra que contiene citosinas, la etapa de tratamiento da como resultado dos ácidos nucleicos derivados (uno para cada hebra complementaria), que contienen cada uno las bases adenina, timina guanina y uracilo. Los dos ácidos nucleicos derivados se producen a partir de las dos hebras sencillas del ADN de doble hebra. Los dos ácidos nucleicos derivados preferiblemente no tienen citosinas pero todavía tienen el mismo número total de bases y la longitud de secuencia que la molécula de ADN original no tratada. Es importante destacar que los dos ácidos nucleicos derivados no son complementarios entre sí y forman un molde de la hebra superior en inferior para la amplificación. Se pueden utilizar una o más de las hebras como diana para la amplificación para producir la molécula de ácido nucleico simplificada. Durante la amplificación de los ácidos nucleicos derivados, los uracilos en la parte superior (o hebra inferior) se sustituyen por timinas en la correspondiente forma simplificada amplificada de los ácidos nucleicos. A medida que continúa la amplificación, la parte superior (y/o hebra inferior si se amplifica) se diluirá a medida que cada nueva hebra complementaria tenga solamente las bases adenina, guanina, timina.

Se apreciará que este aspecto de la invención también incluye moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias complementarias a la molécula de ácido nucleico específica microbiana, y moléculas de ácidos nucleicos que pueden hibridarse, preferiblemente bajo condiciones restrictivas, con la molécula de ácido nucleico específica microbiana.

En la presente invención se pueden usar sondas o cebadores que son indicativos de tipos representativos de microorganismo que se pueden utilizar para determinar si cualquier microorganismo está presente en una muestra dada. Se pueden usar otras sondas específicas del tipo microbiano para detectar o identificar realmente un tipo, subtipo, variante y genotipo dados de ejemplos de microorganismo.

Cuando una molécula de ácido nucleico específica microbiana se ha obtenido o identificado para cualquier microorganismo dado, se pueden diseñar sondas o cebadores para asegurar la amplificación de la región de interés en una reacción de amplificación. Es importante señalar que ambas hebras de un genoma tratado y convertido de este modo, (en lo sucesivo denominado "ácido nucleico derivado") pueden ser analizadas para el diseño de cebadores, ya que el tratamiento o la conversión conducen a asimetrías de la secuencia, y por lo tanto se requiere diferentes secuencias de cebadores para la detección de las hebras "superior" e "inferior" del mismo locus, (también conocidas como hebras de "Watson" y "Crick"). Por lo tanto, hay dos poblaciones de moléculas, el genoma convertido, tal como existe inmediatamente después de la conversión, y la población de moléculas que resulta después de que el ácido nucleico derivado sea replicado por medios enzimológicos convencionales (PCR) o por métodos tales como amplificación isotérmica. Los cebadores se diseñan típicamente para la hebra superior convertida por conveniencia pero también se pueden generar los cebadores para la hebra inferior. De este modo, será posible llevar a cabo análisis clínicos o científicos sobre las muestras para detectar un microorganismo dado.

Los cebadores o sondas se pueden diseñar para permitir la amplificación de regiones específicas del ácido nucleico derivado. En una forma preferida, los cebadores producen la amplificación de la molécula de ácido nucleico específica microbiana.

Se describen un kit para detectar una molécula de ácido nucleico específica microbiana que comprende los cebadores o sondas de acuerdo con quinto aspecto de la presente descripción junto con uno o más reactivos o componentes para una reacción de amplificación.

Preferiblemente, el microorganismo se selecciona del fago, virus, viroides, bacterias, hongos, algas, protozoos, espiroquetas, organismo unicelular, o cualquier otro microorganismo, por variada que sea su clasificación, tal como el Reino Protista de Margulis, L., et al 1990, Handbook of Protoctista, Jones and Bartlett, Publishers, Boston USA, o microorganismos que están asociados con los seres humanos, tal como se define en Harrisons Principles of Internal Medicine, 12a Edición, editado por J D Wilson et al., McGraw Hill Inc, así como ediciones posteriores. También incluye todos los microorganismos descritos en relación con las condiciones humanas definidas en OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man, www.ncbi.gov.

El microorganismo puede ser un patógeno, una muestra ambiental de origen natural, microorganismo acuático o aéreo, (o un organismo existente o que sea transportado en un medio líquido o gaseoso), ya sea maduro o en forma de esporas, o bien extracelularmente o intracelularmente, o asociado con un forma de vida quimérica, o que existe como ectocomensal entre dos o más formas de vida, tales como un microbio asociado con un liquen, o un microbio asociado con una película bacteriana.

Es posible analizar la presencia de virus o viroides ARN convirtiendo en primer lugar su genoma de ARN en una forma de ADNc a través de la transcripción inversa y modificando después el ADNc por medio del reactivo. Esto supera el problema de cualquier metilación existente en las citosinas en los virus ARN, ya que la transcriptasa inversa copiará éstas como si fueran citosinas regulares.

Preferiblemente, el agente modifica la citosina no metilada a uracilo que a continuación se reemplaza como una timina durante la amplificación del ácido nucleico derivado. Preferiblemente, el agente utilizado para modificar la citosina es bisulfito de sodio. También se pueden utilizar otros agentes que modifican de manera similar la citosina no metilada, pero no la citosina metilada en el método de la invención. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a bisulfito, acetato o citrato. Preferiblemente, el agente es bisulfito de sodio, un reactivo, que en presencia de agua, modifica la citosina a uracilo.

El bisulfito de sodio (NaHSO3) reacciona fácilmente con el enlace doble 5,6 de la citosina para formar un intermedio de reacción de citosina sulfonado que es susceptible de desaminación, y en presencia de agua da lugar a un sulfito de uracilo. Si fuera necesario, el grupo sulfito se puede eliminar en condiciones alcalinas suaves, dando como resultado la formación de uracilo. Por lo tanto, potencialmente todas las citosinas se convertirán en uracilos. Cualquier citosina metilada, sin embargo, no puede ser convertida por el reactivo modificador debido a la protección por metilación.

La presente invención se puede adaptar para ayudar a eludir algunos de los problemas emergentes que se ponen de manifiesto por la enorme variación genómica inesperada entre los productos aislados de la misma especie bacteriana, (2005, Tettelin, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 13950-13955; Genome analysis of multiple pathogenic isolates of Streptococcus agalacticiae: implications for the microbial "pan-genome"). Todos los productos aislados de esta especie bacteriana tienen un genoma "esencial" de genes que codifica proteínas que representa aproximadamente 80% de la reserva de genes, además de un genoma prescindible que consiste en genes que codifican proteínas específicos de la cepa y parcialmente compartidos. Al tratar el gen o los genes 23S presentes dentro de una población bacteriana mediante los métodos de acuerdo con la presente invención, los autores de la invención pueden abordar un componente codificante no proteíco esencial que está presente en todos los productos aislados bacterianos.

La presente invención es adecuada para análisis clínicos, medioambientales, forenses, de guerra bacteriológica o científicos para los microorganismos, en los que es útil la identidad inicial anterior o a nivel de especie, con el fin de determinar primero el grupo general al cual pertenece el organismo. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, el diagnóstico de la enfermedad en cualquier organismo, (ya sea vertebrados, invertebrados, procariotas o eucariotas, por ejemplo, enfermedades de plantas y animales, enfermedades de las fuentes de alimento humano, tales como las piscifactorías y los criaderos de ostras), el escrutinio o el muestreo de fuentes ambientales ya sean naturales o contaminadas, la determinación de la contaminación de cultivos celulares o de huevos fertilizados in vitro para la producción de blastocistos humanos en clínicas de fertilización in vitro o para la cría de animales. Tiene especial trascendencia la detección de microorganismos en entornos forenses o en contextos de guerra biológica.

A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un elemento declarado, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Cualquier discusión de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares que ha sido incluida en la presente memoria tiene únicamente el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. No se debe tomar como una admisión de que cualquiera o todos estos asuntos forman parte de la base de la técnica anterior o eran el conocimiento general común en el campo relevante para la presente invención que existía en Australia antes del desarrollo de la presente invención.

A fin de que la presente invención pueda entenderse más claramente, se describirán las formas de realización preferidas con referencia a los dibujos y ejemplos siguientes.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el alineamiento de parte del gen iga de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae antes y después de la simplificación genómica. Como puede verse, antes de la simplificación genómica, se requerirían un total de 512 combinaciones de sondas para la detección universal de especies de Neisseria (74% de similitud de secuencia), en comparación con sólo 2 combinaciones después de la simplificación para formar ácido nucleico derivado (97% de similitud de secuencia). (El SEQ ID NO aparece en la lista después de cada secuencia).

La Figura 2 muestra el uso de sondas de INA para aumentar aún más la similitud de secuencia de las secuencias simplificadas, ya que las sondas de INA pueden tener de longitud más corta que las sondas de oligonucleótidos convencionales. La combinación del procedimiento de simplificación genómico con sondas de INA permite la selección y el uso de sondas con 100% de similitud de secuencia con la secuencia diana. (El SEQ ID NO aparece en la lista después de cada secuencia).

La Figura 3 muestra la simplificación genómica para diferenciar entre especies estrechamente relacionadas usando alineamientos del gen iga de Neisseria y Haemophilus. Como puede verse, el método de la presente invención permite la simplificación del material genómico con el fin de producir sondas específicas de especie. Además, a pesar de la simplificación del ADN genómico, todavía se permite la diferenciación entre Neisseria y las especies de Haemophilus estrechamente relacionadas. (El SEQ ID NO aparece en la lista después de cada secuencia).

La Figura 4 muestra el alineamiento del gen tuf estreptocócico antes y después de la simplificación genómica en 10 especies diferentes de estreptococos. Antes del tratamiento, se requerirían un total de 12.288 combinaciones de sondas que para el cebador universal del gen tuf. Después de simplificación genómica, solamente se requerirían 64 combinaciones de sondas para la detección universal. Además, la similitud de secuencia antes de la simplificación es sólo de 67,5%, que aumenta a 85% después de la simplificación. (El SEQ ID NO aparece en la lista después de cada secuencia).

La Figura 5 muestra el alineamiento de los genes de la enterotoxina estafilocócica antes y después de la simplificación genómica. Antes de tratamiento con bisulfito, se requerirían un total de 1.536 combinaciones de sondas para el cebador universal del gen de la enterotoxina estafilocócica. Después de la simplificación genómica sólo se requerirían 64 combinaciones de sondas para la detección universal. (El SEQ ID NO aparece en la lista después de cada secuencia).

La Figura 6 muestra el alineamiento del gen de neuraminidasa de Influenza del grupo A y B de diferentes cepas de influenza antes y después de la simplificación genómica. Antes del tratamiento, se requerirían un total de 2.048 combinaciones de sondas para el cebador universal del gen de la neuraminidasa del grupo A y B. Después de simplificación genómica sólo se requerirían 48 combinaciones de sonda para la detección universal. Además, la similitud de secuencia antes de la simplificación es sólo de 50%, que aumenta a 75% después de la simplificación. (El SEQ ID NO aparece en la lista después de cada secuencia).

La Figura 7 muestra el alineamiento del gen VP4 de rotavirus antes y después de la simplificación genómica. Antes del tratamiento, se requerirían un total de 512 combinaciones de sondas para el cebador universal del gen VP4 de rotavirus. Después de simplificación genómica sólo se requerirían 32 combinaciones de sonda para la detección universal. (El SEQ ID NO aparece en la lista después de cada secuencia).

La Figura 8 muestra los productos de amplificación obtenidos mediante PCR a partir de las regiones del gen ribosomal 23S genómicamente simplificadas de bacterias Gram positivas y Gram negativas, detectándose amplicones adecuados como bandas de longitud específica mediante electroforesis en gel de agarosa. La flecha indica el tamaño esperado de los amplicones con relación a los marcadores de tamaño convencionales ejecutados en la calle del marcador, (M). El uso de cebadores específicos para bacterias Gram negativas revela bandas sólo en las seis calles Gram negativas (panel superior). El uso de cebadores específicos para las bacterias Gram positivas revela sólo bandas en las seis calles Gram positivas (panel inferior).

La Figura 9 muestra los productos de amplificación obtenidos mediante PCR a partir de las regiones del gen ribosomal 23S genómicamente simplificadas de E. coli (Calle 1) y K. pneumoniae, (Calle 3). La especificidad de la amplificación se ilustra por la ausencia de productos de amplificación a partir de las 10 especies de bacterias restantes.

La Figura 10 muestra el producto de amplificación obtenido mediante PCR a partir de las regiones del gen ribosomal 23S genómicamente simplificadas usando cebadores específicos para Neisseria.

La Figura 11 muestra el producto de amplificación obtenido mediante PCR a partir de un gen codificante de la proteína de la región genómicamente simplificada del gen recA de E. coli. La especificidad del amplicón se ilustra por la presencia del amplicón recA de E. coli y su ausencia de las otras 11 especies de bacterias.

La Figura 12 muestra los productos de amplificación obtenidos mediante PCR a partir de las regiones del gen ribosomal 23S genómicamente simplificadas usando cebadores específicos para estafilococos.

La Figura 13 muestra los productos de amplificación obtenidos mediante PCR a partir de las regiones del gen ribosomal 23S genómicamente simplificadas usando cebadores específicos para estreptococos.

La Figura 14 muestra los productos de amplificación obtenidos mediante PCR de un gen codificante de la proteína de la región genómicamente simplificada del gen recA de Staphylococcus epidermidis. Las dos bandas (flechas) representan el traslado de amplicones de la primera ronda, (banda superior) y la segunda ronda (banda inferior), amplificaciones de PCR.

La Figura 15 muestra la detección de amplicones utilizando cebadores específicos dirigidos a los genes ribosomales 23S genómicamente simplificados de Chlamydia trachomatis.

La Figura 16 muestra las secuencias de secuencias de ADNr 23S genómicas normales y genómicamente simplificadas de Staphylococcus epidermidis. (El SEQ ID NO aparece en la lista después de cada secuencia).

La Figura 17 muestra las secuencias de secuencias genómicas y genómicamente simplificadas del gen recA de E. coli. (El SEQ ID NO aparece en la lista después de cada secuencia).

Modo de llevar a cabo la invención

Definiciones

El término "simplificación genómica" según se utiliza en la presente memoria significa que el ácido nucleico genómico (o de otro tipo) se modifica pasando de comprender cuatro bases adenina (A), guanina (G), timina (T) y citosina (C) a contener sustancialmente las bases adenina (A), guanina (G), timina (T), pero teniendo todavía sustancialmente el mismo número total de bases.

El término "derivado de ácido nucleico" según se utiliza en la presente memoria significa un ácido nucleico que contiene sustancialmente las bases A, G, T y U (o alguna otra base o entidad de tipo base distinta de A, G o T) y tiene sustancialmente el mismo total número de bases que el correspondiente ácido nucleico microbiano no modificado. Sustancialmente todas las citosinas en el ADN microbiano se habrán convertido en uracilo durante el tratamiento con el agente. Se apreciará que las citosinas alteradas, por ejemplo mediante metilación, no necesariamente pueden ser convertidas en uracilo (o alguna otra base o entidad de tipo base distinta de A, G o T). Como el ácido nucleico microbiano no contiene típicamente citosina metilada (u otras alteraciones de citosina) la etapa tratada convierte preferiblemente todas las citosinas. Preferiblemente, la citosina es modificada a uracilo.

El término "ácido nucleico simplificado" según se utiliza en la presente memoria, significa el producto resultante de ácido nucleico obtenido después de la amplificación del ácido nucleico derivado. El uracilo en el ácido nucleico derivado se remplaza a continuación como una timina (T) durante la amplificación del ácido nucleico derivado para formar la molécula de ácido nucleico simplificada. El producto resultante tiene sustancialmente el mismo número de bases totales que el correspondiente ácido nucleico microbiano no modificado pero está sustancialmente formado por una combinación de tres bases (A, G y T).

El término "secuencia simplificada" según se utiliza en la presente memoria significa la secuencia de ácido nucleico resultante obtenida después de la amplificación del ácido nucleico derivado para formar un ácido nucleico simplificado. La secuencia simplificada resultante tiene sustancialmente el mismo número de bases totales que la correspondiente secuencia de ácido nucleico microbiana no modificada pero está formada sustancialmente por una combinación de tres bases (A, G y T).

El término " secuencia no convertida" según se utiliza en la presente memoria significa la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico microbiano antes del tratamiento y la amplificación. Una secuencia no convertida es típicamente la secuencia del ácido nucleico microbiano de origen natural.

El término "modifica" según se utiliza en la presente memoria significa la conversión de una citosina en otro nucleótido. Preferiblemente, el agente modifica la citosina no metilada a uracilo para formar un ácido nucleico derivado.

El término "agente que modifica la citosina" según se utiliza en la presente memoria significa un agente que es capaz de convertir la citosina en otra entidad química. Preferiblemente, el agente modifica la citosina a uracilo que luego se reemplaza como una timina durante la amplificación del ácido nucleico derivado. Preferiblemente, el agente utilizado para modificar la citosina es bisulfito de sodio. También se pueden utilizar otros agentes que modifican de manera similar la citosina, pero no la citosina metilada en el método de la invención. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a bisulfito, acetato o citrato. Preferiblemente, el agente es bisulfito de sodio, un reactivo, que en presencia de condiciones ácidas acuosas, modifica la citosina a uracilo. El bisulfito de sodio (NaHSO3) reacciona fácilmente con el enlace doble 5,6 de la citosina para formar un intermedio de reacción de citosina sulfonada que es susceptible de desaminación, y en presencia de agua da lugar a un sulfito de uracilo. Si fuera necesario, el grupo sulfito puede ser eliminado en condiciones alcalinas suaves, dando como resultado la formación de uracilo. Por lo tanto, potencialmente todas las citosinas se convertirán en uracilos. Cualquier citosina metilada, sin embargo, puede no ser convertida por el reactivo modificador debido a la protección mediante metilación. Se apreciará que la citosina (o cualquier otra base) podría ser modificada mediante medios enzimáticos para lograr un ácido nucleico derivado tal como se ilustra en la presente invención.

Existen dos métodos genéricos amplios por medio de los cuales se pueden modificar las bases de los ácidos nucleicos: químicos y enzimáticos. Por lo tanto, la modificación de la presente invención también puede llevarse a cabo por enzimas de origen natural, o por enzimas construidas o seleccionadas artificialmente aún por referir. El tratamiento químico, tal como las metodologías con bisulfito, pueden convertir citosina en uracilo mediante etapas químicas adecuadas. De manera similar, las citosina desaminasas, por ejemplo, pueden llevar a cabo una conversión para formar un ácido nucleico derivado. El primer informe sobre citosina desaminasas en el conocimiento de los autores de la presente invención es 1932, Schmidt, G., Z. Physiol. Chem., 208, 185; (véanse también 1950, Wang, T.P., Sable, H.Z., Lampen, J.O., J. Biol. Chem, 184, 17-28, Enzymatic deamination of cytosines nucleosides). En este primer trabajo, no se obtuvo citosina desaminasa libre de otras nucleodesaminasas, sin embargo, Wang et al. fueron capaces de purificar dicha actividad de la levadura y E. coli. Así, cualquier conversión enzimática de la citosina para formar un ácido nucleico derivado que finalmente da como resultado la inserción de una base durante la siguiente replicación en esa posición, que es diferente de una citosina, producirá un genoma simplificado. La conversión química y enzimática para proporcionar un derivado seguido por un genoma simplificado es aplicable a cualquier nucleobase, ya se trate de purinas o pirimidinas en ácidos nucleicos origen natural de microorganismos.

El término "forma simplificada del genoma o ácido nucleico", según se utiliza en la presente memoria significa que un genoma o ácido nucleico, ya sea de origen natural o sintético, que por lo general contiene las cuatro bases comunes G, A, T y C, ahora se compone principalmente de sólo tres bases, G, A y T ya que la mayoría o la totalidad de las C en el genoma se han convertido en T mediante la modificación química adecuada y procedimientos posteriores de amplificación. La forma simplificada del genoma significa que la complejidad genómica relativa se reduce de un fundamento de cuatro bases a una composición de tres bases.

El término «entidad de tipo base» según se utiliza en la presente memoria, significa una entidad que se forma por la modificación de la citosina. Una entidad de tipo base puede ser reconocida por una ADN polimerasa durante la amplificación de un ácido nucleico derivado y la polimerasa hace que A, G o T se coloquen sobre la hebra ADN complementaria recién formada en la posición opuesta a la entidad de tipo base en el ácido nucleico derivado. Típicamente, la entidad de tipo base es el uracilo que ha sido modificado a partir de la citosina al correspondiente ácido nucleico microbiano no tratado. Los ejemplos de una entidad de tipo base incluye cualquier nucleobase, ya sea purina o pirimidina.

El término "reducción de la complejidad relativa", según se utiliza en la presente memoria , hace referencia a la longitud de la sonda, a saber, el aumento de la longitud media de la sonda que se requiere para lograr la misma especificidad y nivel de hibridación de una sonda a un locus específico, en un conjunto dado de condiciones moleculares en dos genomas del mismo tamaño, donde el primer genoma es "tal cual" y consiste en las cuatro bases, G, A, T y C, mientras que el segundo genoma es exactamente de la misma longitud, pero algunas citosinas, (idealmente todas las citosinas), se han convertido en timinas. El locus sometido a ensayo está en la misma ubicación en el genoma original no convertido, así como el genoma convertido. Por término medio, una sonda de 11 unidades tendrá una ubicación única a la que se hibridará perfectamente en un genoma regular de 4.194.304 bases consistentes en las cuatro bases G, A, T y C, (411 es igual a 4.194.304). Sin embargo, una vez que dicho genoma regular de 4.194.304 bases ha sido convertido por el bisulfito u otros medios adecuados, este genoma convertido se compone ahora solamente de tres bases y es claramente menos complejo. Sin embargo, la consecuencia de esta disminución de la complejidad genómica es que la sonda de los autores de la presente invención previamente de 11 unidades única ya no tiene un sitio único al que se puede hibridar dentro del genoma simplificado. Ahora hay muchas otras posibles localizaciones equivalentes de secuencias de 11 bases que se han presentado de novo como consecuencia de la conversión con bisulfito. Ahora se requerirá una sonda de 14 unidades para encontrar e hibridarse con el locus original. Aunque en un principio puede parecer contrario al sentido común, se requiere de este modo un aumento de la longitud de la sonda para detectar la ubicación original en lo que es ahora un genoma de tres bases simplificado, puesto que más genoma parece el mismo, (tiene secuencias más similares). Así, la reducida complejidad genómica relativa, (o simplicidad del genoma de tres bases), significa que se tienen que diseñar sondas más largas para encontrar el único sitio original.

El término "reducción de la complejidad genómica relativa" según se utiliza en la presente memoria se puede medir por medio del aumento de las longitudes de las sonda susceptibles de ser específicas de microbio en comparación con el ADN no modificado. Este término también incorpora el tipo de secuencias de sondas que se utilizan en la determinación de la presencia de un microorganismo. Estas sondas pueden tener cadenas principales no convencionales, tales como las de PNA o LNA o adiciones modificadas a una cadena principal tales como las descritas en el INA. Por lo tanto, se considera que un genoma tiene una complejidad relativa reducida, con independencia de si la sonda tiene componentes adicionales tales como pseudonucleótidos intercalantes, tal como en el INA. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, ADN, ARN, ácido nucleico cerrado (LNA), ácido peptidonucleico (PNA), MNA, ácido nucleico altritol (ANA), ácido nucleico hexitol (HNA), ácido nucleico intercalante (INA), ácido nucleico ciclohexanilo (CNA) y mezclas de los mismos y sus híbridos, así como las modificaciones de átomo de fósforo de los mismos, tales como, pero no limitadas a fosforotioatos, fosfolatos de metilo, fosforamiditas, fosforoditiatos, fosforoselenoatos, fosfotriésteres y fosfoboranoatos. Los nucleótidos de origen no natural incluyen, pero no están limitados a los nucleótidos comprendidos dentro de ADN, ARN, PNA, INA, HNA, MNA, ANA, LNA, CNA, CeNA, TNA, (2'-NH)-TNA, (3'- NH)-TNA, a-L-Ribo-LNA, a-L-Xilo-LNA, �-D-Xilo-LNA, a-D-Ribo-LNA, [3,2,1]-LNA, Biciclo-ADN, 6-Amino-Biciclo-ADN, 5-epi-Biciclo-ADN, a-Biciclo-ADN, ADN-Triciclo, Biciclo[4,3,0]-ADN, Biciclo[3,2,1]-ADN, Biciclo[4,3,0]amida-ADN, �-D-Ribopiranosil-NA, a-L-Lixopiranosil-NA, 2'-R-ARN, a-L-ARN o a-D-ARN, �-D-ARN. Además se pueden usar compuestos que no contienen fósforo para la unión a los nucleótidos tales como, pero no limitados a metiliminometilo, formacetato, tioformacetato y grupos de unión que comprenden amidas. En particular, los ácidos nucleicos y análogos de ácido nucleico pueden comprender uno o más pseudonucleótidos intercalantes (IPN). La presencia de IPN no es parte de la descripción de la complejidad de las moléculas de ácido nucleico, ni es la parte central de esa complejidad, tal como en PNA.

Por "INA" se quiere significar un ácido nucleico intercalante de acuerdo con la enseñanza de los documentos WO 03/051901, WO 03/052132, WO 03/052133 y WO 03/052134 (Unest A/S). Un INA es un oligonucleótido o un análogo de oligonucleótido que comprende una o más moléculas de pseudonucleótidos intercalantes (IPN).

Por "HNA" se quieren significar ácidos nucleicos como describen por ejemplo Van Aetschot et al., 1995.

Por "MNA" se quieren significar ácidos nucleicos como describen Hossain et al, 1998.

"ANA" hace referencia a los ácidos nucleicos descritos por Allert et al, 1999.

"LNA" puede ser cualquier molécula de LNA como se describe en el documento WO 99/14226 (Exiqon), Preferiblemente, el LNA se selecciona entre las moléculas descritas en el resumen del documento WO 99/14226. Más preferiblemente, el LNA es un ácido nucleico como describen Singh et al, 1998, Koshkin et al, 1998 u Obika et al., 1997.

"PNA" hace referencia a ácidos peptidonucleicos, como describen Nielsen et al, 1991.

"Reducción de la complejidad relativa" según se utiliza en la presente memoria, no hace referencia al orden en el que aparecen las bases, tal como cualquier diferencia de complejidad matemática entre una secuencia que es ATATATATATATAT (SEQ ID NO: 1) frente a una de la misma longitud que es AAAAAAATTTTTTT (SEQ ID NO: 2), ni tampoco hace referencia a los datos de re-asociación original de los tamaños relativos del genoma, (y por inferencia, las complejidades genómicas), introducidos en las publicaciones científicas por Waring, M. & Britten RJ1966, Science, 154, 791-794; y Britten, RJ y Kohne D E., 1968, Science, 161, 529-540 y referencias anteriores de las mismas que se derivan de los informes de la Carnegie Institution of Washington Yearbook.

"Complejidad genómica relativa" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a una posición inalterada de bases en dos genomas a la que se accede por medio de sondas moleculares (tanto los genomas originales como los no convertidos tienen bases en las posiciones invariantes 1 a n. En el caso del genoma humano haploide de 3 mil millones de pares de bases de una hembra humana concreta, se define que las posiciones invariables están entre 1 y n, donde n es 3000000000. Si en la secuencia de 1 a n, la base iª es una C en el genoma original, la base iª es una T en el genoma convertido.

El término "ácido nucleico genómico" según se utiliza en la presente memoria incluye ARN (de procariota y eucariota unicelular), ADN, ácido nucleico que codifica proteínas, ácido nucleico que no codifica proteínas, y regiones de genes ribosomales de microorganismos procarióticos y eucarióticos unicelulares microbianos.

El término "genoma microbiano" según se utiliza en la presente memoria abarca ácidos nucleicos cromosómicos así como extracromosómicos, así como residentes temporales de ese genoma, tales como plásmidos, bacteriófagos y elementos móviles en el sentido más amplio. El "genoma" tiene un componente esencial como se ilustra mediante S. galactiae, así como también tiene posiblemente elementos codificantes y no codificantes que varían entre los distintos productos aislados.

El término "ADN microbiano derivado", según se utiliza en la presente memoria incluye ADN obtenido directamente a partir de un microorganismo u obtenido indirectamente mediante la conversión de ARN microbiano en ADN mediante cualquier método conocido o adecuado, tal como la transcriptasa inversa.

El término "microorganismo", según se utiliza en la presente memoria incluye fagos, virus, viroides, bacterias, hongos, algas, protozoos, espiroquetas, organismos unicelulares, o cualquier otro microorganismo, por variada que sea su clasificación, tal como el Reino Protista de Margulis, L., et al 1990, Handbook of Protoctista, Jones and Bartlett, Publishers, Boston USA, o microorganismos que están asociados con los seres humanos, tal como se define en Harrisons Principles of Internal Medicine, 12a Edición, editado por J D Wilson et al., McGraw Hill Inc, así como ediciones posteriores. También incluye todos los microorganismos descritos en relación con las condiciones humanas definidas en OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man, www.ncbi.gov.

El término "molécula de ácido nucleico específica microbiana" según se utiliza en la presente memoria significa una molécula que ha sido determinada u obtenida utilizando el método de acuerdo con la presente invención que tiene una o más secuencias específicas para un microorganismo.

El término "nivel taxonómico del microorganismo", según se utiliza en la presente memoria incluye familia, género, especie, cepa, tipo o diferentes poblaciones de las mismas o diferentes poblaciones geográficas o bentónicas. Si bien en el caso de las bacterias se utiliza el esquema generalmente reconocido, por ejemplo Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Neisseria. Las diferentes poblaciones pueden ser polimórficas para cambios de un único nucleótido o una variación que existe en moléculas de ADN que existen en una forma intracelular dentro de un microorganismo (plásmidos o fagémidos), o regiones cromosómicas polimórficas de los genomas de microorganismos tales como islas de patogenicidad. La fluidez de los genomas microbianos y virales, es reconocida, e incluye la naturaleza quimérica de los genomas virales, que pueden estar en piezas independientes de ácido nucleico. Por lo tanto surgen cepas recién derivadas de la redistribución de regiones genómicas de diferentes animales, por ejemplo, nuevas cepas de la gripe humana como quimeras de segmentos que son recogidas a partir de otros genomas virales de mamífero o de ave.

El término "íntima similitud de secuencia " según se utiliza en la presente memoria incluye la definición anterior de complejidad relativa de secuencia y longitudes de sonda como una medida.

Materiales y métodos

Extracción de ADN

En general, el ADN microbiano (o ARN viral) se puede obtener de cualquier fuente adecuada. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, cultivos de células, caldos de cultivo, muestras ambientales, muestras clínicas, fluidos corporales, muestras líquidas, muestras sólidas tales como tejido. El ADN microbiano de las muestras se puede obtener mediante procedimientos convencionales. Un ejemplo de una extracción adecuada es el siguiente. La muestra de interés se coloca en 400 μl de hidrocloruro de guanidinio 7 M, EDTA 5 mM, Tris/HCl 100 mM pH 6,4, Triton-X-100 al 1%, proteinasa K (Sigma) 50 mM, ARNt de levadura de 100 μg/ml. La muestra se homogeneiza a fondo con una mano de mortero desechable de 1,5 ml y se deja durante 48 horas a 60°C. Después de la incubación la muestra se somete a cinco ciclos de congelación/descongelación en hielo seco durante 5 minutos/95°C durante 5 minutos. La muestra se somete después a vórtice y se centrifuga en una microcentrífuga durante 2 minutos para sedimentar los residuos celulares. Se elimina el sobrenadante en un tubo limpio, se diluye para reducir la concentración de sal, después se extrae con fenol:cloroformo, se precipita con etanol y se resuspende en 50 μl de Tris 10 mM/EDTA 0,1 mM.

Específicamente, las extracciones de ADN a partir de bacterias Gram positivas y Gram negativas cultivadas en placas de agar convencionales (con los requerimientos nutricionales específicos para cada especie) se realizaron como sigue.

Para la extracción de ADN a partir de bacterias gram negativas, el protocolo fue el siguiente:

a) Utilizando un palillo de dientes estéril se desprendieron las colonias bacterianas de la placa de cultivo en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml.

b) Se añadieron 180 μl de tampón de extracción de tiocianato de guanidinio (tiocianato de guanidinio 7 M, EDTA 5 mM (pH 8,0), Tris/HCl 40 mM pH 7,6, Triton-X-100 al 1%) y la muestra se mezcló para resuspender las colonias bacterianas.

c) Se añadieron 20 μl (20 mg/ml) de proteinasa K y las muestras se mezclaron bien.

d) Las muestras se incubaron a 55°C durante 3 horas para lisar las células.

e) Se añadieron 200 μl de agua a cada muestra y las muestras se mezclaron pipeteando suavemente.

f) Se añadieron 400 μl de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y las muestras se sometieron a vórtice durante 2 x 15 segundos.

g) Las muestras se centrifugaron a continuación en una microcentrífuga a 14.000 rpm durante 4 minutos.

h) La fase acuosa se separó en un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml.

i) Se añadieron 400 μl de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y las muestras se sometieron a vórtice durante 2 x 15 segundos.

j) Las muestras se centrifugaron a continuación en una microcentrífuga a 14.000 rpm durante 4 minutos.

k) La fase acuosa se separó en un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml.

l) Se añadieron 800 μl de etanol del 100% a cada muestra, la muestra se sometió a vórtice brevemente, después se dejó a –20°C durante 1 hora.

m) Las muestras se centrifugaron en una microcentrífuga a 14.000 rpm durante 4 minutos a 4°C.

n) Los sedimentos de ADN se lavaron con 500 μl de etanol del 70%.

o) Las muestras se centrifugaron en una microcentrífuga a 14.000 rpm durante 5 minutos a 4°C, el etanol se descartó y los sedimentos se secaron al aire durante 5 minutos.

p)Por último, el ADN se resuspendió en 100 μl de Tris/HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM pH 8,0.

q)La concentración y la pureza del ADN se calcularon midiendo la absorbancia de la disolución a 230, 260, 280 nm. Para la extracción de ADN de las bacterias Gram positivas el protocolo fue el siguiente: a) Utilizando un palillo de dientes estéril se desprendieron colonias bacterianas de la placa de cultivo en un

tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml.

b) Se añadieron 180 μl de lisozima de 20 mg/ml (Sigma) y 200 μg de lisostafina (Sigma) a cada muestra y las muestras se mezclaron suavemente para resuspender las colonias bacterianas. c)Las muestras se incubaron a 37°C durante 30 minutos para degradar la pared celular. d) Las muestras se procesaron a continuación y se extrajo el ADN de acuerdo con el protocolo QIAamp DNA

Mini Kit para bacterias Gram positivas. Extracción de ADN de muestras de citología de pacientes. a) La muestra se agitó enérgicamente a mano para volver a suspender las células sedimentadas y para garantizar la homogeneidad de la disolución. b)Se transfirieron 4 ml de las células resuspendidas a un tubo de centrífuga Costar de 15 ml. c) Los tubos se centrifugaron en un rotor de cubeta oscilante a 3000 xg durante 15 minutos. d) El sobrenadante se decantó cuidadosamente y se desechó sin alterar el material celular sedimentado. e) Las células sedimentadas se resuspendieron en 200 μl de tampón de lisis (Tris/HCl 100 mM pH 8,0, EDTA 2 mM

pH 8,0, SDS al 0,5%, Triton-X-100 al 0,5%) y se mezclaron bien hasta que la disolución fue homogénea. f) Se transfirieron 80 μl de la muestra a una placa de preparación de la muestra de 96 pocillos. g)Se añadieron 20 μl de proteinasa K y la disolución se incubó a 55°C durante 1 hora (este procedimiento da como

resultado la lisis celular) Extracción de ADN de muestras de orina Se extrajo el ADN a partir de un volumen de partida de 1 ml de orina de acuerdo con QIAamp UltraSens™ Virus

Handbook. Tratamiento con bisulfito de las muestras de ADN El tratamiento con bisulfito se realizó según el kit de modificación con bisulfito MethylEasy™ High Throughput DNA

(Human Genetic Signatures, Australia) véase también más adelante. Sorprendentemente, los autores de la presente invención han encontrado que no hay necesidad de separar el ADN microbiano de otras fuentes de ácidos nucleicos, por ejemplo cuando hay ADN microbiano en una muestra de células humanas. La etapa de tratamiento se puede utilizar para una gran mezcla de tipos diferentes de ADN y, sin embargo se puede identificar todavía mediante la presente invención un ácido nucleico específico microbiano. Se

estima que los límites de detección en una mezcla compleja de ADN son los límites de la detección mediante PCR convencional que pueden deberse a una única copia de una molécula de ácido nucleico diana. Muestras Se puede utilizar cualquier muestra adecuada para la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero no están

limitados a, cultivos microbianos, muestras clínicas, muestras veterinarias, fluidos biológicos, muestras de cultivo de tejidos, muestras ambientales, muestras de agua, efluentes. Como la presente invención es adaptable para la detección de cualquier microorganismo, esta lista no debe considerarse exhaustiva.

Kits La presente descripción se puede implementar en forma de diferentes kits, o combinaciones de kits e instanciar en términos de plataformas manuales, semiautomáticas o completamente robóticas. En una forma preferida, los kits MethylEasy™ o High Throughput MethylEasy™ (Human Genetic Signatures Pty Ltd., Australia) permiten la conversión de ácidos nucleicos en placas 96 o 384 utilizando una plataforma robótica tal como epMotion.

Tratamiento con bisulfito

Un protocolo ilustrativo para el tratamiento eficaz de ácido nucleico con bisulfito se expone a continuación. El protocolo da como resultado la conservación sustancialmente de todo el ADN tratado. Este método también se denomina en la presente memoria método Human Genetic Signatures (HGS). Se apreciará que se pueden variar los volúmenes o cantidades de las muestras o de los reactivos.

El método preferido para el tratamiento con bisulfito se pueden encontrar en la Patente de los Estados Unidos US 2004219539 o el documento WO 2004096825.

A 2 μg de ADN, que pueden ser pre-digeridos con enzimas de restricción adecuadas si se desea, se les añadieron 2 μl (1/10 volumen) de NaOH 3 M (6 g en 50 ml de agua, recién elaborado), en un volumen final de 20 μl. Esta etapa desnaturaliza las moléculas de ADN de doble hebra a una forma de cadena sencilla, ya que el reactivo de bisulfito preferiblemente reacciona con las moléculas de hebra sencilla. La mezcla se incubó a 37°C durante 15 minutos. Se puede utilizar la incubación a temperaturas por encima de la temperatura ambiente para mejorar la eficacia de la desnaturalización.

Después de la incubación, se añadieron sucesivamente 208 μl de metabisulfito de sodio 2 M (7,6 g en 20 ml de agua con 416 ml de NaOH 10 N; BDH AnalaR Núm. 10356.4D; recién elaborado) y 12 μl de Quinol 10 mM (0,055 g en 50 ml de agua, BDH AnalR Núm. 103122E; recién elaborado). El quinol es un agente reductor y ayuda a reducir la oxidación de los reactivos. También se pueden utilizar otros agentes reductores, por ejemplo, ditiotreitol (DTT), mercaptoetanol, quinona (hidroquinona), u otros agentes reductores adecuados. La muestra se cubrió con 200 μl de aceite mineral. La superposición de aceite mineral evita la evaporación y la oxidación de los reactivos pero no es esencial. La muestra se incubó durante la noche a 55°C. Alternativamente, las muestras se pueden someter a ciclos en un termociclador de la siguiente manera: incubar durante aproximadamente 4 horas o durante la noche como sigue: Etapa 1, ciclación a 55°C/2 hr en la máquina de PCR; Etapa 2, 95°C/2 min. La etapa 1 se puede realizar a cualquier temperatura de aproximadamente 37°C a aproximadamente 90°C y su duración puede variar de 5 minutos a 8 horas. La etapa 2 se puede realizar a cualquier temperatura de aproximadamente 70°C a aproximadamente 99°C y su duración puede variar de aproximadamente 1 segundo a 60 minutos, o más.

Después del tratamiento con metabisulfito de sodio, el aceite se retiró, y se añadieron 1 μl de ARNt (20 mg/ml) o 2 μl de glucógeno si la concentración de ADN era baja. Estos aditivos son opcionales y se pueden utilizar para mejorar el rendimiento de ADN obtenido mediante coprecipitación con el ADN diana, especialmente cuando el ADN está presente a bajas concentraciones. Se desea generalmente el uso de aditivos como vehículo para una precipitación más eficaz de los ácidos nucleicos cuando la cantidad de ácido nucleico es < 0,5 μg.

Se realizó un tratamiento de limpieza con isopropanol como sigue: se añadieron 800 μl de agua a la muestra, se mezcló y después se añadió 1 ml de isopropanol. El agua o tampón reduce la concentración de la sal de bisulfito en el recipiente de reacción a un nivel en el que la sal no precipitará junto con el ácido nucleico diana de interés. La dilución es generalmente de aproximadamente 1/4 a 1/1000, siempre y cuando la concentración de sal se diluya por debajo de un intervalo deseado, como se describe en la presente memoria.

La muestra se mezcló de nuevo y se dejó a 4°C durante un mínimo de 5 minutos. La muestra se centrifugó en una microcentrífuga durante 10-15 minutos y el sedimento se lavó 2x con EtOH del 70%, sometiendo a vórtice cada vez. Este tratamiento de lavado elimina las sales residuales que precipitaron con los ácidos nucleicos.

El sedimento se dejó secar y después se resuspendió en un volumen adecuado de T/E (Tris 10 mM/ EDTA 0,1 mM) pH 7,0-12,5 tal como 50 μl. Se ha encontrado que el tampón a pH 10,5 es particularmente eficaz. La muestra se incubó a 37°C a 95°C durante 1 min a 96 horas, según sea necesario para suspender los ácidos nucleicos.

Otro ejemplo de tratamiento con bisulfito se puede encontrar en el documento WO 2005021778 que proporciona métodos y materiales para la conversión de citosina en uracilo. En algunas realizaciones, un ácido nucleico, tal como ADNg, se hace reaccionar con bisulfito y un catalizador de poliamina, tal como una triamina o tetra-amina. Opcionalmente, el bisulfito comprende bisulfito de magnesio. En otras realizaciones, un ácido nucleico se hace reaccionar con bisulfito de magnesio, opcionalmente en presencia de un catalizador de poliamina y/o un catalizador de amina cuaternaria. También se proporcionan kits que se pueden utilizar para llevar a cabo los métodos de la invención. Se apreciará que estos métodos también serían adecuados para la presente invención en la etapa de tratamiento.

Amplificación

Las amplificaciones mediante PCR se realizaron en mezclas de reacción de 25 μl que contenían 2 μl de ADN genómico tratado con bisulfito, utilizando la mezcla maestra Promega PCR, 6 ng/μl de cada uno de los cebadores. Se utilizan cebadores anidados específicos de la hebra para la amplificación. Se llevaron a cabo amplificaciones de PCR de 1a ronda usando los cebadores de PCR 1 y 4 (véase más abajo). Después de la 1a ronda de amplificación, se transfirió 1 1l del material amplificado a premezclas para la 2a ronda de PCR que contenían los cebadores de PCR 2 y 3 y se amplificaron como se ha descrito previamente. Las muestras de los productos de PCR se amplificaron en un termociclador ThermoHybaid PX2 en las condiciones: 1 ciclo de 95°C durante 4 minutos, seguido de 30 ciclos de 95°C durante 1 minuto, 50°C durante 2 minutos y 72°C durante 2 minutos; 1 ciclo de 72°C durante 10 minutos.

Amplificación múltiplex

Si se requiere la amplificación múltiplex para la detección, se puede llevar a cabo la siguiente metodología.

Se añade 1 μl de ADN tratados con bisulfito a los siguientes componentes en un volumen de reacción de 25 μl, x1 mezcla maestra Qiagen múltiplex, 5-100 ng de cada INA o cebador de oligonucleótido de 1a ronda, MgSO4 1,5 a 4,0

10 mM, 400 μM de cada dNTP y 0,5-2 unidades de la mezcla de polimerasa. Los componentes se someten a ciclos en un termociclador con tapa caliente como sigue. Típicamente puede haber hasta 200 secuencias de los cebadores individuales en cada reacción de amplificación

Etapa 1

94°C 15 minutos 1 ciclo

Etapa 2

94°C 1 minuto

50°C

3 minutos 35 ciclos

68°C

3 minutos

Etapa 3

68°C 10 minutos 1 ciclo

A continuación se realiza una segunda ronda de amplificación sobre una alícuota de 1 μl de la primera ronda de

15 amplificación que se transfiere a un tubo de reacción para la segunda ronda que contiene la mezcla de reacción de la enzima y cebadores de la segunda ronda apropiados. La ciclación se realiza a continuación como se ha descrito anteriormente.

Cebadores

Se pueden utilizar cualquier cebador de PCR adecuado para la presente invención. Un cebador tiene típicamente

20 una secuencia complementaria a una secuencia que será amplificada. Los cebadores son típicamente oligonucleótidos, pero pueden ser análogos de oligonucleótidos.

Sondas

La sonda puede ser cualquier molécula de ácido nucleico o análogo de ácido nucleico adecuada. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, ADN, ARN, ácido nucleico cerrado (LNA), ácido peptidonucleico (PNA), MNA, 25 ácido altritol nucleico (ANA), ácido hexitol nucleico (HNA), ácido nucleico intercalante (INA), ácido nucleico ciclohexanilo (CNA) y mezclas de los mismos y sus híbridos, así como las modificaciones del átomo fósforo de los mismos, tales como, pero no limitados a fosforotioatos, metilfosfolatos, fosforamiditas, fosforoditiatos, fosforoselenoatos, fosfotriésteres y fosfoboranoatos. Los nucleótidos de origen no natural incluyen, pero no están limitados a los nucleótidos comprendidos en ADN, ARN, PNA, INA, HNA, MNA, ANA, LNA, CNA, CeNA, TNA, (2'30 NH)-TNA, (3'-NH)-TNA, a-L-Ribo-LNA, a-L-Xilo-LNA, �-D-Xilo-LNA, a-D-Ribo-LNA, [3,2,1]-LNA, Biciclo-ADN, 6Amino-Biciclo-ADN, 5-epi-Biciclo-ADN, a-Biciclo-ADN, Triciclo-ADN, Biciclo[4,3,0]-ADN, Biciclo[3,2,1]-ADN, Biciclo[4,3,0]amida-ADN, �-D-Ribopiranosil-NA, a-L-Lixopiranosil-NA, 2'-R-ARN, a-L-ARN o a-D-ARN, �-D-ARN. Además se pueden utilizar compuestos que no contienen fósforo para conectar nucleótidos tales como, pero no limitados a metiliminometilo, formacetato, tioformacetato y grupos conectores que comprenden amidas. En particular,

35 los ácidos nucleicos y análogos de ácido nucleico puede comprender uno o más pseudonucleótidos intercalantes.

Preferiblemente, las sondas son ADN u oligonucleótidos de ADN que contienen uno o más IPN internos que forman INA.

Electroforesis

La electroforesis de las muestras se realizó de acuerdo con la guía para el usuario del sistema E-gel (www.invitrogen.doc).

Métodos de detección

Existen numerosos sistemas de detección posibles para determinar el estado de la muestra deseada. Se apreciará que para la presente invención se podría utilizar cualquier sistema o método conocidos para la detección de moléculas de ácido nucleico. Los sistemas de detección incluyen, pero no están limitados a:

I. La hibridación de ADN marcado adecuadamente a un dispositivo de tipo micro-matriz que podría seleccionar 10 - 200.000 componentes individuales. Las matrices se podrían componer de INA, PNA o nucleótidos

o matrices de de nucleótidos modificados en cualquier superficie sólida adecuada tal como vidrio, plástico, mica, nailon, cuentas, cuentas magnéticas, cuentas fluorescentes o membranas;

II. Sistemas de detección de tipo transferencia Southern;

III.Sistemas de detección mediante PCR convencional tales como gel de agarosa, lecturas fluorescentes tales como el análisis GeneScan. Análisis de hibridación sándwich, reactivos de tinción de ADN, tales como bromuro de etidio, Sybr Green, detección con anticuerpos, dispositivos del tipo lector de placa ELISA, dispositivos fluorímétricos;

IV. Cuantificación mediante PCR en tiempo real de fragmentos genómicos amplificados específicos o múltiples

o cualquiera de sus variaciones.

V.

Cualquiera de los sistemas de detección esbozados en el documento WO 2004/065625 tales como cuentas fluorescentes, productos conjugados enzimáticos, cuentas radiactivas y similares;

VI. Cualquier otro sistema de detección que utilice una etapa de amplificación tal como la reacción en cadena de la ligasa o tecnologías de amplificación isotérmica de ADN tales como la Amplificación de Desplazamiento de Hebra (SDA).

VII.Múltiples sistemas de detección multi-fotón.

VIII.Electroforesis y visualización en geles.

IX.Cualquier plataforma de detección utilizada o que se pudiera utilizar para detectar ácido nucleico.

Ácidos nucleicos intercalantes

Los ácidos nucleicos intercalantes (INA) son polinucleótidos de origen no natural que pueden hibridarse a ácidos nucleicos (ADN y ARN) con especificidad de secuencia. Los INA son candidatos como alternativas/sustitutos de sondas de ácidos nucleicos en los análisis de hibridación basados en sondas debido a que exhiben varias propiedades deseables. Los INA son polímeros que se hibridan con ácidos nucleicos para formar híbridos que son termodinámicamente más estables que los correspondiente complejos ácido nucleico/ácido nucleico de origen natural. No son substratos para enzimas que se sabe que degradan péptidos o ácidos nucleicos. Por lo tanto, los INA debe ser más estables en muestras biológicas, así como, tener una mayor vida útil que los fragmentos de ácido nucleico de origen natural. A diferencia de la hibridación de ácidos nucleicos que es muy dependiente de la fuerza iónica, la hibridación de un INA con un ácido nucleico que es bastante independiente de la fuerza iónica y se ve favorecida por la baja fuerza iónica en condiciones que desfavorecen fuertemente la hibridación de ácido nucleico natural a ácido nucleico. La fuerza de unión de INA depende del número de grupos intercalantes diseñados en la molécula, así como de las interacciones habituales de los enlaces de hidrógeno entre las bases apiladas de una manera específica en una estructura de doble hebra. La discriminación secuencia es más eficaz para el INA que reconoce ADN que para el ADN que reconoce ADN.

Preferiblemente, el INA es la fosforamidita de (S)-1-O-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-3-O-(1-pirenilmetil)-glicerol.

Los INA se sintetizan mediante la adaptación de procedimientos de síntesis de oligonucleótidos convencionales en un formato que está disponible comercialmente. La definición completa de INA y sus síntesis se pueden encontrar en los documentos WO 03/051901, WO 03/052132, WO 03/052133 y WO 03/052134 (Unest A/S).

Existen en efecto muchas diferencias entre las sondas de INA y las sondas de ácido nucleico convencionales. Estas diferencias se pueden ser dividir convenientemente en diferencias biológicas, estructurales y fisicoquímicas. Como se discute anteriormente y a continuación, estas diferencias biológicas, estructurales y fisicoquímicas pueden dar lugar a resultados impredecibles cuando se intentan utilizar sondas de INA en aplicaciones en las que se han empleado tradicionalmente ácidos nucleicos. Esta no equivalencia de composiciones diferentes se observa con frecuencia en las técnicas químicas.

Con respecto a las diferencias biológicas, los ácidos nucleicos son materiales biológicos que desempeñan un papel central en la vida de las especies vivas como agentes de transmisión y expresión genética. Sus propiedades in vivo se conocen bastante bien. El INA, sin embargo, es una molécula desarrollada recientemente totalmente artificial, concebida en la mente de los químicos y elaborada utilizando la química orgánica sintética. No tiene ninguna función biológica conocida.

Estructuralmente, el INA también difiere radicalmente de los ácidos nucleicos. Aunque ambos pueden emplear nucleobases comunes (A, C, G, T y U), la composición de estas moléculas es estructuralmente diversa. Las cadenas principales de ARN, ADN e INA se componen de unidades de ribosa y 2-desoxirribosa con enlace fosfodiéster. Los INA difieren de los ADN o ARN en que tienen una o más moléculas grandes planas unidas a través de una o varias molécula conectoras al polímero. Las moléculas planas se intercalan entre las bases en la hebra de ADN complementaria frente al INA en una estructura de doble hebra.

Las diferencias físico/químicas entre INA y ADN o ARN también son sustanciales. El INA se une al ADN complementario más rápidamente de lo que las sondas de ácido nucleico se unen a la misma secuencia diana. A diferencia de los fragmentos de ADN o ARN, el INA se une mal al ARN a menos que los grupos intercalantes estén situados en posiciones terminales. Debido a las fuertes interacciones entre los grupos intercalantes y las bases en la hebra de ADN complementario, la estabilidad del complejo INA/ADN es mayor que la de un complejo de ADN/ADN o de ARN/ADN análogo.

A diferencia de otros ácidos nucleicos tales como los fragmentos de ARN o ADN o el PNA, los INA no muestran propiedades de autoagregación o unión.

Puesto que los INA hibridan con los ácidos nucleicos con una especificidad de secuencia, los INA son candidatos útiles para desarrollar análisis basados en sondas y están particularmente adaptados para kits y análisis de escrutinio. Sin embargo las sondas de INA, no son el equivalente de las sondas de ácidos nucleicos. Por consiguiente, cualquiera de los métodos, kits o composiciones que pudieran mejorar la especificidad, sensibilidad y fiabilidad de los análisis basados en sondas serían útiles en la detección, el análisis y la cuantificación de muestras que contienen ADN. Los INA tienen las propiedades necesarias para este fin.

Resultados

La detección de microorganismos (tales como cepas bacterianas, virales o fúngicas) se ve a menudo dificultada por el gran número de cepas individuales de microorganismos dentro de esa especie.

Los principios in silico generales de la invención se ilustran usando las bacterias Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus sp y Estaphylococcus (Figuras 1 a 5). Los principios generales de la invención se han ilustrado utilizando el virus Influenza y rotavirus (Figuras 6 y 7).

Los datos bioquímicos generales para ilustrar y apoyar a la invención se describen en las Figuras 8 a 18 utilizando bacterias Gram positivas así como Gram negativas clínicamente relevantes.

Bacterias

La Figura 1 muestra una región de 34 nucleótidos del gen de la proteasa iga en N. meningitidis y el locus correspondiente en N. gonorrhoeae (ya que estas regiones existen en sus genomas bacterianos naturales) (clasificación completa; Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae, Neisseria meningitidis, Z2491 del Serogrupo A y las características completas de locus; iga, proteasa IgA1; GeneID 906889. Locus Tag NMA0905; Núm de acceso RefSeq. NC_003116.1; PMID 10761919; Parkhill J et al., 2000, Nature, 404, 502-506). Exite una similitud de secuencia de 74% entre estas dos secuencias de 34 nucleótidos de Neisseria. Los cebadores basados en PCR elaborados para amplificar estas regiones en ambas especies bacterianas requerirían cebadores degenerados con 512 combinaciones posibles. La secuencia común utilizada para la parte de la amplificación mediante PCR sería la secuencia de 34 nucleótidos GYAATYW AGGYCGYCTY GAAGAYTAYA AYATGGC (SEQ ID NO: 3), donde el código convencional para designar las diferentes posiciones se proporciona más abajo: N = A, G, T o C; D = A, G o T; H = A, T o C; B = G, T o C; V = G, A o C; K = G o T; S = C o G; Y = T o C; R = A o G; M = A o C y W = A o T.

Sin embargo, cuando el ADN bacteriano de estas dos especies se trata con el reactivo de bisulfito, (que da resultado la conversión de citosinas en timinas), las secuencias de origen natural se convierten en secuencias derivadas que no tienen potencial de codificación y que no existen en la naturaleza. Las secuencias derivadas tienen ahora 97% de similitud de secuencia. Los cebadores basados en PCR diseñados para permitir la amplificación mediante PCR de estos dos loci bacterianos en un único ensayo solo requieren ahora combinaciones de solamente 2 cebadores. La combinación se basaría en la secuencia GTAATTW AGGTTGTTTT GAAGATTATA ATATGGT (SEQ ID NO: 4), donde solo la base de la posición 7 es una adenina o una timina (indicada como W). Así, la conversión con bisulfito reduce la complejidad genómica relativa de 512 a 2 tipos de cebadores. Esta reducción masiva simplifica la amplificación del mismo locus de especies bacterianas relacionadas.

Se obtienen ventajas adicionales la utilización opcional de sondas de INA para amplificar regiones de estas dos especies bacterianas, utilizando de nuevo el mismo locus. La Figura 2 ilustra la misma región de 34 nucleótidos de los genes iga de N. meningitidis y N. gonorrhoeae como se representa en la Figura 1, con la demostración adicional del grado en que se pueden reducir aún más la longitud y la complejidad de la sonda utilizando sondas de INA. Una secuencia de 16 unidades de INA corta AGGYCGYCTY GAAGAY (SEQ ID NO: 5) requeriría 16 posibles combinaciones de cebadores para detectar esta región, pero después de la conversión con bisulfito, sería suficiente una única secuencia cebadora, AGGTTGTTTT GAAGAT (SEQ ID NO: 6). La ventaja de la molécula de INA es que, debido a los pseudonucleótidos intercalantes que se incorporan en su cadena principal, la hibridación con el locus correcto se distingue mucho más fácilmente de la unión no específica, debido al incremento de la Tm del INA con respecto al oligonucleótido convencional. Se apreciará, sin embargo, que los oligonucleótidos convencionales todavía funcionarán adecuadamente.

Cuando las especies bacterianas estrechamente relacionadas causan síntomas clínicos similares, ADN convertido con bisulfito se puede utilizar de nuevo para diseñar sondas más simples para analizar la presencia de tipos bacterianos específicos. La Figura 3 muestra los alineamientos de ADN del gen iga en tres especies bacterianas, una de los cuales, Haemophilus influenzae es de un grupo taxonómico diferente. El tratamiento con bisulfito del ADN bacteriano dio como resultado un número mucho más pequeño de combinaciones de sondas. Esta comparación ilustra la importancia de poder analizar especies no relacionadas en un ensayo. Tanto N. meningitidis como H. influenzae causan meningitis, por lo que es ventajoso poder analizar en un ensayo todos los microbios que causan los mismos síntomas clínicos.

El análisis de un gran número de diferentes especies bacterianas del mismo grupo taxonómico se facilita de nuevo por medio de la presente invención. La Figura 4 muestra un segmento de 40 nucleótidos del gen tuf en 10 especies de bacterias del grupo Streptococcus a saber S. oralis, S. mitis, S. dysgalactiae, S. cristatus, S. gordonii, S. parauberis, S. pneumoniae, S. bovis, S. vestivularis y S. uberis. Esta región tiene aproximadamente 68% de similitud de secuencia entre las 10 especies y requiere 12.288 combinaciones de cebadores para analizar simultáneamente las 10 especies en el ensayo. La secuencia convertida con entre estas especies tiene 85% de similitud de secuencia y ahora sólo requiere 64 posibles combinaciones de cebadores.

El análisis de diferentes cepas que pertenecen a la misma especie bacteriana se simplifica también mediante la invención. La Figura 5 ilustra un segmento de 23 nucleótidos del gen de enterotoxina se de Staphylococcus aureus. La secuencia natural de esta región del gen tiene sólo 56% de similitud de secuencia entre las 7 cepas y requiere 1536 combinaciones de cebadores, mientras que la secuencia convertida con bisulfito tiene 74% de similitud de secuencia y sólo requiere de 64 combinaciones de cebadores.

Análisis de ácidos nucleicos virales y reducción de la complejidad genómica relativa

El principio de reducción de la complejidad genómica relativa también se puede aplicar a los grupos virales, tales como el virus Influenza que tiene un genoma de ADN, así como a grupos virales que tienen genomas de ARN, (ya que el ARN se puede convertir en ADN por medio de la transcriptasa inversa y después el consiguiente tratamiento con bisulfito). Para ilustrar la aplicación para la detección viral, se han utilizado el gen de la neuraminidasa de las cepas de virus Influenza, (familia Orthomyxoviridae), y la proteína de superficie que codifica el gen de VP4 de las cepas de rotavirus, (familia Reoviridae), teniendo ambos virus un genoma de ARN segmentado. La taxonomía de los virus de la influenza es compleja, estando basados por ejemplo los tipos A, B y C, en características antigénicas, y estando basados los subtipos adicionales en el lugar de origen, el año de aislamiento, el número de producto aislado y el subtipo. Esto refuerza la necesidad en primera instancia de poder identificar los virus de influenza como grupo, y sólo entonces profundizar para analizar los sub-subniveles de clasificación.

La taxonomía de los rotavirus también es compleja. El número de serotipos de rotavirus es grande, siendo reconocidos dos serotipos principales, los serotipos P y G. Hay mínimamente 14 diferentes serotipos G y su detección inequívoca tiene importancia en la medicina pediátrica. Se estima que a la edad de tres años, casi todos los niños en todo el mundo ya se ha infectado por lo menos una vez por Rotavirus, a pesar de que estas infecciones pueden ser subclínicas y sólo tienen leves efectos sobre el tracto gastrointestinal.

Las consecuencias de la infección por influenza en el nivel clínico son bien conocidas, con una significativa morbilidad y mortalidad casi cada invierno. Sin embargo puede haber complicaciones secundarias masivas después de la infección, especialmente por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y Staphylococcus aureus. Es muy claramente ventajoso ser capaz de analizar simultáneamente para ambas infecciones virales e infecciones bacterianas ya que pueden surgir complicaciones pneumónicas de características mixtas de infecciones bacterianas y virales, y el inmediato tratamiento con antibióticos puede ser una terapia eficaz.

La reducción de la complejidad genómica relativa en 9 cepas de influenza diferentes se muestra en la Figura 6. Una región de 20 nucleótidos del gen de la neuraminidasa del virus de la influenza se muestra en su forma de ADN. Hay 50% de similitud de secuencia entre estos 9 productos aislados.

Después de la conversión con bisulfito, la similitud de secuencia se ha incrementado a 75%. En su forma original, que requerirían 2.048 posibles combinaciones de cebadores para analizar estas 9 cepas, mientras que después de la conversión con bisulfito solamente se necesitan 48 combinaciones de cebadores.

La reducción complejidad genómica relativa del gen de VP4 de 3 diferentes cepas de rotavirus se muestra en la 5 Figura 7. Una región de 20 nucleótidos del gen de VP4 tiene 52% de similitud de secuencia antes de la conversión y el 74% después de la conversión. El número de combinaciones de cebadores se reduce de 512 a 32.

Los datos moleculares que apoyan el enfoque in silico de la simplificación de los genomas microbianos, como medio de detección de microorganismos se ilustra en las Figuras 8 a 15 utilizando especies microbianas clínicamente relevantes que se encuentran comúnmente en hospitales y unidades de patología de prueba.

10 Es una clara ventaja, y un imperativo clínico para la detección rápida de microorganismos contaminantes, que se pudiera tomar una decisión inicial entre la presencia de bacterias Gram positivas o Gram negativas en una muestra. El método descrito en la presente memoria proporciona dicho ensayo utilizando los genes ribosomales 23S de diferentes especies de bacterias para generar un conjunto de cebadores que permiten detectar las bacterias Gram positivas o Gram negativas mediante la utilización de tales cebadores sobre genomas simplificados a través de una

15 reacción de amplificación. Las secuencias de 23S son ideales para tales distinciones de alto nivel, puesto que se encuentran en todas las especies bacterianas, a diferencia de algunas secuencias codificantes de proteínas que son adiciones opcionales a algunos genomas bacterianos, tal como se observa en el ejemplo de S. galactiae anterior. Muchas secuencias microbianas codificantes de proteínas son similares a "restos y desechos" genómicos, y su utilidad radica en la diferenciación entre las categorías taxonómicas de nivel inferior, tales como diferentes cepas

20 microbianas, tipos o productos aislados, o en el caso de los virus, entre diferentes tipos o mutaciones recién surgidas. Las secuencias genómicas normales y simplificadas de estos dos componentes, los genes de ARN ribosomal que no codifican proteínas, y el gen recA que codifica proteína de bacterias se proporcionan en las Figuras 15 y 16, respectivamente. Las secuencias de los cebadores utilizados para realizar las reacciones de amplificación para los amplicones bacterianos 23S se proporcionan en la Tabla 1. Las secuencias de los cebadores

25 utilizadas para realizar las reacciones de amplificación para los amplicones recA se proporcionan en la Tabla 2. Todos los cebadores se elaboran para el ADN tratado con bisulfito y se muestran en la orientación 5' a 3'.

La Tabla 1 presenta las secuencias adecuadas de cebadores bacterianos usadas para amplificar el ADN simplificado con bisulfito del gen o los genes de ARN ribosomal 23S utilizando alineamientos para generar cebadores para la detección Gram positivos (Pos), Gram negativos (Neg). Además se diseñaron los cebadores para

30 la detección específica de Mycoplasma spp (Myc), Staphylococcus spp (Staph), Streptococcus spp (Strep), Neisseria spp (NG), Chlamydia (CT), y Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae (EC).

Los siguientes símbolos designan las adiciones de bases siguientes: N = A, G, T o C; D = A, G o T; H = A, T o C; B = G, T o C; V = G, A o C; K = G o T; S = C o G; Y = T o C; R = A o G; M = A o C y W = A o T.

Todos los cebadores utilizados se basaron en secuencias de ADN simplificadas con bisulfito.

35 Tabla 1 Cebadores bacterianos

Cebadores 23S

Secuencia 5'-3 ' SEQ ID NO

Pos-R1F1

GGTTTTTTTTGAAATAGTTTTAGGGTTA 7

Neg-R1F1

GGTTTTTTTTGAAARTTATTTAGGTAGT 8

Pos-R1F2

TGGKAGTTAGAWTGTGRRWGATAAG 9

Neg-R1 F2

TGGGAGATAKATRGTGGGTGTTAAT 10

Pos-R1F3

GGATGTGGDRTTKTKWAGATAA 11

Neg-R1 F3

TGAWGTGGGAAGGTWTAGATAG 12

Pos-R1R1

HCAATMHHACTTCAMMMCMMYT 13

Neg-R1R1

WCAAHHCACCTTCAHMAACYTAC 14

Cebadores 23S

Secuencia 5'-3 ' SEQ ID NO

Pos-R1R2

ACCAACATTCTCACTYMTAAWMAMTCCAC 15

Neg-R1R2

ATCAACATTCACACTTCTAATACCTCCAA 16

W-Pos-R1F1

GGTTTTTTTYGAAATAGTTTTAGGGTTA 17

W-Neg-R1F1

GGTTTTTTTYGAAARTTATTTAGGTAGT 18

W-Pos-R1F2

YGGKAGTTAGAWYGYGRRWGATAAG 19

W-Neg-R1F2

YGGGAGATAKAYRGYGGGTGTTAAT 20

W-Pos-R1F3

GGATGTGGDRTTKYKWAGATAA 21

W-Neg-R1F3

YGAWGTGGGAAGGTWTAGATAG 22

W-Pos-R1R1

HCRATMHHRCTTCRMMMCMMYT 23

W-Neg-R1R1

WCRAHHCACCTTCAHMRACYTAC 24

W-Pos-R1R2

ACCRACATTCTCACTYMTAAWMAMTCCAC 25

W-Neg-R1R2

ATCAACATTCRCACTTCTAATACCTCCAA 26

Pos-R2F1

KTTRAGAAAAGTWTTTAGDDAGRK 27

Neg-R2F1

TTTARGAAAAGTTWTTAAGTWTTA 28

Pos-R2F2

AGDTRAGRWGAGDATTTTWAGGTKR 29

Neg-R2F2

GGKTRGGWWGAGAATWTTAAGGTGT 30

Pos-R2R1

AATYTMYMATTAAAACAATACMCAA 31

Neg-R2R1

AATCTCAAAWAAAAACAAYMYMACC 32

Pos-R2R2

ACMHACATCTTCACWMAYAYTAYAAYTTCACC 33

Neg-R2R2

MAYTACATCTTCACAACMAHWTCAAYTTCACT 34

Pos-R2R3

CMATAYYAAAYTACAATAAAACTC 35

Neg-R2R3

CAATAYMAAACTAYAATAAAAATT 36

Pos-R3F1

GGTGAARTTRTARTRTKWGTGAAGATGTDKG 37

Neg-R3F1

AGTGAARTTGAWDTKGTTGTGAAGATGTART 38

Pos-R3F2

GATWGGATGGAAAGATTTTRTRGAG 39

Cebadores 23S

Secuencia 5'-3 ' SEQ ID NO

Neg-R3F2

KGTWAGATGGAAAGATTTTGTGAAT 40

Pos-R3R1

HYMAYMMWAYHAAAATAATATCC 41

Neg-R3R1

TCAAMMMYWMMAAAATAATATTT 42

Pos-R3R2

AWCCATTCTAAAAAAACCTTTAAACA 43

Neg-R3R2

AACCAWWMYWAAMHMACCTTCAWACT 44

CE-F1

GTTGGTAAGGTGATATGAATTGTTATAA 45

CE-F2

TTATTATTAATTGAATTTATAGGTTA 46

CE-F3

GAGGAGTTTAGAGTTTGAATTAGTRTG 47

EC_R1

TATATACAAAACTATCACCCTATATC 48

CE-R2

TCATCAAACTCACAACAYATAC 49

NG-F1

TTGAGTAAGATATTGATGGGGGTAA 50

NG-F2

TATGGTTAGGGGGTTATTGTA 51

NG-R1

AATCTATCATTTAAAACCTTAACC 52

NG-R2

CCTAACTATCTATACCTTCCCACT 53

NG-R3

CACTCCCCTACCATACCAATAAACC 54

CT-R1F1

GTATGATGAGTTAGGGAGTTAAGTTAAA 55

CT-R1F2

GGTGAGGTTAAGGGATATATA 56

CT-R1F3

AAAAGAGTGAAGAGTTGTTTGGTTTAGATA 57

CT-R1R1

TCCAAACCTTTTTCAACATTAACT 58

CT-R1R2

CCCTAAAATTATTTCAAAAAAAACAAAA 59

CT-R2F1

TTAGTGGGGGTTTATTGGTTTATTAATGGA 60

CT-R2F2

TAAGGAAGTGATGATTTGAAGATAGTTGGA 61

CT-R2R1

ACACCTTCTCTACTAAATACT 62

CT-R2R2

TATACCATAAATCTTCACTAATATC 63

CT-R3F1

TTGTGTAGATGATGGAGTAGTAGGTTA 64

Cebadores 23S

Secuencia 5'-3 ' SEQ ID NO

CT-R3F2

GAATGATGGAGTAAGTTAAGTATGTGGA 65

CT-R3R1

TAAAAATTATTTCTTAAAAACCTCACT 66

CT-R3R2

AAATTATCTCACACACCTTAAAATAT 67

CT-R4F1

AATGTTAAAAGGTTAAAGGGATAT 68

CT-R4F2

TATTGAATTTAAGTTTTGGTGAATGGTT 69

CT-R4R1

CCAATATTTCAACATTAACTCCCACTCTC 70

CT-R4R2

ATATCCATCTTCCAAATTCATAAAATAAT 71

CT-R4R3

TAAACAACAACAATTCCACTTTCC 72

Myc-R1F1

ATAGGAAAAGAAAWTGAAWGWGATTTTG 73

Myc-R1 F2

GTGTAGTGGTGAGTGAAAGTGGAATAGG 74

Myc-R1R1

TAAACAAMTTCMMTCAAAATAACATTTYYCAA 75

Myc-R1R2

CTAATTAATATTTAAACTTACCC 76

Myc-R2F1

TTTTGAAATTATATGTTTATAATGT 77

Myc-R2F2

AAGTATGAGTTGGTGAGTTATGATAGT 78

Myc-R2R1

CCTCCAMTTAWTYATAATCTYAC 79

Myc-R2R2

CACCWAAAYAACACCATCATACATT 80

Myc-R3F1

TGTAGTTAGATAGTGGGGTATAAGTTTTA 81

Myc-R3F2

AGGGGAAGAGTTTAGATTATTAAA 82

Myc-R3R1

ATAACTTCAWCYCMWATACAACACTCAT 83

Myc-R3R2

ATCAATTTAAAAAATTCTCACTCYCAAA 84

Myc-R4F1

TTTTTATWATTGGATTTGGGGWTAAA 85

Myc-R4F2

TKKTWWTTAGTATTGAGAATGA 86

Myc-R4F3

TGTAAATTWATTTTGTAAGTTWGT 87

Myc-R4F4

GAATGAGGGGGGATTGTTTAATT 88

Myc-R4R1

TCTATAACCAAAACAATCAAAAAATA 89

Cebadores 23S

Secuencia 5'-3 ' SEQ ID NO

Myc-R4R2

CATTACACCTAACAAATATCTTCACC 90

Myc-R5F1

ATWWATAGGTTGAATAGGTRAGAAAT 91

Myc-R5F2

ATAGTGATTTGGTGGTTTAGTATGGAAT 92

Myc-R5R1

CAAACCTACTTCAACTCAAAAATAAAATAAAT 93

Myc-R5R2

ACAACAATTTAAACCCAACTCACATATCT 94

Myc-R5R3

AAAAYAAMWCTYTTCAATCTTCCTAYAAA 95

Strep-R1F1

ATWWTTGTTAAGGDWRTGARRAGGAAG 96

Strep-R1F2

TAGRAGGGTAAATTGARGWGTTTA 97

Strep-R1F3

TKATTTGGGAARRTWRGTTAAAGAGA 98

Strep-R1 R1

TCTCTTCAACTTAACCTCACATCAT 99

Strep-R1R2

ATAATTTCAAATCTACAWCMWAAT 100

Strep-R2F1

RATKTATTGGAGGATTGAATTAGGG 101

Strep-R2F2

ATGTTGAAAAGTGTTTGGATGAT 102

Strep-R2R1

TCTAAAATYAATAAWCCAAAATAAMCCCCTC 103

Strep-R2R2

ACTACCAAYHATAWHTCATTAAC 104

Strep-R3F1

AGGTTGAKATTTTTGTATTAGAGTA 105

Strep-R3F2

RWAGTGATGGAGGGATGTAGTAGGTTAAT 106

Strep-R3R1

CTTTTCTYAACAATATAACATCACT 107

Strep-R3R2

CTCTCAMTCACCTAAAACTACTCA 108

Staph-R1F1

AGAAGTTGATGAAGGATGTTATTAATGA 109

Staph-R1 F2

GTTATTGATATGTGAATWTATAGTATRTT 110

Staph-R1R1

CAAAAYTHTTACCTTCTYTAATYC 111

Staph-R1 R2

CAACAAAATTYCACATACTCCAT 112

Staph-R2F1

GATTTGATGTAAGGTTAAGTAGT 113

Staph-R2F2

TTGGTTAGGTTGAAGTTTAGGTAATATTGAA 114

Cebadores 23S

Secuencia 5'-3 ' SEQ ID NO

Staph-R2F3

GATTTATGTTGAAAAGTGAGTGGATGAATTGA 115

Staph-R2R1

CCTYTTTCTAACTCCCAAATTAAATTAAT 116

Staph-R3F1

GAAGTTGTGGATTGTTTTTTGGATA 117

Staph-R3F2

AAGGGTGTTGAAGTATGATTGTAAGGATAT 118

Staph-R3R1

TACAMTCCAAYMACACACTTCACCTATCCTA 119

Staph-R3R2

CAACAATATAAAATCAACAACTCAAA 120

Staph-R4F1

AGGAGTGGTTAGTTTTTGTGAAGTTA 121

Staph-R4F1

ACAAATTAAAAAWCCAACACAACT 122

Staph-R4F2

TAACACTATCTCCCACCAYAATMAAT 123

La Tabla 2 muestra las secuencias de cebadores bacterianos utilizadas para amplificar el ADN simplificado de del gen que codifica la proteína recA utilizando alineamientos de Staphylococcus aureus (SA), Staphylococcus epidermidis (SE), Serratia marscesens (SM), Escherichia coli (CE) y Yersinia enterocolitica (YE) para la tipificación bacteriana única.

Tabla 2 Secuencias de cebadores bacterianos utilizadas en la amplificación de ADN simplificado del gen que codifica la proteína recA

Específico de recA

Secuencia SEQ ID NO

A-SA-F1

TAGGTTGTTGAGTTTTAATTATA 124

A-SA-F2

GAAGTATAAAGTAATGGTGGGGTG 125

A-SA-R1

TACAATATCAACTACACCACTTCTAACAAAT 126

A-SA-R2

TAATAAAAATAACAATTATATTT 127

A-SE-F1

AAGGTTGTAGAGTATTAAGTATTTTAAG 128

A-SE-F2

GTTGATAATGTATTAGGGGTTGGA 129

A-SE-F3

ATATGGATTTGAAAGTTTAGGTAAGATG 130

A-SE-R1

TACTACTAAATCAACAACAACAATATCCACA 131

A-SE-R2

CTTAATACTTAAAACATTAATCT 132

A-SM-F1

GAGAATAAGTAAAAGGTGTTAGTTGTG 133

A-SM-F2

GATTTTTATTGGTTTATTGTTATTTGATATTGTT 134

Específico de recA

Secuencia SEQ ID NO

A-SM-R1

CAAATAATCAATATCAACACCCAACTTTTTC 135

A-SM-R2

TACACACCACCAAACCCATATAC 136

A-CE-F1

GAAAATAAATAGAAAGTGTTGGTG 137

A-CE-F2

TGTTTTTATTGGATATTGTGTTT 138

A-CE-R1

CAATAACATCTACTACACCAAAACAC 139

A-CE-R2

CATATTAAACTACTTCAAATTACCC 140

A-YE-F1

TATGTGTTTTGGTGAAGATTGTTTA 141

A-YE-F2

TTTTGATATTGTATTGGGGGTG 142

A-YE-F3

GGTTTGTTAATGGGGTGTATTGTTGAG 143

A-YE-R1

CATACTCTACATCAATAAAA 144

La Tabla 1 muestra las secuencias de cebadores bacterianos utilizadas para amplificar ADN simplificado con bisulfito del gen o los genes de ARN ribosomal 23S utilizando alineamientos múltiples para generar cebadores óptimos para la detección de bacterias Gram positivas (indicadas como Pos), y Gram negativas (indicadas como Neg). Además 5 también se diseñaron los cebadores para la detección específica de los grupos de especies, así como para las especies individuales. Las denominaciones para estos grupos de cebadores bacterianos son las siguientes; Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae (EC), Neisseria spp (NG), Chlamidia (CT), Mycoplasma spp (Myc), Streptococcus spp (Strep) y Staphylococcus spp (Staph). Las subdenominaciones F y R hacen referencia a los cebadores directos e inversos, respectivamente. Además, cuando es necesaria más de una posible base en una 10 posición determinada de nucleótido, la degeneración de base está dada por el código siguiente: N = A, G, T o C; D = A, G o T; H = A, T o C; B = G, T o C; V = G, A o C; K = G o T; S = C o G; Y = T o C; R = A o G; M = A o C; y W = A o

T. Para reiterar, todos los cebadores usados en esta invención se basan en secuencias de ADN simplificadas con bisulfito.

La Tabla 2 muestra las secuencias de cebadores bacterianos utilizadas para amplificar ADN modificado con bisulfito

15 del gen que codifica la proteína recA utilizando alineamientos de Staphylococcus aureus (SA), Staphylococcus epidermidis (SE), Serratia marscesens (SM), Escherichia coli (CE) y Yersinia enterocolitica (YE) para una tipificación bacteriana única.

La Figura 8 muestra los productos de amplificación obtenidos mediante PCR a partir de las regiones del gen ribosomal 23S genómicamente simplificadas de bacterias Gram positivas y Gram negativas, detectándose los 20 amplicones de tamaño apropiado como bandas de longitud específica mediante electroforesis en gel de agarosa. La flecha indica el tamaño esperado de los amplicones con respecto a los marcadores de tamaño patrón que se ejecutan en la calle del Marcador, (M). El uso de cebadores específicos para las bacterias Gram negativas revela bandas sólo en las seis calles Gram negativas 1 a 6, (panel superior), para Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Klebsiella pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa y Proteus vulgaris. El uso de cebadores

25 específicos para las bacterias Gram positivas revela sólo las bandas en las seis calles Gram positivas, 7 a 12 (panel inferior) para Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus xylosis, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus haemolyticus.

La Figura 9 muestra los productos de amplificación obtenidos mediante PCR a partir de las regiones del gen ribosomal 23S genómicamente simplificadas diseñadas para detectar amplicones de sólo dos especies de bacterias

30 Gram negativas, (en este ejemplo) E. coli y K. pneumoniae. La especificidad de la metodología de amplificación se ilustra por la presencia de amplicones en las calles 1 y 3, que representan E. coli K. pneumoniae, y la ausencia de productos de amplificación en el calle 2, así como de las calles 4 a 12, representado estas 10 calles vacías las restantes 10 especies de bacterias utilizadas en el ensayo.

La Figura 10 muestra los productos de amplificación obtenidos mediante PCR a partir de las regiones del gen ribosomal 23S genómicamente simplificadas usando cebadores específicos para un solo grupo bacteriano, Neisseria. La especificidad de la metodología de simplificación genómica se ilustra por la presencia de un amplicón solo en el calle 2, que representa Neisseria gonorrhoeae, y la ausencia de un producto de amplificación en el calle 1, así como de las calles 3 a 12, representando estas 11 calles vacías las 11 especies de bacterias restantes utilizadas en el ensayo.

Para el análisis de las especies microbianas individuales, también se pueden utilizar cuando sea apropiado genes que codifican proteínas, con la condición de que las diferentes cepas de microorganismos no sean polimórficas para la presencia/ausencia de la secuencia del gen en cuestión.

La Figura 11 ilustra el uso de cebadores para el gen recA bacteriano de E. coli. La especificidad de la amplificación se ilustra por la presencia del amplicón de tamaño correcto en la calle 1 y su ausencia de las calles restantes 2 a 12, lo que representa otras 11 especies de bacterias.

Los datos de la Figura 12 ilustran adicionalmente la especificidad de los cebadores que revela la pertenencia a un grupo más grande de bacterias, tales como estafilococos. Los productos de amplificación obtenidos mediante PCR de las regiones del gen ribosomal 23S genómicamente simplificadas usando cebadores específicos para los estafilococos revelan amplicones solo en las calles 8, 9, y 10, representando Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus y Staphylococcus xylosis. La ausencia de un producto de amplificación en las calles 1 a 7, así como de las calles 11 y 12, demuestran la especificidad de la reacción. Las 9 calles vacías representan las 9 especies de bacterias estafilocócicas no utilizadas en el ensayo.

La Figura 13 muestra los productos de amplificación obtenidos mediante PCR a partir de las regiones del gen ribosomal 23S genómicamente simplificadas usando cebadores específicos para las bacterias Estreptocócicas.

Los productos de amplificación obtenidos mediante PCR de las regiones del gen ribosomal 23S genómicamente simplificadas usando cebadores específicos para Streptoococci revela amplicones sólo en las calles 11 y 12, representando Streptococcus pneumoniae y Streptococcus haemolyticus. La ausencia de un producto de amplificación en las calles 1 a 10, revela la especificidad de la reacción. Estas 10 calles vacías representan las 10 especies de bacterias no Estreptocócicas utilizadas en el ensayo.

La Figura 14 muestra los productos de amplificación obtenidos mediante PCR de un gen que codifica una proteína de la región genómicamente simplificada del gen recA de Staphylococcus epidermidis, (Calle 8). Las dos bandas (flechas) representan los amplicones de transporte de las amplificaciones de PCR de la primera ronda (banda superior) y la segunda ronda (banda inferior). La ausencia de amplicones en las calles 1 a 7 y 9 a 12 muestra la especificidad del método y destaca el punto en el que se pueden utilizar los genes que codifican proteínas en circunstancias particulares en lugar de los componentes no codificantes del genoma, para lograr la detección de una sola especie de bacterias.

La Figura 15 muestra la detección de amplicones usando cebadores específicos dirigidos a los genes ribosomal 23S genómicamente simplificados de Chlamydia. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo por duplicado debido a la baja cantidad de ADN de partida. La calle número 5 era ADN extraído de la orina de un individuo negativo conocido. La presencia de una banda en cualquiera de los duplicados se consideró una reacción positiva de la presencia de ADN de Chlamydia.

La Figura 16 muestra la secuencia de nucleótidos normal del gen de ARN ribosomal 23S de E. coli y la misma secuencia después de la simplificación genómica, donde para fines ilustrativos todas las citosinas se han sustituido por timinas.

La Figura 17 muestra la secuencia de nucleótidos normal del gen recA de E. coli y la misma secuencia después de la simplificación genómica, donde para fines ilustrativos todas las citosinas se han sustituido por timinas.

En resumen, el ADN tratado con bisulfito de las fuentes microbianas, cuando se amplifica usando cebadores genómicamente simplificados, ya sean oligonucleótidos o ácidos nucleicos modificados tales como INA proporcionan un sistema de detección sin igual para la búsqueda de microorganismos de cualquier tipo dentro de una muestra, ya sea la muestra de material clínico humano o en el otro extremo de una fuente ambiental tal como agua contaminada. La presente invención se ha demostrado para una amplia gama de diferentes especies de bacterias, y por un virus clínicamente relevante. La detección de microorganismos eucarióticos unicelulares tales como la levadura Saccharomyces cerevisiae o sus parientes es una simple ampliación del método. Ésta requiere fuentes de secuencias genómicas similares, tales como las secuencias ribosomales 18 o 28S, o como se ha mostrado, secuencias codificantes de proteínas que son específicas para una especie, tipo, cepa o mutante o polimorfismo dados.

Las implicaciones prácticas del sistema de detección de acuerdo con la presente invención también son importantes. Mientras que los principios descritos en detalle en la presente memoria han demostrado usando PCR para la amplificación, las lecturas se pueden desarrollar a través de cualquier método conocido en la técnica. Con el énfasis actual en los sistemas de detección de micromatrices, se podría detectar una mayor variedad de microorganismos con ADN genómicamente simplificado ya que el tratamiento con bisulfito reduce la complejidad genómica y por lo tanto permite someter a ensayo más clases de microorganismos en las micromatrices con un menor número de

5 detectores (características).

Si por ejemplo se fuera a construir una matriz para detectar aproximadamente 250.000 microorganismos diferentes en un ensayo, la metodología actual no podría proporcionar una plataforma de detección pragmática adecuada, ya que vería abrumada por las limitaciones físicas de la plataforma detectora. Sin embargo, con la simplificación genómica, una pequeña micromatriz podría detectar más o menos 1000 diferentes categorías bacterianas de alto

10 nivel. Los positivos de dicho ensayo se podrían evaluar a continuación utilizando otra matriz, que contuviera simplemente los representantes de los grupos que dieron positivo en el ensayo inicial.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Human Genetic Signatures

<120> Detección de Microorganismos

<130> 205591675

<160> 226

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1 <211> 14 <212> DNA <213> artificial

<400> 1 atatatatat atat

14

<210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> artificial

<400> 2 aaaaaaattt tttt

14

<210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Neisseria

<400> 3 gyaatywagg ycgyctygaa gaytayaaya tggc

34

<210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> artificial

<400> 4 gtaattwagg ttgttttgaa gattataata tggt

34

<210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> artificial

<400> 5 aggycgycty gaagay

16

<210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> artificial ,

<400> 6 aggttgtttt gaagat

16

<210> 7 <211> 28

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 7 ggtttttttt gaaatagttt tagggtta

28

<210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 8 ggtttttttt gaaarttatt taggtagt

28

<210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 9 tggkagttag awtgtgrrwg ataag

25

<210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 10 tgggagatak atrgtgggtg ttaat

25

<210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 11 ggatgtggdr ttktkwagat aa

22

<210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 12 tgawgtggga aggtwtagat ag

22

<210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 13 hcaatmhhac ttcammmcmm yt

22

<210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 14 wcaahhcacc ttcahmaacy tac

23

<210> 15 <211> 29

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 15 accaacattc tcactymtaa wmamtccac

29

<210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 16 atcaacattc acacttctaa tacctccaa

29

<210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 17 ggttttttty gaaatagttt tagggtta

28

<210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 18 ggttttttty gaaarttatt taggtagt

28

<210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 19 yggkagttag awygygrrwg ataag

25

<210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 20 ygggagatak ayrgygggtg ttaat

25

<210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 21 ggatgtggdr ttkykwagat aa

22

<210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 22 ygawgtggga aggtwtagat ag

22

<210> 23 <211> 22

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 23 hcratmhhrc ttcrmmmcmm yt

22

<210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 24 wcrahhcacc ttcahmracy tac

23

<210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 25 accracattc tcactymtaa wmamtccac

29

<210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 26 atcaacattc rcacttctaa tacctccaa

29

<210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 27 kttragaaaa gtwtttagdd agrk

24

<210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 28 tttargaaaa gttwttaagt wtta

24

<210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 29 agdtragrwg agdattttwa ggtkr

25

<210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 30 ggktrggwwg agaatwttaa ggtgt

25

<210> 31 <211> 25

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 31 aatytmymat taaaacaata cmcaa

25

<210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 32 aatctcaaaw aaaaacaaym ymacc

25

<210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 33 acmhacatct tcacwmayay tayaayttca cc

32

<210> 34 <211> 32 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 34 maytacatct tcacaacmah wtcaayttca ct

32

<210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 35 cmatayyaaa ytacaataaa actc

24

<210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 36 caataymaaa ctayaataaa aatt

24

<210> 37 <211> 31 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 37 ggtgaarttr tartrtkwgt gaagatgtdk g

31

<210> 38 <211> 31 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 38 agtgaarttg awdtkgttgt gaagatgtar t

31

<210> 39 <211> 25

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 39 gatwggatgg aaagattttr trgag

25

<210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 40 kgtwagatgg aaagattttg tgaat

25

<210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 41 hymaymmway haaaataata tcc

23

<210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 42 tcaammmywm maaaataata ttt

23

<210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 43 awccattcta aaaaaacctt taaaca

26

<210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 44 aaccawwmyw aamhmacctt cawact

26

<210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 45 gttggtaagg tgatatgaat tgttataa

28

<210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 46 ttattattaa ttgaatttat aggtta

26

<210> 47 <211> 27

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 47 gaggagttta gagtttgaat tagtrtg

27

<210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 48 tatatacaaa actatcaccc tatatc

26

<210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 49 tcatcaaact cacaacayat ac

22

<210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 50 ttgagtaaga tattgatggg ggtaa

25

<210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 51 tatggttagg gggttattgt a

21

<210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 52 aatctatcat ttaaaacctt aacc

24

<210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 53 cctaactatc tataccttcc cact

24

<210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 54 cactccccta ccataccaat aaacc

25

<210> 55 <211> 28

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 55 gtatgatgag ttagggagtt aagttaaa

28

<210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 56 ggtgaggtta agggatatat a

21

<210> 57 <211> 30 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 57 aaaagagtga agagttgttt ggtttagata

30

<210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 58 tccaaacctt tttcaacatt aact

24

<210> 59 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 59 ccctaaaatt atttcaaaaa aaacaaaa

28

<210> 60 <211> 30 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 60 ttagtggggg tttattggtt tattaatgga

30

<210> 61 <211> 30 <212 DNA <213> bacteriano

<400> 61 taaggaagtg atgatttgaa gatagttgga

30

<210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 62 acaccttctc tactaaatac t

21

<210> 63 <211> 25

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 63 tataccataa atcttcacta atatc

25

<210> 64 <211> 27 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 64 ttgtgtagat gatggagtag taggtta

27

<210> 65 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 65 gaatgatgga gtaagttaag tatgtgga

28

<210> 66 <211> 27 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 66 taaaaattat ttcttaaaaa cctcact

27

<210> 67 <211> 26 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 67 aaattatctc acacacctta aaatat

26

<210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 68 aatgttaaaa ggttaaaggg atat

24

<210> 69 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 69 tattgaattt aagttttggt gaatggtt

28

<210> 70 <211> 29 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 70 ccaatatttc aacattaact cccactctc

29

<210> 71 <211> 29

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 71 atatccatct tccaaattca taaaataat

29

<210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 72 taaacaacaa caattccact ttcc

24

<210> 73 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 73 ataggaaaag aaawtgaawg wgattttg

28

<210> 74 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 74 gtgtagtggt gagtgaaagt ggaatagg

28

<210> 75 <211> 32 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 75 taaacaamtt cmmtcaaaat aacatttyyc aa

32

<210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 76 ctaattaata tttaaactta ccc

23

<210> 77 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 77 ttttgaaatt atatgtttat aatgt

25

<210> 78 <211> 27 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 78 aagtatgagt tggtgagtta tgatagt

27

<210> 79 <211> 23

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 79 cctccamtta wtyataatct yac

23

<210> 80 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 80 caccwaaaya acaccatcat acatt

25

<210> 81 <211> 29 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 81 tgtagttaga tagtggggta taagtttta

29

<210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 82 aggggaagag tttagattat taaa

24

<210> 83 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 83 ataacttcaw cycmwataca acactcat

28

<210> 84 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 84 atcaatttaa aaaattctca ctcycaaa

28

<210> 85 <211> 26 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 85 tttttatwat tggatttggg gwtaaa

26

<210> 86 <211> 22 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 86 tkktwwttag tattgagaat ga

22

<210> 87 <211> 24

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 87 tgtaaattwa ttttgtaagt twgt

24

<210> 88 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 88 gaatgagggg ggattgttta att

23

<210> 89 <211> 26 <212> DNA , <213> bacteriano

<400> 89 tctataacca aaacaatcaa aaaata

26

<210> 90 <211> 26 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 90 cattacacct aacaaatatc ttcacc

26

<210> 91 <211> 26 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 91 atwwataggt tgaataggtr agaaat

26

<210> 92 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 92 atagtgattt ggtggtttag tatggaat

28

<210> 93 <211> 32 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 93 caaacctact tcaactcaaa aataaaataa at

32

<210> 94 <211> 29 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 94 acaacaattt aaacccaact cacatatct

29

<210> 95 <211> 29

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 95 aaaayaamwc tyttcaatct tcctayaaa

29

<210> 96 <211> 27 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 96 atwwttgtta aggdwrtgar raggaag

27

<210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 97 tagragggta aattgargwg ttta

24

<210> 98 <211> 26 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 98 tkatttggga arrtwrgtta aagaga

26

<210> 99 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 99 tctcttcaac ttaacctcac atcat

25

<210> 100 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 100 ataatttcaa atctacawcm waat

24

<210> 101 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 101 ratktattgg aggattgaat taggg

25

<210> 102 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 102 atgttgaaaa gtgtttggat gat

23

<210> 103 <211> 31

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 103 tctaaaatya ataawccaaa ataamcccct.c

31

<210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 104 actaccaayh atawhtcatt aac

23

<210> 105 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 105 aggttgakat ttttgtatta gagta

25

<210> 106 <211> 29 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 106 rwagtgatgg agggatgtag taggttaat

29

<210> 107 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 107 cttttctyaa caatataaca tcact

25

<210> 108 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 108 ctctcamtca cctaaaacta ctca

24

<210> 109 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 109 agaagttgat gaaggatgtt attaatga

28

<210> 110 <211> 29 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 110 gttattgata tgtgaatwta tagtatrtt

29

<210> 111 <211> 24

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 111 caaaaythtt accttctyta atyc

24

<210> 112 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 112 caacaaaatt ycacatactc cat

23

<210> 113 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 113 gatttgatgt aaggttaagt agt

23

<210> 114 <211> 31 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 114 ttggttaggt tgaagtttag gtaatattga a

31

<210> 115 <211> 32 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 115 gatttatgtt gaaaagtgag tggatgaatt ga

32

<210> 116 <211> 29 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 116 cctytttcta actcccaaat taaattaat

29

<210> 117 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 117 gaagttgtgg attgtttttt ggata

25

<210> 118 <211> 30 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 118 aagggtgttg aagtatgatt gtaaggatat

30

<210> 119 <211> 31

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 119 tacamtccaa ymacacactt cacctatcct a

31

<210> 120 <211> 26 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 120 caacaatata aaatcaacaa ctcaaa

26

<210> 121 <211> 26 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 121 aggagtggtt agtttttgtg aagtta

26

<210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 122 acaaattaaa aawccaacac aact

24

<210> 123 <211> 26 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 123 taacactatc tcccaccaya atmaat

26

<210> 124 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 124 taggttgttg agttttaatt ata

23

<210> 125 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 125 gaagtataaa gtaatggtgg ggtg

24

<210> 126 <211> 31 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 126 tacaatatca actacaccac ttctaacaaa t

31

<210> 127 <211> 23

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 127 taataaaaat aacaattata ttt

23

<210> 128 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 128 aaggttgtag agtattaagt attttaag

28

<210> 129 <211> 24 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 129 gttgataatg tattaggggt tgga

24

<210> 130 <211> 28 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 130 atatggattt gaaagtttag gtaagatg

28

<210> 131 <211> 31 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 131 tactactaaa tcaacaacaa caatatccac a

31

<210> 132 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 132 cttaatactt aaaacattaa tct

23

<210> 133 <211> 27 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 133 gagaataagt aaaaggtgtt agttgtg

27

<210> 134 <211> 34 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 134 gatttttatt ggtttattgt tatttgatat tgtt

34

<210> 135 <211> 31

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 135 caaataatca atatcaacac ccaacttttt c

31

<210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 136 tacacaccac caaacccata tac

23

<210> 137 <211> 24 <212> DNA, <213> bacteriano

<400> 137 gaaaataaat agaaagtgtt ggtg

24

<210> 138 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 138 tgtttttatt ggatattgtg ttt

23

<210> 139 <211> 26 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 139 caataacatc tactacacca aaacac

26

<210> 140 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 140 catattaaac tacttcaaat taccc

25

<210> 141 <211> 25 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 141 tatgtgtttt ggtgaagatt gttta

25

<210> 142 <211> 22 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 142 ttttgatatt gtattggggg tg

22

<210> 143 <211> 27

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 143 ggtttgttaa tggggtgtat tgttgag

27

<210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 144 catactctac atcaataaaa

20

<210> 145 <211> 34 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 145 gtaatcaagg tcgtcttgaa gactacaaca tggc

34

<210> 146 <211> 34 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 146 gcaatttagg ccgcctcgaa gattataata tggc

34

<210> 147 <211> 34 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 147 gtaattaagg ttgttttgaa gattataata tggt

34

<210> 148 <211> 34 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 148 gtaatttagg ttgttttgaa gattataata tggt

34

<210> 149 <211> 16 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 149 aggycgycty gaagay

16

<210> 150 <211> 16 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 150 aggttgtttt gaagat

16

<210> 151 <211> 16

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 151 taactacgga agatca

16

<210> 152 <211> 16 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 152 taattatgga ágata

16

<210> 153 <211> 16 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 153 gtaatcaagg tcgtct

16

<210> 154 <211> 16 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 154 gtaattaagg ttgttt

16

<210> 155 <211> 16 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 155 gcaatttagg ccgcct

16

<210> 156 <211> 16 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 156 gtaatttagg ttgttt

16

<210> 157 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 157 aagctcttga aggtgactct aaatacgaag acatcatcat

40

<210> 158 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 158 aagcccttga aggtgacact aaatacgaag acatcgttat

40

<210> 159 <211> 40

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 159 aagctcttga aggtgactca aaatacgaag atatcatcat

40

<210> 160 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 160 aagctcttga aggtgatact aagtacgaag acatcatcat

40

<210> 161 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 161 aagctcttga aggtgactct aaatacgaag atatcatcat

40

<210> 162 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 162 aagctcttga aggcgataca gcacatgaag atatcatcat

40

<210> 163 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 163 aagctcttga aggtgactct aaatacgaag acatcgttat

40

<210> 164 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 164 aagctcttga aggtgacact cagtacgaag atatcatcat

40

<210> 165 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 165 aagctcttga aggtgattct aaatacgaag acatcatcat

40

<210> 166 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 166 aagctcttga aggtgattct aaatacgaag acatcatcat

40

<210> 167 <211> 40

<212> DNA <213 bacteriano

<400> 167 aagcycttga aggygaywcw vmryaygaag ayatcrtyat

40

<210> 168 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 168 aagtttttga aggtgatttt aaatatgaag atattattat

40

<210> 169 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 169 aagtttttga aggtgatatt aaatatgaag atattgttat

40

<210> 170 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 170 aagtttttga aggtgattta aaatatgaag atattattat

40

<210> 171 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 171 aagtttttga aggtgatatt aagtatgaag atattattat

40

<210> 172 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 172 aagtttttga aggtgatttt aaatatgaag atattattat

40

<210> 173 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 173 aagtttttga aggtgatata gtatatgaag atattattat

40

<210> 174 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 174 aagtttttga aggtgatttt aaatatgaag atattgttat

40

<210> 175 <211> 40

<212> DNA <213> bacteriano

<400> 175 aagtttttga aggtgatatt tagtatgaag atattattat

40

<210> 176 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 176 aagtttttga aggtgatttt aaatatgaag atattattat

40

<210> 177 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 177 aagtttttga aggtgatttt aaatatgaag atattattat

40

<210> 178 <211> 40 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 178 aagtttttga aggtgatwtw rwrtatgaag atattrttat

40

<210> 179 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 179 tacaacgaca ataaaacggt tga

23

<210> 180 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 180 tataatgata ataaaatggt tga

23

<210> 181 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 181 tacggagata ataaagttgt tga

23

<210> 182 <211> 23 <212> DNA <213> bacteriano

<400> 182 tatggagata ataaagttgt tga

23

<210> 183 <211> 23

<212> DNA

<213> bacteriano

<400> 183 tacaacgaca ataaaacggt tga

<210> 184

<211> 23

<212> DNA

<213> bacteriano

<400> 184 tataatgata ataaaatggt tga

<210> 185

<211> 23

<212> DNA

<213> bacteriano

<400> 185 tacaacgaca ataaaacggt tga

<210> 186

<211> 23

<212> DNA

<213> bacteriano

<400> 186 tataatgata ataaaatggt tga

<210> 187

<211> 23

<212> DNA

<213> bacteriano

<400> 187 tatagagata ataaaacgat taa

<210> 188

<211> 23

<212> DNA

<213> bacteriano

<400> 188 tatagagata ataaaatgat taa

<210> 189

<211> 23

<212> DNA

<213> bacteriano

<400> 189 tacagagata ataaaactat taa

<210> 190

<211> 23

<212> DNA

<213> bacteriano

<400> 190 tatagagata ataaaattat taa

<210> 191

<211> 23

<212> DNA

<213> bacteriano

<400> 191 tacaatgaca ataaaatggt tga

<210> 192

<211> 23

<212> DNA

<213> bacteriano

<400> 192 tataatgata ataaaatggt tga

<210> 193

<211> 23

<212> DNA

<213> bacteriano

<400> 193 tayrrhgaya ataaarykrt tra

<210> 194

<211> 23

<212> DNA

<213> bacteriano

<400> 194 tatrrwgata ataaartkrt tra

<210> 195

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 195 tgtgtgtgca gggataattg

<210> 196

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 196 tgtatatgta gggacaattg

<210> 197

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 197 tgtgtttgta gagacaactg

<210> 198

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 198 tgtatatgta gggacaattg

<210> 199

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 199

tgtgtttgca gagataattg

20

<210> 200

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 200

tgcatttgca gggacaattg

20

<210> 201

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 201

tgcacttgca gggataattg

20

<210> 202

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 202

tgcgtttgcc gagataattg

20

<210> 203

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 203

tgtgcctgta gagataacag

20

<210> 204

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1)..(10)

<223> n

<400> 204

tgyryntgym grgayaaywg

20

<210> 205

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 205

tgtgtgtgta gggataattg

20

<210> 206

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 206 tgtatatgta gggataattg

<210> 207

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 207 tgtgtttgta gagataattg

<210> 208

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 208 tgtatatgta gggataattg

<210> 209

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 209 tgtgtttgta gagataattg

<210> 210

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 210 tgtatttgta gggataattg

<210> 211

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 211 tgtatttgta gggataattg

<210> 212

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 212 tgtgtttgtt gagataattg

<210> 213

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 213 tgtgtttgta gagataatag

<210> 214

<211> 20

<212> DNA

<213> viral

<400> 214 tgtrtdtgtw grgataatwg

<210> 215

<211> 19

<212> DNA

<213> viral

<400> 215 ctaaattcgc tccgattta

<210> 216

<211> 19

<212> DNA

<213> viral

<400> 216 ttaaatttgt tttgattta

<210> 217

<211> 19

<212> DNA

<213> viral

<400> 217 caaaattgac ccagactta

<210> 218

<211> 19

<212> DNA

<213> viral

<400> 218 taaaattgat ttagattta

<210> 219

<211> 19

<212> DNA

<213> viral

<400> 219 ttaaattcgt taagattca

<210> 220

<211> 19

<212> DNA

<213> viral

<400> 220 ttaaatttgt taagattta

<210> 221

<211> 19

<212> DNA

<213> viral

<400> 221 ywaaattsry ymmgaytya

<210> 222

<211> 19

<212> DNA

<213> viral

<210> 223

<211> 2922

<212> DNA

<213> bacteriano

<210> 224

<211> 2922

<212> DNA

<213> bacteriano

<400> 224 <210> 225

<211> 1062

<212> DNA

<213> bacteriano

<400> 225 <210> 226

<211> 1062

<212> DNA

<213> bacteriano

Claims (28)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para detectar un microorganismo que comprende:

   reducir la complejidad de un genoma microbiano o de un ácido nucleico microbiano mediante la generación de una forma derivada del genoma microbiano o de una forma derivada del ácido nucleico microbiano en el que las posiciones ocupadas naturalmente por citosinas están ocupadas por uracilos en la forma derivada del genoma microbiano o forma derivada del ácido nucleico microbiano mediante el tratamiento del genoma microbiano o un ácido nucleico microbiano con un agente seleccionado entre bisulfito, acetato o citrato que modifica la citosina a uracilo;

   donde la forma derivada del genoma microbiano o la forma derivada del ácido nucleico microbiano contienen un ácido nucleico que es específico para un microorganismo que tiene el genoma microbiano o el ácido nucleico microbiano, y

   detectar el ácido nucleico específico microbiano, en donde la detección del ácido nucleico específico microbiano es indicativa de la presencia de un microorganismo que tiene el genoma microbiano o el ácido nucleico microbiano.

2. 2.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los uracilos en la forma derivada del genoma microbiano o la forma derivada del ácido nucleico microbiano son remplazados por timinas mediante la amplificación del genoma microbiano derivado o del ácido nucleico microbiano derivado para formar un genoma microbiano simplificado o un ácido nucleico microbiano simplificado que contiene un ácido nucleico que es específico para un microorganismo que tiene el genoma microbiano o el ácido nucleico microbiano.

3. 3.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende convertir el ARN microbiano en ADN antes de llevar a cabo el método.

4. 4.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende llevar a cabo el método sobre ARN microbiano para producir una molécula de ARN derivada o simplificada convirtiendo a continuación el ARN derivado o simplificado para formar una molécula de ADN derivada o simplificada.

5. 5.

   El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el agente es bisulfito de sodio.

6. 6.

   El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ácido nucleico específico microbiano comprende una o más secuencias de nucleótidos únicas para un microorganismo.

7. 7.

   El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde el ácido nucleico específico microbiano contiene sustancialmente solo bases seleccionadas entre adenina (A), guanina (G) y timina (T).

8. 8.

   El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el genoma microbiano o el ácido nucleico es de fago, virus, viroide, bacteria, hongo, alga, protozoo, espiroqueta, u organismo unicelular.

9. 9.

   El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el ácido nucleico específico microbiano es de una región de un gen ribosomal de un procariota o de un microorganismo eucariótico unicelular.

10. 10.

    El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la región del gen ribosomal es 16S o 23S en un procariota o 18S o 28S en un microorganismo eucariótico unicelular.

11. 11.

    El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en donde la amplificación se lleva a cabo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación isotérmica, o amplificación de la señal.

12. 12.

    El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el ácido nucleico específico microbiano se detecta mediante PCR en tiempo real.

13. 13.

    El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el ácido nucleico específico microbiano es detectado por un sistema de detección de micromatrices.

14. 14.

    El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el ácido nucleico específico microbiano es detectado:

    proporcionando un ligando detector capaz de unirse a una región diana de la molécula de ácido nucleico específica microbiana y dejando tiempo suficiente para que el ligando detector se una a la región diana; y

    midiendo la unión del ligando detector a la región diana para detectar la presencia del ácido nucleico específico microbiano.

15. 15.

    El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el ácido nucleico específico microbiano es detectado mediante la separación de un producto de amplificación y la visualización del producto separado.

16. 16.

    El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el producto de amplificación se separa mediante electroforesis y se detecta mediante la visualización de una o más bandas en un gel.

17. 17.

    El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el ácido nucleico específico microbiano no está presente naturalmente en el microorganismo.

18. 18.

    El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la molécula de ácido nucleico específico microbiano tiene una secuencia de ácido nucleico indicativa de un nivel taxonómico del microorganismo.

19. 19.

    El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el nivel taxonómico del microorganismo incluye familia, género, especie, cepa, tipo, o diferentes poblaciones de las mismas o diferentes poblaciones geográficas o bentónicas.

20. 20.

    Un método para detectar la presencia de un microorganismo, comprendiendo el método:

    tratar ácido nucleico microbiano con un agente seleccionado entre bisulfito, acetato o citrato que modifica la citosina a uracilo para formar un ácido nucleico microbiano derivado en el que las posiciones ocupadas naturalmente por citosinas en el ácido nucleico microbiano están ocupadas por uracilos en el ácido nucleico microbiano derivado;

    proporcionar cebadores capaces de permitir la amplificación de una molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada específica de un microorganismo para el ácido nucleico microbiano derivado;

    llevar a cabo una reacción de amplificación sobre el ácido nucleico microbiano derivado para formar un ácido nucleico simplificado que tenga timinas en lugar de uracilos en el ácido nucleico microbiano derivado; y

    analizar la presencia de un producto de ácido nucleico amplificado que contiene la molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada, en donde la detección del ácido nucleico específico microbiano deseado es indicativa de la presencia del microorganismo.

21. 21.

    El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el microorganismo se selecciona entre fago, virus, viroide, bacteria, hongo, alga, protozoo, espiroqueta, u organismo unicelular.

22. 22.

    El método de acuerdo con la reivindicación 20 o 21, en donde el agente es bisulfito de sodio.

23. 23.

    El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en donde la amplificación se lleva a cabo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación isotérmica, o amplificación de la señal.

24. 24.

    El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde la molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada se detecta mediante PCR en Tiempo Real.

25. 25.

    El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde la molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada se detecta mediante un sistema de detección de micromatrices.

26. 26.

    El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde la molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada es detectada:

    proporcionando un ligando detector capaz de unirse a una región de la molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada y dejando tiempo suficiente para que el ligando detector se una a la región; y

    midiendo la unión del ligando detector a la molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada para detectar la presencia de la molécula de ácido nucleico.

27. 27.

    El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde la molécula de ácido nucleico específica microbiana deseada se detecta separando un producto de amplificación y visualizando el producto separado.

28. 28.

    El método de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el producto de amplificación se separa mediante electroforesis y se detecta visualizando una o más bandas sobre un gel.