JP2014526905A - 分子検出アッセイ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、細胞破壊および核酸処理を可能にする条件下で直接的にバイサルファイト薬剤で生体サンプルを処理することと;処理サンプルからバイサルファイト薬剤を除去することと;処理サンプル中でターゲット核酸を検出することとを含む、分子検出アッセイに関するものである。
【選択図】なし
Description
(a)細胞破壊および核酸処理を可能にする条件下で直接的にバイサルファイト薬剤で生体サンプルを処理することと;
(b)処理サンプルからバイサルファイト薬剤を除去することと;
(c)処理サンプル中でターゲット核酸を検出することと
を含む分子検出アッセイを提供する。
生体サンプルは、糞便、鼻水、血液、血漿、血清、頬細胞、膿、創傷、濃縮濾液、脳脊髄液、精液、液状化検体細胞診(LBC)組織、FFPE、レーザ捕獲細胞、培養細胞、ペレット化細胞、細菌培養物、細菌コロニー、ウイルス懸濁液、吸引物、気管支洗浄液、痰サンプル、環境サンプル、環境濃縮物、食品、原料、水サンプル、または水濃縮物等から選択されてよい。
感染症は、細菌、ウイルス、ウイロイド、酵母、菌類、プリオン、寄生虫またはアメーバを含む微生物によって引き起こされてよい。
遺伝的疾患は、癌、突然変異、コピー数変異、遺伝性疾患、環境誘導疾患、発癌因子への暴露によって引き起こされる疾患、ゲノム中のヌクレオチドリピート長の拡大または縮小によって特徴付けられる疾患であってよい。
遺伝的形質は、遺伝的変化および後成的変化が疾患状態の進行に寄与する癌または任意の他の疾患に感応性であってよい。
1つの好ましい形態において、誘導微生物核酸は実質的に、塩基アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)およびウラシル(U)を含有し、対応する未処理核酸と実質的に同じ総数の塩基を有する。
好ましくは、処理サンプルは、増幅反応を受けて、微生物に特異的なターゲット核酸分子または遺伝的指標を形成する。
微生物特異的核酸分子のターゲット領域に結合可能なディテクタリガンドを提供し、かつディテクタリガンドがターゲット領域に結合するのに十分な時間を与えることと;
ディテクタリガンドのターゲット領域への結合を測定して、微生物特異的核酸分子の存在を検出することと
によって検出される。
別の好ましい形態において、ターゲット核酸分子は、増幅産物を分離し、かつ分離産物を視覚化することによって検出される。好ましくは、増幅産物は、電気泳動によって分離され、かつゲル上で1つまたは複数のバンドを視覚化することによって検出される。
バイサルファイト試薬と;
核酸溶出および反応試薬と;
ターゲット核酸用PCRプライマーと;
アッセイを実行するための使用説明書と
を含む。
キットはさらに、核酸分離または精製カラム、PCRマスターミックス、PCR用試薬、コントロール核酸プライマー、反応チューブ、試験チューブ、スワブ等を含んでよい。
本発明は、先行技術の方法に勝る多くの利点を有しており、以下を含む。
a.サンプルの細胞溶解および核酸変換が、同じチューブ内で同時に起こり、完全な溶解および変換が30分未満で達成され得、さらに言えば僅か10から20分で達成され得る。
b.糞便材料等のサンプルが、感度を損なうことなく直接的にプロセシングされ得る。
c.本発明に基づく試験は、一次患者サンプルに、プロテイナーゼK等の酵素による前処理なしに実行され得るという利点を有する。
e.バイサルファイトの除去後、サンプルは続いて、熱脱スルホン化等のさらなる処理を何ら必要としない単純な溶出バッファ中に再懸濁され、こうしてプロセスを単純化する。
f.本方法は、特殊化されたウイルス精製キットを何ら用いる必要なく、同じチューブ内で同じサンプルからRNAウイルスおよびDNAウイルスの双方を同時に検出することができる。RNAウイルスおよびDNAウイルスの双方は(一方が一本鎖であり、もう一方が二本鎖であろうとも)、本発明によって等しい効率で溶解され、かつ変換される。
h.本方法は、類似の条件を用いて全ての細菌型を溶解し、かつ変換することができるので、単一の患者サンプルが、クロストリジウム・ディフィシル、サルモネラ属、カンピロバクター属および寄生虫等について複数の試験に用いられ得るので、各細菌またはターゲット微生物のための抽出法を別々にするという問題を解消する。
i.本方法は、従来の溶解技術に対して耐性のある丈夫な外殻を形成することができる、寄生虫等の溶解させるのが困難なサンプルに適用可能である。従って、結核菌(TB)(従来の溶解技術に対して非常に耐性がある)等のターゲット生物は、感度の良い核酸ベースの診断試験が必要とされるので、検出するのに理想的であろう。
k.本方法はまた、現在実行されているような、長時間かかるサンプルプロセシング時間を短くし、かつサンプルが精製されてからバイサルファイト変換されて、再び精製されなければならないという問題を解消する。
l.本方法は、患者糞便材料における、結腸直腸癌の高感度検出に適している。このようなサンプルは非侵襲性であり、検出の一次手段として、内視鏡検査への依存を減らすであろう。また、「サンプルから結果まで」が、複雑なサンプルプロセシング手順なしに3時間未満になると予想される。診断のために血清サンプルよりも糞便材料を使用することは、多くの利点を有し、この最上位にあるのは、感度が常に大きな問題となる血清サンプルとは異なり、多数のヒト細胞がサンプル中に存在しやすいことである。
本発明は、糞便、鼻水、血液、血漿、血清、頬細胞、膿、創傷、濃縮濾液、脳脊髄液、精液、液状化検体細胞診(LBC)組織、FFPE、レーザ捕獲細胞、培養細胞、ペレット化細胞、細菌培養物、細菌コロニー、ウイルス懸濁液、吸引物、気管支洗浄液、痰サンプル、環境サンプル、環境濃縮物、食品、原料、水サンプル、水濃縮物等を含むサンプルをプロセシングするのに適している。
本発明に従うサンプルの好ましい処理方法は、以下の通りである。サンプルは、200μlの3M(2.5から3.5Mの範囲)ナトリウムバイサルファイトpH5.0(4.5から5.5のpH範囲)内に直接入れられて、10から20分間、75℃から95℃の間で加熱される。
バイサルファイトは、任意の適切な手段によって、処理サンプルから除去される。例は、カラムベースの精製を含み、またはビーズベースの精製が最適であるが、場合によっては単純な沈殿工程で十分なことがある。
バイサルファイトの除去後、サンプルは、pHが11.5から12.5の間(>pH12が好ましい)である溶出バッファ中に再懸濁される。
サンプルはこれで、さらなるプロセシングがなくとも、PCR増幅の準備が整う。
バイサルファイト除去は、MethylEasy(商標)技術(Human Genetic Signatures)等の市販の方法によって達成されてよい。手短に言うと、240μlの試薬#3がサンプルに加えられて、サンプルが遠心カラムに移される。続いて、カラムは10,000×gで回転されて、バイサルファイトを除去する。続いて、カラムは、洗浄の間10,000×gで回転することで、300μlの試薬#4で2回洗浄される。20から50μlの溶出バッファが加えられて、サンプルはきれいなコレクションチューブ内に回転により集められる。サンプルはこれで、PCR増幅の準備が整う。
現行のサンプル前処理は、Qiagen Inc(Valencia,CA 91355 USA)、Sigma Life Sciences(St Louis,MO,USA)、Invitrogen Corporation(Carlsbad,CA 92008,USA)、およびPromega Corporation(Madison,WI 53711 USA)によって販売される商用キットを伴う。
「インハウス」病院試験
便のサンプルが10分間95℃で加熱されてから希釈され、続いてサンプルはクロストリジウム・ディフィシルのtcdB遺伝子について増幅された。
Qiagen精製
QIAamp DNA Stool Mini Kit(50)Cat#51504。
市販の寄生虫試験
AusDiagnostics Gastrointestinal Parasites 5,Catalogue number:6502。
糞便サンプル
表1、表2、表3および表4における試験された全糞便サンプルは、以下のように処理された:
スワブが糞便材料内に入れられ、続いて、200μlの3MナトリウムバイサルファイトpH5.0を含有するチューブへ移されて混合されてから、15分間95℃で加熱された。
バイサルファイトは、MethylEasy(商標)法を用いて除去され、サンプルは20から50μlの溶出バッファ中に再懸濁され、続いて標準的な条件を用いて増幅された。
クロストリジウム・ディフィシルについて陽性の3つ、およびクロストリジウム・ディフィシルについて陰性の1つの4つの便サンプルが、抽出効率に及ぼす温度および時間の影響を決定するためにアッセイされた。また、抽出コントロール(16s rDNA遺伝子)が、便サンプル内に存在する混合叢に及ぼす条件の影響を決定するために、含められた。Famチャンネルがクロストリジウム・ディフィシルのtcdA/B遺伝子に特異的であり、Cy5チャンネルが抽出コントロールに特異的である。結果は、図1および表4に示される。
表4の結果からわかるように、これらのサンプルの溶解に好ましい温度および時間は、85℃から95℃の間で15分間である。全ての陽性サンプルおよび糞便叢が容易に検出された。
表4の結果と組み合わせられたこれらの結果は、15分間の約90℃の温度が、クロストリジウム・ディフィシル等の二本鎖DNA含有生物およびHCV等の一本鎖RNAウイルスのための汎用サンプルプロセシング方法で有り得たことを示唆している。また、クロストリジウム・ディフィシルは芽胞含有生物であるので、これらの結果は、本方法が、丈夫な芽胞をこじ開ける程十分に厳しいが、RNA含有ウイルスが分解されない程十分に穏やかであることを示唆している。ここでも、このようなデータは先行技術によって予測されなかったであろう。
PCR AおよびPCR Bは、用いたマスターミックスが異なる(それぞれJumpStart(Sigma)およびFastStart(Roche))。
HCVの希釈液(Zeptoometrix)が調製された後、各10μlの希釈液が200μlの3Mナトリウムバイサルファイトに加えられて、10分間75℃にまで加熱された。
バイサルファイトが、MethylEasy(商標)法を用いて除去され、サンプルが、20μlの溶出バッファ中に再懸濁され、12μlが逆転写された後、2μlが標準的な条件を用いて増幅された。
A.Fam=ノロウイルス(一本鎖RNAウイルス)
B.Hex=アデノウイルス(二本鎖DNAウイルス)
C.Cy5=ロータウイルス(一本鎖RNAウイルス)
ノロウイルス、アデノウイルスおよびロータウイルスの質的サンプルが、Zeptometrixから得られた。各ウイルスのサンプル(10μl)が、3Mナトリウムバイサルファイトに加えられて、サンプルは10、15および20分間90℃で加熱された。その後、バイサルファイトが、修正MethylEasy(商標)法を用いて除去され、サンプルが、20μlの溶出バッファ中に再懸濁され、12μlが逆転写された後、2μlが標準的な条件を用いて増幅された。
バイサルファイトが、修正MethylEasy(商標)法を用いて除去され、サンプルが、20μlの溶出バッファ中に再懸濁され、12μlが逆転写された後、2μlが標準的な条件を用いて増幅された。
本発明が癌等のヒト疾患の検出にも適しているかを決定するために、5μl、10μlおよび20μlの希釈ヒト細胞が、200μlの3Mバイサルファイト中にて、10分または15分間、70℃、80℃、90℃および95℃でインキュベートされた。サンプルは、バイサルファイト溶液を除去するためにプロセシングされて、50μlのバッファpH12.3中に再懸濁された。続いて、材料(2μl)が、ヒトβ−グロビン遺伝子特異的プライマーおよびプローブを用いて、増幅された。結果は、表9および図3に示される。
結果は、ヒト細胞のメチル化プロファイリングが、バイサルファイトに先立つ前処理もサンプル精製も必要とせずに、患者から得られる糞便サンプルに直接的に実行され得ることを示している。従って、本方法は、一次患者材料からの直接的な結腸直腸癌の診断のための非侵襲性の、かつ単純な方法として理想的である。
本発明は、診断研究所等において使いやすくできる診断キットの形で提供されてよい。表10および表11は、例えば、微生物用の代表的な試験キットにおいて提供される試薬を示している。キットは使用説明書を含む。チューブ、スワブおよび他の研究所の備品がキット内に提供されない場合があることは、これらの材料が普通、診断研究所において容易に入手可能であるので、いうまでもない。
特異的な微生物または遺伝的試験用のキットは、ターゲット核酸分子の増幅を可能にするPCRプライマーを含む。
Claims (20)
- 細胞破壊および核酸処理を可能にする条件下で直接的にバイサルファイト薬剤で生体サンプルを処理することと;
処理サンプルからバイサルファイト薬剤を除去することと;
処理サンプル中でターゲット核酸を検出することと
を含む、分子検出アッセイ。 - 生体サンプルは、糞便、鼻水、血液、血漿、血清、頬細胞、膿、創傷、濃縮濾液、脳脊髄液、精液、液状化検体細胞診(LBC)組織、FFPE、レーザ捕獲細胞、培養細胞、ペレット化細胞、細菌培養物、細菌コロニー、ウイルス懸濁液、吸引物、気管支洗浄液、痰サンプル、環境サンプル、環境濃縮物、食品、原料、水サンプル、または水濃縮物から選択される、請求項1に記載のアッセイ。
- 動物における感染症、遺伝的疾患または遺伝的形質を検出するための、請求項1または請求項2に記載のアッセイ。
- 感染症は微生物によって引き起こされる、請求項3に記載のアッセイ。
- 微生物は、細菌、ウイルス、ウイロイド、酵母、菌類、プリオン、寄生虫またはアメーバである、請求項4に記載のアッセイ。
- 遺伝的疾患は、癌、コピー数変異と関連した疾患、遺伝性疾患、環境誘導疾患、発癌因子への暴露によって引き起こされる疾患、ヌクレオチドリピート長の拡大または縮小によって特徴付けられる疾患である、請求項2に記載のアッセイ。
- バイサルファイト薬剤は、ナトリウムバイサルファイトまたはナトリウムメタバイサルファイトである、請求項1から請求項6の何れか一項に記載のアッセイ。
- バイサルファイト薬剤は、pH範囲が4.5から5.5である2.5Mから3.5Mの濃度で用いられる、請求項7に記載のアッセイ。
- バイサルファイト薬剤は、5.0のpHにて3Mの濃度で用いられる、請求項8に記載のアッセイ。
- 処理工程は、1分間から30分間、75℃から95℃の間で加熱することを伴う、請求項1から請求項9の何れか一項に記載のアッセイ。
- サンプルは、10から20分間、80℃から95℃の間の温度で加熱される、請求項10に記載のアッセイ。
- バイサルファイトは、カラムベースの精製、ビーズベースの精製または沈殿によって除去される、請求項1から請求項11の何れか一項に記載のアッセイ。
- バイサルファイトの除去後、処理サンプルは、pHが少なくとも10である溶出バッファ中に再懸濁される、請求項1から請求項12の何れか一項に記載のアッセイ。
- 溶出バッファは、pHが11.5から12.5までである、請求項13に記載のアッセイ。
- 溶出バッファは、pHが少なくとも12である、請求項14に記載のアッセイ。
- 核酸プライマーまたはプローブを処理サンプルに与えることをさらに有する、請求項1から請求項15の何れか一項に記載のアッセイ。
- ターゲット核酸分子は増幅によって検出される、請求項16に記載のアッセイ。
- 増幅は、PCR、qPCR、逆転写PCR、デジタルPCR、等温増幅またはシグナル増幅である、請求項17に記載のアッセイ。
- ターゲット核酸は、処理材料を配列決定することによって検出される、請求項1から請求項18の何れか一項に記載のアッセイ。
- サンプルの直接的処理のための分子検出アッセイのためのキットであって:
バイサルファイト試薬と;
核酸溶出および反応試薬と;
ターゲット核酸用プライマーと;
アッセイを実行するための使用説明書と
を含むキット。
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