ES2613743T3 - Ensayo de detección molecular - Google Patents

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Abstract

Un ensayo de detección molecular que comprende: tratar una muestra biológica directamente con un agente de bisulfito en na concentración de 2.5M a 3.5M y un rango de pH de 4.5 a 5.5 y calentar entre 75º C a 95º C por 1 a 30 minutos para permitir la interrupción celular y el tratamiento con ácido nucleico; retirar el agente bisulfito de la muestra tratada; y detectar un ácido nucleico objetivo en la muestra tratada; En el que el ensayo se lleva a cabo sin pretratamiento de la muestra biológica antes de tratar con agente bisulfito.

Description

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DESCRIPCION
Ensayo de deteccion molecular Campo tecnico
La presente invencion se refiere a metodos para el procesamiento de muestras para ensayos de deteccion molecular, particularmente el procesamiento de muestras clmicas para ensayos de deteccion de acidos nucleicos para deteccion de enfermedades.
Antecedentes de la invencion
Las pruebas moleculares en seres humanos se han vuelto cada vez mas importantes para el diagnostico medico y el tratamiento de pacientes. Las pruebas moleculares en animales estan ganando importancia en aplicaciones veterinarias. Las pruebas de acidos nucleicos son una herramienta esencial para aplicaciones forenses, de inmigracion, de asignacion de paternidad y otras aplicaciones de identidad humana. La epigenetica es cada vez mas importante para la investigacion del cancer, la identificacion de biomarcadores, factores de predisposicion y objetivos de farmacos potenciales. La genotipificacion de ARN comprende una serie de aplicaciones utilizadas para analizar diferencias geneticas entre individuos o celulas, en todos los ambitos de la investigacion, pruebas aplicadas y diagnosticos. Cuando se trata de muestras biologicas, las presentes pruebas moleculares requieren pretratamiento espedfico de las muestras antes de llevar a cabo la deteccion de acidos nucleicos con tecnicas tales como reaccion en cadena de polimerasa (PCR). El pretratamiento de muestras actualmente se considera esencial y se han desarrollado muchos kits y sistemas comerciales que se utilizan en el mercado. Lamentablemente, el pretratamiento agrega un coste a las pruebas moleculares y requiere equipos y tiempo de procesamiento adicionales.
Human Genetic Signatures Pty Ltd (Sidney, Australia) ha desarrollado un metodo para la deteccion de microorganismos como se divulga en el documento WO 2006/058393 y US 7833942. El metodo implica tratar el acido nucleico microbiano de un microorganismo con un agente para formar una forma simplificada del acido nucleico derivado del acido nucleico microbiano que tiene secuencias de acidos nucleicos unicas que se pueden utilizar para detectar el microorganismo.
La presente invencion ha desarrollado un ensayo de deteccion molecular mejorado que no requiere pretratamiento de muestras como se requiere en los ensayos de deteccion molecular actualmente.
Resumen de la invencion
La presente invencion se refiere a un ensayo de deteccion molecular llevado a cabo en una muestra biologica que no requiere una etapa de limpieza de la muestra o el procesamiento de la muestra biologica para lisar las celulas o purificar el acido nucleico.
En un primer aspecto, la presente invencion proporciona un ensayo de deteccion molecular que comprende:
tratar una muestra biologica directamente con un agente de bisulfito en una concentracion de 2.5 M a 3.5 My un rango de pH de 4.5 a 5.5 calentar entre 75° C y 95° C durante 1 minuto a 30 minutos para permitir el tratamiento de acido nucleico e interrupcion celular;
eliminar el agente de bisulfito de la muestra tratada; y
detectar un acido nucleico objetivo en la muestra tratada, en el que el ensayo se lleva a cabo sin pretratamiento de la muestra biologica antes de tratar con el agente de bisulfito.
La muestra biologica requiere interrupcion celular o tratamiento qmmico/ffsico antes de la etapa (a).
La muestra biologica se puede seleccionar de muestra fecal, nasal, sangumea, plasma, suero, celulas bucales, pus, herida, filtrados concentrados, lfquido cefalorraqrndeo, semen, citologfa de base lfquida (LBC), tejido, FFPE, celulas capturadas por laser, celulas cultivadas, celulas sedimentadas, cultivos bacterianos, colonias bacterianas, suspensiones vmcas, aspirados, lavado bronquial, muestra de esputo, muestra ambiental, concentrado ambiental, productos alimenticios, materia prima, muestra de agua o concentrado de agua, y similares.
El acido nucleico detectado puede ser ADN, ARN o combinaciones de ADN y ARN.
El ensayo es adecuado para detectar una enfermedad infecciosa, enfermedad genetica o rasgo genetico en un animal. Preferiblemente, el animal es un ser humano.
La enfermedad infecciosa puede ser provocada por un microorganismo, incluso bacterias, virus, viroides, levaduras, hongos, priones, parasitos y amebas.
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La enfermedad genetica puede ser cancer, mutacion, variacion en el numero de copias, trastorno hereditario, enfermedad inducida por el ambiente, enfermedad provocada por la exposicion a carcinogenos, enfermedad caracterizada por la expansion o reduccion en una longitud de repeticion de nucleotidos en un genoma.
El rasgo genetico puede ser la susceptibilidad al cancer o cualquier otra enfermedad en donde los cambios geneticos y epigeneticos contribuyen al desarrollo de un estado de la enfermedad.
Preferiblemente, el agente de bisulfito es bisulfito de sodio o metabisulfito de sodio. Preferiblemente, el agente de bisulfito se utiliza en una concentracion de entre aproximadamente 2.5 M a aproximadamente 3.5M con un intervalo de pH entre aproximadamente 4.5 a aproximadamente 5.5. Mas preferiblemente, el agente de bisulfito se utiliza en una concentracion de aproximadamente 3M en un pH de aproximadamente 5.0.
Preferiblemente, la etapa (a) implica calentar entre aproximadamente 75° C y 95° C durante aproximadamente de 1 minuto a 30 minutos. Mas preferiblemente, la muestra se calienta durante aproximadamente de 10 a 20 minutos a una temperatura de entre aproximadamente 80° C y 95° C. Se apreciara que la temperatura y la duracion del calentamiento pueden variar dependiendo de la muestra que se trata y la fuente celular del acido nucleico que se va a detectar.
El bisulfito se puede eliminar de la muestra tratada a traves de cualquier medio adecuado. Ejemplos incluyen purificacion basada en columna o purificacion basada en perlas, que son optimas, pero en algunos casos una etapa de precipitacion sencilla puede ser suficiente.
Despues de la eliminacion del bisulfito, preferiblemente la muestra se resuspende en regulador de elucion que tiene un pH de por lo menos 10, mas preferiblemente entre aproximadamente pH 11.5 a aproximadamente 12.5. Se ha descubierto que un pH de por lo menos aproximadamente 12 es adecuado para la mayona de las muestras.
El agente de bisulfito modifica la citosina a uracilo en el acido nucleico tratado. En ADN de cadena doble, el agente de bisulfito modifica la citosina a uracilo en cada cadena del ADN genomico de cadena doble complementario que forma dos moleculas de acido nucleico derivado pero no complementario.
En una forma preferida, el acido nucleico microbiano derivado sustancialmente contiene bases adenina (A), guanina (G), timina (T) y uracilo (U) y tiene sustancialmente el mismo numero total de bases que el acido nucleico sin tratar correspondiente.
Si el acido nucleico tratado se amplifica, el acido nucleico amplificado contiene sustancialmente las bases adenina (A), guanina (G) y timina (T). La amplificacion se puede llevar a cabo mediante cualquier medio adecuado tal como reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), amplificacion isotermica o amplificacion de senal.
En una forma preferida, el ensayo incluye adicionalmente proporcionar sondas o cebadores de acido nucleico para la muestra tratada.
Preferiblemente, la muestra tratada sufre una reaccion de amplificacion para formar una molecula de acido nucleico objetivo espedfica para el microorganismo o indicador genetico.
La molecula de acido nucleico objetivo se detecta preferiblemente por amplificacion. Ejemplos de deteccion por amplificacion adecuada incluyen pCr, qPCR, PCR de transcriptasa inversa, PCR digital, amplificacion isotermica o amplificacion de senal.
El acido nucleico tratado tambien se puede detectar por un metodo de secuenciacion como los sistemas Roche 454, ABI SOLiD o Ion torrent Systems, Illumina Hi Seq SBS technology, Helicos Heliscope o tecnologfa SMRT empleada por Pacific Biosciences o cualquier otra tecnologfa equivalente.
En una forma preferida, la molecula de acido nucleico objetivo se detecta al:
Al proporcionar un ligando detector que se puede unir a una region objetivo de la molecula de acido nucleico especifica microbiana y permitiendo un tiempo suficiente para que el ligando detector se una a la region objetivo; y
medir la union del ligando detector a la region objetivo para detectar la presencia de la molecula de acido nucleico especifica microbiana.
En otra realizacion, el acido nucleico objetivo se detecta al secuenciar la muestra tratada.
En otra forma preferida, la molecula de acido nucleico objetivo se detecta al separar un producto de amplificacion y visualizar el producto separado. Preferiblemente, el producto de amplificacion se separa por electroforesis y se detecta por visualizacion de una o mas bandas en un gel.
Preferiblemente, la molecula de acido nucleico objetivo no se produce naturalmente en una celula.
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Tambien se describe un kit para un ensayo de deteccion molecular para tratamiento directo de una muestra, el kit comprende:
un reactivo de bisulfito;
reactivos de reaccion y elucion de acido nucleico; cebadores de PCR para el acido nucleico objetivo; e instrucciones para llevar a cabo el ensayo.
El kit puede incluir adicionalmente columnas de purificacion o separacion de acido nucleico, mezcla de reaccion PCR, reactivos para PCR, cebadores de acido nucleico de control, tubos de reaccion, tubos de ensayo, hisopos y similares.
A lo largo de esta especificacion, a menos que el contexto indique lo contrario, se entendera que la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implica la inclusion de un elemento indicado, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas, pero no la exclusion de cualquier otro elemento, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas.
Cualquier planteamiento de los documentos, actos, materiales, dispositivos, artfculos o similares que se han incluido en la presente especificacion es solamente a los efectos de proporcionar un contexto para la presente invencion. No se debe tomar como una admision de que cualquiera o todos estos asuntos forman el componente de la base de la tecnica anterior o eran el conocimiento general comun en el campo relevante para la presente invencion tal como existfa en Australia antes del desarrollo de la presente invencion.
Para que se entienda mas claramente la presente invencion, se describiran realizaciones preferidas con referencia a los siguientes dibujos y ejemplos.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestran los resultados de la deteccion de C. difficile utilizando la presente invencion. A. El canal Fam es espedfico para los genes tcdA/B de C. difficile; B. muestra el canal Cy5 espedfico para el control de extraccion.
La figura 2 muestran los resultados de amplificacion de tres virus a partir de la misma muestra. A. Fam=Norovirus (virus de ARN de cadena sencilla); B. Hex=Adenovirus (virus de ADN de cadena doble; C. Cy5=Rotavirus (virus de ARN de cadena sencilla).
La figura 3 Muestra el efecto de agregar celulas humanas en materia fecal. A. muestra las celulas MRC5 humanas calentadas durante 15 minutos en reactivo bisulfito 3M a 95° C, luego resuspendidas en regulador de pH alto (12.3) y amplificadas para el gen humano p-globina. B. muestra las mismas celulas adicionadas en materia fecal calentadas durante 15 minutos en reactivo bisulfito 3M a 95° C, luego resuspendidas en regulador de pH alto (12.3) y amplificadas para el gen humano p-globina.
Modos para llevar a cabo la invencion
Ventajas
La presente invencion tiene muchas ventajas sobre los metodos de la tecnica anterior que incluyen lo siguiente.
a. La lisis de las celulas y la conversion de acido nucleico de la muestra se producen simultaneamente en el mismo tubo y se alcanza la conversion y la lisis y en menos de 30 minutos, e incluso se pueden alcanzar en tan poco como en 10 a 20 minutos.
b. Las muestras tales como la materia fecal se pueden procesar directamente sin perdida de sensibilidad.
c. Las pruebas basadas en la presente invencion tienen la ventaja de poder realizarse en la muestra primaria de un paciente sin pretratamiento con enzimas tales como proteinasa K.
d. El metodo no requiere ningun metodo de purificacion costoso, por ejemplo los kits de purificacion comerciales actualmente en el mercado. Estos kits comerciales estan disponibles para casi cualquier tipo de muestra tales como sangre, heces, celulas cultivadas, FFPE, bacterias, virus y parasitos, por mencionar solo algunos. Estos kits comerciales pueden llegar a costar miles de dolares y pueden tardar de 2 a 4 horas para purificar una muestra. Casi todos los laboratorios en el mundo utilizan estos kits para la purificacion de la muestra antes de cualquier etapa de amplificacion posterior en ensayos moleculares empleados actualmente.
e. Despues de la eliminacion del bisulfito la muestra se resuspende en un regulador de elucion simple que no requiere ningun tratamiento adicional tal como desulfonacion por calor, simplificando asf el proceso.
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f. El metodo puede detectar simultaneamente virus de ARN y ADN en el mismo tubo de la misma muestra sin necesidad de utilizar un kit de purificacion viral especializado. Los virus de ARN y ADN (incluso aunque uno es de cadena sencilla y uno es de cadena doble) se someten a lisis y se convierten con igual eficiencia por la presente invencion.
g. Sorprendentemente, el regulador de elucion, que tiene un pH alto, no degrada el ARN. Este hallazgo contradice lo que se ha ensenado en la tecnica anterior ya que el principio de la tecnica anterior recomienda espedficamente que se evite el tratamiento de ARN a temperaturas y pH altos.
h. El metodo puede someter a lisis y convertir todos los tipos bacterianos utilizando condiciones similares de esta manera se puede utilizar una unica muestra de paciente para multiples pruebas para detectar C. difficile, Salmonella, Campylobacter y parasitos, etc. eliminando asf el problema de un metodo de extraccion independiente para cada bacteria o microorganismo objetivo.
i. El metodo es aplicable a muestras diffciles de lisar tales como parasitos, que pueden formar una capa exterior fuerte que las hace resistentes a tecnicas de lisis convencionales. Por lo tanto, sena ideal detectar organismos objetivo tales como Mycobacterium tuberculosis (TB) (muy resistentes a las tecnicas de lisis convencionales), ya que se requieren pruebas de diagnostico basadas en acidos nucleicos sensibles.
j. El metodo puede someter a lisis y convertir de manera eficiente el virus de la hepatitis C (HCV) directamente de suero utilizando tan solo 10 copias del virus demostrando la utilidad de detectar virus de ARN importantes en un nivel muy bajo.
k. El metodo tambien reduce el tiempo de procesamiento de pruebas por muchas horas y elimina el problema de que la muestra tema que ser purificada, luego convertida con bisulfito y purificada nuevamente como se lleva a cabo actualmente.
l. El metodo es adecuado para la deteccion sensible de cancer colorrectal en la materia fecal del paciente. Dichas muestras no son invasivas y reducinan la dependencia de la endoscopia como el medio de deteccion primario. Adicionalmente, se esperana una "muestra para dar como resultado" en menos de tres horas sin proceso de procesamiento complejo de muestras. El uso de materia fecal sobre muestras de suero para el diagnostico tiene muchas ventajas, la mas significativa es que es probable que haya una gran cantidad de celulas humanas en la muestra, a diferencia de las muestras de suero en donde la sensibilidad siempre es un problema importante.
Muestras
La presente invencion es adecuada para procesar muestras que incluyen muestra fecal, nasal, sangumea, plasma, suero, celulas bucales, pus, herida, filtrados concentrados, lfquido cefalorraqrndeo, semen, citologfa de base lfquida (LBC), tejido, FFPE, celulas capturadas por laser, celulas cultivadas, celulas sedimentadas, cultivos bacterianos, colonias bacterianas, suspension viral, aspirados, lavado bronquial, muestra de esputo, muestra ambiental, concentrado ambiental, productos alimenticios, materia prima, muestra de agua, concentrado de agua, o similares.
Tratamiento de la muestra (HGS)
El siguiente es un metodo preferido para tratar una muestra de acuerdo con la presente invencion. Se coloca la muestra directamente en 200 pl de bisulfito de sodio 3M (rango 2.5 a 3.5M) de pH 5.0 (rango de pH de 4.5 a 5.5) y se calienta entre aproximadamente 75° C y 95° C entre 10 y 20 minutos.
Se elimina el bisulfito de la muestra tratada mediante cualquier medio adecuado. Ejemplos incluyen purificacion basada en columna o purificacion basada en perlas, que son optimas, pero en algunos casos puede ser suficiente una etapa de precipitacion sencilla.
Despues de la eliminacion del bisulfito, la muestra se resuspende en regulador de elucion que tiene un pH de entre 11.5 a 12.5 (>pH 12 preferido).
La muestra esta lista para la amplificacion por PCR sin procesamiento adicional.
Eliminacion de bisulfito
Se puede utilizar la eliminacion de bisulfito a traves de un metodo disponible a nivel comercial tal como la tecnica de MethylEasy™ (Human Genetic Signatures). En resumen, se agrega 240 pl de reactivo No. 3 a la muestra y la muestra se transfiere a una columna de centrifugacion. La columna se centrifuga a 10.000 xg para eliminar el bisulfito. La columna se lava x2 con 300 pl de reactivo No. 4 que gira a 10.000 xg entre lavados. Se agrega de 20 a 50 pl de regulador de elucion y la muestra se centrifuga en un tubo de recoleccion limpio. La muestra esta lista para amplificacion por PCR.
Pretratamiento de la muestra
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El pretratamiento de la muestra actual implica kits comerciales comercializados por Qiagen Inc (Valencia, CA 91355 EUA), Sigma Life Sciences (St Louis, MO, EUA), Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA 92008, EUA) y Promega Corporation (Madison, WI 53711 EUA).
La presente invencion se comparo con los siguientes metodos.
Prueba “interna” en hospital
Se calento una muestra de heces a 95° C durante 10 minutos, luego se diluyo y la muestra se amplifico para el gen tcdB de C. difficile.
Purificacion de Qiagen
QIAamp DNA Stool Mini Kit (50) Cat No. 51504.
Pruebas comerciales de parasitos
Parasitos gastrointestinales de AusDiagnostics 5, numero de catalogo: 6502.
Resultados Muestras fecales
Todas las muestras fecales evaluadas en las tablas 1,2, 3 y 4 se trataron de la siguiente forma:
Se coloco un hisopo en materia fecal y luego se transfirio a un tubo que contema 200 pl de bisulfito de sodio 3M pH 50, se mezclo y luego se calento a 95° C durante 15 minutos.
Se elimino el bisulfito utilizando el metodo de MethylEasy™ y las muestras se resuspendieron en 20 a 50 pl de regulador de elucion, luego se amplificaron utilizando condiciones estandar.
La tabla 1 muestra los resultados de una prueba interna de hospital, las mismas muestras evaluadas utilizando la purificacion de Qiagen y las mismas muestras evaluadas utilizando el metodo de acuerdo con la presente invencion. Como se puede observar a partir de los resultados, la prueba interna de hospital produjo 7 resultados negativos falsos y 1 resultado positivo falso (confirmado por EIA y cultivado asf como un kit de diagnostico molecular disponible a nivel comercial) que indican que el metodo no tema la sensibilidad requerida para la deteccion de C. difficile en muestras primarias de un paciente. Utilizando el metodo de Qiagen, 4 muestras no tuvieron suficiente material para procesar mientras 1 muestra dio un resultado negativo falso (GDH positivo por EIA). Estos resultados demuestran la utilidad del metodo de acuerdo con la presente invencion (metodo hGs) para el diagnostico rapido de C. difficile. Adicionalmente, las muestras que tienen volumenes limitados se evaluan facilmente utilizando el metodo HGS. Adicionalmente, el metodo Qiagen requiere un tiempo de preparacion de la muestra de por lo menos 2 horas y tiene que pesar cantidades predeterminadas de materia fecal.
Tabla 1. Resultados de la prueba interna de hospital contra purificacion de Qiagen contra metodo HGS para la deteccion de C. difficile.
# de muestra
"interna" Qiagen HGS # de muestra "interna" Qiagen HGS
1
NEG NEG NEG 24 NEG POS POS
2
POS POS POS 25 POS INSUF POS
3
NEG NEG POS 26 NEG NEG NEG
4
POS POS POS 27 NEG POS POS
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POS POS POS 28 NEG NEG NEG
6
NEG NEG NEG 29 NEG NEG NEG
7
POS POS POS 30 NEG NEG NEG
8
NEG POS POS 31 POS INSUF POS
9
NEG NEG NEG 32 POS POS POS
10
NEG NEG NEG 33 NEG NEG NEG
11
NEG NEG NEG 34 NEG NEG NEG
12
NEG POS POS 35 NEG NEG NEG
13
NEG NEG NEG 36 NEG NEG NEG
14
NEG NEG NEG 37 NEG NEG NEG
15
POS NEG NEG 38 NEG POS POS
16
NEG NEG NEG 39 POS POS POS
17
NEG NEG NEG 40 POS POS POS
18
NEG INSUF NEG 41 POS POS POS
19
NEG NEG NEG 42 POS POS POS
20
NEG POS POS 43 POS INSUF POS
21
POS POS POS 44 NEG NEG NEG
22
POS POS POS 45 NEG NEG NEG
23
NEG NEG NEG
Tabla 2. Resultados de la microscopia estandar vs kit de deteccion de parasitos disponible a nivel comercial vs metodo HGS.
Parasito Detectado Parasitos Intestinales EasyPlex 5 Negativo Otros Resultados Clmicos
# de muestra 1
Giardia intestinalis HGS Giardia intestinalis
2
Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
3
Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
4
Cryptosporidium spp. Negativo Cryptosporidium spp
5
Cryptosporidium spp. Negativo Cryptosporidium spp
6
Cryptosporidium spp. Negativo Cryptosporidium spp
7
Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
8
Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
9
Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
10
Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp and Entamoeba
11
Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp.
12
Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp.
13
Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis and Entamoeba
14
Giardia intestinalis Cryptosporidium spp. Giardia intestinalis and Entamoeba
15
Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis and Entamoeba
16
Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
17
Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
18
D.fragilis, G.lamblia Cryptosporidium spp. Giardia intestinalis, Dientamoeba y Salmonella spp. Salmonella Aislada
19
Giardia intestinalis Giardia Giardia intestinalis
Giardia
20
intestinalis Giardia Negativo Giardia intestinalis
21
intestinalis Cryptosporidium spp. Giardia intestinalis
Cryptosporidium
22
spp. Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp.
Giardia Giardia intestinalis,
23
intestinalis Negativo Dientamoeba y Campy C. jejuni Aislado
Giardia
24
intestinalis Giardia Negativo Giardia intestinalis
25
intestinalis Giardia Negativo Giardia intestinalis
26
intestinalis Negativo Giardia intestinalis
27
NPI Negativo Negativo
28
NPI Negativo Negativo
29
NPI Negativo Negativo
Cryptosporidium Cryptosporidium spp. y No Shigella
30
spp. Cryptosporidium spp. Shigella Aislada
Cryptosporidium Cryptosporidium spp. y No Shigella
31
spp. Cryptosporidium spp. Shigella Aislada
Cryptosporidium Cryptosporidium spp. y No Shigella
32
spp. Cryptosporidium spp. Shigella Aislada
Cryptosporidium Cryptosporidium spp. y No Shigella
33
spp. Cryptosporidium spp. Shigella Aislada
Cryptosporidium Cryptosporidium spp. y No Shigella
34
spp. Cryptosporidium Cryptosporidium spp. Shigella Aislada
35
spp. Cryptosporidium spp. Cryptosporidium spp.
Giardia Giardia intestinalis, Shigella spp tambien
36
intestinalis Giardia Entamoeba, Shigella aislada
0
Giardia
37
intestinalis Negativo Giardia intestinalis Shigella spp tambien
Giardia Giardia intestinalis, aislada.
38
intestinalis Giardia Entamoeba, Shigella
Giardia Giardia intestinalis, Shigella spp tambien
39
intestinalis Giardia Entamoeba, Shigella aislada.
40
NPI Negativo Negativo
41
NPI Negativo Giardia intestinalis
42
NPI Negativo Negativo
43
NPI Negativo Giardia intestinalis
Giardia
44
intestinalis Giardia Negativo Giardia intestinalis
45
intestinalis Negativo Giardia intestinalis
46
NPI Negativo Giardia intestinalis
47
NPI Negativo Giardia intestinalis
48
NPI Negativo Giardia intestinalis
Giardia
49
intestinalis Negativo Giardia intestinalis
Giardia
50
intestinalis Negativo Giardia intestinalis
5
10
15
20
25
51
Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
52
NPI Negativo Salmonella spp No cultivado
53
Giardia intestinalis Negativo Giardia intestinalis
54
Giardia intestinalis Giardia Giardia intestinalis
Todas las muestras resaltadas pertenecen a mismo paciente.
La tabla 2 muestra los resultados de una comparacion directa del microscopio estandar, una prueba comercial de parasitos (Ausdiagnostic Easy-Plex Gastrointestinal parasite 5) y el metodo hGs. Como se puede observar a partir de los resultados, el metodo comercial no puede someter a lisis a muchas de las pruebas que contienen quistes de Giardia. Esto contrasta con el metodo HGS que detectan facilmente todas las muestras de Giardia y tambien algunas muestras que se pierden mediante microscopio convencional. Adicionalmente, el metodo HGS parece ser universal para la lisis de bacterias y parasitos igual que un numero de muestras contenidas en los parasitos y bacterias, resultados que posteriormente fueron confirmaron por el hospital.
La tabla 3Muestra los resultados del metodo HGS vs metodos de cultivo convencionales para la deteccion de microbios. Como se puede observar, el metodo de cultivo no pudo detectar una muestra que contema A Campylobacter spp que el metodo molecular detectado. Adicionalmente, no se detecto ninguna reactividad cruzada con las muestras que conteman C. difficile. Todos los resultados de cultivo positivos estuvieron de acuerdo con el metodo HGS que indicaba la sensibilidad mejorada de los metodos moleculares en comparacion con el cultivo convencional. Por otra parte, los resultados del metodo HGS estan disponibles en tan solo 3 horas en comparacion con cultivos durante la noche requeridos para los metodos de cultivo convencionales.
Tabla 3. Resultados de los metodos de cultivo convencionales para la deteccion de bacterias contra el metodo HGS.
Muestra
Cultivo Campy Salmon Muestra Cultivo Campy Salmon
A01
Salmon N/A 23.77 A23 Campy 32.57 N/A
A02
NPI N/A N/A A24 Salmon N/A 30.98
A03
Salmon N/A 29.7 A25 Campy 31.18 N/A
A04
Salmon N/A 26.06 A26 Salmon N/A 45.32
A05
Campy 39.18 N/A A27 Campy 41.49 N/A
A06
Campy 44.37 N/A A28 Campy 38.69 N/A
A07
Campy 39.88 N/A A29 Campy 38.36 N/A
A08
Salmon N/A 39.83 A30 Salmon N/A 38.3
A09
CD N/A N/A A31 CD N/A N/A
A10
Campy 35.39 N/A A32 Salmon N/A 35.76
A11
NPI 36.09 N/A A33 Campy 35.61 N/A
A12
Campy 35.72 N/A A34 CD N/A N/A
A13
Salmon N/A 30.21 A35 Campy 36.12 N/A
A14
Salmon N/A 30.24 A36 Campy 39.96 N/A
A15
Campy 40.05 N/A A37 Salmon N/A 37.53
A16
Salmon N/A 27.06 A38 Campy 46.2 N/A
A17
Campy 36.26 N/A A39 Campy 35.96 N/A
A18
Campy 44.81 N/A A40 Campy 47.31 N/A
A19
Campy 26.57 N/A A41 Salmon N/A 30.3
A20
Campy 29.8 N/A A42 Salmon N/A 37.14
A21
Salmon N/A 26.58 A43 CD N/A N/A
A22
Campy 34.78 N/A
Condiciones de tratamiento
Se evaluaron cuatro muestras de heces, 3 positivas para C. difficile y 1 negativa para C. difficile para determinar el efecto de la temperatura y el tiempo en la eficiencia de extraccion. Tambien se incluye un control de extraccion (16s gen ADNr) para determinar el efecto de las condiciones en la flora mezclada que esta presente dentro de las muestras de heces. El canal Fam es espedfico para los genes tcdA/B de C. difficile mientras que el canal Cy5 es espedfico para el control de extraccion. Los resultados se muestran en las figuras 1 y en la tabla 4.
5
10
15
20
25
30
Como se puede observar a partir de los resultados en la tabla 4, la temperatura y los tiempos preferidos para la lisis de estas muestras son entre 85° C y 95° C durante 15 minutos. Todas las muestras positivas y la flora fecal se detectaron facilmente.
Tabla 4. El efecto del tiempo y la temperatura en la eficiencia del metodo de lisis/conversion HGS utilizando muestras de heces.
10 min/85° C 15 min/85° C 20 min/85° C
TcdA/B ExCon TcdA/B ExCon TcdA/B ExCon
Muestra 1
44.73 34.54 40.46 31.91 39.1 31.08
Muestra 2
41.57 35.09 41.59 30.31 40.23 29.09
Muestra 3
N/A 32.76 N/A 28.15 N/A 27.25
Muestra 4
42.6 30.19 N/A 30.26 46.22 28.91
10 min/90° C 15 min/90° C 20 min/90° C
TcdA/B ExCon TcdA/B ExCon TcdA/B ExCon
Muestra 1
41.66 32.17 39.63 30.39 39.88 30.73
Muestra 2
41.19 29.05 41.25 27.53 41.33 25.17
Muestra 3
N/A N/A N/A 27.31 N/A 26.6
Muestra 4
42.63 28.69 43.88 27.27 N/A 27.86
10 min/95° C 15 min/95° C 20 min/95° C
TcdA/B ExCon TcdA/B ExCon TcdA/B ExCon
Muestra 1
40.48 30.82 39.53 31.52 39.52 29.74
Muestra 2
40.38 26.41 40.3 26.31 42.21 30.52
Muestra 3
N/A 27.08 N/A 27.47 N/A 37.35
Muestra 4
41.93 27.64 40.31 27.76 42.2 26.66
Tabla 5. El efecto del pH del regulador de elucion en la capacidad del metodo para detectar de manera eficiente HCV directamente de muestras de suero
70°C 75°C 80°C 90°C
5 min
10 min 15 min 5 min 10 min 15 min 5 min 10 min 15 min 5 min 10 min 15 min
PCR-A-pH 11.5
N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
PCR-A-pH 12.5
N/A 36.83 36.01 N/A 33.27 34.8 36.88 33.02 N/A 34.45 34.22 33.14
PCR-B-pH 11.5
N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
PCR-B-pH 12.5
N/A 39.34 37.17 N/A 35.76 36.2 40.98 35.05 N/A 36.21 36.48 35.51
Se agregaron 10 pl de HCV (Acrometrix) a 200 pl de bisulfito de sodio 3M y se calento a 75° C, 75° C, 80° C y 90° C durante 5, 10 o l5 minutos. Se elimino el bisulfito utilizando un metodo de MethylEasy™ modificado y las muestras se resuspendieron en 20 pl de regulador de elucion, se transcribieron inversamente 12 pl y se amplificaron 2 pl utilizando condiciones estandar.
Como se puede observar a partir de los resultados de la tabla 5 ARN de HCV puede soportar facilmente la conversion de lisis a 90° C, la mayor temperatura evaluada. Aun mas sorprendente, el ensayo funciono para la deteccion de virus de ARN en presencia de regulador con pH alto, lo cual es contrario a las publicaciones que indican que las especies de ARN necesitan ser mantenidas alrededor de pH neutral.
Estos resultados combinados con los resultados de la tabla 4 sugieren que una temperatura de aproximadamente 90° C durante 15 minutos podna ser un metodo de procesamiento de muestra universal para los organismos con presencia de ADN de cadena doble como C. difficile y los virus de ARN de cadena sencilla como el HCV. Adicionalmente, como C. difficile es un organismo que contiene esporas, los resultados indican que el metodo es lo suficientemente duro como para abrir las esporas resistentes, pero lo suficientemente suave como para que los virus que contienen ARN no se degraden. Una vez mas, estos datos no han sido predichos por la tecnica anterior.
PCR A y B difieren en la mezcla de reaccion utilizada (JumpStart (Sigma) y FastStart (Roche) respectivamente).
Suero
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Se prepararon diluciones de HCV (Zeptoometrix), se agregaron 10 |jl de cada dilucion a 200 |jl de bisulfito de sodio 3M y se calento a 75° C durante 10 minutes.
Se elimino el bisulfito utilizando el metodo de MethylEasyTM y las muestras se resuspendieron en 20 jl de regulador de elucion, se transcribieron inversamente 12 jl y se amplificaron 2 jl utilizando condiciones estandar.
Tabla 6. Deteccion sensible de virus HCV directamente desde el suero.
1\10
HCV/PCR 200 UI/PCR 32.54 Positivo 34.41
1\100
20 37.07 38.32
1\1000
2 37.54 38.63
1\10000
0.2 N/A N/A
1/100000
0.02 N/A N/A
Proceso
N/A N/A
Como se puede observar a partir de la tabla 6, cuando se utiliza el metodo HGS para procesar el suero directamente, solo se pueden someter a lisis y convertir de manera eficiente 2 UI de HCV simultaneamente. Estos resultados demuestran la excelente sensibilidad que se puede generar utilizando los virus de ARN como objetivo para el proceso.
Tabla 7. Lisis/conversion simultanea de virus de ARN y virus de ADN en condiciones identicas de extraccion.
La figura 2 muestra la amplificacion de los tres virus de la misma muestra.
A. Fam=Norovirus (virus de ARN de cadena sencilla).
B. Hex=Adenovirus (virus de ADN de cadena doble).
C. Cy5=Rotavirus (virus de ARN de cadena sencilla).
Se obtuvieron muestras cualitativas de Norovirus, Adenovirus y Rotavirus de Zeptometrix. Se agregaron las muestras de cada virus (10 jl) a bisulfito de sodio 3M y se calentaron las muestras a 90° C durante 10, 15 y 20 minutos. Se elimino el bisulfito utilizando un metodo de MethylEasy™ modificado y se resuspendieron las muestras en 20 jl de regulador de elucion, se transcribieron inversamente 12 jl y se amplificaron 2 jl utilizando condiciones estandar.
Como se puede observar a partir de la tabla 7, despues de calentamiento durante 15° C a 90° C, se sometieron a lisis y se convirtieron de manera eficiente los virus de ARN y de ADN. Se purificaron ambos tipos de virus en condiciones identicas. Estos resultados demuestran adicionalmente la utilidad del metodo HGS como un metodo de preparacion de muestras universal para la lisis y conversion eficiente de los virus de ADN y de ARN de la misma muestra. Nuevamente, de forma sorprendente, los virus de ARN pueden soportar facilmente el tratamiento de la muestra a 90° C y regulador con pH alto.
Tabla 7. Lisis/conversion simultanea de virus de ARN y virus de ADN en condiciones identicas de extraccion.
Fam Norovirus
Hex Adenovirus Cy5 Rotavirus
10 min 15 min 20 min PC 10 min 15 min 20 min PC 10 min 15 min 20 min PC
Puro
31.75 29.67 30.09 N/A 36.32 32.36 36.37 N/A 34.5 32.13 37.35 N/A
1\10
35.61 33.25 31.96 N/A N/A 36.45 N/A N/A 40.04 34.5 38.6 N/A
1\100
40.51 38.87 35.84 N/A N/A 44.67 N/A N/A 39.32 38.57 N/A N/A
Se agregaron muestras cualitativas de Norovirus, Adenovirus y Rotavirus obtenidas de Zeptometrix a muestras fecales. Se agregaron muestras de los virus (10 jl) a materia fecal y se mezclo la muestra. Se coloco un hisopo en materia fecal y luego se transfirio a un tubo que contema 200 jl de bisulfito de sodio 3M de pH 5.0 y luego se calento a 90° C durante 15 minutos.
Se elimino el bisulfito utilizando un metodo de MethylEasy™ modificado y se resuspendieron las muestras en 20 jl de regulador de elucion, se transcribieron inversamente 12 jl y se amplificaron 2 jl utilizando condiciones estandar.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tabla 8. Efecto de agregar virus a las muestras fecales.
Norovirus Adenovirus Rotavirus Proceso
Adicion de Adenovirus
N/A 41.1 N/A N/A
Adicion de Norovirus
39.45 N/A N/A N/A
Adicion de Rotavirus
N/A N/A 39.62 N/A
Los resultados de la tabla 8 muestran que incluso cuando se agregaron partfculas virales a las muestras fecales y se aplico la condicion universal, los virus de ADN y de ARN se sometieron a lisis y se convirtieron de manera eficiente. Por lo tanto, el metodo debena ser aplicable a cualquier tipo de muestra para cualquier microorganismo de interes.
Celulas humanas
Para determinar si la presente invencion tambien es adecuada para detectar enfermedades humanas como el cancer, se incubaron 5 pl, 10 pl y 20 pl de celulas humanas diluidas durante 10 minutos o 15 minutos a 70° C, 80° C, 90° C y 95° C en 200 pl de bisulfito 3M. Se procesaron las muestras para extraer la solucion de bisulfito y se resuspendieron en 50 |jl de regulador pH 12.3. Se amplifico el material (2 pl) utilizando cebadores y sondas espedficos para el gen humano de 13-globina. Los resultados se muestran en la tabla 9 y en la figura 3.
Tabla 9. Optimizacion de tiempo/temperatura utilizando celulas MRC5 humanas.
70°C 80°C 90°C 95°C
10 min 15 min 10 min 15 min 10 min 15 min 10 min 15 min
5 celulas ul
N/A N/A 42.15 43.63 38.62 33.19 ND ND
10 celulas ul
N/A N/A 40.72 36.45 35.04 33.31 37.11 33.8
20 celulas ul
N/A N/A 45.08 37.03 36.38 32.49 ND ND
ND=no hecho.
Como se puede observar a partir de la tabla 9, el tiempo y la temperatura preferidos para la lisis y conversion simultanea de celulas humanas sin pretratamiento es entre 90° C a 95° C durante 15 minutos.
La figura 3 muestra el efecto de agregar celulas humanas en materia fecal. La figura 3A muestra las celulas MRC5 humanas calentadas durante 15 minutos en reactivo de bisulfito 3M a 95° C, luego resuspendidas en regulador de pH alto (12.3) y amplificadas para el gen humano de p-globina. La figura 3B muestra las mismas celulas adicionadas en materia fecal calentadas durante 15 minutos en 3M de reactivo de bisulfito a 95° C, luego resuspendidas en regulador de pH alto (12,3) y amplificadas para el gen de p-globina humano. Como se puede observar a partir de los resultados, se pueden someter a lisis y convertir de manera eficiente las celulas humanas en materia fecal humana primaria sin ninguna necesidad de preprocesamiento de la muestra o aislamiento de ADN.
Los resultados indican que el perfilado por metilacion de las celulas humanas se puede llevar a cabo directamente en muestras fecales obtenidas de un paciente sin la necesidad de un pretratamiento o una purificacion de la muestra antes del bisulfito. Por lo tanto, el metodo sena ideal como un metodo no invasivo y simple para el diagnostico del cancer colorrectal directamente a partir de la materia primaria del paciente.
Kits de pruebas de diagnostico
La presente invencion se puede proporcionar en forma de kits de diagnostico para permitir la facilidad de uso en un laboratorio de diagnostico o similar. La tabla 10 y la tabla 11, por ejemplo, muestran los reactivos proporcionados en un kit de prueba tfpico para un microorganismo. El kit incluye instrucciones de uso. Se apreciara que es posible que los tubos, los hisopos y otros equipos de laboratorio no se proporcionen en un kit ya que estos materiales, generalmente, estan facilmente disponibles en un laboratorio de diagnostico.
Tabla 10. Caja 1 de 2 (almacenamiento a temperatura ambiente)
Nombre del componente
Contenidos
Reactivo 1 (Agua alcalina)
5 x 5 mL
Reactivo 2 (Bisulfito)
5 x 3.5 g
Reactivo 3 (Reactivo de union)
5 x 5.8 mL
Reactivo 4 (Regulador de lavado)
5 x 3ML
Reactivo 5 (Regulador de elucion)
5 x 3ML
Hisopos Hinchados
100
Tubos de reaccion (1.5 mL)
100
Tubos de lavado
100
Tubos de recoleccion (1.5 mL)
100
Columnas de purificacion
100
Grna detallada de usuario
1
Tabla 11. Caja 2 de 2 (almacenamiento a -20° C luego de recepcion)
PCR mezcla de reaccion
x 5 frascos
PCR componentes
x 5 frascos
5 La caja 2 se debe almacenar a -20° C en una "habitacion libre de" ADN en una ubicacion diferente del lugar donde se procesaran las muestras.
Los kits para microorganismos espedficos o pruebas geneticas incluyen cebadores de PCR para permitir la amplificacion de la molecula de acido nucleico objetivo.
10

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    Reivindicaciones
    Un ensayo de deteccion molecular que comprende:
    tratar una muestra biologica directamente con un agente de bisulfito en na concentracion de 2.5M a 3.5M y un rango de pH de 4.5 a 5.5 y calentar entre 75° C a 95° C por 1 a 30 minutos para permitir la interrupcion celular y el tratamiento con acido nucleico;
    retirar el agente bisulfito de la muestra tratada; y detectar un acido nucleico objetivo en la muestra tratada;
    En el que el ensayo se lleva a cabo sin pretratamiento de la muestra biologica antes de tratar con agente bisulfito.
  2. 2. El ensayo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el cual la muestra biologica se selecciona de una muestra fecal, nasal, sangumea, plasma, suero, celulas bucales, pus, herida, filtrados concentrados, lfquido cefalorraqmdeo, semen, citologfa de base liquida (LBC), tejido, FFPE, celulas capturadas por laser, celulas cultivadas, celulas sedimentadas, cultivos bacterianos, colonias bacterianas, suspension viral, aspirados, lavado bronquial, muestra de esputo, muestra ambiental, concentrado ambiental, productos alimenticios, materia prima, muestra de agua o concentrado de agua.
  3. 3. El ensayo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2 para detectar una enfermedad infecciosa, enfermedad genetica o rasgo genetico en un animal.
  4. 4. El ensayo de acuerdo con la reivindicacion 3 en el cual la enfermedad infecciosa es provocada por un microorganismo; preferiblemente el microorganismo es una bacteria, virus, viroides, levadura, hongos, parasitos o amebas.
  5. 5. El ensayo de acuerdo con la reivindicacion 2 en el cual la enfermedad genetica es cancer, una enfermedad asociada con variacion en el numero de copias, trastorno hereditario, enfermedad inducida por el ambiente, enfermedad provocada por la exposicion a carcinogenos, enfermedad caracterizada por la expansion o reduccion en una longitud de repeticion de nucleotidos.
  6. 6. El ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el cual el agente de bisulfito es bisulfito de sodio o metabisulfito de sodio.
  7. 7. El ensayo de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 1 a 6, en el que el agente bisulfito se utiliza en una concentracion de 3M en un pH de 5.0.
  8. 8. El ensayo de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 1 a 7 en el que la muestra biologica se caliente durante 10 a 20 minutos a una temperatura de entre 80° C y 95° C.
  9. 9. El ensayo de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 1a 8 en el que el bisulfito se elimina mediante purificacion basada en columna, purificacion basada en perlas o precipitacion.
  10. 10. El ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 9 en el que despues del retiro del bisulfito, la muestra tratada se resuspende en regulador de elucion que tiene un pH de por lo menos 10; preferiblemente el regulador de elucion tiene un pH de entre 11.5 y 12.5.
  11. 11. El ensayo de acuerdo con la reivindicacion 10 en el que el regulador de elucion tiene un pH de por lo menos 12.
  12. 12. El ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11 que incluye adicionalmente proporcionar sondas o cebadores de acido nucleico a la muestra tratada.
  13. 13. El ensayo de acuerdo con la reivindicacion 12 en que la molecula de acido nucleico objetivo se detecta mediante amplificacion.
  14. 14. El ensayo de acuerdo con la reivindicacion 13 en el que la amplificacion es PCR, qPCR, PCR de trascripcion inversa, PCR digital, amplificacion isotermica O amplificacion de senal.
  15. 15. El ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en el cual el acido nucleico objetivo se detecta mediante secuenciacion de la muestra tratada.
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