CN101903521A

CN101903521A - 核酸扩增相关污染物的清除

Info

Publication number: CN101903521A
Application number: CN2008801218105A
Authority: CN
Inventors: 道格拉斯·斯潘塞·米勒
Original assignee: Human Genetic Signatures Pty Ltd
Current assignee: Human Genetic Signatures Pty Ltd
Priority date: 2007-12-20
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2010-12-01
Also published as: EP2222850A1; CA2709632A1; EP2222850A4; WO2009079703A1; AU2008341021A1; US20110003700A1; JP2011505845A

Abstract

本发明涉及非天然碱基和能够降解含非天然碱基的核酸的酶在扩增反应中清除所述扩增反应中残留污染物的应用。

Description

核酸扩增相关污染物的清除

技术领域

本发明涉及克服扩增反应中扩增子带来潜在残留污染的策略。

背景技术

在约1985年开发的聚合酶链式反应(PCR)(Saiko，R.K.，Scharf，S.，Faloona，F.，Mullis，K.B.，Horn，G.T.，Erlich，H.A.，Arnheim，N.(1985).Science.230：1350-1354)已经为生物学体系的研究带来了革命，其能够从几乎任何靶生物体检测和指数性扩增少量核酸(DNA或RNA)。常规PCR反应包括嗜热酶如Taq DNA聚合酶、镁离子(Mg²⁺)和四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)(脱氧腺嘌呤三磷酸(dATP)、脱氧鸟嘌呤(dGTP)、脱氧胸腺嘧啶(dTTP)和脱氧胞嘧啶(dCTP))的混合物。理论上，一个拷贝的核酸分子可被指数性扩增产生足够的扩增材料，使得能够容易地通过琼脂糖凝胶电泳观察到产物。因此，如果进行40个循环的扩增，在单个反应中将产生约2×10¹²拷贝的靶核酸(约2ⁿ拷贝，其中n是所用的PCR循环数)。

由于PCR中产生大量扩增子，如果不实施管理扩增产物(本文称为扩增子)意外释放的策略，残留污染会成问题。从PCR出现起，已经开发出此方法的衍生方法，以及核酸扩增新方法(如逆转录酶-PCR(RT-PCR)、连接酶链反应、等温扩增、滚环扩增)，全部这些都易于发生残留污染。残留污染物的存在是假阳性结果的一个原因。在研究实验室中，假阳性结果，特别是由残留污染物引起的假阳性结果将造成数据无效。因此，实验必须以大大增加的成本和人力来重做。在临床中，与残留污染相关或无关的假阳性结果会造成严重后果，特别是如果使用此结果来定患者处理用的正确药物疗法。

残留污染的发生是之前扩增的靶DNA意外或无察觉的进入分析物的结果。因为实验操作差，或实验设备、一次性和非一次性的玻璃制品、塑料制品和试剂污染以及测试物(test)和其它环境污染物间的残留污染的结果，所以污染物会被引入到分析物中。

如果有需要，从两方面来获得无污染物的结果：(a)将防止污染作为“第一道防线”；和(b)破坏污染物。

可用于破坏PCR污染物的方法包括(i)UV辐射，(ii)使用次氯酸钠、盐酸或盐酸羟胺进行化学清除，或(iii)使用一种或多种酶处理。UV辐射(有效地用于从PCR预混物、实验室表面、耗材和设备中清除DNA/RNA)引起核苷酸的氧化，导致单链和双链断裂和相邻嘧啶间形成环丁烷环。形成的嘧啶二聚体抑制产物通过Taq聚合酶延伸。次氯酸钠是强氧化剂且也引起核酸中单链和双链断裂。破坏正常碱基配对的还原剂盐酸羟胺可有效进行后PCR污染控制，但其是致突变的。然而，这些方法主要限于表面和容器的去污，且与PCR反应预混物的实际组成不相容。

核酸标靶的酶促处理是清除污染物的第三种方法，已表明其与核酸扩增反应不相容。用于破坏污染物的酶包括脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶或内切核酸酶/DNA修复酶，其靶向特定核苷酸或核苷，如尿嘧啶DNA糖基化酶。尽管脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶有效地去除核酸和它们的扩增产物，但在灭活后会有残余的酶促活性，这将干扰下游的应用如亚克隆。更重要地，这些酶的使用也与PCR反应混合物的组成不相容，因为靶分子以及可能的污染物均被破坏。

尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)/尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)或许是最公知的用于清除残留污染物的内切核酸酶。在扩增反应中，dTTP被dUTP替代，所述dUTP是UDG/UNG消化的标靶。这些酶从单链和双链DNA的糖骨架上去除尿嘧啶，产生耐热酶如源自水生栖热菌(Thermus aquatius)的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)无法绕过的无碱基位点，因此抑制核酸扩增。该UDG/UNG-dUTP污染处理策略与单管核酸扩增相容，从而使由开口管引起的进一步污染的机会最小化。具体地，所述酶可包含在含替代dTTP的dUTP的PCR反应预混物中。UDG/UNG将特异性地降解含dUTP的任何扩增污染物，所述扩增污染物在扩增前已被引入到PCR反应混合物中。所述酶随后在PCR的初始变性步骤期间被灭活，以防止新靶扩增子的降解。已对此体系进行调整以用于防止PCR中残留污染，并以多种扩增试剂盒形式在市场上出售。然而，此策略与亚硫酸氢钠处理的核酸不相容，因为此修饰方法使胞嘧啶残基脱氨基经由尿嘧啶磺酰基中间体成为尿嘧啶。

亚硫酸氢钠修饰是用于研究DNA甲基化状态而广泛使用的技术，因为胞嘧啶残基通过亚硫酸氢盐反应而转化，而5-甲基胞嘧啶抵抗此化学修饰。已表明人基因组中胞嘧啶残基的甲基化对发育和胚胎发生中的基因表达的调节和控制至关重要。抑癌基因和致癌基因的富含胞嘧啶-鸟嘌呤(CG)启动子中胞嘧啶低甲基化和高甲基化参与癌发生过程。DNA的亚硫酸氢钠修饰已极大促进了对5-甲基胞嘧啶在肿瘤发生、发育和胚胎发生中作用的研究。然而，亚硫酸氢盐方法本身在理论和实际上与UDG/UNG-dUTP污染策略不相容，因为在亚硫酸氢盐修饰方法中产生的尿嘧啶残基会与任何残留污染物一起被降解。

然而，最近开发的方法使UDG能够用于清除含亚硫酸氢钠处理的靶DNA的PCR反应物中的残留污染。亚硫酸氢盐修饰中的关键步骤是从6-磺酰基尿嘧啶中间体中去除磺酸盐基团。通常，此去除的发生是通过在扩增或进一步加工前使处理的DNA在高温下经历碱性环境，这是因为DNA聚合酶在扩增含大加合物的DNA时效率极低。在此方法中，6-磺酰基尿嘧啶(被Epigenomics AG称为“SafeBis DNA”)在修饰和脱盐后不立即脱磺化。SafeBisDNA中磺酰基团似乎提供针对UDG消化的保护，因此上述UDG/UNG-dUTP污染处理策略可与PCR联用而不降解靶DNA。在UDG/UNG处理后，将反应物加热至约95℃，持续20至30分钟，使得可灭活UDG/UNG，而同时活化Taq DNA聚合酶和使6-磺酰基尿嘧啶残基脱磺化。

包括SafeBis DNA的此方法存在大量限制性参数。首先，SafeBis DNA必须被洗脱并存储在中性pH和低温溶液中。大于8-9的碱性pH和/或高存储温度将导致SafeBis DNA的脱磺化。此SafeBis方法规定修饰的DNA用灭菌水洗脱。推荐为了长期储存，DNA应重悬在TE缓冲液中，因为DNA易受酸水解影响，因此当存储在水中时容易降解。

此技术的另一限制是高污染物浓度不会被此体系破坏。在高浓度污染物存在时，UDG/UNG残留污染物的去除不可能是最佳的。在PCR退火温度低于50℃时，UDG可以再活化，因此消化PCR期间产生的靶核酸和扩增子。重要的是，已估计SafeBis方法仅成功地去除最高为10,000拷贝的扩增子。然而，标准的40个循环的PCR能够扩增约2⁴⁰或2×10¹²拷贝的核酸标靶。虽然UDG/UNG-dUTP残留污染处理策略已(在一定程度上)被证实对SafeBisDNA有效，但另一种有效方法能克服这些限制，所述方法不利用亚硫酸氢钠转化的尿嘧啶中间体和尿嘧啶-D-和尿嘧啶-N-糖基化酶活性。

广义上，该常规方法的其它限制与UDG/UNG酶的性质有关。据称UDG在PCR初始变性步骤期间被灭活；需要在95℃下变性10分钟来灭活酶。不利用热启动Taq聚合酶的标准PCR通常具有95℃下3至5分钟的初始变性，这不足以灭活UDG或UNG。此外，热稳定的UNG在75℃至90℃下可保留一些残留活性，且UDG活性在低于55℃下可部分地再活化。事实上，已推荐在PCR完成时应包括72℃浸泡/存储步骤，以确保酶将保持无活性。设计的引物/寡核苷酸中的大部分具有小于或约55℃的最佳退火温度，因此新扩增的DNA链可在PCR期间裂开。部分或全部这些问题可通过使用热不稳定UDG或UNG如HK^TM UNG热不稳定尿嘧啶-N-糖基化酶来克服。

本发明的发明人已开发出在扩增反应的残留污染清除中无需UDG/UNG的方法。

发明内容

本发明涉及用于清除残留污染物的策略，所述残留污染物是核酸扩增的不希望产物。一般而言，本发明涉及将非天然碱基掺入污染物扩增子中和使用能够降解含非天然碱基的核酸的酶。

第一方面，本发明提供了非天然碱基和能够降解含所述非天然碱基的核酸的酶在扩增反应中清除残留污染物的应用。

将所述非天然碱基定义为这样的化合物，其能够被加入核酸中且其是内切核酸酶底物，优选内切核酸酶V底物。适合的非天然碱基的实例是肌苷、黄嘌呤核苷、oxanosine、脱氧核苷酸或其脱氧-三磷酸类似物。应理解，其它非天然碱基也适用于使用适合内切核酸酶的选择性降解特性的本发明。

优选地，能够降解含所述非天然碱基的核酸的酶是内切核酸酶V。

本发明可与普通(normal)核酸和亚硫酸氢盐处理的核酸如DNA和RNA的体外线性或指数性复制联用。除了用在扩增/复制方法中的通常反应条件，还可对所述反应条件进行调整。

第二方面，本发明提供了扩增反应混合物，其包含：

(a)脱氧肌苷三磷酸(dITP)或脱氧黄嘌呤核苷三磷酸(dXTP)或deoxyoxanosine(dOTP)或其组合。

(b)脱氧核苷酸(dNTP)，其包含脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)；

(c)能够降解含非天然碱基的核酸的酶；和

(d)耐热聚合酶。

优选地，与所用的dITP或dXTP或dOTP或其组合的浓度相比，所述扩增反应混合物包含限制浓度(limiting concentration)的一种或多种dNTP。

当使用非天然碱基dITP时，扩增反应混合物优选包含限制浓度的dGTP。

优选地，所述能够降解含非天然碱基的核酸的酶是内切核酸酶，如内切核酸酶V。内切核酸酶V，也称为脱氧肌苷3’-内切核酸酶，是源于大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA修复酶，其能够从标准dNTP背景中优先识别掺入有脱氧肌苷的单链和双链核酸。最近，已从生物体如沙门氏菌属(Salmonella)和海栖热袍菌(Thermotoga maritima，TMA)中分离出其它内切核酸酶V，已表明其与最初的大肠杆菌酶具有类似的底物识别。此酶在损伤的第二磷酸二酯键3’处优先切割含肌苷的核酸链以及含黄嘌呤核苷和oxanosine残基的核酸，留下具有3’羟基和5’磷酰基的缺口。在修复蛋白存在下，核苷酸类似物将随后被切除并修复。内切核酸酶V也将识别脱氧尿苷残基、具有无碱基位点或尿素的DNA、碱基错配、插入/缺失错配、发夹和未配对环、瓣和假Y结构，但比率明显较低。

适用于全部核酸扩增的耐热聚合酶包括但不限于嗜热和嗜温DNA聚合酶(如Taq、Pfu、Tth、Tfl、Pfx、Tko、Bst、

ABV、UlTima、DyNAzyme

终止子、polκ、pol IV、Dbh、Dpo4和Dpo4样酶、DNA I、DNA I聚合酶Klenow片段、Phi 29、T4和T7 DNA聚合酶)、逆转录酶(如AMV RT、M-MuLV RT、ThermoX

Thermoscript

Superscript III)和内切核酸酶(如内切核酸酶III、IV、V、VIII、T7内切核酸酶I)，和其突变体或嵌合体。已表明与插入dNTP(主要是dCTP，与dITP相对)相容的酶是Taq、Pfu、Tth和来自于超好热始原菌(Thermococcuskodakaraensis)KOD1的KOD，和称为5D4的Taq聚合酶修饰变体，该5D4已证明比标准Taq聚合酶更有效地掺入肌苷残基。

EP 18012113中公开了大量修饰的聚合酶，它们是用在本发明中的潜在候选物，或被进一步修饰以开发或增强扩增活性。本发明的发明人已经发现EP 18012113中定义的酶5D4特别适合扩增含肌酐的核酸。

扩增反应混合物可进一步包含用于扩增的引物或引物组。

第三方面，本发明提供了用于清除在核酸扩增期间可能出现的残留污染的方法，所述方法包括：

(a)提供含待被扩增的核酸模板的样品；

(b)提供用于扩增反应的引物、探针或寡核苷酸；

(c)提供根据本发明第二方面的扩增混合物；

(d)进行温育反应，使得所述反应混合物中含非天然碱基的任何扩增子被能够降解含非天然碱基的核酸的酶降解；

(e)将所述温育的反应混合物在一定温度下加热，以灭活所述能够降解含非天然碱基的核酸的酶；和

(f)进行扩增反应以从所述核酸模板中扩增所期望的产物。

所述方法可进一步包括：

(g)进一步处理或分析扩增产物。

所述处理或分析可包括通过任何适合的方法，如凝胶电泳、杂交、消化、实时扩增、基于阵列的方法、RFLP分析来测定所扩增产物的序列、甲基化状态、大小和长度，和所扩增产物的变化。

所述样品可包括天然的和亚硫酸氢盐修饰的DNA、RNA和cDNA，或这些核酸中任何的组合。

优选地，所述温育步骤(d)是从约0℃至约70℃。更优选地，所述加热是在约37℃。

温育步骤(d)通常可进行约1秒至约90分钟。本发明的发明人已经发现在约37℃下温育约15分钟对于大多数PCR反应非常好。

优选地，所述加热步骤(e)是从约70℃至约95℃。更优选地，所述加热是在约95℃，以确保完全灭活能够降解含肌苷的核酸的酶。

所述扩增反应(f)优选以常规方法进行，使得耐热聚合酶使用引物、探针或寡核苷酸来复制核酸模板。

本发明特别适用于亚硫酸氢盐处理的核酸，以清除扩增反应的残留污染。

与现有技术不同，根据本发明的方法提供这样的策略，其在核酸逆转录和/或扩增过程期间利用适合酶的能力掺入dITP。首先，本发明允许在核酸扩增过程期间将dITP掺入初始合成的核酸链中。在随后逆转录和/或扩增反应中，所述方法利用内切核酸酶V或其它适合酶的能力在适当的逆转录和/或扩增开始前识别和切割反应容器中含dITP的任何残留污染物。尽管所述方法特别适合于亚硫酸氢钠处理的核酸，但所述方法适用于且已表明适用于使用天然核酸作为模板的全部逆转录和扩增反应中的残留污染物清除。此残留污染预防方法适用于在单个或多个反应容器中进行的涉及以线性或指数性方式逆转录和/或扩增核酸的全部技术(如PCR、RT-PCR和/或其它DNA复制方法)。

在本发明中，除非所述内容特别要求，术语“包括”、“包含”或其变体应理解为包括所述元件、整数或步骤，或元件、整数或步骤组，但不排除任何其他元件、整数或步骤货，或元件、整数或步骤组。

包含在本说明书中的文献、法规、材料、装置或物品等的任何讨论都仅出于提供本发明内容的目的。不能认为由于以上任一项内容或所有内容在本申请的各项权利要求的优先权日之前已在澳大利亚存在，就认定这些内容构成部分现有技术的基础或者是本发明相关领域的普遍常识。

为了更清楚地理解本发明，将参考以下附图和实施例对优选实施方案进行阐述。

附图说明

图1显示使用添加有不同浓度脱氧肌苷三磷酸(dITP)和脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)的PCR反应混合物的PCR扩增结果。

图2显示使用内切核酸酶V酶促消化的图1PCR产物的PCR扩增结果。

图3显示在内切核酸酶V处理“污染物”后的PCR扩增结果。

图4显示在内切核酸酶V处理“污染物”后PCR扩增20和25个循环的结果。

图5显示这样的PCR扩增结果，所述PCR扩增结果显示各种内切核酸酶V浓度对清除“污染物”效果。

具体实施方式

本发明的发明人已开发出在残留污染清除中无需UDG/UNG的方法。作为替代，利用内切核酸酶V的性质和其优选底物dITP或其它优选底物如黄嘌呤核苷和oxanosine或其组合，来克服与用亚硫酸氢盐处理的DNA工作相关的各种限制。实际上，本申请适用于全部类型的核酸(DNA、RNA、cDNA)，且可用于亚硫酸氢盐处理和未处理的核酸样品中。

本发明对亚硫酸氢盐修饰的核酸提供了优异的残留污染控制。本发明允许全部且特异的清除残留污染物。与SafeBis方法不同，本发明允许修饰的核酸在适合的碱缓冲液中洗脱、部分或全部脱磺化和稳定储存，所述碱缓冲液不但有助于脱磺化过程，而且也保护核酸在储存期间免于降解。此强力污染清除策略与有效亚硫酸氢钠处理方法(US 7288373)的组合允许可靠且正确地分析甲基化状态或特异和灵敏地检测微生物。

本发明可用在未修饰核酸模板的其他线性和指数性扩增中，所述扩增包括但不限于PCR、RT-PCR、等温扩增、滚环扩增、全基因组扩增以及涉及线性或指数性逆转录和/或扩增核酸的全部方法。而且，本发明提供了两种其它内切核酸酶Fpg和hOGG1的应用，该两种其它内切核酸酶的底物不是RNA或DNA中天然存在的核苷酸或核苷。已报道这两种酶通过靶向切割损伤的第一磷酸二酯键5’和3’来氧化嘌呤，优选8-氧鸟嘌呤。8-氧鸟嘌呤是氧化反应的突变碱基副产物。因为其不可能固有地出现，所以该核苷类似物的使用与本发明一样有用。此外，黄嘌呤核苷和oxanosine是鸟嘌呤的自发脱氨基产物，其也可被源自不同细菌的内切核酸酶V识别。因此，这些非天然碱基也可用于掺入PCR产物中以清除不期望的PCR残留污染。

应理解，本发明所用组分可以以试剂盒形式提供，用于在涉及全部类型核酸逆转录和/或扩增的全部技术中清除残留污染。

非天然碱基

本文将非天然碱基定义为这样的化合物，其能够被掺入核酸中且是内切核酸酶底物，优选内切核酸酶V底物。适合的非天然碱基的实例是肌苷、黄嘌呤核苷、oxanosine、脱氧核苷酸或其脱氧-三磷酸类似物。应理解，其它非天然碱基也可适合用于使用适合内切核酸酶的选择性降解特性的本发明。

酶

能够降解含非天然碱基的核酸的酶是内切核酸酶，如内切核酸酶V。内切核酸酶V，也称为脱氧肌苷3’-内切核酸酶，是源于大肠杆菌的DNA修复酶，其能够从标准dNTP背景中优先识别掺入有脱氧肌苷的单链和双链核酸。最近，已从生物体如沙门氏菌属和海栖热袍菌(TMA)中分离出其它内切核酸酶V，已表明其与最初的大肠杆菌酶具有类似的底物识别。此酶在损伤的第二磷酸二酯键3’处优先切割含肌苷的核酸链，以及含黄嘌呤核苷和oxanosine残基的核酸，留下具有3’羟基和5’磷酰基的缺口。在修复蛋白存在下，核苷酸类似物将随后被切除并修复。内切核酸酶V也将识别脱氧尿苷残基、具有无碱基位点或尿素的DNA、碱基错配、插入/缺失错配、发夹和未配对环、瓣和假Y结构，但比率明显较低。

适用于全部核酸扩增的耐热聚合酶包括但不限于嗜热和嗜温DNA聚合酶(如Taq、Pfu、Tth、Tfl、Pfx、

Tko、Bst、

ABV、U1Tima、DyNAzyme

Thermoscript

Superscript III)和内切核酸酶(如内切核酸酶III、IV、V、VIII、T7内切核酸酶I)，和其突变体或嵌合体，以及称为5D4的Taq聚合酶修饰变体，该5D4已证明比标准Taq聚合酶更有效地掺入肌苷残基。

适用于本发明的其它聚合酶的实例可使用公开于WO 99/02671、WO00/40712、WO 02/22869、WO 03/044187、WO 05/045和EP 18012113(MedicalResearch Council)中的改进方法获得。

EP 18012113中公开了大量修饰的酶，它们是用在本发明中的潜在候选物，或被进一步修饰以开发或增强对含非天然碱基的核酸的活性。实例包括被称为2F3、1A10、1A9、2F12、1C2、2G6、1A8、2F11、2H4、2H9、1B12、2H2、1C8、2H10X、3A10、3B5、3B6、3B8、3B10、3C12、3D1、4D1和5D4的酶。本发明的发明人已经发现酶5D4特别适用于将肌苷掺入核酸中。

样品制备

样品可从组织、细胞制备，或可为任何生物学样品，如血液、尿液、粪便、精液、脑脊髓液、灌洗液，来自如脑、结肠、泌尿生殖系统、肺、肾脏、造血系统、乳房、胸腺、睾丸、卵巢、子宫等来源的细胞或组织，来自胚胎或胚外种系的组织、环境样品、植物，包括细菌、胞内寄生物、病毒、真菌、原生动物、类病毒在内的微生物等。适用于通过本发明处理的哺乳动物细胞类型总结在B.Alberts et al.，1989，The Molecular Biology of the Cell，2ndEdition，Garland Publishing Inc New York and London，pp 995-997中。

人、动物、植物、细菌、真菌和病毒来源样品中天然的和亚硫酸氢盐修饰的靶序列的转录和/或扩增意在涵盖从受精到死亡后48小时内的所有细胞、组织和器官的所有生命周期阶段，以及可源自组织学来源的样品如显微镜载玻片样品，整块包埋的样品，或者从合成或天然表面或从液体提取的样品。

分析包括健康个体(WHO定义的健康)的细胞、组织和器官以及来自疾病个体的细胞、组织和器官之间天然存在的变异。此意义上的疾病包括在Harrison’s Principles of Internal Medicine，第12版，由Jean D Wilson等编著，McGraw Hill Inc，以及之后的版本中描述或提及的全部人类疾病、痛苦、不适和异常；以及在OMIM中描述的全部疾病、痛苦、不适和异常(OnlineMendelian Inheritance in Man，www.ncbi.gov)中)，但强调死亡的主因，即恶性肿瘤(癌)、缺血性心脏病、脑血管疾病、慢性阻塞性肺病、肺炎和流感、动脉的疾病(包括动脉粥样硬化和主动脉瘤)、糖尿病和中枢神经系统疾病，以及社会性衰弱病症(socially debilitating conditions)如焦虑、压力相关的神经精神病症和肥胖，和由染色体数异常或染色体重排引起的全部病症(涉及常染色体以及性染色体的异倍性、复制、缺陷、易位和插入)，以及线粒体基因组的类似异常。

正常或患病个体可来自(i)不同种族划分和进化谱系的人群；(ii)品系和地理的隔离种；(iii)亚种；(iv)相同或不同性别的双胞胎或更多胎；(v)由普通配对方法、人工授精、胚胎干细胞法克隆或核(来自体细胞或生殖系核)转移克隆产生的个体，或由线粒体或其它细胞器官输入或修饰产生的个体；(vi)源自转基因敲除、敲入或敲减方法(或体内、离体、或基因活性被瞬时或永久改变的任何方法，所述方法如RNAi、核酶、转座子活化、药物或小分子方法学、肽核酸(PNA)、插入核酸(INA)、阿卓糖核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、锁核酸(LNA)、Cyclohexanyl核酸(CAN)等，或基于核酸的缀合物，包括但不限于特洛伊肽)的个体，或在怀孕、正常或异位的任何时期的个体。

分析还包括来自原核或真核生物体和病毒的天然和修饰DNA、cDNA或RNA(或其组合)，其与胞外或胞内模式的人类疾病相关，在正常改变体系和患病体系中，用于诊断学目的和疾病状态监测或确定和治疗学上改变以下疾病的变化参数和基础机制：

(i)遗传性疾病；

(ii)由环境诱因(生物或非生物起源)引起的非遗传性或表观遗传性疾病(此意义上的环境也包括在怀孕全部时期，或在生育和不育处理情况下生物体本身内部的环境)；

(iii)对遗传或非遗传性疾病的倾向，包括由“朊病毒”类因子、暴露于压力变化和失重、或辐射作用所引起的结果；

(iv)在全部细胞类型、组织、器官系统和生物网络的老化过程中(如5-甲基胞嘧啶)的遗传和表观遗传改变，包括年龄相关的抑郁、疼痛、神经精神性和神经退行性病症，和更年期前和更年期后病症(包括两种性别中生育力降低)；

(v)在癌症中(如5-甲基胞嘧啶)的遗传和表观遗传改变(包括在具有因DNA扩增、缺失、重排、易位和插入事件引起的异常核型的细胞中的变化)和在不同细胞周期现象中它们的变化或改变(包括昼夜节律、光周期、睡眠、记忆和“时差”对细胞周期的影响)；

(vi)在最广义定义的代谢网络中(如5-甲基胞嘧啶)的遗传和表观遗传改变，其来自这样的合子，所述合子经过胚胎发生、胎儿发育、出生、青年、成年和老年(包括由低氧、缺氧、任何类型辐射(离子化或非离子化，或由于化疗治疗、来自邻近自然源如岩石或来自军事或政府资助活动的“放射性沉降物”的高海拔暴露辐射)、应激、线粒体、细胞核或器官基因组间不平衡引起的代谢作用)；

(vii)(如5-甲基胞嘧啶)的遗传和表观遗传改变，其是由于在分子、细胞、组织、器官和整个生物体水平上响应蛋白质、多肽、肽和DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CNA等，或肽适配体(包括具有翻译后添加物、翻译后裂解产物、翻译后修饰物(如内含子和外显子，泛素化和降解产物)的任何肽适配体)；涉及学习、脑生长和细胞死亡的含稀有天然氨基酸的蛋白质、多肽和肽，以及单个稀有氨基酸，如D-丝氨酸；药物、生物药剂、化学实体(其中化学实体和生物药剂的定义与G. Ashton，2001，Nature Biotechnology 19，307-3111的定义相同))、代谢物、新盐、前药、现有化合物的酯、疫苗、抗原、聚酮、非核糖体肽、维生素和任何天然来源的分子(如植物源的环巴胺)；

(viii)(如5-甲基胞嘧啶)的遗传和表观遗传改变，其是由于在分子、细胞、组织、器官和整个生物体水平上响应单链或双链的RNA和DNA病毒，所述病毒是外源的，或在如内源转座子或逆转座子(SINES和LINES)中被在内部活化；

(ix)(如5-甲基胞嘧啶)的遗传和表观遗传改变，其是由于在分子、细胞、组织、器官和整个生物体水平上响应基因源或非基因源(含或不含内含子)的RNA转录本的逆转录拷贝；

(x)(如5-甲基胞嘧啶)的遗传和表观遗传改变，其是由于在分子、细胞、组织、器官和整个生物体水平上响应：(a)DNA、RNA、PNA(肽核酸)、INA(插入核酸)、ANA、HNA、LNA(锁核酸)、CAN(HNA是指如Van Aetschot etal.，1995所述的核酸；MNA是指Hossain et al，1998所述的核酸；ANA是指WO 99/14226(Exiqon)所述的任何LNA分子，优选LNA选自WO 99/14226摘要中描述的分子，更优选LNA是Singh et al，1998、Koshkin et al，1998或Obika et al.，1997所述的核酸；PNA是指如Nielsen et al，1991所述的肽核酸)等(或DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CAN、全部组合中任何的适配体)；包括在怀孕之前、期间和之后在包括血液和脑脊液的全部流体以及母性液体中循环的DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CAN和类似分子，(b)缀合生物分子的组合，所述缀合生物分子是肽和核酸的嵌合体；或天然分子如胆固醇部分、激素和核酸的嵌合体；和

(xi)(如5-甲基胞嘧啶)的遗传和表观遗传改变，其是由于人和动物源的干细胞(体内、离体或与新环境或天然和合成底物(或其组合)有关)响应上述(i)至(X)中任何变化所引起。

用亚硫酸氢盐处理核酸

可使用任何适于获得核酸材料的方法。实例包括但不限于商购的DNA、RNA试剂盒或试剂、工作站、含蛋白酶试剂的标准细胞裂解缓冲液，和本领域技术人员熟知的有机提取方法。

此方法可在反应容器中进行。反应容器可为任何适合的容器，如试管、平板、毛细管、孔、离心管、微离心管、载玻片、盖玻片、珠子、膜或任何适合的表面。

通常，通过加入碱如NaOH来向样品提供碱性环境。如果核酸材料是RNA，优选使用加热代替碱，以产生无二级结构的单链材料。提供碱性环境，以将双链核酸分子变性为分子易于与亚硫酸氢盐试剂反应的状态。然而，应理解，可加入或使用任何其它变性方法如热处理或其它适合的碱或变性剂，如KOH和任何其它碱。

通常，亚硫酸氢盐试剂是偏亚硫酸氢钠。亚硫酸氢盐试剂使胞嘧啶碱基磺化，从而获得磺酸胞嘧啶(cytosine sulphonate)，随后通过磺酸胞嘧啶的水解脱氨基获得磺酸尿嘧啶(uracil sulphonate)。然而，可理解，任何其它适合的亚硫酸氢盐试剂可使用，例如亚硫酸盐或乙酸盐离子(参见Shapiro，R.，DiFate，V.，and Welcher，M，(1974)J.Am.Chem.Soc.96：906-912)。

与磺化试剂的温育可在低于7的pH以及有利于形成尿嘧啶磺酸盐基团的温度下进行。低于7的pH最适用于进行磺化反应，由此将胞嘧啶碱基转化成磺酸胞嘧啶，随后转化为磺酸尿嘧啶。然而，如果需要，这些方法可在7以上的pH下通过磺化反应进行。

磺化反应可在能够增强亚硫酸氢盐反应的添加剂存在下进行。适合的添加剂的实例包括但不限于醌醇、尿素、DTT和甲氧胺。在这些试剂中，醌醇为还原剂。尿素和甲氧胺是为改进亚硫酸氢盐反应效率而加入的试剂。此外，DTT可用在反应中以防止RNA被内源核糖核酸酶降解。可理解，还可提供其他添加剂或试剂以辅助所述亚硫酸氢盐反应。磺化反应导致核酸样品中的甲基化胞嘧啶保持不变，而未甲基化的胞嘧啶被转换为尿嘧啶。

运行很好的反应条件如下。将待处理的DNA或其它核酸制成20μl体积，且通过用2.2μl新鲜制备的3M氢氧化钠(BDH AnalaR#10252.4X)溶液在37℃下温育15分钟来变性。氢氧化钠浓度和温育时间可根据需要调节，以确保完成模板核酸的变性。加入220μl新鲜制备的3M偏亚硫酸氢钠溶液(BDHAnalaR#10356.4D)pH 5.0(该pH可通过添加10M氢氧化钠(BDH AnalaR#10252.4X)来调节到)，以及12μl 100mM的醌醇溶液(BDH AnalaR#103122E)。所添加的醌醇的浓度可以是约10mM至500mM范围内的任何值，这根据试验确定。随后将溶液涡旋混合，并用208μl矿物油(Sigma，分子生物等级M-5904)覆盖。随后将样品在适合温度下温育充分的时间，以获得用于完全亚硫酸氢盐转化的时间，如在80℃下温育45分钟。本领域技术人员可以理解，只要反应条件适合于核酸的磺化，可改变上述体积、浓度以及温育时间和温度。

将转化的核酸随后通过使用脱盐柱，如根据生产商说明书使用Zymo-Spin I柱来脱盐，或通过沉淀来脱盐。为了沉淀，将样品稀释，使得抑制随后反应的盐不与磺化的核酸共沉淀。将盐浓度稀释至小于约1M。通常稀释步骤使用水或缓冲液进行，从而将盐浓度降低至低于约0.5M。例如，通常将盐浓度稀释至小于约1mM至约1M，特别是小于约0.5M，小于约0.4M，小于约0.3M，小于约0.2M，小于约0.1M，小于约50mM，小于约20mM，小于约10mM，或者，如果需要，甚至可小于约1mM。本领域技术人员能很容易地测定减少盐与核酸沉淀的适合的稀释度，从而能够实施随后的步骤，并使对所述核酸样品的进一步净化或处理缩减至最小限度。稀释通常在水中进行，但也可在任何适合的缓冲液，例如Tris/EDTA或其它生物缓冲液中进行，前提是此缓冲液不明显沉淀核酸，或导致盐与核酸一起明显沉淀以至于抑制后续反应。通常沉淀使用沉淀剂如醇进行。用于沉淀核酸的示例性醇可选自异丙醇、乙醇或任何其它适合的醇。

脱磺化步骤可通过将沉淀的经处理核酸的pH调节至最大到约12.5来进行。暴露于碱性环境有助于促进之前暴露于酸性pH所诱导的DNA中脱嘌呤位点处的链断裂。因此，使碱性pH的处理最少化以避免链断裂。此步骤可使用适合的缓冲剂或碱性试剂在约pH 10.5-11.5下有效地进行。适合的缓冲剂或碱性试剂的实例包括具有pH 7.0-12.5的缓冲剂。本领域技术人员可以理解，适合的缓冲剂或碱性试剂可选自大量已知可获得的缓冲剂和碱性试剂。

脱磺化步骤的温度范围从室温至约96℃，且时间可从2分钟变化至96小时，这取决于所使用条件。本领域技术人员可以容易地确定适合于进行脱磺化反应的时间和温度。也可使用低于室温的温度，只要增加温育时间以进行充分脱磺化。因此，温育步骤可在约10℃、约20℃、约22℃、约25℃、约30℃、约35℃、约37℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约76℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃和约96℃下进行。进行脱磺化反应的特别有用的温度在约75至95℃的温度范围内。

扩增

本发明提供了这样的方法，所述方法与普通核酸和亚硫酸氢盐处理的核酸如DNA和RNA的体外线性或指数性复制联用。除了用在扩增/复制方法中的通常反应条件，还对所述反应条件进行调整。在优选的形式中，本发明允许在扩增反应中包括以下：(i)各种浓度的脱氧肌苷三磷酸(dITP)，(ii)反应混合物中限制浓度的脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)而无需改变其余脱氧核苷酸(dNTP)浓度(即dATP、dCTP、dTTP)，和(iii)内切核酸酶V。

肌苷经由腺苷或肌苷单磷酸(IMP)中间产物衍生自腺嘌呤，当核糖环(呋喃核糖)与次黄嘌呤分子连接时，形成肌苷。其通常存在于tRNA中，且是参与摆动碱基对基因翻译的基本组分。它的核糖核苷和脱氧核糖核苷衍生物ITP和dITP能够与DNA和RNA形成天然碱基配对，不过形成的碱基配对比沃森-克里克碱基配对弱。已表明脱氧肌苷在dNTP中具有亲和力，顺序如下：dI:dC＞dI:dA＞dI:dG～dI:dT，不过已报道当dITP-DNA作为PCR模板时，dCTP是与dITP相对的唯一替代物。相反地，已报道在直接测序前在PCR中用dITP替代dGTP能够成功地克服由测序片段堆叠引起的压缩失真以及使得稳定的发夹结构易于核酸扩增。相反地，在标准测序反应中加入dITP似乎促进接近高二级结构区时过早终止，但是这可通过将测序反应的初始温度从90℃降低至70℃来克服。推测这与dITP的替代降低链分离温度和引物退火温度的事实有关，尽管Taq聚合酶能耐受高温。在直接测序期间，观察到在测序反应中加入dITP过早终止测序反应，不推荐将在测序反应中加入dITP用于直接测序，不过过早终止率可通过降低反应温度来降低。

内切核酸酶V(NEB目录#M0305)，也称为脱氧肌苷3’-内切核酸酶，是源于大肠杆菌的DNA修复酶，其能够从标准dNTP背景中优先识别具有掺入脱氧肌苷的单链和双链核酸。此外，源自海栖热袍菌的内切核酸酶V(Fermentas目录#EN0141)或任何其它适合的内切核酸酶V如沙门氏菌属内切核酸酶V可用在反应中。此酶在损伤的第二磷酸二酯键3’处切割含非天然碱基如肌苷以及含黄嘌呤核苷和oxanosine残基的核酸链，留下具有3’羟基和5’磷酰基的缺口。在修复蛋白存在下，DNA将随后被切除并修复。内切核酸酶V也将识别具有无碱基位点或尿素的DNA、碱基错配、插入/缺失错配、发夹和未配对环、瓣和假Y结构，但比率明显较低。

适用于全部核酸扩增的目的酶包括但不限于嗜热和嗜温DNA聚合酶(如Taq、Pfu、Tth、Tfl、Pfx、

Tko、Bst、

Deep

ABV、UlTima、DyNAzyme

Thermoscript

Superscript III)和内切核酸酶(如内切核酸酶III、IV、V、VIII、T7内切核酸酶I)，和其突变体或嵌合体。已证明与插入dNTP(主要是dCTP，与dITP相对)相容的酶是Taq、Pfu、Tth和来自于超好热始原菌KOD1的KOD，和称为5D4的Taq聚合酶修饰变体，所述5D4已表明比标准Taq聚合酶更有效地掺入肌苷残基。

实施例

为了说明本发明，已将肌苷用作适用于本发明的代表性非天然碱基。

方法和试剂

化学品获得如下：乙醇来自Aldrich(St.Louis MO；200proofE702-3)；异丙醇来自Sigma(St.Louis MO；99％+Sigma I-9516)；矿物油来自Sigma(M-5904)；醌醇来自BDH(AnalaR#103122E)；3M的乙酸钠溶液来自Sigma(S-7899)；氯化钠来自Sigma(ACS reagent S9888)；和氢氧化钠来自BDH(AnalaR#10252.4X)；偏亚硫酸氢钠来自BDH(AnalaR#10356)；二乙醚来自Sigma(St.Louis MO；309958)；己烷来自Sigma(St.Louis MO；650420)；Luria肉汤来自Oxoid(Liverpool；CM0996B)；氯化镁来自Sigma(St.Louis MO；63069)；矿物油来自Sigma(M-5904)；氯化钾来自Sigma(St.Louis MO；60142)；Span 80来自Fluka(Buchs CH；85548)；盐酸四环素来自Sigma(St.Louis MO；T8032)；Triton X-100来自Sigma(St.Louis MO；93426)；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐来自Sigma(St.Louis MO；T5941)；Tween 80来自Sigma(St.Louis MO；P8074)。

酶/试剂获得如下：dNTP来自Promega(Madison WI；C1145)；糖原来自Roche(Indianapolis IN；#10 901 393 001)；DNA标记来自Sigma(直接上样的PCR低梯度100-1000bp，Sigma D-3687和100-10Kb，Sigma D-7058)；PCR通用混合物来自Promega(Madison WI；#M7505)；内切核酸酶V来自NewEngland Biolabs(Beverly MA；#M0305)；dITP来自Fermentas(Cat##R1191)。

溶液如下：(1)10mM Tris/0.1M EDTA，pH 7.0-12.5；(2)3M NaOH(50ml水中6g；BDH AnalaR#10252.4X)；(3)3M偏亚硫酸氢盐(7.6g，在含416μl 10N NaOH的20ml水中(BDH AnalaR#10356.4D))；(4)100mM醌醇(50ml水中0.55g；BDH AnalaR#103122E)；(5)50X TAE凝胶电泳缓冲液(242g Trizma碱、57.1ml冰乙酸、37.2g EDTA和水至1L)；(6)5X琼脂糖凝胶上样缓冲液(1ml 1％溴酚蓝(Sigma B6131)、1ml二甲苯蓝(Sigma X-4126)、3.2ml甘油(Sigma G6279)、8μl 0.5M EDTA pH 8.0、200μl 50X TAE缓冲液和水至10ml)；和(7)1x Taq缓冲液(50mM KCl、10mM Tris-HCl，pH 9.0、0.1％Triton X-100、1.5mM MgCl₂)。

用亚硫酸氢盐处理模板DNA

用亚硫酸氢盐处理核酸的示例性方法描述如下，且可用于产生新型酶扩增或复制用的模板核酸。此方法成功地导致保留基本全部的被处理的DNA。应理解可改变样品或试剂的体积或量。

向20μl体积的2μg核酸中加入2.2μl 3M NaOH(50ml水中6g，新鲜制备)。此步骤将双链核酸分子变性为单链形式，这是因为亚硫酸氢盐试剂优选与单链分子反应。将混合物在37℃下温育15分钟。在室温以上的温度下温育可用于改进变性效率。

在温育后，连续加入220μl 3M偏亚硫酸氢钠(3.35g，在含320μl 10NNaOH的4.68ml水中；BDH AnalaR#10356.4D；新鲜制备)和12μl 100mM醌醇(50ml水中0.55g，BDH AnalaR#103122E；新鲜制备)。醌醇是还原剂，且有助于降低试剂的氧化。也可使用其它还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、醌(氢醌)，或其它适合的还原剂。同样地，也可加入增强反应的添加剂，如甲氧胺或尿素。将样品用200μl防止试剂挥发或氧化的矿物油覆盖，但这不是必需的。随后将样品在80℃下温育45分钟。也可使用25℃至90℃的其它温度，以及从5分钟至8小时或更长的温育时长。

在用偏亚硫酸氢钠处理后，将油去除，且如果核酸浓度低，加入2μl糖原(20mg/ml；Roche#10 901 393 001)或tRNA(Roche#10 109 495 001)。这些添加剂是任选的，且当核酸以低浓度存在时，可用于改进通过与靶核酸共沉淀获得的核酸的产率。通常，将糖原用在DNA的沉淀中，将tRNA用作RNA的助沉淀剂，不过也可使用其它助沉淀剂。

将亚硫酸氢盐修饰的核酸随后通过使用脱盐旋转柱，如根据生产商说明书使用Zymo-spin柱(Zymo#C1003)来脱盐。或者，样品可通过异丙醇沉淀，如下：将800μl水加入样品中，混合，并随后加入1ml异丙醇。水或缓冲液将反应容器中亚硫酸氢盐的浓度降低至盐不与目标靶核酸一起沉淀的水平。将样品再混合并在4℃下放置60分钟，不过在有效引起核酸沉淀的前提下，可使用其它温育温度和时长。将样品以15,000xg在4℃下离心10至15分钟，并将沉淀物用70％EtOH清洗。此清洗处理可清除与核酸一起沉淀的任何残余盐。

将沉淀物干燥并随后重悬在合适体积的缓冲液或水中，这取决于下步应用。如果需要脱磺化，发现在TE缓冲液(10mM Tris、0.1mM EDTA，pH 10.5)中重悬并在95℃下温育20分钟特别有助于DNA样品的脱磺化。也可使用pH 7.0-12.5的缓冲液，且可将样品在37℃至95℃下温育1分钟至96小时，以根据需要促进核酸脱磺化至使用者可接受的水平。

上述方法可通过用一种或多种限制性酶消化来进行。两种独立的限制性酶消化建立在与下述相同的DNA样品上。消化选用的酶通常取决于待扩增的序列。例如，消化2μg基因组DNA要使用20μl体积的EcoRI在37℃下持续1小时。此步骤用于将基因组DNA消化为比基因组DNA更易受到亚硫酸氢盐转化作用的较小片段。超声波降解或物理力也可用于将DNA剪切为较小片段。根据DNA片段的所需大小选择超声波的强度和超声波的长度。如上所述，单独的消化反应通过如用HindIII消化2μg基因组DNA来进行。可选择这些或其它适合的限制性酶来用于预处理消化。如上所述，将消化的DNA用偏亚硫酸氢盐处理。

结果

残留污染物的清除和PCR扩增

图1显示使用添加有各种浓度脱氧肌苷三磷酸(dITP)和脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)的PCR反应混合物的PCR扩增结果。

在25μl终反应体积中扩增1μl人基因组DNA(Promega，20ng/μl)，所述25μl终反应体积由1x PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶，和各自分别为50ng的上游引物(MT-1F)和下游引物(MT-4R)组成，所述引物特异于线粒体基因MARS。将200μM dATP、dTTP、dCTP用在PCR中，且反应还添加以下限制量的dITP和dGTP。

泳道1：200μM dGTP和0μM dITP，对照反应。

泳道2：180μM dGTP和20μM dITP

泳道3：160μM dGTP和40μM dITP

泳道4：120μM dGTP和80μM dITP

泳道5：80μM dGTP和120μM dITP

泳道6：40μM dGTP和160μM dITP

泳道7：20μM dGTP和180μM dITP

泳道8：0μM dGTP和200μM dITP

泳道9：200μM dGTP和0μM dITP，无模板

进行30个循环的PCR扩增反应(95℃20秒，50℃30秒和65℃30秒)，且产物通过琼脂糖凝胶电泳可见。结果表明，当dGTP完全用dITP补充时(泳道8)，未检测到扩增产物。这表明在扩增反应中，dITP不能完全替代dGTP。

图2显示使用内切核酸酶V酶促消化的图1PCR产物的结果。

在用MT-1F和MT-4R引物(见图1)扩增前，将9μl扩增子用1μl内切核酸酶V(10U/μl)消化。将样品在37℃下温育30分钟，随后在95℃灭活5分钟，5μl产物通过琼脂糖凝胶电泳观察。

用于消化的样品是：

泳道1：200μM dGTP和0μM dITP，对照反应。

泳道2：80μM dGTP和120μM dITP

泳道3：40μM dGTP和160μM dITP

泳道4：20μM dGTP和180μM dITP

10个单位的内切核酸酶V显示出部分或完全消化使用限制量dGTP和dITP产生的扩增子。相反，仅使用200μM dGTP的对照反应保持未消化。

图3显示在内切核酸酶V处理“污染物”后的PCR扩增结果。

将图2的内切核酸酶V处理的PCR产物或“污染物”连续稀释。将1μl未稀释或连续稀释的“污染物”在PCR反应中扩增，所述PCR反应包括1xPCR通用混合物(Promega批号#M7505)，分别为50ng的上游引物(MT-1F)和下游引物(MT-4R)。

以95℃20秒，50℃30秒和65℃30秒进行5、10、15和20个循环的扩增反应，产物通过琼脂糖凝胶电泳观察到。在完成5、10、15和20个循环的PCR后，将反应中止，并将样品在15℃浸泡，以使得可取出一组样品。当一组样品被取出并在琼脂糖凝胶上观察到时，继续进行PCR方法。

扩增的污染物的量是：

泳道1：无污染物，未稀释

泳道2：污染物以1∶10稀释

泳道3：污染物以1∶100稀释

泳道4：污染物以1∶1000稀释

泳道5：污染物以1∶10000稀释

泳道6：无模板对照

将图2的内切核酸酶V处理的PCR产物或“污染物”连续稀释。将1μl未稀释或连续稀释的“污染物”在PCR反应中扩增，所述PCR反应包括1×PCR通用混合物(Promega)，分别为50ng的上游引物(MT-1F)和下游引物(MT-4R)。进行20或25个循环的扩增反应(95℃20秒，50℃30秒和65℃30秒)，产物通过琼脂糖凝胶电泳观察到。与图3不同，未中断PCR反应。

扩增的污染物的量是：

泳道1：无污染物，未稀释

泳道2：污染物以1∶10稀释

泳道3：污染物以1∶100稀释

泳道4：污染物以1∶1000稀释

泳道5：污染物以1∶10000稀释

泳道6：污染物以1∶100000稀释

图5显示出不同内切核酸酶V浓度对清除“污染物”的效果。

在25μl终反应体积中扩增1μl人基因组DNA(Promega，20ng/μl)，所述25μl终反应体积由1×PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶，和各自分别为50ng的上游引物(MT-1F)和下游引物(MT-3R)组成，所述引物特异于线粒体基因MARS。将200μM dATP、dTTP、dCTP用在PCR中，且反应还添加限制量的dITP和dGTP。

将PCR产物用10单位(1)、5单位(2)、2.5单位(3)和1.25单位(4)的内切核酸酶V在37℃下处理15分钟。将1μl未稀释或连续稀释的“污染物”在PCR反应中扩增，所述PCR反应包括1×PCR通用混合物(Promega)，分别为50ng的上游引物(MT-1F)和下游引物(MT-3R)。进行5个循环的扩增反应(95℃20秒，50℃30秒和65℃30秒)，且产物通过琼脂糖凝胶电泳可见。

结果显示只要核苷酸混合物中仍有少量残余dGTP，在PCR扩增中dITP就可有效地加入，且含dITP的PCR产物的完全消化可通过使用内切核酸酶V实现(见图1和2)。此外，如图3和图4所示，将反应混合物添加180μM/20μM浓度的dITP/dGTP导致PCR产物的完全降解，这是因为甚至当扩增子未稀释并随后再扩增时，在20个循环扩增后，如图2所示的消化产物的再扩增不产生PCR产物(见图3)。图5显示可降低扩增反应中内切核酸酶V的浓度，并在甚至仅使用1.25单位酶时，仍实现扩增的显著降低。

PCR扩增

建立含全部所需组分如引物、酶、缓冲液、dNTP、Mg²⁺和模板DNA的PCR预混物。除了标准PCR试剂外，反应还添加有dITP和内切核酸酶V。如果在建立反应期间，混合物已被来自之前反应(含dITP)的扩增子污染，此污染物可在PCR起始前通过将反应物加热至37℃持续约15分钟来去除。此预温育步骤将不影响模板DNA或PCR引物，因为这些组分均不含dITP。dITP仅被加入到扩增的材料中。下一步骤是灭活内切核酸酶V，使其不降解待被扩增的样品。灭活在初始95℃并持续3分钟的变性步骤期间进行。在变性后，PCR反应再次以标准方式进行，产生含dITP的新扩增子，其随后可通过任何适合的方法分析。

本领域技术人员可以理解，在不偏离广泛阐述的本发明的精神或范围的前提下，可以对具体实施方案中所示的本发明进行多种改变和/或改进。因此，在所有方面考虑，本发明的实施方案都是说明性的而非限制性的。

Claims

1.非天然碱基和能够降解含非天然碱基的核酸的酶在扩增反应中清除所述扩增反应中残留污染物的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述非天然碱基是肌苷、黄嘌呤核苷、oxanosine、脱氧核苷酸或其脱氧-三磷酸类似物。

3.如权利要求2所述的应用，其中所述非天然碱基是脱氧肌苷三磷酸(dITP)、脱氧黄嘌呤核苷三磷酸(dXTP)或deoxyoxanosine(dOTP)。

4.如权利要求2所述的应用，其中所述非天然碱基是肌苷或脱氧肌苷三磷酸(dITP)。

5.如权利要求1至4中任一项所述的应用，其中所述酶是内切核酸酶。

6.如权利要求5所述的应用，其中所述内切核酸酶是源自嗜温或耐热细菌的内切核酸酶V。

7.如权利要求1至6中任一项所述的应用，其中所述扩增反应是普通核酸或亚硫酸氢盐处理的核酸的线性或指数性复制。

8.如权利要求7所述的应用，其中所述核酸是DNA或RNA。

9.一种扩增反应混合物，其包含：

(a)脱氧肌苷三磷酸(dITP)、脱氧黄嘌呤核苷三磷酸(dXTP)或deoxyoxanosine(dOTP)或其组合；

(b)脱氧核苷酸(dNTP)，其包含脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)；

(c)能够降解含肌苷、黄嘌呤核苷或oxanosine的核酸的酶；和

(d)耐热聚合酶。

10.如权利要求9所述的扩增反应混合物，其包含脱氧肌苷三磷酸(dITP)。

11.如权利要求9或10所述的反应混合物，其含有与dITP、dXTP或dOTP浓度相比限制浓度的一种或多种dNTP。

12.如权利要求9至11中任一项所述的反应混合物，其中所述能够降解含非天然碱基的核酸的酶是内切核酸酶。

13.如权利要求12所述的反应混合物，其中所述酶是内切核酸酶V。

14.如权利要求9至13中任一项所述的反应混合物，其中所述耐热聚合酶选自由嗜热和嗜温DNA聚合酶、逆转录酶、内切核酸酶、其突变体和嵌合体组成的组。

15.如权利要求14所述的反应混合物，其中所述耐热聚合酶选自Taq、Pfu、Tth、5D4和来自超好热始原菌(Thermococcus kodakaraensis)KOD1的KOD。

16.如权利要求9至15中任一项所述的反应混合物，其进一步包含用于扩增的引物或引物组。

17.一种用于清除可在核酸扩增反应期间出现的残留污染物的方法，所述方法包括：

提供含待被扩增的核酸模板的样品；

提供用于扩增反应的引物、探针或寡核苷酸；

提供权利要求9至15中任一项所述的扩增混合物；

进行温育反应，使得所述反应混合物中含肌苷、黄嘌呤核苷或oxanosine的任何扩增子被能够降解含肌苷、黄嘌呤核苷或oxanosine的核酸的酶降解；

将温育的反应混合物在一定温度下加热，以灭活所述能够降解含肌苷、黄嘌呤核苷或oxanosine的核酸的酶；和

进行扩增反应以从所述核酸模板中扩增所期望的产物。

18.如权利要求17所述的方法，所述方法进一步包括：

处理或分析所述扩增产物。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述处理或分析包括测定所述扩增产物的序列、甲基化状态、大小、长度。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述处理或分析包括对所述扩增产物进行凝胶电泳、杂交、消化、实时扩增、基于阵列的方法、RFLP分析。

21.如权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述样品包括天然的和亚硫酸氢盐修饰的DNA、RNA和cDNA或其组合。

22.如权利要求17至21中任一项所述的方法，其中所述温育反应在0℃至70℃下进行1秒至90分钟。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述温度为约37℃，进行约15分钟。

24.如权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述加热步骤是从70℃至95℃。

25.如权利要求17至24中任一项所述的方法，其中核酸模板用亚硫酸氢盐处理。