WO1999050447A1 - Verfahren und nucleinsäureverbindung zum abbau von in-vitro synthetisierten nucleinsäuremolekülen - Google Patents

Verfahren und nucleinsäureverbindung zum abbau von in-vitro synthetisierten nucleinsäuremolekülen Download PDF

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WO1999050447A1
WO1999050447A1 PCT/EP1999/002248 EP9902248W WO9950447A1 WO 1999050447 A1 WO1999050447 A1 WO 1999050447A1 EP 9902248 W EP9902248 W EP 9902248W WO 9950447 A1 WO9950447 A1 WO 9950447A1
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nucleic acid
nitrobenzoxy
degraded
glycosylase
dimethoxytriphenylmethyl
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PCT/EP1999/002248
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Robert-Mathias Leiser
Jochen Temper
Lutz Plobner
Sergei Zavriev
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Mira Diagnostika Gmbh
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Definitions

  • the present invention relates to a process for the degradation of nucleic acid molecules and nucleic acid compounds, in which at least one structural unit is provided in the polymer chain which, after chemical modification, has at least one recognition site for nucleases, glycosylases or other nucleic acid-modifying enzymes.
  • WO 92/01814 (Cetus) or US Pat. No. 5,035,996 and US Pat. No. 5,683,896 (Life Technologies) propose to control contaminants in reaction batches for DNA amplifications by adding amplification products or starter oligonucleotides used certain derivatives of nucleotide residues (e.g. deoxyuridine) are incorporated.
  • any amplification products in the reaction mixture can then be removed from previous amplifications by using appropriate enzymes (eg uracil DNA glycosylase, UDG) to create strand breaks in the amplification products where the Derivatives of nucleotide residues or starter oligonucleotides containing them were incorporated.
  • appropriate enzymes eg uracil DNA glycosylase, UDG
  • the object of the present invention is to provide a method and to provide compounds with which the disadvantages which have arisen in the prior art can be avoided.
  • nucleosides of the nucleic acid molecule to be degraded are converted by a chemical modification reaction into nucleoside analogs which are recognized by a nucleic acid glycosylase as their substrate,
  • the nucleic acid to be degraded is degraded by reaction of the added nucleic acid glycosylase.
  • the nucleosides which are to serve as a substrate for the nucleic acid glycosylase in the nucleic acid molecules to be degraded can be converted into a substrate for glycosylases by a chemical modification reaction.
  • the following bases can be considered as substrates:
  • Modification reactions which give the following nucleoside analogues after a chemical modification reaction are particularly preferred: uracil, 5-formyluracil, 5-hydroxymethylcytosine, 2,6-diammo-4-oxo (N-methylformamido) pyrimidine, hydroxymethyluracil, hypoxanthine.
  • 3-methyladenine DNA glycosylase I 5,6-dihydrothymine DNA glycosylase, 5-hydroxymethylcytosine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase, cytosine DNA glycosylase, endonuclease III, endonuclease V, endonuclease VIII, formamidopyrimidine-DNA-glycosylase, urea-DNA-glycosylase, hypoxanthine-DNA-glycosylase, N-alkylpurin-DNA-glycosylase, N-methylpurine-DNA-glycosylase, pyrimidine dimer-DNA-glycosylase, thymidine-DNA-glycosylase, Uracil DNA glycosylase.
  • enzymes are 3-methyladenine DNA glycosylase II and 5-hydroxymethyluracil DNA glycosylase.
  • the choice of the enzymes depends on the type of the recognition site of the nucleoside analog, which is exposed as a result of the chemical modification reaction - 4 -
  • Substrate for the enzyme to be used is used. Conversely, if a specific nucleoside analog has been inserted into the nucleic acid to be degraded, the corresponding enzyme with the associated substrate specificity can be selected. This means a high degree of flexibility, which the user obtains through the method according to the invention.
  • nucleic acids synthesized in vitro can be degraded.
  • a rare or artificial nucleoside is preferably incorporated into the in vitro synthesized nucleic acid, which is converted into an analog by the chemical modification reaction mentioned above, which is recognized as a substrate by the nucleic acid glycosylases mentioned.
  • the rare or artificial nucleoside is preferably incorporated by using the appropriate nucleoside triphosphate during in vitro synthesis.
  • the rare or artificial nucleoside can also be incorporated into the synthesis product as a component of the starter oligonucleotide.
  • the process according to the invention is particularly suitable for the degradation of deoxyribonucleic acids.
  • a chemical modification reaction according to the invention is in particular a modification reaction which leads to the formation of inosine, uridine, 5-hydroxymethyluridine or 5-formyluridine residues in the nucleic acid to be degraded.
  • Substrate base uracil enzyme: uracil DNA glycosylase or
  • nucleic acid compounds in which at least one structural unit is provided in the polymer chain, which has at least one recognition site for nucleases, glycosylases, and / or methylases and min- - 9 -
  • the nucleosides suitable as substrates for the enzymatic degradation result from chemical, in particular, photochemical and biochemical, in particular enzymatic reactions on other incorporated natural, rare and / or artificial nucleosides. After the reactions mentioned, these are cut out by enzymes which do not react with them before the reactions. According to the invention, the point in time of the enzymatic degradation can thus be precisely determined.
  • the nucleic acid compound claimed according to the invention may, for example, be in the form of an oligomer or a polymer.
  • Primers oligonucleotides with a length of 5 to 100 bases, preferably 15 to 40 bases
  • the polymer can be present in particular as an amplifier of 10 to 100,000 base pairs with a length of preferably 200 to 2,000 base pairs.
  • the nucleic acid compound according to the invention has an atypical nucleoside residue and / or an atypical base which is C-, N-glycosidically linked to a sugar building block from the group of pentoses and hexoses or deoxypentoses and deoxyhexoses.
  • the present invention also relates to a nucleic acid with a recognition site in the form of a modified base of the nucleic acid chain, in particular uracil, 5-uracilcarboxylic acid, hypoxanthine, 5-formyluracil, 5-hydroxymethyl cytosine, 5-hydroxymethyluracil.
  • R has the following meaning
  • bases can be considered as atypical bases as atypical bases in the compounds according to the invention, which are practically an intermediate on the way to the nucleic acid to be degraded:
  • the method according to the invention allows undesired nucleic acid molecules which have arisen from in vitro synthesis, for example PCR, to be broken down in order, for example, to prevent contamination of new synthesis batches with the products of previous analyzes.
  • the advantage over previously known processes is that the enzymatic degradation of the ones to be hydrolyzed - 11 -
  • Nucleic acid is only made possible by first modifying certain nucleic acid building blocks by means of a suitable chemical reaction, as a result of which these become the substrate for the selected enzyme. This makes it possible to predetermine the time and place of the nucleic acid degradation by simple chemical modification of the undesired nucleic acid molecules present.
  • the nucleic acid building blocks to be modified and degraded can be incorporated into the product formed during the in vitro synthesis both as a nucleoside triphosphate and as a component of the starter oligonucleotide.
  • the method offers the advantage of being able to add the nucleic acid-degrading enzyme to the reaction mixture irrespective of the time of the hydrolysis and of not having to inactivate after hydrolysis.
  • the nucleic acid building blocks in question can be nucleosides which are customary or rare in in vitro syntheses as well as synthetic nucleoside analogs.
  • the synthesis and incorporation of the DdUTP into a nucleotide chain takes place e.g. according to DD265429.
  • a PCR polymerase chain reaction
  • dATP deoxynucleoside triphosphates
  • dTTP deoxynucleoside triphosphates
  • dCTP dCTP
  • dGTP mixing ratio of 1: 3.
  • the total concentration of DdUTP and dTTP is equal to the individual concentration of the other three dNTP.
  • the mixture is diluted 1: 100 and 5 ⁇ l of the dilution are added to 3 new reaction vessels. 5 ⁇ l of a buffer solution (pH 2.0) are pipetted in, incubated after mixing for 10 min at 50 ° C. and, after cooling to room temperature, approximately neutralized with 5 ⁇ l of a buffer solution (pH 10.0).
  • a PCR master mix is added to the almost neutral solutions, which contains two units of the enzyme AlkA in addition to the Taq polymerase in two of the reaction vessels.
  • a conventional master mix without AlkA is added to the third reaction vessel.
  • 5 ⁇ l template DNA (from E. coli) are pipetted into one of the reaction vessels with AlkA in the master mix and 5 ⁇ l ultrapure water are pipetted into the other two.
  • the volume of all batches is now made up to 50 ⁇ l with ultrapure water.
  • the reaction batches are incubated at 20 ° C. for 15 min and then the PCT is started.

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Abstract

Verfahren zum Abbau von Nucleinsäuremolekülen, wobei in einem abzubauenden Nucleinsäuremolekül Nucleoside des abzubauenden Nucleinsäuremoleküls durch eine chemische Modifikationsreaktion in Nucleosidanaloga umgewandelt werden, die von Nucleinsäure-Glycosylasen als deren Substrat erkannt werden; Zugabe der Nucleinsäure-Glycosylase zu einer Probe, in der das abzubauende Nucleinsäuremolekül vorhanden ist und die abzubauende Nucleinsäure durch Reaktion der zugegebenen Nucleinsäure-Glycosylase abgebaut wird. Des weiteren werden Nucleinsäureverbindungen offenbart, bei denen in der Polymerkette mindestens eine Struktureinheit vorgesehen ist, die mindestens eine Erkennungsstelle für Nucleasen, Glycosylasen, und/oder Methylasen und mindestens eine transformierbare Gruppe aufweist, die nach einer Transformation die Erkennungsstelle freilegt.

Description

- 1 -
Verfahren und Nucleinsäureverbindung zum Abbau von in-vitro synthetisierten Nucleinsäuremolekülen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Abbau von Nucleinsäuremolekülen und Nucleinsäureverbindungen, bei der in der Polymerkette mindestens eine Struktureinheit vorgesehen ist, die nach chemischer Modifikation mindestens eine Erkennungsstelle für Nucleasen, Glycosylasen oder andere Nucleinsäure- modifizierende Enzyme aufweist.
Durch die äußerst hohe Sensitivität des PCR- Verfahrens besteht ein enormes Risiko der Kontamination des Arbeitsplatzes und damit neuer Reaktionsansätze mit Ampli- fikaten vorangegangener Analysen. Zur Eindämmung oder Verhinderung der Kontaminationsgefahr wird in WO 92/01814 (Cetus) bzw. US 5,035,996 und US 5,683,896 (Life Technologies) vorgeschlagen, Kontaminatonen in Reaktionsansätzen zur DNA-Amplifikationen dadurch zu kontrollieren, dass in die entstehenden Amplifikate bzw. verwendeten Starter-Oligonucleotide bestimmte Derivate von Nucleotidresten (z. B. Desoxyuridin) eingebaut werden. Vor einer neuen Amplifi- kationsreaktion können dann eventuell im Reaktionsansatz befindliche Amplifika- tionsprodukte aus vorangegangenen Amplifikationen dadurch entfernt werden, dass durch Verwendung von geeigneten Enzymen (z.B. Uracil-DNA-Glycosylase, UDG) Strangbrüche in den Amplifikationsprodukten an der Stelle erzeugt werden, wo die Derivate von Nucleotidresten bzw. diese enthaltene Starter-Oligonucleotide eingebaut wurden.
Der Nachteil dieser Verfahren besteht darin, daß das zur Anwendung kommende Enzym (UDG) vor Beginn der neuen Amplifikation inaktiviert werden muß, damit es die neu entstehenden Amplifikate nicht angreift. In der Praxis hat sich herausgestellt, daß diese Inaktivierung meist nur partiell gelingt, wodurch die Effektivität der - 2 -
anschließenden Amplifikation, gemessen an der entstehenden Amphfikatmenge, zum Teil dramatisch verringert wird. Wie sich in der experimentellen Praxis gezeigt hat, konnte dieser Nachteil auch durch Verwendung von in ihrer Thermostabilität modifizierten Enzymen (hier UDG) nicht restlos aufgehoben werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen und Verbindungen anzugeben, mit denen die im Stand der Technik aufgetretenen Nachteile vermieden werden können.
Erfindungsgemäß wird dies erreicht durch ein Verfahren zum Abbau von Nuclein- säuremolekülen, wobei
• in einem abzubauenden Nucleinsäuremolekül Nucleoside des abzubauenden Nucleinsäuremoleküls durch eine chemische Modifikationsreaktion in Nucleosid- analoga umgewandelt werden, die von einer Nucleinsäure-Glycosylase als deren Substrat erkannt werden,
• Zugabe der Nucleinsäure-Glycosylase zu einer Probe in der das abzubauende Nucleinsäuremolekül vorhanden ist und
• die abzubauende Nucleinsäure durch Reaktion der zugegebenen Nucleinsäure- Glycosylase abgebaut wird.
Die Nucleoside, die in den abzubauenden Nucleinsäuremolekülen als Substrat für die Nucleinsäureglycosylase dienen sollen, können durch eine chemische Modifikationsreaktion in ein Substrat für Glycosylasen überführt werden. Es kommen dabei folgende Basen als Substrat in Betracht:
3-Alkyladenin, 8-Hydroxyadenin, 3-Alkylguanin, 7-Alkylguanin, 8-Hydroxyguanin, Hypoxanthin, 8-Hydroxyinosin, 8-Hydroxynebularin, 5-Hydroxycytidin, 6- - 3 -
Hydroxy-5,6-dihydrocytidin, 5-Hydroxymethylcytosin, 5,6-Dihydrothymin, 5- Hydroxy-6-hydrothymin, Thyminglycol, Uracil, 5,6-Dihydrouracil, 5-Hydroxy-6- hydrouracil, 5-Hydroxyuracil, Uracilglycol, 5-Formyluracil, 5-Hydroxymethyl- uracil, Formami dopyrimidinbasen, Harnstoff-Derivate, Pyrimidin-Dimere, Alloxan, 5-Hydroxyhydantoin, trans-l-Carbamoyl-2-oxo-4,5-dihydroxy-imidazolidin, 5- Hydroxy-5-methylhydantoin.
Besonders bevorzugt sind Modifizierungsreaktionen, die nach einer chemischen Modifikationsreaktion die folgenden Nucleosidanaloga ergeben: Uracil, 5-Formyl- uracil, 5-Hydroxymethylcytosin, 2,6-Diammo-4-oxo-(N-methylformamido)pyrimi- din, Hydroxymethyluracil, Hypoxanthin.
Besonders bevorzugt ist die Zugabe der folgenden Enzyme:
3-Methyladenin-DNA-Glycosylase I, 5,6-Dihydrothymin-DNA-Glycosylase, 5- Hydroxymethylcytosin-DNA-Glycosylase, 8-Oxoguanin-DNA-Glycosylase, Cyto- sin-DNA-Glycosylase, Endonuclease III, Endonuclease V, Endonuclease VIII, Formamidopyrimidin-DNA-Glycosylase, Harnstoff-DNA-Glycosylase, Hypox- anthin-DNA-Glycosylase, N-Alkylpurin-DNA-Glycosylase, N-Methylpurin-DNA- Glycosylase, Pyrimidindimer-DNA-Glycosylase, Thymidin-DNA-Glycosylase, Uracil-DNA-Gylcosylase.
Insbesondere bevorzugt sind als Enzyme 3-Methyladenin-DNA-Glycosylase II und 5-Hydroxymethyluracil-DNA-Glycosylase.
Es können auch rekombinant gewonnene Enzyme und/oder thermostabile Varianten der genannten Enzyme eingesetzt werden.
Die Wahl der Enzyme ist abhängig von der Art der durch die chemische Modifizierungsreaktion freigelegten Erkennungsstelle des Nucleosidanalogons, welches als - 4 -
Substrat für das einzusetzende Enzym eingesetzt wird. Umgekehrt kann, wenn ein bestimmtes Nucleosidanalogon in die abzubauende Nucleinsäure eingefügt wurde, das entsprechende Enzym mit der dazugehörigen Substratspezifität ausgesucht werden. Dies bedeutet eine hohe Flexibilität, die der Anwender durch das erfindungsgemäße Verfahren erhält.
Erfindungsgemäß können insbesondere in-vitro synthetisierte Nucleinsäuren abgebaut werden. Vorzugsweise wird in die in-vitro synthetisierte Nucleinsäure ein seltenes oder künstliches Nucleosid eingebaut, das durch die oben erwähnte chemische Modifikationsreaktion zu einem Analogon umgewandelt wird, das durch die genannten Nucleinsäurenglycosylasen als Substrat erkannt wird.
Bevorzugterweise wird das seltene oder künstliche Nucleosid durch Verwendung des entsprechenden Nucleosidtriphosphates während der in-vitro Synthese eingebaut. Dabei kann das seltene oder künstliche Nucleosid auch als Bestandteil des Starter-Oligonucleotids in das Syntheseprodukt eingebaut werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere für den Abbau von Desoxyribo- nucleinsäuren geeignet.
Als chemische Modifikationsreaktion kommt erfindungsgemäß insbesondere eine Modifikationsreaktion in Betracht, die zur Bildung von Inosin-, Uridin-, 5- hydroxymethyluridin- oder 5-Formyluridin-Resten in der abzubauenden Nucleinsäure führt.
Nachstehende Beispiele betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die erfindungsgemäßen Bausteine sind zur besseren Übersicht hier als freie Basen aufgeführt. 5 -
Beispiel A
Einbau: 5-(2-( 1 ,3 -Dioxanyl))-uracil
Reaktionen: schwach saure Hydrolyse zum 5-Formyluracil
Oxidation zur Uracil-5-carbonsäure
Decarboxylierung
Substratbase: Uracil Enzym: Uracil-DNA-Glycosylase oder
Cytosin-DNA-Glycosylase oder
Thymidin-DNA-Glycosylase oder
Hydroxymethyl-DNA-Glycosylase
u υ
H.
N
Figure imgf000007_0002
H
X^.
Figure imgf000007_0003
O N
Figure imgf000007_0001
R
Beispiel B
Einbau: 5-(2-( 1 ,3-Dioxanyl))-uracil Reaktionen: schwach saure Hydrolyse Substratbase: 5-Formyluracil Enzym: 3-Methyladenin-DNA-Glycosylase II
Figure imgf000008_0001
Beispiel C
Einbau: 5-(o-Nitrobenzoxy)methylcytosin Reaktionen: Photolyse Substratbase: 5-Hydroxymethylcytosin Enzym: 5-Hydroxymethylcytosin-DNA-Glycosylase oder
Formamidopyrimidin-DNA-Glycosylase oder
Endonuclease VIII
CH2OH
Figure imgf000008_0002
Beispiel D
Einbau: 7-Methylguanin Reaktionen: Teilabbau durch (katalytische) Oxidation oder Photooxidation Substratbase: 2,6-Diamino-4-oxo-(N-methylformamido)pyrimidin Enzym: Formamidopyrimidin-DNA-Glycosylase - 7 -
O CH,
N
HN
Figure imgf000009_0003
\
CHO
Figure imgf000009_0002
H,N H2N N' NHR
Figure imgf000009_0001
Beispiel E
Einbau: 5-(6-Nitroveratryloxy)methyluracil Reaktionen: Photolyse Substratbase: Hydroxymethyluracil Enzym: 5-Hydroxymethyluracil-DNA-Glycosylase oder 3 -Methyladenin-DNA-Glycosylase II
CH.OH
Figure imgf000009_0004
Beispiel F
Einbau: 5- (4-[2-Nitrophenyl])- 1 ,3-dioxolanyl)methyluracil Reaktionen: Photolyse Substratbase: Formyluracil Enzym: 3-Methyladenin-DNA-Glycosylase II
Figure imgf000010_0001
Beispiel G
Einbau: 6-(2-Nitroveratryloxy)purin Reaktionen: Photolyse Substratbase: Hypoxanthin Enzym: 3-Methyladenin-DNA-Glycosylase II
Figure imgf000010_0002
Figure imgf000010_0003
Erfindungsemäß beansprucht werden auch Nucleinsäureverbindungen, bei denen in der Polymerkette mindestens eine Struktureinheit vorgesehen ist, die mindestens eine Erkennungsstelle für Nucleasen, Glycosylasen, und/oder Methylasen und min- - 9 -
destens eine transformierbare Gruppe aufweist, die nach einer Transformation die Erkennungsstelle freilegt.
Die als Substrat für den enzymatischen Abbau geeigneten Nucleoside entstehen durch chemische, insbesondere, photochemische sowie biochemische, insbesondere enzymatische Reaktionen an anderen inkorporierten natürlichen, seltenen und/oder künstlichen Nucleosiden. Nach den genannten Reaktionen werden diese durch Enzyme ausgeschnitten, die vor den Reaktionen mit ihnen nicht reagieren. Erfindungsgemäß wird so der Zeitpunkt des enzymatischen Abbaus exakt festlegbar.
Die erfindungsgemäß beanspruchte Nucleinsäureverbindung kann zum Beispiel in Form eines Oligomers oder eines Polymers vorliegen. Als Oligomer kommen insbesondere Primer (Oligonucleotide mit einer Länge von 5 bis 100 Basen, vorzugsweise 15 bis 40 Basen) in Betracht, wohingegen das Polymer insbesondere als Ampli- kon von 10 bis 100.000 Basenpaaren vorliegen kann mit einer Länge von vorzugsweise 200 bis 2.000 Basenpaaren.
Die erfindungsgemäße Nucleinsäureverbindung weist als Struktureinheit einen atypischen Nucleosidrest und/oder eine atypische Base, die C-, N-glycosidisch verknüpft ist mit einem Zuckerbaustein der Gruppe der Pentosen und Hexosen oder der Desoxypentosen und Desoxyhexosen, auf.
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nucleinsäure mit einer Erkennungsstelle in Form einer modifizierten Base der Nucleinsäurekette, insbesondere Uracil, 5-Uracilcarbonsäure, Hypoxanthin, 5-Formyluracil, 5-Hydroxyme- thylcytosin, 5-Hydroxymethyluracil.
Als erfindungsgemäße Verbindungen, die in die in-vitro synthetisierten Nucleinsäu- remoleküle eingebaut werden und die nach deren Einbau als transformierbare Gruppe wirken, werden Verbindungen der Formel B-R bevorzugt, wobei - 10 -
B eine atypische Base ist und
R die nachstehende Bedeutung hat
Wasserstoff, 2'-Desoxyribofuranosyl, Ribofüranosyl, 5'-(4,4'-Dimethoxytriphenyl- methyl-)-2'-desoxyribofuranosyl, 5'-(4,4'-Dimethoxytriphenyl-methyl-)-ribofurano- syl, 5'-(4,4,-Dimethoxytriphenylmethyl-)-3'-phosphoramidityl-2'-desoxyribofurano- syl, 5'-(4,4l-Dimethoxytriphenylmethyl-)-3'-phosphoramidityl-ribofüranosyl, 5'- (4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl-)-3'-phosphoramidityl-2'-tri-methylsilylribofurano- syl, 5'-(4,4,-Dimethoxytriphenylmethyl-)-3'-phosphoramidityl-2'-tert.butyldimethyl- silylribofuranosyl, 5'-Triphosphato-2'-desoxyribofuranosyl.
Als atypische Base kommen in den erfindungsgemäßen Verbindungen, die praktisch ein Zwischenprodukt auf dem Weg zur abzubauenden Nucleinsäure darstellen, folgende Basen als atypische Basen in Betracht:
5-(2-(l,3-Dioxanyl))-uracil, 5-(2-Nitrobenzoxy)methylcytosin, 5-(4-Methoxy-2- nitrobenzoxy)methylcytosin, 5-(4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzoxy)methylcytosin [= 5- (6-Nitroveratryloxy)methylcytosin] , 5-(2-Nitrobenzoxy)methyluracil, 5-(4-Me- thoxy-2-nitrobenzoxy)methyluracil, 5-(4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzoxy)methylura- cil [= 5-(6-Nitroveratryloxy)methyluracil], 5-(2-(4-(2-Nitrophenyl)-l ,3-dioxola- nyl))methyluracil, 6-(2-Nitrobenzoxy)purin, 6-(4-Methoxy-2-nitrobenzoxy)purin, 6- (4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzoxy)purin [= 5-(6-Nitroveratryloxy)purin].
Das erfmdungsgemäße Verfahren erlaubt, unerwünschte Nucleinsäuremoleküle, die durch in-vitro-Synthese, z.B. PCR entstanden sind, abzubauen, um z.B. eine Kontamination neuer Syntheseansätze mit den Produkten vorangegangener Analysen auszuschließen. Der Vorteil gegenüber bisher bekannten Verfahren (z.B. WO 92/01814) besteht darin, daß der enzymatische Abbau der zu hydrolysierenden - 11 -
Nucleinsäure erst dadurch ermöglicht wird, daß zunächst durch eine geeignete chemische Reaktion bestimmte Nuclemsäurebausteine modifiziert werden, wodurch diese zum Substrat für das gewählte Enzym werden. Dadurch ist es möglich, Zeitpunkt und Stelle des Nucleinsäureabbaus durch einfache chemische Modifikation der vorliegenden unerwünschten Nucleinsäuremoleküle vorherzubestimmen. Die zu modifizierenden und abzubauenden Nuclemsäurebausteine können in das während der in-vitro-Synthese entstehende Produkt sowohl als Nucleosidtriphosphat als auch als Bestandteil des Starter-Oligonucleotids eingebaut werden. Das Verfahren bietet den Vorteil, das Nucleinsäure-abbauende Enzym unabhängig vom Zeitpunkt der Hydrolyse zum Reaktionsansatz geben zu können und nach Hydrolyse nicht inaktivieren zu müssen. Die betreffenden Nucleinsäurebausteine können sowohl bei in- vitro-Synthesen übliche oder seltene Nucleoside als auch synthetische Nucleosida- naloga sein.
Die Erfindung wird anhand des folgenden Ausführungsbeispiels näher erläutert.
Ausführungsbeispiel:
Abkürzungen:
AlkA 3-Methyladenin-DNA-Glycosylase II
DdU 5-(2-( 1 ,3-Dioxanyl))-2'desoxyuridin
DdUTP DdU-5'-triphosphat dTTP 2'-Desoxythymidin-5'-triphosphat
Die Synthese und der Einbau des DdUTP in eine Nucleotidkette erfolgt z.B. gemäß DD265429.
Zur Demonstration der Wirksamkeit des Verfahrens zum Abbau von in-vitro synthetisierten Nucleinsäuren wird im ersten Schritt eine PCR (polymerase chain reaction) durchgeführt. Dabei wird ein Gemisch von dNTP - 12 -
(desoxynucleosidtriphosphaten) eingesetzt (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), bei dem das dTTP durch eine Mischung von DdUTP und dTTP im Mischungsverhältnis 1 :3 ersetzt wurde. Die Gesamtkonzentration von DdUTP und dTTP ist dabei gleich der Einzelkonzentration der drei anderen dNTP. Nach Abschluß dieser Amplifikation wird das Gemisch 1 : 100 verdünnt und je 5 μl der Verdünnung in 3 neue Reaktionsgefäße gegeben. Dazu werden 5 μl einer Pufferlösung (pH 2,0) pipettiert, nach Mischung 10 min bei 50°C inkubiert und nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit 5 μl einer Pufferlösung (pH 10,0) annähernd neutralisiert. Zu den annähernd neutralen Lösungen wird ein PCR-Mastermix gegeben, der bei zwei der Reaktionsgefäße neben der Taq-Polymerase eine Einheit des Enzyms AlkA enthält. Zum dritten Reaktionsgefäß wird ein herkömmlicher Mastermix ohne AlkA zugegeben. Zu einem der Reaktionsgefäße mit AlkA im Mastermix werden 5 μl Template-DNA (aus E. coli) und zu den anderen zwei je 5 μl Reinstwasser pipettiert. Das Volumen aller Ansätze wird nun mit Reinstwasser auf 50 μl aufgefüllt. Die Reaktionsansätze werden 15 min bei 20°C inkubiert und anschließend die PCT gestartet.
Der Erfolg der Dekontaminationsbehandlung wird im Vergleich der PCR-Ansätze mit Zugabe von AlkA deutlich. Nur der Ansatz enthält ein Amplifikat, dem entsprechende Template-DNA zugegeben worden war. Im Ansatz ohne AlkA und ohne Template-DNA ist ebenfalls ein Produkt nachweisbar, welches hier aber von der künstlichen Kontamination herrührt, die ohne AlkA nicht zerstört wurde.

Claims

- 13 -Patentansprüche
1. Verfahren zum Abbau von Nucleinsäuremolekülen, wobei
• in einem abzubauenden Nucleinsäuremolekül Nucleoside des abzubauenden Nucleinsäuremoleküls durch eine chemische Modifikationsreaktion in Nucleosidanaloga umgewandelt werden, die von Nucleinsäure- Glycosylasen als deren Substrat erkannt werden,
• Zugabe der Nucleinsäure-Glycosylase zu einer Probe, in der das abzubauende Nucleinsäuremolekül vorhanden ist und
• die abzubauende Nucleinsäure durch Reaktion der zugegebenen Nucleinsäure-Glycosylase abgebaut wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den abzubauenden Nucleinsäuremolekülen um in-vitro synthetisierte Nucleinsäuremoleküle handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, dass in die in-vitro- synthetisierte Nucleinsäure der Einbau eines seltenen oder künstlichen Nucleo- sids erfolgt, das durch die folgende chemische Modifikationsreaktion zu einem Analogon umgewandelt wird, das durch Nucleinsäure-Glycosylasen als Substrat erkannt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, dass der Einbau eines seltenen oder künstlichen Nucleosids durch Verwendung des entsprechenden Nucleosidtriphosphats während der in-vitro-Synthese erfolgt. - 14 -
5. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, dass der Einbau eines seltenen oder künstlichen Nucleosids dadurch erfolgt, dass dieses als Bestandteil des Starter-Oligonucleotids in das Syntheseprodukt eingefügt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, dass es sich bei der abzubauenden Nucleinsäure um Desoxyribonucleinsäure handelt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, dass die chemische Modifikationsreaktion zur Bildung von Inosin-, Uridin-, 5-Hydroxymethyluri- din- oder 5-Formyluridinresten in der abzubauenden Nucleinsäure führt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet dadurch, dass als Nucleinsäu- reglycosylase 3-Methyladenin-DNA-Glycosylase II und/oder 5-Hydroxyme- thyluracil-DNA-Glycosylase verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, gekennzeichnet dadurch, dass es sich bei der 3- Methyladenin-DNA-Glycosylase II oder 5-Hydroxymethyluracil-DNA- Glycosylase um ein rekombinant gewonnenes Enzym und/oder um eine thermostabile Variante dieses Enzyms handelt.
10. Nucleinsäureverbindung, bei der in der Polymerkette mindestens eine Struktureinheit vorgesehen ist, die mindestens eine Erkennungsstelle für Nucleasen, Glycosylasen, und/oder Methylasen und mindestens eine transformierbare Gruppe aufweist, die nach einer Transformation die Erkennungsstelle freilegt.
11. Nucleinsäureverbindung nach Anspruch 10, bei der die transformierbare Gruppe mittels chemischer, insbesondere photolytischer oder enzymatischer Abspaltungsreaktion die Erkennungsstelle für Nucleasen freilegt - 15 -
12. Nucleinsäureverbindung nach einem der Ansprüche 10 oder 11 in Form eines Oligomers, insbesondere eines Primers, wie eines Oligonucleotids einer Länge von 5 bis 100 Basen, vorzugsweise 15 bis 40 Basen, oder in Form eines Polymers, insbesondere eines Amplicons vorzugsweise mit einer Länge von 10 bis 100.000 Basenpaaren, vorzugsweise 200 bis 2.000 Basenpaaren.
13. Nucleinsäureverbindung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Struktureinheit ein atypischer Nucleosidrest und oder eine atypische Base C- N-glycosidisch verknüpft mit einem Zuckerbaustein der Gruppe der Pentosen und Hexosen oder der Desoxypentosen und Desoxyhexosen ist.
14. Nucleinsäureverbindung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die Erkennungsstelle eine modifizierte Base der Nucleinsäurekette, insbesondere Uracil, 5-Uracilcarbonsäure, Hypoxanthin, 5-Formyluracil, 5-Hydroxymethyl- cytosin, 5-Hydroxymethyluracil ist.
15. Verbindung zum Einbau in eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 10 bis 14 mit der Formel B-R, die nach dem Einbau als transformierbare Gruppe wirkt, wobei
B eine atypische Base ist und
R die nachstehende Bedeutung hat
Wasserstoff, 2'-Desoxyribofuranosyl, Ribofuranosyl, 5'-(4,4'-Dimethoxytri- phenyl-methyl-)-2'-desoxyribofüranosyl, 5'-(4,4'-Dimethoxytriphenylme- thyl)-ribofuranosyl, 5'-(4,4,-Dimethoxytriphenylmethyl-)-3'-phosphoramidi- tyl-2'-desoxyribofuranosyl, 5'-(4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl-)-3'-phosphor- amidityl-ribofuranosyl, 5'-(4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl-)-3'-phosphorami- - 16 -
dityl-2'-tri-methylsilylribofuranosyl, 5'-(4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl-)-3'- phosphoramidityl-2'-tert.butyldimethylsilylribofuranosyl, 5'-Triphosphato-2'- desoxyribofuranosyl.
16. Nucleinsäureverbindung nach einem der Ansprüche 10 bis 15 wobei die atypische Base eine der folgenden Basen
5-(2-( 1 ,3-Dioxanyl))-uracil, 5-(2-Nitrobenzoxy)methylcytosin, 5-(4-Methoxy -2-nitrobenzoxy)methylcytosin, 5-(4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzoxy)methyl- cytosin [= 5-(6-Nitroveratryloxy)methylcytosin], 5-(2-Nitrobenzoxy)- methyluracil, 5-(4-Methoxy-2-nitrobenzoxy)methyluracil, 5-(4,5-Dimethoxy- 2-nitrobenzoxy)methyl-uracil [= 5-(6-Nitroveratryloxy)methyluracil], 5-(2- (4-(2-Nitrophenyl)- 1 ,3-dioxolanyl))methyluracil, 6-(2-Nitrobenzoxy)purin, 6-(4-Methoxy-2-nitrobenzoxy)purin, 6-(4, 5 -Dimethoxy-2-nitrobenzoxy)purin [= 5-(6-Nitroveratryloxy)purin] ist.
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