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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Bei
der Pyrosequenzierung wird ein Sequenzierungsprimer zu einem DNS-Einzelstrangtemplate
hybridisiert, um einen Nukleinsäureduplex zu bilden. Dieser
Duplex wird mit den Enzymen DNS-Polymerase, ATP-Sulfurylase und
Luziferase und mit den Substraten Adenosin-5'-phosphosulfat (APS)
und Luziferin inkubiert. Außerdem wird noch eines der vier
Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs; d. h. dATP, dGTP, dGTP oder TTP)
zugegeben. Wenn das dNTP zur nächsten Position auf dem
Nukleinsäuretemplate komplementär ist, wird das
Desoxynukleotid in den länger werdenden Nukleinsäurestrang
eingebaut, und stöchiometrisch wird ein Pyrophosphatmolekül
(PPi) freigesetzt. Wichtig ist, dass nur dann Pyrophosphat freigesetzt
wird, wenn das komplementäre Nukleotid in die länger
werdende Nukleinsäurekette eingebaut wird.
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Die
Freisetzung von PPi zeigt an, dass eine Reaktion stattgefunden hat.
Demzufolge kann die Identität des in den länger
werdenden Nukleinsäurestrang eingebauten Nukleotids anhand
der Tatsache ermittelt werden, ob PPi freigesetzt wurde. Das bei
diesen Reaktionen freigesetzte Pyrophosphat kann auf verschiedene Weise
detektiert werden, darunter auch enzymatisch. Zuerst wandelt die
Sulfurylase das PPi in Anwesenheit von APS quantitativ in Adenosintriphosphat
(ATP) um. Anschließend wird dieses ATP in einer Luziferin-Luziferase-Reaktion
umgesetzt, bei der PPi und detektierbares Licht in einer Menge entstehen,
die der ATP-Menge proportional ist. Somit ist jedes Lichtsignal
der Anzahl der in den wachsenden Strang eingebauten Nukleotide proportional.
Darüber hinaus hängt die Pyrosequenzierung von
der Freisetzung von PPi ab, um die Reaktionskette auszulösen,
die zur Emission eines detektierbaren Lichtsignals führt.
Mittels solcher Verfahren kann eine Base an einer Zielposition erkannt
werden. Die schrittweise Wiederholung des Verfahrens mit jedem dNTP
ermöglicht die Sequenzierung eines DNS-Template.
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ÜBERBLICK OBER DIE
ERFINDUNG
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Es
wird ein Verfahren zur Sequenzierung einer Nukleinsäure
bereitgestellt. Bei bestimmten Ausführungsformen beinhaltet
das Verfahren das Zusammenbringen eines Nukleinsäureduplexes,
der ein Nukleinsäuretemplate und einen an das Template
angelagerten Primer aufweist, mit einer Reagenzienmischung unter den
Bedingungen für die Primerverlängerung, um einen
verlängerten Primer und ATP zu erzeugen. Das Verfahren
beinhaltet ferner die Detektierung der erzeugten ATP. Die Reagenzienmischung
kann eine Adenosin-2'-desoxynukleosidtetraphosphat-Komponente und
eine Polymerase enthalten. Es werden auch Adenosin-2'-desoxynukleosidtetraphosphat-Komponenten
angegeben, die bei den beschriebenen Verfahren Anwendung finden.
Ferner werden Mischungen mit Adenosin-2'-desoxynukleosidtetraphosphat
beschrieben, die bei den beschriebenen Verfahren angewendet werden.
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KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1 zeigt
die chemische Struktur von Adenosin-2'-desoxynukleosidtetraphosphat.
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2 zeigt
eine schematische Darstellung der bei der Direktsequenzierung durch
ATP-Freisetzung ablaufenden chemischen Reaktionen.
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DEFINITIONEN
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Im
Folgenden werden die Begriffe „Nukleinsäure" und „Polynukleotid"
austauschbar zur Beschreibung eines Polymers einer beliebigen Länge,
z. B. mehr als ungefähr 10 Basen, mehr als ungefähr
100 Basen, mehr als ungefähr 500 Basen, mehr als ungefähr
1000 Basen, für gewöhnlich bis zu ungefähr
10000 oder mehr Basen mit Nukleotiden, z. B. Desoxyribonukleotiden
oder Ribonukleotiden oder synthetisch erzeugten Verbindungen (z.
B. der in der
US-Patentschrift
Nr. 5 948 902 und den darin angegebenen Literaturstellen
beschriebenen PNS) gebraucht, die in einer sequenzspezifischen Weise
analog zwei natürlich vorkommende Nukleinsäuren hybridisieren
und z. B. an Basenpaar-Wechselwirkungen gemäß Watson-Crick teilnehmen
können. Zu den natürlich vorkommenden Nukleotiden
gehören Guanin, Cytosin, Adenin und Thymin (bzw. G, C,
A und T).
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Die
hier gebrauchten Begriffe „Ribonukleinsäure" und „RNS"
bezeichnen ein Polymer, das aus Ribonukleotiden besteht.
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Die
hier gebrauchten Begriffe „Desoxyribonukleinsäure"
und „DNS" bezeichnen ein Polymer, das aus Desoxyribonukleotiden
besteht.
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Die
Begriffe „Nukleosid", „Nukleotid", „Desoxynukleosid"
und „Desoxynukleotid" sollen diejenigen Anteile bezeichnen,
die nicht nur die bekannten Purin- und Pyrimidinbasen, sondern auch
andere heterozyklische Basen enthalten, die modifiziert wurden.
Solche Modifikationen beinhalten methylierte Purine oder Pyrimidine, acylierte
Purine oder Pyrimidine, alkylierte Ribosen oder andere Heterozyklen.
Darüber hinaus bezeichnen die Begriffe „Nukleosid", „Nukleotid", „Desoxynukleosid"
und „Desoxynukleotid" diejenigen Komponenten, die nicht
nur die üblichen Ribose- und Desoxyribosezucker, sondern
auch andere Zucker enthalten. Modifizierte Nukleoside, Nukleotide,
Desoxynukleoside oder Desoxynukleotide beinhalten auch Modifikationen
am Zuckeranteil, z. B. wenn eine oder mehrere der Hydroxylgruppen
durch Halogenatome oder aliphatische Gruppen substituiert oder als
Ether, Amine oder Ähnliches funktionalisiert wurden.
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Die
natürlich vorkommenden Nukleotide oder Nukleoside werden
hier als Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C) definiert.
Es ist klar, dass bestimmte Modifikationen dieser Nukleotide oder
Nukleoside in der Natur vorkommen. Modifikationen von A, T, G und
C, die in der Natur vorkommen und die Basenpaarbildung über
Wasserstoffbrückenbindungen beeinflussen, werden jedoch
als nicht in der Natur vorkommend angesehen. Zum Beispiel kommt
2-Aminoadenosin in der Natur vor, ist jedoch kein „natürlich
vorkommendes" Nukleotid oder Nukleosid im Sinne des hier gebrauchten
Begriffs. Andere nicht als Einschränkung anzusehende Beispiele
von modifizierten Nukleotiden oder Nukleosiden, die in der Natur
vorkommen und die Basenpaarbildung nicht beeinflussen und demzufolge
als natürlich vorkommend angesehen werden, betreffen das
5-Methylcytosin, das 3-Methyladenin, das O(6)-Methylguanin und das
8-Oxoguanin.
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Nukleotide
und Nukleoside können als stickstoffhaltige Nukleotide
oder Nukleoside definiert werden, die sich vom Purin oder vom Pyrimidin
ableiten. Zu den „modifizierten Nukleotiden", den „modifizierten
Nukleosiden", den „Nukleotidanaloga" oder den „Nukleosidanaloga"
(außer A, T, G und C) gehören zum Beispiel Nukleotide
oder Nukleoside mit einer vom Purin oder vom Pyrimidin abgeleiteten
Struktur (d. h. Nukleotid- oder Nukleosidanaloga). Beispielsweise,
was jedoch nicht als Einschränkung zu verstehen ist, kann
ein modifiziertes Adenin eine Struktur aufweisen, die ein Purin
mit einem kovalent am C6 des Purinrings gebundenen Stickstoffatom
beinhaltet, wobei sich die Nummerierung nach der gebräuchlichen
chemischen Nomenklatur richtet. Außerdem ist klar, dass
Modifikationen am Purinring und/oder am C6-Stickstoff ebenfalls
in einem modifizierten Adenin enthalten sein können. Ein
modifiziertes Thymin kann eine Struktur aufweisen, die zumindest
ein Pyrimidin, ein kovalent am C4-Kohlenstoff gebundenes Sauerstoffatom
und eine Methylgruppe am C5-Kohlenstoff aufweist. Ferner ist dem
Fachmann klar, dass ein modifiziertes Adenin auch Modifikationen
am Pyrimidinring, ein am C4-Kohlenstoff gebundenes Sauerstoffatom
und/oder eine Methylgruppe am C5-Kohlenstoff beinhalten kann. Beispielsweise,
was jedoch nicht als Einschränkung zu verstehen ist, kann
ein modifiziertes Guanin eine Struktur aufweisen, die mindestens
ein Purin und ein kovalent am C6-Kohlenstoff gebundenes Sauerstoffatom
aufweist. Ein modifiziertes Cytosin kann eine Struktur aufweisen,
die ein Pyrimidin und ein kovalent am C4-Kohlenstoff gebundenes
Stickstoffatom beinhaltet. Modifizierte Guaninnukleotide oder -nukleoside
können auch Modifikationen am Purinring und/oder das Sauerstoffatom
am C6-Kohlenstoff beinhalten. Modifizierte Cytosinnukleotide oder
-nukleoside können auch Modifikationen am Pyrimidinring
und/oder das Stickstoffatom am C4-Kohlenstoff beinhalten.
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Als
Beispiele von modifizierten Nukleotiden, die jedoch nicht als Einschränkung
zu verstehen sind, seien die 2'-Desoxynukleotide genannt, welche
das 2'-Desoxyadenosinmonophosphat (dAMP), das 2'-Desoxyguanosinmonophosphat
(dGMP), das 2'-Desoxycytidinmonophosphat (dCMP), das 2'- Desoxythymidinmonophospat
(Thymidin) (dTMP oder TMP), das 2-Amino-2'-desoxyadenosinmonophosphat,
das 2-Thio-2'-desoxythimidinmonophosphat (oder 2-Thiothymidinmonophosphat),
das 2-Thio-2'-desoxycytidinmonophosphat, das 2'-Desoxyinosinmonophosphat
und das 2'-Desoxypyrrolopyrimidinmonophospat (dPMP) beinhalten.
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Zu
den in der Erfindung brauchbaren Nukleotiden gehören beliebige
Nukleotide oder Nukleotidanaloga, unabhängig davon, ob
sie in der Natur vorkommen oder synthetisch hergestellt wurden.
Als Beispiele für Nukleotide seien die Phosphatester von
Desoxyadenosin, Desoxycytidin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin, Adenosin,
Cytidin, Guanosin und Uridin genannt. Weitere Nukleotide beinhalten
eine Adenin-, Cytosin-, Guanin- und Thyminbase, ein Xanthin oder
Hypoxanthin; 5-Bromuracil, 2-Aminopurin, Desoxyinosin oder methyliertes
Cytosin wie beispielsweise 5-Methylcytosin und N4-Methoxydesoxycytosin.
Ferner gehören dazu Basen von nachgeahmten Polynukleotiden
wie methylierte Nukleinsäuren, z. B. 2'-O-methRNS, Peptidnukleinsäuren, modifizierte
Peptidnukleinsäuren, blockierte Nukleinsäuren
und beliebige andere Strukturkomponenten, die im Wesentlichen wie
ein Nukleotid oder eine Base agieren können, indem sie
sich beispielsweise als komplementär zu einer oder mehreren
in der DNS oder der RNS vorkommenden Basen erweisen und/oder zum
basenkomplementären Einbau fähig sind, und Analoga
für den Kettenabbruch. Ein Nukleotid entspricht einer bestimmten
Nukleotidart, wenn beide zumindest zu einer Base komplementär
sind.
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Als
Analoga kommen auch Derivate des Purins infrage, wobei die kovalent
am C6-Kohlenstoff gebundenen Atome keinerlei Einschränkungen
unterliegen. Diese Analoga werden dann als Purinderivate definiert. Als
Analoga kommen auch Derivate des Pyrimidins infrage, wobei die kovalent
am C4-Kohlenstoff gebundenen Atome keinerlei Einschränkungen
unterliegen. Diese Analoga werden dann als Pyrimidinderivate definiert. Zu
den Purinanaloga gehören auch solche, die mit Pyrimidinanaloga
stabile Basenpaare bilden können, wobei die Analoga von
A, T, G und C gemäß Definition keinerlei Einschränkungen
unterliegen. Zu den Purinderivaten gehören auch solche,
die mit Pyrimidinanaloga keine stabilen Basenpaare bilden können,
wobei die Analoga von A, T, G und C keinerlei Einschränkungen
unterliegen.
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Außer
den Purinen und Pyrimidinen beinhalten die modifizierten Nukleotide
oder Analoga entsprechend dem vorliegenden Gebrauch alle Verbindungen,
die mit einem oder mehreren in der Natur vorkommenden Nukleotiden
oder einem anderen Nukleotidanalogon eine Wasserstoffbrückenbindung
bilden können. Jede Verbindung, die mindestens zwei Wasserstoffbrückenbindungen
mit T oder einem Derivat von T bildet, gilt als Analogon von A oder
als modifiziertes A. Desgleichen gilt jede Verbindung, die mindestens
zwei Wasserstoffbrückenbindungen mit A oder einem Derivat
von A bildet, als Analogon von T oder als modifiziertes T. Desgleichen
gilt jede Verbindung, die mindestens zwei Wasserstoffbrückenbindungen
mit G oder mit einem Derivat von G bildet, als Analogon von C oder
als modifiziertes C. Desgleichen gilt jede Verbindung, die mindestens
zwei Wasserstoffbrückenbindungen mit C oder mit einem Derivat
von C bildet, als Analogon von G oder als modifiziertes G. Gemäß diesem
Schema ist klar, dass einige Verbindungen zum Beispiel sowohl als Analoga
von A als auch als Analoga von G (Purinanaloga) oder sowohl als
Analoga von T als auch als Analoga von C (Pyrimidinanaloga) gelten.
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Der
Begriff „komplementär", „Komplement"
oder „komplementäre Nukleinsäuresequenz"
betrifft den Nukleinsäurestrang, der gemäß den
Regeln von Watson-Crick zur Basenpaarbildung zur Basensequenz in
einem anderen Nukleinsäurestrang passt. Im Allgemeinen
sind zwei Sequenzen zueinander komplementär, wenn die Sequenz
des einen Strangs im antiparallelen Sinne eine Hybridisierung mit
der Sequenz des anderen Strangs eingehen kann, wobei das 3'-Ende
jeder Sequenz mit dem 5'-Ende der anderen Sequenz hybridisiert wird
und sich jedes A, T, G und C der einen Sequenz auf ein T, A, C bzw.
G der anderen Sequenz ausrichtet. Die Komplementarität
von modifizierten Nukleotidanaloga wird entsprechend dem Ausgangsnukleotid
definiert. Für die Eigenschaft der Komplementarität
von modifizierten Nukleotidanaloga ist es nicht erforderlich, dass
stabile Basenpaare über Wasserstoffbrückenbindungen
gebildet werden können. Mit anderen Worten, zwei modifizierte
Nukleotidanaloge können gemäß der Natur
des modifizierten Nukleotidanalogons zueinander komplementär
sein, brauchen aber kein stabiles Basenpaar zu bilden. Die Komplementarität
von Nukleotidanaloga, die nicht als Derivate von A, T, G oder C
anzusehen sind, wird gemäß einer Fähigkeit zur
Bildung eines stabilen Basenpaars mit einem Nukleotid oder dessen
Analogon definiert. Zum Beispiel kann ein bestimmtes Derivat von
C (d. h. 2-Thiocytosin) zwar kein stabiles Basenpaar mit G bilden,
gilt aber dennoch als komplementär.
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Unter
dem Begriff „Duplex" sind mindestens zwei Oligonukleotide
und/oder Polynukleotide zu verstehen, die ganz oder teilweise zueinander
komplementär sind und zwischen allen oder den meisten ihrer
Nukleotide eine Basenpaarbildung vom Watson-Crick-Typ eingehen,
sodass ein stabiler Komplex gebildet wird. Die Begriffe „Anlagerung"
(annealing) und „Hybridisierung" werden austauschbar gebraucht
und bedeuten die Bildung eines stabilen Duplexes. Unter „ideal
passend" ist in Bezug auf einen Duplex zu verstehen, dass die Poly- oder
Oligonukleotidstränge, welche den Duplex bilden, zusammen
eine Doppelstrangstruktur bilden, sodass jedes Nukleotid in jedem
Strang eine Basenpaarbildung vom Watson-Crick-Typ mit einem Nukleotid
im anderen Strang eingeht. Der Begriff „Duplex" umfasst
die Paarbildung von Nukleosidanaloga, zum Beispiel von Dexoxyinosin,
Nukleosiden mit 2-Aminopurinbasen, PNSs und dergleichen, die verwendet
werden können. Unter einer „Nichtübereinstimmung"
in einem Duplex zwischen zwei Oligonukleotiden oder Plynukleotiden
ist zu verstehen, dass ein Nukleotidpaar im Duplex nicht in der
Lage ist, eine Watson-Crick-Bindung einzugehen.
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Die
Begriffe „Hybridisierung" und „Hybridisieren"
werden hier in Verbindung mit Nukleotidsequenzen austauschbar gebraucht.
Die Fähigkeit von zwei Nukleotidsequenzen zur Hybridisierung
miteinander hängt vom Grad der Komplementarität
der beiden Nukleotidsequenzen ab, der wiederum vom Anteil der passenden komplementären
Nukleotidpaare abhängt. Je mehr Nukleotide in einer bestimmten
Sequenz zu einer anderen Sequenz komplementär sind, desto
strengere Anforderungen können an die Hybridisierung gestellt
werden und desto spezifischer wird die Hybridisierung der beiden
Sequenzen erfolgen. Eine bessere Passgenauigkeit kann durch Erhöhung
der Temperatur, durch einen höheren Anteil an beigemischten
Lösemitteln, durch Verringerung der Salzkonzentration und Ähnliches
erreicht werden.
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Die
Begriffe „Hybrid" und „Duplex" betreffen ein zweisträngiges
Nukleinsäuremolekül, das durch Wasserstoffbrückenbindungen
zwischen komplementären Nukleotiden gebildet wird.
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Der
Begriff „Primer" bezeichnet Oligonukleotide, die entweder
in der Natur vorkommen oder synthetisch erzeugt werden und in der
Lage sind, nach der Bildung eines Duplexes mit einem Polynukleotidtemplate als
Startpunkt für die Nukleinsäuresynthese zu dienen
und von ihren 3'-Ende entlang dem Template verlängert zu
werden, sodass ein verlängerter Duplex gebildet wird. Die
Sequenz der während des Verlängerungsprozesses
hinzugefügten Nukleotide hängt von der Sequenz
des qPolynukleotid-Template ab. Ein Primer dient als Startpunkt
für die Nukleotidpolymerisation, die entweder durch die
DNS-Polymerase, die RNS-Polymerase oder die reverse Transkriptase
katalysiert wird.
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Der
Begriff „Template" bezeichnet ein Nukleinsäuremolekül,
das von einer Nukleinsäurepolymerase zur Steuerung der
Synthese eines Nukleinsäuremoleküls verwendet
werden kann, das gemäß der Basenpaarbildung vom
Watson-Crick-Typ komplementär zum Template ist. Zum Beispiel
verwenden DNS-Polymerasen eine DNS, um ein anderes DNS-Molekül
mit einer Sequenz zu synthetisieren, die zu einem Strang des DNS-Template
komplementär ist. RNS-Polymerasen verwenden DNS als Template,
um die Synthese von RNS mit einer Sequenz zu steuern, die zu einem
Strang des DNS-Template komplementär ist. Reverse DNS-Transkriptasen
verwenden RNS zur Synthese von DNS mit einer Sequenz, die zu einem
Strang des RNS-Template komplementär sind.
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Der
Ausdruck „Primer-Verlängerungsbedingungen" bezeichnet
Bedingungen für die Primerverlängerung unter Vermittlung
einer Polymerase durch Anfügen von Nukleotiden an das Ende
des Primermoleküls unter Verwendung des Templatestrangs
als Template.
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Wenn
ein bestimmter Primer „für" ein bestimmtes Nukleinsäure-Template
steht oder diesem „entspricht", paaren sich die Basen des
Primer mit diesem Nukleinsäure-Template, d. h. gehen eine
Hybridisierung mit ihm ein. Im Folgenden wird ausführlich
erörtert, dass ein Primer für ein bestimmtes Nukleinsäure-Template und
das betreffende Nukleinsäure-Template oder dessen Komplement
normalerweise mindestens einen Bereich benachbarter Nukleotide enthalten,
deren Sequenz identisch ist.
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Der
hier gebrauchte Begriff „Reagenzienmischung" betrifft eine
Kombination von Reagenzien, die miteinander vermischt sind und keiner
bestimmten Reihenfolge unterliegen. Eine Reagenzienmischung ist
heterogen und lässt sich räumlich nicht in seine
verschiedenen Bestandteile auftrennen. Als Beispiele für
Mischungen von Elementen seien eine Anzahl verschiedener Elemente,
die in ein und derselben wässrigen Lösung gelöst
sind, oder eine Anzahl verschiedener Elemente genannt, die in einer
zufälligen oder in keiner bestimmten Verteilung auf einem
festen Substrat angebracht sind oder bei denen sich die verschiedenen
Elemente räumlich nicht voneinander unterscheiden.
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Unter
dem Begriff „Sequenzierung" ist die Ermittlung der Art
eines oder mehrerer Nukleotide zu verstehen, d. h., ob es sich bei
dem Nukleotid um G, A, T oder C handelt.
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Der
Ausdruck „oberflächengebundenes Enzym" betrifft
ein Enzym, das auf einer Oberfläche eines festen Substrats
immobilisiert ist, wobei das Substrat eine Vielfalt vom Anordnungen
haben kann, z. B. als Blatt, Perle oder als andere Struktur. Bei
bestimmten Ausführungsformen befinden sich die hier verwendeten
Enzyme auf einer Oberfläche desselben Substrats.
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Der
Begriff „Luziferase" bezieht sich auf eine Adenosintriphosphat(ATP)-hydrolase,
welche die Hydrolyse von ATP unter Freisetzung von Licht (hν)
in ihre Bestandteile Adenosinmonophospat (AMP) und Pyrophosphat
(PPi) katalysiert. Eine Luziferase weist eine Aktivität
auf, wie sie gemäß EC 1.13.12.7 in der Enzymnomenklatur
der IUBMB beschrieben wird. Der systematische Name für
eine Luziferase lautet Photinus-luziferin-4-monooxygenase (zur ATP-Hydrolyse).
Die Luziferase Photinus pyralis ist ein Luziferasetyp.
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Die
Begriffe „Sulfurylase" oder „ATP-Sulfurylase"
betreffen eine Transferase, welche die Bildung von ATP aus PPi in
Anwesenheit von Adenosin-5'-Phosphosulfat (APS) katalysiert. Eine
Sulfurylase weist eine Aktivität gemäß EC
2.7.7.4 in der Enzymnomenklatur der IUBMB auf. Der systematische
Name für eine Sulfurylase lautet ATP-sulfat-adenylyltransferase.
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Der
Begriff „Apyrase" betrifft eine Nukleotid-Hydrolase, welche
die Hydrolyse von Nukleosidtriphosphat und Nukleosiddiphosphat in
seine Bestandteile Nukleosidmonophosphat und Phosphat katalysiert.
Eine Apyrase weist eine Aktivität gemäß EC
3.6.1.5 in der Enzymnomenklatur der IUBMB auf. Der systematische Name
für eine Apyrase lautet ATP-diphosphohydrolase (zur Phosphatbildung).
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Der
Begriff „Pyrophosphohydrolase" betrifft eine Dinukleosidtetraphosphat-Hydrolase,
welche die symmetrische Hydrolyse von Dinukleosidtetraphosphat in
dessen Nukleosiddiphosphate katalysiert. Eine Pyrophosphohydrolase
weist eine Aktivität auf, wie sie von Plateau,
P., et al. in Biochemistry 24 (1985), S. 914 bis 922, beschrieben
wird.
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Dem
Begriff „verwenden" kommt seine übliche Bedeutung
zu und bedeutet insofern das Benutzen, z. B. das Ingangsetzen, eines
Verfahrens oder einer Zusammensetzung, um eine bestimmte Zielstellung
zu erreichen. Wenn beispielsweise ein Programm zum Erstellen einer
Datei verwendet wird, wird ein Programm zum Erzeugen einer Datei
ausgeführt, wobei die Datei im Allgemeinen das Ergebnis
des Programms darstellt. Wenn bei einem anderen Beispiel eine Computerdatei
verwendet wird, wird üblicherweise auf sie zugegriffen, sie
wird gelesen, und die in der Datei gespeicherten Daten werden zum
Erreichen einer bestimmten Zielstellung benutzt. Wenn eine eindeutige
Kennung, z. B. ein Strichcode, verwendet wird, wird die eindeutige
Kennung desgleichen üblicherweise gelesen, um zum Beispiel
ein mit der eindeutigen Kennung in Zusammenhang stehendes Objekt
oder eine Datei zu ermitteln.
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BESCHREIBUNG DER BESONDEREN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Es
wird ein Verfahren zur Sequenzierung einer Nukleinsäure
bereitgestellt. Bei bestimmten Ausführungsformen beinhaltet
das Verfahren das Zusammenführen eines Nukleinsäureduplexes,
der ein Nukleinsäuretemplate und einen an das Template
angelagerten Primer aufweist, mit einer Reagenzienmischung unter
den Bedingungen für die Primerverlängerung, um
einen verlängerten Primer und ATP zu erzeugen. Die Reagenzienmischung
kann eine Adenosin-2'-desoxynukleosidtetraphosphat-Komponente und
eine Polymerase enthalten. Das Verfahren beinhaltet ferner die Detektierung
der erzeugten ATP. Ferner werden auch Adenosin-2'-desoxynukleosidtetraphosphat-Komponenten
angegeben, die bei den beschriebenen Verfahren Anwendung finden.
Ferner werden auch Mischungen mit Adenosin-2'-desoxynukleosidtetraphosphat-Komponenten beschrieben,
die bei den beschriebenen Verfahren angewendet werden.
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Bevor
die vorliegende Erfindung ausführlicher beschrieben wird,
sollte klar sein, dass diese Erfindung nicht auf die einzelnen beschriebenen
Ausführungsformen beschränkt ist und insofern
natürlich variieren kann. Ferner sollte klar sein, dass
die hier gebrauchten Begriffe nur zur Beschreibung bestimmter Ausführungsformen
dienen und nicht als Einschränkung anzusehen sind, da die
vorliegende Erfindung nur durch die angehängten Ansprüche
beschränkt wird.
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Wenn
ein Wertebereich angegeben wird, ist klar, dass, wenn sich nicht
aus dem Zusammenhang deutlich anderes ergibt, jeder Zwischenwert
in Zehnteln der Einheit des unteren Grenzwertes zwischen dem oberen und
dem unteren Grenzwert dieses Bereichs und jeder andere angegebene
oder Zwischenwert in diesem angegebenen Bereich von der Erfindung
erfasst wird.
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Sofern
nicht anders definiert, haben alle hier gebrauchten technischen
und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie einem
Fachmann geläufig ist, an den sich diese Erfindung richtet.
Obgleich zur Ausführung oder zum Testen der vorliegenden
Erfindung auch beliebige Verfahren und Materialien verwendet können,
die den hier beschriebenen ähnlich oder gleichwertig sind,
werden im Folgenden die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben.
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Alle
in dieser Beschreibung angegebenen Veröffentlichungen und
Patente sind hierin durch Bezugnahme derart aufgenommen, als würde
jede einzelne Veröffentlichung oder jedes einzelne Patent
im Besonderen und einzeln als durch Bezugnahme aufgenommen bezeichnet,
um die Verfahren und/oder Materialien in dem Zusammenhang darzulegen
und zu beschreiben, in welchem die Veröffentlichungen angegeben
werden. Die Nennung einer beliebigen Veröffentlichung dient
zu deren Offenlegung vor dem Anmeldedatum und ist nicht als Eingeständnis
anzusehen, dass die vorliegende Erfindung nicht zur Vordatierung
einer solchen Veröffentlichung mittels einer vorhergehenden
Erfindung berechtigt sei. Ferner kann das angegebene Datum der Veröffentlichungen
von den wirklichen Daten der Veröffentlichungen abweichen,
die gegebenenfalls unabhängig davon bestätigt
werden müssen.
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Es
muss darauf hingewiesen werden, dass sich die in dieser Beschreibung
und in den angehängten Ansprüchen gebrauchten
Einzahlformen „ein", „eine" und „der,
die, das" auch die Bedeutung der Mehrzahl einschließen,
sofern sich nicht aus dem Zusammenhang deutlich anderes ergibt.
Ferner wird darauf hingewiesen, dass die Ansprüche so abgefasst
sein können, dass jedes wahlweise Element ausgeschlossen
wird. Insofern dient diese Feststellung als Bezugsbasis für
die Verwendung von Ausschließlichkeitsbegriffen wie „ausschließlich", „nur"
und Ähnliches in Verbindung mit der Nennung von Elementen
der Ansprüche oder für die Verwendung einer „negativen"
Einschränkung.
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Nach
der Lektüre dieser Beschreibung ist dem Fachmann klar,
dass jede einzelne der hier beschriebenen und dargestellten Ausführungsformen
einzelne Komponenten und Merkmale aufweist, die unschwer von den
Merkmalen jeder beliebigen der anderen Ausführungsformen
abgetrennt oder mit diesen kombiniert werden können, ohne
von Geist oder Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Jedes angegebene Verfahren kann in der angegebenen Reihenfolge der
Verfahrensschritte oder in einer beliebigen anderen logisch möglichen
Reihenfolge ausgeführt werden.
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Als
Erstes werden Adenosin-2'-desoxynukleosidtetraphosphat-Verbindungen
beschrieben, worauf eine detaillierte Beschreibung der Art und Weise
der Verwendung der betreffenden Adenosin-2'-desoxynukleosidtetraphosphat-Verbindungen
zur Sequenzierung einer Nukleinsäure folgt.
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ADENOSIN-2'-DESOXYNUKLEOSIDTETRAPHOSPHAT-VERBINDUNGEN
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Adenosin-2'-desoxynukleosidtetraphosphat-Verbindungen
(Ap
4dN), die im vorliegenden Zusammenhang
verwendet werden können, weisen die folgende Formel auf:
wobei
R ein 2'-Desoxynukleosid ist.
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Formel
(I) zeigt, dass die Ap4dN-Verbindungen einen
Adenosinsubstituenten enthalten, der über vier Phosphatgruppen
mit einem 2'-Desoxynukleosid-Substituenten durch dessen 5'-Hydroxylgruppe
verbunden ist. Bei bestimmten Ausführungsformen wird die
Nukleosidbase von Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G), Cytosin (C)
oder einem ihrer Analoga gebildet, wobei ein Analogon eine modifizierte
Base aufweist, die ihre Fähigkeit zur Basenpaarbildung
mit einem komplementären Nukleotid beibehält.
Bei bestimmten Ausführungsformen dient Desoxyadenosin,
Desoxyguanosin, Desoxycytidin oder Thymidin als 2'-Desoxynukleosid-Substituent.
Mit anderen Worten, gemäß 1 enthalten
die betreffenden Ap4dN-Verbindungen einen
Adenosintriphosphat(ATP)-Substituenten und einen 2'-Desoxynukleotidmonophosphat-(dNMP-)Substituenten.
Bei bestimmten Ausführungsformen besteht der dNMP-Teil
des Moleküls aus Desoxyadenosinmonophosphat (dAMP), Desoxyguanosinmonophosphat
(dGMP), Desoxycytidinmonophosphat (dCMP) oder aus Thymidinmonophosphat
(TMP). Die Strukturen beispielhafter Ap4dN-Verbindungen sehen wie
folgt aus: Adenosin-2'-desoxyadenosintetraphosphat (Formel (II));
Adenosin-2'-desoxycytidintetraphosphat (Formel (III)); Adenosin-2'-desoxyguanosintetraphosphat
(Formel (IV)); und Adenosin-thymidintetraphosphat (Formel (V)).
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Die
betreffenden Verbindungen können entweder enzymatisch (z.
B. unter Verwendung der E. coli-lyxyl-tRNS-Synthetase gemäß der
Beschreibung von Plateau, P., et al., Biochemistry 24 (1985),
S. 914 bis 922) oder unter Verwendung von Syntheseverfahren
hergestellt werden. Als Syntheseverfahren zur Herstellung von Ap4dN kann die Phosphitylierung eines geschützten
Nukleosids mit 2-Chloro-4H-1,3,2-benzo-dioxyphosphorin-4-on (Salicylchlorophosphit)
mit anschließender Reaktion mit anorganischem Pyrophosphat
und einem Nukleosid-5'-monophosphat infrage kommen. Beispielhafte
Syntheseverfahren zur Herstellung von Ap4dN
werden von Han, Q., et al., Organic Letters, 8(10), S. 2075
bis 2077 (2006) sowie von Reiss, J. R. und Moffatt,
J. G., Journal Organic Chemistry, 30, S. 3381 bis 3387 (1965); Feldhaus,
P., et al., European Journal Biochemistry, 57, S. 197 bis 204 (1975);
und Shimazu, M., et al., Tetrahedron Letters, 31, S. 235
bis 238 (1990) beschrieben, wobei diese Veröffentlichungen
hier zur Darlegung dieser Verfahren durch Bezugnahme einbezogen
sind.
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Im
Folgenden wird unter Bezug auf 2 ausführlicher
die Verwendung eines solchen Ap4dN als Substrat
für eine templateabhängige Polymerisationsreaktion
beschrieben, welche zum Einbau des dNMP-Substituenten in den länger
werdenden Primer und zur entsprechenden Freisetzung der ATP-Komponente
des Ap4dN führt.
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Im
Folgenden wird außerdem ausführlicher beschrieben,
wie die Adenosin-2'-Desoxynukleosidtetraphosphat-Verbindungen bei
den hier beschriebenen Sequenzierungsverfahren verwendet werden
können.
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VERFAHREN
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Es
werden Verfahren zur Sequenzierung durch Synthese bereitgestellt.
Bei bestimmten Ausführungsformen und unter Bezug auf 2 beinhaltet
das betreffende Verfahren das Zusammenführen eines Nukleinsäureduplexes
(d. h. ein Nukleinsäuretemplate mit einem angelagerten
Primer) mit einer entsprechenden Adenosin-2'-Desoxynukleosidtetraphosphat(Ap4dN)-Komponente und einer Polymerase unter
den Bedingungen für die Primerverlängerung, um
einen verlängerten Primer und Adenosintriphosphat (ATP)
zu erzeugen. Ferner beinhaltet das Verfahren die Detektierung des
erzeugten ATP.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen und unter Bezug auf 2 wird
ein Nukleinsäureduplex, der einen an das Nukleinsäuretemplate
angelagerten Primer aufweist, unter den Bedingungen für
die Primerverlängerung mit einer Reagenzienmischung zusammengeführt.
Bei bestimmten Ausführungsformen beinhaltet die Reagenzienmischung
eine Ap4dN-Komponente und eine Polymerase.
Wenn das Ap4dN einen dNMP-Substituenten
enthält, der zu der nächsten erreichbaren Base
im Nukleinsäuretemplate komplementär ist, baut
die Polymerase den dNMP-Substituenten des Ap4dN
in den Primer ein und verlängert so den Primer um ein Nukleotid.
Außerdem setzt die Polymerase entsprechend die ATP-Komponente
des Ap4dN frei. Somit ist die Menge des
durch die Polymerase freigesetzten ATP der Anzahl der in den länger
werdenden Primer eingebauten dNMPs proportional. Die Anzahl der
in den länger werdenden Primer eingebauten dNMPs kann aus
der Menge des Lichts abgeleitet werden, das in der nachfolgenden
Luziferin-Luziferase-Reaktion erzeugt wird, die im Folgenden beschrieben
wird.
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Das
durch die Polymerasereaktion erzeugte ATP kann auf einem beliebigen
aus einer Vielfalt von verschiedenen Wegen detektiert werden. Bei
bestimmten Ausführungsformen wird das durch die Polymerasereaktion
erzeugte ATP direkt durch eine enzymatische Reaktion unter Lichtemission
detektiert. Bei bestimmten Ausführungsformen wird das durch
die Polymerasereaktion erzeugte ATP mit Luziferin und einem ATP-abhängigen
Luziferaseenzym zusammengebracht. Bei bestimmten Ausführungsformen
dient als Luziferase ein an der Oberfläche gebundenes Enzym.
Bei bestimmten Ausführungsformen werden die Polymerase
und die Luziferase zu einem einzigen chimären Enzym vereint.
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Das
durch die Polymerasereaktion erzeugte ATP wird bei der Luziferin-Luziferase-Reaktion
umgesetzt, was zur Bildung von anorganischem Pyrophosphat (PPi)
und Licht (hν) führt. Somit ist die Menge des erzeugten
Lichts der Menge des durch die Polymerase freigesetzten ATP proportional,
die wiederum der Anzahl der in den länger werdenden Primer
eingebauten dNMPs proportional ist. Wenn das Nukleinsäuretemplate
beispielsweise zwei aufeinanderfolgende identische Nukleotide enthält
und das Ap4dN, welches das komplementäre
Nukleotid enthält, zur Polymerasereaktion hinzugefügt
wird, wird der Primer um zwei komplementäre Nukleotide
verlängert. Demzufolge wird durch die Polymerasereaktion
doppelt so viel ATP freigesetzt und durch die Luzifering-Luziferase-Reaktion
folglich doppelt so viel Licht erzeugt.
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Wichtig
ist, dass die vorliegenden Verfahren bei bestimmten Ausführungsformen
nicht von der Freisetzung der PPi abhängig sind, um eine
Reaktionskette zur Erzeugung eines detektierbaren Lichtsignals auszulösen.
Wie oben erörtert wurde, wird stattdessen das zum Auslösen
der lichtemittierenden Luziferin-Luziferase-Reaktion erforderliche
ATP direkt durch die Polymerasereaktion freigesetzt.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen wird das durch die Luziferin-Luziferase-Reaktion
erzeugte Licht detektiert. Solche Detektionsverfahren sind bestens
bekannt und werden üblicherweise bei anderen Sequenzierungsverfahren
wie zum Beispiel bei dem in der
US-Patentschrift
6 613 523 beschriebenen angewendet.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen wird das betreffende Verfahren
unter Verwendung verschiedener Ap4dNs nacheinander
oder parallel wiederholt. Zum Beispiel kann das Verfahren nacheinander
durchgeführt werden, zuerst mit Adenosin-2'-desoxyadenosintetraphosphat
(Ap4dN), dann mit Adenosin-2'-desoxyguanosintetraphosphat
(Ap4dG), dann mit Adenosin-2'-desoxycytidintetraphosphat
(Ap4dC) und schließlich mit Adenosinthymidintetraphosphat
(Ap4T). Das bei einer dieser Reaktionen
erzeugte Licht zeigt an, welches dNMP jeweils zum länger
werdenden Primer hinzugefügt wurde, und demzufolge, welche
komplementäre Base sich in der Sequenz des Nukleinsäuretemplate
befindet. Somit können mehrere Wiederholungen des beschriebenen
Verfahrens unter Verwendung verschiedener Ap4dNs
durchgeführt werden, um die Sequenz des Nukleinsäuretemplate
zu ermitteln.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen wird das beschriebene Verfahren
in parallelen Reaktionen durchgeführt, wobei jede Reaktion
ein anderes Ap4dN verwendet. Bei bestimmten
Ausführungsformen wird das beschriebene Verfahren in einer
Reihe paralleler Reaktionen durchgeführt, wobei jede Reaktion
in einer Reihe ein anderes Ap4dN verwendet.
-
Ferner
wird ein Verfahren zur Sequenzierung einer Nukleinsäure
bereitgestellt, das folgende Schritte aufweist: (a) aufeinanderfolgendes
Zusammenbringen eines Nukleinsäureduplexes, der ein Nukleinsäuretemplate
und einen daran angelagerten Primer aufweist, in beliebiger Reihenfolge
mit: (i) Adenosin-2'-desoxycytidintetraphosphat; (ii) Adenosin-2'-desoxyguanosintetraphosphat;
(iii) Adenosin-2'-Desoxyadenosintetraphosphat; und (iv) Adenosinthymidintetraphosphat;
und einer Polymerase unter den Bedingungen für die Primerverlängerung;
und (b) Detektieren, welche der Reaktionen ATP erzeugt, wobei die
ATP-Erzeugung das an den Primer angelagerte Nukleotid anzeigt.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen können viele hundert
oder viele tausend oder Millionen von Nukleinsäuretemplates
in räumlich adressierbaren Reaktionen parallel sequenziert
werden, z. B. indem sie auf einer 96er Mikrotiterplatte, auf Perlen
oder in einer Matrix angeordnet sind. Bei bestimmten Ausführungsformen durchlaufen
alle räumlich adressierbaren Reaktionen parallel dieselben
chemischen Umsetzungen, z. B. durch die Verwendung einer Durchflusszelle.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen und unter Bezug auf 2 wird
das durch die Luziferin-Luziferase-Reaktion erzeugte PPi mit Adenosin-5'-phosphosulfat
(APS) und einer ATP-Sulfurylase zusammengebracht. Bei bestimmten
Ausführungsformen dient als Sulfurylase ein an die Oberfläche
gebundenes Enzym. Bei bestimmten Ausführungsformen werden
die Enzyme Sulfurylase und Luziferase auf demselben festen Substrat
immobilisiert. Bei bestimmten Ausführungsformen werden
die Luziferase und die Sulfurylase zu einem einzigen chimären
Enzym vereint. Das durch die Luziferin-Luziferase-Reaktion erzeugte
PPi wird durch Sulfurylase wieder in ATP umgewandelt. Die entstandene
ATP kann im Kreislauf durch die Luziferin-Luziferase-Reaktion geführt
werden, um das Gesamtsignal zu verstärken und die Empfindlichkeit
des Verfahrens zu verbessern.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen und unter Bezug auf 2 beinhaltet
die Reagenzienmischung ein Enzym, welches die Ap4dNs
abbaut. Bei bestimmten Ausführungsformen handelt es sich
bei dem Enzym um eine Pyrophosphohydrolase. Bei bestimmten Ausführungsformen
handelt es sich bei dem Enzym um E. coli-Pyrophosphohydrolase. Die
Pyrophosphohydrolase hydrolysiert die Ap4dNs
zu 2'-Desoxynukleotiddiphosphat-(dNDP-)Komponenten und Adenosindiphosphat
(ADP).
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Bei
bestimmten Ausführungsformen und unter Bezug auf 2 beinhaltet
die Reagenzienmischung ein Enzym für den Nukleotidabbau.
Bei bestimmten Ausführungsformen handelt es sich bei dem
Enzym für den Nukleotidabbau um Apyrase. Bei bestimmten
Ausführungsformen handelt es sich bei der Apyrase um ein an
der Oberfläche gebundenes Enzym. Apyrase wandelt restliches
ATP, APS, ADP und dNDPs in Nukleotidmonophosphate(NMPs) und anorganisches
Monophosphat (Pi) um. Durch das Entfernen von restlichem ATP, APS,
ADP und dNDPs wird verhindert, dass sie sich störend auf
den gewünschten Reaktionsverlauf auswirken können.
Bei bestimmten Ausführungsformen wird die Apyrase mit der
Reaktionsmischung zusammengebracht, nachdem das Licht detektiert
wurde. Bei bestimmten Ausführungsform wird die Apyrase
vor der nachfolgenden Wiederholung des beschriebenen Verfahrens
entfernt.
-
Bei
bestimmten Ausführungsformen wird ein Verfahren zur Sequenzierung
einer Nukleinsäure bereitgestellt. Das Verfahren beinhaltet
in einer Vielzahl von Reaktionen das getrennte Zusammenbringen eines
Nukleinsäureduplexes, der einen an ein Nukleinsäuretemplate
angelagerten Primer aufweist, mit: (i) Adenosin-2'-desoxycytidintetraphosphat;
(ii) Adenosin-2'-Desoxyguanosintetraphosphat; (iii) Adenosin-2'-Desoxyadenosintetraphosphat;
oder (iv) Adenosinthymidintetraphosphat; und eine Polymerase unter
den Bedingungen für die Primerverlängerung. Das
Verfahren beinhaltet ferner das Detektieren, welche aus der Vielzahl
der Reaktionen ATP erzeugt. Durch das Detektieren, welche Reaktion
ATP erzeugt, kann die Natur des an den länger werdenden
Primer angefügten Nukleotids ermittelt werden, da gemäß der
obigen Beschreibung ATP nur dann freigesetzt wird, wenn an den länger
werdenden Primer ein Nukleotid angefügt wird. Demzufolge
wird hierdurch die Natur des entsprechenden komplementären
Nukleotids des Nukleinsäurestemplate angezeigt.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen und gemäß der
obigen Beschreibung wird das vorliegende Verfahren wiederholt. Somit
kann die Sequenz des Nukleinsäuretemplate ermittelt werden.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen und gemäß der
obigen Beschreibung kann das durch die Polymerasereaktion erzeugte
ATP durch eine enzymatische Reaktion direkt detektiert werden. Bei
bestimmten Ausführungsformen wird die durch die Polymerasereaktion
erzeugte ATP mit Luziferin und einem ATP-abhängigen Luziferaseenzym
zusammengebracht. Bei bestimmten Ausführungsformen handelt
es sich bei der Luziferase um ein an der Oberfläche gebundenes
Enzym. Die durch die Polymerasereaktion erzeugte ATP wird bei der Luziferin-Luziferase-Reaktion
verbraucht, was zur Bildung von anorganischem Pyrophosphat (PPi)
und Licht (hν) führt. Somit hängen die
vorliegenden Verfahren bei bestimmten Ausführungsformen
nicht von der Freisetzung von PPi ab, um ein detektierbares Lichtsignal
erzeugen zu können. Gemäß der obigen
Erörterung wird stattdessen das zum Auslösen der
lichtemittierenden Luziferin-Luziferase-Reaktion erforderliche ATP
direkt durch die Polymerasereaktion freigesetzt.
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Bei
den vorliegenden Verfahren kann jede Polymerase verwendet werden,
die eine templateabhängige Anlagerung eines Nukleotids
an einen Primer katalysieren kann. Je nach den Eigenschaften der
Ziel-Nukleinsäure kann eine DNS-Polymerase, eine RNS-Polymerase,
eine reverse Transkriptase oder eine abgewandelte oder veränderte
Form einer der vorhergehenden Verbindungen verwendet werden.
-
Zu
den für die Erfindung brauchbaren DNS-Polymerasen zählen,
wobei sie nicht darauf beschränkt sind: Pyrococcus furiosus
(Pfu)-DNS-Polymerase (
Lundberg et al., 1991, Gene, 108:1,
Stratagene), Pyrococcus woesei (Pwo) DNS-Polymerase (
Hinnisdaels
et al., 1996, Biotechniques, 20:186–8, Boehringer Mannheim),
Thermus thermophilus (Tth) DNS-Polymerase (
Myers und Gelfand
1991, Biochemistry 30: 7661), Bacillus stearothermophilus DNS-Polymerase
(Stenesh und McGowan, 1977, Biochim. Biophys. Acta 475: 32), Thermococcus
litoralis (TI) DNS-Polymerase (auch als
VentTM DNS-Polymerase
bezeichnet, Cariello et al., 1991, Polynucleotides Res., 19: 4193,
New England Biolabs), Stoffel-Fragment, ThermoSequenase
TM (Amersham Pharmacia Biotech UK), Therminator
TM (New England Biolabs), Thermotoga maritima
(Tma) DNS-Polymerase (
Diaz and Sabino, 1998 Braz. J. Med.
Res., 31: 1239), Thermus aquaticus (Taq) DNS-Polymerase
(
Chien et al., 1976, J. Bacteriol., 127: 1550),
Pyrococcus kodakaraensis KOD DNS-Polymerase (
Takagi et al.,
1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 4504), JDF-3 DNS-Polymerase
(von thermococcus sp. JDF-3, Patentanmeldung
WO 0132887 ), Pyrococcus GB-D (PGB-D)
DNS-Polymerase (auch als Deep Vent DNS-Polymerase bezeichnet (
Juncosa-Ginesta
et al., 1994, Biotechniques, 16: 820, New England Biolabs),
UITma DNS-Polymerase (
von dem thermophilen Thermotoga maritima;
Diaz und Sabino, 1998 Braz. J. Med. Res., 31: 1239; PE Applied Biosystems),
Tgo DNS-Ppolymerase (von Thermococcus gorgonarius, Roche Molecular Biochemicals),
E. coli DNS-Polymerase I (
Lecomte und Doubleday, 1983, Polynucleotides
Res. 11: 7505), T7 DNS-Polymerase (
Nordstrom et
al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 3112), und archaische DP1I/DP2
DNS-Polymerase II (
Cann et al., 1998, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 95: 14250).
-
In
bestimmten Fällen kann es sich bei der Polymerase um eine
Polymerase handeln, die speziell ausgewählt wurde, da sie
eine hohe Affinität für die oben beschriebenen
Substrate aufweist. Bei bestimmten Ausführungsformen ist
die Michaelis-Menten-Konstante (Km) des Ap4dN für die Polymerase
der Km der natürlichen dNTPs vergleichbar (d. h. kleiner
als ungefähr 20 μM).
-
Bei
bestimmten Ausführungsformen kann eine Polymerase Verfahren
der so genannten „gelenkten Evolution" unterworfen werden,
die nach einer Polymerase mit einer veränderten Affinität
für Ap4dN suchen. In der Praxis sind eine Vielfalt von
solchen Verfahren der „gelenkten Evolution" bekannt, darunter,
aber nicht darauf beschränkt, DNA shuffling (PCT
WO 00/42561 A3 ;
PCT
WO 01/70947A3 ),
Exon shuffling (
US-Patentschrift
Nr. 6 365 377 ;
Kolkman & Stemmer, 2001, Nat. Biotechnol.
19: 423–428), Family shuffling (
Crameri
et al., 1998, Nature 391: 288–291;
US-Patentschrift Nr. 6 376 246 ), RACHITT.TM.
(
Coco et al., 2001, Nat. Biotechnol. 19: 354–359;
PCT
WO 02/06469 ), STEP
and random priming of in vitro recombination (
Zhao et al., 1998,
Nat. Biotechnol. 16: 258–261;
Shao et
al., 1998, Nucleic Acids Res. 26:681–683), Exonuclease
mediated gene assembly (
US-Patentschrift
Nr. 6 352 842 ;
US-Patentschrift
Nr. 6 361 974 ), Gene site saturation Mutagenesis.TM. (
US-Patentschrift Nr. 6 358 709 ),
Gene Reassembly.TM. (
US-Patentschrift
Nr. 6 358 709 ), SCRATCHY (
Lutz et al., 2001, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 98: 11248–11253), DNA fragmentation
methods (
Kikuchi et al., Gene 236: 159–167),
Single-stranded DNA shuffling (
Kikuchi et al., 2000, Gene
243: 133–137), und AMEsystem.TM. directed evolution
Protein engineering technology (Applied Molecular Evolution) (
US-Patentschrift Nr. 5 824 514 ;
US-Patentschrift Nr. 5 817 483 ;
US-Patentschrift Nr. 5 814 476 ;
US-Patentschrift Nr. 5 763 192 ;
US-Patentschrift Nr. 5 723 323 ).
-
REAGENZIENSÄTZE
-
Reagenziensätze
zur Verwendung beim Durchführen bestimmter hier beschriebener
Verfahren werden ebenfalls bereitgestellt. Bei bestimmten Ausführungsformen
beinhalten die Reagenziensätze mindestens vier verschiedene
Adenosin-2'-desxoxynukleosidtetraphosphate, z. B. Adenosin-2'-desoxycytidintetraphosphat,
Adenosin-2'-desoxygunosintetraphosphat, Adenosin-2'-Desoxyadenosintetraphosphat
und Adenosin-thymidintetraphosphat. Ein Reagenziensatz kann außerdem
auch noch eine Polymerase enthalten. Ferner kann ein Reagenziensatz
Reagenzien zum Detektieren von ATP enthalten, darunter, aber nicht
darauf beschränkt: eine Luziferase und Luziferin. In bestimmten
Fällen kann ein Reagenziensatz ferner auch Adenosin-5'-Phosphosulfat,
eine ATP-Sulfurylase, eine Apyrase, eine Pyrophosphohydrolase usw.
enthalten. Ferner kann ein Reagenziensatz weitere Reagenzien enthalten,
die bei den Verfahren gemäß der Erfindung verwendet
werden, z. B. Puffer, oxidierende Reagenzien, Abbruchreagenzien,
Spaltreagenzien usw. Bei bestimmten Ausführungsformen enthalten
die Reagenziensätze ferner Anweisungen zur Durchführung
der beschriebenen Verfahren oder Mittel zu deren Beschaffung (z.
B. den URL einer Website, welcher den Benutzer auf eine Webseite
führt, welche die Anweisungen bereithält), wobei
diese Anweisungen auf einer Unterlage aufgedruckt sein können und
als Unterlage eine oder mehrere der folgenden Möglichkeiten
infrage kommen: eine Packungsbeilage, die Verpackung selbst, Reagenzienbehälter
und Ähnliches. In den beschriebenen Reagenziensätzen
liegen die eine oder die mehreren Komponenten in ein und demselben
oder in verschiedenen Behältern vor, je nachdem wie es
von Vorteil oder wünschenswert ist.
-
Alle
in dieser Beschreibung genannten Veröffentlichungen und
Patentanmeldungen sind hierin durch Bezugnahme derart aufgenommen,
als würde jede einzelne Veröffentlichung oder
jede einzelne Patentanmeldung im Besonderen und einzeln als durch
Bezugnahme aufgenommen bezeichnet. Die Nennung einer beliebigen
Veröffentlichung dient zu deren Offenlegung vor dem Anmeldedatum
und ist nicht als Eingeständnis anzusehen, dass die vorliegende
Erfindung nicht zur Vordatierung einer solchen Veröffentlichung
mittels einer vorhergehenden Erfindung berechtigt sei.
-
Obwohl
die obige Erfindung zur Verdeutlichung durch Abbildungen und Beispiele
bis zu einem gewissen Grad detailliert beschrieben wurde, ist dem
Fachmann angesichts der Lehren dieser Erfindung klar, dass daran
bestimmte Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden
können, ohne von Geist oder Geltungsbereich der angehängten
Ansprüche abzuweichen.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
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- - US 6613523 [0050]
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