DE69827060T2

DE69827060T2 - Modifizierte Primer

Info

Publication number: DE69827060T2
Application number: DE69827060T
Authority: DE
Inventors: Stephen Gordon Will
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-03-20
Filing date: 1998-03-12
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2018-03-13
Also published as: EP0866071B1; EP0866071A2; HUP9800581A2; ATE280177T1; ES2230631T3; HK1012192A1; US6001611A; IL123694A0; AU712448B2; CN1065873C; JP2966389B2; CA2229766A1; NO981239D0; NO981239L; BR9801878A; HU9800581D0; BR9801878B1; UA49843C2; HU223669B1; PL190142B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und Nucleinsäurechemie. Genauer betrifft sie Methoden und Reagenzien zur Verbesserung der Ausbeute bei Nucleinsäureamplifikationsreaktionen. Die Erfindung hat Anwendungen in jedem Gebiet, in dem eine Nucleinsäureamplifikation verwendet wird.
Die Erfindung der Polymerasekettenreaktion (PCR) machte die in-vitro-Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen möglich. Die PCR wird in den U.S.-Patenten Nr. 4 683 195; 4 683 202 und 4 965 188; in Saiki et al., 1985, Science 230: 1350–1354; Mullis et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263–273 und Mullis und Faloona, 1987, Methods Enzymol. 155: 335–350 beschrieben. Die Entwicklung und Anwendung der PCR wird intensiv in der Literatur beschrieben. Z. B. werden eine Reihe von mit PCR in Beziehung stehenden Themen diskutiert in PCR Technology – principles and applications for DNA amplification, 1989 (Herausgeber H. A. Erlich) Stockton Press, New York; PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990 (Herausgeber M. A. Innis et al.) Academic Press, San Diego und PCR Strategies, 1995 (Herausgeber M. A. Innis et al.) Academic Press, San Diego. Kommerzielle Vertreiber, wie Perkin Elmer (Norwalk, CT) vertreiben PCR-Reagenzien und veröffentlichen PCR-Protokolle.
Seit der ursprünglichen Publikation der Nucleinsäureamplifikation wurden verschiedene auf Primer basierende Nucleinsäureamplifikationsmethoden beschrieben, unter anderem Lipase Chain Reaction (LCR, Wu und Wallace, 1989, Genomics 4: 560–569 und Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189–193); Polymerase Lipase Chain Reaction (Barany, 1991, PCR Methods and Applic. 1: 5–16); Gap-LCR (PCT Patentanmeldung Veröffentlichungsnr. WO 90/01069); Repair Chain Reaction (Europäische Patentanmeldung Veröffentlichungsnr. 439 182 A2), 3SR (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173–1177; Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878; PCT Patentanmeldung Veröffentlichungsnr. WO 92/0880A) und NASBA (U.S.-Patent Nr. 5 130 238). Ein Überblick über Amplifikationssysteme wird in Abramson und Myers, 1993. Current Opinion in Biotechnology, 4: 41–47 gegeben.
Die Spezifität von auf Primern basierenden Amplifikationsreaktionen hängt von der Spezifität der Primerhybridisierung ab. Bei erhöhten Temperaturen, die bei einer typischen Amplifikation verwendet werden, hybridisieren Primer nur mit der vorgesehenen Zielsequenz. Amplifikationsreaktionsmischungen werden typischerweise jedoch bei Raumtemperatur zusammengefügt, gut unterhalb der Temperatur, die notwendig ist, um die Primerhybridisierungsspezifität sicherzustellen. Unter weniger stringenten Bedingungen können die Primer unspezifisch an andere, nur teilweise komplementäre Nucleinsäuresequenzen oder an andere Primer binden und die Synthese von unerwünschten Extensionsprodukten starten, die zusammen mit der Zielsequenz vervielfältigt werden können. Die Amplifikation unspezifischer Primerextensionsprodukte kann mit der Amplifikation der gewünschten Zielsequenzen konkturrieren und kann die Effizienz der Amplifikation der gewünschten Sequenz erheblich vermindern.
Eine häufig beobachtete Art von nicht spezifischem Amplifikationsprodukt ist ein matrizenunabhängiges Artefakt von Amplifikationsreaktionen, das als "Primerdimer" bezeichnet wird. Ein Primerdimer ist ein doppelsträngiges Fragment, dessen Länge typischerweise der Summe der beiden Primerlängen nahe kommt und scheint aufzutreten, wenn ein Primer über den anderen Primer verlängert wird. Die entstehende Verkettung bildet eine unerwünschte Matrize, die aufgrund ihrer kurzen Länge wirksam amplifiziert wird.
Eine unspezifische Amplifikation kann vermindert werden, indem die Bildung von Primerextensionsprodukten vor dem Start der Reaktion vermindert wird. Bei einer Methode, die als "Heißstart"-Protokoll bezeichnet wird, werden ein oder mehrere kritische Reagenzien aus der Reaktionsmischung ferngehalten, bis die Temperatur ausreichend hoch ist, um die notwendige Hybridisierungsspezifität zu liefern. Auf diese Art und Weise kann die Reaktionsmischung die Primerextension während der Zeit, während der die Reaktionsbedingungen spezifische Primerhybridisierung nicht sicherstellen, nicht unterstützen.
Manuelle Heißstartmethoden, bei denen die Reagenzgläser nach der ersten Inkubationsstufe bei hoher Temperatur geöffnet werden und die fehlenden Reagenzien zugegeben werden, sind arbeitsintensiv und erhöhen das Risiko einer Kontamination der Reaktionsmischung. Alternativ kann ein wärmeempfindliches Material, wie ein Wachs, verwendet werden, um Reaktionskomponenten voneinander zu trennen oder zu komplexieren, wie in U.S.-Patent Nr. 5 411 876 und Chou et al., 1992, Nucl. Acids. Res. 20(7): 1717–1723 beschrieben. Bei diesen Methoden schmilzt durch eine Präreaktionsinkubation bei hoher Temperatur das wärmeempfindliche Material, wodurch die Reagenzien sich vermischen können.
Eine andere Methode, um die Bildung von Primerextensionsprodukten vor dem Start der Reaktion zu reduzieren, vertraut auf eine in der Wärme reversible Hemmung der DNA-Polymerase durch DNA-Polymerasespezifische Antikörper, wie in U.S.-Patent Nr. 5 338 671 beschrieben. Die Antikörper werden mit der DNA-Polymerase in einem Puffer bei Raumtemperatur inkubiert vor der Zusammenfügung der Reaktionsmischung, um die Bildung des Antikörper-DNA-Polymerase-Komplexes zuzulassen. Jede Hemmung der DNA-Polymeraseaktivität wird inaktiviert durch eine Präreaktionsinkubation bei hoher Temperatur. Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, dass die Erzeugung von Antikörpern, die für die DNA-Polymerase spezifisch sind, teuer und zeitaufwändig ist, insbesondere bei großen Mengen. Weiterhin kann die Zugabe von Antikörpern zu einer Reaktionsmischung eine Umgestaltung der Amplifikationsreaktion erfordern.
Die Bildung von Extensionsprodukten vor dem Start der Reaktion kann auch durch Zugabe eines ein zelsträngigen bindenden Proteins, das nicht kovalent an die Primer in einer durch Hitze reversiblen Art und Weise bindet und die Primerextension hemmt, indem es die Hybridisierung verhindert, zu der Reaktion gehemmt werden.
Eine unspezifische Amplifikation kann auch durch enzymatisch abbauende Extensionsprodukte, die vor dem Start der Reaktion gebildet werden, reduziert werden unter Verwendung der in U.S.-Patent Nr. 5 418 149 beschriebenen Methoden. Der Abbau von neu synthetisierten Extensionsprodukten wird erreicht, indem in die Reaktionsmischung dUTP und UNG eingearbeitet wird und die Reaktionsmischung auf 45 bis 60°C inkubiert wird, bevor die Amplifikationsreaktion durchgeführt wird. Die Primerextension führt zur Bildung von uracilhaltiger DNA, die durch UNG unter Präamplifikationsbedingungen abgebaut wird. Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, dass der Abbau des Extensionsproduktes mit der Bildung des Extensionsproduktes konkurriert und die Eliminierung nicht spezifischer Primerextensionsprodukte wahrscheinlich weniger vollständig ist. Ein Vorteil dieser Methode besteht darin, dass auch uracilhaltige DNA, die in die Reaktionsmischung als Kontamination aus einer vorherigen Reaktion eingetragen wurde, abgebaut wird und daher die Methode auch das Problem der Kontamination einer PCR durch amplifizierte Nucleinsäure aus vorherigen Reaktionen reduziert.
Übliche Techniken der Molekularbiologie und Nucleinsäurechemie, die auf dem Gebiet des Fachmannes liegen, werden vollständig in der Literatur erläutert. Siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Herausgeber, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames und S. J. Higgins, Herausgeber, 1984) und eine Serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).
Die vorliegende Erfindung liefert kovalent modifizierte Oligonucleotidprimer für die in-vitro-Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen. Die Verwendung der modifizierten Primer der Erfindung führt zur Reduktion einer nicht spezifischen bzw. unspezifischen Amplifikation, insbesondere der Primerdimerbildung und/oder einem gleichzeitigen Anstieg der Ausbeute des vorgesehenen Ziels im Vergleich zu einer Amplifikation, die mit unmodifizierten Primern durchgeführt wird.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung einen Oligonucleotidprimer für die Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz mit der allgemeinen Struktur:
worin S₁ eine erste Sequenz von Nucleotiden mit einer Länge zwischen etwa 5 und etwa 50 bedeutet;
worin S₂ eine zweite Sequenz mit einer Länge zwischen 1 und 3 Nucleotiden bedeutet;
worin N ein Nucleotid bedeutet, das eine Purin- oder Pyrimidinbase enthält, die ein exocyclisches Amin aufweist;
worin R eine Modifikatorgruppe bedeutet, wobei R kovalent an N über das exocyclische Amin gebunden ist und wobei R die Struktur:
hat, worin R₁ und R₂ unabhängig Wasserstoff, eine C₁-C₁₀-Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine Phenylgruppe, eine Phenoxygruppe, eine substituierte Phenylgruppe, eine Naphthylgruppe oder eine substituierte Naphthylgruppe bedeuten. Alkylgruppen können verzweigt oder unverzweigt sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist N ein modifiziertes konventionelles Nucleotid, wobei in diesem Fall N ein Adenosin, Cytidin oder Guanosin ist und die Modifikatoreinheit kovalent an das exocyclische Amin einer Adenin-, Guanin- oder Cytosinbase gebunden ist. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist N ein Adenosin.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist R eine 2-Naphthylmethylgruppe, eine Benzylgruppe oder eine substituierte Benzylgruppe. Bevorzugte substituierte Benzylgruppen haben die Struktur
worin R₃ eine verzweigte oder lineare C₁-C₆-Alkylgruppe bedeutet, bevorzugter eine verzweigte oder lineare C₁-C₄-Alkylgruppe, eine Methoxygruppe oder eine Nitrogruppe. Bevorzugt ist R₃ in para-Position gebunden.
In einer bevorzugteren Ausführungsform ist R eine Benzyl-, p-Methylbenzyl-, p-tert.-Butylbenzyl-, p-Methoxybenzyl- oder 2-Naphthylmethylgruppe.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Amplifikationsprimer, die durch fotolabile kovalente Bindung einer Modifikatorgruppe modifiziert sind, was zu einer teilweisen oder vollständigen Hemmung der Primerextension führt. Der fotolabile Modifikator kann entweder an das exocyclische Amin gebunden sein, wie in den oben beschriebenen modifizierten Nucleotiden, oder an den Ringstickstoff. In einer Ausführungsform ist mindestens eine Nitrobenzylgruppe an das exocyclische Amin einer Adenin-, Guanin- oder Cytosinbase des 3'-terminalen Nucleotids gebunden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Paar oder ein Satz von Primern, worin mindestens einer der Primer wie oben beschrieben modifiziert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform sind beide Mitglieder eines Paars von Primern oder alle Mitglieder eines Satzes von Primern modifiziert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Methoden zur Amplifikation von Nucleinsäuren, was beinhaltet, dass eine Amplifikationsreaktion unter Verwendung der modifizierten Primer der Erfindung ausgeführt wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Methoden oder Verfahren zur Amplifikation einer Zielnucleinsäure, was beinhaltet, dass eine Amplifikationsreaktion unter Verwendung der fotolabilen modifizierten Primer der Erfindung durchgeführt wird, wobei die Reaktionsmischung mit Licht so bestrahlt wird, dass die Modifikatorgruppe entfernt wird und die Bildung von Primerextensionsprodukten möglich wird. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Bestrahlung als getrennte Stufe durchgeführt vor dem Start der Amplifikationsreaktion, aber nachdem die Reaktionsmischung auf eine Temperatur von mehr als etwa 50°C erhitzt wurde. In anderen Ausführungsformen wird die Bestrahlungsstufe mit einer Vorstufe des Amplifikationsprozesses kombiniert, wie der reversen Transkriptionsstufe bei einer RNA-Amplifikationsreaktion oder der anfänglichen Denaturierungsstufe bei einer DNA-Amplifikationsreaktion.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Kits zur in-vitro-Amplifikationsreaktion von Nucleinsäuresequenzen, wobei die Kits ein Paar von Primern enthalten, bei denen mindestens einer der Primer wie hier beschrieben modifiziert ist. Die Kits der vorliegenden Erfindung können auch ein oder mehrere Amplifikationsreagenzien einschließen, z. B. eine Nucleinsäuresepolymerase oder -ligase, Nucleosidtriphosphatase und geeignete Puffer.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Ergebnisse von Amplifikationen von HIV-1 RNA, die unter Verwendung von benzylierten Primern durchgeführt wurden, wie in Beispiel 5 beschrieben.
2 zeigt die Ergebnisse von Amplifikationen von HCV-RNA, die unter Verwendung benzylierter Primer durchgeführt wurden, wie in Beispiel 6 beschrieben.
3 zeigt die Ergebnisse von Amplifikationen von HCV-RNA, die unter Verwendung von Primern durchgeführt wurden mit einer bis drei Modifikatorgruppen, wie in Beispiel 7 beschrieben.
4 zeigt die Ergebnisse von Amplifikationen von HCV-RNA, die durchgeführt wurden unter Verwendung der in Beispiel 8 beschriebenen fotolabilen modifizierten Primer.
5 zeigt die Ergebnisse von Amplifikationen von mykobakterieller DNA unter Verwendung von Primern, die mit einer Benzylgruppe modifiziert wurden und Primern, die mit einer p-tert.-Butylbenzylgruppe modifiziert wurden, wie in Beispiel 10 beschrieben.
6 zeigt ein allgemeines Reaktionsschema, das zur Synthese von mit Benzyl- oder substituierten Benzylgruppen modifiziertem dA-kontrolliertem Porenglas bzw. Glas mit kontrollierter Porengröße (CPG) geeignet ist.
Um das Verständnis der Erfindung zu fördern, werden verschiedene Ausdrücke unten definiert.
Der Ausdruck "Nucleinsäure" und "Oligonucleotid" bezieht sich auf Polydesoxyribonucleotide (die 2-Desoxy-D-ribose enthalten), auf Polyribonucleotide (die D-Ribose enthalten) und auf jede andere Art von Polynucleotid, das ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase oder modifizierten Purin- oder Pyrimidinbase ist. Es gibt keine gewollte Unterscheidung in der Länge zwischen den Ausdrücken "Nucleinsäure" und "Oligonucleotid" und diese Ausdrücke werden austauschbar verwendet. Diese Ausdrücke beziehen sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Somit schließen diese Ausdrücke doppel- und einzelsträngige DNA ebenso wie doppel- und einzelsträngige RNA ein.
Der Ausdruck "konventionell" oder "üblich" in Bezug auf Nucleinsäurebasen, Nucleotide oder Nucleotide bezieht sich auf solche, die natürlicherweise in dem beschriebenen Polynucleotid auftreten. Die vier konventionellen (auch als Haupt- bezeichnet) Desoxyribonucleotide von DNA enthalten die Purinbasen Adenin und Guanin und die Pyrimidinbasen Cytosin und Thymin. Die vier konventionellen Ribonucleotide von RNA enthalten die Purinbasen Adenin und Guanin und die Pyrimidinbasen Cytosin und Uracil. Zusätzlich zu den obigen konventionellen oder üblichen Basen treten eine Anzahl anderer Purin- und Pyrimidinderivate, die seltene oder unbedeutende Basen genannt werden, in kleinen Mengen in einigen Nucleinsäuren auf. Der Ausdruck "unkonventionell", wie er hier in Bezug auf Nucleinsäuresebasen, Nucleoside oder Nucleotide verwendet wird, bezieht sich auf seltene oder wenig vorkommende Nucleinsäurebasen, Nucleoside oder Nucleotide und Modifikationen, Derivate oder Analoga üblicher Basen, Nucleoside oder Nucleotide und schließt synthetische Nucleotide mit modifizierten Baseanteilen und/oder modifizierten Zuckereinheiten ein (siehe Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Methods in Molecular Biology, Bd. 26 (Sudhir Agrawal, Herausgeber, Humana Press, Totowa, NJ (1994)); und Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach (Fritz Eckstein, Herausgeber, IRL Press, Oxford University Press, Oxford).
Oligonucleotide können mit jeder geeigneten Methode hergestellt werden, einschließlich z. B. Klonen und Restriktion geeigneter Sequenzen und direkte chemische Synthese durch eine Methode, wie die Phosphotriestermethode von Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90–99; die Phosphodiestermethode von Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 109–151; die Diethylphosphoamididmethode von Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859–1862; und die Festphasenmethode von U.S.-Patent Nr. 4 458 066. Ein Überblick über Synthesemethoden wird in Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3): 165–187, gegeben.
Der Ausdruck "Basenpaarung", auch im Stand der Technik als "Watson-Crick-Basenpaarung" bezeichnet, bezieht sich auf die wohl bekannte Wasserstoffbindung der komplementären Basenpaare Adenin-Thymin und Guanin-Cytosin in einer doppelsträngigen DNA-Struktur, Adenin-Uracil und Guanin-Cytosin in einem RNA/DNA-Hybridmolekül und der analogen Bindung von unkonventionellen Nucleotidpaaren.
Der Ausdruck "Hybridisierung" bezieht sich auf die Bildung eines Doppelstrangs aus zwei einzelsträngigen Nucleinsäuren aufgrund komplementärer Basenpaarung. Eine Hybridisierung kann zwischen voll komplementären Nucleinsäuresträngen oder zwischen "im Wesentlichen komplementären" Nucleinsäuresträngen auftreten, die kleinere Bereiche von Fehlpaarungen enthalten. Bedingungen, unter denen nur vollständig komplementäre Nucleinsäurestränge hybridisieren, werden als "stringente Hybridisierungsbedingungen" oder "sequenzspezifische Hybridisierungsbedingungen" bezeichnet. Stabile Duplices oder Doppelstränge von im Wesentlichen komplementären Sequenzen können unter weniger stringenten Hybridisierungsbedingungen erzielt werden; der Grad an Fehlpaarungen, der toleriert wird, kann durch geeignete Einstellung der Hybridisierungsbedingungen kontrolliert werden. Der Fachmann auf dem Gebiet der Nucleinsäuretechnologie kann die Doppelstrangstabilität empirisch bestimmen unter Inbetrachtziehung einer Anzahl von Variablen, was z. B. Länge und Basenpaarkonzentration der Oligonucleotide, Ionenstärke und Auftreten von fehlgepaarten Basenpaaren nach den Leitlinien, die durch den Stand der Technik gegeben werden (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York und Wetmur, 1991, Critical Review in Biochem. und Mol. Biol. 26(3/4): 227–259).
Der Ausdruck "Primer" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das als Startpunkt der DNA-Synthese unter Bedingungen dienen kann, in denen die Synthese eines Primerextensionsproduktes, das komplementär zu einem Nucleinsäurestrang ist, induziert wird, d. h. in Gegenwart der vier verschiedenen Nucleosidtriphosphate und eines Mittels zur Extension (z. B. einer DNA-Polymerase oder reversen Transkriptase) in einem geeigneten Puffer und bei einer geeigneten Temperatur. Der Ausdruck "Primer", wie er hier verwendet wird, soll Oligonucleotide einschließen, die in ligationsvermittelten Amplifikationsprozessen verwendet werden, in denen ein Oligonucleotid "verlängert" wird durch Ligation an ein zweites Oligonucleotid, das an einer benachbarten Position hybridisiert. Somit bezieht sich der Ausdruck "Primerextension", wie er hier verwendet wird, sowohl auf die Polymerisation einzelner Nucleosidtriphosphate unter Verwendung der Primer als Startpunkt der DNA-Synthese, als auch auf die Ligation von zwei Primern unter Bildung eines verlängerten Produkts.
Ein Primer ist bevorzugt eine einzelsträngige DNA. Die geeignete Länge eines Primers hängt von der vorgesehenen Verwendung des Primers ab, liegt aber typischerweise in einem Bereich von 6 bis 50 Nucleotiden. Kurze Primermoleküle erfordern im Allgemeinen kühlere Temperaturen, um ausreichend stabile Hybridkomplexe mit der Matrize bzw. dem Templat zu bilden. Ein Primer muss nicht die genaue Sequenz der Matrizennucleinsäure widerspiegeln, muss aber ausreichend komplementär sein, um mit der Matrize zu hybridisieren. Der Aufbau geeigneter Primer für die Amplifikation einer gegebenen Zielsequenz ist im Stand der Technik wohl bekannt und wird in der hier zitierten Literatur beschrieben.
Primer können zusätzliche Merkmale aufweisen, die den Nachweis oder die Immobilisierung des Primers zulassen, aber die Grundeigenschaft des Primers, als Startpunkt der DNA-Synthese zu dienen, nicht verändern. Z. B. können Primer eine zusätzliche Nucleinsäuresequenz am 5'-Ende aufweisen, die nicht mit der Zielnucleinsäure hybridisiert, sondern das Klonieren des amplifizierten Produktes erleichtert. Der Bereich des Primers, der ausreichend komplementär zu der Matrize ist, um zu hybridisieren, wird hier als hybridisierende Region oder hybridisierender Bereich bezeichnet.
Die Ausdrücke "Ziel", "Zielsequenz", "Zielbereich" bzw. "Zielregion" und "Zielnucleinsäure" beziehen sich auf einen Bereich oder eine Untersequenz einer Nucleinsäure, die amplifiziert werden soll.
Ein Primer ist "spezifisch" für eine Zielsequenz, nach der hier angewendeten Ausdrucksweise, wenn die Anzahl der Fehlpaarungen zwischen Primersequenz und Zielsequenz geringer ist als die Anzahl der Fehlpaarungen zwischen Primersequenz und Nichtzielsequenzen, die in der Probe vorhanden sein können. Es können Hybridisierungsbedingungen ausgewählt werden, unter denen stabile Doppelstränge nur gebildet werden, wenn die Zahl der vorhandenen Fehlpaarungen nicht höher ist als die Anzahl der zwischen Primersequenz und Zielsequenz vorhandenen Fehlpaarungen. Unter solchen Bedingungen kann der Primer einen stabilen Doppelstrang nur mit einer Zielsequenz bilden. Somit ermöglicht die Verwendung von zielspezifischen Primern unter geeigneten stringenten Amplifikationsbedingungen die spezifische Amplifikation solcher Zielsequenzen, die die Zielprimerbindungsstellen enthalten. Die Verwendung von sequenzspezifischen Amplifikationsbedingungen ermöglicht die spezifische Amplifikation solcher Zielsequenzen, die die exakt komplementären Primerbindungsstellen aufweisen.
Der Ausdruck "nicht spezifische Amplifikation" bezieht sich auf die Amplifikation von anderen Nucleinsäuresequenzen als der Zielsequenz, was durch Primer, die mit anderen Sequenzen hybridisieren als der Zielsequenz und dann als Substrat für Primerextension dienen, entsteht. Die Hybridisierung eines Primers mit einer Nichtzielsequenz wird als "nicht spezifische Hybridisierung" bezeichnet und kann unter Präamplifikationsbedingungen von geringerer Temperatur und reduzierter Stringenz auftreten.
Der Ausdruck "Primerdimer" bezieht sich auf ein matrizenunabhängiges nicht spezifisches Amplifikationsprodukt, das durch Primerextensionen entsteht, wobei ein anderer Primer als Matrize dient. Obwohl ein Primerdimer häufig ein Konkatemer von zwei Primern zu sein scheint, d. h. ein Dimer, können auch Konkatemere von mehr als zwei Primern auftreten. Der Ausdruck "Primerdimer" wird hier allgemein verwendet, um matrizenunabhängige nicht spezifische Amplifikationsprodukte zu beschreiben.
Der Ausdruck "Reaktionsmischung" bezieht sich auf eine Lösung, die Reagenzien enthält, die notwendig sind, um eine gegebene Reaktion durchzuführen. Eine "Amplifikationsreaktionsmischung", die sich auf eine Lösung bezieht, die Reagenzien enthält, die notwendig sind, um eine Amplifikationsreaktion auszuführen, enthält typischerweise Oligonucleotidprimer und eine DNA-Polymerase oder Ligase in einem geeigneten Puffer. Eine "PCR-Reaktionsmischung" enthält typischerweise Oligonucleotidprimer, eine thermostabile DNA-Polymerase, dNTP's und ein zweiwertiges Metallkation in einem geeigneten Puffer. Eine Reaktionsmischung wird als vollständig bezeichnet, wenn sie alle Reagenzien enthält, die notwendig sind, um die Reaktion zu ermöglichen, und wird als unvollständig bezeichnet, wenn sie nur eine Untergruppe der notwendigen Reagenzien enthält. Es versteht sich für den Fachmann auf diesem Gebiet, dass Reaktionskomponenten routinemäßig als getrennte Lösungen aufbewahrt werden, die jeweils eine Untergruppe aller Komponenten enthalten, aus Gründen der Einfachheit, Lagerstabilität oder um eine anwendungsabhängige Einstellung der Komponentenkonzentrationen zuzulassen und dass Reaktionskomponenten vor der Reaktion kombiniert werden, um eine komplette Reaktionsmischung zu erzeugen. Weiterhin versteht es sich für den Fachmann auf diesem Gebiet, dass Reaktionskomponenten getrennt für die Kommerzialisierung verpackt werden und dass nützliche kommerzielle Kits jede Untergruppe der Reaktionskomponenten enthalten können, was die modifizierten Primer der Erfindung einschließt.
Modifizierte Primer
Die Amplifikationsprimer der Erfindung werden modifiziert durch kovalente Bindung einer Gruppe an eines der vier Nucleotide am 3'-terminalen Ende des Primers. In einer Ausführungsform besteht ein modifizierter Primer der Erfindung aus einer Nucleinsäuresequenz mit der allgemeinen Struktur
worin S₁ eine erste Sequenz von Nucleotiden mit einer Länge zwischen etwa 5 und etwa 50 bedeutet;
worin S₂ eine zweite Sequenz mit einer Länge zwischen 1 und 3 Nucleotiden bedeutet;
worin N ein Nucleotid bedeutet, das eine Purin- oder Pyrimidinbase enthält, die ein exocyclisches Amin aufweist;
worin R eine Modifikatorgruppe bedeutet, wobei R kovalent an N über das exocyclische Amin gebunden ist und wobei R die Struktur wie unten gezeigt hat.
Wie in den Beispielen gezeigt, wird die Wirkung der Modifikation maximiert, wenn die Modifikation am 3'-terminalen Nucleotid erfolgt. Somit enthält bevorzugt der Primer ein modifiziertes 3'-terminales Nucleotid.
Das modifizierte Nucleotid wird aus solchen ausgewählt, deren Base ein exocyclisches Amin enthält, das an der Basenpaarung des Nucleotids mit seinem komplementären Nucleotid beteiligt ist. Typischerweise sind Primer DNA, die nur konventionelle Nucleotide enthält. Von den vier konventionellen Nucleotidbasen, die in DNA gefunden werden, enthalten Adenin, Guanin und Cytosin ein exocyclisches primäres Amin, das an der Basenpaarung mit der komplementären Base beteiligt ist. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird der Primer modifiziert durch Bindung einer einzelnen Modifikatorgruppe an das exocyclische Amin, wobei eines der beiden Wasserstoffatome der Amingruppe substituiert wird, die, in der unmodifizierten Base, an der Basenpaarung beteiligt sein können. Die Strukturen der modifizierten Nucleotide, die eine modifizierte Adenin-, Guanin- bzw. Cytosinbase enthalten, sind unten gezeigt
worin S den Zuckeranteil bedeutet und R die Modifikatorgruppe bedeutet.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf Primer beschränkt, die aus üblichen bzw. konventionellen Nucleotiden bestehen. Jedes Nucleotidanalogon, bei dem der Basenanteil ein exocyclisches primäres Amin enthält, das an der Basenpaarung mit einer komplementären Base beteiligt ist, ist, wie hier beschrieben, modifizierbar. Bei spiele für unkonventionelle Nucleotide schließen 3-Methyladenin, 7-Methylguanin, 3-Methylguanin, 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin ein.
Die Modifikatorgruppe beschränkt die Fähigkeit der modifizierten Base, an der Wasserstoffbindung teilzunehmen, da der Modifikator ein Wasserstoffatom ersetzt. Das verbleibende Wasserstoffatom kann immer noch an der Wasserstoffbindung teilnehmen. Die Modifikatoren können daher sowohl die Kinetik als auch die Thermodynamik der Hybridisierung beeinflussen. Eine Mehrzahl von Modifikatorgruppen werden in Betracht gezogen, die die folgenden Eigenschaften besitzen:

1. Watson-Crick-Basenpaarung der modifizierten Base mit der komplementären Base, stören, ohne sie zu verhindern;
2. Stören der Extension des modifizierten Primers ohne sie zu verhindern und
3. die Synthese eines zu dem Extensionsprodukt des modifizierten Primers komplementären Strangs zulassen.

Die Modifikatorgruppe stört sterisch die Basenpaarung und daher die Primerextension. Somit beeinflusst die physikalische Größe des Modifikators den Interferenzgrad der Hybridisierung. Wenn ein modifiziertes Adenosin- oder Cytidinnucleotid in eine doppelsträngige Nucleinsäure eingebaut wird, ragt die Modifikatorgruppe in den zentralen Raum der großen Furche. Demzufolge sollten sogar relativ große Modifikatorgruppen wenig sterische Hinderung der Doppelstrangstruktur verursachen. Geeignete Modifikatoren sind jedoch nicht so groß, dass die Wasserstoffbindung verhindert wird oder eine enzymatische Extension des 3'-Hydroxyls des Primers verhindert wird. Wenn das modifizierte Guanosinnucleotid in eine doppelsträngige Nucleinsäure eingebaut wird, ragt die Modifikatorgruppe in die kleine Furche, die weniger Raum liefert, um die Masse der Modifikatorgruppe aufzunehmen. Demzufolge sind kleinere Modifikatorgruppen für die Bindung an eine Guaninbase bevorzugt.
Primerextensionsprodukte, die als Matrizen in nachfolgenden Amplifikationszyklen verwendet werden, enthalten die durch den Primer eingeführte modifizierte Base. Die Modifikatorgruppe wird so ausgewählt, dass die Gegenwart der modifizierten Base in der Matrize keine Beendigung der Primerextension oder Hemmung der Primerextension verursacht. Bevorzugt sollte die Art der Modifikatorgruppe nicht zu mutagenen Ereignissen führen, wodurch die Identität der modifizierten Base bei Replikation einer vom Primer abgeleiteten Matrize verloren geht. Die Wirkung der modifizierten Base in der Matrize auf die Primerextension kann routinemäßig getestet werden nach den Anleitungen, die hier und im Stand der Technik gegeben werden (siehe z. B. Gniazdowski und Cera, 1996, Chem. Rev. 96: 619–634).
Modifikatorgruppen R, die die obigen Eigenschaften erfüllen, sind zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Methoden geeignet. Bevorzugte Modifikatorgruppen haben die Struktur:
worin R₁ und R₂ unabhängig Wasserstoff, eine C₁-C₁₀-Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine Phenylgruppe, eine Phenoxygruppe, eine substituierte Phenylgruppe, eine Naphthylgruppe oder eine substituierte Naphthylgruppe bedeuten. Alkylgruppen können verzweigt oder linear sein. Größere Alkylgruppen, bis zu mindestens C₂₀, können auch verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist R eine 2-Naphthylmethylgruppe; eine Benzylgruppe oder eine substituierte Benzylgruppe. Bevorzugte substituierte Benzylgruppen haben die Struktur:
worin R₃ eine verzweigte oder lineare C₁-C₆-Alkylgruppe, bevorzugter verzweigte oder lineare C₁-C₄-Alkylgruppe, eine Methoxygruppe oder Nitrogruppe bedeutet. Eine verzweigte oder lineare C₁-C₄-Alkylgruppe ist Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isopropyl, Isobutyl, tert.-Butyl und dgl. Methyl und tert.-Butyl sind bevorzugte Alkylgruppen. Bevorzugt ist R₃ in para-Position gebunden.
Besonders bevorzugte Modifikatorgruppen R sind unten gezeigt:
Eine Anzahl von speziellen Modifikatorgruppen werden in den Beispielen beschrieben. Allgemein kann eine empirische Auswahl einer speziellen geeigneten Modifikatorgruppe aus der Klasse der beschriebenen Verbindungen routinemäßig von einem Fachmann auf diesem Gebiet nach den hier gegebenen Anleitungen durchgeführt werden. Bevorzugt wird die Eignung einer speziellen Gruppe empirisch bestimmt, indem die modifizierten Primer in einer Amplifikationsreaktion verwendet werden. Eine erfolgreiche Amplifikation zeigt sowohl, dass die modifizierte Base nicht vollständig die Primerextension hemmt, als auch, dass die Gegenwart der modifizierten Base in einer vom Primer abgeleiteten Matrize keine Beendigung der Primerextension verursacht. Die Reduktion des Primerdimers wird bestimmt, wie in den Beispielen beschrieben.
Primer mit einer fotolabilen Modifikation
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden Primer mit einer oder mehreren fotolabilen Gruppen modifiziert, die durch Bestrahlung mit Licht entfernt werden können nachdem die Reaktion die Hochtemperaturreaktionsbedingungen erreicht hat, die eine Spezifität sicherstellen. Da der Modifikator vor der Primer extension entfernt wird, muss der modifizierte Primer nicht vor der Entfernung der Gruppe verlängerbar sein. Beispiele für fotolabile Modifikatoren, die in den erfindugsgemäßen Methoden verwendet werden können, werden in Pillai, 1980, "Photoremovable Protecting Groups in Organic Synthesis", Synthesis: 1–26, beschrieben.
Bevorzugt werden die fotolabilen Primer der Erfindung am 3'-terminalen Nucleotid durch Bindung von einer oder zwei o-Nitrobenzylgruppen modifiziert:
In Primern, die durch Bindung einer einzelnen Nitrobenzylgruppe an das exocyclische primäre Amin eines Basenanteils modifiziert wurden, kann das entstehende sekundäre Amin immer noch an der Basenpaarung teilnehmen, wenn die Amingruppe so gedreht wird, dass der verbleibende Wasserstoff hin zu der komplementären Base orientiert ist. Wie in den Beispielen beschrieben, können diese Primer in einer Amplifikation entweder mit oder ohne Entfernung durch Bestrahlung mit UV-Licht verwendet werden.
Primer, die durch Bindung von zwei Nitrobenzylgruppen an das exocyclische Amin der Base modifiziert wurden, können nicht verlängert werden. Die Hemmung entsteht wahrscheinlich durch die Unfähigkeit der modifizierten Base, eine Basenpaarung auszuführen, was verhindert wird, da beide Wasserstoffe des exocytischen Amins durch sperrige Nitrobenzylgruppen ersetzt sind. Die Verwendung von mit zwei Nitrobenzylgruppen modifizierten Primern in einer Amplifikation, in der die Reaktionsmischung UV-Licht ausgesetzt wurde über einen Zeitraum, der ausreicht, um die Nitrobenzylgruppen zu entfernen, wodurch die Primerextension möglich wird, wird in den Beispielen beschrieben.
In einer alternativen Ausführungsform wird die Modifikatorgruppe an den Ringstickstoff gebunden. Primer, die durch Bindung einer Nitrobenzylgruppe an den Ringstickstoff der Base modifiziert sind, können nicht verlängert werden aufgrund der Unfähigkeit der modifizierten Base, eine Basenpaarung auszuführen. Die Entfernung der Nitrobenzylgruppen durch Belichtung mit UV-Licht lässt die Primerextension zu.
Die Verwendung von fotolabilen Primern, die nicht verlängert werden können, bis die Modifikatorgruppe entfernt ist, liefert im Wesentlichen eine "Heißstart"-Amplifikation. Die Primerextension wird während der nicht spezifischen Präreaktionsbedingungen gehemmt. Der Ansatz wird bestrahlt und die Primer werden erst deblockiert, nachdem die Reaktionstemperatur auf eine Temperatur gestiegen ist, die eine Reaktionsspezifität sicherstellt.
Synthese von modifizierten Primern
Die Synthese der modifizierten Primer wird ausgeführt unter Verwendung von im Stand der Technik wohl bekannten chemischen Standardmitteln. Methoden zur Einführung dieser Modifikatoren können in vier Klassen eingeteilt werden.

1. Der Modifikator kann eingeführt werden durch Verwendung eines modifizierten Nucleosids als DNA-Synthese-Träger.
2. Der Modifikator kann eingeführt werden durch Verwendung eines modifizierten Nucleosids als Phosphoramidit.
3. Der Modifikator kann eingeführt werden durch Verwendung eines Reagenzes während der DNA-Synthese (z. B. Benzylaminbehandlung eines umwandelbaren Amidits, wenn es in eine DNA-Sequenz eingebaut wird).
4. Postsynthetische Modifikation. Der Modifikator kann als reaktives Reagenz eingeführt werden, wenn er mit synthetischer DNA in Kontakt kommt.

Die Synthese der speziell modifizierten Primer wird in den Beispielen beschrieben. Zusätzliche modifizierte Primer können synthetisiert werden unter Verwendung von Standardsynthesemethoden in analoger Weise.
Bevorzugt werden modifizierte Primer synthetisiert unter Verwendung eines derivatisierten Glases mit kontrollierten Poren (CPG) als Syntheseträger. Ein allgemeines Reaktionsschema für die Synthese von derivatisiertem dA CPG ist in 6 gezeigt. Spezielle Modifikatorgruppen können zugefügt werden durch Verwendung des geeigneten Alkylhalogenids, Benzylhalogenids, substitiuierten Benzylhalogenids, Methylnaphthylhalogenids oder substituierten Methylnaphthylhalogenids als Alkylierungsmittel. Die Synthesen der Benzyl- und p-tert.-Butylbenzyl-dA-CPGs, die in den Beispielen 1 und 2 beschrieben werden, folgen dem in 6 gezeigten Schema.
Die Alkylierung der exocyclischen Aminogruppe kann unter Verwendung von Methoden durchgeführt werden, die analog sind der von Griffin und Reese, 1963, in Biochim. Acta 68: 185–192 beschriebenen Methylierung. Zusätzliche Synthesemethoden werden von Aritoma et al., 1995, in J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1.: 1837–1849 beschrieben.
Amplifikationen unter Verwendung von modifizierten Primern
Die erfindungsgemäßen Methoden beinhalten, dass eine auf Primer basierende Amplifikation unter Verwendung der modifizierten Primer der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird. Allgemein können die modifizierten Primer unmodifizierte Primer ersetzen, die die gleiche Nucleotidsequenz besitzen in einer auf Primer basierenden Amplifikation ohne Veränderung der Amplifikationsreaktionsbedingungen. Natürlich erkennt der Fachmann auf diesem Gebiet, dass eine geringe Routinereoptimierung der Reaktionsbedingungen bei einigen Reaktionen nützlich sein kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die modifizierten Primer der vorliegenden Erfindung in der Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet. Die Erfindung ist jedoch nicht auf irgendein spezielles Amplifikationssystem beschränkt. Die modifizierten Primer der vorliegenden Erfindung können in jedem auf Primer basierenden Amplifikationssystem verwendet werden, in dem Primerdimere oder nicht spezifische Amplifikationsprodukte gebildet werden können. Beispiele schließen die in den oben zitierten Literaturstellen beschriebenen Amplifikationsmethoden ein. Wenn andere Systeme entwickelt werden, können diese Systeme auch von der Praxis dieser Erfindung profitieren.
Die Methoden der vorliegenden Erfindung sind geeignet für die Amplifikation sowohl von DNA als auch RNA. Z. B. ist die Amplifikation von RNA unter Verwendung einer Reverse Transkription/Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) im Stand der Technik wohl bekannt und wird in den U.S.-Patenten Nr. 5 322 770 und 5 310 652, Myers und Gelfand, 1991, Biochemistry 30(31): 7661–7666, Young et al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4): 882–886 und Mulder et al., 1994, J. Clin. Microbiol. 32(2): 292–300, beschrieben.
In einer auf Primer basierenden Amplifikation wird die Primerextension typischerweise bei erhöhter Temperatur unter Verwendung eines thermostabilen Enzyms, wie thermostabiler DNA-Polymerase ausgeführt. Das Enzym startet die Synthese am 3'-Ende des Primers und fährt in Richtung hin zum 5'-Ende der Matrize fort, bis die Synthese endet. Gereinigte thermostabile DNA-Polymerasen, die für Amplifikationsreaktionen geeignet sind, sind im Stand der Technik wohl bekannt und schließen die Enzyme ein, die in U.S.-Patent Nr. 4 889 818, U.S.-Patent Nr. 5 079 352; U.S.-Patent Nr. 5 352 600; U.S.-Patent Nr. 5 491 086; WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200; WO 92/06202 und U.S.-Patent Nr. 5 210 036 beschrieben werden, ohne darauf beschränkt zu sein. Ein Überblick über thermostabile DNA-Polymerasen findet sich in Abramson, 1995, in PCR Strategies (Herausgeber M. A. Innis et al.), Seiten 39–57, Academic Press, San Diego.
In einer bevorzugten Ausführungsform, insbesondere zur Amplifikation von DNA, wird die Amplifikation unter Verwendung eines reversibel inaktivierten Enzyms durchgeführt, wie beschrieben. Die Verwendung eines reversibel inaktivierten Enzyms, das unter den Reaktionsbedingungen bei hoher Temperatur reaktiviert wird. reduziert weiter die unspezifische Amplifikation, indem die Primerextension vor dem Start der Reaktion gehemmt wird. Eine reversibel inaktivierte thermostabile DNA-Polymerase, die von Hoffmann-La Roche entwickelt und hergestellt wird (Nutley, NJ) und von Perkin Elmer (Norwalk, CT) vertrieben wird, wird bei Birch et al., 1996, Nature 381(6581): 445446, beschrieben.
Die Wirkung der Modifikatorgruppe auf die Fähigkeit des Enzyms, den Primer zu verlängern, hängt teilweise von dem speziell verwendeten Enzym und teilweise von den ausgewählten Reaktionsbedingungen ab. Z. B. ist Tth-DNA-Polymerase permissiver, wenn Mn²⁺ statt Mg²⁺ als zweiwertiges Kation verwendet wird, wie bei einigen RNA-Amplifikationen. Der Fachmann erkennt, dass bei der Routineauswahl einer geeigneten Modifikatorgruppe das Enzym und die Reaktionsbedingungen in Betracht gezogen werden.
Methoden zur Probenvorbereitung, die für Amplifikationsreaktionen geeignet sind, sind im Stand der Technik wohl bekannt und in der hier zitierten Literatur vollständig beschrieben. Die jeweilige verwendete Methode ist nicht ein kritischer Teil der vorliegenden Erfindung. Der Fachmann kann Reaktionsbedingungen zur Verwendung für bekannte Probenvorbereitungsmethoden optimieren.
Methoden, um amplifizierte Nucleinsäuren zu analysieren, sind im Stand der Technik wohl bekannt und in der hier zitierten Literatur vollständig beschrieben. Die jeweils verwendete Methode ist kein kritischer Teil der vorliegenden Erfindung. Der Fachmann kann eine geeignete Analysemethode abhängig von der Anwendung auswählen.
Eine bevorzugte Methode, um eine Amplifikationsreaktion zu analysieren, besteht in der Überwachung des Anstiegs der Gesamtmenge an doppelsträngiger DNA in der Reaktionsmischung, wie von Higuchi et al. 1992 in Bio/Technology 10: 413–417; Higuchi et al., 1993, Bio/Technology 11: 1026–1030; in den Europäischen Patentschriften Nr. 512 334 und 640 828 beschrieben. Bei dieser Methode, die hier als "kinetische PCR" bezeichnet wird, beruht der Nachweis von doppelsträngiger DNA auf der erhöhten Fluoreszenz, die Ethidiumbromid (EtBr) und andere DNA bindende Markierungen aufweisen, wenn sie an doppelsträngige DNA gebunden sind. Die Amplifikation wird in Gegenwart der Markierung ausgeführt. Der Anstieg an doppelsträngiger DNA, der durch die Synthese der Zielsequenzen entsteht, führt zu einem nachweisbaren Anstieg der Fluoreszenz, der während der Amplifikation überwacht wird. Somit ermöglichen die Methoden die Überwachung des Fortschreitens einer Amplifikationsreaktion.
Bei einer kinetischen PCR hängt die gemessene Fluoreszenz von der Gesamtmenge an doppelsträngiger DNA, die vorhanden ist, ab, unabhängig davon, ob sie aus unspezifischer Amplifikation oder Amplifikation der Zielsequenz entsteht. Die Überwachung der Fluoreszenz lässt die Messung des Anstiegs der Gesamtmenge an doppelsträngiger DNA zu, aber der Anstieg, der durch Amplifikation der Zielsequenz entsteht, wird nicht unabhängig von Anstieg, der durch nicht spezifische Amplifikationsprodukte entsteht, gemessen. Die modifizierten Primer der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich für die kinetische PCR, da sie nicht nur die Menge an gebildetem Primerdimer vermindern, sondern auch die Bildung von nachweisbaren Mengen an Primerdimer verzögern. Eine Verzögerung der Primerdimerbildung bis ein signifikanter Anstieg der Zielsequenz erfolgt ist, ermöglicht die unabhängige Überwachung der Amplifikation von Zielsequenzen und minimiert die Störung durch Primerdimer.
Kits
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Kits, Mehrbehältereinheiten, die nützliche Komponenten zur Durchführung der vorliegenden Methode aufweisen. Ein nützlicher Kit enthält Primer, von denen mindestens einer wie hier beschrieben modifiziert ist, für die Nucleinsäureamplifikation. Andere fakultative Komponenten des Kits schließen z. B. ein Mittel, um die Synthese von Primerextensionsprodukten zu katalysieren, die Substratnucleosidtriphosphate, geeignete Reaktionspuffer und Anleitungen zur Durchführung der vorliegenden Methode ein.
Die Beispiele der vorliegenden Erfindung, die unten angegeben sind, dienen nur der Erläuterung und sollen den Schutzbereich der Erfindung nicht beschränken. Zahlreiche Ausführungsformen der Erfindung innerhalb des Schutzbereichs der Ansprüche, die folgen, ergeben sich für den Fachmann auf diesem Gebiet durch Lesen des vorhergehenden Textes und der folgenden Beispiele.
Beispiel 1
Synthese von mit einer Benzylgruppe modifizierten Primern
Primer, die durch Zufügung der Benzylgruppe modifiziert wurden, wurden mit einem von zwei unten beschriebenen Prozessen synthetisiert. Primer, die an der 3'-terminalen Base modifiziert waren, wurden synthetisiert unter Verwendung von N⁶-Benzyldesoxyadenosin-kontrolliertes Porenglas (CPG), um die DNA-Synthese zu starten. Primer, die an einer inneren Base modifiziert waren, wurden synthetisiert unter Verwendung von N⁶-Benzyldesoxyadenosinphosphoamdit.

Die folgenden Standardabkürzungen werden in dem Beispiel verwendet:

DMAP	4-Dimethylaminopyridin
DMF	N,N-Dimethylformamid
TEA	Triethylamin
EDC	1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid
THF	Tetrahydrofuran
DMT	4,4'-Dimethoxytrityl
LCAA-CPG	Kontrolliertes Porenglas mit langkettigem Alkylamino

I. Synthese von N⁶-Benzyldesoxyadenosin-CPG
Stufe 1: Synthese von N⁶-Benzoyl,N⁶-benzyl,5'-O-DMT-2'-desoxyadenosin
Zu N⁶-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyadenosin (657 mg, 1,0 mmol; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) wurde Pyridin (10 ml) zugegeben und die Mischung durch Verdampfen im Vakuum getrocknet. Dies wurde wiederholt. Der entstehende Schaum wurde in wasserfreiem DMF (15 ml; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) gelöst und auf 5°C gekühlt. Natriumhydrid (44 mg, 1,1 mmol, 1,1 Äquivalente, 60% Dispersion in Öl) wurde unter Argonatmosphäre zugegeben und bei Raumtemperatur 45 Minuten lang gerührt. Benzylbromid (143 μl, 206 mg, 1,2 mmol, 1,2 Äquivalente; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) wurde 2 Minuten lang zugegeben und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde durch Verdampfen im Vakuum getrocknet und der Rückstand zwischen Ethylacetat und Wasser (jeweils 10 ml) aufgetrennt und extrahiert. Die wässrige Phase wurde wieder mit Ethylacetat (10 ml) extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das rohe Produkt wurde mit Säulenchromatographie auf Silicagel (75 g) unter Verwendung von Methanol, Triethylamin, Methylenchlorid (3 : 0,5 : 96,5) gereinigt. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden vereinigt und durch Verdampfen getrocknet, was das erwartete N⁶-Benzoyl,N⁶-benzyl,5'-O-DMT-2'-desoxyadenosin (410 mg, 54%) ergab. Die Struktur des Produktes wurde durch NMR bestätigt.
Stufe 2: Succinylierung
Zu dem N⁶-Benzoyl,N⁶-benzyl,5'-O-DMT-2'-desoxyadenosin (295 mg, 0,39 mmol) wurde Pyridin (10 ml) zugegeben und die Mischung durch Verdampfen im Hochvakuum getrocknet. Diese Stufe wurde wiederholt. Frisches wasserfreies Pyridin (10 ml) wurde zusammen mit Bernsteinsäureanhydrid (200 mg, 2 mmol, 5,0 Äquivalente) und DMAP (24 mg) zugegeben und die Lösung unter Argonatmosphäre über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Masse des Lösungsmittels wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand zwischen Methylenchlorid (20 ml) und Natriumcitratlösung (20 ml, 0,1 M, pH 5,0) aufgetrennt und extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit mehr Methylenchlorid (20 ml) extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und durch Verdampfen getrocknet. Das Produkt wurde mit Säulenchromatographie auf Silicagel (4,5 g) unter Verwendung von Ethylacetat, Triethylamin, Methylenchlorid (32 : 1 : 67) gereinigt, was den erwarteten 3'-Succinatester, N⁶-Benzoyl-N⁶-benzyl-3'-O-succinat-5'-O-DMT-2'-desoxyadenosin (247 mg, 74%) ergab.
Stufe 3: Derivatisierug von CPG
Mit Säure gewaschenes CPG wurde wie folgt hergestellt. LCAA-CPG (1,0 g, LCA00500C, 500 Å., 88,6 (Mol/g; CPG Inc., Fairfield, NJ) wurde mit Dichloressigsäure in Dichlormethan (2%, 20 ml) gewaschen, indem 20 Minuten lang bei Raumtemperatur periodisch verwirbelt wurde. Das mit Säure gewaschene CPG wurde auf einer Glasfritte filtriert und mit Dichlormethan gewaschen, bis es säurefrei war. Das Pulver wurde an der Luft getrocknet und dann im Vakuum bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet.
Das Kuppeln des modifizierten Nucleosidzwischenproduktes an das mit Säure gewaschene CPG wurde wie folgt durchgeführt. Zu einer Lösung von N⁶-Benzoyl-N⁶-benzyl-3'-O-succinat-5'-O-DMT-2'-desoxyadenosin (170 mg, 0,2 mmol), das wie oben beschrieben hergestellt wurde, in Dichlormethan (10 ml) wurde TEA (100 μl) zugegeben und die Lösung auf ungefähr 5 ml unter Argonatmosphäre eingeengt. DMAP (12 mg, 0,1 mmol, 0,5 Äquivalente), TEA (100 μl), EDC (384 mg, 2,0 mmol, 10 Äquivalente) und mit Säure gewaschenes CPG von oben wurden in dieser Reihenfolge zugegeben. Wasserfreies Pyridin (5 ml) wurde zugegeben und die Mischung verschlossen und 3 Tage bei Raumtemperatur geschüttelt. Das CPG wurde im Vakuum abfiltriert und intensiv mit Isopropanol und dann mit Dichlormethan gewaschen, an der Luft getrocknet und dann im Vakuum 1 Stunde lang getrocknet.
Das Verkappen des derivatisierten CPGs wurde wie folgt ausgeführt. Zu dem trockenen derivatisierten CPG wurden Cap-A- und Cap-B-Lösungen (jeweils 5 ml, Essigsäureanhydrid/2,6-Lutidin/THF und 10% N-Methylimidazol in THF; Glen Research DNA Synthesereagenzien, Sterling, VA) zugegeben und die Mischung 4 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Das CPG wurde im Vakuum abfiltriert und intensiv mit Isopropanol und dann mit Dichlormethan gewaschen, an der Luft getrocknet und dann im Vakuum über Nacht getrocknet.
II. Synthese von N⁶-Benzyldesoxyadenosinphosphoramidit
N⁶-Benzoyl,N⁶-benzyl,5'-O-DMT-2'-desoxyadenosin wurde wie oben beschrieben synthetisiert.
Zu N⁶-Benzoyl,N⁶-benzyl,5'-O-DMT-2'-desoxyadenosin (196 mg, 0,26 mmol) in trockenem THF (8 ml) wurde Diisopropylethylamin (350 μl, 270 mg, 2,04 mmol, 7,8 Äquivalente) und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit (161 mg, 0,68 mmol, 2,6 Äquivalente; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) zugegeben und die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand zwischen Natriumbicarbonatlösung (5%, 20 ml) und Ethylacetat (20 ml) aufgetrennt. Die organische Phase wurde mit Bicarbonatlösung, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung (jeweils 20 ml) in dieser Reihenfolge gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde mit Säulenchromatographie auf Silicagel (4 g) unter Verwendung von Aceton/Hexan/TEA (34 : 65 : 0,7) gereinigt, was das gewünschte Phosphoramidit (248 mg, 100%) lieferte.
III. DNA-Synthese, Reinigung und Analyse
Das mit Benzyl derivatisierte Adenosin-CPG (25 mg, 1,0 Mol) wurde in leere Synthesesäulen (Glen Research, Sterling, VA) überführt und diese wurden verwendet, um Oligonucleotide auf einem ABI-374-DNA-Syntheseautomaten (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) unter Verwendung der üblichen Synthese- und Abspaltungsbedingungen herzustellen. Die rohe DMT-DNA wurde gereinigt und in 5'-Hydroxy-DNA umgewandelt mit Standard-DMT On/Off-HPLC unter Verwendung einer Rainin-Pure-DNA-Säule in einem Rainin-HPLC-System (Rainin Instrument Co., Woburn, MA). Die Oligonucleotide wurden unter Verwendung eines ABI-Kapillarelektrophoresesystems (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) oder durch denaturierende Anionenaustausch-HPLC-Chromatographie auf einer Dionex-Nucleopak-Säule (Dionex Corp., Sunnyvale, CA) analysiert.
In gleicher Weise wurde die Synthese von intern modifizierten Primern durchgeführt unter Verwendung von unmodifiziertem CPG und dem wie oben synthetisierten modifizierten Phosphoramidit.
Beispiel 2
Synthese von Primern die mit einer t-Butylbenzylgruppe modifiziert sind
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von Primern, die am 3'-terminalen Adenosin mit einer p-tert.-Butylbenzylgruppe modifiziert sind. Die modifizierten Primer wurden synthetisiert, im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei aber N⁶-(p-tert.-Butylbenzyl)desoxyadenosin-CPG verwendet wurde. Die Synthese des derivatisierten CPG ist unten beschrieben.
Stufe 1: Synthese von N⁶-Benzoyl-N⁶-(p-tert.-butylbenzyl)-5'-O-(4 4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyadenosin
Zu N⁶-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyadenosin (658 mg, 1,0 mmol) wurde DMF (wasserfrei, 10 ml) zugegeben und zur Trockene eingedampft. Dies wurde wiederholt. Frisches DMF (10 ml) wurde unter Argonatmosphäre zugegeben. Natriumhydrid (44 mg, 60% in Öl, 1,1 mmol) wurde zugegeben und die Mischung 0,5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. 4-(tert.-Butyl)benzylbromid (272 mg, 1,2 mmol) wurde tropfenweise zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand zwischen Ethylacetat und Wasser (jeweils 20 ml) aufgetrennt. Die organische Phase wurde mit Wasser (dreimal, 20 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockene eingeengt. Das rohe Produkt wurde mit Säulenchromatographie auf Silicagel (100 g) gereinigt unter Verwendung von Methylenchlorid : Methanol : Triethylamin 96,5 : 3 : 0,5, was N⁶-Benzoyl-N⁶-(p-tert.-butylbenzyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyadenosin (229 mg, 28,5%) lieferte.
Stufe 2: Succinylierung
N⁶-Benzoyl-N⁶-(p-tert.-butylbenzyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyadenosin (217 mg, 0,27 mmol) wurde mit Bernsteinsäureanhydrid (135 mg, 5 Äquivalente) und DMAP (17 mg, 0,5 Äquivalente) in Pyridin (10 ml) versetzt. Die Aufarbeitung und Chromatographie, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, lieferte N⁶-Benzoyl-N⁶-(p-tert.-butylbenzyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyadenosin-3'-O-succinat (199 mg, 82%).
Stufe 3: Derivatisierung von CPG
Das Succinat (180 mg, 0,2 mmol) von Stufe 2 oben wurde mit mit Säure gewaschenem LCAA-CPG, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Das CPG wurde verkappt und im Vakuum getrocknet, was N⁶-Benzoyl-N⁶-(p-tert.-butylbenzyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyadenosin,3'-O-succinat-derivatisiertes CPG lieferte (1,065 g).
Beispiel 3
Synthese von mit einer Methylgruppe modifizierten Primern
Primer, die am 3'-terminalen Adenosin mit einer Methylgruppe modifiziert waren, wurden unter Verwendung von N⁶-Methyl-dA-CPG (22 mg, 1 μmol, Glen Research, Sterling, VA) synthetisiert. Das N⁶-Methyl-dA-CPG wurde in eine leere Synthesesäule gegeben und die Primer wurden hergestellt unter Standardbedingungen in Bezug auf Synthese und Abspaltung der Schutzgruppen. Die Primer wurden gereinigt unter Verwendung des DMT On/Off-HPLC-Verfahrens, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 4
Synthese von fotolabil modifizierten Primern
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von Primern, die am 3'-terminalen Adenosin entweder mit einer oder mit zwei Nitrobenzylgruppen synthetisiert werden. Die modifizierten Primer wurden synthetisiert im Wesentlichen, wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei entweder ein Mononitrobenzyl-dA-CPG oder Bisnitrobenzyl-dA-CPG verwendet wurde.
I. Mononitrobenzylierte Primer
Die allgemeine Methode zur Synthese von mit N⁶-Benzoyl-N⁶-benzyl-2'-desoxyadenosin-derivatisiertem CPG (siehe Beispiel 1) wurde angewendet auf die Synthese von N⁶-Benzoyl-N⁶-ortho-nitrobenzyl-2'-desoxyadenosin-derivatisiertem CPG, in dem ortho-Nitrobenzylbromid das Alkylierungsmittel ersetzte. Die nachfolgenden Stufen für das CPG waren identisch mit den in Beispiel 1 beschriebenen mit der Zufügung, dass die Zwischenprodukte vor Umgebungslicht geschützt wurden, indem die Reaktionskolben mit Aluminiumfolie umhüllt wurden.
Nach der Synthese des derivatisierten CPGs wurden die Primer synthetisiert wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden aber mit Festphasenextraktion unter Verwendung von Nensorb Prep Wegwerfsäulen (NEN Research Products Biotechnology Systems, Du Pont Co., Boston, MA) isoliert unter Verwendung der vom Hersteller beschriebenen Protokolle.
II. Bisnitrobenzylierte Primer
Bisnitrobenzyldesoxyadenosin-CPG wurde synthetisiert, wie unten beschrieben. Nach Synthese des derivatisierten CPGs wurden die Primer synthetisiert und gereinigt, wie für die Mononitrobenzylprimer beschrieben.
Stufe 1: Synthese von 5'-O-DMT-N⁶-Bis-ortho-nitrobenzyl-2'-desoxyadenosin
2'-Desoxyadenosinmonohydrat (538 mg, 2,0 mmol, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) wurde getrocknet durch Verdampfung mit wasserfreiem Pyridin (zweifach, 10 ml) unter Vakuum. Der Rückstand wurde in wasserfreiem DMF (10 ml, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) unter Argonatmosphäre gelöst und Natriumhydrid (88 mg, 2,2 mmol, 1,1 Äquivalente, 60% Dispersion in Öl) zugegeben und 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. 2-Nitrobenzylbromid (710 mg, 3,3 mmol, 1,5 Äquivalente) wurde zugegeben und die Lösung 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das DMF wurde durch Verdampfen im Vakuum entfernt und der Rück stand zwischen Ethylacetat und Wasser (jeweils 20 ml) aufgetrennt. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (20 ml) extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser (20 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das rohe Produkt wurde mit Säulenchromatographie auf Silicagel (50 g unter Verwendung von 3% MeOH in CH₂Cl₂) gereinigt, was 2'-Desoxy-N⁶-bis-ortho-nitrobenzyladenosin (320 mg, 30%) lieferte.
Zu 2'-Desoxy-N⁶-bis-ortho-nitrobenzyladenosin (200 mg, 0,518 mmol) wurde wasserfreies Pyridin (10 ml) zugegeben und zur Trockene eingeengt. Pyridin (10 ml) wurde zugegeben und anschließend 4-4'-Dimethoxytritylchlorid (900 mg, 2,3 mmol, 4,5 Äquivalente) und Triethylamin (280 mg, 2,76 mmol, 4,0 Äquivalente) und bei Raumtemperatur 5 Stunden lang unter Argonatmosphäre gerührt. Wasser (0,5 ml) wurde zugegeben und 20 Minuten lang gerührt. Die Mischung wurde zwischen Ether und Wasser (jeweils 20 ml) aufgetrennt und die wässrige Phase wieder mit Ether (20 ml) extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und mit Wasser (20 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das Material wurde mit Chromatographie auf Silicagel (4 g unter Verwendung von 0,7 bis 2,5% Methanol in Methylenchlorid) gereinigt, was 5'-O-DMT-N⁶-Bis-ortho-nitrobenzyl-2'-desoxyadenosin (121 mg, 33%) lieferte.
Stufe 2: Succinylierung
5'-O-DMT-N⁶-Bis-ortho-nitrobenzyl-2'-desoxyadenosin (121 mg, 0,145 mmol) wurde durch Verdampfen mit wasserfreiem Pyridin (zweimal, 3 ml) getrocknet. Pyridin (3 ml), Bernsteinsäureanhydrid (58 mg, 0,58 mmol, 4 Äquivalente) und DMAP (11 mg, katalytisch) wurden zugegeben und die Lösung bei Raumtemperatur 3 Tage lang gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum eingedampft und der Rückstand zwischen Methylenchlorid (10 ml) und Natriumcitratpuffer (0,1 M, pH 5,0, 10 ml) aufgetrennt. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockene eingedampft. Das rohe Produkt wurde mit Chromatographie auf Silicagel (2 g unter Verwendung von EtOAc : CH₂Cl₂ : TEA, 32 : 67 : 1, 10 ml, dann MeOH : CH₂Cl₂ 3 : 97, 25 ml) gereinigt, was einen gelben Schaum, 5'-O-DMT-N⁶-Bis-ortho-nitrobenzyl-2'-desoxyadenosin-2'-O-succinat (138 mg, 99,5%), lieferte.
Stufe 3: Derivatisierung von CPG
Mit Säure gewaschenes LCAA-CPG wurde hergestellt wie in Beispiel 1.
Die Kupplung des modifizierten Nucleosidzwischenprodukts an mit Säure gewaschenes CPG wurde wie folgt durchgeführt. 5'-O-DMT-N⁶-Bis-ortho-nitrobenzyl-2'-desoxyadenosin-3'-O-succinat (37 mg, 0,04 mmol) wurde mit TEA (16 μl) in einem bernsteinfarben gefärbten Glasfläschchen behandelt und eingedampft. Zu diesem Rückstand wurde wasserfreies Pyridin (1,5 ml), TEA (2 μl), DMAP (2,4 mg), EDC (76 mg, 0,04 mmol) und mit Säure gewaschenes LCAA-CPG (200 mg) zugegeben und die Mischung auf einem Orbitalmischer 3 Tage lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Das CPG wurde bei vermindertem Druck abfiltriert und intensiv mit Isopropanol und dann mit Methylenchlorid gewaschen, an der Luft getrocknet, dann im Vakuum 1 Stunde lang getrocknet.
Das Verkappen des derivatisierten CPGs wurde durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 5
Amplifikationen unter Verwendung modifizierter Primer – Wirkung der Position des modifizierten Nucleotids
Um die Wirkung der modifizierten Primer auf die Bildung von Primerdimeren zu demonstrieren, wurden Vergleichsversuche durchgeführt bei Amplifikationen von HIV-1-RNA unter Verwendung sowohl von modifizierten Primern als auch unmodifizierten Primern. Um außerdem die Wirkung der Position des modifizierten Nucleotids auf die Reduktion des Primerdimers zu beurteilen, wurden Amplifikationen durchgeführt unter Verwendung von drei verschiedenen stromaufwärts modifizierten Primern, die sich nur durch den Ort der modifizierten Base unterschieden.
Zielnucleinsäure
HIV-1-RNA-Matrizen wurden synthetisiert unter Verwendung eines HIV-1-RNA-Transkriptionsvektors, im Wesentlichen wie bei Mulder et al., 1994, J. Clin. Microbiol. 32(2): 292–300, beschrieben.
Primer
Amplifikationen wurden durchgeführt sowohl mit unmodifizierten als auch mit modifizierten Primern. Die Nucleotidsequenzen der unmodifizierten Primer sind unten gezeigt, orientiert in 5'- zu 3'-Richtung. Stromaufwärtsprimer RAR1032MB (SEQ ID Nr. 1) und Stromabwärtsprimer RAR1033MB (SEQ ID Nr. 2) amplifizieren ein 175-Basenpaar-Produkt entsprechend den Nucleotidpositionen 2956 bis 3130 der Sequenz des HIV-1-Referenzstamms HXB2 (Genbank Zugangsnr. K03455).
HIV-1-Amplifikationsprimer
Die obigen Primerbezeichnungen beziehen sich auf die unmodifizierten Primer. Unmodifizierte Primer wurden am 5'-Ende biotinyliert. Modifizierte Primer wurden wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert, die aus denselben Nucleotidsequenzen bestanden, wie die unmodifizierten Primer, aber ein benzyliertes Adenosin entweder an 3'-terminaler Position oder an einer Position 1 oder 3 Nucleotide stromaufwärts des 3'-Endes enthielten. Die modifizierten Formen der Primer sind im Folgenden angegeben:
Modifizierte HIV-1-Amplifikationsprimer
Amplifikation
Amplifikationen wurden durchgeführt in 100-μl-Ansätzen, die die folgenden Reagenzien enthielten:
100 Kopien HIV-Matrizen-RNA
50 mM Tricin (pH 8,33)
110 mM KOAc,
jeweils 300 μM dATP, dCTP und dGTP
50 μM dTTP
500 μM dUTP
50 μM von jedem Primer
3,5 mM Mn(OAc)₂
13% Glycerin
20 Einheiten Z05-DNA-Polymerase und
2,5 Einheiten UNG.

Amplifikationstemperaturzyklen wurden durchgeführt in einem TC480-DNA-Thermocycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT) unter Verwendung des folgenden Temperaturprofils:

Präreaktionsinkubation:	4 min lang 45°C;
Reverse Transkription:	20 min lang 60°C;
46 Zyklen:	Denaturieren 45 s bei 94°C, Vereinigen (Annealing)/Verlängern 45 s bei 60°C;
Letzte Extension:	7 min bei 60°C;
Nachreaktion:	10°C bis Analyse (kurze Zeit).

Nachweis des amplifizierten Produkts
Die Gegenwart des amplifizierten Produkts wurde mit Gelelektrophorese wie folgt nachgewiesen. Reaktionsprodukte wurden unter Verwendung von Agarosegel (100 ml 3% NuSieve und 0,5% SeaChem) fraktioniert und 1 × TBE (0,089 M Tris, 0,089 M Borsäure, 0,0025 M Dinatrium-EDTA) wurde als Laufpuffer verwendet.
Ethidiumbromid (0,5 μg/ml) wurde zugegeben, um jegliche vorhandene DNA zu färben. Die Elektrophorese wurde ungefähr 1 Stunde lang mit 100 V ausgeführt. Die mit Ethidiumbromid angefärbten Banden von DNA wurden unter Verwendung von UV-Strahlung sichtbar gemacht.
Ergebnisse
Die Ergebnisse der gelelektrophoretischen Analyse sind in 1 zu sehen. Die Ziffern der Bahnen entsprechen jeweils den Amplifikationen unter Verwendung von Kombinationen von unmodifizierten und modifizierten Primern, wie in der Tabelle unten gezeigt. Die Banden, die dem vorgesehenen HIV-Produkt entsprechen, sind in der Figur durch einen Pfeil gezeigt. Die anderen Banden in dem Gel entsprechen unspezifischen Amplifikationsprodukten und insbesondere Primerdimer.
Da die Bildung von Primerdimer mit der Bildung des vorgesehenen Amplifikationsproduktes konkurriert, führt eine Reduktion an Primerdimer typischerweise zu einem gleichzeitigen Anstieg der Menge an vorgesehenem gebildeten Produkt. Somit ist die Wirkung der modifizierten Primer zu sehen, indem die Menge an gebildetem Primerdimer mit der unter Verwendung unmodifizierter Primer gebildeten Menge verglichen wird und durch Vergleich der Menge an vorgesehener Zielsequenz mit der Menge, die unter Verwendung unmodifizierter Primer gebildet wird.
Ein Vergleich der Ergebnisse unter Verwendung von zwei unmodifizierten Primern (Bahn 1) mit den Ergebnissen unter Verwendung eines einfach 3'-modifizierten Primers (Bahnen 2 und 5) und mit den Ergebnissen unter Verwendung von zwei 3'-modifizierten Primern (Bahn 6) zeigt, dass eine Abnahme an Primerdimer erhalten wurde bei Verwendung entweder von einem oder von zwei modifizierten Primern. Bei Amplifikationen unter Verwendung eines einzigen 3'-modifizierten Primers war eine kleine Differenz bei der Reduktion an Primerdimer zu sehen, die davon abhing, welcher Primer modifiziert war. Die Verwendung von zwei modifizierten Primern (Bahn 6) führte sowohl zur größten Verringerung an Primerdimer als auch zu einem nachweisbaren Anstieg der Menge an amplifizierter Zielsequenz.
Die Wirkung der Position des modifizierten Nucleotids ist bei einem Vergleich der Bahnen 6 bis 8 zu sehen. Die Reduktion am Primerdimer, die erhalten wurde unter Verwendung eines Primers, der an dem Nucleotid benachbart dem 3'-terminalen Nucleotid modifiziert war (Bahn 7) war äquivalent der, die erhalten wurde unter Verwendung eines Primers, der am 3'-terminalen Nucleotid modifiziert war (Bahn 6), wohingegen die Verbesserung, die erzielt wurde unter Verwendung eines Primers, der an dem Nucleotid drei Basen stromaufwärts des 3'-terminalen Nucleotids modifiziert war (Bahn 8), etwas geringer war.
Beispiel 6
Weitere Amplifikationen unter Verwendung modifizierter Primer – Wirkung der Position des modifizierten Nucleotids
Um die Wirkung der modifizierten Primer auf die Bildung von Primerdimer weiter zu demonstrieren, wurden Vergleiche von Amplifikationen von HCV-RNA unter Verwendung sowohl von modifizierten Primern als auch unmodifizierten Primern, im Wesentlichen wie oben beschrieben, durchgeführt. Die Amplifikationen wurden durchgeführt unter Verwendung von drei verschiedenen stromabwärts modifizierten Primern, die sich nur in Bezug auf den Ort der modifizierten Base unterschieden.
Zielnucleinsäure
HCV-RNA-Matrizen wurden synthetisiert unter Verwendung eines HCV-RNA-Transkriptionsvektors, wie bei Young et al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4): 882–886, beschrieben.
Primer
Die Amplifikationen wurden durchgeführt sowohl unter Verwendung von unmodifizierten als auch modifizierten Primern. Die Nucleotidsequenzen der unmodifizierten Primer sind unten gezeigt, orientiert in Richtung 5' zu 3'. Der Stromaufwärts-Primen ST280A (SEQ ID Nr. 3) und der Stromabwärts-Primer ST778AA (SEQ ID Nr. 4) amplifizieren ein 240-Basenpaar-Produkt aus dem 5'-untranslatierten Bereich des HCV-Genoms.
HCV-Amplifikationsprimer
Die obigen Primerbezeichnungen beziehen sich auf unmodifizierte Primer. Modifizierte Primer wurden synthetisiert, wie in Beispiel 1 beschrieben, die aus denselben Nucleotidsequenzen bestanden, wie die unmodifizierten Primer, aber ein benzyliertes Adenosin entweder an 3'-terminaler Position oder an einer Position 1 oder 3 Nucleotide stromaufwärts des 3'-Endes aufwiesen. Die modifizierten Formen der Primer sind im Folgenden angegeben:
Modifizierte HCV-Amplifikationsprimer
Amplifikation und Analyse
Die Amplifikationen wurden durchgeführt, im Wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben, aber unter Verwendung von 100 Kopien HCV-RNA-Matrize. Die Gelananalyse des amplifizierten Produkts wurde durchgeführt, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Ergebnisse
Die Ergebnisse der gelelektrophoretischen Analyse sind in 2 zu sehen. Die Ziffern der Bahnen entsprechen jeder der Amplifikationen unter Verwendung von Kombinationen von unmodifizierten und modifizierten Primern, wie in der Tabelle unten gezeigt. Die Banden, die dem vorgesehenen HCV-Produkt entsprechen, sind in der Figur durch einen Pfeil gezeigt. Die anderen Banden in dem Gel entsprechen unspezifischen Amplifikationsprodukten und insbesondere dem Primerdimer.
Primer
Da die Bildung des Primerdimers mit der Bildung des vorgesehenen Amplifikationsproduktes konkurriert, führt eine Reduktion an Primerdimer typischerweise zu einem gleichzeitigen Anstieg der Menge an vorgesehenem gebildeten Produkt. Somit ist die Wirkung der modifizierten Primer sowohl durch Vergleich der Menge an gebildetem Primerdimer mit der Menge, die unter Verwendung unmodifizierter Primer gebildet wurde, als auch durch Vergleich der Menge an vorgesehener Zielsequenz, die gebildet wurde, mit der Menge, die unter Verwendung unmodifizierter Primer gebildet wurde, zu erkennen.
Die erhaltenen Ergebnisse waren ähnlich denen, die bei HIV-Amplifikationen erhalten wurden, wie in dem vorherigen Beispiel beschrieben, aber bei den HCV-Amplifikationen war der Anstieg an vorgesehenem Produkt offensichtlicher als bei den HIV-Amplifikationen. Ein Vergleich der Ergebnisse unter Verwendung von zwei unmodifizierten Primern (Bahn 1) mit den Ergebnissen unter Verwendung eines einzelnen 3'-modifizierten Primers (Bahnen 2 und 5) und den Ergebnissen unter Verwendung von zwei 3'-modifizierten Primern (Bahn 6) zeigt, dass eine Abnahme an Primerdimer erhalten wurde bei Verwendung entweder von einem oder von zwei modifizierten Primern. Die Verwendung von zwei modifizierten Primern (Bahn 6) führte sowohl zur stärksten Abnahme an Primerdimer als auch einem signifikanten Anstieg der Menge an amplifizierter Zielsequenz. Wie im vorherigen Beispiel war eine geringe Differenz der Abnahme an Primerdimer bei Amplifikationen zu sehen unter Verwendung eines einzigen 3'-modifizierten Primers, die davon abhing, welcher Primer modifiziert war.
Die Wirkung der Position des modifizierten Nucleotids ist bei einem Vergleich der Bahnen 6 bis 8 zu sehen. Im Wesentlichen äquivalente Ergebnisse wurden erzielt unter Verwendung von Primern, die am 3'-terminalen Nucleotid modifiziert waren (Bahn 6), dem Nucleotid benachbart dem 3'-terminalen Nucleotid (Bahn 7) und dem Nucleotid drei Basen stromaufwärts des 3'-terminalen Nucleotids (Bahn 8). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Modifikatorgruppe an irgendeines der vier Nucleotide am 3'-Ende des Primers gebunden werden kann.
Beispiel 7
Amplifikationen unter Verwendung von modifizierten Primern – Wirkung der Modifikatorgruppe
Um die Wirkung der modifizierten Primer auf die Bildung des Primerdimers weiter zu zeigen und um alternative Primermodifikationen zu zeigen, wurden Vergleiche durchgeführt bei Amplifikationen von HCV-RNA unter Verwendung sowohl von modifizierten Primern als auch unmodifizierten Primern, wobei die Primer durch Addition von einer bis drei verschiedenen Modifikatorgruppen modifiziert wurden: Benzyl-, Nitrobenzyl- und Methylgruppen.
Die Amplifikationsergebnisse wurden mit zwei verschiedenen Methoden analysiert. Bei einem Satz von Vergleichen wurde die Gegenwart von Primerdimer mit gelelektrophoretischer Analyse der Reaktionsprodukte untersucht. Bei einem zweiten Satz von Vergleichen wurde die Bildung von Primerdimer während der Amplifikation überwacht unter Verwendung der oben beschriebenen kinetischen PCR-Methoden.
Zielnucleinsäure
HCV-RNA-Matrizen wurden synthetisiert unter Verwendung eines HCV-RNA-Transkriptionsvektors, wie von Young et al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4): 882–886, beschrieben.
Amplifikationsprimer
Amplifikationen wurden durchgeführt unter Verwendung sowohl von unmodifizierten als auch modifizierten Primern. Die modifizierten Primer bestanden aus den gleichen Nucleotidsequenzen, wie die unmodifizierten Primer, waren aber am 3'-terminalen Adenosin modifiziert durch Addition einer Methylgruppe, einer Benzylgruppe oder einer Nitrobenzylgruppe. Die Primer wurden synthetisiert, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben. Die Bezeichnungen für die verwendeten Primer sind unten gezeigt.
Amplifikationsreaktionen
Die Amplifikationen wurden in 100-μl-Ansätzen durchgeführt, die die folgenden Reagenzien enthielten:
0, 20 oder 200 Kopien HCV-RNA-Matrize;
50 mM Tricin, pH 8,3;
110 mM KOAc;
3,5 mM Mn(OAc)₂;
jeweils 300 μM dATP, dCTP, dGTP;
50 μM dTTP;
500 μM dUTP;
250 nM von jedem Primer;
20 U rTth;
2 U UNG und
13% Glycerin.

Ein Thermocycling jeder Reaktionsmischung wurde durchgeführt in einem GeneAmp^®-PCR-System 9600 Thermocycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT) unter Verwendung des folgenden Temperaturprofils:

Präreaktionsinkubation:	4 min lang 45°C;
Reverse Transkription:	24 min lang 60°C;
46 Zyklen:	Denaturieren 30 s bei 94°C, Annealing/Verlängern 30 s bei 60°C;
Letzte Extension:	7 min bei 60°C;
Nachreaktion:	4°C.

Detektion des amplifizierten Produkts
A. Gelelektrophorese
Die Gegenwart des amplifizierten Produkts wurde mit Gelelektrophorese wie folgt nachgewiesen. Reaktionsprodukte wurden unter Verwendung von Agarosegel (100 ml 3% NuSieve, 0,5% SeaChem und 0,5 μg/ml Ethidiumbromid) fraktioniert und 1 × TBE (0,089 M Tris, 0,089 M Borsäure, 0,0025 M Dinatrium-EDTA) wurde als Laufpuffer verwendet. Die Elektrophorese wurde ungefähr 1 Stunde lang mit 100 V ausgeführt. Die mit Ethidiumbromid angefärbten Banden von DNA wurden unter Verwendung von UV-Strahlung sichtbar gemacht.
B. Detektion mit kinetischer PCR
Bei der oben beschriebenen kinetischen PCR-Methode wird ein interkalierender Farbstoff, wie Ethidiumbromid, der stärker fluoresziert, wenn er in doppelsträngige DNA interkaliert, der PCR zugefügt. Der Anstieg an doppelsträngiger DNA während der Amplifikation wird überwacht, indem die Fluoreszenz des Farbstoffs während der Reaktion gemessen wird. Da kinetische PCR-Methoden nur einen Anstieg der Gesamtmenge an doppelsträngiger DNA messen, wird die Bildung unspezifischer Amplifikationsprodukte nicht unabhängig gemessen. Um das Auftreten von unspezifischer Amplifikation durch Primerdimer unabhängig von der Matrizenamplifikation zu messen, wurden Reaktionen ohne Matrizennucleinsäure durchgeführt. In solchen templatfreien bzw. matrizenfreien Reaktionen ist jeder Anstieg an doppelsträngiger DNA der Bildung von matrizenunabhängigem unspezifischen Amplifikationsprodukt zuzurechnen.
Die Bedingungen der kinetischen PCR-Reaktion waren wie oben beschrieben, außer dass Ethidiumbromid zu der Reaktionsmischung in einer Konzentration von 1 g/ml zugegeben wurde. Die Reaktionen wurden überwacht, indem die Fluoreszenz der Reaktionsmischung gemessen wurde, wie in EP 640 828 beschrieben.
Die Fluoreszenzmessung wurde normalisiert, indem durch eine Anfangsfluoreszenzmessung, die während eines frühen Zyklus während der Reaktion erhalten wurde, geteilt wurde, während die Fluoreszenzmessungen zwischen den Zyklen relativ konstant waren. Die Zykluszahl, die für die Anfangsfluoreszenzmessung ausgewählt wurde, war die gleiche für alle verglichenen Reaktionen, so dass alle Messungen Anstiege bezogen auf den gleichen Reaktionszyklus zeigen. Die Reaktionsfluoreszenz in zielfreien Reaktionen blieb relativ konstant, bis sich Primerdimer bildete. Bei den meisten Ansätzen wurde schließlich Primerdimer nachweisbar, wenn genug Amplifikationszyklen durchgeführt worden waren. Die Wirkung der modifizierten Primer kann bei einem Vergleich der Anzahl von Zyklen erkannt werden, die durchgeführt wurden, bis Primerdimer gebildet wurde, wenn überhaupt.
Ergebnisse
Die Ergebnisse der gelelektrophoretischen Analyse sind in 3 zu sehen. Die Bahnziffern, die jeweils den Amplifikationen unter Verwendung von unmodifizierten und drei Arten von modifizierten Primern und 200 Kopien, 20 Kopien oder 0 Kopien HCV-RNA entsprechen, sind in der Tabelle unten gezeigt (die Bahnziffern werden von links nach rechts gezählt: die Bahnen 1 bis 30 sind in der oberen Hälfte des Gels; die Bahnen 31 bis 60 in der unteren Hälfte des Gels). Außerdem waren Molekulargewichtsmarker in den Bahnen 1 und 31 vorhanden (mit Hae III verdaute PhiX 174 RF DNA, New England Biolabs, Beverly, MA) und in den Bahnen 30 und 60 (Superladder-low, 20 by Leiter, Gen Sura, Del Mar, CA). Die Banden, die dem vorgesehenen spezifischen Produkt entsprechen, sind in der Figur durch einen Pfeil angezeigt (~ 230 bp). Die anderen Banden in dem Gel entsprechen unspezifischem Amplifikationsprodukt und insbesondere Primerdimer.
Bahnziffern von Amplifikationsergebnissen, die in Fig. 3 gezeigt sind
Die Ergebnisse zeigen, dass eine Amplifikation unter Verwendung der modifizierten Primer zu einer größeren Menge an amplifizierter HCV-Nucleinsäure führte, als Amplifikationen unter Verwendung unmodifizierter Primer. Außerdem führte eine Amplifikation unter Verwendung der modifizierten Primer zu einer Reduktion von Primerdimer im Vergleich zu Amplifikationen unter Verwendung unmodifizierter Primer.
Bei den kinetischen PCR-Assays wurde die Fluoreszenz während der gesamten Reaktion überwacht. Die Zunahmerate der Fluoreszenz nach dem Fluoreszenzanstieg war nachweisbar ungefähr die gleiche bei allen Reaktionen, was durch die Form der Kurve sichtbar gemacht wird, die erhalten wurde, indem die Fluoreszenz gegen die Zykluszahl aufgetragen wurde (nicht gezeigt). Dies deutet darauf hin, dass die modifizierten Primer die Effizienz jeder Amplifikationsstufe nach der Anfangsstufe der Amplifikation nicht nachweisbar hemmten. Die Reaktionen unterschieden sich signifikant in der Anzahl der Zyklen, die durchgeführt wurden, bevor ein Anstieg der Fluoreszenz nachweisbar war.
Um die Unterschiede zwischen den Reaktionen quantitativ auszuwerten, sind die Ergebnisse ausgedrückt in Bezug auf die Anzahl von Amplifikationszyklen, die durchgeführt wurden, bis die Fluoreszenz einen willkürlich vorgegebenen Fluoreszenzpegel (AFL) überstieg. Der AFL wurde ausgewählt nahe dem Basisfluoreszenzpegel, aber über dem Bereich von statistischen Schwankungen bei der gemessenen Fluoreszenz, so dass die Reaktionskinetik während der geometrischen Wachstumsphase der Amplifikation gemessen wurde. Die Akkumulation von amplifiziertem Produkt in späteren Zyklen hemmt die Reaktion und fuhrt schließlich zu einem Reaktionsplateau.
Die kinetischen PCR-Ergebnisse sind in der Tabelle unten zusammengefasst. Jeder Wert für Amplifikationen von 20 oder 200 Kopien der Zielmatrize bedeutet einen Durchschnitt von 5-fach wiederholten Amplifikatio nen mit Ausnahme der Amplifikationen unter Verwendung von benzylierten Primern und 20 Kopien des Ziels, der einen Durchschnittswert für vier Wiederholungen zeigt. Jeder Wert für Amplifikationen ohne Matrize zeigt einen Durchschnitt von 8-fach durchgeführten Versuchen.
Zwei von acht Replikaten der Amplifikationen unter Verwendung von benzylierten Primern ohne Ziel zeigten kein Ergebnis bei der Primerdimerbildung am Ende von 46 Zyklen. Der Durchschnitt der verbleibenden sechs Amplifikationen ist gezeigt, der einen Durchschnitt für gebildetes Primerdimer ergibt. Der konditionelle Durchschnitt ist nicht vergleichbar mit den anderen gezeigten Werten wegen der weggelassenen Daten.
Zyklen, um AFL zu erreichen Zielkopienzahl
Die Daten zeigen, dass die modifizierten Primer offensichtlich die Amplifikation der Zielnucleinsäure verlangsamen, so dass der AFL mehrere Zyklen später erreicht wird. Die Verzögerung entsprach nicht einer Reduktion der Endausbeute an spezifischem Amplifikationsprodukt. Es wurde beobachtet, dass alle Amplifikationen der Zielnucleinsäure ein Plateau innerhalb von 46 Zyklen erreichten, die in diesem Versuch verwendet wurden und wie aus den entsprechenden Daten bei der gelelektrophoretischen Analyse sichtbar wird, stieg die Endausbeute bei Verwendung modifizierter Primer.
Die Daten zeigen, dass die Verzögerung bei der Bildung von Primerdimer signifikant größer war als die Verzögerung der Amplifikation der Zielsequenz. Der positive Effekt der Primer ist am deutlichsten zu sehen beim Vergleich von zielfreien Amplifikationen zu Amplifikationen von 200 Kopien Matrize. Unter Verwendung unmodifizierter Primer trat der Anstieg der Fluoreszenz zum AFL nur einen Zyklus später auf als bei Amplifikationen ohne Ziel, was andeutet, dass die Amplifikation des Ziels schwierig von der Bildung von Primerdimer zu unterscheiden wäre. Im Gegensatz dazu trat bei Verwendung von modifizierten Primern der Anstieg der Fluoreszenz aufgrund des Primerdimers mindestens drei Zyklen später auf und bei Verwendung der benzylierten Primer sechs Zyklen später, wenn er überhaupt auftrat. Somit könnte die Zielamplifikation nachgewiesen und von der Bildung von Primerdimer unterschieden werden.
Wenn man zielfreie Amplifikationen und Amplifikationen von 20 Kopien der Matrize vergleicht, zeigt die Wirkung der modifizierten Primer das gleiche Muster einer größeren Verzögerung des Einsetzens der Primerdimerbildung, als die Verzögerung der Zielamplifikation. Unter Verwendung von unmodifizierten Primern konnten 20 Kopien der Matrize nicht nachgewiesen werden. Unter Verwendung von Nitrobenzyl- und Benzylprimern wurde die Bildung von Primerdimer ausreichend verzögert, damit der Nachweis von 20 Kopien Matrize in diesem System ermöglicht wurde.
Die Daten von der Überwachung der Fluoreszenz bei jedem Amplifikationszyklus (Daten nicht gezeigt) zeigten, dass allgemein die Verzögerung der Primerdimerbildung ausreichend war, um zu verhindern, dass die Primerdimerbildung ein Plateau innerhalb von 46 Zyklen erreichte. Somit schienen die modifizierten Primer die Bildung des Primerdimers ausreichend zu verzögern, dass die Amplifikation des Ziels abgeschlossen werden konnte und die Reaktion gestoppt werden konnte, bevor ein signifikanter Pegel an Primerdimer gebildet war
Beispiel 8
Fotolabile Primer
Um die Verwendung fotolabiler modifizierter Primer zu zeigen, wurden Amplifikationen von HCV-RNA durchgeführt unter Verwendung sowohl von modifizierten Primern als auch unmodifizierten Primern. Die modifizierten Primer wurden durch Bindung von einer oder zwei Nitrobenzylgruppen an das exocyclische Amin von 3'-terminalem Adenin gebunden.
Amplifikationsprimer
Die Primer wurden synthetisiert, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Bezeichnungen für die verwendeten Primer sind unten gezeigt.
Amplifikationsreaktionen
Für jedes Primerpaar wurden Reaktionen durchgeführt unter Verwendung einer Verdünnungsreihe der Konzentrationen an zugefügter Zielsequenz. Zwei Gruppen von Ansätzen, die jeweils alle Kombinationen von Primerpaar und Konzentration an zugefügter Zielsequenz einschlossen, wurden durchgeführt und innerhalb jeder Reaktionsgruppe wurde jede Reaktion, die ein gegebenen Primerpaar und eine Zielkonzentration enthielt, doppelt durchgeführt. Die Amplifikationen wurden in 100-μl-Ansätzen durchgeführt, die die folgenden Reagenzien enthielten:
0, 10, 10², 10³, 10⁴ oder 10⁵ Kopien HCV-RNA-Matrize;
55 mM Tricin;
90 mM KOAc;
3 mmol Mn(OAc)₂;
jeweils 200 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP;
200 μM dUTP;
250 nM von jedem Primer;
10 U rTth;
2 U UNG und
8% Glycerin.

Thermocycling und jede Reaktionsmischung wurden durchgeführt in einem GeneAmp-PCR-System 9600 Thermocycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT) unter Verwendung des folgenden Temperaturprofils:

Präreaktionsinkubation:	5 min 50°C;
Reverse Transkription:	30 min 60°C;
Anfangsdenaturierung:	1 min 95°C;
2 Zyklen:	Denaturieren 15 s bei 95°C, Annealing/Verlängern 20 s bei 60°C;
46 Zyklen:	Denaturieren 15 s bei 90°C, Annealing/Verlängern 20 s bei 60°C;
Letzte Extension:	10 min bei 72°C.

Es wurden immer polierte Reagenzglaskappen (Perkin Elmer, Norwalk, CT) verwendet. Nachdem die Reaktionstemperatur in der Stufe der reversen Transkription auf 60°C gestiegen war, wurde der erwärmte Deckel von dem PCR-Tablett in dem Block des Thermocyclers entfernt und die Hälfte der Reagenzgläser (ein vollständiger Satz der doppelt durchgeführten Reaktionen) wurde mit Aluminiumfolie bedeckt. Die andere Hälfte wurde 10 Minuten lang unter Verwendung einer in der Hand gehaltenen UV-Lampe, die bei 302 nm emittierte (UVP Modell UVM-57, UVP Products, San Gabriel, CA) beleuchtet. Der erwärmte Deckel wurde ersetzt und die Amplifikation fortgesetzt.
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Amplifikationen wurden mit Gelelektrophorese analysiert, wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in 4 zu sehen. Die Primer und die Matrizenkopienzahl, die in jeder Reaktion verwendet wurde, sind angegeben im Gel (log der Kopienzahl gezeigt). Die Banden, die dem vorgesehenen Produkt entsprechen, sind in der Figur gezeigt. Die anderen Banden in dem Gel entsprechen unspezifischem Amplifikationsprodukt und insbesondere Primerdimer.
Ein Vergleich der mit UV bestrahlten Reaktionssätze zeigt, dass die Verwendung der modifizierten Primer zu einer erheblichen Abnahme an Primerdimer führte, insbesondere bei niedrigen Kopiezahlen.
Ein Vergleich der nicht bestrahlten Reaktionssätze zeigt, dass die Verwendung der Bisnitrobenzylprimer zu einer vollständigen Hemmung der Amplifikation führte, wie erwartet. Die Amplifikationen unter Verwendung der Mononitrobenzylprimer lieferten nicht nur Produkt, sondern zeigten auch eine erhebliche Abnahme an Primerdimer, was übereinstimmte mit den in den vorherigen Beispielen erhaltenen Ergebnissen.
Beispiel 9
Amplifikationen unter Verwendung von p-tert.-butylbenzylmodifizierten Primern
Dieses Beispiel beschreibt die Amplifikation von HCV-RNA unter Verwendung von Primern, die mit p-tert.-Butylbenzylgruppen modifiziert sind.
Zielnucleinsäure
HCV-RNA-Matrizen wurden synthetisiert unter Verwendung eines HCV-RNA-Transkriptionsvektors, wie von Young et al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4): 882–886, beschrieben.
Primer
Amplifikationen wurden durchgeführt unter Verwendung von modifizierten Primern, die wie in Beispiel 2 oben beschrieben synthetisiert wurden. Die Nucleotidsequenzen der unmodifizierten Primer sind unten gezeigt, orientiert von 5' nach 3'. Die verwendeten Primer waren modifizierte Versionen des Stromaufwärtsprimers ST280A (SEQ ID Nr. 3) und des Stromabwärtsprimers ST778AA (SEQ ID Nr. 4). Die modifizierten Formen der Primer sind im Folgenden angegeben:
Modifizierte HCV-Amplifikationsprimer
Amplifikation und Analyse
Amplifikationen wurden durchgeführt in 100-μl-Ansätzen, die die folgenden Reagenzien enthielten: 20, 5, 2,5, 2 oder 0 Kopien HCV-Matrizen-RNA;
50 mM Tricin (pH 8,33);
110 mM KOAc;
jeweils 300 μM dATP, dCTP und dGTP;
50 μM dTTP;
500 μM dUTP;
50 nM von jedem Primer;
3,5 mM Mn(OAc)₂;
13% Glycerin;
20 Einheiten rTth-DNA-Polymerase und
8,0 Einheiten UNG.

Das Amplifikationstemperaturcycling wurde durchgeführt in einem TC480 DNA-Thermocycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT) unter Verwendung des folgenden Temperaturprofils:

Präreaktionsinkubation:	12 min bei 45°C;
UNG-Inaktivierung:	30 s bei 90°C;
Reverse Transkription:	20 min bei 60°C;
47 Zyklen:	Denaturieren 45 s bei 94°C, Annealing/Verlängern 70 s bei 60°C;
Letzte Extension:	7 min bei 60°C und
Nachreaktion:	10°C bis zur Analyse (kurze Zeit).

Die Amplifikationsprodukte wurden mit Gelelektrophorese analysiert, wie oben beschrieben.
Ergebnisse
Die Amplifikationen, die mit jeder Zielmatrizenzahl durchgeführt wurden, wurden wie folgt repliziert: 3 Amplifikationen wurden durchgeführt unter Verwendung von 20 Kopien der ZielMatrize, 3 Amplifikationen wurden durchgeführt unter Verwendung von 5 Kopien der Zielmatrize, 2 Amplifikationen wurden durchgeführt unter Verwendung von 2,5 Kopien der Zielmatrize, 1 Amplifikation wurde durchgeführt unter Verwendung von 2 Kopien der Zielmatrize und 23 Amplifikationen wurden ohne Zielsequenz durchgeführt. Alle matrizenpositiven Amplifikationen führten zu einer einzigen Bande auf dem Gel mit der erwarteten Zielgröße. Keine der Amplifikationen führte entweder zu Primerdimer oder einem anderen unspezifischen Amplifikationsprodukt.
Die Ergebnisse können mit denen von Beispiel 6 oben verglichen werden, bei dem das gleiche HCV-Ziel amplifiziert wurde unter Verwendung der gleichen Primersequenzen. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit denen von Beispiel 6 zeigt, dass Amplifikationen unter Verwendung von p-tert.-butylbenzylmodifizierten Primern signifikant verbessert waren im Vergleich zu den entsprechenden Amplifikationen, die mit unmodifizierten Primern durchgeführt wurden.
Zusätzliche Versuche wurden durchgeführt, in denen HIV-1-RNA amplifiziert wurde unter Verwendung der p-tert.-butylbenzylmodifizierten Versionen der in Beispiel 5 oben beschriebenen Primer. Die Amplifikationen wurden im Wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt. Wie bei dem hier beschriebenen HCV-System führten alle HIV-1-matrizenpositiven Amplifikationen zu einer einzigen Bande auf dem Gel mit der erwarteten Zielgröße und keine der Amplifikationen führte entweder zu Primerdimer oder anderem unspezifischen Amplifikationsprodukt.
Diese zusätzlichen Ergebnisse können mit denen von Beispiel 5 oben verglichen werden, bei dem das gleiche HIV-Ziel amplifiziert wurde unter Verwendung der gleichen Primersequenzen. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit denen von Beispiel 5 oben zeigt, dass Amplifikationen unter Verwendung von p-tert.-butylbenzylmodifizierten Primern signifikant besser waren als die entsprechenden Amplifikationen, die mit unmodifizierten Primern durchgeführt wurden.
Beispiel 10
Amplifikation von mykobakterieller DNA
Dieses Beispiel beschreibt einen Vergleich von Amplifikationen von mykobakterieller DNA, die durchgeführt wurden unter Verwendung von unmodifizierten und modifizierten Primern. Sowohl Primer, die durch Addition einer Benzylgruppe an das 3'-terminale Nucleotid modifiziert wurden, als auch Primer, die durch Addition einer p-tert.-Butylbenzylgruppe an das 3'-terminale Nucleotid modifiziert wurden, wurden verwendet. Die Reaktionen unter Verwendung unmodifizierter Primer waren im Wesentlichen wie bei Tevere et al., 1996, J. Clin. Microbiol. 34(4): 918–923, beschrieben. Die Amplifikationen wurden durchgeführt unter Verwendung von Sputumproben, denen mykobakterielle DNA in einer bekannten Konzentration zugegeben worden war, um infizierte klinische Proben nachzuahmen. Weitere Amplifikationen wurden durchgeführt unter Verwendung von gereinigter mykobakterieller DNA und unter Verwendung von DNA-freien negativen Kontrollproben.
Probenvorbereitung
Sputumproben, von denen vorher durch Mikroskopie und Kultur gezeigt worden war, dass sie für Mykobakterien negativ waren wurden verflüssigt und mit der von CDC empfohlenen N-Acetylcystein-NaOH-Methode dekontaminiert (Kent und Kubica, 1985, Public Health Mycobacteriology – a guide for the level III laboratory, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control, Atlanta). Verflüssigtes Sputum (100 μl) wurde zu 500 μl Atemwegsprobenwaschreagenz (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1% (V/V) Triton X-100, 0,05% NaN₃, pH 8,0) zugegeben und 10 Minuten mit 12.500 × g zentrifugiert. Jedes Pellet wurde wieder in 100 μl Lysereagenz (0,05 n NaOH, 1% (V/V) Triton X-100, 1 mM EDTA, 0,05% NaN₃) resuspendiert und 45 Minuten bei 60°C inkubiert. Die Lysate wurden dann mit 100 μl Neutralisationsreagenz (0,2 M Tris-HCl, 8 mM MgCl₂, 0,05% NaN₃, pH 7,5) neutralisiert.
Gepoolte Sputumlysate wurden erzeugt, indem jeweils 80 μl von zwei getrennten Sputumlysaten vereinigt wurden. Zu jedem der 8 gepoolten Sputumlysate (jeweils 160 μl) wurden 15 μl eines DNA-Vorrats (2 Kopien/μl in einer 1 : 1-Mischung von Lyse- und Neutralisationsreagenzien) zugegeben, der aus gezüchteten M. tuberculosis isoliert worden war.
Proben, die gereinigte mykobakterielle DNA in bekannter Konzentration enthielten (kein Sputum), wurden hergestellt, indem 10 μl DNA-Vorrat auf 100 μl einer 1 : 1-Mischung aus Lysereagenz und Neutralisierungsreagenz zugefügt wurden.
Negative Kontrollproben (keine DNA) bestanden aus einer Mischung von 100 μl Lysereagenz und 100 μl Neutralisierungsreagenz.
Amplifikationsprimer
Die Amplifikationen wurden durchgeführt unter Verwendung von Primern, die aus den folgenden Nucleotidsequenzen bestanden:
Die folgenden Primerpaare, die die angegebene Modifikatorgruppe gebunden an die 3'-terminale Base aufwiesen, wurden für die Amplifikationen verwendet. Alle modifizierten Primer wurden synthetisiert, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben. Alle Primer waren am 5'-Ende biotinyliert.
Amplifikation
Für jede Probe wurden Amplifikationen durchgeführt unter Verwendung des unmodifizierten Primerpaars, KY18 (SEQ ID Nr. 5) und KY75 (SEQ ID Nr. 7), und von modifizierten Formen des Primerpaars, KY436 (SEQ ID Nr. 6) und KY75 (SEQ ID Nr. 7).
Amplifikationen wurden durchgeführt in 100-μl-Ansätzen, die jeweils 50 μl von einer der drei Proben, wie oben beschrieben, enthielten und 50 μl 2X Reagenzienmischung, die die folgenden Reagenzien enthält:
100 mM Tris-HCl, pH 8,9;
500 mM von jedem Primer;
200 μM (jeweils) dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dUTP);
20% (V/V) Glycerin;
10 Einheiten AmpliTaq;
6 Einheiten AmpErase.

Das Thermocycling jedes Ansatzes wurden in einem GeneAmp PCR-System 9600 Thermocycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT) durchgeführt unter Verwendung des folgenden Temperaturprofils:

Präreaktionsinkubation:	5 min bei 50°C;
2 Zyklen:	Denaturieren 20 s bei 98°C, Annealing 20 s bei 62°C und Verlängern 45 s bei 72°C;
41 Zyklen:	Denaturieren 20 s bei 94°C, Annealing 20 s bei 62°C, Verlängern 45 s bei 72°C;
Letzte Extension:	ungefähr 12 h bei 72°C (über Nacht).

Die Amplifikationsprodukte wurden mit Elektrophorese durch ein 2% Nusieve^®, 0,5% Agarosegel nach Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht.
Ergebnisse
Die Ergebnisse der elektrophoretischen Analyse sind in 5 gezeigt. Für jede Probe wurden die Produkte aus Amplifikationen, die mit unmodifizierten Primern (als "A" bezeichnet) und nur modifizierten Primern (mit "B" und "C" bezeichnet) durchgeführt wurden, auf benachbarten Bahnen laufen gelassen. Die Banden, die der vorgesehenen mykobakteriellen Zielsequenz entsprechen, sind mit Pfeilen gezeigt. Andere Banden entsprechen unspezifischen Amplifikationsprodukten; die unterste Bande in dem Gel entspricht einem Primerdimer. Bahnen, die mit "M" markiert sind, enthalten Molekulargewichtsmarker (Hae III-Verdau von PhiX 174 DNA).
Unter Verwendung der unmodifizierten Primer führte die Amplifikation von gereinigter mykobakterieller DNA zur Bildung von Primerdimer. Die Verwendung der jeweils modifizierten Primerpaare erhöhte die Menge an vorgesehenem Ziel und schloss im Wesentlichen die Bildung von nachweisbarem Primerdimer aus.
Im Gegensatz zur Amplifikation von gereinigter DNA unter Verwendung unmodifizierter Primer reduzierte die Gegenwart von Sputumlysat in der Amplifikationsreaktion die Effizienz und erhöhte die Bildung von unspezifischen Amplifikationsprodukten, wie durch die Gegenwart von fremden Produktbanden gezeigt wird. Der Anstieg des unspezifischen Amplifikationsproduktes ist nicht übenaschend, da Sputumlysate eine signifikante Menge an Human-DNA enthalten, die bei den Amplifikationen von gereinigter mykobakterieller DNA nicht vorhanden war. Die Verwendung jedes der modifizierten Primerpaare bei Amplifikationen, die in Gegenwart von Sputum durchgeführt wurden, führte sowohl zu einem signifikanten Anstieg der Menge an vorgesehenem Produkt, das erzeugt wurde, als auch zur Reduktion an unspezifischer Amplifikation.
Beispiel 11
Weitere Synthese von Primern, die mit einer Benzylgruppe modifiziert sind
Primer, die durch Addition einer Benzylgruppe an das terminale Cytosin modifiziert waren, wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert, aber unter Verwendung von LCAA-CPG-gebundenem N⁴-Acetyl,N⁴-benzyl-5'-O-DMT-2'-desoxycytidin, das wie unten beschrieben hergestellt wurde.
Stufe 1: Synthese von N⁴-Benzyl-2'-desoxycytidin
Zu 2'-Desoxycytidinhydrochlorid (5,28 g, 20 mmol, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) wurde Benzylamin (20 ml) zugegeben und die Mischung wurde 3 Stunden lang unter Argonatmosphäre auf 150°C erhitzt. Die Lösung wurde im Vakuum eingeengt, was ein viskoses gelbes Öl lieferte, das zwischen Wasser (100 ml) und Ethylacetat (100 ml) aufgetrennt wurde. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (100 ml) gewaschen und abgetrennt. Die wässrige Phase wurde im Vakuum eingeengt, was einen gelben Sirup (13 g) lieferte, der mit Silicagelsäulenchromatographie mit 15 : 1 Methylenchlorid : Methanol als Elutionsmittel gereinigt wurde, was das gewünschte Produkt (5,8 g, 91,5%) als farblosen Sirup lieferte.
Stufe 2: Synthese von N⁴-Acetyl,N⁴-benzyl-2'-desoxycytidin
N⁴-Benzyl-2'-desoxycytidin (2,5 g, 7,9 mmol) wurde in 15 ml trockenem Dimethylformamid (15 ml) gelöst, Essigsäureanhydrid (8 g, 79 mmol, 10 Äquivalente) zugegeben und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel und überschüssiges Essigsäureanhydrid wurden im Vakuum eingedampft. Das Produkt wurde mit Säulenchromatographie mit Silicagel unter Verwendung von 20 : 1 Methylenchlorid : Methanol als Elutionsmittel gereinigt, was die Titelverbindung (1,3 g, 48%) lieferte. Die Verbindung war äußerst hygroskopisch und wurde im Exsikkator bei –20°C aufbewahrt.
Stufe 3: Synthese von N⁴-Acetyl,N⁴-benzyl,5'-O-DMT-2'-desoxycyt
N⁴-Acetyl,N⁴-benzyl-2'-desoxycytidin (76 mg, 0,2 mmol) wurde in 1 ml trockenem Pyridin gelöst und DMT-Cl (122 mg, 0,2 mmol, 1,0 Äquivalent) wurde zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden lang gerührt. Die Analyse mit DC zeigte, dass etwas Ausgangsmaterial übrig geblieben war, daher wurde ein weiteres Aliquot an DMT-Cl (61 mg, 0,5 Äquivalente) zugegeben und die entstehende Mischung eine weitere Stunde lang gerührt, wonach eine Analyse mit DC zeigte, dass die Reaktion vollständig war. Die Reaktion wurde mit 15 ml Kochsalzlösung abgeschreckt bzw. abgesättigt und die wässrige Phase mit Methylenchlorid (3 × 15 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Kochsalzlösung (2 × 15 ml) gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde verdampft und die Mischung wurde mit Silicagelchromatographie gereinigt unter Verwendung von 50 : 1 Methylenchlorid : Methanol, was N⁴-Acetyl,N⁴-benzyl, 5'-O-DMT-2'-desoxycytidin (96 mg, 65% Ausbeute) lieferte.
Stufe 4: Succinylierung
N⁴-Acetyl,N⁴-benzyl,5'-O-DMT-2'-desoxycytidin (96 mg, 0,13 mmol) wurde in 2 ml trockenem Pyridin gelöst. Brnsteinsäureanhydrid (100 mg, 1,0 mmol) und Dimethylaminopyridin (20 mg) wurden zugegeben und die entstehende Mischung bei Raumtemperatur 3 Tage lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand gleichzeitig mit Toluol (3 × 10 ml) eingedampft. Chloroform (50 ml) wurde zugegeben, um den Rückstand zu lösen (Beschallung wurde verwendet, um die Auflösung zu fördern). Die Chloroformphase wurde mit Kochsalzlösung (3 × 15 ml) und Wasser (1 × 15 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde verdampft, was 108 mg reines N⁴-Acetyl,N⁴-benzyl,5'-O-DMT-2'-desoxycytidin-3'-O-succinat ergab (97% Ausbeute).
Stufe 5: Herstellung von an LCAA-CPG gebundenem 5'-O-DMT-N⁴-Acetyl,N⁴-benzyl-2'-desoxycytidin-3'-O-succinat
Aktiviertes CPG wurde wie folgt hergestellt. LCAA-CPG (1,0 g, LCA00500C, CPG Inc., Fairfield, NJ) wurde mit Trichloressigsäure in Methylenchlorid (3%, 10 ml) versetzt und durch Rotation an einem Rotationsverdampfer (rotovapor, Buchi, Flawil, Schweiz) (kein Vakuum) 4 Stunden lang gemischt. Das Lösungsmittel wurde abfiltriert und das CPG mit 9 : 1 Triethylamin : Ethyldiisopropylamin (3 × 5 ml), Methylenchlorid (3 × 10 ml) und Ether (3 × 10 ml) aufeinander folgend gewaschen und dann im Vakuum getrocknet.
Das Kuppeln des modifizierten Nucleosidzwischenproduktes an mit Säure gewaschenes CPG wurde wie folgt durchgeführt. Zu 1 g aktiviertem LCAA-CPG wurde N⁴-Acetyl,N⁴-benzyl,5'-O-DMT-2'-desoxycytidin,3'-O-succinat (108 mg, 0,13 mmol), das wie oben beschrieben hergestellt worden war, Dimethylaminopyridin (20 mg) und 5 ml trockenes Pyridin zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde an einem Rotavapor (kein Vakuum) 3 Tage lang rotiert. Der Überstand wurde abfiltriert und das gekuppelte LCAA-CPG wurde aufeinander folgend mit Pyridin (3 × 5 ml), Methylenchlorid (3 × 10 ml) und Ether (3 × 10 ml) gewaschen und dann im Vakuum getrocknet.
Das Verkappen des LCAA-CPG, an das N⁴-Acetyl,N⁴-benzyl,5'-O-DMT-2'-desoxycytidin,3'-O-succinat gebunden war, wurde wie folgt durchgeführt: Zu dem derivatisierten CPG wurde Verkappungsmischreagenz A (THF/Lutidin/Ac₂O 8 : 1 : 1, Glen Research DNA Synthesereagenzien, Sterling, VA) und B (10% N-Methylimidazol in THF, Glen Research) zugegeben und die Reaktionsmischung an einem Rotavapor (kein Vakuum) über Nacht rotiert. Die Lösung wurde abfiltriert und das gekuppelte LCAA-CPG wurde aufeinander folgend mit Pyridin (3 × 5 ml), Methylenchlorid (3 × 10 ml), THF (3 × 10 ml) und Ether (3 × 10 ml) gewaschen und dann im Vakuum getrocknet.
Die Kupplungskapazität des derivatisierten LCAA-CPG wurde bestimmt, indem 5 mg des Produkts mit 3% Trichloressigsäure in Methylenchlorid versetzt wurden und die Menge an freigesetztem Dimethoxytritylcarboniumion mit UV-Spektroskopie gemessen wurde. Die Menge an Nucleosidderivat, das an LCAA-CPG gebunden war, wurde bestimmt als 19,5 μmol/g.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Oligonucleotid mit der allgemeinen Struktur:
worin S₁ eine erste Sequenz von Nucleotiden mit einer Länge von 5 bis 50 Nucleotiden bedeutet; worin S₂ eine zweite Sequenz mit einer Länge von 1 bis 3 Nucleotiden bedeutet; worin N ein Nucleotid bedeutet, das eine Purin- oder Pyrimidinbase aufweist, die ein exocyclisches Amin enthält; worin R eine Modifikatorgruppe bedeutet, wobei R kovalent an N über das exocyclische Amin gebunden ist und wobei R die Struktur
hat, wobei R₁ und R₂ unabhängig Wasserstoff, eine C₁-C₁₀-Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, Phenylgruppe, Phenoxygruppe, substituierte Phenylgruppe, Naphthylgruppe oder substituierte Naphthylgruppe bedeuten.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei R eine 2-Naphthylmethylgruppe, eine Benzylgruppe oder eine substituierte Benzylgruppe ist.
Oligonucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei R eine substituierte Benzylgruppe mit der Struktur
ist, wobei R₃ eine verzweigte oder lineare C₁-C₆-Alkylgruppe, Methoxygruppe oder Nitrogruppe bedeutet.
Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R₃ eine verzweigte oder lineare C₁-C₄-Alkylgruppe, Methoxygruppe oder Nitrogruppe bedeutet.
Oligonucleotid nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, wobei R₃ in para-Position gebunden ist.
Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei N A, G oder C ist.
Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei N Adenosin ist.
Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Benzyl, p-Methylbenzyl, p-tert.-Butylbenzyl, p-Methoxybenzyl, o-Nitrobenzyl und 2-Naphthylmethyl.
Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäurezielsequenz, wobei das Verfahren beinhaltet, dass eine Amplifikationsreaktion ausgeführt wird unter Verwendung mindestens eines Oligonucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Verfahren die Polymerasekettenreaktion ist.
Kit zur Durchführung einer Nucleinsäureamplifikationsreaktion, wobei das Kit ein Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält.