JP2003516765A

JP2003516765A - 鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ）複合体種の検出のための方法および組成物

Info

Publication number: JP2003516765A
Application number: JP2001545588A
Authority: JP
Inventors: ブレンターノ，スティーブン・ティー; ランクフォード，ロージャー・エル
Original assignee: ジェン−プローブ・インコーポレーテッド
Priority date: 1999-12-15
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2003-05-20
Also published as: DE60024679T2; EP1252331B1; WO2001044511A3; EP1252331A2; CA2389533A1; WO2001044511A2; US7361746B2; ES2253279T3; DE60024679D1; US20020012918A1; US20040224348A1; US6747141B2; CA2389533C; ATE312204T1

Abstract

(57)【要約】鳥型結核菌複合体（ＭＡＣ）生物を検出する方法であって、ＭＡＣ種由来の１６ＳｒＲＮＡまたは１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に特異的な増幅オリゴヌクレオチドでのｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅を用いる、前記方法が開示される。ＭＡＣ種由来の１６ＳｒＲＮＡまたは１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を増幅し、そして検出するためのオリゴヌクレオチドを含む組成物およびキットが開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下に、その内容が本明細書に援
用される米国仮出願第６０／１７１，２０２号、１９９９年１２月１５日提出の
優先権を請求する。発明の分野本発明は、病原性細菌のｉｎｖｉｔｒｏ診断検出に関し、そして具体的には
、ｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅を用いることによって、鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ）複合体（ＭＡＣ）生物（例えば鳥型結核菌、Ｍ・
イントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ））の核酸を増幅する
ための組成物およびアッセイに関する。

【０００２】発明の背景臨床試料における鳥型結核菌複合体（ＭＡＣ）のマイコバクテリウム属（Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種の検出は、診断ツールとして重要である。鳥型結核
菌複合体生物には、鳥型結核菌、Ｍ・イントラセルラレおよびこれらから区別す
ることが困難な他の種、例えばパラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓ）が含まれる。ＭＡＣ生物は、臨床試料にしばしば見られ、そしてＨＩＶ
感染個体あるいは化学療法を受けているかまたは免疫抑制薬剤を用いている個体
などの免疫無防備状態の個体における日和見感染の一般的な原因病原体である（
Ｇｏｏｄら，１９８２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４６：８２９
−８３３；Ｇｉｌｌら，１９８５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．２２：５４３−５４６）。したがって、ＭＡＣ種を検出し、そしてこれら
を他の種から区別することが可能なアッセイは、臨床診断のために重要である。

【０００３】マイコバクテリウム属種の臨床診断アッセイは、しばしば、細菌の物理的特性
（例えば染色および顕微鏡的検出）、生理学的特性（例えば定義された培地上の
増殖）および／または生化学的特性（例えば膜脂質組成）を解析する、時間がか
かる方法に頼る。こうした方法はしばしば、試料中に比較的高濃度の細菌が存在
することが必要であり、そして感染種を適切に決定するのに、高い度合いの経験
および専門知識を必要とする可能性がある。細菌のｉｎｖｉｔｒｏ増殖を必要
とする診断アッセイは、患者の遅延されたまたは不適切な初期治療の点でも、そ
してまた、しばしばｉｎｖｉｔｒｏで増殖させることが困難であるマイコバク
テリウム属を培養するのに必要な、実験装置の量およびスペースの点でも、費用
がかかる。

【０００４】試料中のマイコバクテリウム属核酸の存在を検出する分子生物学技術を用いる
アッセイが導入され、診断の感度および相対速度が増加している（米国特許第５
，０３０，５５７号、第５，５６７，５８７号、第５，５９５，８７４号、第５
，６０１，９８４号および第５，６７７，１２８号；ＰＣＴ第ＷＯ／９５／０
６７５５号）。これらのアッセイは、試料に存在する核酸配列を直接検出しても
よいし、または検出工程前の、試料に存在する核酸のｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅
に頼ってもよい（米国特許第５，５５４，５１６号、第５，７６６，８４９号、
第５，７９５７５２号、第５，９０６，９１７号、第５，９０８，７４４号；欧
州特許第ＥＰ０５２８３０６号および第ＥＰ０８１８４６５号；およびＰＣ
Ｔ第ＷＯ９６３６７３３号および第ＷＯ９７２３６１８号）。多くのｉｎ
ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応は、増幅オリゴヌクレオチドを必要とし、該オリゴヌク
レオチドは、試料に存在する核酸をテンプレートとして用いるポリメラーゼ反応
のためのプライマーとして働く。増幅された核酸の検出はしばしば、増幅された
配列にハイブリダイズし、検出可能シグナルまたは複合体を産生する特異的核酸
プローブの使用を必要とする。

【０００５】本発明は、生物学的試料に存在するＭＡＣ種の検出を可能にするため、比較的
長い増幅核酸配列を産生する組成物およびｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅を提供する
。

【０００６】発明の概要本発明の１つの側面にしたがい、生物学的試料に存在する鳥型結核菌複合体（
ＭＡＣ）種を検出する方法が提供される。該方法は、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、鳥型結核菌、Ｍ・イントラセルラレ、およびパラ結核
菌からなる群より選択される少なくとも１つのＭＡＣ種由来の核酸であって、１
６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）または１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含む前記核酸を含む生物学的試料を提供し；少なくとも１つのポリメラーゼ活
性、並びに配列番号１から配列番号６からなる群より選択される配列を有する少
なくとも１つの第一のプライマー、並びに配列番号７、配列番号８および配列番
号９からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つの第二のプライマー
を含む、ｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅混合物中で、１６ＳｒＲＮＡまたはＤＮＡ
を増幅して、増幅された核酸を産生し；そして増幅された核酸を検出する工程を
含む。１つの態様において、検出工程は、少なくとも１つのプローブに、増幅さ
れた核酸をハイブリダイズさせ、そしてプローブにハイブリダイズしている増幅
された核酸から生じるシグナルを検出することをさらに含む。別の態様において
、検出工程は、増幅された核酸の一部に相補的な配列を含む、少なくとも１つの
標識化プローブを用いる。該方法の別の態様は、ＭＡＣ種由来の核酸を固定化核
酸に結合させ、増幅工程前に、試料中の他の構成要素からＭＡＣ種由来の核酸を
精製するために、少なくとも１つのＭＡＣ種由来の核酸に特異的にハイブリダイ
ズする、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドを用いる工程をさらに含む。
別の態様において、増幅工程は、ヒト型結核菌、鳥型結核菌、Ｍ・イントラセル
ラレ、パラ結核菌由来の１６ＳｒＲＮＡまたはそれらの組み合わせのいずれか
を増幅する。該方法のある態様において、増幅工程は：配列番号１の配列を有す
る第一のプライマー、および配列番号７の配列を有する第二のプライマー；配列
番号１の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有する第二
のプライマー；配列番号１の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９
の配列を有する第二のプライマー；配列番号２の配列を有する第一のプライマー
、および配列番号７の配列を有する第二のプライマー；配列番号２の配列を有す
る第一のプライマー、および配列番号８の配列を有する第二のプライマー；配列
番号２の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有する第二
のプライマー；配列番号３の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７
の配列を有する第二のプライマー；配列番号３の配列を有する第一のプライマー
、および配列番号８の配列を有する第二のプライマー；配列番号３の配列を有す
る第一のプライマー、および配列番号９の配列を有する第二のプライマー；配列
番号４の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７の配列を有する第二
のプライマー；配列番号４の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８
の配列を有する第二のプライマー；配列番号４の配列を有する第一のプライマー
、および配列番号９の配列を有する第二のプライマー；配列番号５の配列を有す
る第一のプライマー、および配列番号７の配列を有する第二のプライマー；配列
番号５の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有する第二
のプライマー；配列番号５の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９
の配列を有する第二のプライマー；配列番号６の配列を有する第一のプライマー
、および配列番号７の配列を有する第二のプライマー；配列番号６の配列を有す
る第一のプライマー、および配列番号８の配列を有する第二のプライマー；並び
に配列番号６の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有す
る第二のプライマーからなる群より選択される組み合わせを用いる。他の態様に
おいて、増幅工程は、配列番号１から配列番号３からなる群より選択される配列
を有する少なくとも１つの第一のプライマー、並びに配列番号７、配列番号８お
よび配列番号９からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つの第二の
プライマーの組み合わせを用いる。いくつかの好ましい態様は：配列番号１の配
列を有する第一のプライマー、および配列番号７の配列を有する第二のプライマ
ー；配列番号１の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有
する第二のプライマー；配列番号１の配列を有する第一のプライマー、および配
列番号９の配列を有する第二のプライマー；配列番号２の配列を有する第一のプ
ライマー、および配列番号７の配列を有する第二のプライマー；配列番号２の配
列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有する第二のプライマ
ー；配列番号２の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有
する第二のプライマー；配列番号３の配列を有する第一のプライマー、および配
列番号７の配列を有する第二のプライマー；配列番号３の配列を有する第一のプ
ライマー、および配列番号８の配列を有する第二のプライマー；並びに配列番号
３の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有する第二のプ
ライマーからなる群より選択される組み合わせを用いる。他の態様において、増
幅工程は、転写仲介増幅、および：配列番号１の配列を有する第一のプライマー
、および配列番号７の配列を有する第二のプライマー；配列番号１の配列を有す
る第一のプライマー、および配列番号８の配列を有する第二のプライマー；配列
番号１の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有する第二
のプライマー；配列番号２の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７
の配列を有する第二のプライマー；配列番号２の配列を有する第一のプライマー
、および配列番号８の配列を有する第二のプライマー；配列番号３の配列を有す
る第一のプライマー、および配列番号７の配列を有する第二のプライマー；配列
番号３の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有する第二
のプライマー；並びに配列番号３の配列を有する第一のプライマー、および配列
番号９の配列を有する第二のプライマーからなる群より選択されるプライマーの
組み合わせを用いる。

【０００７】本発明の別の側面は、少なくとも１つの鳥型結核菌複合体（ＭＡＣ）種由来の
１６ＳｒＲＮＡ配列または１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡを増幅するた
めの組成物であって、配列番号１から配列番号９からなる群より選択される塩基
配列を有する１以上のオリゴヌクレオチドを含む、前記組成物である。１つの態
様において、組成物は、増幅されたＭＡＣ１６ＳｒＲＮＡ配列または１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡを検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレ
オチドをさらに含み、配列番号１１から配列番号１８からなる群より選択される
塩基配列を有する１以上のオリゴヌクレオチドを含む。

【０００８】本発明の別の側面は、配列番号１から配列番号９からなる群より選択される塩
基配列を有する１以上のオリゴヌクレオチドを含む、キットである。１つの態様
において、該キットは、配列番号１１から配列番号１８からなる群より選択され
る塩基配列を有する１以上のオリゴヌクレオチドをさらに含む。

【０００９】詳細な説明ｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅に頼る診断アッセイは、意図される標的核酸を特異
的に増幅する一方、空気で運ばれるかあるいは水、試薬またはアッセイに用いら
れる実験器具に存在する可能性がある混入核酸の増幅を避けなければならない。
混入核酸の増幅は、誤診または不必要な患者治療を導くであろう偽陽性結果を生
じる可能性がある。

【００１０】偽陽性結果は、試料が非ＭＡＣマイコバクテリウム属種または同様の配列を含
む他の細菌（例えばＭ・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ））から生
じる核酸を含み、そしてしばしば環境混入物質である場合、生じる可能性がある
。混入核酸は、一般的に、生物学的試料に存在する、損なわれていないＭＡＣ生
物に存在する標的配列に比較し、部分的に分解された配列である（すなわち比較
的短い）。比較的短いＭＡＣ配列が増幅される場合、試料に存在する混入および
／または分解配列もまた増幅され、偽陽性結果を導く可能性がある。増幅される
がアッセイ中で検出されない可能性がある混入配列はまた、プライマーおよび／
または核酸重合基質に関してＭＡＣ標的と競合し、偽陰性結果を導く可能性もあ
る。

【００１１】より短い混入核酸の増幅を避けるため、本発明は、プライマー結合部位間に位
置する比較的長い配列（例えば２００残基より長いもの）が増幅されるように、
標的配列に特異的にハイブリダイズするプライマーを用いる。検出される比較的
長いＭＡＣ標的配列を増幅することが可能であり、したがって試料に存在するＭ
ＡＣ種の信頼可能な検出のため、増幅された核酸を産生する組成物および方法に
関する必要性が存在する。

【００１２】本発明は、試料中のＭＡＣ種を検出するための、増幅オリゴヌクレオチドおよ
びこれらのオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとして用いるｉｎｖｉｔｒｏ
核酸増幅法を含む。これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、ｉｎｖｉｔｒ
ｏ増幅法において、比較的長い（約２８０から３２０ｎｔ）１６ＳリボソームＲ
ＮＡ（ｒＲＮＡ）またはリボソームＲＮＡ配列をコードするゲノムＤＮＡを特異
的に増幅する。こうした標的配列を含む可能性がある生物学的試料は、好ましく
はヒト由来であり、そしてより好ましくはプロセシングされた痰試料である。本
方法は、増幅または増幅されたＭＡＣ配列の検出を補助する、さらなるオリゴヌ
クレオチド組成物および方法と組み合わせてもよい。例えば、試料に存在するＭ
ＡＣ標的配列は、ＭＡＣ配列を選択するさらなる核酸オリゴマー（ときに「捕捉
オリゴヌクレオチド」と呼ばれる）を用いることによって、増幅前に試料の他の
構成要素から部分的に精製することが可能である。同様に、増幅核酸の検出は、
増幅されたＭＡＣ核酸に特異的にハイブリダイズする標識化または非標識化核酸
オリゴマー（「プローブ」または「標識化プローブ」）に頼ってもよい。

【００１３】本発明の核酸配列は、ＭＡＣ種の比較的長い核酸配列を増幅し、したがってＭ
ＡＣ種の検出を可能にする一方で、上述の混入核酸の短い部分を増幅することに
関連する問題を避けるのに有用である。したがって、本発明の組成物および方法
は、ＭＡＣ生物によって引き起こされた感染を検出する一方、試料中に混入する
核酸から生じる可能性がある偽陽性の発生を制限するのに有用である。さらに、
比較的長い標的配列を増幅することによって、増幅された配列が部分的に分解さ
れていたとしてもなお、特異的に検出され（すなわち十分な配列情報を保持し）
、したがって偽陰性結果を避けることが可能である。同様に、本発明の組成物お
よび方法によって産生される比較的長い増幅された配列は、他の近縁マイコバク
テリウム属種から区別される、ＭＡＣ種の特異的検出および同定に、より有用で
ある。本発明を説明する際に用いられる用語の理解を補助するため、以下の定義
が提供される。

【００１４】「生物学的試料」により、マイコバクテリウム属核酸を含む可能性がある生存
しているまたは死亡したヒト由来のいずれかの組織または成分、あるいはこうし
た成分由来の細菌培養いずれかを意味する。例えば、試料は、痰、呼吸組織また
は滲出物、末梢血、血漿または血清、子宮頚スワブ試料、生検組織、胃腸組織、
尿、糞便、精液または他の体液、組織または細菌培養（液体培地中または固体培
地上）であってもよい。解析用の試料を調製するため、生物学的試料を処理し、
物理的に細胞構造を破壊し、そして他の構成要素（例えば、酵素、緩衝剤、塩、
界面活性剤およびそれらに匹敵するもの）を含んでもよい溶液中に、細胞内核酸
を遊離させることが可能である。こうした方法は、当該技術分野に公知である（
例えば、米国特許第５，３７４，５２２号、第５，６４１，６３２号、第５，８
４６，７０１号）。

【００１５】「核酸」により、窒素性複素環塩基、または塩基類似体（ａｎａｌｏｇ）を有
する、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含み、ヌクレオシドが主鎖構造
を介して共有結合し、ポリヌクレオチドを形成する、多量体化合物を意味する。
核酸には、慣用的なリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、お
よびその類似体が含まれる。核酸主鎖は、既知の多様な連結を含む可能性があり
、該連結には、例えば、１以上の糖−ホスホジエステル連結、ペプチド−核酸結
合（ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート連結、メチルホ
スホネート連結またはそれらの組み合わせが含まれる。核酸の糖部分は、リボー
スまたはデオキシリボース、あるいは、例えば、２’メトキシ置換および／また
は２’ハロゲン化物置換などの置換を有する同様の化合物であってもよい。窒素
性塩基は、慣用的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その既知の類似体（例えばイ
ノシン（Ｉ）および他のもの、例えばＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆ
ｔｈｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ５−３６，Ａｄａｍｓら監修，第
１１版，１９９２に記載されるようなもの）、あるいはプリンまたはピリミジ
ン塩基類の既知の誘導体（ＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）、および１以上
の残基に関し、主鎖が窒素性塩基を含まない、「無塩基性（ａｂａｓｉｃ）」残
基（米国特許第５，５８５，４８１号）であってもよい。核酸は、ＲＮＡおよび
ＤＮＡに見られるような慣用的な糖、塩基および連結のみを含んでもよいし、ま
たは慣用的な構成要素および置換両方（例えばメトキシ主鎖を介して連結される
慣用的塩基、または慣用的塩基および１以上の塩基類似体を含む核酸）を含んで
もよい。本明細書にＤＮＡ配列として示される配列全てに関し、開示される配列
がまた、開示される配列のＲＮＡ均等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）（Ｔ残基の代
わりにＵを用いる）、逆配列および逆相補体も開示することが理解されるであろ
う。

【００１６】「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」により、一般的に１，０００残
基未満を有する核酸を意味し、約２から５ヌクレオチド残基の下限および約５０
０から９００ヌクレオチド残基の上限を有する大きさの範囲にあるポリマーが含
まれる。好ましいオリゴマーは、約５から約１５残基の下限および約５０から６
００残基の上限を有する大きさの範囲にあり；より好ましくは、約１０残基の下
限および約１００残基の上限を有する大きさの範囲にある。オリゴマーは、天然
に存在する供給源から精製してもよいが、好ましくは、公知の方法を用い、合成
する。

【００１７】「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」により、標的核酸また
はその相補体にハイブリダイズし、そしてｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅反応に関与
するオリゴヌクレオチドを意味する。好ましくは、増幅オリゴヌクレオチドは、
標的核酸配列（またはその相補体）の領域に相補的である、少なくとも約１０の
連続する塩基、そしてより好ましくは、少なくとも約１２の連続する塩基を含む
。連続する塩基は、好ましくは、増幅オリゴヌクレオチドが結合する標的配列部
位に、少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％相補的である
。増幅オリゴヌクレオチドは、好ましくは、長さ約１０から約６０塩基であり、
そして修飾ヌクレオチドまたは類似体、あるいは修飾主鎖連結を含んでもよい。

【００１８】増幅オリゴヌクレオチドおよびオリゴマーは、「プライマー」または「プロモ
ーター・プライマー」と称される可能性がある。「プライマー」は、一般的に、
テンプレート核酸にハイブリダイズし、そして重合反応、通常、酵素仲介反応に
おいて伸長する３’端を有する、オリゴヌクレオチドを指す。プライマーの５’
領域は、標的核酸に非相補的であり、そしてプロモーター配列のようなさらなる
塩基を含んでもよい（したがって「プロモーター・プライマー」と称してもよい
）。当業者は、プライマーとして機能することが可能ないかなるオリゴマーも、
５’プロモーター配列を含むよう修飾され、そしてしたがってプロモーター・プ
ライマーとして機能することが可能であることを認識するであろう。同様に、い
かなるプロモーター・プライマーも、そのプロモーター機能と独立にプライマー
として働くことが可能である。

【００１９】「増幅」により、標的核酸配列、その相補体または断片の多コピーを得るため
の、増幅オリゴヌクレオチドまたはプライマーのポリメラーゼ仲介伸長に頼る、
いかなる既知のｉｎｖｉｔｒｏ法も意味する。ｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅は、
完全標的領域配列またはその相補体より短い配列を含む可能性がある増幅された
核酸の産生を指す。こうした増幅法には、例えば、転写仲介増幅（ＴＭＡ）、レ
プリカーゼ仲介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および鎖置換増幅（
ＳＤＡ）が含まれる。レプリカーゼ仲介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、および自
己複製ＲＮＡに特異的なＱＢレプリカーゼのようなレプリカーゼを用いる（米国
特許第４，７８６，６００号；ＰＣＴ第ＷＯ９０／１４４３９号）。ＰＣＲ
増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよび一連の熱反復反応を用い、多コ
ピーのＤＮＡの２つのＤＮＡまたはｃＤＮＡ相補鎖を合成する（米国特許第４，
６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８７，Ｖｏｌ．１
５５：３３５−３５０を参照されたい）。ＳＤＡは、エンドヌクレアーゼが標的
配列を含む半修飾ＤＮＡ二重鎖の１つの鎖にニックを入れ、続いて、一連のプラ
イマー伸長および鎖置換工程において増幅が起こるように、制限エンドヌクレア
ーゼの認識部位を含む、プライマーを用いる（Ｗａｌｋｅｒら，１９９２，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：３９２−３９
６；および米国特許第５，４２２，２５２号）。

【００２０】「転写仲介増幅」または「転写関連増幅」により、ＲＮＡポリメラーゼを用い
、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生するｉｎｖｉｔｒｏ核酸増
幅のいかなる種類も意味する。これらの方法は、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼ
活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌク
レオシド三リン酸、並びにプロモーター・プライマーおよび第二の非プロモータ
ー・プライマーを使用し、そして所望により、１以上のさらなるオリゴヌクレオ
チド（ときに「ヘルパー」と称される）を含んでもよい。これらの方法は、別に
詳細に開示されるように、当該技術分野に公知である（米国特許第５，３９９，
４９１号および第５，５５４，５１６号；米国特許第５，４３７，９９０号；米
国特許第５，１３０，２３８号；米国特許第４，８６８，１０５号および第５，
１２４，２４６号；ＰＣＴ第ＷＯ９３／２２４６１号、第ＷＯ９４／０３
４７２号、第ＷＯ９５／０３４３０号、第ＷＯ８８／０１３０２号および第
ＷＯ８８／１０３１５号）。本発明の態様において、好ましくは、転写仲介増
幅（ＴＭＡ）が用いられるが、当業者は、本発明のオリゴヌクレオチドプライマ
ー配列は、ポリメラーゼによるプライマー伸長に基づく、他のｉｎｖｉｔｒｏ
増幅法で容易に用いることが可能であることを理解するであろう。好ましいＴＭ
Ａ法は、先に詳細に記載されている（米国特許第５，３９９，４９１号および第
５，５５４，５１６号；ＰＣＴ第ＷＯ９３／２２４６１号、第ＷＯ９４／
０３４７２号および第ＷＯ９５／０３４３０号）。

【００２１】「プローブ」により、核酸またはその相補体、好ましくは増幅された核酸中の
標的配列に、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で特異的にハイブリダイ
ズし、それにより核酸の検出を可能にする、核酸オリゴマーを意味する。検出は
、直接（すなわち標的配列または増幅された核酸に直接ハイブリダイズするプロ
ーブから生じる）であっても、または間接的（すなわちプローブを標的配列また
は増幅された核酸に連結する中間分子構造にハイブリダイズするプローブから生
じる）であってもよい。プローブの「標的」は、一般的に、水素結合（すなわち
塩基対形成）を用い、プローブ・オリゴマーの少なくとも一部に特異的にハイブ
リダイズする、増幅された核酸配列内の配列（すなわちサブセット）を指す。「
十分に相補的な」配列は、２つの配列が１００％相補性でなくても、選択された
ハイブリダイゼーション条件において、標的配列へのプローブ・オリゴマーの安
定なハイブリダイゼーションを可能にする。プローブは、用いる検出法に応じ、
標識されていても、またはされていなくてもよい。

【００２２】「十分に相補的」により、一連の相補的塩基間の水素結合により、別の塩基配
列にハイブリダイズする、連続する核酸塩基配列を意味する。相補的配列は、標
準的塩基対形成（例えばＧ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ対形成）を用い、各位で相
補的であってもよいし、または標準的水素結合を用いて相補的ではない１以上の
残基（無塩基性残基を含む）を含むが、相補的配列が、適切なハイブリダイゼー
ション条件において、別の塩基配列と特異的にハイブリダイズするものであって
もよい。連続する塩基は、オリゴマーがハイブリダイズする配列に、好ましくは
、少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％相補的である。当
業者には、適切なハイブリダイゼーション条件が公知であり、そして該条件は、
配列組成および条件に基づいて容易に予測することが可能であり、または日常的
な試験を用いることにより、実験的に決定することが可能である（例えば、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハー
バー，１９８９）§§１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−
９．５１および１１．４７−１１．５７、特に§§９．５０−９．５１、１１．
１２−１１．１３、１１．４５−１１．４７および１１．５５−１１．５７を参
照されたい）。

【００２３】「分離」または「精製」により、生物学的試料の１以上の構成要素が、該試料
の１以上の他の構成要素から除去されることを意味する。試料構成要素には、他
の成分（例えばタンパク質、炭水化物、脂質）を含む可能性がある、一般的に水
性溶液中の核酸が含まれる。好ましくは、核酸の分離または精製工程は、少なく
とも約７０％、より好ましくは、少なくとも約９０％、そしてさらにより好まし
くは、少なくとも約９５％の他の試料構成要素を除去する。

【００２４】標的核酸の精製は、「標的捕捉」と称される可能性がある（ＰＣＴ第ＷＯ９
８／５０５８３号）。「捕捉オリゴヌクレオチド」または「捕捉オリゴマー」ま
たは「捕捉プローブ」により、塩基対ハイブリダイゼーションを用いることによ
り、標的配列および固定化オリゴマーに特異的に連結するための手段を提供する
、少なくとも１つの核酸オリゴマーを意味する。「固定化プローブ」または「固
定化核酸」または「固定化オリゴマー」により、固体支持体に捕捉オリゴマーを
直接または間接的に連結して、試料中の非結合成分から、結合した標的配列を分
離するのを促進する核酸を意味する。

【００２５】「標識」により、検出することが可能であるかまたは検出可能反応を導くこと
が可能である分子部分または化合物を意味する。標識は、直接または間接的に、
核酸プローブまたは検出しようとする核酸（例えば増幅された核酸）に連結され
る。直接標識は、標識をプローブに連結する結合または相互作用（例えば共有結
合または非共有相互作用）を通じて起こる可能性がある。間接的標識は、直接ま
たは間接的に標識される、架橋部分または「リンカー」（例えばさらなるオリゴ
ヌクレオチド）の使用を通じて起こる可能性がある。標識は、いかなる既知の検
出可能部分（例えば、放射性核種、ビオチンまたはアビジンなどのリガンド、酵
素または酵素基質、反応性基、色素または有色粒子などの発色団、生物発光剤、
燐光剤または化学発光化合物などの発光化合物、あるいは蛍光化合物）も含む。
好ましくは、標識化プローブ上の標識は、均一アッセイ系において検出可能であ
る（すなわち、混合物において、結合した標識化プローブが、非結合標識化プロ
ーブに比較し、検出可能なシグナルを示す；米国特許第５，２８３，１７４号お
よび第５，６３９，６０４号を参照されたい）。均一アッセイで使用するのに好
ましい標識は、化学発光化合物、より好ましくは、アクリジニウムエステル（「
ＡＥ」）化合物である（米国特許第５，６５６，２０７号、第５，６５８，７３
７号および第５，６３９，６０４号）。核酸に標識を付着させ、そして標識を検
出する方法は、当該技術分野に公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ
，第２版（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８９），
第１０章；米国特許第５，６５８，７３７号、第５，６５６，２０７号、第５，
５４７，８４２号、第５，２８３，１７４号および第４，５８１，３３３号；お
よび欧州特許出願第０７４７７０６号を参照されたい）。

【００２６】「均一検出可能標識」は、標識が、標的配列にハイブリダイズしているプロー
ブ上にあるかどうかに基づき、その存在を検出することが可能な標識を指す。す
なわち、均一検出可能標識は、標識化プローブの非ハイブリダイズ型からハイブ
リダイズ型を物理的に除去することなく、検出することが可能である。既知の均
一検出可能標識およびこれらを検出する方法は、米国特許第５，２８３，１７４
号、第５，６５６，２０７号、および第５，６５８，７３７号に詳細に記載され
る。

【００２７】「本質的に、からなる」により、本発明の基本的なそして新規の特性を実質的
に変化させない、さらなる構成要素（類）、組成物（類）または方法工程（類）
が、本発明の組成物または方法に含まれていてもよいことを意味する。こうした
特性には、ＭＡＣ種配列の特異的検出を可能にする、比較的長い増幅されたマイ
コバクテリウム属配列を産生する能力が含まれる。本発明の基本的な特性に実質
的な影響を有する、構成要素、組成物または方法工程は、この用語の外に属する
。

【００２８】別に定義されない限り、本明細書に用いられるすべての科学的および技術的用
語は、相当する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同一の意味を有する
。多くのこうした用語の一般的な定義は、例えば、ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，１９９４，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆
Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州ニューヨーク）またはＴｈｅＨａｒｐｅｒＣｏｌｌｉｎｓＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＢｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ＆Ｍ
ａｒｈａｍ，１９９１，ＨａｒｐｅｒＰｅｒｅｎｎｉａｌ，ニューヨー
ク州ニューヨーク）に見られる。別に言及されない限り、本明細書に使用される
または意図される技術は、一般の当業者に公知の標準的方法論である。

【００２９】本発明は、ＭＡＣ種を検出するため用いられるｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅法で
用いられる組成物、具体的には、個々のまたは組み合わせた核酸増幅オリゴマー
を含む。本発明はまた、ｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅において、こうした増幅オリ
ゴマーを用いて、ＭＡＣ種を検出する方法も含む。所望により、さらなるＤＮＡ
配列を用いて、ＭＡＣ配列の増幅前に、生物学的試料から、ＭＡＣ標的配列を捕
捉することが可能である。増幅された核酸を特異的に検出するための多様な方法
が、当該技術分野に知られる。本発明の態様において、増幅されたＭＡＣ核酸配
列を検出するのに、好ましくは、標識化プローブが用いられる。より好ましくは
、標識化プローブは、均一検出アッセイにおいて、増幅されたＭＡＣ核酸を検出
する。

【００３０】本発明のプライマー配列を用いて、マイコバクテリウム属の１６ＳｒＲＮＡ
配列内に含まれる、比較的長い配列を増幅する。一般的に、プライマーは、ヒト
型結核菌、鳥型結核菌およびＭ・イントラセルラレ由来の既知の１６ＳｒＲＮ
Ａ配列を比較し、そして配列が比較的保存され、そして少なくとも２００残基の
ｒＲＮＡ配列の増幅を可能にするのに十分に離れている領域を選択することによ
って、設計した。すなわち、同一のまたは同様の配列の領域をマッチさせること
によって、配列を並列し、そして公知の分子生物学技術を用いて、配列を比較し
た。配列比較は、コンピューター化アルゴリズムを用いることによって容易にす
ることが可能であるが、当業者は、こうした比較を容易に手動で行うことが可能
である。比較配列の比較的保存された領域を選択したら、すべて標準法を用いて
決定されるように、ＧＣ含量が約４０％から６０％であり、Ｔ_mが６０℃を超え
、そして予測される二次構造（例えばヘアピン構造）が相対的にほとんどないか
またはまったくない保存配列のサブセットを含む、特異的オリゴマーを設計した
。配列番号１から配列番号３および配列番号７から配列番号９の配列を有する設
計オリゴマーを合成した。

【００３１】少なくとも２つのプライマーを用いたＭＡＣ標的領域の増幅は、多様な既知の
核酸増幅反応を用いて達成することが可能であるが、好ましい態様は、等温転写
仲介増幅（ＴＭＡ）反応を用いる（米国特許第５，３９９，４９１号および第５
，５５４，５１６号）。この方法を用いて、核酸の多くの鎖が、単一コピーの標
的核酸から産生され、こうして既知の検出法を用いることによって、増幅された
標的の検出が可能になる。簡潔には、ＴＭＡは、５’プロモーター配列を含むプ
ロモーター−プライマー、第二のプライマー、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ
、核酸重合の基質（ｄＮＴＰ類およびｒＮＴＰ類）並びに溶液中の適切な塩およ
び緩衝剤を用いて、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する。プロ
モーター−プライマーが、標的ＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、そして逆転
写酵素が、プロモーター−プライマーの３’端からの伸長によって、第一鎖ｃＤ
ＮＡを生成する。ｃＤＮＡは第二のプライマーとハイブリダイズする。ハイブリ
ダイゼーションは、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖を変性させることによって、または逆
転写酵素に関連するＲＮアーゼＨ活性を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖中のＲＮ
Ａを除去することによって、促進することが可能である。第二のプライマーは、
第一のプライマーの遠位でｃＤＮＡに結合し、そして逆転写酵素を用いて、第二
のプライマーの３’端からＤＮＡの新規鎖が合成され、機能するプロモーター配
列を一端に含む二本鎖ＤＮＡが生じる。ＲＮＡポリメラーゼは、二本鎖プロモー
ター配列に結合し、そして転写は多数の転写物、すなわち標的配列の増幅産物ま
たは「単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）」を生じる。単位増幅配列は、その後
、ＴＭＡ過程でさらに用いられ、複製の新規周期のテンプレートとして働き、こ
うして多量の増幅された一本鎖核酸（すなわち単一テンプレートから合成される
、約１００から３，０００コピーのＲＮＡ転写物）が生成される。

【００３２】プライマー配列（配列番号１から配列番号９）は、ＭＡＣ標的配列またはＭＡ
Ｃ標的配列の相補体に特異的に結合するが、標的配列またはその相補体に結合し
ない配列を含んでもよい。特に、Ｔ７プロモーター・プライマー（配列番号１か
ら配列番号３）は、標的またはその相補体に結合する３’配列に付着した５’Ｔ
７プロモーター配列（配列番号１０に別個に示される）を含む。当業者は、付着
するプロモーター配列を含むまたは含まない標的特異的プライマー配列が、多様
なｉｎｖｉｔｒｏ増幅条件において、プライマーとして有用である可能性があ
ることを認識するであろう。

【００３３】簡潔には、本発明のアッセイは、ＭＡＣ標的ｒＲＮＡまたは１６ＳｒＲＮＡ
をコードするＤＮＡを含む生物学的試料を提供し、所望により、標的を部分的に
精製するため標的捕捉を用い、ｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅を行い、増幅された核
酸産物を検出する工程を含む。続く実施例に例示される、ＴＭＡを用いる好まし
い態様において、増幅混合物は、ＭＡＣ標的ｒＲＮＡ、標的配列にハイブリダイ
ズする少なくとも１つのプロモーター・プライマー、Ｔ７プロモーター・プライ
マーを用いて標的から作成された第一鎖ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする
少なくとも１つの第二のプライマー、並びに逆転写酵素およびＴ７ＲＮＡポリ
メラーゼを用いることによる酵素的重合の基質および補因子を含む。

【００３４】増幅された核酸産物は、例えばゲル解析、あるいは少なくとも１つの相補的プ
ローブ配列への増幅された産物またはその一部のハイブリダイゼーションを含む
、多様な既知の方法のいずれかを用いて検出することが可能である。プローブは
、プライマー配列の逆相補的配列を含むオリゴヌクレオチド（配列番号１１から
配列番号１６）であってもよい。当業者は、本明細書に開示されるプライマーを
用いて産生される増幅されたＭＡＣ配列にハイブリダイズする他のプローブ配列
（すなわち、本発明の２つの機能的に適合する増幅オリゴヌクレオチドのいずれ
かを用いることによって産生される増幅された標的の一部に特異的にハイブリダ
イズするいずれかの配列）を容易に決定することが可能である。増幅された核酸
の検出のため、プローブを標識することが可能であるし、または増幅された産物
を標識することが可能である。例えば、均一系において、標識化プローブを、増
幅された核酸にハイブリダイズさせ、そして検出することが可能である（米国特
許第５，１８５，４３９号、第５，２８３，１７４号、第５，５８５，４８１号
および第５，６３９，６０４号）。別の例において、固定化プローブを用いて、
増幅され標識化された核酸を捕捉し、これをその後、生じた標識化核酸：固定化
プローブ複合体において、検出してもよい。

【００３５】所望により、方法に標的捕捉を含み、ｉｎｖｉｔｒｏ増幅前にＭＡＣ標的核
酸の濃度または純度を増加させる。好ましくは、標的捕捉は、ＰＣＴ第ＷＯ９
８／５０５８３号に詳細に記載されるように、標的核酸をハイブリダイズさせそ
して単離する、比較的単純な方法を伴う。簡潔には、固体支持体に付着したオリ
ゴヌクレオチドを、適切なハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸と混合し
、標的核酸が固体支持体に遊離可能に付着することを可能にする。標的捕捉は、
ＭＡＣ核酸および固体支持体上の固定化オリゴヌクレオチドの間の直接ハイブリ
ダイゼーションから生じる可能性があるし、または固定化オリゴヌクレオチドに
ＭＡＣ核酸を連結させるハイブリダイゼーション複合体を形成する１以上のオリ
ゴヌクレオチドを介して、間接的である可能性がある。好ましい固体支持体は、
溶液から容易に分離することが可能な粒子（例えば容器に磁場を適用することに
よって、混合物から単離することが可能な常磁性粒子）である。固体支持体に連
結したＭＡＣ標的核酸は洗浄され、そしてその後、ｉｎｖｉｔｒｏ増幅反応に
おいて、適切なプライマー、基質および酵素への曝露に際して、増幅される。

【００３６】本発明の態様である典型的な増幅アッセイは、以下の工程および条件を含む。
試料は、緩衝溶液中に鳥型結核菌から単離された既知の量の精製ｒＲＮＡを含む
かまたは細菌（例えば０．５ｍｌの痰沈降物または細菌培養）を含む。精製ｒＲ
ＮＡ標的を含む試料では、細胞溶解はまったく必要でないため、アッセイは、直
接、ｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅に進行する。細菌含有試料では、試料を溶解緩衝
液（例えば１０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．２５−０．５％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸
リチウム、ｐＨ８）と試験管中で混合し、そして標準法（例えば超音波処理）を
用いて、細胞内核酸を遊離させる。例えば、５０μｌの痰沈降物試料を、２００
μｌの溶解緩衝液と混合し、そして超音波水槽中で、室温で１５分間、試料をイ
ンキュベーションし、所望により、その後、９５℃で１５分間インキュベーショ
ンすることによって、残った生物を熱殺した。こうした試料調製法は公知である
（米国特許第５，３６４，７６３号、第５，３７４，５２２号および第５，８３
７，４５２号）。

【００３７】所望により、混合物中の他の試料構成要素からＭＡＣ標的核酸を部分的に精製
するために標的捕捉を含む際、方法は、実質的に、ＰＣＴ第ＷＯ９８／５０５
８３号に記載されるとおりである。簡潔には、２５０μｌの細菌溶解物を、増幅
しようとする１６ＳｒＲＮＡ配列の一部に相補的な標的捕捉オリゴマー（通常
５ｐｍｏｌ）を含む、等量の緩衝液、および標的捕捉オリゴマーの少なくとも一
部に相補的である固定化プローブ（例えばポリ−ｄＴ_14-24）が付着した５０μ
ｇの常磁性粒子（０．７−１．０５μ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ、インディアナ州イ
ンディアナポリス）と混合する。標的捕捉混合物を加熱し（例えば６０−７０℃
で１５−２０分間）、そしてその後、室温まで冷却してハイブリダイゼーション
を可能にし、その後、反応容器のある位置にＭＡＣ標的ＲＮＡを含む付着複合体
を含む磁気粒子を引き寄せるため、磁場を適用する（５分間）（米国特許第４，
８９５，６５０号）。粒子を洗浄緩衝液（例えば、１ｍｌの１０ｍＭＨＥＰＥ
Ｓ、６．５ｍＭＮａＯＨ、１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１
％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム）で２回洗浄し、そして再び分離する。引
き寄せられた標的を含む粒子は、核酸増幅反応に直接用いることが可能である。

【００３８】ＴＭＡを用いたｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅は、以下の条件を用いて行った（米
国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号もまた参照された
い）。一般的に、標的（精製１６ＳｒＲＮＡ、細胞溶解物または洗浄粒子のい
ずれか）を含む試料を、増幅試薬溶液（４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．
５、１７．５ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ₂、５％ポリビニルピロリドン
、各１ｍＭのｄＮＴＰ、各４ｍＭのｒＮＴＰ）および少なくとも２つのプライマ
ー・オリゴマー（少なくとも１つのプロモーター・プライマーおよび第二のプラ
イマー、各々２．５から３０ｐｍｏｌ）と混合し、そして蒸発を防ぐため、不活
性油の層（２００μｌ）で覆った。あるアッセイでは、増幅試薬溶液に、４０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌの代わりに７４ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂の代わりに６．１５ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭＫＣｌの代わりに２３ｍ
Ｍ酢酸Ｋ、１ｍＭｄＮＴＰの代わりに０．６２ｍＭｄＮＴＰを用い、そし
て７．７％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを添加した。混合物を９０−１００℃で１５分間
、その後、４２℃で５分間インキュベーションした。その後、２５μｌの酵素試
薬（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ ^TM Ｘ−１００またはＴｗｅｅｎ^TM−４０、１２０ｍＭＫＣｌ、および２０％
（ｖ／ｖ）グリセロール中の、反応あたり２５０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素および
５００ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼの溶液）を添加した。増幅混合物を穏やか
に震蘯し、そして４２℃で１−２時間インキュベーションした。陰性対照は、す
べて同一の試薬からなったが、ＭＡＣ標的の代わりにＭＡＣ核酸を含まない等体
積の水または緩衝液を用いた。

【００３９】増幅配列は、一般的に、適切な発光測定装置（例えばＬＥＡＤＥＲ^TM発光測定
装置、Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、カリフォルニア州サン
ディエゴ）中での化学発光によって検出されるアクリジニウムエステル（ＡＥ）
標識化プローブ（通常、反応あたり５．５ｐｍｏｌ）を用いて検出し、そして実
質的に先に記載されるように（米国特許第５，６５８，７３７号、第２５欄、２
７−４６行；Ｎｅｌｓｏｎら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：８４
２９−８４３８の８４３２）相対光単位（ＲＬＵ）で表した。一般的に、複製ア
ッセイに関して検出されたＲＬＵの平均を報告する。プローブは、配列番号１７
であり、そしてヘルパープローブは配列番号１８であった。

【００４０】以下の限定されない実施例は、本発明の好ましい態様の側面を示す。

【００４１】

【実施例】

実施例１異なるプライマーを用いた鳥型結核菌ｒＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ増幅上述の増幅および標識化プローブ検出法を用いて、転写仲介増幅の効率を、異
なる組み合わせおよび濃度のプロモーター・プライマーおよび第二のプライマー
を用いて試験した。

【００４２】反応の第一組で、プロモーター・プライマーおよび第二のプライマーは、反応
あたり、各々７．５、１５または３０ｐｍｏｌで存在し；そして各条件組の陰性
対照は、標的ＲＮＡを含まなかった。用いたプライマーは、配列番号１（ＧＡＡ
ＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＧＴＡ
ＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＡＴＣＴＣＡ）のＴ７プロモーター・プライマー
および配列番号７（ＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＧ
ＡＧＧＴＡ）の第二のプライマーであった。標的配列は、反応あたり４００また
は２０００コピー（それぞれ１ｆｇまたは５ｆｇ）で増幅反応中に存在する精製
鳥型結核菌１６ＳｒＲＮＡであった。各条件組に関し、３つの複製アッセイを
行った。先に記載される検出法（米国特許第５，５９５，８７４号および第５，
６３９，６０４号）を用いて、非標識化ヘルパープローブ（配列番号１８）とＡ
Ｅ標識化プローブ（配列番号１７）との増幅産物のハイブリダイゼーション後に
検出される相対光単位（ＲＬＵ）に基づいて、増幅（４２℃で２時間）を評価し
た。表１は、これらの組み合わせの増幅オリゴヌクレオチドで得られた結果を示
す。各結果は、各条件に関する３つの複製アッセイの平均を表す。

【００４３】表１：配列番号１および配列番号７を用いた鳥型結核菌ｒＲＮＡの増幅後に検出されたＲＬＵ（平均）

【００４４】

【表１】

【００４５】これらの結果は、増幅反応において、全ての濃度のプライマーおよびプロモー
ター・プライマーが、標的ＲＮＡをまったく含まない陰性対照反応におけるより
、有意に多い検出可能増幅産物を生じたことを示す。これらの条件下で、各々７
．５ｐｍｏｌの濃度のプロモーター・プライマーおよび第二のプライマーは、試
験した標的の両濃度に関して、最高量の検出可能増幅産物を生じた。

【００４６】反応第二組は、同一濃度のプライマーおよび標的を用い、第一組と実質的に同
一に行ったが、異なる組み合わせのプライマー配列を用いた。プロモーター・プ
ライマーは、配列番号３（ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ
ＧＡＧＡＣＣＡＣＡＧＣＣＣＡＴＴＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＣＣＣＣＡＣＴ）で
あり、そして第二のプライマーは配列番号９（ＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴ
ＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧ）であった。表２の結果は、各反応あたり、３つの複
製アッセイに関する条件各々について検出された平均ＲＬＵを示す。

【００４７】表２：配列番号３および配列番号９を用いた鳥型結核菌ｒＲＮＡの増幅後に検出されたＲＬＵ（平均）

【００４８】

【表２】

【００４９】これらの結果は、プライマーの別の組もまた、陰性対照に比較して、１６Ｓ
ＭＡＣ標的を増幅することが可能であるが、プライマーのこの組み合わせでの増
幅結果が、実験第一組で用いられたものより、より少ない増幅産物を生じたこと
を示す。プライマーの先の組み合わせと同様に、配列番号３および配列番号９の
組み合わせは、試験した最低濃度（各７．５ｐｍｏｌ）のプライマーを用いると
、最適の増幅が得られた。

【００５０】実施例２異なる組み合わせのプライマーを用いたＭＡＣｒＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ増幅実質的に実施例１に記載されるような増幅および標識化プローブ検出法を用い
て、異なる組み合わせのプライマー：配列番号１と配列番号８、および配列番号
１と配列番号９を用い、転写仲介増幅の効率を試験した。

【００５１】第一の組み合わせでは、Ｔ７プロモーター・プライマーは配列番号１であり、
そして第二のプライマーは配列番号８（ＣＧＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＴＣＴＴ
ＣＧＧＡＧＧＴＡＣＴ）であり、各々、各反応に７．５、１５または３０ｐｍｏ
ｌで存在し；各プライマー濃度の陰性対照反応は、標的ＲＮＡを含まなかった。
標的配列は、反応あたり４００または２０００コピーの精製鳥型結核菌１６Ｓ
ｒＲＮＡであった。各条件組に関し、３つの複製アッセイを行った。第二の組み
合わせでは、Ｔ７プロモーター・プライマーは配列番号１であり、そして第二の
プライマーは配列番号９（ＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣ
ＧＴＧ）であり、各反応は、第一の組み合わせの反応と同様に行った。各反応に
関し、三つ組アッセイを行った。表３は、これらの組み合わせの増幅オリゴヌク
レオチドで得られた結果（平均ＲＬＵ）を示す。

【００５２】表３：検出された増幅ＭＡＣ核酸（平均ＲＬＵ）

【００５３】

【表３】

【００５４】これらの結果は、他の第二のプライマーを、配列番号１を有するプライマーと
組み合わせて、ｉｎｖｉｔｒｏでＭＡＣ標的核酸を増幅することが可能である
ことを示す。配列番号１および配列番号８の組み合わせは、配列番号１および配
列番号９の組み合わせより、同一標的核酸の増幅に、より効率的であった。前者
の組み合わせでは、７．５および１５ｐｍｏｌのプライマー濃度が、ここで試験
したうちの最適値であるようであった。

【００５５】実施例３異なる組み合わせのプライマーを用いたＭＡＣｒＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ増幅実質的に実施例１に記載されるような増幅および標識化プローブ検出法を用い
て、配列番号１と配列番号９、および配列番号２と配列番号８のプライマーの組
み合わせを用い、転写仲介増幅の効率を試験した。

【００５６】第一の組み合わせでは、Ｔ７プロモーター・プライマーは配列番号１であり、
そして第二のプライマーは配列番号９であり、実施例２におけるようにアッセイ
した。第二の組み合わせでは、Ｔ７プロモーター・プライマーは配列番号２（Ｇ
ＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＴＧＣＣ
ＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＡＴＣ）であり、そして第二のプ
ライマーは配列番号８であり、各々、各反応に７．５、１５または３０ｐｍｏｌ
で存在し；各プライマー濃度の陰性対照反応は、標的ＲＮＡを含まなかった。標
的配列は、反応あたり４００または２０００コピーの精製鳥型結核菌１６Ｓｒ
ＲＮＡであった。各条件組に関し、３つの複製アッセイを行った。表４は、これ
らの組み合わせの増幅オリゴヌクレオチドで得られた結果（平均ＲＬＵ）を示す
。１５ｐｍｏｌの配列番号２および配列番号８プライマーを用いたアッセイ組の
陰性対照は、２つの複製アッセイを報告することに注目されたい。

【００５７】表４：検出された増幅ＭＡＣ核酸（平均ＲＬＵ）

【００５８】

【表４】

【００５９】これらの結果は、別の組み合わせのプライマー（配列番号２および配列番号８
）もまた、ｉｎｖｉｔｒｏでＭＡＣ標的核酸を増幅することを示す。これらの
アッセイにおいて、配列番号１および配列番号９の組み合わせは、表３に示され
る実験よりも、増幅に関して、より効率的であった。

【００６０】実施例４配列番号２または配列番号３を、配列番号７または配列番号８プライマーと共に用いた、ＭＡＣｒＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ増幅実質的に実施例１に記載されるような増幅および標識化プローブ検出法を用い
て、配列番号２と配列番号７、配列番号３と配列番号７および配列番号３と配列
番号８のプライマーの組み合わせを用い、転写仲介増幅の効率を試験した。

【００６１】反応第一組において、Ｔ７プロモーター・プライマーは配列番号２（実施例３
を参照されたい）であり、そして第二のプライマーは配列番号７（実施例１を参
照されたい）であった。表５は、この組み合わせの増幅オリゴヌクレオチドで得
られた結果（平均ＲＬＵ）を示す。

【００６２】表５：配列番号２および配列番号７を用いたＭＡＣ核酸増幅後に検出されたＲＬＵ（平均）

【００６３】

【表５】

【００６４】これらの結果は、別の組み合わせのプライマー（配列番号２および配列番号７
）もまた、ｉｎｖｉｔｒｏでＭＡＣ標的核酸を増幅することを示す。実施例２
で報告される実験におけるように、７．５および１５ｐｍｏｌの濃度のプライマ
ーが、これらの増幅条件において最も有効であった。

【００６５】実験第二組において、別の調製の検出試薬を用いて、配列番号３と配列番号７
および配列番号３と配列番号８の組み合わせを用い、鳥型結核菌１６ＳｒＲＮ
Ａの増幅を試験した。各プライマーの組み合わせおよび濃度に関する三つ組アッ
セイの結果を表６に示す。

【００６６】表６：配列番号３と配列番号７または配列番号８を用いたＭＡＣ核酸増幅

【００６７】

【表６】

【００６８】これらの結果は、別の組み合わせのプライマーが、ＭＡＣ増幅において有効で
あることを示す。陰性対照（標的０コピー）および実験（標的４００および２０
００コピー）アッセイがすべて、先の実験におけるより高いＲＬＵを生じたが、
検出された増幅核酸は、陰性対照より有意に多かった。これらの条件を用いて試
験した他の組み合わせに見られるように、７．５ｐｍｏｌのプライマーは、一般
的に、試験した、より高い濃度より、増幅に関して、より効率的であった。

【００６９】同様の実験において、反応あたり、より高い濃度（１５、３０または４５ｐｍ
ｏｌ）の各プライマーで、配列番号３および配列番号７の組み合わせを用いて、
反応あたり、０、１００、４００または１０００コピーのＭＡＣｒＲＮＡを増
幅した。これらの条件を用いて、より高いプライマー濃度（反応あたり３０ｐｍ
ｏｌおよび４５ｐｍｏｌ）は、試験した標的核酸のすべての濃度に関し、１５ｐ
ｍｏｌの各プライマーより、より効率的でなかった。

【００７０】実施例５低いプライマーおよび標的濃度を用いた、ＭＡＣｒＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ増幅実質的に実施例１に記載されるような増幅および標識化プローブ検出法を用い
て、配列番号１と配列番号７、および配列番号１と配列番号８のプライマーの組
み合わせを用い、転写仲介増幅の効率を試験した。これらのアッセイにおいて、
組み合わせ中、各プライマー２．５、５．０、７．５または１５ｐｍｏｌの濃度
で、プライマーを用いた。どちらの組み合わせに関しても、Ｔ７プロモーター・
プライマーは配列番号１（実施例１を参照されたい）であり、そして第二のプラ
イマーは、配列番号７（実施例１を参照されたい）または配列番号８（実施例２
を参照されたい）のいずれかであった。標的配列は、反応あたり０、４００また
は１０００コピーの精製鳥型結核菌１６ＳｒＲＮＡであった。各条件組に関し
、３つの複製アッセイを行った。表７は、これらの組み合わせの増幅オリゴヌク
レオチドで得られた結果（平均ＲＬＵ）を示す。

【００７１】表７：低いプライマーおよび標的濃度を用いた増幅後に検出された増幅ＭＡＣ核酸（平均ＲＬＵ）

【００７２】

【表７】

【００７３】これらの結果は、先の実施例におけるより少ないプライマーを用いて、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでのＭＡＣ標的核酸増幅に関して、プライマーの組み合わせが有効で
あることを示す。これらのアッセイにおいて、配列番号１および配列番号７の組
み合わせは、反応あたり２．５ｐｍｏｌで用いた際、最も有効であり；配列番号
１および配列番号８の組み合わせは、少なくとも、反応あたり比較的少ない標的
コピー（４００）に関しては、反応あたり２．５または５．０ｐｍｏｌで用いた
際、最も有効であった。どちらの濃度に関しても、増幅は、反応あたり、より高
い濃度のプライマーを用いた際、より効率的でなかった。

【００７４】反応あたり、より高い濃度（３０または４５ｐｍｏｌ）の各プライマーで、配
列番号１および配列番号８の組み合わせを用いて、同様の実験を行い、反応あた
り、０、１００、４００または１０００コピーのＭＡＣｒＲＮＡを増幅した。
これらの条件を用いて、反応あたり３０ｐｍｏｌのプライマーは、反応あたり４
５ｐｍｏｌのプライマーより、ＭＡＣ核酸の増幅に関して、より効率的であった
。３０および４５ｐｍｏｌのプライマーはどちらも、反応あたり１００コピーと
同程度に少ない標的核酸を増幅するのに有効であった。

【００７５】実施例６低いプライマーおよび標的濃度を用いた、ＭＡＣｒＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ増幅実質的に実施例５に記載されるような増幅および標識化プローブ検出法を用い
て、配列番号３と配列番号７、配列番号３と配列番号８、および配列番号２と配
列番号８のプライマーの組み合わせを用い、転写仲介増幅の効率を試験した。組
み合わせ中、各プライマー２．５、５．０、７．５または１５ｐｍｏｌの濃度で
、プライマーを用いた。これらの組み合わせにおいて、Ｔ７プロモーター・プラ
イマーは配列番号１（実施例１を参照されたい）または配列番号２（実施例３を
参照されたい）であり、そして第二のプライマーは、配列番号７（実施例１を参
照されたい）または配列番号８（実施例２を参照されたい）いずれかであった。
標的配列は、反応あたり０、１００、４００または１０００コピーの精製鳥型結
核菌１６ＳｒＲＮＡであった。各条件組に関し、３つの複製アッセイを行った
。表８は、これらの組み合わせの増幅オリゴヌクレオチドで得られた結果（三つ
組アッセイの平均ＲＬＵ、「２アッセイ」と示されたものを除く）を示す。

【００７６】表８：低いプライマーおよび標的濃度を用いた増幅後に検出された増幅ＭＡＣ核酸（平均ＲＬＵ）

【００７７】

【表８】

【００７８】これらの結果は、反応あたり各プライマー２．５ｐｍｏｌと同程度に少ないプ
ライマーを用いても、これらの組み合わせのプライマーが、ｉｎｖｉｔｒｏで
ＭＡＣ標的核酸増幅に有効であることを示す。これらの結果はまた、これらのプ
ライマーが、反応あたり１００コピーと同程度に少ないＭＡＣ標的核酸を増幅し
、検出可能増幅核酸を産生することが可能であることも示す。

【００７９】実施例７ＭＡＣｒＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ増幅における偽陽性の頻度本実施例は、実施例１から６に記載されるような増幅反応において、偽陽性が
高頻度で起こらないことを示す。環境的混入物は、アッセイに用いられる水、試
薬、実験器具（例えば試験管、ピペッティング装置）中のＭＡＣ生物または核酸
の存在から生じる可能性があるし、または実験室中の多様な供給源（例えば水槽
、シンク、エアロゾル）からアッセイに進入する可能性がある。環境的混入物の
増幅による偽陽性頻度は、まず、反応混合物が実施例１から６に記載されるＭＡ
Ｃ標的ＲＮＡを含まない際（すなわち陰性対照反応）に、陽性シグナル（一般的
に１００，０００ＲＬＵより高い）を提供する反応の数に基づいて概算した。決
定された偽陽性頻度は１．４％（１４４反応中２）であった。

【００８０】これを、各４０の増幅アッセイ４組（総数１６０）において、実質的に陰性対
照（すなわち標的核酸を含まないもの）に関して記載されるような増幅および標
識化プローブ検出法で、実施例１および５に記載される配列番号１と配列番号８
のプライマーの組み合わせを用いることによって、さらに拡張した。ＭＡＣ種（
鳥型結核菌）由来の１６ＳｒＲＮＡの非存在下において、１６０中３つのアッ
セイのみが、偽陽性とみなされる増幅結果を示した。したがって、これらのプラ
イマーは、これらの試験中、ＭＡＣ標的核酸の非存在下で、約１．８％の偽陽性
率を有した。

【００８１】総標的陰性反応（すなわち実施例１から７）の偽陽性率は１．６％（３０４中
５）であった。これらの結果は、本発明の組成物および方法が、偽の環境的混入
物による、高頻度の偽陽性結果を持たないことを示す。

【００８２】実施例８ポリメラーゼ連鎖反応を用いたＭＡＣｒＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ増幅本実施例は、本発明のＭＡＣプライマーの組み合わせを用いて、ＰＣＲ増幅を
用い、ＭＡＣ特異的配列を増幅することが可能であることを示す。標的調製のた
め、標準的微生物学法を用いて、Ｍ・イントラセルラレおよび鳥型結核菌をｉｎ
ｖｉｔｒｏで増殖させ、そして１０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ラ
ウリル硫酸リチウム、ｐＨ８中に細菌を懸濁し、そしてその後、超音波水槽中で
、室温で１５分間、試験管をインキュベーションすることによって、約１０⁶細
菌／ｍｌを溶解する。

【００８３】ＰＣＲ増幅は、各々５０ｍＫＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、
１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、５％（ｖ／ｖ）ジ
メチルスルホキシド、プライマー組み合わせ中、各０．３３μＭのプライマー、
各２００μＭのｄＮＴＰ、および０．７５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ
Ｔａｑ^TM；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、コネティカット州ノーウォーク）を含む
、４５μｌ反応中で、各組み合わせのプライマーを用い、各標的に関して行う。
熱周期は、９４℃５分間の第一周期、その後、３０周期の９４℃１分間、５５℃
１分間および７２℃１分間、並びに７２℃１０分間の最終周期を用いて行う（Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ９６００^TMサーマルサイクラー）。

【００８４】試験したプライマーの組み合わせには：配列番号１と配列番号７；配列番号１
と配列番号８；配列番号１と配列番号９；配列番号２と配列番号７；配列番号２
と配列番号８；配列番号２と配列番号９；配列番号３と配列番号７；配列番号３
と配列番号８；配列番号３と配列番号９；配列番号４と配列番号７；配列番号４
と配列番号８；配列番号４と配列番号９；配列番号５と配列番号７；配列番号５
と配列番号８；配列番号５と配列番号９；配列番号６と配列番号７；配列番号６
と配列番号８；および配列番号６と配列番号９が含まれる。

【００８５】ＰＣＲ増幅に続き、アガロースゲル電気泳動によって増幅された産物を解析し
て、既知のサイズマーカーに比較して、約２５０−３００ｎｔのＤＮＡのバンド
の存在または非存在を検出する。陰性対照のゲル上にはバンドは可視でないが、
プライマーの各組み合わせでは、およその大きさのバンドが見られる。すなわち
、配列番号１および配列番号７または配列番号８の組み合わせでは、増幅された
ＤＮＡのバンドは、長さ約２８０ｎｔであり；配列番号２および配列番号７また
は配列番号８の組み合わせでは、増幅されたＤＮＡのバンドは、長さ約２８５−
２９０ｎｔであり；そして配列番号３および配列番号７または配列番号８の組み
合わせでは、増幅されたＤＮＡのバンドは、長さ約３１５ｎｔである。試験した
他の組み合わせはすべて、既知のサイズマーカーに比較し、ゲル上に検出される
ような、長さ約２８０−３２０ｎｔの増幅されたＤＮＡを生じる。

【００８６】ＰＣＲ増幅後、増幅された産物はまた、配列番号１１から配列番号１６からな
る群より適切に選択される、組み合わせで用いたプライマーの少なくとも１つの
逆相補体（すなわち増幅に用いられる少なくとも１つのプライマーに相補的）で
あるプローブとのハイブリダイゼーションによっても解析する。すべての場合で
、増幅された核酸は、適切なプローブに特異的にハイブリダイズする。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＦターム(参考） 2G045 AA28 BA11 BA13 BB18 BB20 BB50 CB17 CB21 DA12 DA13 DA14 FA36 FB02 FB04 FB07 4B024 AA13 CA01 CA09 CA12 CA20 HA11 HA13 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ50 QQ54 QR08 QR32 QR35 QR39 QR42 QR56 QR62 QR82 QR84 QS12 QS16 QS25 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生物学的試料に存在する鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍａｖｉｕｍ）複合体（ＭＡＣ）種を検出する方法であって：ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、鳥型結核菌、Ｍ・イント
ラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、およびパラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からなる群より選択される少なくとも１
つのＭＡＣ種由来の核酸であって、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）または
１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む前記核酸を含む生物学的試料を提供
し；少なくとも１つのポリメラーゼ活性、並びに配列番号１から配列番号６からな
る群より選択される配列を有する少なくとも１つの第一のプライマー、並びに配
列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群より選択される配列を有する
少なくとも１つの第二のプライマーを含む、ｉｎｖｉｔｒｏ核酸増幅混合物中
で、１６ＳｒＲＮＡまたはＤＮＡを増幅して、増幅された核酸を産生し；そし
て増幅された核酸を検出する工程を含む、前記方法。
【請求項２】検出工程が、少なくとも１つのプローブに、増幅された核
酸をハイブリダイズさせ、そしてプローブにハイブリダイズしている増幅された
核酸から生じるシグナルを検出することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】検出工程が、増幅された核酸の一部に相補的な配列を含む
、少なくとも１つの標識化プローブを用いる、請求項２の方法。
【請求項４】ＭＡＣ種由来の核酸を固定化核酸に結合させ、増幅工程前
に、試料中の他の構成要素からＭＡＣ種由来の核酸を精製するため、少なくとも
１つのＭＡＣ種由来の核酸に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの捕
捉オリゴヌクレオチドを用いる工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項５】増幅工程が、ヒト型結核菌、鳥型結核菌、Ｍ・イントラセ
ルラレ、パラ結核菌由来の１６ＳｒＲＮＡまたはそれらの組み合わせのいずれ
かを増幅する、請求項１の方法。
【請求項６】増幅工程が：配列番号１の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号１の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号１の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号２の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号２の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号２の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号３の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号３の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号３の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号４の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号４の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号４の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号５の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号５の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号５の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号６の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号６の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有す
る第二のプライマー；並びに配列番号６の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有す
る第二のプライマーからなる群より選択される組み合わせを用いる、請求項１の方法。
【請求項７】増幅工程が、配列番号１から配列番号３からなる群より選
択される配列を有する少なくとも１つの第一のプライマー、並びに配列番号７、
配列番号８および配列番号９からなる群より選択される配列を有する少なくとも
１つの第二のプライマーの組み合わせを用いる、請求項１の方法。
【請求項８】増幅工程が：配列番号１の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号１の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号１の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号２の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号２の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号２の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号３の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号３の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有す
る第二のプライマー；並びに配列番号３の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有す
る第二のプライマーからなる群より選択される組み合わせを用いる、請求項７の方法。
【請求項９】増幅工程が、転写仲介増幅、および：配列番号１の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号１の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号１の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号２の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号２の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号３の配列を有する第一のプライマー、および配列番号７の配列を有す
る第二のプライマー；配列番号３の配列を有する第一のプライマー、および配列番号８の配列を有す
る第二のプライマー；並びに配列番号３の配列を有する第一のプライマー、および配列番号９の配列を有す
る第二のプライマーからなる群より選択されるプライマーの組み合わせを用いる、請求項７の方法。
【請求項１０】少なくとも１つの鳥型結核菌複合体（ＭＡＣ）種由来の
１６ＳｒＲＮＡ配列または１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡを増幅するた
めの組成物であって、配列番号１から配列番号９からなる群より選択される塩基
配列を有する１以上のオリゴヌクレオチドを含む、前記組成物。
【請求項１１】増幅されたＭＡＣ１６ＳｒＲＮＡ配列または１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡを検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレ
オチドをさらに含み、配列番号１１から配列番号１８からなる群より選択される
塩基配列を有する１以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１０の組成物。
【請求項１２】配列番号１から配列番号９からなる群より選択される塩
基配列を有する１以上のオリゴヌクレオチドを含む、キット。
【請求項１３】配列番号１１から配列番号１８からなる群より選択され
る塩基配列を有する１以上のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１２のキ
ット。