JPH07500502A

JPH07500502A - マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）のバクテリア株と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列

Info

Publication number: JPH07500502A
Application number: JP5508207A
Authority: JP
Inventors: ゲスドン，ジャン−リュック; シエリー，ドミニーク; ビンセン，ベロニク
Original assignee: アンスティテュパストゥール
Priority date: 1991-10-31
Filing date: 1992-10-30
Publication date: 1995-01-19
Also published as: ATE136592T1; FR2683227B1; FR2683227A1; GR3020265T3; WO1993009251A1; EP0612356B1; CA2122367A1; DE69209846T2; DE69209846D1; ES2088660T3; EP0612356A1; US5650272A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレ、ノクス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）のノくクチリア株と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列本発明は、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）（鳥結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）−マイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）群）に特異的なヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｉｃ）配列、並びにマイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックスに属する株に特異的な核酸の検出のためのヌクレオチド・プローブとして、又は生物学的サンプル中のマイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックスの株から得られたＤＮＡ又はＲＮＡの増幅におけるヌクレオチド・プライマーとして役立つことができるこの配列の特定の断片に関する。

また、本発明は、核酸断片を使用した生物学的サンプル中のマイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックスに属する株の検出方法、並びにこの方法を行うためのキ・ソトにも関する。

日和見性マイコバクテリアにより引き起こされる感染数は、それらがエイズ（ＡＩＤＳ）患者においてしばしばみられることを部分的理由として、増加している。ここ数年にわたり行われた細菌学的研究に従えば、最も重要な日和見性バクテリアは：マイコバクテリウム・カンサシＱ１．　Ｋａｎｓａｓ　ｉ　ｉ）、マイコバクテリウム・クセノビ（Ｍ、　ｘｅｎｏｐｉ）、マイコバクテリウム・シミアエ（Ｍ、　５１ｍ１ａｅ）及び特に、上記の群。

マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａアである。しかしながら、地理的変動が、これらの様々な日和見性マイコバクテリアによる感染の事件において存在する。

Ｊ、　Ｇｒｏｓｓｅｔにより指導されたＰｉｔｉ６−Ｓａｌｐｅｔｒｉｊｒｅ病院のグループの細菌学及びウィルス学の実験室により行われた最近の研究において、その血液を培養された７０９人のエイズ患者（２４６０サンプル）の中で、６３人（８，９％）が、マイコバクテリアとの陽性の血液培養物（ｈａｅｍｏｃｕｌｔｕｒｅｓ）をもっていた。他方において、この陽性血液培養物の現型として関連した種であり、そしてそれ故、ＭＡＩ群（ｃｏｍｐｌｅｘ）中にグループ分けされる。本発明の目的のためのＭＡＩ群は、５ＡＩＴＯｅｔａｌ（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　Ａｕｇｕｓｔ　１９９０．２８．　ｐ、１６９４−１６．９７）により定義された株を意味していると理解されるべきである。この群は、ヒト及び動物の病原体を一緒に運ぶ。旧Ｖウィルスにより非感染のヒトにおいては、この感染は、成人においてはその肺内に、小児においては神経節（ｇａｎｇｌｉａ）内に、特に在る。ＭＡＩ感染は、エイズ患者の５０〜９０％において診断されている。その配置は、この場合においては、好ましくは消化系であり、そして転移している。また、ＭＡの命名に導入された（Ｔｈｏｒｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　［ｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔ４ｒｉｏ１．。

１９９０、４０．２５４−２６０）。パラ結核菌がＣｒｏｈｎ’　ｓ病を患う患者から単離されたということにも留意すべきである。

血清学を使用して、２８の血清型が、ＭＡＩ内に認知されている。近年、血清型１〜６．８〜１１及び２１が、鳥結核菌として、そして血清型７．１２〜２０及び２５が、マイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍ、　１ｎｔｒａｃｅ１１ｕｌａｒｅ）として分類されている。血清型２２〜２４及び２６〜２８の分類学上の位置に関して、不特定のものが残っている。旧Ｖウィルスにより非感染のヒトにおいては、この血清型の分配は、高く分散しており、一方、エイズ患者においては、血清型１，４．８及び９のみが、優勢である（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｍｙｃ。

ｂａｃｔｅｒｉａのデータ）。この分散は、血清型１．２．３．４．８が好ましくは見つかった動物において観察されたものに類似している。

エイズ患者から単離された鳥結核菌（Ｍ、　ａｖｉｕｍ）株についてのフランス国の疫学的状況は、米国又はスウェーデンにおいて観察されたものと異なっている。フランスにおいては、血清型８が優勢であるが、血清型４又は６が、これらの他の２国において見つかっているものである。

本発明中で述べる血清型（血液型亜型（ｓｅｒｏｖａｒｓ））は、Ｐ、Ｊ、　Ｂｒｅｎｎａｎ　ｅｔ　ａｌ、（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａ　ｔｙｐｉｃａｌ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ　ｂｙ　Ｔｈ１ｎ−Ｌａｙｅｒ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｏｆ　Ｔｈｅｉｒ　５ｕｒｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｏｃｔ、　１９７８．　ｐ、　３７４−３７９）　ｌ：より定義されたものと同じである。日和見性マイコバクテリアは、微生物学者、免疫学者及び臨床医に対し多数の挑戦を課している。実際に、同種の（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）のバクテリア集団をもつヒト結核菌とは異なり、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックスの株は、集落上に様々なタイプのコロニーを与える細胞から成り：抗結核性化学療法（ａｎｔｉｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）に対する患者の反応と、インビトロにおける耐性記録（ａｎｔｉｂｉｏｇｒａｍ）の結果との間に、矛盾が観察され、耐性記録の役割に疑いを差し挟み（いがなる場合においても、ＭＡＩ感染が、様々な抗生物質及び抗結核治療等に僅かに反応し又はほとんど反応しない。）：マイコバクテリアは、結核に対する非特異的感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）に反応し、そして免疫応答にも影響を及はすことができる。

実験室においては、様々なサンプルから日和見性マイコバクテリアを、単離することにおいて、そしてその後、その種を決定することにおいて、困難が在る。環境中の日和見性マイコバクテリアのいたるところにある存在は、コロニー形成と感染との間の区別を、しばしば困難にする。なぜなら、サンプルから単離されたマイコバクテリウムの臨床的重要性を決定する前に正確な臨床的及び細菌学的基準（ｃｌｉｔｅｒｉａ）を与えることが重要であるからである。したがって、臨床医と細菌学者との間の協力の良好な質を確立し、そして日和見性マイコバクテリアを同定するための信頼でき且つ特異的な技術をもつことが不可欠である。病的な生成物（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ）から単離されそして同定されたマイコバクテリアの種が、それらの同定のために今日使用される単離技術及び計画に結びついているということは明白である。細菌学者は、日和見性マイコバクテリアの同定が、幾つかの要因により困難なものとなっていることを知っており：特定の種が、培養前に要求される脱汚染技術に対し、より高く又はより低く感受性であり、幾つかの種が、特定の条件下でのみ第一培養において単離され、最後に、表現型の性質に基づ（特定の同定技術が、十分に信頼できるものでなく、そして間違った同定を導くことができる。他方において、ＭＡＩ群に関連する特定のマイコバクテリアの分類学上の地位が、未だに未特定であり、そしてこの場合において、同定が確立されることができていない。

クチリアは、ヒト結核菌ＣＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）と同様に、小児の腺炎（ａｄｅｎｉｔｅｓ）の原因であることができる。臨床医は、しばしば、敗退までかかるかもしれない細菌学的診断を待ちながら、最初の抗結核治療を与え、この治療を、その細菌学的診断が得られるや否や中止する。

解釈のこれらの誤りを避け、そして速い診断を可能にするために、本発明に責任を負う発明者は、彼ら自身に、マイコバクテリウム・なりＮＡ配列を単離し、これらの配列を使用して、ＰＣＲ技術及び分子ハイブリダイゼーション技術に基づく同定の方法を開発することの目的を、あてがっている。それ故、彼らは、診断のため及び分子疫学のための両方において使用されることができる配列を探究した。

リダイゼーションを使用したアプローチが、提案された：しかしながら、これらの方法のほとんどが、培養後のみの同定を可能にする。

なぜなら、それらが、生物学的サンプル中で直接的にこれらのマイクバクテリアを検圧するために十分に感受性でないからである。これは、例えば、リポソームＲＮＡ配列に相補であり、そしてＧｅｎｅ−Ｐｒ。

ｂｅ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）により市場に出されたｃＤＮＡプローブについての場合である。ＷＯ８４１０２７２１、ＷＯ８８１０３９５７、＆１ｕｓｉａ１．　Ｃ，Ｅ。

ｅｔ　ａｌ、　（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９８８．２６．２１２０−２１２３）を参照のこと。さらに、５ａｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋９９０．２８．１６９４−１６９７）の基準に記載の微生物株が、Ｇｅｎｅ−Ｐｒｏｂｅにより市場に出されたプローブを使用して検出できない。他の著者は、類似の結果を発見した：Ｅｎｎｓ、　Ｒ，に、（Ｌａｂ、　Ｍｅｄ、１９８８．　１９．２９５−３００）、Ｓｈｅｒｍａｎ、［。

ｅｔ　ａｌ、　（Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９Ｂ９．２７．２４１−２４４）。

ＰＲ−２，６４５，８７８は、さらに、ヒト結核菌を含む少なくとも５のマイコバクテリア種において相同的な３８３塩基対のヌクレオチド配列について記載している。

しかしながら、この配列は、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックスに特異的でないという欠点をもっている。

より感度がありそしてより特異的な方法が、それ故、不定型のマイコバクテリア症（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｓｅｓ）のための信頼できる診断及び様々な日和見性マイコバクテリアの正確な同定を確立するために必要であった。

本発明の目的は、それ故、このような方法並びにこの方法を使用した要素を提供することである。

本発明の対象は、それ故、ヌクレオチド配列番号ｌ、ヌクレオチド配列番号２、これらと相補的な配列、並びに１以上の塩基の突然変異、挿入、欠失又は置換によりそれから異なった配列か６４ばれた、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックスに属する株のゲノムの核酸配列と特異的にハイブリダイズし、そして上記の群に属さないマイコバクテリアの核酸とハイブリダイズしない核酸配列である。

また、本発明の対象は、ヌクレオチド配列番号ｌ、ヌクレオチド配列番号２、それらの相補的な配列、並びに１以上の塩基の突然変異、挿入、欠失又は置換によりそれから異なった配列から選ばれ、そして上記と同じ特異性をもつ核酸配列である。

先に定義した核酸配列は、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列であることができる。

配列番号ｌの断片（断片（６）の正確なサイズは、１６４２塩基対である。ＥＭＢＬ及びＧｅｎｂａｎｋ　ｄａｔａ　ｔｈａｎｋｓ中のサーチは、既に知られたＤＮＡ並列と有意な相同性がないことを明らかにした。断片１６は。プラスミドｐＵｃ１８中にクローン化され、そしてこの組換えプラスミドを、ｐＭＡＯｌ　という。

プラスミドｐＭＡ０１を、１９９１年８月２８日に第［−１１３７号の下、Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託した。

異なるマイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー血清型上のプローブとして使用した配列番号２の断片は、血清型２．３．７．１２．１３．１４．１５．１６．１７．１８．１９．２０．２３．２４及び２５との）１イブリダイゼーシヨンを示す。断片Ｕは、マイコバクテリウム・イントラセルラー株及び鳥結核菌の血清型２及び３とハイブリダイズする。

今日、血清亜型ｌ、２．３．４、テ、６．８．９、ｌＯ１＋１及び２１は、鳥結核菌として、そして血清亜型７．１２．１３．１４．１５．１６．１７．１８．１９．２０及び２５は、マイコバクテリウム・イントラセルラーとして、考えられている。

そのサイズが２００４塩基対に等しい断片ＩＩは、プラスミドｐＵｃ１８中にクローン化されており：この組換えプラスミドを、ｐＭＡＯ２という。

このプラスミドｐＭＡ０２を、１９９１年８月２８日に第［−１１３８号の下、Ｃ０１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託した。

これらのプラスミド、並びに、一般的に、先に定義したような核酸配列を含むクローニング・ベクターは、本発明の他の対象を構成する。

上記のデータ・バンクの調査は、配列］１と既知の配列との間の相同性を現さなかった。

断片］６及び１１、機能的に等価な部分又はそれらの変異体は、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックスの種の検出及び同定のための分子ハイブリダイゼーション技術において使用されることができる。この機能的に等価な変異体は、これらの断片の特異性に不可欠な性質を影響されることなく、塩基対が突然変異され、欠失され、挿入され又は置換された配列を含んで成る。

制限酵素５ａｌｌ及びＥｃｏＲ［により最初の断片１６を解裂させることにより得られた７００塩基対の核酸断片を、鳥結核菌の異なる血清型のＤＮＡ上のプローブとして使用した。ハイブリダイゼーションは、血　。

溝型ｌ、２．３．４．５．６．８．９、ｌｏ、ｌｌ及び２１を担持する鳥結核菌株のＤＮＡのみにより観察される。この７００塩基対プローブがエイズ患者において最もしばしば遭遇する鳥結核菌の血清型を検出することを可能にするということに留意することが重要である。

配列１６及びＩｌ又はこれらの配列から得られた断片を、ＰＣＲ技術のためのプライマーを選択するためにも使用することができる。

この技術は、増幅されるべき断片に隣接するオリゴヌクレオチド対の選択を必要とする（米国特許第４．６８３．２０２号）。これらのオリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチド・プライマーは、有利には、１８と３０との間の、そして好ましくは１８と２２との間の長さのヌクレオチドをもつ。この２つのプライマーの中の１つは、そのテンプレートのストランド（＋）に相補的であり、そして他のプライマーは、その（−）ストランドに相補的である。これらのプライマーが２次構造又は相互に相補的な配列を有していないということが重要である。他方において、それぞれのプライマーの長さ及び配列は、そのプライマーが、原核又は真核細胞から得られた他の核酸と、特にマイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックスに属さないマイクバクテリアの核酸配列と、そしてヒトＤＮＡ又はＲＮＡであってそのサンプル中におそらく汚染することができるものと、ハイブリダイズしないように選ばれるべきである。

＆ｌＡ［群に属する株のヌクレオチド配列の増幅のための特異的プライマーとして選ばれたアンブリ？　−（ａｍｐｌｏｍｅｒｓ）は、Ｇｒｉｆｆａｉｓ　ｅｔａｌ、（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１９９１．１９．３８８７− ３８９１）により記載された方法に従って選ばれた。

配列１６から、本発明者は、ＰＣＲテストを行うために、オリゴヌクレオチドを選んだ。これらのオリゴヌクレオチドを使用して、彼らは、鳥結核菌（血清型ｌ、２．３．４．５．６．８．９．１Ｏ１１１及の、又はヒト結核菌（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群に属するマイコバクテリウムの核酸による増幅は、全く見られなかった。

同様に、配列１１から、本発明者は、特異的ＰＣＲテストを開発することを可能にするオリゴヌクレオチド・プライマーを選んだ。断片１１から選ばれたプライマーにより、彼らは、増幅を受ける核酸が血清型２．３．７．１２．１３．１４．１５．１６．１７．１８．１９．２０．２３．２４及び２５を担持するマイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー株から来るときにのみ増幅された断片を観察した。

好ましい対のプライマーを、図１中に表す。プライマーとして使用されることができるオリゴヌクレオチド対は、好ましくは！８の連続したヌクレオチドであってその配列の３゛末端を保存しながら選ばれているものを含んで成る。

最も特に好まれる対のプライマーは、一方で配列Ｉ６から得られたオリゴヌクレオチド貼１及び＾ＩＡ２、他方で配列Ｉｔから得られたＭＡ３及びＭＡ４から成る対により表され、以下の配列：ＭＡＬ：５°　ＧＧＣＣＣＧ　ＡＴＧ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　ＣＧＡ　ＧＡ　３゜九ＩＡ２：５’　ｃｃｃ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ＣＧＣＴＴＣＧＴＣＧＡ　３’ＭＡ３：５°ＧＡＡ　ＣＧＣＣＣＧ　ＴＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣＡＴＴ　ＣＡＣＧＡＧ　ＧＡＧ　３゜ＭＡ４：５’　ｃｃｃ　ＣＡＡ　ＣＡＣＧＧＴ　ＣＧＧ　ＡＣＡ　ＧＧＣＣＴＴ　ＣＣＴ　ＣＧＡ　３゜を有する。

増幅された断片は、アガロース又はポリアクリルアミド・ゲル電気泳動の後、又はキャピラリー電気泳動の後、又はあるいはクロマトグラフの技術（ゲル濾過、疎水性又はイオン交換クロマトグラフィー）の後、同定されることができる。増幅の特異性は、プローブとして、ヌクレオチド配列Ｉ６又は１１、それらの断片、これらの配列又はそれらの断片を含むプラスミド、これらの配列又は配列の断片に相補的なオリゴヌクレオチド、又は増幅の生成物を使用した分子ハイブリダイゼーションにより制御されることができる。これらのプローブは、放射性元素により又は非放射性分子により、標識付は等されることができる。

これらのプローブは、有利には、先に述べた配列又はその配列の断片の中に少なくとも２ｏの連続したヌクレオチドを含んで成り、そして本発明のその他の対象を構成する。

このプローブは、ＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブである。

本発明中で記載される核酸配列は、それ故、生物学的サンプル中のマイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックスに属する株を特異的に且つ直接的に検出するためのプローブとして使用されることができる。非標識配列がプローブとして直接的に使用されることができる。しかしながら、この核酸配列は、多数の用途のために使用されることができるプローブを得るために、一般的に、放射性元素（”Ｐ　、　”Ｓ　、　３Ｈ１”　Ｄｔ＝ヨリ又ハ非放射ｎｏｆｌｕｏｒｅｎｅ）　、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）　、５−ブロモデオキシウリジン（５−ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒ　ｉｄ　１ｎｅ）により標識される。後者の場合においては、ＦＲ２，４２２，９５６及びＦＲ２，５１８，７５５中に記載された標識付は方法の中の１つを使用することができる。このハイブリダイゼーション技術を、様々な方法において行うことができるＱｌａｔｔｈｅｗｓ、　Ｊ、　Ａ。

ａｎｄ　Ｋｒ１ｃｋａ、Ｌ、Ｊ、、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９８８．　１６９゜１−２５）。最も広く使用される方法は、支持体にトロセルロース、ナイロン、ポリスチレン等）上にマイクバクテリア細胞から抽出された核酸を固定化し、そしてよく定められた条件下で、その固定化された標的核酸を上記プローブ核酸と共にインキュベートすることから成る。ハイブリダイゼーション後、過剰のプローブを取り除き、そして形成されたハイブリッド分子を、適当な方法（そのプローブ等に結合した放射能、蛍光又は酵素活性の測定）により検出する。

他の用途においては、ここに記載する核酸プローブを、捕獲プローブとして使用することができる。この方法においては、このプローブを、支持体上に固定化し、そして特異的ハイブリダイゼーションによりそのマイコバクテリアから抽出された標的核酸を捕獲するために使用する。必要な場合は、この固体支持体を、サンプルから分離し、そしてその捕獲プローブと標的核酸との間に形成された２本鎖を、次に、容易に検出できる要素により標識された第二検出プローブにより検出する。

十分な量のマイコバクテリアの核酸が分析されるべきサンプルから抽出されることができるとき、本特許中に記載された配列を、これらのサンプル中で直接的にマイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックスに属する株を検出及び同定するために使用することができる。これらと反対の場合には、液体培地中の速い培養が、マイコバクテリア核酸の抽出前に行われることができ、あるいは、そのサンプルから抽出された少量のマイコバクテリア核酸を、ＰＣＲ技術に供することができる。

また、本発明の対象は、生物学的サンプル中のマイコバクテリウム・アビウム− イントラセルラー・コンプレックスに属する株の存在の検出方法であって、以下の段階：ｌ）そのサンプル中に含まれる核酸を適切にはハイブリダイゼーションに前もって利用しやすいようにし、そしてマイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックスに属する株の核酸へのそのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、生物学的サンプルを、先に定義したようなプライマーといわれる１対の核酸断片と接触させるように持っていき；ｌｌ）マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックスに属する株の核酸を増幅し：１ｉｉ）そのプライマーに隣接した断片に対応する核酸断片の増幅を可視化し；ｉｖ）例えば、特異的プローブ・ハイブリダイゼーションにより、配列決定により又は制限部位分析により、その増幅断片の配列を場合により確認すること、を特徴とする方法でもある。

本発明の対象は、さらに、生物学的サンプル中のマイコバクテリウム・アビウム −イントラセルラー・コンプレックスに属する株の存在の検出のためのキットであり、以下の要素ニー先に定義したような１対の核酸断片ニーマイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックスに属する株の核酸の増幅を行うために必要な試薬ニー場合により、増幅された断片の配列を確認することができる成分、さらに特に先に定義したヌクレオチド・プローブ、を含んで成ることを特徴とするキットである。

このキットは、より有利には、標識された又は標識されていないプローブを含む。これらは、溶液中にあり又は支持体上に固定化されることができる。また、このキットは、マイコバクテリアの溶菌及び標的核酸の抽出、並びにハイブリダイゼーション及び選ばれた方法に対応した洗浄溶液に必要な試薬も含むことができる。

本発明は、以下の記載中により詳細に説明するが、このためには、添付図を参照すべきであり、図中ニー図１は、オリゴヌクレオチド・プライマーの選択に好適なヌクレオチド配列を表している。

一図２は、コスミドＤＮＡのコスミドＤＮＡ　＋６のサザン・プロット分析を表し、３μｇに大体対応する１５μＩのＤＮＡを、１０ユニツトの酵素５ａｉｌにより消化した。電気泳動後、ＤＮＡを、ニトロセルロース上矢印は、１６４２塩基対の関連断片を示している。

−図３は、コスミドＤＮＡ　［１のサザン・プロット分析を表している。

３μｇに大体対応する１５μｌのコスミドＤＮＡを、１０単位の酵素５ａ１１により消化した。電気泳動後、ＤＮＡを、ニトロセルロース上に転矢印は、２００４塩基対の関連断片を示している。

−図４は、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｊｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）のＤＮＡのサザン・プロット分析を表している。

２μｇのＤＮＡを、ｌＯユニットの酵素圏により消化した。電気泳動後、ＤＮＡを、ニトロセルロースに転移させ、そして２５μｇの放射標識した、＋６から得られたＳａ　ｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズした。このプローブは、血清型ｌ、２．３．４．５．６．８．９．１０．１１及び２１内の断片を検出する。

一図５は、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）のＤＮＡのサザン・プロット分析を表している。

２μｇのＤＮＡを、１０ユニツトの酵素煕により消化した。電気泳動後、ＤＮＡを、ニトロセルロースに転移させ、そして２５μｇの放射標識した、【１から得られたＳａｉｌ−Ｂａｍ旧断片とハイブリダイズした。このプローブは、血清型２．３．７．１２．１３．１４．１５．１６．１７．１８．１９．２０．２３．２４及び２５内の断片を検出する。

−図６は、増幅されたサンプルのアガロース・ゲル分析を表している。

図１中に記載したプライマーの対により増幅され、且つ断片１６から得られたサンプルのｌＯμｌを、ＴＡＢ中の２％アガロース・ゲル上に置く。血清型ｌ、２．３．４．５．６．８．９、ｌＯ，ｌｌ及び２１に対応する増幅された断片を、臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）の存在中でＵＶ下で可視化する。

−［Ｎ７は、増幅されたサンプルのアガロース・ゲル分析を表している。

断片１１から得られたオリゴヌクレオチド嚇３及びＭＡ４により増幅された１０ μｍのサンプルを、ＴＡＥ中の２％アガロース・ゲル上に置く。

血清型２．３．７．１２．１３．１４．１５．１６．１７．１８．１９．２０．２３．２４及び２５に対応する増幅された断片を、臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒａｍｉｄｅ）の存在中でＵＶ下で可視化する。

−図８は、断片１６（Ａ）及び１１（Ｂ）を配列決定するために辿られる戦略図を表す。

鳥結核菌（血清型２）のゲノムＤＮＡを、供給者により推奨されたバッファー中のＤＮＡのμｇ当たりの０．０３０の酵素を、１時間３７°Ｃにおいて反応させることにより制限エンドヌクレアーゼ’５ａｉｌにより部分的に消化する。このように消化されたゲノムＤＮＡを、０．４％アガロース・ゲル上の電気泳動により分離する。その長さが３０と４０ｋｂとの間にある断片を、電気溶出させ、そしてフェノール／クロロホルム（ｌ／１）抽出後エタノールにより沈降させる。

ベクターは、コスミドｐＨＣ７９である。それを、同様なやり方で消化し、そしていずれかの自己結合を避けるために脱リン酸化する。

結合を、７００ｎｇのベクター、０．８μｇの、３０／４０ｋｂのＤＮＡ断片を混合することにより行い、この混合物を、適切なバッファー中の２゜５ユニットのＴ４　ＤＮＡリガーセを添加された後、１８時間、１４℃において放置する。

組換えコスミドを、インビトロにおいてバゲージングし、そしてバクテリア（ＨＢＩＯ＋）を形質転換するために使用する。この形質転換されたバクテリアを、ＬＢ培地中で３７°Ｃにおいて１時間インキュベートし、そして次に、２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む選択培地上にブレーティングする。このアンピシリン耐性コロニーをすべて、テトラサイクリンに対するそれらの感受性についてテストするが、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔ）を不活性化し、そしてアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）を保存するために、そのベクター中に３０／４０ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されている。

アンピシリンに耐性（Ａｍｐ’　）で且つテトラサイクリンに感受性（Ｔｅｔ“ ）の第一の８０の形質転換体コロニーからのＤＮＡのミニ−調製を、アルカリ性溶菌技術に従って行う。これらの調製からのＤＮＡを、次に、制限エンドヌクレアーゼ５ａｌｔにより消化し、０．８％アガロース・ゲル上の電気泳動により分析し、そして次に、ナイロン・フィルター上に転移させる。このＤＮＡを、２５４ｎｍにおけるＵｖに５分間露出させることにより不可逆的に結合させる。

これらの様々なフィルターを、１０％硫酸デキストラン、５Ｘ！ＩＤｅｎｈａｒａｔ溶液（０，０２％Ｆｉｃｏｌｌ　、０．０２％ポリビニルピロリドン及び０．０２％ウシ血清アルブミンに対応するＩＸ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液）　、ｌｏｍＭ　ＥＤＴＡ、ライミング（ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｉｎｇ）により３２リンにより放射標識された変性サケ精子ＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ　、を含む６Ｘ　ＳＳＣバッフ　ｙ　（０，１５Ｍ　ＮａＣ１及び０．０１５Ｍクエン酸Ｎａに対応するＩＸ　５ＳＣ）中で６８℃において１６−１８時間、インキュベートする。

ハイブリダイゼーション後、このフィルターを、６５°Ｃにおいて２ｘＳＳＣ中ＩＯ分間で２回、６５°（、ニオイテ０．１％　ＳＯＳを補ワレタ２ｘＳＳＣ中３０分間で１回、そして最後に６５°Ｃにおいて０．１ＸＳＳＣ中ＩＯ分間で１回、洗浄する。未だ湿ったフィルターを、増感スクリーンにより一８０°Ｃにおいて１時間〜２日間、オートラジオグラフィーにかける。

これらのハイブリダイゼーションの結果は、約２ｋｂの断片を含む２つのコスミド・クローンであって＋６及び］ｌといわれるものを単離することを可能にする。

断片１６は、鳥結核菌のゲノムＤＮＡだけとハイブリダイズし、断片■６は、鳥結核菌及びマイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｌ」核菌（Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）　Ｈ３７ｒｖの標識ＤＮＡと／％イブリダイズしない（図２及び３）。

断片■６及び１１を、ベクターｐＵｃ１８中にクローン化し、そして大量に調製した。得られたプラスミドを、それぞれ、ｐＭＡｏ　１及びｐＭＡｏ２といった。

これらの断片を、酵素Ｓｍａｌ、　ＢａｍＨＩ　、　Ｐｓｔｌ及びＥｃｏＲＩにより解裂させ、そして次に、ファージＭ１３ｍｐ１８及びＩＪ１３ｍｐ１９中にクローン化し、そしてｄＧＴＰの代わりにｄ−ａｚａＧＴＰの存在中でＴａｑポリメラーゼを使用するＳａｎｇｅｒ法に従って配列決定した。すべての配列決定反応を、３ｓＳ標識ＡＴＰにより行った。

図８のダイアグラムは、断片１６及び１１の配列決定のために辿られる戦略を表している。

この断片の完全な配列を、添付書類中に表す（配列番号ｌ及び配列番号２は、それぞれ、断片Ｉ６及び断片１１に対応する。）。Ｌｏｓ　Ａｔａｍｏｓデータ・バンクの全体と断片１６の１６４２ヌクレオチド及び断片１１の２００４ヌクレオチドとの間の組成であってこのように決定したものは、最近知られた配列と有意な相同性を全く現していなし１゜本発明を、以下の例により説明する：例１ニプローブとして本発明の核酸配列を使用したサザン技術（＝よるマイコバクテリアＤＮＡの分析。

本研究において使用したマイコＩくクチリアのリストを、以下の表中に与える。

表、使用した株の名称零　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　［ｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｅネネ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ本本ネ　Ｔｒｕｄｅａｕ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ　ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＬｏｗｅｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＬｏ又はＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ　７）１９培地上の培養の後、マイコバクテリアを、以下の技術を使用して溶菌させる：バクテリアを、７０００ｇにおいて３０分間遠心分離し、１００μｇ／ｍｌのＤ−シクロセリン、１４μｇ／ｍｌのグリシン、２００　、ｃｚｇ／ｍｌのりソザイム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）及び６ｍＭのＥＤＴＡを含む７Ｈ９培地の２０ｍ　ｌ中に再懸濁させ、そして５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ８，５０ｍ１Ｊ　ＥＤＴＡ　、　１００ｍＭ　ＮａＣ１，０，５％ＳＤＳから成りそして６０μｇ／ｍｌのプロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）を含む４ｍｌの溶菌バッファー中で３７℃において１８時間インキュベートする。

溶菌後、ＤＮＡ５を、フェノール−クロロホルム混合物により抽出し、そしてエタノールにより沈降させる。このように抽出したＤＮＡ５を、酵素Ｐｓｔ［による全消化に供する。得られた断片を、次に、サザン技術に従ってニトロセルロース膜上に転移させる前にＴＥＡ中の０．８％アガロース・ゲル上の電気泳動により分離する。

転移された断片を、分子ハイブリダイゼーションにより分析する。

この例においては、使用したプローブは、酵素５ａｉｌ及びＥｃｏＲＩによる断片［６の消化により抽出された７００塩基対の断片及びＡｍｅｒｓｈａｍにより市場に出された”マルチプライム（Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ）”キットの技術に従って３！リンにより標識されているｐ＆ＩＡＯ２である。この結果を、図４及び５中に表す。

配列１６から得られたプローブは、鳥結核菌（血清型ｌ、２．３．５．６．８．９．１Ｏ１１１及び２１）のＤＮＡ５をもつ２つの断片及び血清型４を担持する株のＤＮＡ５をもっただ１つの断片を検出する。これらの断片のサイズは、テストされた株により変化し、これにより、異なったパターンがサザン・プロッティングにより得られる（図４）。

配列１！を含むプローブｐ＆ＩＡＯ２は、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー株（血清型２．３．７．１２．１３．１４．１５．１６、得られた断片のサイズは、変化し、そして約５と２０ｋｂとの間にある（図５）。

例２：本発明の対象である核酸配列から定めされたプライマーによるマイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー株のＤＮＡのインビトロにおける酵素的増幅。

オリゴヌクレオチド・プライマーの合成配列！６及びＩＩから得られ、そして１８と２２との間の長さのヌクレオチドをもつプライマーを、ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓの化学に基づ＜　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍの自動装置内で合成した。合成後、オリゴヌクレオチド溶液を、ガラス・チューブ中に移し、そして４時間５０℃において濃水酸化アンモニウムと共にインキュベートする。この水酸化アンモニウムを次に５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ／Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ内で蒸発させ、そしてそのペレットを滅菌蒸留水により２回洗浄し、そして乾燥させる。最後に、このペレットを、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．５ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣＩ／＜　ツファー１使用して測定し、そしてアリコツトを、そのプライマーが分解していることを確認するためにポリアクリルアミド・ゲル上の電気泳動により分析する。

マイコバクチ１功ムＤＮＡの単離生物学的抽出物を、適切なやり方で処理し、そして次に遠心分離する。このＤＮＡを、２Ｍ　ＮａＣｌ及び０．５％ＳＤＳを含む０．１ＭＮａ０）Ｉの５０μｌにより再懸濁させることにより抽出する。この混合液を、９５°Ｃにおいて１５分間インキュベートＬ　：４００μｍの０．ＩＬＩ　Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ　、　ｐＨ７を、反応混合物に添加する。このＤＮＡを、フェノール／クロロホルムにより３回抽出し、エタノールにより沈降させ、そして０．１ｄ　ＥＤＴＡを含む１０ｍ！Ｊ　Ｔｒｉｓバッファーの５０μｌ中に溶かす。

増幅インビトロにおける酵素による増幅技術（ＰＣＲ）を、５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａ！。

（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　１９８８．２３９．４８７−４９１）により記載された手順に従って、図１中のプライマー番号ｌの対のオリゴヌクレオチドの１２．５μ ｍｏｌ、一方において又はＭＡ３及びＭＡ４　、他方において、そして５０ｎｔｌ　ＫＣＩ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ８，３，２ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、３００　μＭのデオキシリボヌクレオチド・トリホスフェート及び１００ μｇ／ｍｌのゼラチンを含むバッファー中の２ユニツトのＴａｑポリメラーゼによるマイコバクテリアの異なる株のＤＮＡの５μｇを使用して、反応の最終容量を１００μＩにしながら、行う。ＰＣＲ段階のためのパラメーターを、以下のやり方において選んだ１９４°Ｃにおいて２分間、５０°Ｃにおいて２分間、７２ °Ｃにおいて２分間。３０サイクルを、自動装置を使用して行う。最後のサイクルの後、サンプルを、分析まで４°Ｃにおいて維持する。

増幅サンプルのアガロース・ゲル上の電気泳動分析１０μｍのサンプルを、１μ ｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含むＴＥＡバッファ　−（０，０４＾Ｉ　Ｔｒｉｓ −アセテート、０．００１Ｍ　ＥＤＴＡ）中の２％アガロース・ゲル上に供給する。この増幅断片を、Ｕｖ下で可視化し、そのゲルを、Ｐｏ１ａｒｏｉｄ　６６７フイルムを使用して写真を採る。

図６及び７は、一方において異なるマイコバクテリアＤＮＡ５及びプライマー番号１の対（図６）により、及び他方においてプライマーＭＡ３及びＭＡ４（図７）により得られた結果を示す。

プライマー番号１の対を使用するとき、予測サイズに対応するＤＮプライマー番号ｌの対がバラ結核菌の検出を可能にし、獣医学の分野において使用され得る方法を作る。実際に、パラ結核菌（Ｍ、　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は、反別動物におけるＪｏｈｎｅ’　Ｓ病の原因である。この病気は、経済的驚異を有しており：それは、肉及び牛乳の生産の損失をもたらし、そのコストは、米国内において、１年間に１０（ｔドルにと見積もられている。

プライマーＭＡ３及びＭＡ４の対を使用するとき、予測サイズに対応するＤＮＡ断片は、以下マイコバクチ１功ムア結核菌Ｑ１．ａｖｉｕｍ）（血清型２．３．７、！２、Ｉ３．１４．１５．１６．１７．１８．１９．２０．２３．２４及び２５）により観察される。

中の１つ、ＡｌＡｌ及びＭＡ２の対又はＭＡ３及びＭＡ４の対を増幅に向けるために使用するとき、増幅断片は、全く見えない。

配列表１−一般情報（１）出願人　ｌＮ５ＴＩＴＵＴ　ＰＡＳＴＥＵＲ（２）発明の名称・マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレ・ノクスのバクテリア株と特異的にノツブリダイズするヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチド・プライマー、ヌクレオチド・プローブとしてのそれらの使用、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラー・コンプレックスに属するマイコノくクチリアの同定法、その方法を行うためのキット。

（３）配列数２１１−配列番号ｌの情味配列の特徴形：ヌクレオチド長さ１６４２塩基対素置、　一本ｊ貞トポロジー　直鎖分子タイプＤＮＡ生物、マイコバクチ１功ム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）名称、Ｉ−６配列Ｃ入　αＸ講　α刀ｕＴｃＪ端ＣαＸ込ｅＣＱＸ工＊ＧＣＣＧＣＣＣｎ（？ｒＧＡｎＴＣＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣｚｃｃｃｃＣＡ　σｒＧＴＣＣＣＡ２ＧＧＧＡＧＡＣＧＡＴＣｌ１１＝配列番号２の情報配列の特徴形：ヌクレオチド長さ・２００４塩基対鎖ニ一本鎖トポロジー：直鎖分子タイプ：　ＤＮＡ生物：マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）名称＝１−１配列１０　２０　３０　４０　Ｓ。

ＧＴＣＧＡα；ＣＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＡＣＧＡＣＡ　ＣＧＧＣＡＣＧＡＴＣＧＣＧＡＡ印Ｇ工鮎（Ａ σα云℃工ＭＣＡＴＴＣＡＱｌａＡＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＣＴＣＡＣＣ国■鮎ＣＣＴｒαスＣＡＡＴ工工ＯπズπＱＴＧＣＣＡＧＧＴＣ＾ｆｆ１ＴＧＡＴｃＧｃＧ＾ＡＴＧ入＾　Ｃ＾丁＾ｃｃｃ’ｒＡＣｆｌＣＧＧＣＣＡ　ＣＡＧＣＡ　ＧＣＧＡＴＣＣＡＡＣＴＡｅＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡ　ＴＧＴＧＧＴＴＣαゴＧＧＧＣＧＣＣＧＣＡπを緑品　σπ草℃χＣＡＣ（Ｊｔ（ＪＬＴｒＡＡｕヱＣＡＴＣＣＡＣＣＣｎＴＧＡＡα京π工ＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＧ１’ＡＡＣＧＴｒＣＣα ｚｃｃｃｃｃｍαａｃＧＧＧＡＡα詰父ｃｒ胃ＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴｒＣＣＣＧＴｒＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＣＣＧＧＴｒＣＡＡＣＧＧＣＣＧＴＧＣＧＣＡＴＣＧＡＧＴＧＴＣｍＣＣＧＴＡ　ＧＣＧＧｒＣＧＡＧＧＭＧＧＣＣＴＧｒＣＣＧＡＣＣＧＴＣＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧｒＡＧＣＩ’ＧＴＣＣＡＧＧＣＣＧＡＴＣＣＡ８１０　８２０　８３０　８４０　ＢＳ＋１ＧＴＧＡＡＧＣＣＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＧＣＣα論、ＡＣＣＣＧＡＡＣＧＴ′ＧＣＡＣＣＡＧＣＣＧＴＣＧＧＧＴＴＣＣＧＣＣＧＣＡＣＧＣＡＡＣＧＣＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＧＧＡＣＴＴＧＴ’ＣＧＧＣ’ｒＴＣＧＡＣＣＴＧＧＧＧＡＡＴＣＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧＣＡＡＣＧＡＣＣｎ’ＣＡＡＡＣＣＣＧＣＧα工；ＴＣＧ１’ＡαχτＣｒＣ■℃Ｇα−ＡＧＧＣＧＡＧＧＴＡｃｃｒｃｃｒ′ｒＡα工ＡＴＧＡＧＯＪＴＧＣ（ｍ工ｉ’ｒＡＧｃ？Ｃα：ＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＣＡＡＣＣＣＧＧＣＧＣＧＧＴ’ＧＧＣＣＴＣＧＡ　Ｏ７■χに１ＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧ！’ｒＡＴＣＣＧＡＣＡＣＣＣＡＣＧＧＧＣＣＣＴｒＣＧＡ　ＴＣＡＧＴＣＣＯ；Ｎズ−＾ＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡコ−ＣＡＴＡＣＡＧＡＴＡＫスフＧＧＴに講ＧＧＣＣＣＡＣＣＧＣＧＣＧＡＣ［Ｖ−配列番号１から得られたプライマー（配列番号３〜配列番号５８）を構成するヌクレオチド配列の対の番号１〜２８情報配列の特徴形　ヌクレオチド長さ３０塩基鎖　一本鎖トポロジー　直鎖分子タイプ・ＤＮＡ生物　マイコバクテリウム・アビウムＱＪｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）配列プライマー対番号ｌ配列番号３・　５’　Ａ　気＝とα℃χ２π入Ｃ３・配列番号４：　ｓ’　国− ｚスＡＣＡ　３Ｃプライマ一対番号２゜配列番号５５・　πα窓℃にと３゜配列番号’５’ＡＡ□□３゜プライマー対番号３配列番号７　：　５　’　Ａ□ＧＡＣＧＡＴＣｒＡＴＧＣＣＧαπｒＡＣ３”配列番号８　：　ｓ　′ＧＡＡ（ｌｘｃＣＣＴＧＡｃｃ（’ＧＣＡγ：π℃スＴＣＧＣ３′プライマー対番号４配列番号９５′Ａπ■恵℃スＧ、二Ａπに窟ｍＡｃ　３’配列番号１０：　５．ユい□□３゜プライマー対番号５ｆｉｌ　列番％　ｌ　ｌ　：　５　’　ＧＣＣＧＧＧＡＧＡＣＧＡＴＣｒＡＴＧＣＣＧＧＣＧｒＡＣＯＧＧ　３　’配列番号＋２５’　ｍＴｃＧｃＡ＄ＧｃＧα ｒＡｃＡ３’プライマー対番号６・配列１号１３：　５’　ＧＣα；ＣＧＡＴＣＴＡｆｆｌＡＣＣＧＧ　３　’配列番号！”　５’　ＡＡＣＡＣＣＣＴＧＡ　ＴＣＧＣＡ　３’プライマー対番号７配列番号１５：５’ＧｃαｎＧＡｃＧＡ’ｌ”ＣＴＡ！ＡＣＣＧＧ　３’配列番号１”’　５’　ＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣＧＴＴＣＧＡＴＣＧＣ３’プライマ一対番号８配列番号１７：　５’　ｍｃｃＧＧ３’配列番号１８５．ユ。□□っ３゜プライマー対番号９゜配列番号１９５′　工ｇニ℃スαコ込■３Ｃ配列番号２０：　ｓ・ＣＧＴＴＱＩ；Ａ　ＧｃＧｃｇｒＡｃｑ　３′プライマー対番号ＩＯ配列番号２１：　５′α忘ｌα臥α桝工Ｍα℃工αスαゴＡＡＣＧ　３’配Ｊ’ １　番号２２　：　ｓ・ＡＡＣＡＣＣコヱエユγ宸π℃惺τα込３・プライマー対番号１１配列番号２３５’　ＣＣＧＧＣＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＣＧＣＣＧＧＧＡＣ口’ＭＣＧ　３’配夕１１番号２”　５’　ＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣＧＴｒＣＧＡＴＣＧＣ３’プライマー対番号１２配列番号２５５′　工■コ力惺ＣＣＴＡＡＣＧ　３’配列番号２６：　５’　ＣＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＡ　ＴＧＣ３’プライマー対番号１３配列番号２７：５’ＴＣＡＡ工ＧＣＴＡα℃α（６）刀匡α、ヤ。つ工３゜配夕 ′１番号２８°　５’　Ｔｃ）−Ｃ０−ｒＣＣＡノχ品３゜プライマー対番号１４ｆｆｉ−列番号２９　；　５　’　ＧＣＩ’Ａ　３　・配列番号３０：　５’　ＴＣＡαＶ℃スωｌ緑ロ京コゴ■π℃論、。

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配列番号１０３：　５’πｎＡＧＣＡＡＴＧＣＧＡＴＧＣＧＣＧＧＡＴＣＱＡ　３　’配列番号１０４：５　’　ｍＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴ１’ＣＣＧＡＴＣＧＩ’Ｃ３’プライマー対番号５２、配列番号１０６：　５”！’ＣＧＴ３’プライマー対番号５３：配列番号１０７：　５′＝１ＣＣＧＴ　３’配列番号１０８：　５．π２工つエエエ。ヵ。１いエヤ、。

プライマー対番号５４・配列番号１０ｇ　５’　πγにＤｘ℃工Ｍホｖユ冨に頷ＣｃＧＴ３　’配列番号１１０：　５’　ｍ　ＴＣＧＩ’　３’プライマ一対番号５５・配列１　号ｌｔ　ｌ：　ｓ　′ＧＴＡｘυい℃ＣＫＸｇｚスπロ℃α云刀３′配列番号＋１２：　５・χソαでユ　、ＴＣＧｒＣ３・プライマー対番号５６・配列番号＋　１３　：　５　’　ＧＴＡＧＣＭ’ｌ”ＧＣＧＡｅＴＣＧＡＣＣＧＴＣＧ　３　’配夕°１番号１１４５・ａαスＧＧＣＣＡ匡γ京コ刀ａπ買、ヤ。３゜プライマー対番号５７：配列８号１１５・５’　ＣＣＡＣＣＡＣＡπワ刀α云スα込印πα詰Ｔ工３′配列番号１１６・５’　ＴＣＣ□、□。−３゜プライマー対番号５日。

配列番号１１７：　５’αスα”’　ＴＣＣ３′配列番号１１８：　５”ＴＡ　ＴＡａ、ＴＴＣ３’プライマー対番号５９：配列番号１２°°　５・ニー国よ。、エエ。？ＡＣＧＧ。３゜プライマー対番号６゜配列番号１２１：　５・αスαス　、３゜配列番号１２２’　５ｊ　ｃｃＧｃｒＡ−ＴＡＣＧ　３−プライマー対番号６１゜配列番号１２３：　５１αスαス□＝窺頂ｆｆｌい。１、い工３Ｉ配列１％Ｉ２４・　５・πＣ工ぐスπ窺ユ２頭よ、。工。ユ、３゜プライマー対番号６２；配列番号＋２５：　５’　ＣＡＣＣＡＣＡｎＣＧＡＧＴＩ’Ｃ艶ｆｒｃＧＧ３’ 配列番号１２６：　５．’ｒｃｃｃｏワ、イＣＱＡＣＴＡ　３’プライマー対番号６３・配列番号＋２７：　５’　ＣＡＣＣＡＣＡ３ＣＧＡＧＴｒ’ＣＧＡＴＣＧＧ　３ ’配列番号＋２８：　５・ＴＡＴＧＧＣＡＧＡＣいオゆ、□。３゜プライマー対番号６４配列番号＋２９：　５’　ＣＡＣＣＡＣＡｍＣＧＡＧＴＴＣＧＡＴαＤ３’配列番号＋３０：　５．。ヤ。工やよっ。ア。。ユニＴＡＣＧＧＴＩ’　３　’プライマー対番号６５・配列番号＋３］：　５’　ｃＡ匡にχ〒２東πスαス♂にグ藻３′配列番号１３２：　Ｓ’　ｃｃつつぃヤ、ユニよ。１ウユアｒＡＣＧ３’プライマー対番号６６：配列番号１３３・　５・Ｇαス　α込ａｉ工Ｍ立Ｅ３’配列番号１３４’　５’ 　ＴＧＣ国ロトーａＧＡ　ＴＡ　３’プライマー対番号６７配列番号１３５：　Ｓ’　α＊刀鯖３′配列番号１３６：　５＋□□□３゜プライマー対番号６８゜配列番号＋３７’　５’　ＴＧＩ’！　＄７３’プライマ一対番号６９・配列番号１３９：　ｓ’　ｃ’ｒｃα７ｅＣＧＴＣＧＧＡＴＡＧｒＣＧＴＴ　３　’配列番号””　５’　ＧＡＴｒ’ＧＡＣＧＧＣｍＩＣＧＡ　３’プライマー対番号７０゜配列番号＋４１：　５’　ＧＣＣＧＡ　ｃｃＧＭｃｃＧｒＡ　３′配列番号１４２：　５・ユ７ヮいヤ、。、カニ。。７エゆ。２３゜プライマー対番号７■。

配列番号＋４３：　５’　ＧＣＣＱＡ　’ＣＣＧＡＡＣＣＧｒＡ　３’配列番号１４４：　５．い。。ヤニや、ヵ、ヤ。。っユＣＡＴｒＡ　３・プライマー対番号７２：配列番号１４５：　５’ω論口−ロ以（６）−χＣαｎ驕−Ｔ３’配列番号１４６：　５’　頷ＴＴＧＡｍ、３゜プライマー対番号７３：配列番号１４７・　５′ω詰口−ロ以なＷぬ≧ｃ鳴工。ユ、３゜ｉＥ　′ｊ！１番引”　”　’　Ｍζａワ刀ヤ。７ｏツ、ＣＡＴｒＡ　３　。

プライマー対番号７４・配列番号１４９：　５’　Ａ　ＣＣＧＡＡＣＣＧＴＡＴＧＣＧ　３’３列番号１５０：　５・いπ−−父γ□ウヵいっ、え、つ、。

プライマー対番号７５゜配列番号”””　Ｓ’　Ａ　ＣＣＧＡＡＣＣＧＴＡＴＧＣＧ　３’配列番号１５２°５・ＡＡＧ’ｌα迫工ゎヤ。５ｏｏエユ。、３゜プライマー対番号７６配列番号１５３：　５’　τ国国３・配列番号＋５４：　５Ｉ３’ プライマー対番号７７：配列番号１５５：　５’　”ｆｆｌ’　ｃＣｃＡＡｃｃｃ’ｒａ’ｒｃｃｃｃｃ　３’配列番号１５６・　５・Ｍα℃χつ、９カい７、ヤ、っ。いユ、。

プライマー対番号７８゜配列番号１５７．　５’αＮλ印υＸ酩隨α口℃℃とαχコス３・配列番号１５８：　５・国−ｚｘス匡ＧＡ　ｆｆ１３・プライマー対番号７９配列番号１５９：　５・α訣コαムμπ表ｆｆｌスＣπＧＡＣＧＣＡ　３’配列番号１６０：５’　ＴＩ’Ａ　ＡＣＣＣＣＧＡ５３’Ｖｌ−配列番号ｌから得られたプライマー（配列番号１６１〜配列番号１６２）を構成するヌクレオチド配列の対の番号８０の情報配列の特徴形　ヌクレオチド長さ２０塩基鎖、−重鎖トポロジー、直鎖分子タイプ・ＤＮＡ生物、マイコバクテリウム・アビウムＱｌｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）名称：ＭＡｌ−ＭＡ２配列配列番号１６”　”ＧＧＣＣＣＧ　ＡＴＧ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　ＣＧＡ　ＧＡ”配列番号！６２：　”ＧＣＧ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ｃａｃ　ＴＴＣＧＴＣＧＡ”ＶＩ［−配列番号２から得られたプライマー（配列番号１６３〜配列番号１６４）を構成するヌクレオチド配列の対の番号８１の情報配列の特徴形、ヌクレオチド長さ・３０塩基鎖　−重鎮トポロジー　直鎖分子タイプＤＮＡ名称・ＭＡ３−ＭＡ４配列配列番号１６３’　”ＧＡＡ　ＣＧＣＣＣＧ　ＴＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣＡＴＴ　ＣＡＣＧＡＧ　ＧＡＧ配列番号Ｉ６４’　”ＧＣＧ　ＣＡＡ　ＣＡＣＧＧＴ　ＣＧＧ　ＡＣＡ　ＧＧＣＣＴＴ。。ア。。。

ｃｏｕｐｌｅ　ｄ″ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０１　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０２　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０３　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’４　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’５　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’６　：５′　α：’ＣＧＧＧＡＧＡＣＧＡＴＣＴＡＴＧＣＣＧＧＣＧＴＡＣαＤ３’５’　ＭＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣＧＴｒＣＧＡＴＣα譜３１ｃＯｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’７　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ′ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’８　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ ’ａｒｎｏｒｃｅｓ　ｎ’９　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’ｌｏ　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎｏｌｌ　＝５　’　ＧＭＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣＧＴＴＣＧＡＴＣＧＣ３’５’　ＣＧＭＣＡＣα？ＴＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣＧＴｒＣＧＡＴＧＣ３’ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’１３　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’１４　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’１５　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａＩＴ１０ｒｃｅｓ　ｎ’１６　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’１７　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’１８　：５　’　ＧＣＣＣＧＣＧＴＧＡＡ’ＩＴＣＣＧＣＣＧＩ’Ｇ（？ＴＣＧＡＣＧＡＡ　３　’５　’　ＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧＴＣＧＡＧＴＧＡＴＣＧＣＧＡＡＴ　３　’ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’１９　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’２０　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ”２１　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０２２　＝ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ”２３　：ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０２４　：５’　ＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＡＡＴＣＧＡＧＡＴ’ｒＣＧＣＧ　３’５’　ＧＣＣＡＣＧＡＴＡＴＣＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＣＣＧＣＧＴＡＡＴ　３’ＦＩＧ、１　（ｓｕ’＋ｔｅ）Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０３５：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０３６：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’３７：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’　３８　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ ’　３９　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’４ｏ　：５　’　ＡＴＣＧＡＧＴＧＴＣＣＧＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＣＧＴＡＴαに３１５　’　ＧＣＧＣＧＣＣＧＣＧＧＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＧＡＴＡ　３　’ＦＩＧ、１　（ｓｕ’＋ｔｅ）Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０４１　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０４２　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’　４３　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’　４４　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０４５　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’　４６：５　’　ＣＧＡＧＴＧＴＣＣＧＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＣＧＴＡＴＣＧＧＣＧ　３　’５　 ’　ＧＣＧＣＣＧＣＧＧＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＧＡＴＡＣＡ　３　’ Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０１＋、７　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０４８：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０４９　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０Ｓｏ　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ′ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’　５１　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎｏ　５２　：５　’ 　ＴＧＣＴＣＴＧＴＡＧＣＡＡＴＧＣＧＡＴＧＣＧＣＧＧＡＴＣＧＡ　３　’５　’　ＧＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴ　３　 ’ＦＩＧ、１　（ｓｕ’＊ｔｅ）Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’ｓ３　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ′ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’ｓ４　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’ｓｓ　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０ｓ６　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’　５７５Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’　５８　：５’　ＣＣＡＣＣＡＣＡＴＴＧＣＧＧＧＴＧＡＣＧＡＧＴｒＣＧＡＴＣＧ　３’５’　ＴＡＴＧＧＣＡＧＡＣＧＡＧＧ’１ＴＣＧＣＧＣＡＴＡＣＧＧＴｒＣ３’Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’６０　：Ｃ０ｕｐｌｅｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’ ６ｔ　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’ｇｚ　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’６３　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ′ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’６４　：５　’　ＣＡＣＣＡＣＡＴｒＧＣＧＧＧＴＧＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＴＣＧＧ　３　’５　’　ＣＴＡＴＧＧＣＡＧＡＣＧＡＧＧＴＴＣＧＣＧＣＡＴＡＣＧＧＴＴ　３　’Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ′ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’ｇｓ　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’６６　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０６７　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ′ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’６８　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０６９　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’７ｏ　：５ ′　α：ＣＧＡＣ’ｆｆｌ’ＣＡαＸ℃ＮズＸＡＣＣＧＡＡＣＣＧＴＡ　３’５ ’　ＧＡＴ’ｒＧＡＣＧＧＣＧＣＧＴＧＧＧＡＣＴＣＣＴＧＣＧＴＣＧＡ　３’ Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’７１　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’　７２　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’　７３　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’　７４　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’７ｓ　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’　７６　：５　 ”ＩＴｒＣＡＧＧＧＧＡＧＣＧＡＣＣＧＡＡＣＣＧＴＡＴＧＣＧＣＧ　３　’５　’　ＧＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＣＧＴＧＧＧＡＣＴＣＣＴＧＣＧＴＣＧＡ　３　 ’Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０７７　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ’　７８　：Ｃｏｕｐｌｅ　ｄ’ａｍｏｒｃｅｓ　ｎ０７９　：Ｓ ’　ＧＧＡＧＡＣＧＧＭＴＧＡＡＣＧＣＴＣＡＣＡＴＣＧＡＣＧＣＡ　３　’５ ′　ＴＴＡＴＣＧＧＴＧＧＴＴＧＣＧＴＧＴＡＣＣＣＣＧＡＴＣＣＧＧ３′Ａ　Ｂ　Ｃ一〇、８Ａ　Ｂ　Ｃｏ　−０８ ω へ５ａｌｔ　ＥｃｏＲＩ　ＢａｍＨＩ　Ｋｐｎｌ　５ｓＬＩ　５ａｌｔ１　１　１１＋　１ −−−３８−−−−＞　（＋＋５３＋−（−＋−５２＋−＋＋＋　（−７３−＋ −（−−−＋−１３−＋＋−−−−−１４−−−−＞　ｃ−４１−−−−−−− −４３−＞　−−−−−−４８−−−＝−１−３３−−−−１（−−５６−−− −−５３−−−−＞５ｉｌｌ　ρｓＬＩ　ＥｃｏＱＩ　ＢａｍＨＩ　５ａｌｌｌ　Ｉｔ　１．　１ −−−２９−−−＞　−＝７２−−＞　−−−４３−一−−＞　＜−−−−３６ −−−−＜−−１５−−−−＜−−−７８−−く−−３６ｏ１ｉ−−−＜−−− ７０−−”−−−＝７１−−＞　−−２２−−＞　−−−７７−−＞＜　−’　８１　−−−−　−一−４３ｏｌｉ−−−一−−−＞

Claims

【特許請求の範囲】１．マイコバクテリウム・アビウムーイントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｒ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）に属する株のゲノムの核酸配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列であって、ヌクレオチド配列番号１、ヌクレオチド配列番号２、これらと相補的な配列、並びに１以上の塩基の突然変異、挿入、欠失又は置換によりそれらとは異なっている配列から選ばれており、そしてこのコンプレックスに属しないマイコバクテリアの核酸とはハイブリダイズしない核酸配列。２．血清型２、３、７、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、２４及び２５を担持するマイコバクテリウム・アビウムーイントラセルラー・コンプレックス（Ｍ．ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅ１１ｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）に属する株のゲノムの核酸配列と特異的にハイブリダイズし、且つこのコンプレックスに属さないマイコバクテリアの核酸とはハイブリダイズしない核酸配列であって、請求項１に記載のヌクレオチド配列番号２、それらに相補的な配列、並びに１以上の塩基の突然変異、挿入、欠失又は置換によりそれらとは異なっている配列から成ることを特徴とする核酸配列。３．血清型１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１又は２１を担持する鳥結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）に属する株のゲノムの核酸配列と特異的にハイプリダイズする核酸配列であって、請求項１に記載のヌクレオチド配列番号１をもつ核酸配列をＳａ１１及びＥｃｏＲｌにより解裂させることにより得られる７００塩基対の核酸断片から成ることを特徴とする核酸配列。４．ヌクレオチド配列番号１、ヌクレオチド配列番号２及びそれらの相補的配列、並びに１以上の塩基の突然変異、挿入、欠失又は置換によりそれらとは異なっている配列から選ばれており、そして同一の特異性をもつ核酸配列。５．マイコバクテリウム・アビウムーイントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）に属する株の核酸配列の増幅に好適なオリゴヌクレオチド・プライマーであって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の配列から選ばれた、１８〜３０ヌクレオチド、好ましくは１８〜２２ヌクレオチドをもつオリゴヌクレオチドの対を含んで成ることを特徴とするプライマー。６．請求項５に記載のマイコバクテリウム・アビウムーイントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌｄａｒｅ　ｃｏｍｌｅｘ）に属する株の核酸配列の増幅に好適なオリゴヌクレオチドプライマーであって、図１中に表したヌクレオチド配列から選ばれた、少なくとも１８ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの対を含んで成ることを特徴とするプライマー。７．請求項５に記載のマイコバクテリウム・アビウムーイントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）に属する株の核酸配列の増幅に好適なオリゴヌクレオチドプライマーであって、一方において、オリゴヌクレオチド対ＭＡ１及びＭＡ２、そして他方において、ＭＡ２及びＭＡ３から成り、以下の配列：【配列があります】を有することを特徴とするプライマー。８．請求項４に記載の核酸配列を含むことを特徴とするクローニング・ベクター。９．１９９１年８月２８日にＣＮＣＭに第１−１１３７号の下で寄託されたプラスミドＰＭＯ１。１０．１９９１年８月２８日にＣＮＣＭに第１−１１３８号の下で寄託されたｐＭＡＯ２１１．マイコバクテリウム′アビウムーイントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）に属する株の核酸配列に特異的なヌクレオチド・プローブであって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の配列から選ばれた少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含んで成ることを特徴とするプローブ。１２．マイコバクテリウム・アビウムーイントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｕｍ　ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅＸ）に属する株の核酸配列に特異的なヌクレオチド・プローブであって、ヌクレオチド配列番号１、ヌクレオチド配列番号２、これらの配列の断片、これらの配列又はこれらの配列の断片を含むプラスミド、これらの配列又はこれらの配列の断片に相補的なオリゴヌクレオチド、あるいはこれらの配列又はこれらの配列の断片の増幅の生成物を含んで成ることを特徴とするプローブ。１３．請求項１２に記載の、マイコバクテリウム・アビウムーイントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ　ｍａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）に属する株の核酸配列に特異的なヌクレオチド・プローブであって、支持体上に固定化され、そして捕獲プローブとして使用されることを特徴とするプローブ。１４．生物学的サンプル中のマイコバクテリウム・アビウムーイントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）に属する株の存在の検出方法であって、以下の段階ｉ）そのサンプル中に含まれるマイコバクテリウム・アビウムーイントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）に属する株の核酸を適切には前もってハイブリダイゼーションに利用しやすいようにし、そしてマイコバクテリウムアビウムーイントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）に属する株の核酸へのそのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、その生物学的サンプルを、請求項５〜７のいずれか１項に記載のプライマーといわれる１対の核酸断片と接触させるように持っていき；ｉｉ）マイコバクテリウム・アビウムーイントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）に属する株の核酸を増幅し；ｉｉｉ）そのプライマーに隣接した断片に対応する核酸断片の増幅を可視化し；ｉｖ）例えば、特異的プローブ・ハイブリダイゼーシヨンにより、配列決定により又は制限部位分析により、その増幅断片の配列を場合により確認すること、を特徴とする方法。１５．生物学的サンプル中のマイコバクテリウム・アビウムーイントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）に属する株の存在の検出のためのキットであって、以下の要素： −請求項５〜７のいずれか１項に記載の１対の核酸断片：−マイコバクテリウム・アビウムーイントラセルラー・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）に属する株の核酸の増幅を行うために必要な試薬：−場合により、増幅された断片の配列を確認することができる成分、さらに特に請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のヌクレオチド・プローブ、を含んで成ることを特徴とするキット。