JPH03503837A - 公衆衛生、医学、および獣医学の実施におけるマイコバクテリアのための診断法およびワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 名称：　公衆衛生、医学、および獣医学の実施におけるマイコバクテリアのＩ； めの診断法およびワクチン序論 世界で３〜６百万の人々は、毎年、らい病および結核単独で死亡すると推定され る。異型マイコバクテリアによるヒトの病気は増加しつつある。結核および副結 核は、家畜において普通であり、主要な経済的損失の原因となり、そしてヒトの 病気の保有宿主を形成する。ＢＣＧワクチンおよびいくつかの効果的な薬物にか かわらず、マイコバクテリアの病気は主要な地球全体の問題でありつづける。

ヒトおよび動物の病気からの試料中のマイコバクテリアの同定および特徴づけの 現在の方法は、ゼイルーネイルソンの着色（Ｚｅｉｌｎｅｉｌｕｓｏｎ　　ｓｔ ａｎｉｎｉｇ）、生体外および生体内の培養、生化学的試験および血清学的型の 決定による〔１コ。これらの方法は、一般に、遅く、そして密接に関係するマイ クバクテリアの菌株と種、とくに、例えば、バラ結核［１（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ　　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびトリ結核菌（Ｍｙｃｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ａｖｉｕｍ）との間を容易には区別しない。マイクバク テリアは環境において広く広がり、そして一般に非病原性である多くの環境的菌 株の中から特別のｇＩ４原性菌株を同定する、迅速な方法は存在しない。マイコ バクテリアの同定および特徴づけの現存の方法を使用するときの困難は、ヒトに おいてクローン病（Ｃｒｏｈｎ’　　ｓ　　ｄｉｓｅａｓｅ）（局限性腸炎）［ ２］および動物におけるヨー不ｆＮ（Ｊｏｈｎｅ’　　ｓ　　ｄｉｓｅａｓｅ） （特に畜生、ヒツジおよびヤギ）の微生物の分離物（ｉｓｏｌａｔｅｓ）の分析 ならびにマイコバクテリアの重感染をもつエイズ（ＡＩＤＳ）の患者からのトリ 結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ）菌株［４］に関連して増加した。ヒトらい病 および結核の原因となる因子の認識は明瞭であるが、病気の各々の臨床病理学的 形態、例えば、らい病の類結核的形態が存在し、ここでマイクバクテリアの組織 の存在量は低く、そして同定は相応して困難である。マイクバクテリアの特定の 認識および特徴づけにおける改良は、病気、例えば、慢性関節リウマチをマイク バクテリアの抗体に結合する現在の証拠が実証されるならば、また、関連して増 加することができる［５］。エイズ（ＡＩＤＳ）患者からのトリ結核菌（Ｍ−ａ 　ｖ　ｉ　ｕｎ）分離物およびＴＢ患者からのヒト結核菌（Ｍｙｃ。

ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を包含するマイコバクテリ アに対して発生する薬物抵抗性は、増加する問題である。環境的および病気の同 定、病原性菌株の特別の認識、密接に関係するマイコバクテリアの菌株、および 抗マイコバクテリア剤に対する抵抗性のパターンを定めるための、迅速な方法は 、非常に要求されている。

遺伝子型の特徴づけによる、マイコバクテリアの正確な同定および密接に関係す るマイコバクテリアの菌株と種との間の弁別のための、ＤＮＡプローブを使用す る方法。遺伝子型の分析の方法は、さらに、遺伝子型の性質、例えば、薬物抵抗 性および病原性の迅速な同定に適用可能である。

本発明のＤＮＡプローブは、ＤＮＡのライブラリーから誘導されるか、あるいは 異なるマイコバクテリアの菌株および種から誘導された組み換え体ＤＮＡクロー ンからのＤＮＡ配列の情報を使用して合成される。ＤＮＡクローンは、他のマイ コバクテリアのＤＮＡからのマイコバクテリアのＤＮＡを特異的に同定する、そ れらの能力について選択される。本発明のＤＮＡプローブは、まｊ；、密接に関 係するマイクバクテリアの菌株および種、例えば、バラ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ　　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびトリ結核菌（Ｍｙ ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ａｖｉｕｍＬおよびエイズ患者から分離されたもの を包含するマイコバクテリアの異なる菌株を区別および弁別する、それらの能力 について選択される。本発明のＤＮＡプローブは、また、遺伝子型の特徴づけに より、薬物抵抗性を包含するマイクバクテリアの表現型を同定および予測する、 それらの能力について選択される。

われわれは、最初に、マイコバクテリアの病気の分離物の遺伝子における関係す るＤＮＡ挿入配列（ＩＳＭＹ）の族を同定した。ＩＳＭＹの最初の例（ＩｓＭＹ −１）を、われわれは、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ　　ｄｉｓｅａｓｅ）（Ｃ Ｄ）からのマイクバクテリアの分離物から誘導したゲノムＤＮＡライブラリーか ら、クローンｐＭＢ２２　　［工業および海洋のバクテリアの国際収集物（ｔｈ ｅ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｉｎｄｕｓｔｒ ｉａｌ　　ａｎｄ　　ＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ）、スコツトランド、エイ バーディーン、にＮＣＩＢ　　Ｎｏ、１２４６１で受託された］において同定お よび特徴づけた。

われわれは、また、ヨーネ病（Ｊｏｈｎｅ’　　ｓ　　ｄｉｓｅａｓｅ）（ＪＤ ）に悩まされる畜牛および他の動物から培養した、バラ結核菌においてＩｓＭＹ −１を同定する。われわれは、エイズ（後天性免疫欠損症候群）をもつ重感染患 者からのマイコバクテリアの病気の分離物、免疫能力ヒトにおいてマイコバクテ リアの異型肺炎、および動物およびトリからの他のマイコバクテリアの病気の分 離物において、ＩＳＭＹ族の関係配列を同定する。われわれは、また、らい病（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　１ｅｐｒａｅ）および鼠らい病（（Ｍｙｃｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）の分離物においてＩＳＭＹを同定 する。

Ｉ　ＳＭＹ配列は、病原性マイコバクテリアにおいて優勢挿入配列と思われるが 、腐生性マイクバクテリアにおいて同定されてきていない。

ＩＳＭＹ族の構成員の各々のＤＮＡ配列のすべてまたは一部分は、ポリメラーゼ 鎖反応（ＰＣＲ）または他の技術により、酵素の増幅を使用するか、あるいはを 使用しないで、環境的および病気の試料においておよび生体外培養物において、 病原性マイコバクテリアの特別の認識だめの診断において、ＤＮＡまたはＲＮＡ のプローブとして使用することができる。Ｉ　ＳＭＹによる発現において、エン コードされ、突然変異しあるいは修飾された、タンパク質またはペプチドのすべ てまたは一部分は、組み換え体タンパク質または合成ペプチドのどちらに基づく かにかかわらず、同様な目的のために、免疫診断法および他の診断法において使 用することができる。このようなＩＳＭＹ誘導タンパク質またはペプチドは、ま た、医学および獣医学の実施においてマイコバクテリアの病気の予防のための特 別のワクチンとして使用することができる。ＩＳＭＹの全体マたは一部分の欠失 またはトランスフエクンタンによる微生物の表現型の変更は、ワクチンとして、 免疫治療または診断において、使用するために適当な培養可能な微生物菌株を操 作するｔ；めに使用することができる。

図面の要約 第１図は、３つの別々のクローン病（ＣＤ）のマイコｌくクチリアの分離物およ び１つのヨーネ病（ＪＤ）のバラ結核菌の分離物の各々からの制限したゲノムＤ ＮＡを、本発明のＩ　ＳＭＹ−１を含有する９ＭＢ２２でブロービングしたとき 、得られ！；多数の／（ンデイングノ）ターン（ｂａｎｄｉｎｇ　　ｐａｔｔｅ ｒｎ）ＤＮＡｒフィンガープリント」を示す。

第１図は、また、Ｉ　ＳＭＹ−１または病原性を付与しない相同挿入配列を含有 しない、マイコバクテリアの４つの種からの制限したゲノムＤＮＡを使用した、 異なる、非常に簡単なバンディングパターンを示す。この図面は、共有しｔ；複 合バンディングパターンがＣＤおよびＪＤの分離物の間のようなマイクバクテリ アの間の同一性を実証し、ならびに異なるマイコバクテリアを正確に区別する方 法を図解する。

第２図は、オランダ国アルステルダムおよび米国ロサンジエルスからの独立のＣ Ｄマイフバクテリア分離物（両者はトリ結核菌（ＬＬａｖｉｌｌｍ）と異なる） の間の同一性を示すことによって、第１図を支持する。

第３図は、クローンｐＭＢ２２における、本発明の配列Ｉ　ＳＭＹ−１を含有す るインサートＤＮＡの５ｋｂを特徴づける、制限地図を示す。第３図、また、ト リ結核菌（Ｍ、ａｖ　ｉ　ｕｎ）およびバラ結核菌のＤＮＡから得られｌ；マツ ピングデータを示し、バラ結核菌のＤＮＡ７ランキングＩＳＭＹ−１が、トリ結 核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）における同一部位に存在するが、もちろん、 関連するＩＳＭＹ−１をもｔ；ない、ことを示す。

これは、ＩＳＭＹ−１がバラ結核菌のゲノム中にこの部位において挿入され、そ して放散性の表現型の可能な原因であることを示す。第４図は、まｉ、９ＭＢ２ ２においてクローニングしｔ；インサートを特徴づけ、部分的ＤＮＡ配列のデー タはＩＳＭＹ−１挿入要素に及ぶ。第５図は、トリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ）の １系列の病原性菌株から得られた、多数のバンディングパターンを示し、これら はｐＭＢ２２中に存在する挿入配列Ｉ　ＳＭＹ−１に関係する他のＩＳＭＹ配列 を含有することを示す。

これらの関係するＴ　ＳＭＹ−１配列は、これらおよび他のマイコ／（クチリア の病原性、とくにトリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）の病原性に おいて含まれ得る。第５図は、また、ざらに病原性マイコノ（クチリアを同定し 、そしてそれらを環境的マイクバクテリアから区別するためのＤＮＡのフィンガ ープリンティングの使用を実証する。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

哀施例１１マイコバクテリアの特異的同定のためのプローブＤＮＡプローブは次 のようにして誘導した。ヒトＣＤ患者から分離したバラ結核菌の菌株からのゲノ ムＤＮＡ　［６］を、標準の技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２、モレキュラ ー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕＩａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）：Ｌａｂｏｒａｔ ｃｙｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）を使用して、ＢａｍＨＩで消化し、プラスミドベクタ ーｐＧＥＭ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）中に結合し、モしてＥ、ｃ ｏｌｉ　　ＤＨｌを形質転換するために使用した。２０．０００より多いアンピ シリン抵抗性組み換え体クローンを得た。１２の不規則的に選択しｔ；クローン （ｐＭＢ１〜１２）からのプラスミドＤＮＡにおける挿入の大きさは、１８０ｂ ｐ〜４２００ｂｐの範囲であった。このライブラリーをパラ結核菌菌株Ｂｅｎｚ パラ結核菌（ＡＴＣＣ１９６９８）およびマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍ 、ｋａｎｓａｓｉｉ）（ＴＭＣ１２０１）からのへキサヌクレオチドでプライミ ングし、放射線標識した完全なゲノムＤＮＡプローブとハイブリダイゼーション し、ハイブリダイゼーションコロニーをオートラジオグラフィーにより同定した 。クローンのほぼ５％はパラ結核菌（ＡＴＣＣ１９６９ｇ）およびパラ結核菌（ 菌株Ｂｅｎ）の両者にハイブリダイゼーションし、そして１％はマイコバクテリ ウム・カンサンイにハイブリダイゼーションした。４８のクローンは、３つの源 からのＤＮＡとの弁別ハイブリダイゼーションシグナルを与えるか、あるいは３ つの源からのＤＮＡとの同様なングナルを与えることに関して選択し、そして順 列（ｏｒｄｅｒｅｄ　　ａｒｒａｙ）上にグリッドした（ｇｒｉｄｄｅｄ）。順 列は、再び、パラ結核菌菌株Ｂｅｎ、バラ結核菌（ＡＴＣＣ１９６９８）および トリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍｃｏｍｐｌｅ’ｘ）血清型２（Ｃａｄｄｉｇｇ　　 １６７４１）、トリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）血清型５　（ ２５５４６−７５９）、マイコバクテリウム・カンサンイ（ＴＭＣ１２０１）お よびマイコバクテリウム・７レイ（Ｍ−ｐｈｌｅｉ）（ＮＣＩ８　８５７３）か らの放射線標識したゲノムＤＮＡとハイブリダイゼーションしＩ：。ｐＭＢＩ３ 〜２４と表示するクローンを、すべてのＤＮＡ試料に強くハイブリダイゼーショ ンするか、あるいはＤＮＡ試料の間の弁別ハイブリダイゼーションを実証するか に関して選択した。

施例２−１６ｓリポソームＲＮＡのためのＤＮＡグローブリポソームＲＮＡ配列 をエンコードするプローブは、パラ結核菌菌株Ｂｅｎゲノムライブラリーを、ト リ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ）血清型２細胞から抽出した完全ＲＮＡかも 調製した放射線標識した相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）でスクリーニングすることに よって、分離した。細胞を４モルのグアニジニウムイソチオシアネート中で８０ 秒間超音波処理して溶菌し、モしてＲＮＡを５．７モルの塩化カルシウムを通す 遠心により精製し、そして７０％のエタノールで沈澱させＩ；。放射線標識した ｃＤＮＡは、ｌμｇの精製したＲＮＡを逆トランスクリプターゼとともに、ｃＤ ＮＡの合成のプライミングのためにランダムへキサヌクレオチドを使用して、イ ンキュベーションすることによって調製した。放射線標識したプローブを、バク テリアのクローンにその場でハイブリダイゼーションした。オートラジオグラフ ィーはハイブリダイゼーションするコロニーを明らかにし、これらを取り上げ、 そしてプラスミドＤＮＡを抽出した。これを放射線標識し、そしてトリ結核菌（ Ｍ−ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）の完全ＲＮＡのノザンプロットのプロービングに使用 した。ｐＭＢｒ１６と表示するクローンは、ノザン分析で１６ｓリポソームＲＮ Ａに強くハイブリダイゼーションすることが分かった。

特異的マイコバクテリア菌株の認識および弁別のためのＤＮＡプローブの調製お よび使用のそれ以上の実施例において、ウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ　　ｂｏｖｉｓ）（ＢＣＧ）菌株Ｇｌａｘｏ）を、前述の標準技術により、Ｂ ａｍＨＩで消化し、ベクターｐＧＥＭ−１に結合し、そしてＥ、ｃｏｌｉ　　Ｄ ＨＩを形質転換するｔ：めに使用した。

生ずるゲノムＤＮＡライブラリーを、放射線標識したウシ結核菌（Ｍ。

ｂｏｖｉｓ）ゲノムＤＮＡでプロービングし、そしてｐＭＢＣＧ１３−２４と表 示する強くハイブリダイゼーションするクローンを取り上げた。

同様に、ゲノムＤＮＡをらい腫らいから得られたらい病（Ｍｙｃｏｌ）ａｃｔｅ ｒｉｕｍ　　１ｅｐｒａｅ）の２つのヌードマウス分離物から抽出し、そして数 千のクローンのゲノムライブラリーを調製した。挿入を含有しそしてｐＭＬｌ− １２と表示する１２の不規則に選択したクローンを分離した。

実施例４−マイコバクテリアのＤＮＡプローブの使用マイコバクテリアの菌株お よび種の間の正確な同定および弁別は、一般に、標的バクテリアからのゲノムＤ ＮＡの分離、制限エンドヌクレアーゼを使用する消化、電気泳動、および前述の ように放射線標識したマイクバクテリアＤＮＡの１つを使用するサザンプロンテ イングにより実施する。オートラジオグラフィーはバンディングパターンを明ら かにし、これらを制限断片長さの多形性（ＲＦＬＰｓ）について検査するが、ド ットプロ７ト分析せず、そして非放射性顕現系ならびにＰＣＲ増幅を、まＩ；、 使用することができる６ＲＦＬＰｓは、また、菌株および種の間のＤＮＡ塩基置 換の測定に使用する。

パラ結核菌およびトリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）の間の弁別 。パラ結核菌ＡＴＣＣ１９６９８、バラ結核菌菌株Ｂｅｎ、およびトリ結核菌（ Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）血清型２　（Ｃａｄｄ　ｉ　ｇ　１６７４１）から のＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨｒ、ＥｃｏＲＩ％Ｂｓｔｌ、Ａｖ ａｌ、Ｐｓｔ　Ｔ、Ｈｉｎｆ　Ｉ、Ｈａｅｌｌｌ、５ａｕ３Ａ。

ＨｉｎｃＩ、Ｐｖｕｌｌ、Ｐｖｕ　ＩおよびＴａｇＩで消化し、電気泳動し、ブ ロッティングし、そして放射線標識したクローン、ｐＭＢ７．２ＭＢ１２、ｐＭ Ｂ　ｌ　６、ｐＭＢ　１７、ｐＭＢ１９、ｐＭＢ２０、ｐＭＢ２１、ｐＭＢ２２ でプロービングし、そしてＤＮＡ試料を区別するＲＦＬＰｓについて検査した。

（本発明の挿入配列ｖｔクローンｐＭＢ２２の誘導化を実施例５に記載する）。

いくつかのＲＦＬＰｓはトリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）およびパラ結 核菌を区別することが分かった［７］。

しかしながら、ＲＦＬＰｓはパラ結核菌ＡＴＣＣ１９６９８およびパラ結核菌菌 株Ｂｅｎ、複合バンディングパターンを包含する、を、ＩＳＭＹ−１挿入配列を 含有するｐＭＢ２２で区別することが分かり　［７］、これらの２つは遺伝子的 に同一であることを示唆する。パラ結核菌であると推定されるワクチン菌株１８ は、さらに、トリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ）血清型ｌと事実同一あることが示さ れた［８］。

クローン病（ＣＤ）誘導バクテリアの同定。ＣＤ組織からのマイコバクテリアの いくつかの分離物は、パラ結核菌と関すると考えられた［６゜９１゜しかしなが ら、パラ結核菌およびトリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）（とくにミコバ クチン依存性トリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ）　）を正確に区別すること が不可能である、従来の技術は、これらのＣＤ分離物の同一性を残した。トリ結 核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ　　ｃ　ｏｍｐ　Ｉ　ｅ　ｘ）菌株は健康な被検 体から分離することができ、そして普通の環境的有機体であ己［１０］ので、Ｃ Ｄ誘導菌株の正確な同定はＣＤにおけるそれらの病因学的意味の評価に対して重 要である。したがって、ＤＮＡを３つのＣＤＩＨＩ菌株（Ｂｅｎ、Ｌｉｎｄａお よびＤｏｍｉｎｉｃ）［６］、およびまた、トリ結核１１（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　 ｃｏｍｐｌｅｘ）血清型２、トリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ） 血清型５、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍ、ｋａｎｓａｓ　ｉ　ｉ）およ びマイコバクテリウム・フレイ（Ｍ、ｐｈｌｅｉ）から抽出した。ＤＮＡを制限 エンドヌクレアーゼで消化し、そしてバラ結核菌およびトリ結核菌（Ｍ、ａｖｉ ｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）血清型２を弁別する前述のＲＦＬＰｓを同定する本発 明のＤＮＡクローンでプロービングした。６つの異なるＲＦＬＰｓを研究した。

３つのＣＤ誘導菌株の各々は、バラ結核菌と同定であることが示された［７］　 　ｔＪ１図）。これらの発見は、本発明のクローンｐＭＢ２２を含有するＩＳＭ ＹＩを使用して、２つのそれ以上特徴づけされていないヒトｌ：Ｄマイコバクテ リア分離物、それぞれ、米国においてギトニク（Ｇ　ｉ　ｔ　ｎ　ｉ　ｋ）博士 およびピーマン（Ｂｅａｍａｎ）博士ＵＣＬＡおよびオラ〉・ダ国アムステルダ ムＪ、ハーグスマ（Ｈａ　ａ　ｇ　ｓｍａ）博士（Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｖｅｔ ｒｉｎａｒｙ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）の２つの独立の研究所から得た４１（Ｉ ｎよびＨｌからの制限したＤＮＡをプロービングした。同一のバンディングパタ ーンが得られ、これらのそれ以上のＣＤ分離物は、再び、バラ結核菌を含有する ｆｓＭＹ−１であっｆ：（第２図）。

本発明の同様な方法およびＤＮＡプローブを使用して、ヨ・−手痛で感染した雌 牛から分離したバラ結核菌の８菌株の同一性を検査した。分離物を英国、フラン ス国および米国において感染した動物から独立に誘導し、ならびに追加の分離物 をヨーネ病に類似する病気に悩まされるオナガザル（Ｍａｃａｑｕｅ　　ｍｏｎ ｋｅｙ）から誘導し７：［ｌｌ］、プローブｐＭＢ１４、ｐＭＢ２０およびｐＭ Ｂ２２を使用するＲＦＬＰ分析は、すべての菌株がｐＭＢ２２について第１図お よび第２図において見られるものへの同一のバンディングパターンを与えること を明らかにし、病原性バラ結核菌の保存された性質を実証した。挿入配列Ｉ　Ｓ ＭＹ−１を含有するクローンｐＭＢ２２を使用するプロービングは、菌株の各々 について同一のバンディングパターンを明らかにした。

マイコバクテリアのトリ結核菌（Ｍ、　　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ　　ｃ　ｏｍｐ　ｌ 　ｅ　ｘ）の構成員は、従来の技術により特徴づけおよび定義することは困難で あった。われわれは、記載する本発明のマイクバクテリアのプローブおよび方法 を使用して、ある範囲のトリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）菌株 を検査した。いくつかの異なるパターンが得られた［８］。

血清型２．４．５．６および８は、菌株のタイプの間の２％のＤＮＡ塩基置換よ り少ないものに類似することが分かった。しかしながら、少なくとも６つの菌株 タイプのバンディングパターンは認識された。トリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　 ｃｏｍｐｌｅｘ）血清型１１．１６および２７は、お互いにおよび血清型２．４ ．５．６．８群の間の１３％のＤＮＡ塩基置換より大きく有することがわかった 。これらの菌株は従来ヒト肺病巣（Ｍ、ｉｎｔ　ｒａｃｅ　Ｉ　ｌｕ　１ａｒｅ ）または中間の菌株と表示されていた。われわれは、この研究から、血清型２． ４．５．６および８を使用して得られたものに類似するバンディングパターンを 与えるトリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）菌株をトリ結核菌（Ｍ 、ａｖｉｕｍ）と表示し、そして血清型１１．１６および２７により表される異 種の菌株をヒト肺病巣（Ｍ、１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　　ｃ。

ｒｒｌｐｌｅｘ）［８：ｌ　と表示することを提案した。本発明のより高い分解 能のＤＮＡグローブ法を使用する菌株型の決定は、常に、従来の血清盤の決定と 対応しなかった。

本発明の方法およびＤＮＡプローブは、さらに、ウシ結核菌（Ｍ、　ｂｏｖｉｓ ）ＢＣＧ（Ｇｌａｙ、ｏ）およびヒト結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 菌株Ｈ３７ＲＶを区別するために使用した。これらの７１゛フバクテリアからの ＤＮＡをＡｖａｌ、Ｓｍａｌ、Ｋｐｎ　Ｉ、ＰｖｕＩＩおよびＰｓｔＩで消化し 、電気泳動し、ブロッティングし、そしてｐＭＢｒ１３およびｐＭＢＣＧｌ　３ でプロービングした。ｐＭＢｒ１６はウシ結核菌およびヒト結核菌ＤＮＡおよび ｐＭＢＣＧｌ　３のＫｐｎ　１消化物の間のＲＦＬＰを実証し、Ｓｍａ　Ｉ消化 しｆ；Ｄ　Ｎ　ＡをもつＲＦＬＰを明らかにした。

同様な技術を適用してらい病を特徴づけた。らい病ＤＮＡをｐｖｕ　！■で消化 し、電気泳動し、ブロッティングし、そしてｐＭＢｒ１６およびｐＭＬｌでプロ ービングした。ｐＭＬｌはらい病ＤＮＡでバンディングパターンを与えたが、他 のマイコバクテリアからのＤＮＡ１ニハイブリダイゼーンヨンしなかった。ｐＭ Ｂｒ１６は、試験した他のマイコバクテリアを使用して見られるものと区別され るバラ結核菌のバンディングパターンを与えｔ二。

ＤＮＡをある範囲のマイコバクテリアから抽出し、Ｐｖｕ　Ｉ　Ｔで消化し、抽 出し、ブロッティングし、そして放射線標識したクローンｐＭＢｒ１６および他 のクローンでプロービングした。結果が実証するように、マイコバクテリアの各 々は明確な同定可能なりＮＡのバンディングパターンを与えた。

マイコバクテリアの特異的同定のための本発明のクローニングしたＤＮＡプロー ブの使用は、また、マイクバクテリアで生体内感染した組織のＤＮＡ抽出物に適 用可能である。これを実証するために、われわれがマイクバクテリアＤＮＡの抽 出に開発した方法を使用して、鼠らい病（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　Ｉｅ ｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）で感染したマウス肝臓を抽出した［８］。抽出したＤＮ ＡをＰｖｕＩＩで切断し、電気泳動し、ブロンティングし１．モしてＰＭＢｌ　 ２、ｐＭＢ１６、ｐ　Ｍ　Ｂ２０およびｐＭＢ２２でプロービングした。特異的 バンディングパターンはマウス肝臓からの鼠らい病（Ｍ、ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉ ｕｍ）について得られ、これはこの有機体がトリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ 　ｍ）に密接に関係することを示し、それとトリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃ ｏｍｐｌｅｘ）血清型２との間のほぼ２％の塩基置換を有した［８］。

挿入配列およびトランスポゾンは、ゲノムＤＮＡ内のＤＮＡの短い反復片であり 、適当な環境的条件に対して応答して移動することができる。

それらはそれらがエンコードする成分を通ずか、あるいは隣接する宿主遺伝子ま たはそれらが挿入されるようになる宿主遺伝子へのそれらの影響によって、それ らの生物学的作用を発揮する。これらの要素は自然に広く存在し、そしであるバ クテリア、酵母、植物、昆虫および動物において同定されてきている［１２］。

それらは、従来、マイクバクテリアにおいて同定されてきていない。

本発明の主要な面は、マイクバクテリアの病気分離物における関係する挿入配列 の新規な族の、最初の、同定からなる。挿入配列のこの族はＩＳＭＹと表示し、 そしてＩＳＭＹの１つの例（ＩＳＭＹ−１）をわれわれはクローニングし、そし て詳細に特徴づける。本発明のマイコバクテリアの挿入配列のＩＳＭＹ族の構成 員は、配列の相同性を共有させ、そして２ＭＢ２２　［工業および海洋のバクテ リアの国際収集物（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ 　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　ａｎｄ　　Ｍａｒｉｎｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉａ） 、スコツトランド、エイバーディーン、に受託されｔ：］において低いストリン ジエンジ−ストリンジエンシー（ｓ　ｔ　ｒ　１ｎｇｅｎｃｙ）で、ＩＳＭＹ− １とハイブリダイゼーションすることによって同定する。Ｉ　ＳＭＹ族の構成員 によりエンコードされるＤＮＡまたはＲＮＡのすべてまＩ；は一部分およびＩＳ ＭＹによりエンコードされるか、あるいはＩＳＭＹによる発現において突然変異 または変更した、タンパク質またはペプチドのすべてまたは一部分は、ＩＳＭＹ を含有する病気を引き起こすマイコバクテリアについての診断法の新規な範囲に おける使用に適用することができる。本発明のＩＳＭＹは、まｊ：、特異的欠失 またはトランスフエフシコンにより、新規なワクチン、免疫治療剤、または診断 剤を提供するための、突然変異体または組み換え体バクテリアの発生に使用され る。

パラ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ ｓ）のクローン病分離物からのゲノムＤＮＡを使用して、前述の標準技術により プラスミドベクターｐＧＥＭ−１およびＥ、ｃｏｌｉＤＨＩ細胞を使用してゲノ ムＤＮＡ組み換え体ライブラリーを発生させた。このライブラリーは、パラ結核 菌、マイコバクテリウム・カンサシイおよびトリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ 　ｍ）から誘導した放射線標識ＤＮＡグローブでスクリーニングした。パラ結核 菌に強くハイブリダイゼーシヨンするが、トリ結核菌およびマイコバクテリウム ・カンサシイに弱くハイブリダイゼーションしたわずかに１つのクローンが存在 し、そしてわれわれはこのクローンを２ＭＢ２２と表示した。これを取り上げ、 そして約５ｋｂのインサートを含有することが分かった。この組み換え体ＤＮＡ 断片を切除し、精製し、それ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そしてプ ラスミドベクターｐＧＥＭ−１，またはＭｌ　３７ア一ジベクターｍｐ１８およ びｍｐ１９中にスクリーニングした。生ずるクローンをパラ結核菌ＤＮＡにハイ ブリダイゼーションし、そして強く陽性のクローンを同定した。２ＭＢ２２にお ける５ｋｂの挿入内の選択しＩ；サブクローンの位置、それらのあるものはパラ 結核’！１ＤＮＡと強く／＼イブリダイゼーンＨンした、を示す（第３Ａ図）。

２ＭＢ２２を収容するＥ−ｃｏｌｉ菌株ＤＨＩは、ブダペスト条約に従い、工業 および海洋のバクテリアの国際収集物（ｔｈｅ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　ａｎｄ　　Ｍａｒｉｎｅ 　　Ｂａｃｔｅｒｉａ）、スコツトランド、エイバーディーン、に１９８７年４ 月２４日にＮＣＩＢ　　Ｎｏ、１２４６１で受託された。

実施例６、パラ結核菌中の挿入配列ｒＳＭＹ−１この節は、パラ結核菌中のＩ　 ＳＭＹ−１が挿入配列であること、およびこれらがこの有機体のｇｊｇｉ性をも って分離することを示す証拠を記載する。

パラ結核菌ＤＮＡをＢａｍＨＩ、Ｓｓ　ｔ　Ｉ、ＥｃｏＲＩおよびＢｓｔ■で切 断し、電気泳動し、ブロッティングし、そして２ＭＢ２２およびそのサブクロー ンｐＭＢ２２／Ｓ４およびｐＭＢ２２１５１２にハイブリダイゼーションした。

各場合において、はぼ８つの強くハイブリダイゼーションするバンドが得られた 。この手順を制限エンドヌクレアーゼＡＩｕＩ、Ａｖａ　Ｉ％　Ｐｓ　ｔ　Ｉ、 Ｐｖｕ　Ｉ　ＩおよびＰｖｕ　Ｔを使用して反復すると、はぼ１６の強くハイブ リダイゼーションするバンドが２ＭＢ２２およびそのサブクローンＳ４で見られ ｔ二が、これらのバンドの８つのみのサブセットがｐＭＢ２２サブクローン３１ ２にノ＼イブリダイゼーシ日ンした。パラ結核菌ゲノムＤＮＡをＨｉｎｆＩで消 化すると、２ＭＢ２２およびｐＭＢ２２／Ｓ４と強くノ翫イブリダイゼーシコン する２つのバンドが得られ、それらの１つのみは、また、ｐＭＢ２２／Ｓ４とハ イブリダイゼーションした。次いで、２ＭＢ２２およびそのサブクローンＳ４お よび５１２を使用して、トリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）血清型２　（ Ｃａｄｄｉｇｇ１６７４１）および血清型５　（２５５４６−７５９）の２つの 実験室菌株から得られたＢａｍＨＩ制限ゲノムＤＮＡのサザンプロットをプロー ビングした［７］。単一のバンドがトリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｎ）菌株 でｐＭＢ２２プローブを使用して見いだされた。

ｐＭＢ　２２／Ｓ　ｌ　２はトリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）血清型２ のＤＮＡにハイブリダイゼーションせず、そしてｐＭＢ２２１５４は非常に弱く 単一のバンドにハイブリダイゼーションした。

これらの結果が、実施例５における結果と一緒に、示すように、２ＭＢ２２はパ ラ結核菌のゲノム中に分散したほぼ８つのコピー中に存在するが、トリ結核菌（ Ｍ、ａｖ　ｉ　ｕｎ）血清型２中に存在しない配列を含有する。８つのハイブリ ダイゼーションするバンドを与える酵素はクローンｐＭＢ２２内に含有される挿 入配列を切断してはならず、したがってバンドの各々はＩＳＭＹ挿入要素の異な るゲノムの位置を表す。酵素、例えば、ＰｖｕｌＩは要素を１回切断し、したが ってゲノムのコピーの各々について２つの断片を生成する。配列ｐＭＢ　２２／ Ｓ　ｌ　２はＰｖｕＩＩ断片の１つから誘導されねばならず、これに対してＰｖ ｕｌｌ／Ｓ４はＰｖｕ　Ｉ　１部位に及ぶ。酵素ＨｉｎｆＩは挿入要素内に少な くとも３つの部位をもたなくてはならず、したがってＩＳＭＹのゲノムのコピー の各々は切断されて、同一の２つの内部のＩＳＭＹ断片、これに加えてフランキ ングＤＮＡを含有する異種のＩ　ＳＭＹ断片を与える。２ＭＢ２２の詳細な制限 エンドヌクレアーゼ地図を誘導し、そして示す（第３Ａ図）。

表されるデータが示すように、試験したパラ結核菌８よびトリ結核菌（Ｍ、ａｖ ｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）菌株は非常に密接に関係し、２つの種の間の１％よ り少ないＤＮＡ塩基置換を示す。しかしながら、広範な種類の地理学的源および 病気の宿主から分離したパラ結核菌菌株の同一性質は、パラ結核菌が畜生、ヤギ および霊長類の少なくとも１つの種においてヨーネ病、および多分ヒトにおける クローン病のいくつかの場合を引き起こす、保存された特異的病原体であること を示唆する。これが示唆するように、パラ結核菌を特徴づけ、病原性を与え、そ してこれらの病気を引き起こさせる、特異的遺伝子の変化か存在する。パラ結核 菌へのＩ　ＳＭＹ−１挿入配列の緊密な分離および検査したトリ結核菌（Ｍ、　 ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ）のほとんどの実験室菌株からのｒＳＭＹ−１の特異的不存在 は、Ｉ　ＳＭＹ−１を、その病原性を付与するパラ結核菌において遺伝子の変化 の原因となる強い候補の配列とする。

９ＭＢ２２およびバラ結核菌内で同定された、本発明の挿入配列ＩｓＭＹ−１を フランキングするゲノムＤＮＡの有機化を、ｐＭＢ２２ｊ’；よびサブクローン Ｓ４、Ｓ８および５１２を使用して検査し、そして結果をトリ結核菌ゲノムＤＮ ＡＩこついての同様な研究と比較しｊ；。地図を示す（第３Ｂ図）ｅｐＭＢ２２ におけるＩＳＭＹ−１をフランキングするゲノムＤＮＡは、トリ結核菌（Ｍ、ａ ｖ　ｉ　ｕｍ）およびバラ結核面の間の検出可能な変化を示さず、制限地図にお けるどこかのこの領域におけるＤＮＡ間の塩基の置換の同様なレベルを示す。バ ラ結核菌および１・り結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）は進化的に非常に密 接に関係するので、パラ結核菌における反復要素ＩＳＭＹ−１の存在は、トリ結 核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ）からの分岐を引き起こすバラ結核菌により最近獲得され たＩｓＭＹ−１と匹敵する。あるいは、配列ＩＳＭＹ−ｉは、進化の間にトリ結 核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ）から欠失されで、そのバラ結核菌からの分岐を 引き起こすことがありうる。後者の提案はパラ結核菌のゲノムからのＩ　ＳＭＹ −１のコピーの各々の正確な切除および欠失を必要としく極端にあり得ない事象 ）、前者の説明はよりもっともらしい。反復配列ＩｓＭＹ−］は挿入配列として 知られている遺伝子要素の例を形成するであろう（Ｉ　２１６１　ＳＭＹ−１の ＤＮＡ配列を、−木調のＭ１３配列決定により決定し、そして示す（第４図）。

実施例７、他のマイクバクテリアのｌ　ＳＭＹ関連配列この節は、相同性を共有 することによってＩＳＭＹ−１に関係づけられ、そして９ＭＢ２２またはそのサ ブクロー〕／との適当な実験条件下のハイブリダイゼーションにより同定され乙 、他の病原性マイクバクテリア中の配列の存在を実証する。Ｉ　ＳＭＹ−１を使 用するときのように、ＩＳＭＹ族の他の構成員はマイクバクテリア宿主に病原性 を与えると思われる。

野生ハｈ　（ｗｏｏｄ　　ｐｅｇｅｏｎ）、ン力、ヤギ、ブタおよびアルマシロ から分離したミコバクチン依存性菌株およびまたトリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ） 血清型２およびバラ結核菌の収集物からのＤＮＡをｐＭ８２２およびそのサブク ローンとハイブリダイゼーションした。ミコバクチン依存性トリ結核菌（Ｍ、ａ ｖ　ｉ　ｕｍ）菌株のハイブリダイゼーションは、トリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　 ｉ　ｕｍ）血清型２からのＤＮＡを使用するものに類似するバンディングパター ンを与えたが、またトリ結核菌（Ｍ。

ａｖｉｕｍ）［ｍ溝型２中に存在しない、１系列の追加のバンドを示した（第５ Ａ図）。高いストリンジエンシーにおいて洗浄したとき、これらの追加のバンド からのシグナルのほとんどは選択的に障去された。代表的ＤＮＡの試料をサブク ローンｐＭＢ２２／Ｓ４でプロービングしたとき、これらの追加のバンドは強く ハイブリダイゼーションしたが、１つのみのかすかなバンドは、フランキングＤ ＮＡから誘導した、トリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ）血清型２を使用して 得られた（第５Ｂ図）。サブクローンｐＭＢ２２１５１２はバラ結核菌ＤＮＡに おいてＩＳＭＹ−１とハイブリダイゼーションしたが、アルマシロ誘導ミコバク チン依存性菌株である試料１５７Ｒおよび１５７Ｓにおいて単一のバンドにのみ ハイブリダイゼーションした（第５Ｃ図）。バラ結核菌１０９１１の非ミコバク チン依存性アルマシロ誘導菌株は、９ＭＢ２２／Ｓ４または９ＭＢ２２／Ｓ１２ のいずれにもハイブリダイゼーションしなかった。これらのＤＮＡ試料を無関係 のバラ結核菌ＤＮＡグローブでプロービングしたとき、非常に類似するか、ある いは同一のバンプ１ングパターンがすべての菌株から得られた。

これらの結果が示すように、トリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ）の１７１ｆ ｉ性ミフバクチン依存性菌株は病原性バラ結核菌におけるＩＳＭＹ−１に関係す る挿入配列を含有する。菌株１５７Ｒ８よび１’５７　Ｓは、Ｉ　ＳＭＹ−１が ９ＭＢ２２／Ｓ４および９ＭＢ２２／Ｓ１２の両者にハイブリダイゼーションし たので、ＩＳＭＹ−１に密接に関係する挿入配列を含有する。シカ、ヤギ、野生 ハトおよびブタのマイコバクテリア中に存在する挿入配列は、Ｉ　ＳＭＹ−１に それほど密接に関係せず、そしてｐＭＢ２２／Ｓ　１２に対して相同性の配列を 含有しない。バンディングパターンはこの群において異なる菌株のいくつかに類 似し、そしてこれらの菌株において挿入配列はＩＳＭＹ−２と表示１−２だ。

それ以上の選択しないトリ結核Ｍ　（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）菌株を、ＩＳ ＭＹ族の挿入配列の存在について研究した。いくつかの菌株はＩＳＭＹ−２また は関係する挿入配列を含有ず５ことが分かったが、今日まで、ｌ５ｒｖｉｙ−１ を含有する他のマイクバクテリアの菌株は同定されてきていない。２つのそれ以 上の病原体が、ＩＳＭＹの関係する挿入配列を含有４“ることが分かった。らい 病バチリスらい病（λＬ　　１ｅｐｒａｅ）からのＤＮＡは、ｐ　Ｍ　Ｂ　２２ ７　Ｓ　４にハイブリダイゼーションした配列を含有する。ンノトらい病バチリ ス鼠らい病（Ｍｙｃｏｂｃｔｅｒｉｕｍｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）からのＤＮ Ａは、９ＭＢ２２／Ｓ４にハイブリダイゼーションしたが、ｐｈ４Ｂ　２２／Ｓ 　１２Ｉこハイブリダイゼーションしなかった配列を含有した。

これらの結果が示すように、ＴＳＭＹ−ｉに関係する挿入配列は、ある数のマイ クバクテリア病原体において、とくにエイズ（ＡＩＤＳ）患者から分離したもの を包含するトリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｔｅｘ）内に見いだされる 。われわれは、２０より多いそれ以上の主として腐生性および環境的マイコバク テリア種および菌株をスクリーニングし、そしていずれもＩＳＭＹ族の挿入配列 を含有しないことが分かった。Ｉ　ＳＭＹはマイコバクテリアの病原性をもって 分離するように思われる。

本発明符皮見および用途 特定のマイ」バクテリアから誘導した組み換え体ＤＮＡライブラリー、あるいは このようなライブラリーからの情報に基づきモしてマイコバクテリアの菌株また は表現型の特異的について選択した合成のＤＮＡからの、本発明のクローニング したＤＮＡプローブは、マイクバクテリアのＤＮＡまたはＲＮ’Ａの特異的同定 および他の微生物の配列からのマイクバクテリアの弁別Ｊ：おいて使用される。

このような特異的マイコバクテリアのＤＮＡプローブは、また、マイコバクテリ アの菌株および種の間の正確な弁別および表現型の性質、例えば、媒質感受性お よび病原性の認識または予測のために使用される。

さらに、配列ＩＳＭＹ−１（ＮＣ’ＴＢ　　Ｎｏ、１２４６１で受託されたｐＭ Ｂ２２中の）、ＩＳＭＹ−２、およびＩ　ＳＭＹ−１と部分的相同性を共有する 本発明のマイコバクテリアの挿入配列のＩＳＭＹ族の他の構成員のすべてまたは 一部分から誘導した、ＤＮＡまたはＲＮＡのプローブまたは合成オリゴヌクレオ チドは、マイコバクテリアの潜在的に病原性の菌株の特異的検出のためのプロー ブとして使用される。これらは次のものを包含するニパラ鮎槁薗、トリ結核菌（ Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）の病原性の形態、エイズの重感染において含まれる ものを包含する、およびＩＳＭＹ配列を含有する他の病原性マイコバクテリア、 らい病（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）を包含する。

マイクバクテリアの正確な同定および弁別ならびにＩ　ＳＭＹ含有病原性菌株の 特異的検出は、環境的試料、例えば、水、動物およびヒトの食物、および土の試 料に適用される。このような応用は、ヒトおよび動物におけるマイコバクテリア の病気の予防および公衆衛生の抑制において有用である。本発明の方法およびプ ローブを使用する試験は、また、組織、組織抽出物、体液、例えば、乳、および 排出物の医学および獣医学の試料に、ならびに生体外培養において成長したバク テリアの加速した同定および特徴づけに、およびこのような培養条件の敬良に適 用される。

これらの応用は、マイコバクテリアの病気、例えば、畜牛および他の動物におい てヨー不磨、動物園の動物および鳥類におけるマイコバクテリアの病気、ヒトの マイコバクテリアの病気、例えば、らい病、トリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ ｍ）の感染、エイズのマイコバクテリアの重感染、およびヒトのクローン病にお いて有用である。

試験において使用する方法において、ＤＮＡプローブは一本鎖または二本鎖であ るか、あるいはＲＮＡ転写体であり、そして非標識であるか、あるいは放射線、 ビオチニル、蛍光、酵素、免疫学的に、か、あるいは他の顕現剤まｔ；は方法で 標識することができる。ＩＳＭＹのすべてまたは一部分を表すプローブは、溶液 相で使用するか、あるいはビーズ、管または他のマトリックスの形態の、固相の 支持体、例えば、セルロース、ナイロン、ニトロセルロース、プラスチックまた はゲルの系に結合する。

試料を処理してマイコバクテリアのＤＮＡまたはＲＮＡを解放する。機械的崩壊 および／まｔ；は超音波処理および／または酵素処理および／または熱処理およ び／または化学的処理を使用する。処理した試料を、ハイブリダイゼーションを 可能としかつヌクレアーゼの作用を防止するように設計して溶液中で、プローブ （沸騰した、二本鎖である場合）と混合する。に料中に存在するＤＮＡまたはＲ ＮＡを標的する特異的プローブのハイブリダイゼーションは、標準の手順により 達成される。

雑種の検出は、ある数の方法による。ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）を添加し て二本鎖ＤＮＡまｊ；はＲＮＡを結合することができ、次いでＨＡＰを洗浄して ハイブリダイゼーションしないプローブを除去する。他の固体マトリックスを使 用して雑種を結合する。あるいは、ハイブリダイゼーションしないプローブは、 −末鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、次いで雑種をトリクロロ酢酸、エタノール または他の物質により沈澱させることによって除去する。雑種は使用する顕現法 に依存する方法により検出する。非標識プローブのＤＮＡを固体マトリックスに 結合し、そして試料へのハイブリダイゼーシヨンに使用する。グローブの配列に 対して相同性の標的マイコバクテリアのＤＮＡまたはＲＮＡは、プローブを経て マトリックスに結合するようになる。マトリックスを洗浄し、そして標的ＤＮＡ またはＲＮＡを加熱または変性溶液への移送により解放する。次いで、標的ＤＮ ＡまたはＲＮＡを前述の方法により直接検出する。あるいは、ＤＮＡまたはＲＮ Ａをまずポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ［１２］　）により、ＤＮＡポリメラーゼ または逆トランスクリプターゼ＋ＤＮＡポリメラーゼをプローブまたはＩＳＭＹ 配列中に存在する特異的オリゴヌクレオチドプライマーと一緒に使用して、増幅 し、そしてこのようなプライマーは本発明のそれ以上の面を形成する。増幅後、 標的配列を前述の方法のいずれかにより検出する。検出は未反応のプライマーお よびＰＣＲ反応において延長されたプライマーとの間の弁別を包含することがで きる。この場合において、プライマーを標識し、そして検出を使用する標識に依 存する。非増幅のまたは増幅した標的マイクバクテリアの配列へのプローブのハ イブリダイゼーションは、標準の手順により、そしてドツトプロット法またはＲ ＦＬＰＳの同定をまた使用する。

ＩＳＭＹ−１（ｐＭＢ２２中の）、ＩＳＭＹ−２およびＩ　ＳＭＹ−１との部分 的配列の相同性を共有するＩＳＭＹ族の他の構成員を包含する本発明のマイコバ クテリアの挿入配列のすべてまたは一部分を使用して、Ｉ　ＳＭＹ配列に基づく 制限酵素タンパク質またはペプチドまたは合成ペプチドを発生させ、そしてこの ような誘導された配列は、本発明のそれ以上の面を形成する。ＩＳＭＹによる発 現において突然変異体または変更したタンパク質をまた使用する。

ＩＳＭＹ誘導した組み換え体タンパク質およびペプチドは、また、ＩＳＭＹ含有 病原性マイコバクテリアの特異的検出のためＩこ、医学、獣医学、環境的および 生体外培養の試料に適用可能な標準の技術を使用して、免疫および他の診断のア ッセイにおいて使用する。このような診断イムノアッセイにおいて使用するため の、ＩＳＭＹ誘導したタンパク質またはペプチドに対する抗体は、ポリクローナ ル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであっても、においでのそれ以上の面 を形成する。ＩｓＭＹ配列に基づく組み換え体タンパク質は、コンピューターに 基づく構造の研究を使用するか、あるいはを使用しないで、特異的薬物の合理的 設計のために使用して、それらの生物学的作用を修飾または遮断する。組み換を 体ＩｓＭＹのタンパク質まｔ；はペプチドは、それら自体、治療剤として使用し て、生体内の特異的生物学的作用、例えば、免疫調節を仲介することができる。

ＩＳＭＹ族の構成員のＤＮＡ配列のすべてまたは一部分を使用して、突然変異体 のバクテリアまたはウィルスを操作することができ、そしてＩＳＭＹ配列を含有 する突然変異体の形態は本発明のそれ以上の面を形成する。これらは、医学およ び獣医学の実施において病原性マイコバクテリアにより引き起こされる病気の予 防のための特定のワクチンとして使用される。それらは、また、免疫治療または 診断法における因子として使用することができる。ＩＳＭＹから誘導されたタン パク質またはペプチドは、また、同一の目的のためのワクチンとして使用される 。

参考文献 ］、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ　　ＭおよびＷａｙｎｅ　　ＬＧ、（１９８２）−Ｔ ｈｅ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　ｏｆ　　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｒａｔｌｅｄ ｇｅ　　＆　　５ｔａｎｆＯｒｄ編、Ａｃａｄｅｍｉｅ　　Ｐｒｅｓｓ。

Ｌｏｄｏｎ。

２−　Ｇｒａｈａｍ％ＤＹ、ｅ　ｔ　　ａ　１．（１９８７）−Ｇａｓｔｒｏｅ ｎＩｌｅｒｏｌ　　９２；　　４３６−４４２−３、Ｃｈｉｏｄｉｎｉ　　ＲＪ 、ｅｔ　　ａｌ、（１９８４）−Ｔｈｅ　　Ｃｏｒｎｅｌｌ　　Ｖｅｔｅｒｉｎ ａｒｉａｎ　　７４：２］８−２６２゜ ４、Ｃｏ１１ｉｎｓ　　Ｆ。

Ｉｎｔ、Ｊ、Ｌｅｐｒｏｓｙ　　５４：　　４５８−４７４゜５、Ｖａｎ　　Ｅ ｄｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ、（１９８８）−Ｎａｔｕｒｅ　　３３１：　　１７１ 　１７３゜６、Ｃｈｉｏｄｉｎｉ　　ＲＪ　　ｅｔ　　ａｌ、（＋９８４）Ｄｉ ｇ、Ｄｉｓ、Ｓｃｉ、２９：１０７３　１０７９゜７、ＭｃＦａｄｄｅｎ　　Ｊ Ｊ、’ｅｔ　　ａｌ、（１９８７）Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２５ ＋７９６−８０１８、ＭｃＦａｄｄｅｎ　　ＪＪ、ｅｔ　　ａｌ、（１９８７） 。

Ｍｏ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１：２８３−２９１゜９、Ｃｏ１１ｉｎｓ　　Ｊ 、ｅｔ　　ａｌ、（１９８７）、Ｇａ５ｔｒｏｅｎｔｅｒｏ１．９２：１３５２ ゜ １０、Ｍａｒｔｉｎ　　ＣＭ、ｅｔ　　ａｔ　　（１９８７）。

Ａｍ、Ｒｅｖ、Ｒｅｓ、Ｄｉｓ、１３６：３４４−３４８゜１１、ＭｃＣｌｕｒ ｅ　　ＨＭ、ｅｔ　　ａｌ、（１９８７）。

Ｊ、Ｉｎｆ、Ｄｉｓ、１５５：１ｏｌｌ−１０１９゜１２、Ｃｕｌｌｕｍ　　ｊ 、（１９８５）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　ｏｆ　　Ｂａｅｔｅｒｉａ、ｅｄ、５ｃ ａｉｆｅ　　Ｊ、ｅｔ　　ａｌ、、Ａｃａｄｅｍｉｃ　　ＰｒｅｓｓＳ　Ｌｏｄ ｏｎ−１３，５ｃｈａｒｆ　　ＳＪ、ｅｔ　　ａｌ、（１９８７）。

５ｃｉｅｎｃｅ、２３３＋１０７６−７８゜図面のリスト 第１図 ＤＮＡを次のクローン病誘導菌株から抽出した：Ｂｅｎ　（ＣＤＩ）、Ｉ、１ｎ ｄａ（ＣＤ２）およびＣｏｍｏｎ　ｉ　ｃ　（ＣＤ３）　；バラ結核菌、トリ結 核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）血清型２、トリ結核菌（Ｍ、ａｖｉ ｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）血清型５、マイコバクテリウム・ｈンサシイ（Ｍ、ｋ ａｎｓａｓ　ｉ　ｉ）およびマイコバクテリウム・フレイ（Ｍ、ｐｈ　Ｉ　ｅ　 ｉ）　。ＤＮＡＫ料（１’ｇ）を制限エンドヌクレアーゼＰｖｕｌｌで消化し、 １％のアガロースを通して電気泳動し、ナイロ膜上にブロッティングし、放射線 標識したプローブｐＭＢ２２にハイブリダイゼーンッ二／シ、そしてオートラジ オグラフィーにかけた。分子量マーカー（ｋ　ｂ）を右に示す。

第２ｃｇＪ ＤＮＡをクローン病誘導菌株４１０　（Ｇ、Ｇｉｔｎｉｃｋから入手した）およ び菌株Ｈ１（Ｊ、Ｈａａｇｓｍａ）；およびトリ結核菌（Ｍ。

ａｖｉｕｍ）から抽出した。ＤＮＡ試料（１ｇ）を制限エンドヌクレアーゼｐｖ ｕｌ＋で消化し、１％のアガロースを通し”ｌ：’［気泳動し、＋イロ膜上にブ ロッティングし、放射線標識１、ｊ；プローブｐＭＢ２２にハイブリダイゼーシ ョンし、そしてオートラジオグラフィーにかけた。レーンｌニトリ結核Ｍ（Ｍ、 　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ入　レーン２：Ｍ株Ｈ７，レーン３：菌株４１０゜ 第３Ａ図 配列決定のコンチグス（ｃｏｎｔ　１ｇ５）Ｃ１およびＣ２の位置（→）および またサブクローンＳ４、Ｓ８およびＳ１２の位Ｒ（−−−−）を示ス、ｐ　Ｍ　 Ｂ　２２の制限エンドヌクＬ・アーゼ地図。サブ７０−一・の正確な位置は決定 されず、したがってそれらの最大の範囲はハツチング線上こよりしめす６　Ｐ− Ｐｖｕ　Ｉ　Ｌ　Ｘ−Ｘｈｏ　Ｉ、Ｒ−ＥｃｏＲｌ、　Ｂニー８ピＩＩＩ、Ｋ− Ｋｐ’ｎｌ、分子量はキロ塩基（ｋ　ｂ）で示す。

第３Ｂ図 位置をエンコードする配列の制限エンドヌクレアーゼ地図は、バ″？結核菌およ びトリ結核Ｉｉ　（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ”）のゲノムにおけるｐＭＢ２２ 中に含有された。分子量はキロ塩基（ｋ　ｂ）で示す。

第４図 グロー〕・Ｉ）ＭＢ２２から得られたＤ　Ｎ　、Ａ配列の情報。２つの隣接する 長さの配列（コンチグスＣ１ｓよびＣ’２）が示されている。コンチグスの位置 は、第３Ａ図においてｐＭＢ２２の地図中に示す。

第５図 Ｉ）　Ｎ　Ａは、トリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ）　、バラ結核菌および 異型トリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ）菌株のミコバクチン依存性病気誘導 菌株から抽出された。Ｄ　Ｎ　Ａ試料（はぼ０．５ｇ）を制限エンドヌクｔ−ア ーゼｐｖｕＩＩで消化し、１％のアガロースを通して電気泳動し、ナイロン膜上 にブロッティングし、放射線標識しｔ；、プローブｐＭＢ２２（Ａ）、りＭＢ２ ２／Ｓ４プローブ（Ｂ）、ｐＭＢ２２／Ｓ１２プローブ（Ｃ）にハイブリダイゼ ーションし、そしてオートラジオグラフィーにかけた。

ＤＮＡの試料は、次のとおりであった：バラ結核菌（レーンｌ）、非ミコバクチ ン依存性トリ結核菌（Ｍ、ａｖ　ｉ　ｕｎ）血清型２（レーン２）、非ミコバク チン依存性アルマシロ誘導撹拌１０９１１（レーン３）、ミコバクチン依存性ヤ ギ誘導菌株８５８９　（レーン４）、ミコバクチン依存性アルマシロ誘導菌株工 ５７（レーン５）および１５７５（レーン６）、ミコバクチン依存性シカ誘導菌 株７９４１（レーン７）、ミコバクチン依存性シカ誘導菌株８４４６　（レーン ８）および（レーン９）、ミコバ　、。

クヂン依存性野生ハト（ｗｏｏｄ−ｐ　ｉ　ｇｅｎ）誘導菌株１／７９（レーン Ｉ　Ｏ）、］／７２（レーン１２）・およびミコバクチン依存性ヤギ誘導菌株Ｇ Ｋ２７（レーン１３）、分子量のマーカーはＡの右に示す。

クローン病の菌株 ＢＡＭ）４１ ♀　ロ　　Ｊ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　ａ−〜　　　　　　　　Ｙ φ　Ｌ／ＩＬ／ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−−鄭 二乱匡シＬユ ｑ２匡工Ｌユ ｋｂ　　　ｌ　　　２　　：Ｉ　ａ　　ｓ　　６ｙ　　８　９１０　０１２　　 ０＋　　　　２３４５６７８　　　　＋　　　２３４５　６７８補正書の写しく 翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成１年ｌＯ月２４日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ　８　ｇｌｏ　０３１３ ２、発明の名称 公衆衛生、医学、および獣医学の実施におけるマイコバクテリアのための診断法 およびワクチン３、特許出願人 ４、代理人　〒１０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正書の提出年月日 １９８９年７月５日 ６、添付書類の目録 （１）　　補正書の写しく翻訳文）　　　　　　　　　　１通２、　マイコバク テリＴの挿入配列（ＩＳＭＹ）に基−づく、公衆ｍ３゜医学および獣医学の使用 のための診断法およびワクチンわれわれは、最初に、マイコバクテリアの病気の 分離物の遺伝子における関係するＤＮＡ挿入配列（ＩＳＭＹ）の族を同定した。

ＩＳＭＹの最初の例（ＩＳＭＹ−１）を、われわれ（ま、クローン病（Ｃｒｏｈ ｎ’ｓ　　ｄｉｓｅａｓｅ）（ＣＤ）からのマイコバクテリアの分離物から誘導 したゲノムＤＮＡライブラリーから、クローンｐＭＢ２２　［工業および海洋の バクテリアの国際収集物（ｔｈｅ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｃｏｔｆａｃｔｉｏ ｎ　　ｏｆ　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　ａｎｄ　　ＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒ ｉａ）、スコアトラント′、エイバーディーン、にＮＣＩＢ　　Ｎｏ、１２４６ １で受託された］において同定ｊりよび特徴づけた。

われわれは、また、ヨーオｆＦｉ（Ｊｏｈｎｅ’　　ｓ　　ｃｌｉｓｅａｓｅ） （ＪＤ）に悩まされる畜生および他の動物から培養した、パラ結核菌においてＩ 　ＳＭＹ−１を同定する。われわれは、エイズ（後天性免疫欠損症候群）をもつ 重感染患者からの１イコバクテリアの病気の分離物、免疫能力ヒトに８（１てマ イクバクテリアの異型肺炎、および動物２３よびトリからの他のマイコバクテリ アの病気の分離物において、ＩＳＭＹ族の関係配列を同定する。われわれは、ま た、らいＦ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ　　１ｅｐｒａｅ）および鼠らいＦ（ （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）の分離物においてＩ 　ＳＭＹを同定する。

Ｉ　ＳＭＹ配列は、病原性マイコバクテリアにおいて優勢挿入配列と思われるが 、腐生性マイクバクテリアにおいて同定されてきていない、ＩＳＭＹａの構成員 の各々のＤＮＡ配列のすべてまｔ：は一部分は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ） または他の技術により、酵素の増幅を使用するか、あるいはを使用しないで、環 境的ｊりよび病気の試料においておよび生体外培養物において、病原性マイコバ クテリアの特別の認識ための診断において、Ｄ　Ｎ　ＡまたはＲＮＡのプローグ として使用することができる。ｌＳＭＹによる発現において、エンコードされ、 突然変ｊ％１．あるいは修飾された、タンパク質またはペプチドのすべてまたは 一部分は、組み換え体タンパク質または合成ペプチドのどちらに基づくかにかか わらず、同様な目的のために、免疫診断法および他の診断法において使用するこ とができる。このようなＴＳＭＹ誘導タンパク質またはペプチドは、また、医学 および獣医学の５！施においてマイクバクテリアの病気の予防のための特別のワ クチンとして使用することができる。ＩＳＭＹの全体または一部分の欠失または トランスフェクションによる微生物の表現型の変更は、ワクチンとして、免疫治 療または診断において、使用するために適当な培養５ｒ能な微生物菌株を操ｔπ するために使用丈ることができる。

図面の要約 第１図は、３つの別々のクローン病（ＣＤ）のマイコバクテリアの分離物および １つのヨーネＩＦＩ（ＪＤ）のパラ結核菌の分離物の各々からの制限したゲノム ＤＮＡを、本発明のＩ　ＳＭＹ−１を含有するｐＭＢ２２でブロービングしｌ： どき、得られた多数のバンディングパターン（ｂａｎｄｉｒ＋ｇ　　ｐａむｔ　 ｅ　ｒｎ）ＤＮＡ　ｒフィンガープリントＪを示す。

第１図は、また、Ｉ　ＳＭＹ−１または病原性を付与しない相同挿入配列を含有 しない、マイクバクテリアの４つの種からの制限したゲノムＤＮＡを使用した、 異なる、非虞に簡単なバンディングパターンを示す。この図面は、共有した複合 バンディングパターンがＣＤおよびＪＤの分離物の間のようなマイクバクテリア の間の同一性を実証し、ならびに異なるマイコバクテリアを正確に区別する方法 を図解する。

第２図は、オランダ国アルステルダムおよび米国ロサンジエルスからの独立のＣ Ｄマイコバクテリア分離物（両者はトリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ）と異なる）の 間の同一性を示すことによって、ｍ１図を支持する。

ｍ３図は、り”−７ｐＭＢ２２１．：８１ｔ６、本発明ｃｙ）配列ＩＳＭＹ、− １−含有するインサートＤＮＡの５．ｋｂを特徴づける、制限地図を示す。第３ ［ｍ、また、トリ結核Ｗｌ　（Ｍ、　　ａ′ｖｌｕ　ｍ）およびバラ結ｍｍのＤ ＮＡから得られたマツピングデータを示し、バラ結核ｍのＤＮＡ　７フンキング ｌＳＭＹ−１が、トリ結核Ｍ　（Ｍ−ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）における同一部位に これは、Ｉ　ＳＭＹ−１がパラ結核菌のゲノム中にこの部位において挿入され、 そして放散性の表現型の可能な原因であることを示す。第４図は、また、ｐＭＢ ２２においてクローニングしたインサートを特徴づけ、部分的Ｄ　Ｎ　Ａ配列の データはＩ　ＳＭＹ−１挿入要素に及ぶ、、第５図は、トリ結核ｍ　（Ｍ、　ａ 　ｖ　ｉ　ｕｍ）の１系列の病原性菌株から得らｔｌを二多数のバンディングパ ターンを示し、こイ１らはｐＭＢ２２中に存在する挿入配列Ｉ　ＳＭＹ−１に関 係する他のｌ　ＳＭＹ配列を含りすることを示す。

これらの関係するＩＳＭＹ−１配列は、これらおよび他のづイフバクテリアのｆ Ｆ［［性、とくに１・り結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）の病原性 において含ま／−ｘｆ＊る。第５図は、また、さらに病原性マイクバクテリアを 同定し、そしてそれらをｍＶ的マイクバクテリアから区別するｊ二めのＤＮＡの フィンガープリンティングのｆｆｆｉ用を％Ｍする。

パラ結核菌およびトリ結核菌（Ｍ、ａｖ日＋ｍ　　＋＝ｏｍｐｌｅｘ）の間の弁 別。パラ結核ＷＡＴＣＣ１９６９８、バラ結核ｍＩＷ株Ｂｅｎ、およびトリ結核 ＷＪ　（Ｍ、　　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）血清型２　（Ｃａｄｃｌｉｇ１６７４１ ）からのＤＮＡを、制限エンドヌク１／アーゼＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲｌ、Ｂｓｔ ＬΔｖ’ａｌ、Ｐｓｉ、Ｈｉ　ｎ　ｆ　Ｔ、Ｈａｅ　Ｉ　Ｔ　１％５ａｕ３Ａ。

Ｈｉｎｃｌ、Ｐｖｕｌｌ、Ｐｖｕｌおよび′ｒａ　ｇ　Ｉで消イｅし、電気永動 し、ブロッティングし、そして放射線標識したり青−ン、ｐ、ＭＢ７．９ＭＢ１ ２、ｐＭＢ　１６、ｐＭＢ］７、ｐＭＢ１９、ｐＭ１１’２０、ｐ　Ｍ　Ｂ２１ 、ｐＭＢ２２でブロービングし１．そしてＤＮＡ試料を区別するＲＦＬＰｓにつ いて検査した。、（本発明の挿入配列ｖｔフクロ　′／ｐ　Ｍ’Ｂ　２２の誘導 化を実施例５に記載する）。い°くつかのＲＦ　Ｌ　Ｐ　ｓｌまトリ結核菌（Ｍ 、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）およびパラ結核菌を区別することが分かった［７１゜ しかしながら、ＲＦ　Ｌ　Ｐ　ｓはパラ結核菌Ａｒｃｃ１９６９８８よびパラ結 線Ｍ菌株Ｂ　ｅ　ｎ−、複合バンディングパターンを包含する、を、ＩＳＭＹ− １挿入配列を含有するｐＭＢ２２で区別することが分かり［７１、これらの２つ は遺伝子的に同一であることを示唆する。パラ結核菌であると推定されるワクチ ンｒＩ４株１８は、さらに、トリ桔槁隋（Ｍ、　ａ　ｖ　＋ｕｍ）血清型ｌと事 実同一おることが示された［８］。

クローン病（ＣＤ）Ｕ＜導バクテリアの同定。ＣＤ組織からのマイクバクテリア のいくつかの分離物は、パラ結核菌と関すると考えられた［６゜９ｊ、しかしな がら、バラ結核ＲＢよびトリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ）（とくにミコバクチン依 存性トリ結核薗（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ）　）を正確に区別することが不可能 である、従来の技術は、こねらのＣＤ分＃物の同一性を残した。トリ結核Ｎ（Ｍ 、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）Ｒ’ｆ株は健康な被検体から分離することが でき、そして普通の環境的有機体である［ｌＯ］ので、ＣＤＩ！導菌株の正確な 同定はＣＤにおけるそれらの病因学的意味の評価に対して重要である。したがっ て、ＤＮＡを３つのＣＤ誘導菌株（Ｂｅｎｂ　Ｌｉｎｄａ８よびＤｏｍｉｎｉｃ ）［６］％およびまた、トリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）血清 型２、トリ結核Ｍ（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）血清型５、マイコバク テリウム・カンサシイ（Ｍ、ｋａｎｓａｓ　ｉ　ｉ）８よびマイコバクテリウム ・７レイ（Ｍ、　ｐｈ　ｌ　ｅ　ｉ）から抽出した。ＤＮＡを制限エンドヌクレ アーゼで消化し、そしてバラ結核菌およびトリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏ ｍｐｌｅｘ）血清型２を弁別する前述のＲＦＬＰｓを同定する本発明のＤＮＡク ローンでプロービングした。６つの異なるＲＦＬＰｓを研究した。３つのＣＤ誘 導菌株の各々は、バラ結核菌と同定であることが示された［７］　（第１図）。

これらの発見は、本発明のクローンｐＭＢ２２を含をするＩ　ＳＭＹ−１を使用 して、２つのそれ以上特徴づけされていないヒトＣＤマイコバクテリア分離物、 それぞれ、米国においてギトニク（Ｇｉｔｎｉｋ）博士およびピーマン（Ｂｅａ ｍａｎ）博士ＵＣＬＡおよびオランダ国アムステルダムＪ、ハーグスマ（Ｈａａ ｇｓｍａ）博士（Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｖｅｔｒｉｎａｒｙ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕ ｔｅ）の２つの独立の研究所から得た４１０およびＨｌからの制限したＤＮＡを プロービングした。同一のバンディングパターンが得られ、これらのそれ以上の ＣＤ分離物は、再び、バラ結核菌を含有するＩＳＭＹ−１であった（第２図）。

本発明の同様な方法およびＤＮＡグローブを使用して、ヨーネ病で感染した雌牛 から分離したバラ結核菌の８菌株の同一性を検査した。分離物を英国、フランス 国および米国において感染した動物から独立に誘導し、ならびに追加の分離物を ヨーネ病に類似する病気に悩まされるオナガザル（Ｍａｃａｑｕｅ　　ｍｏｎｋ ｅｙ）から誘導した［１１］、プローブｐＭＢ１４．２ＭＢ２０およびｐＭＢ２ ２を使用するＲＦＬＰ分析は、すべての菌株がｐＭＢ２２について第１図および １１２図において見られるものへの同一のバンディングパターンを与えることを 明らかにし、病深性パラ結核薗の保存された性質を実証した。挿入配列ＩＳＭＹ −１を含有するクローンｐＭＢ２２を使用するブロービングは、菌株の各々につ いて同一のバンディングパターンを明らかにした。

マイコバクテリアのトリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ　　ｃ　ｏｍｐ　ｌ　 ｅ　ｘ）の構成員は、従来の技術により特徴づけおよび定義することは困難であ った。われわれは、記載する本発明のマイコバクテリアのプローブおよび方法を 使用して、ある範囲のトリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）菌株を 検査した。いくつかの異なるパターンが得られた［８］。

血清型２．４．５．６および８は、菌株のタイプの間の２％のＤＮＡ塩基置換よ り少ないものに類似することが分かった。しかしながら、少なくとも６つの菌株 タイプのバンディングパターンは認識された。トリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　 ｃｏｍｐｌｅｘ）血清型１１，１６および２７は、お互いにおよび血清型２．４ ．５．６．８群の間の１３％のＤＮＡ塩基置換より大きく有することがわかった 。これらの菌株は従来ヒト肺病巣（Ｍ、１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）または 中間の菌株と表示されていた。われわれは、この研究から、血清型２．４．５． ６および８を使用して得られたものに類似するバンディングパターンを与えるト リ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）菌株をトリ結核菌（Ｍ、ａｖｉ ｕｍ）と表示し、そして血清型１１％　１６および２７により表される異種の菌 株をヒト肺病巣（Ｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　　ｃ。

ｍｐｌｅｘ）［８］　と表示することを提案した。本発明のより高い分解能のＤ ＮＡプローブ法を使用する菌株型の決定は、常に、従来の血清型の決定と対応し なかった。

マイコバクテリアの特異的同定のための本発明のクローニングしたＤＮＡプロー ブの使用は、また、マイコバクテリアで生体内感染した組織のＤＮＡ抽出物に適 用可能である。これを実証するために、われわれがマイコバクテリアＤＮＡの抽 出に開発した方法を使用して、鼠らい病（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　Ｉｅ ｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）で感染したマウス肝臓を抽出した［８］。抽出したＤＮ ＡをＰｖｕ　Ｉ　Ｉで切断し、電気泳動し、ブロッティングし、そしてｐＭＢｌ 　２、ｐＭＢｌ６．２ＭＢ２０およびｐＭＢ２２でブロービングしｔ；。特異的 バンディングパターンはマウス肝臓からの鼠らい病（Ｍ、ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉ ｕｍ）について得られ、これはこの有機体がトリ結核菌（Ｍ、ａｖ　ｉ　ｕｍ） に密接に関係することを示し、それとトリ結核菌（Ｍ−ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐ ｔｅｘ）血清型２との間のほぼ２％の塩基置換を有した［８］。

施例５、本発明のマイツバクチリア挿入配列（ｒｓＭＹ）の同定、クローニング および　差ハイブリダイゼーシッン挿入配列およびトランスポゾンは、ゲノムＤ ＮＡ内のＤＮＡの短い反復片であり、適当な環境的条件に対して応答して移動す ることができる。

それらはそれらがエンコードする成分を通すか、あるいは隣接する宿主遺伝子ま たはそれらが挿入されるようになる宿主遺伝子へのそれらの影響によって、それ らの生物学的作用を発揮する。これらの要素は自然に広く存在し、そしであるバ クテリア、酵母、植物、毘虫および動物において同定されてきている［１２］。

それらは、従来、マイコバクテリアにおいて同定されてきていない。

本発明の主要な面は、マイコバクテリアの病気分離物における関係する挿入配列 の新規な族の、最初の、同定からなる。挿入配列のこの族はＩＳＭＹと表示し、 そしてＩＳＭＹの１つの例（ＩＳＭＹ−１）をわれわれはクローニングし、そし て詳細に特徴づける。本発明の１イコバクテリアの挿入配列のＩＳＭＹ族の構成 員は、配列の相同性を共有させ、そしてｐＭＢ：２　［工業および海洋のバクテ リアの国際収集物（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ 　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　ａｎｄ　　ＭａｒｉｎＰ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）、 スコツトランド、エイバーディ−〉・、に受託されに１において低いストリ〉・ ジェンパ／−ストリ〉ジエ〉・シー（Ｓ　ｔ　ｒｉｎｇｅｎｃｙ）で、ＩＳＭＹ −１どハイブリダイゼーションすることによって同定する。Ｉ　ＳＭＹ族の構ａ ：員によりエンコードされるＤＮＡまたはＲＮＡのすべてまたは一部分およびＩ ＳＭＹによりエンコードされるか、あるいはＩＳＭＹによる発現において突然変 異または変更しｊ−、タンパク質またはペプチドのすべてまｊ−は一部分は、Ｉ 　ＳＭＹを含有する病気を引き起こすマイコバクテリ丁についての診断法の新規 な範囲における使用に適用することができる。本発明のＩＳＭＹは、また、特異 的欠失またはトランスフェクシシンにより、新規なワクチン、免疫治療剤、また は診断剤を提供するための、突然変異体または組み換え体バクテリアの発生に使 用される。

バラ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｐａｒａｊｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ ｓ）のクローン病分離物からのゲノムＤＮＡを使用して、前述の標準技術により プラスミドベクターｐＧＥＭ−１およびＥ、ｃｏｌｉＤＨＩ細胞を使用してゲノ ムＤＮＡ組み換え体ライブラリーを発生させた。このライブラリーは、バラ結核 菌、マイコバクテリウム・カンサシイおよびトリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ 　ｍ）から誘導した放射線標識ＤＮＡプローブでスクリ・−二〕／グした。バラ 結核菌に強くハイブリダイゼーションするが、トリ結核菌およびマイコバクテリ ウム・カンサシイに弱くハイブリダイゼーションしたわずかに１つのクローンが 存在し、そしてわれわれはこのクローンを９ＭＢ２２と表示した。これを取り上 げ、そして約５ｋｂのインサートを含有することが分かった。この組み換え体Ｄ ＮＡ断片を切除し、精製し、それ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そし てプラスミドベクターｐＧＥＭ−１、またはＭ１３７アージベクターｍｐ１８お よびｍｐｌ、９中にスクリーニングした。生ずるクローンをバラ結核菌ＤＮＡに ハイブリダイゼーションし、そして強ぐ陽性のクローンを同定１〜だ、９ＭＢ２ ２における５ｋｂの挿入内の選択したヅブクローンの位置、それらのあるものは パラ給液１！ＤＮＡと強くハイブリダイゼータ５：／シｊ；、を示す（第３Ａ図 ）。９ＭＢ２２を収容するｌ’：、ｃｏｌｉ菌株ＤＨＩは、グダベスト条約に従 い、工業および海洋のバクテリアの国際収集物（ｔｈｅ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　 　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　ａｎｄ　　Ｍａ ｒｉｎｅ　　Ｂａｃ：ｔｅｒｉａ、：）、スフ・／トラフト、エイバーデイーン 、に１９８７年４月２４日にＮＣＩＢ　　Ｎｏ、１２４６１で受託された。

！施例６、ｄ二椎倍臭史９燻Δ配男μｍ多−ｊ４　Ｙ二ｌ−この節は、パラ結核 菌中のＩＳＭＹ−１が挿入配列であること、およγＥこれらがこの有機体の病原 性をもって分離することを示す証拠を記載する。

バラ結核菌ＤＮＡをＢａｍＨＩ、Ｓｓ　ｔ　Ｉ、ＥｃｏＲＩおよびＢｓｔｌで切 断肱電気泳動し、ブロンディングし、そして９ＭＢ２２およびそのサブクローン ｐＭＢ２２／Ｓ４およびｐＭＢ２２１５１２に７・イブリダイゼーシッンした。

各場合においで、はぼ８つの強く／１イブリダイゼーシｉンするバンドが得られ た。この手順を制限エンドヌクレアーゼ、Ａｌｕｉ、ＡｖａＩ、ＰｓｔＩ、Ｐｖ ｕ　Ｉ　ＩおよびＰｚｒｕＩを使用して反復すると、はぼ１６の強くハイブリダ イゼーションするバンドが９ＭＢ２２およびそのサブクローンＳ４で見られたが 、これらのバンドの８つのみのサブセットがｐＭＢ２２サブクローンＳ１２にノ ）イブリダイゼーションした。パラ結核菌ゲノムＤＮＡをＨｉ　＊　ｆ　Ｉで消 化すると、９ＭＢ２２およびｐＭＢ２２／Ｓ４と強く／＼イブリダイゼーシコン する２つのバンドが得られ、それらの１・つのみは、また、ｐＭＢ２２／Ｓ４と ハイブリダイゼー・／２ンした。次いで、９ＭＢ２２およびそのサブクローンＳ ４および５１２を使用１７て、トリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ）血清型２ 　（Ｃａｄｄｉｇｇ１６７４１）および血清型５　（２５５４６−７５９）の２ つの実験室菌株から得られたＢａｍＨＩ制限ゲノムＤＮＡのサザンプロットをプ ロービングした［７］。単一のバ〉・ドがトリ給液勇（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ ）菌株でｐＭＢ２２プローブを使用しで見いだされた。

ｐＭＢ２２１５１２はトリ結核菌（Ｍ７ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）血清型２のＤＮＡ にハイブリダイゼーションせず、そしてｐ　Ｍ　Ｂ　２２　／　Ｓ　４は非常に 献く単一のバンドにハイブリダイゼーションし、た。

これらの結果が、突施例５における結果と一緒に、示すように、９ＭＢ２２はバ ラ結核菌のゲ、Ｉム中に分散したほぼ８つのコピー中に存在するが、トリ結核菌 （Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｒｎ）血清型２中に存在しない配列を含有する。８つの ハイブリダイゼー・ジョンするバンドを与える酵素はクローンｐＭＢ２２内に含 有される挿入配列を切断しＣはならず、しまたがつてバンドの各々はＴ　ＳＭＹ 挿入要素の異なるゲノムの位置を表す。酵素、例えば、ｐｖｕＩＩは要素を１回 切断し、したがってゲノムのコピーの各々について２つの断片を生成する。配列 りＭＢ２２１５１２はＰｖｕＩＴ断片の１つから誘導されねばならず、これに対 してＰｖｕｌｌ／Ｓ４はｐｖｕ１１部位に及ぶ、酵素Ｈ４ｎｆＩは挿入要素内に 少なくとも３つの部位をもたなくてはならず、したがってＩＳＭＹのゲノムのコ ピーの各々は切断されて、同一の２つの内部のＩＳＭＹ断片、これに加えてフラ ンキングＤ　Ｎ　Ａ、を含有する異種のＩ　ＳＭＹ断片を与える。９ＭＢ２２の 詳細な制限エンドヌクレアーゼ地図を誘導し、そして示す（第３Ａ図）。

表されるデータが示十ように、試験したバラ結核Ｍおよびトリ結核菌（Ｍ、ａｖ ｉｕｍ　　ｃｏｍｐし＝ｘ）菌株は非常に密接に関係し、２つの種の間の１％よ り少なｕ）ＤＮＡ塩基置換を示す。しかしながら、広範な種類の地理学的源おｔ び病気の宿主から分離したバラ結核菌菌株の同・−性質は、バラ結核菌が畜生、 ヤギおよび霊長類の少なくとも１つの種に村い゛（３−木偶、および多分ヒトに おけるクローン病のいくつかの場合を引き起こす、保存されｊ；特異的病原体で あることを示唆する。これが示唆するように、バ５結核菌を特徴づけ、泗原性を 与え、そしてこれらの病気を引き起こさせる、特異的遺伝子の変化が存在する。

バラ結核菌へのＩＳＭＹＩ挿入配列の緊密な分離および検査したトリ結＃薗（Ｍ 、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）のほとんどの実験室菌株からのＩＳＭＹ−１の特異的 遺伝子は、ｉｓＭＹ〜１を、その病原性を付与するバラ結核菌において遺伝子の 変化の原因となる強い候補の配列とする。

９ＭＢ２２およびバＸｙ結核菌内で同定された、本発明の挿入配列ＩｓＭＹ−１ をフランキングするゲノムＤＮＡの有機化を、９ＭＢ２２およびサブクローンＳ ４、Ｂ８および５１２を使用して検査し、そして結果をトリ結核菌ゲノムＤＮＡ についての同様な研究と比較した。地図を示す（第３Ｂ図）。９ＭＢ２２におけ るＩＳＭＹ−１を７ランキングするゲノムＤＮＡは、トリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ 　ｉ　ｕｎ）およびバラ結核菌の間の検出可能な変化を示さず、制限地図におけ るどこかのこの領域におけるＤＮＡ間の塩基の置換の同様なレベルを示す。バラ 結核菌およびトリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）は進化的に非常に密接に 関係するので、パラ結核菌における反復要素ＩＳＭＹ−１の存在は、トリ結核菌 （Ｍ、ａｖｉｕｍ）からの分岐を引き起こすパラ結核菌により最近獲得されたＩ ＳＭＹ−１と匹敵する。あるいは、配列Ｉ　ＳＭＹ−１は、進化の間にトリ結核 菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ）から欠失されて、そのパラ結核菌からの分岐を引 き起こすことがありうる。後者の提案はバラ結核菌のゲノムからのＩＳＭＹ−１ のコピーの各々の正確な切除および欠失を必要としく極端にあり得ない事象）、 前者の説明はよりもつともらしい。反復配列ＩＳＭＹ−１は挿入配列として知ら れている遺伝子要素の例を形成するである″）［１２］。Ｔ　ＳＭＹ−１１７） ＤＮＡ配列を、−末鎖のＭ１３配列決定により決定し、そして示す（第４図）。

実施ｆＰｌ！７、他のマイコバクテリアのＩＳＭＹ関連配列この節は、相同性を 共有することによってＩ　ＳＭＹ−１に関係づけられ、そして９ＭＢ２２または そのサブクローンとの適当な実験条件下のハイブリダイゼーションにより同定さ れる、他の病原性マイコバクテリア中の配列の存在を実証する。Ｉ　ＳＭＹ−１ を使用するときのように、ＩＳＭＹ族の他の構成員はマイコバクテリア宿主に病 原性を与えると思われる。

野生ハト（ｗｏｏｄ−ｐｅｇｅｏｎ）、シカ、ヤギ、ブタおよびアルマシロから 分離したミコバクチン依存性菌株およびまたトリ結核菌（Ｍ。

ｌｙｉｕｍ）血清型２およびバラ結核菌の収集物からのＤＮＡを９ＭＢ２２およ びそのサブクローンとハイブリダイゼーシヨンした。ミコバクチン依存性トリ結 核菌（Ｍ、ａｖ　ｉ　ｕｍ）菌株のハイブリダイゼーションは、トリ結核菌（Ｍ −ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）血清型２からのＤＮＡを使用するものに類似するバンデ ィングパターンを与えたが、またトリ結核菌（Ｍ。

ａｖｉｕｍ）血清型２中に存在しない、１系列の追加のバンドを示した（第５Ａ 図）。高いストリンジエンシーに８いて洗浄したとき、これらの追加のバンドか らのシグナルのほとんどは選択的に除去された。代表的ＤＮＡの試料をサブクロ ーンｐＭＢ２２／Ｓ４でプロービングしたとき、これらの追加のバンドは強くハ イブリダイゼーションしたが、１つのみのかすかなバンドは、７ランキングＤＮ Ａから誘導した、トリ結核菌（Ｍ、ａｖ　ｉ　ｕｍ）血清型２を使用して得られ た（第５Ｂ図）。サブクローンｐＭＢ　２２／Ｓ　Ｌ　２はバラ結核菌ＤＮＡに おいてｒＳＭＹ−１とハイブリダイゼーションしたが、アルマシロ誘導ミコバク チン依存性菌株である試料１５７Ｒおよび１５７Ｓにおいて単一のバンドにのみ ／＼イプリダイゼーシ１ンした（第５Ｃ図）。バラ結核菌１０９１１の非ミコバ クチン依存性アルマシロ誘導菌株は、９ＭＢ２２／Ｓ４またはｐＭＢ　２２／Ｓ 　１２のいずれにもハイブリダイゼーションしなかった。これらのＤＮＡ試料を 無関係のパラ結核菌ＤＮＡプローブでプロービングしたとき、非常に類似するか 、あるいは同一のバンディングパターンがすべての菌株から得られｔ；。

これらの結果が示すように、トリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ）の病原性ミ コバクチン依存性菌株は病原性バラ結核菌に８けるＩＳＭＹ−１に関係する挿入 配列を含有する。菌株１５７Ｒおよび１５７ｓは、ＩＳＭＹ−１が９ＭＢ２２／ Ｓ４およびｐＭＢ２２／Ｓ１２の両者にハイブリダイゼーションしたので、ＩＳ ＭＹ−１に密接に関係する挿入配列を含有する。シカ、ヤギ、野生ハトおよびブ タのマイコバクテリア中に存在する挿入配列は、Ｉ　ＳＭＹ−１にそれほど密接 に関係せず、そしてｐ　Ｍ　Ｂ２２／Ｓ　ｌ　２に対して相同性の配列を含有し ない。バンディングパターンはこの群において異なる菌株のいくつかに類似し、 そしてこれらの菌株において挿入配列はＩＳＭＹ−２と表示した。

それ以上の選択し、ないトリ結核菌（Ｍ、　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）菌株を、ＩＳ ＭＹ族の挿入配列の存在について研究した。いくつかの菌株はＩＳＭＹ−２また は関係する挿入配列を含有することが分かったが、今日まで、ＩＳＭＹ−１を含 有する他のマイコバクテリアの菌株は同定されてきていない。２つのそれ以上の 病原体が、ＩＳＭＹの関係する挿入配列を含有することが分かった。らい病バチ リスらい病（Ｍ−１ｅｐｒａｅ）からのＤＮＡは、９ＭＢ２２／Ｓ４にハイブリ ダイゼーションした配列を含有する。ラットらい病バチリス鼠らい病（Ｍｙｃｏ ｂｃｔｅｒｉｕｍｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）からのＤＮＡは、９ＭＢ２２／Ｓ ４にハイブリダイゼーションしたが、ｐＭＢ２２１５１２にハイブリダイゼーシ ョンしなかった配列を含有した。

これらの結果が示すように、Ｉ　ＳＭＹ−１に関係する挿入配列は、ある数のマ イコバクテリア病原体において、とくにエイズ（ＡＩＤＳ）患者から分離したも のを包含するトリ結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｔｅｘ）内に見いだされ る。われわれは、２０より多いそれ以上の主として腐生性および環境的マイコバ クテリア種および菌株をスクリーニングし、そしていずれもＩＳＭＹ族の挿入配 列を含有しないことが分かった。ＩＳＭＹはマイクバクテリアの病原性をもって 分離するように思われる。

本発明の応用および用途 特定のマイコバクテリアから誘導した組み換え体ＤＮＡライブラリー、あるいは このようなライブラリーからの情報に基づきモしてマイコバクテリアの菌株また は表現型の特異的について選択しｔ；合成のＤＮＡからの、本発明のクローニン グしたＤＮＡプローブは、マイクバクテリアのＤＮＡまたはＲＮＡの特異的同定 むよび他の微生物の配列からのマイコバクテリアの弁別において使用される。こ のような特異的マイコバクテリアのＤＮＡプローブは、また、マイコバクテリア の菌株および種の間の正確な弁別および表現型の性質、例えば、媒質感受性およ び病原性の認識または予測のために使用される。

さらに、配列ＩＳＭＹ−１（ＮＣＩＢ　　Ｎｏ、１２４６１で受託されたｐＭＢ ２２中の）、ＩＳＭＹ−２、およびＩＳＭＹ−１と部分的相同性を共有する本発 明のマイコバクテリアの挿入配列のＩＳＭＹ族の他の構成員のすべてまたは一部 分から誘導した、ＤＮＡまたはＲＮＡのプローブまたは合成オリゴヌクレオチド は、マイコバクテリアの潜在的に病原性の菌株の特異的検出のためのプローブと して使用される。これらは次のものを包含する：パラ結核菌、トリ結核菌（Ｍ、 　ａ　ｖ　ｉ　ｕ　ｍ）の病原性の形態、エイズの重感染において含まれるもの を包含する、およびＩ　ＳＭＹ配列を含有する他の病原性マイコバクテリア、ら い病（Ｍ、１ｅｐｒａｅンを包含する。

マイコバクテリアの正確な同定および弁別ならびり、ＩＳＭＹ含有＊含有菌原性 菌株的検出は、環境的試料、例えば、水、動物Ｈよびヒトの食物、および土の試 料に適用される。このような応用は、ヒトおよび動物におけるマイコバクテリア の病気の予防および公衆衛生の抑制において有用である。本発明の方法およびプ ローブを使用する試験は、また、組織、組織抽出物、体液、例えば、乳、および 排出物の医学および獣医学の試料に、ならびに生体外培養において成長したバク テリアの加速しｔ−同定および特徴づけに、およびこのような培養条件の改良に 適用される。

これらの応用は、マイコバクテリアの病気、例えば、畜牛および他の動物におい てヨー不磨、動物園の動物および鳥類におけるマイクバクテリアの病気、ヒトの マイコバクテリアの病気、例えば、らい病、トリ結槙ＩＩ　（Ｍ、　ａｖ　ｉ　 ｕｍ）の感染、エイズのマイコバクテリアの重感染、およびヒトのクローン病に おいて有用である。

試験において使用する方法において、ＤＮＡプローブは一本鎖まｔ；は二本鎖で あるか、あるいはＲＮＡ転写体であり、そして非標識であるか、あるいは放射線 、ヒオチニル、蛍光、酵素、免疫学的に、か、あるいは他の顕現剤または方法で 標識することができる。ＩＳＭＹのすべてまたは一部分を表すグローブは、溶液 相で使用するか、あるいはヒープ、管まｔ：は他のマトリックスの形態の、固相 の支持体、例えば、セルロース、ナイロン、ニトロセルロース、プラスチックま たはゲルの系に結合する。

試料を処理してマイコバクテリアのＤＮＡまＩ；はＲＮＡを解放する。機械的崩 壊および／または超音波処理および／または酵素処理および／または熱処理およ び７／または化学的処理を使用する。処理した試料を、ハイブリダイゼーション を可能どしかつヌクレアーゼの作用を防止するようｌ二設計して溶液中で、グロ ・−ブ（沸騰し１；、二本鎖である場合）と混合する。試料中に存８：するＤＮ ＡまたはＲＮＡを標的する特異的グローブのハイブリダイゼーションは、標準の 手順により達成される。

雑種の検出は、ある数の方法による。ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）を添加し て二本＠ＤＮＡまたはＲＮＡを結合することかでさ、次いでＨＡＰを洗浄しエハ イブリダイゼーションしないプローブを除去する。他の固体マトリックスを使用 して雑種を結合する。あるいは、ハイブリダイゼーションしないプローブは、− 木調特異的ヌクし・アーゼで消化し、次いで雑種をトリクロロ酢酸、エタノール または他の物質により沈澱させることによって除去する。雑種は使用する顕現法 に依存する方法により検出する。非標識プローブのＤ　Ｎ　Ａを固体マトリック スに結合し、そして試料へのハイブリダイゼーションに使用する。プローブの配 列に対して相同性の標的マイコバクテリアのＤＮＡまたはＲＮＡは、プローブを 経てマトリックスに結合するようになる。マトリックスを洗浄し、そして標的Ｄ ＮＡまｊ−はＲＮＡを加熱または変性溶液への移送により解放する。次いで、標 的ＤＮＡまたはＲＮＡを前述の方法により直接検出する。あるいは、ＤＮＡまた はＲＮＡをまずポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ［１２）　）により、ＤＮＡポリメ ラーゼまたは逆トランスクリプターゼ＋ＤＮＡポリメラーゼをプローブまたはＩ ＳＭＹ配列中に存在する特異的オリゴヌクレオチドブライマーと一緒に使用して 、増幅し、そしてこのようなブライマーは本発明のそれ以上の面を形成する。増 幅後、標的配列を前述の方法のいずれかにより検出する。検出は未反応のブライ マーおよびＰＣＲ反応において延長されたブライマー・との間の弁別を包含する ことができる。この場合において、ブライマーを標識し、そして検出を使用する 標識に依存する。非増幅のまＩ；は増幅した標的マイコバクテリアの配列へのグ ローブのハイブリダイゼーションは、標準の手順により、そしてドツトプロット 法またはＲＦＬＰＳの同定をまた使用する。

Ｔ　ＳＭＹ−１（ｐＭＢ２２中の）、ＩＳＭＹ−２およびｉ　ＳＭＹ−！との部 分的配列の相同性を共有するＩＳＭＹ族の他の構成員を包含する本発明のマイコ バクテリアの挿入配列のすべてまたは一部分を使用して、ＩＳＭＹ配列に基づく 制限酵素タンパク質またはペプチドまたは合成ペプチドを発生させ、そしてこの ような誘導された配列は、本発明のそれ以上の面を形成する。ＩＳＭＹによる発 現において突然変異体または変更したタンパク質をまた使用する。

ＩＳＭＹ誘導した組み換え体タンパク質およびペプチドは、また、ＩＳＭＹ含有 病原性マイクバクテリアの特異的検出のために、医学、獣医学、環境的および生 体外培養の試料に適用可能な標準の技術を使用して、免疫および他の診断のアッ セイにおいて使用する。このような診断イムノアッセイにおいて使用するための 、ＩＳＭＹｉｙｊ導したタンパク質またはペプチドに対する抗体は、ポリクロー ナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであっても、においてのそれ以上の 面を形成する。ＩＳＭＹ配列に基づく組み換え体タンパク質は、コンピューター に基づく構造の研究を使用するか、あるいはを使用しないで、特異的薬物の合理 的設計のために使用して、それらの生物学的作用を修飾または遮断する。組み換 え体ＩＳＭＹのタンパク質またはペプチドは、それら自体、治療剤として使用し て、生体内の特異的生物学的作用、例えば、免疫調節を仲介することができる。

ＩＳＭＹ族のｗ！ｌ成員のＤＮＡ配列のすべてまたは一部分を使用して、突然変 異体のバクテリアまたはウィルスを操作することができ、モしてＩＳＭＹ配列を 含有する突然変異体の形態は本発明のそれ以上の面を形成する。これらは、医学 および獣医学の実施において病原性マイコバクテリアにより引き起こされる病気 の予防のための特定のワクチンとして使用される。それらは、また、免疫治療ま たは診断法における因子として使用することができる。ＩＳＭＹから誘導された タンパク質またはペプチドは、また、同一の目的のためのワクチンとして使用さ れる。

６、マイコバクテリウム由来のＩＳＭＹ−１゜７、請求の範囲第３〜６”Ｊのい ずれかに記載のＤＮＡ配列のすべてまたは一部分に基づく、組み換え体ＤＮＡま たはＲＮＡ、まｔ；は合成オリゴヌクレオチドからなるＤＮＡまたはＲＮＡのプ ローブ。

８、請求の範囲第３〜６項のいずれかに記載の配列の存在による発現において、 突然変異するかあるいは他の方法で変更したＤＮＡ配列に基づく、組み換え体Ｄ ＮＡまたはＲＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドからなるＤＮＡまたはＲＮＡの プローブ。

９、顕現（ｒｅｖｅａ　Ｉ　ｉ　ｎｇ）標識を有する、請求の範囲第３〜８項の いずれかに記載のＤＮＡまたはＲＮＡのプローブ。

ｌ０１ＤＮＡまたはＲＮＡが免疫学的に活性であるタンパク質またはぺ／チドの 遺伝情報を指定するように、請求の範囲第３〜６項のいずれかに記載のＤＮＡま たはＲＮＡの配列を有するバクテリウムまたはウィルス。

ＩＬ試料をマイコバクテリウムのＤＮＡまたはＲＮＡについて請求の範囲第９項 記載プローブあるいは請求の範囲第１０項記載のバクテリウムまたはウィルスで アッセイすることからなる、マイコバクテリウムの菌株または表現型の存在また は不存在を検出する方法。

１２、密接に関係するマイコバクテリウムの菌株または種を正確に同定および弁 別する、請求の範囲第１１項記載の方法。

１３、マイコバクテリウムの菌株またはその１つはバラ結核菌（Ｍ。

ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である、請求の範囲第１１または１２項記 載の方法。

１４、マイコバクテリウムの菌株またはその１つはトリ結核菌（Ｍ。

ａｖｉｕｍ−４ｎｔｒａｃｅｌ　１ｕｌａｒｅ）またはトリ結核菌（Ｍ。

ａｖｉｕｍ　　ｃｏｍｐｌｅｘ）の群である、請求の範囲第１１または１２項記 載の方法。

１５、マイコバクテリウムの菌株またはその１つはらい病（Ｍ、１ｅｐｒａｅ） である、請求の範囲第１１または１２”Ｊ記載の方法。

１６、マイコバクテリウムまたはその１つはエイズ（ＡＩＤＳ）の重感染または 異型鞘液を引き起こす、請求の範囲第１１または１２項記載の方法。

１７、表現型は病原性または薬物抵抗性である、請求の範囲第１１項記載の方法 。

１８、マイコバクテリウムの菌株は、動物に８けるヨー不病（Ｊｏｈｎｅ’ｓ　 　ｄｉｓｅａｓｅ）またはヒトにおけるクローン病（Ｃｒ　ｏ　ｈｎ’　　ｓ　 　ｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こす、請求の範囲第」１または１２項記載の方法。

１９、試料は、体液、組織抽出物、排出物、生体外培養物または環境的試料から なる、請求の範囲第１１〜１８項のいずれかに記載の方法。

２０、請求の範囲第３〜９項のいずれかに記載のＤＮＡグローブを使用する、ポ リメラーゼ鎖反応酵素増幅法によりマイコバクテリアを検出する方法。

２Ｌ請求の範囲第３〜９項のいずれかに記載のＤＮＡまたはＲＮＡのすべてまた は一部分により、あるいは請求の範囲第１０項記載のバクテリウムまたはウィル スのＤＮＡまたはＲＮＡ、または同一構造の合成タンパク質またはペプチド、ｌ または２以上の他のタンパク質またはペプチドに組み込まれていてもよい組み換 え体または合成タンパク質またはペプチドにより、エンコードされた組み換え体 タンパク質またはペプチド。

２２、請求の範囲第２１項記載のタンパク質またはペプチドに対する抗体。

２３、請求の範囲第１Ｏ項記載のバクテリアまたはウィルス、請求の範囲第２１ 項記載の１または２以上の組み換え体または合成タンパク質またはペプチドある いは請求の範囲第２３項記載の抗体からなる、動物またはヒトにおけるマイクバ クテリアの病気に対するワクチン。

２４、活性成分として、請求の範囲第１Ｏ項記載のバクテリアまたはウィルス、 請求の範囲第２１項記載の１または２以上の組み換え体または合成タンパク質ま たはペプチドあるいは請求の範囲第２２項記載の抗体からなる、製剤学的調製物 。

２５、請求の範囲第３〜９項のいずれかに記載のＤＮＡまたはＲＮＡのプローブ 、請求の範囲第１Ｏ項記載のバクテリウムまたはウィルス、請求の範囲＠２１ｆ ｆ記載の組み換え体または合成タンパク質またはペプチドあるいは請求の範囲！ ２２項記載の抗体からなる、標識されていてもよい診断試薬。

２６、固相上に固定化された、請求の範囲第２５記載の標識されていてもよい診 断試薬。

２７．１つの成分として、請求の範囲第２５または２６記載の標識されていても よい診断試薬からなる、診断試験キット。

２８、ヒトに８けるクローン病または動物におけるヨー不磨の診断のための、請 求の範囲第２５または２６記載の診断試薬または請求の範囲８２７項記載の試験 キット。

０ＲＦＩ１９７のアミノ酸配列を含むＩＳＭｙｌのヌクレオチド配列。

ＴＣＣＴＴＡＣＣＴＴＴＣＴＴＧＡＡＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＧＧＣＣＧＴＣＧＣ ＴＴＡＧＧＣＴＴＣＧＡＡＴＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＣｌｏ　　　　　　　　２０ 　　　　　　３０　　　　　　４０　　　　　　５０．６０ＧＴＣＧＧＧＴＡＴ ＧＧＣＴＴ？ＣＡＴＧＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＧＴＴＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＡＧＧ ＡＧＡＴＴＧＧＣＣＧＣＣＣＧＣ７０８０９０Ｚｏｏ　　　　　　　１１０　　 　　　　１２０ＧＧＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＡＣＴＣＧＡＣＣＧＣＴＪＩＪｋＴ！ ’ＧＡＧＡＧＡＴＧＣＧＡＴＴＧＧＡＴＣ：ＧＣＴＧＴＧＴＭＧＧＡＣＡＣ：Ｌ ９０　　　　　　２００　　　　　　２１０　　　　　　２２０　　　　　　２ ３０　　　　　　２４０ＬＩＡＡＶＴＴＬＡＤＧＧＥＶＴＷＡ　　　工　　ＤＬ ＧＴＴＧＡＴ？ＧＣＧＧＣＧＧ’ｒ’ＧＡＣＧＡＣＧＴＴＧＧＣＣＧＡＴＧＧＡ ＧＧＣＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＣＧＡＣＣＴ３７０　　　　　　３ Ｂ０　　　　　　３９０　　　　　　４００　　　　　　４１０　　　　　　４ ２０ＬＲＡＧＤＤＩＡＶＥ’ＬＲＩＬＴＳＲＲ５ＤＴＣＴＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣ ＧＡＴにＡＣＡＴＣＧＣＡＧＴＣＧＡＧＣＴＧＣにＣＡＴＣＣ？ＧＡＣＣＡにＣ ＣＧＡＣＧ’！？ＣＣＧＡＬＶＡＤＲＴＲＡ　　工　　ＥＰＮＡＲＰＡＡＧＩＬ ＴＣＴＧＧ１’ＧＧＣＴＧＡＴＣににＡＣＣＣＧＧＧＣＧＡＴＣにＡＡＣＣＧＡ ＡＴＧＣにＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＣ！’ＧＧＡＡＴＡＣＴＳＡＬＥＲＡＦＤＹＮ ＫＳＲＡＡＬ　　工　　ＬＬＴＴＴＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＣＧＣＧＣＣＴＴＣ ＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧ八ＧＣＣＧＴＧＣＣにＣＧＣＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＴ ＡＣ７３０へ７４０　　　　　　７５０　　　　　　７６０　　　　　　７７０ 　　　　　　７８０ＧＹＱＴＰＤＡＬＲ８ＡＧＧＡＲＶＡＡＦＬＴＧＧＣＴＡＣ ＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＡＣＧＣＧＣＴＧＣＧＣＡＧＣＧＣＣＧＧＴＧＧＣＧＣＴ ＣＧＡＧＴＡＧＣＣＧＣＧＴＴＣＴ’Ｔ補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許 法第１８４条の８）平成１年１０月２４日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８８１０　Ｏ３１３ ２、発明の名称 公衆衛生、医学、および献医学の実施におけるマイコバクテリアのための診断法 およびワクチン３、特許出願人 ４、代理人　〒１０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正音の提出年月日 １９８９年７月２０日 ６、添付書類の目録 （１）補正音の写しく翻訳文）　　　　　　　　　　１通請求の範囲 １１マイコバクテリウム由来のＩＳＭＹ−１を含有するプラスミドｐＭＢ２２゜ ２、プラスミドｐＭＢ２２により形質転換された宿主細胞。

３、低いストリンジエンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）においてマイコバクテリ ウム由来のＩ　ＳＭＹ−１とハイブリダイゼーシゴンする、マイコバクテリウム のゲノムからのＤＮＡ配列。

４、マイコバクテリウム由来のＩＳＭＹ−１内の少なくとも２０ヌクレオチドの 隣接ストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）と少なくとも７０％の配列の相同性を有する 、マイコバクテリウムのゲノムかものＤＮＡ配列。

５、マイコバクテリウム由来のＩＳＭＹ−１と少なくとも７０％の配列の相同性 を有する、請求の範囲第４項記載のＤＮＡ配列。

６、マイコバクテリウム由来のＩＳＭＹ−１゜７、請求の範囲第３〜６項のいず れかに記載のＤＮＡ配列のすべてまたは一部分に基づく、組み換え体ＤＮＡまた はＲＮＡ、または合成オリゴヌクレオチドからなるＤＮＡまたはＲＮＡのプロー ブ。

国際調査報告 国際調査報告 ＧＢ　８８００３１３ ＳＡ　　　　２１９１８ 国際調査報告 ＧＢ　８８００３１３ ＳＡ　　　２１９１８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＩＳＭ−１を含有するプラスミドｐＭＢ２２。 ２、プラスミドｐＭＢ２２により形質転換された宿主細胞。 ３、低いストリンジェンシー（Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）においてＩＳＭ−１とハ イブリダイゼーションする、マイコバクチリウムのゲノムからのＤＮＡ配列。 ４、ＩＳＭ−１内の少なくとも２０ヌクレオチドの隣接ストレッチ（ｓｔｒｅｔ ｃｈ）と少なくとも７０％の配列の相同性を有する、マイコバクテリウムのゲノ ムからのＤＮＡ配列。 ５、アイコバクテリウム由来のＩＳＭ−１と少なくとも７０％の配列の相同性を 有する、請求の範囲第４項記載のＤＮＡ配列。 ６、ＩＳＬ４−１。 ７、請求の範囲第３〜６項のいずれかに記載のＤＮＡ配列のすべてまたは一部分 に基づく、組み換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ、または合成オリゴヌクレオチドから なるＤＮＡまたはＲＮＡのプローブ。 ８、請求の範囲第３〜６項のいずれかに記載の配列の存在による発現において、 突然変異するか、あるいは他の方法で変更した、ＤＮＡ配列に基づく、組み換え 体ＤＮＡまたはＲＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドからなるＤＮＡまたはＲＮ Ａのプローブ。 ９、顕現（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ）標識を有する、請求の範囲第３〜８項のいずれ かに記載のＤＮＡまたはＲＮＡのプローブ。 １０、ＤＮＡまたはＲＮＡが免疫学的に活性であるタンパク質またはペプチドの 遺伝情報を指定するように、請求の範囲第３〜６項のいずれかに記載のＤＮＡま たはＲＮＡの配列を有するバクテリウムまたはウイルス。 １１、試料をマイコバクテリウムのＤＮＡまたはＲＮＡについて請求の範囲第９ 項記載プローブあるいは請求の範囲第１０項記載のバクテリウムまたはウイルス でアッセイすることからなる、マイコバクテリウムの菌株または表現型の存在ま たは不存在を検出する方法。 １２、ＤＮＡプローブを使用する、制限断片一長さの多形性の同定により、マイ コバクテリウムの菌株、種または表現型を正確に同定および弁別する方法。 １３、密接に関係するマイコバクテリウムの菌株または種を正確に同定および弁 別する、請求の範囲第１１または１２項記載の方法。 １４、マイコバクテリウムの菌株またはその１つはパラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔ ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である、請求の範囲第１１、１２または１３項記載の 方法。 １５、マイコバクテリウムの菌株またはその１つはトリ結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ −ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）またはトリ結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ　ｃｏｍ ｐｌｅｘ）の群である、請求の範囲第１１、１２または１３項記載の方法。 １６、マイコバクテリウムの菌株またはその１つはらい病（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ） である、請求の範囲第１１、１２または１３項記載の方法。 １７、マイコバクテリウムまたはその１つはエイズ（ＡＩＤＳ）の重感染または 異型結核を引き起こす、請求の範囲第１１、１２または１３項記載の方法。 １８、表現型は病原性または薬物抵抗性である、請求の範囲第１１項記載の方法 。 １９、マイコバクテリウムの菌株は、動物におけるヨーネ病（Ｊｏｈｎｅ′ｓ　 ｄｉｓｅａｓｅ）またはヒトにおけるクローン病（Ｃｒｏｈｎ′ｓ　ｄｉｓｅａ ｓｅ）を引き起こす、請求の範囲第１１、１２または１３項記載の方法。 ２０、試料は、体液、組織抽出物、排出物、生体外培養物または環境的試料から なる、請求の範囲第１１〜１９項のいずれかに記載の方法。 ２１、請求の範囲第３〜９項のいずれかに記載のＤＮＡプローブを使用する、ポ リメラーゼ鎖反応酵素増幅法によりマイコバクテリアを検出する方法。 ２２、請求の範囲第３〜９項のいずれかに記載のＤＮＡまたはＲＮＡのすべてま たは一部分により、あるいは請求の範囲第１０項記載のバクテリウムまたはウイ ルスのＤＮＡまたはＲＮＡ、または同一構造の合成タンパク質またはペプチド、 １または２以上の他のタンパク質またはペプチドに組み込まれていてもよい組み 換え体または合成タンパク質またはペプチドにより、エンコードされた組み換え 体タンパク質またはペプチド。 ２３、請求の範囲第２２項記載のタンパク質またはペプチドに対する抗体。 ２４、請求の範囲第１０項記載のバクテリアまたはウイルス、請求の範囲第２２ 項記載の１または２以上の組み換え体または合成タンパク質またはペプチドある いは請求の範囲第２３項記載の抗体からなる、動物またはヒトにおけるマイコバ クテリアの病気に対するワクチン。 ２５、活性成分として、請求の範囲第１０項記載のバクテリアまたはウイルス、 請求の範囲第２２項記載の１または２以上の組み換え体または合成タンパク質ま たはペプチドあるいは請求の範囲第２３項記載の抗体からなる、製剤学的調製物 。 ２６、請求の範囲第３〜９項のいずれかに記載のＤＮＡまたはＲＮＡのプローブ 、請求の範囲第１０項記載のバクテリウムまたはウイルス、請求の範囲第２２項 記載の組み換え体または合成タンパク質またはペプチドあるいは請求の範囲第２ ３項記載の抗体からなる、標識されていてもよい診断試薬。 ２７、固相上に固定化された、請求の範囲第２５記載の標識されていてもよい診 断試薬。 ２８、１つの成分として、請求の範囲第２６または２７記載の標識されていても よい診断試薬からなる、診断試験キット。 ２９、ヒトにおけるクローン病または動物におけるヨーネ病の診断のための、請 求の範囲第２６または２７記載の診断試薬または請求の範囲第２８項記載の試験 キット。