JPH10507902A - Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｈｅｎｓｅｌａｅおよびｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａの核酸ならびにｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｈｅｎｓｅｌａｅおよびｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａ感染を診断するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 被検体におけるRochalimaea henselaeまたはその抗原性フラグメントの存在を検出することによって、該被検体におけるネコ引っ掻き病を診断する方法および細菌性血管腫症を診断する方法を提供する。免疫原量の、非病原性Rochalimaea henselaeまたはその免疫原性特異的決定因子、および薬学的に受容可能なキャリアを含むワクチンもまた提供する。被検体由来のサンプルにおけるRochalimaea quintanaに特異的な核酸の存在を検出することによって、被検体におけるRochalimaea quintana感染を診断する方法を提供する。Rochalimaeaの精製された、60-kDaの熱ショックタンパク質を提供する。Rochalimaeaの17-kDaの抗原性ポリペプチドもまた提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ROCHALIMAEA HENSELAEおよびROCHALIMAEA QUINTANAの核酸ならびに ROCHALIMAEA HENSELAEおよびROCHALIMAEA QUINTANA感染を診断するための方法 および組成物 発明の背景 ネコ引っ掻き病(CSD)は、永年、臨床学的および微生物学的にかなり重要な問 題である。毎年、米国では推定7000件のネコ引っ掻き病（cat scratch disease ）が生じている。CSDを診断する困難性、および他の症候群と混同し得る臨床学 的類似性のため、米国におけるネコ引っ掻き病の実際のケースの数は、１年当た り70000件近くであり得る。CSDは、側頭部をネコに引っ掻かれるか、あるいは咬 み付かれることに関連する亜急性局所的リンパ節炎として記載されており、CDS は場合によっては脳膜髄炎を生じる。 CSDの診断には問題がある。なぜなら、この疾患の病因因子は、以前には同定 されていないからである。未同定の桿菌が、Warthin-Starry株を用いて、CSDを 患う患者からのバイオプシーにおいて視覚化されているが、単離された培養物を 得る困難性のため、同定が妨害されている。CSDの病因因子は、近年では「Afipi a felis」であると提案されている(7)。これらの取り組みにも関わらず、この因 子を単離すること、あるいはネコ引っ掻き病を患うほとんどの人と関連づけるこ とはこれまで不可能であった。 臨床学的に関連する疾患（細菌性血管腫症(bacillary angiomatosis)(BA)）は 、血管の増殖による多数の腫瘍または腫脹によって特徴付けられる状態である。 BAは、免疫妥協状態（特にHIV感染）に関してしばしば見出される。未同定の桿 菌が、Warthin-Starry株を用いて、血管腫症組織において視覚化されている(28) 。血管腫症組織から抽出されたDNAは、Rochalimaea quintanaの16S rDNAに関連 するが、これと同一ではない16S rDNA遺伝子のフラグメントを含有することが示 された。このDNAは、生物の純粋な培養物からは得られなかった(28)。これらの 研究者は、患者の組織から感染生物を単離し得ず、従って組織中に観察 されたDNA配列と同定可能な疾患起因生物とを明確に関連づけ得なかった。これ らの組織において確認され得る生物および疾患を引き起こす実際の因子のいずれ もが、同定され得なかった。 従って、この疾患の集中的な調査および広範囲にわたる取り組みにもかかわら ず、CSDおよびBAの両方の病因因子は、同定されていない。本発明は、本明細書 中でR.henselaeと命名される、この両方の疾患を引き起こす生物の同定を記載し ている。 R.quintanaは、通常の個体および免疫抑制された個体の菌血症を伴う種々の臨 床学的症候群（持続性の熱を含む）に関連する(18、23、30、34)。R.quintanaと疾 患が関連するにもかかわらず、R.quintanaは、CSDにしっかりと結び付けられな い。CSDの病因をとりまく論議、およびR.quintanaとヒト疾患との関連が与えら れると、CSD患者由来のリンパ節組織における各々のこれらの生物を直接検出す る方法が必要である。 本発明は、被検体のR.quintana感染を検出する核酸ベースの方法を提供するこ とによって、その必要性を満たす。本発明の単離された核酸配列により、プライ マーおよびプローブが、そのような核酸ベース検出システムのために容易に設計 されることが可能となる。 R.henselaeによる患者の感染の存在を迅速に同定する必要も存在する。このよ うな感染の迅速かつ効率的な決定は、R.henselaeによる感染に関連する以前には 不明瞭であった徴候の診断の助けとなり、従って適切な処置経過の評価を促進す る。 本発明は、現在あるいは以前にR.henselaeに感染した患者の血清中で循環する R.henselae抗体の存在を検出するために必要な精製抗原性ポリペプチドを提供す ることにより、この必要性を満たす。この同一の精製抗原性ポリペプチドは、被 検体に存在するR.henselae抗原の存在を検出し、従って被検体がR.henselaeに現 在感染しているか、または以前に感染したかを決定する方法にそれ自体が用いら れ得る抗体を産生するために用いられ得る。 発明の要旨 本発明は、被検体内のRochalimaea henselaeまたはその免疫原性特異的決定因 子（immunogenically specific determinant）の存在を検出することによる、被 検体におけるネコ引っ掻き病を診断する方法および細菌性血管腫症を診断する方 法に関する。さらに、本発明によって、R.henselaeの抗原性決定因子に結合する 、被検体の抗体の存在を検出することによる、被検体におけるネコ引っ掻き病を 診断する方法、および細菌性血管腫症を診断する方法が提供される。 本発明はまた、R.henselaeの免疫原性ポリペプチドをコードする単離された核 酸を提供する。 本発明の核酸を含有するベクターも提供される。このベクターは、診断用およ び予防用の抗原性ポリペプチド試薬を産生する宿主発現系において用いられ得る 。 本発明はさらに、被検体由来のサンプル中のRochalimaea quintanaに特異的な 核酸の存在を検出することによる、被検体のRochalimaea quintana感染を診断す る方法に関する。 図面の簡単な説明 図１は、R.henselaeに関する生物間の、共移動(comigrate)DNAフラグメント数 および推定配列分岐率を示す。かっこ内の数字（対角線上）は、各々の種の分析 に用いられた総フラグメント数を示す。右上領域の割合は、各対の種についての 共移動DNAフラグメントの数を両方の種について存在するフラグメントの数で割 った数を示す。左下の数は、推定配列分岐率に対応する。 図２は、ネコ引っ掻き病症候群であると診断された人の中でのR.henselae特異 的抗体の分布を示す。 図３は、健常者中のR.henselae特異的抗体の分布を示す。 図４は、プライマーCAT1およびCAT2ならびにオリゴヌクレオチドプローブRH1 およびRQ1に対応する、抗原遺伝子の３つの領域についてのヌクレオチド配列ア ライメントを示す。抗原遺伝子配列を、プライマーおよびプローブ配列に対応す る部分のみを用い、最大限の相同性について整列した。R.henselaeについての配 列および他の種について対応する塩基置換（R.henselae配列由来）が示され、そ して保存部位はピリオドで示される。PCRプライマーCAT2の相補鎖が示 される[CAT2(C)]。 発明の詳細な説明 精製R.henselae抗原 本発明は、R.henselaeの免疫原性特異的タンパク質または抗原性ポリペプチド フラグメントを提供する。これらの免疫原性特異的タンパク質またはポリペプチ ドは、R.henselaeに特異的に結合する抗体に特異的に結合するタンパク質または ポリペプチドである。R.quintanaの免疫原性特異的タンパク質またはポリペプチ ドフラグメントは、R.quintanaに特異的に結合する抗体に特異的に結合するタン パク質またはポリペプチドフラグメントである。特異的結合とは、特定の種以外 の生物由来の抗体または抗原との交差反応がないことを示す。本明細書から意図 されるように、R.henselaeおよびR.quintanaの両方について特異的な抗原または 抗体は、これら両方の細菌由来の抗体または抗原に結合し得るが、他の生物由来 の抗体または抗原には結合し得ない。 R.henselaeまたはR.quintanaの免疫原性特異的決定因子は、生物の化学的また は機械的粉砕によって生物体から単離され得る。例えば、生物の炭水化物部分は 、標準的な方法（例えば、プロテアーゼを用いて生物を消化し、タンパク質部分 を除去する方法）により得られ得る。 あるいは、R.henselaeまたはR.quintanaのタンパク質部分は、イオン性界面活 性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）または非イオン性界面活性剤(例えば 、Triton X-100(Ｃ₃₄Ｈ₆Ｏ₁₁平均)またはエチルフェニル-ポリエチレングリコー ル(NP-40、Shell Oil Company))を用いて生物体を処理することにより得られ得 る。このようにして得られたタンパク質フラグメントは、上記のように免疫原性 および特異性について試験され得る。生物の他の免疫原性特異的決定因子は、上 記の標準的な方法により得られ得る。 本発明の免疫原性特異的決定因子または抗原性ポリペプチドは、R.henselaeま たはR.quintanaの免疫原性特異的決定因子をコードする核酸配列を含有するベク ターを合成することにより得られ得る。R.henselaeの免疫原性決定因子をコード する核酸の例が本明細書中（特に実施例３および４）で提供される。次い で、このベクターは、免疫原性特異的決定因子が合成され得る宿主に置かれ得る 。免疫原性特異的決定因子をコードする核酸配列の選択は、生物のDNAのクロー ンライブラリーをスクリーニングすることにより達成され得る。簡潔に言えば、 １％ドデシル硫酸ナトリウムおよびプロテイナーゼＫを用いる標準的な手順によ り、細菌を溶解し、そしてDNAを抽出する。次いで、得られたDNAを制限エンドヌ クレアーゼEcoRIで消化し、サイズ分両し、そしてゲル精製し（アガロースゲル 電気泳動）、そして標準的な手順（例えば、Maniatisらに記載されている手順(2 0)）に従って、λファージベクターλ ZapII中にクローン化する。組換えプラー クを、一次抗体（E.coli溶解物で吸収されるヒトあるいは非ヒト（例えば、ネコ ）の回復期血清である）とともにELISAにより、抗原産生についてスクリーニン グする。あるいは、組換えクローンにより産生される抗原は、抗原を発現させ、 そしてネコ引っ掻き病と診断された患者から得られる抗体含有血清とその抗原と をインキュベートすることにより、スクリーニングされ得る。次いで、R.hensel ae特異的抗原を発現するこれらの組換えクローンは、通常の方法により同定され 得る(14)。抗原発現クローンは、続いてサブクローン化され、配列決定される。 次いで、各々の種について特異的なプローブが得られ得る。 種特異的抗原を発現するサブクローンは配列決定され、対応する合成ペプチド が、診断用抗原または免疫原として用いるために、推定アミノ酸配列から構築さ れ得る。あるいは、適切な宿主細胞株におけるポリペプチド発現ベクターから合 成される組換え抗原は、アフィニティクロマトグラフィー、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動、高速ペプチド液体クロマトグラフィー(FPLC)、高圧液体クロマト グラフィーなどにより精製され得る。 例えば、本発明は、17kDa（17キロダルトン）の適切な分子量を有する148アミ ノ酸の読み取り枠を有するポリペプチドをコードする、配列番号11として配列表 に記載されているような、単離された核酸を提供する。実施例４に示されるよう に、この精製ポリペプチドは、ネコ引っ掻き病と診断された患者の血清中に存在 する抗体に特異的に結合する。従って、この単離されたポリペプチドは、診断用 の価値ある試薬を提供する。 同様に、本発明はまた、配列番号７として配列表に記載されているような単離 された核酸を提供する。この単離された核酸によりコードされるポリペプチドは 、60kDa（60キロダルトン）の適切な分子量を有する503アミノ酸の読み取り枠を 有し、R.henselaeのhtrA遺伝子によりコードされる熱ショックタンパク質を表す 。実施例３に示されるように、この単離された核酸は、R.henselae感染の核酸ベ ース検出アッセイに有効な診断試薬を提供する。 抗原のアミノ酸配列が提供されると、標準的なペプチド合成技術を用いて、抗 原の免疫反応性領域に相同なペプチドフラグメントを合成し、そしてこれらのフ ラグメントを通常の技術を用いてそれらの抗原性について試験することもまた可 能である(14)。これらの抗原性フラグメントはまた、推定配列の特定のアミノ酸 残基の付加(inclusion)、欠失、または改変により改変され得る。従って、提供 される抗原由来の非常に多くの数のペプチドの合成または精製が可能である。 同様に、提供される抗原性ポリペプチドのフラグメントは、インビボでのペプ チド合成のために、ペプチド発現ベクター中にクローン化され得る。このような インビボで合成されたポリペプチドは、アフィニティクロマトグラフィーのよう な技術を用いて、容易に精製され得る。 本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、いくつかのさらなる特性（例えば、 可溶性）を提供するように設計された配列に結合した抗原の免疫反応性部分を含 有し得る。ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、１またはそれ以上のアミノ酸が 他のアミノ酸で置換された配列を包含し得、それらは、いくつかのさらなる特性 （例えば、ジスルフィド結合し得るアミノ酸を除去／付加する、その生体長寿性 (bio-longevity)を上昇させる、酵素活性を変化させる、あるいは胃酸との相互 作用を変化させる）を提供する。どのような場合でも、ペプチドは生物活性特性 （例えば、免疫反応性、免疫原性など）を有する。 非病原性のR.henselae抗原またはR.quintana抗原は、標準的な技術を用いて、 生物を改変することにより誘導され得る。例えば、全細胞抗原は、γ放射を受け 、その生物を非病原性にし得る。全細胞抗原を不活性化する他の標準的な方法と しては、β-プロピオラクトンまたはホルマリンでの処理が挙げられる(14)。 抗原性および特異性の測定 免疫原性フラグメント（抗原性ポリペプチド）または改変細菌体の抗原性およ び特異性は、通例の方法により測定され得る。簡潔に言えば、様々な濃度の推定 不活性（非病原性）免疫原性特異的決定因子が調製され、そして動物に投与され 、そして各々の濃度に対する動物の免疫学的応答（すなわち、抗体の産生）が測 定される。投与される抗原または不活性あるいは改変生物の量は、被検体（例え ば、ヒトまたはネコ）、被検体の状態、被検体の大きさなどに依存する。この後 、このように非病原性抗原を接種された動物は、病原性生物に曝され、免疫原性 特異的決定因子の潜在的ワクチン効果を試験され得る。推定免疫原性特異的決定 因子の特異性は、接種された動物由来の血清または他の液体を他の種との交差反 応性について試験することによって確かめられ得る(14)。 血清学的診断 本発明は、被検体のネコ引っ掻き病を診断する方法を提供し、その方法は被験 中体のRochalimaea henselaeまたはその免疫原性特異的決定因子（以下、本明細 書中ではまとめて「R.henselae抗原」という）の存在を検出する工程を包含する 。被検体はヒトまたは他の動物であり得る。本明細書中で用いられるように、「 免疫原性特異的決定因子」は、完全なR.henselaeまたはR.henselaeの抗原フラグ メント」上にあり得る。 R.henselaeの存在が、ネコ引っ掻き病、細菌性血管腫症、脾肝性紫斑病(splen ic hepatic peliosis)に関連するという本知見が与えられると、細菌を検出する 多くの周知の方法が、R.henselaeを検出し、そして疾患を診断することに応用さ れ得る。ネコ引っ掻き病を診断する方法の１つの例においては、R.henselae抗原 を検出する工程が、被検体由来の液体または組織サンプルと、R.henselae抗原と 特異的に結合するある量の精製リガンド（例えば、抗体または抗体フラグメント ）とを接触させ、そしてリガンドとR.henselae抗原との反応を検出することによ り実施される。本明細書中で意図されるように、用語「抗体」は、完全抗体、抗 体フラグメント、または抗原と無作為に結合する他の試薬（リガンド）を包含す る。本方法の液体サンプルは、R.henselaeを含有する任意の体液（例えば、血液 、血漿、および血清）を含有し得る。体液の他の考えら れ得る例としては、尿、唾液、粘液などが挙げられる。 他の実施態様では、本発明のネコ引っ掻き病を診断する方法は、R.henselaeの 存在が、R.henselae抗原と特異的に結合する被検体由来の抗体の存在を検出する ことによって決定されるような方法であり得る。R.henselaeと特異的に結合する 抗体の存在は、R.henselaeによる感染の存在を示す。本明細書中で用いられるよ うに、用語「特異的に結合する」は、１つの特定の抗原（この場合、R.henselae 抗原)以外の他の抗原とは実質的に交差反応または結合しない抗体または他のリ ガンドを示す。 ネコ引っ掻き病を診断する方法が、R.henselae抗原と特異的に反応する（すな わち、特異的に結合する）抗体の存在を検出することによる場合は、R.henselae 抗原に特異的に反応する抗体の存在を検出する工程は、例えば、被検体由来の液 体または組織サンプルと、R.henselaeと特異的に結合する抗体と結合するある量 のR.henselae抗原とを接触させ、そしてR.henselae抗原と抗体との結合を検出す る工程を包含する。用いられる抗原が、R.henselae感染の経過において産生され るR.henselaeに対する抗体と特異的に結合することが予期される。このような診 断法を実施する１つの方法が実施例２に説明されている。 リガンドとR．henselae抗原との反応の検出は、検出可能な部分に結合されて いるリガンドの使用によって促進され得る。このような検出可能な部分は、沈澱 または変色の視覚的検出、顕微鏡による視覚的検出、あるいは分光法または放射 能測定等による自動化した検出を可能にする。検出可能な部分の例としては、フ ルオレセインおよびローダミン（蛍光顕微鏡用）、西洋ワサビペルオキシダーゼ (光学顕微鏡または電子顕微鏡および生化学的検出のいずれか用)、ビオチン−ス トレプトアビジン(光学顕微鏡または電子顕微鏡用)、およびアルカリホスファタ ーゼ(変色による生化学的検出用)が挙げられる。使用される検出法および検出可 能部分は、上記のリストまたは他の適切な例から、このような選択に適用される 標準的な基準によって選択され得る(14)。 本発明の診断方法において、リガンドとR．henselae抗原との反応の検出工程 は、適切な例においては、二次抗体、または異なるエピトープに特異的に結合す るかあるいはリガンドまたは結合した抗体と非特異的に結合する他のリガンドの 使用によって、さらに補助され得る。 R．henselae抗原と特異的に結合する抗体の存在を検出する診断方法において 、R．henselae抗原を基質に結合させ、そして血液、血漿または血清のような液 体試料に接触させ得る。この試料は、患者から直接採取してもよく、あるいは部 分的に精製された形態であってもよい。この様式では、R．henselae抗原に特異 的な抗体(一次抗体)が、結合したR．henselae抗原に特異的に結合する。その後 、検出可能な部分に結合した(あるいは検出可能な部分で標識された)二次抗体を 加えて、一次抗体の検出を増強し得る。一般に、二次抗体は、一次抗体の複数の 部位に結合するその能力によって選択される。従って、例えば、いくつかの二次 抗体分子が一次抗体の各々に結合し得、一次抗体をより検出しやすくさせる。 免疫蛍光アッセイ(IFA)および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)のような検出 方法が、R．henselae抗原およびこれに特異的に結合する抗体の両方の検出を達 成するために容易に適合され得る。IFAプロトコルの例は、実施例２で提供され る。実施例２で教示される間接的な免疫細胞化学法は、ある生物に特異的な抗原 または抗体を検出するために、一般的に適用できる。ヒトIgG抗体の検出に基づ く、ネコ引っ掻き病の診断のために有効なELISA法は、例えば、以下の通りであ り得る：(1)抗原(R．henselae抗原)を基質に結合させる；(2)結合した抗原を、R ．henselae抗原と反応性の抗体を含む、被検体からの血清試料と接触させる；(3 )上記のものを、検出可能な部分(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素また はアルカリホスファターゼ酵素)に結合した抗ヒトIgG抗体（二次抗体）と接触さ せる；(4)上記のものをその酵素の基質と接触させる；(5)上記のものを発色試薬 (color reagent)と接触させる；(6)R．henselae抗原と特異的に結合するIgG抗体 の存在下での変色を観察する。R．henselaeに対するIgG抗体についての間接的な 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)は、簡潔には以下の通りである：平底の96ウ ェルのポリスチレンプレートをR．henselaeまたはネガティブコントロール抗原 でコートし、一晩インキュベートする。翌日、２倍連続希釈した試験血清および ５つのネガティブコントロール血清、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したマ ウス抗ヒトIgG、および最後に基質ABTS(2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンゾチアゾ リンスルホネート])を、各ウェルに順次加える。各工程の間に、プレ ートを37℃で１時間インキュベートし、そして次に0.1％Tween 20を含むリン酸 緩衝化生理食塩水(pH7.4)で３回洗浄する。R．henselae抗原で試験した血清標本 とネガティブコントロール抗原で試験した血清標本との間の吸光度の差が、R．h enselae抗原およびネガティブコントロール抗原の両方で試験した５つのネガテ ィブコントロール血清の平均値と標準偏差の３倍との和を超えた場合に、血清の 希釈物は陽性であるとする。 ヒトIgM抗体の検出に基づく、ネコ引っ掻き病および細菌性血管腫症の診断の ために有効な上記ELISAの改変は、以下の通りであり得る：(1)ヒトIgM抗体と反 応し得る抗ヒトIgM抗体を基質に結合させる(抗体捕獲(capture));(2)その結合し た抗体を、被検体からの血清試料と接触させる；(3)上記のものをR.henselae抗 原と接触させる；(4)上記のものをウサギ抗-R．henselae抗体と接触させる；(5) 上記のものを検出可能な部分(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素)に結合 した抗ウサギ抗体と接触させる；(6)上記のものをその酵素の基質に接触させる ；(7)上記のものを発色試薬と接触させる；(8)R．henselae抗原と特異的に反応 するIgM抗体の存在下での変色を観察する。IgM捕獲(capture)ELISAのために、平 底96ウェルポリスチレンプレートをヤギ抗ヒトIgM抗体でコートし、次いで、５ つのネガティブコントロールを含む、連続２倍希釈の血清、R.henselaeまたはネ ガティブコントロール抗原、R．henselae超免疫ウサギ抗血清、および西洋ワサ ビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギ、およびその基質(ABTS)でコートし た。各工程の間に、プレートを37℃で１時間インキュベートし、そして次に0.1 ％Tween 20を含むリン酸緩衝化生理食塩水(pH7.4)で３回洗浄する。R．henselae 抗原で試験した血清標本とネガティブコントロール抗原で試験した血清標本との 間の吸光度の差が、R．henselae抗原およびネガティブコントロール抗原の両方 で試験した５つのネガティブコントロール血清の平均値と標準偏差の３倍との和 を超えた場合に、血清の希釈物は陽性であるとする。 あるいは、免疫ブロット分析のような方法が、R．henselae抗原およびこれに 特異的に結合する抗体の存在の検出を達成するために容易に適用され得る。免疫 ブロット分析の例は実施例４で提供される。実施例４で教示される免疫ブロット 分析は、生物全体に特異的な抗原または抗体の検出、あるいは生物全体のフラグ メントのみに特異的な抗原または抗体の検出のために、適用し得る。R．hensela e抗原またはR．henselaeに対して特異的な抗体の検出のために有効な免疫ブロッ ト分析は、例えば、以下の通りであり得る：(1)R．henselaeをコードする核酸を 含有する組換えベクターを、組換え核酸の発現のために適切な宿主中で増殖させ る；(2)宿主を誘導して組換え核酸を発現させる；(3)宿主を可溶化して、ベクタ ーによって発現されたポリペプチドを放出させる；(4)放出されたポリペプチド をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動する；(5)タン パク質をニトロセルロースメンブレンに移す；(6)ニトロセルロースメンブレン を、R．henselaeに感染している可能性のある患者からの血清と共にインキュベ ートする；および(7)フィルターを西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ 抗ヒトIgGと反応させることによって、結合した抗原または抗体を検出する。 R．henselae感染を検出するために有用であり得る別の免疫学的手法は、R．he nselae抗原と特異的に結合する抗体の検出のためのモノクローナル抗体を使用す る。簡潔に述べると、被検体からの血清を、基板(例えば、ELISA96ウェルプレー ト)に結合したR．henselae抗原と共にインキュベートする。過剰な血清を完全に 洗い落とす。次に標識された(酵素結合、蛍光、放射活性など)モノクローナル抗 体を、予め反応させた抗原−血清抗体複合体と共にインキュベートする。モノク ローナル抗体の結合の阻害量を、コントロール(患者の血清抗体なし)と比較して 測定する。モノクローナル抗体の阻害度は特定の種に対する非常に特異的な試験 である。なぜなら、モノクローナル抗体の結合特異性に基づいているからである 。 ミクロ凝集試験もまた、被検体中のR．henselaeの存在を検出するために使用 され得る。簡潔に述べると、ラテックスビーズ(または赤血球)をR．henselae抗 原でコートし、被検体からの血清と混合して、R．henselae抗原と特異的に結合 する組織または体液中の抗体が抗原と架橋して凝集を起こす。凝集した抗原−抗 体複合体は沈澱を形成し、肉眼で見ることができる。上記試験の改変において、 R．henselae抗原と特異的に反応性結合する抗体はビーズおよび血清中の抗原と 結合し得、それにより検出される。被検体の他の体液も有効に使用され得る。 さらに、典型的なサンドイッチアッセイにおけるように、抗体を基質と結合さ せ、そしてR．henselae抗原と共にインキュベートする。その後、二次標識抗体 を、一次抗体には認識されないエピトープに結合させ、そして二次抗体を検出す る。 上記の検出方法および類似の間接的免疫細胞化学法において使用される特定の 試薬およびプロトコルは、当該分野で入手可能なものから標準的な基準に基づい て選択され得る(14)。 本発明はまた、被検体中のR．henselae抗原の存在を検出することによって被 検体における臨床的細菌性血管腫症を診断する方法を提供する。R．henselaeの 存在を検出する工程は、ネコ引っ掻き病の診断について上記に教示したのと同様 のプロトコルを用いて達成され得る。 R．quintanaもまたBAに関連するので、本発明はまた、被検体中のR．quintana 抗原の存在を検出することによって被検体における臨床的細菌性血管腫症を診断 する方法を提供する。R．quintanaの存在を検出する工程は、ネコ引っ掻き病の 診断について上記に教示したのと同様のプロトコルを用いて達成され得る。 核酸および核酸ベースの診断 本発明の診断方法において、R．henselaeの存在はまた、R．henselaeに特異的 な核酸配列の存在を検出することによって決定され得る。従って、CSDは、患者 試料中のR．henselaeに特異的な核酸を検出することによって診断され得る。核 酸は、種特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または他のルー チンの増幅法の後の増幅産物の存在を検出することによって、検出され得る。あ るいは、核酸は、実施例３に例示されているように、PCRの非特異的増幅産物を 種特異的プローブによってプローブすることによって検出され得る。さらに、種 特異的プローブをインサイチュハイブリダイゼーションプロトコルに用いて、こ の生物に特異的な核酸配列の存在を検出し得、例えば、BAまたはCSDを有してい ると推測される患者からのリンパ節バイオプシー組織において使用され得る。 本発明はまた、本明細書に記載されているようなルーチンの方法を用いてR． quintanaに特異的な核酸配列の存在を検出することによって、被検体における現 在または過去のR．quintana感染を診断する方法を提供する。R．quintanaはBAに 関連するので、R．quintanaを検出することによって細菌性血管種症を診断し得 る(15)。 被検体におけるネコ引っ掻き病または細菌性血管腫症を診断する、迅速な２工 程法が提供される。この方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配 列番号４からなるプライマー混合物を用いて被検体からのDNAを増幅する工程を 包含する。増幅の後、CSDまたはBAあるいはその両方は、増幅されたDNAを配列番 号５の核酸からなるプローブと接触させ、そしてプローブと増幅されたDNAとの ハイブリダイゼーションを検出すること（ハイブリダイゼーションの存在は、ネ コ引っ掻き病と相互関連するR．henselaeの存在を示す)によって診断され得、そ して増幅されたDNAを配列番号６の核酸からなるプローブと接触させ、そしてプ ローブと増幅されたDNAとのハイブリダイゼーションを検出すること(ハイブリダ イゼーションの存在は、細菌性血管腫症と相互関連するR．quintanaの存在を示 す)によって診断され得る。この方法の一例の工程は、実施例３において詳細に 述べられている。 以下、より詳細に説明するように、R．henselaeに特異的な核酸配列は、16Sリ ボソームRNAサブユニットをコードする核酸を含み得る。あるいは、R．henselae に特異的な核酸配列は、クエン酸シンターゼをコードする核酸を含み得る。当業 者が、クエン酸シンターゼ遺伝子および16SリボソームRNA遺伝子を検出するため の本明細書に記載の方法を適用して、R．henselaeに特異的な他の核酸配列を検 出し得ることは明らかである。R．henselaeに特異的な他の配列の例としては、 ヒートショックタンパク質、他の抗原性タンパク質、およびある種の代謝酵素お よび合成酵素の遺伝子が挙げられ得る。これらの配列のR．henselaeについての 特異性は、コンピューターデータベースであるGenBankのカタログにある既知配 列とのコンピューターによる比較を、例えば、コンピュータープログラムである Genetics Computer GroupのGap(これはカタログにある配列を目的の遺伝子との 類似性について検索する)を用いて行うことによって、決定され得る。 実施例３は、R．henselaeおよびR．quintanaに特異的な核酸の例を記載してい る。例えば、R．henselaeに特異的な核酸は、配列表の配列番号７として定義さ れているヌクレオチド配列中のヌクレオチドからなる。この遺伝子htrAは、R．h enselaeの抗原性ヒートショックタンパク質をコードする。配列表の配列番号５ として定義されているヌクレオチド配列中のヌクレオチドからなる核酸は、配列 番号７由来であり、そしてまたR．henselaeに特異的である(配列番号８)。 配列表の配列番号６として定義されているヌクレオチド配列中のヌクレオチド を含む、R．quintanaに特異的な核酸が提供される。この核酸は、実施例３に示 されているようにR．quintana感染を検出するための種特異的プローブとして有 効である。R．quintanaのhtrA遺伝子についての部分ヌクレオチド配列が提供さ れていれば、この配列の残りは、実施例１および本明細書中の他の場所に記載さ れているような標準的な方法を用いて容易に得られ得る。さらに、R．henselae のhtrA遺伝子の配列の本発明の教示があれば、対応するR．quintanaのhtrA遺伝 子中の他の配列はR．quintanaに特異的であることがルーチンに決定し得るが、 それは全配列を得、そして実施例３で教示されている方法で特異性についてセグ メントを試験するだけでよい。 実施例４は、R．henselaeに特異的な核酸の他の例を記載しており、配列表の 配列番号１１として記載されているヌクレオチド配列からなる。この17kDaのポ リペプチドの免疫分析は、このポリペプチドがR．henselaeの免疫優性抗原であ り、従って、診断的適用および予防的適用において使用し得る、価値の高い免疫 試薬であることを示唆している。この17kDaポリペプチドの核酸配列が明らかに なれば、この17kDaタンパク質をコードする核酸の存在を検出する核酸検出シス テムにおいて用いられるプライマーおよびプローブのような核酸試薬を容易に設 計し得ることが、関連分野の当業者には容易に理解され得る。 「単離された核酸」とは、その核酸が天然由来の生物の少なくともいくつかの他 の成分、例えば、細胞構造成分から分離されていることを意味する。従って、核 酸の単離は、細胞溶解、次にフェノールとクロロホルムによる抽出、次にエタノ ールによる核酸の沈澱のような手法によって達成され得る(20)。単離された核酸 は、必ずしも完全に非核酸成分を含まずに純粋であることは意図されないが、単 離された核酸は、臨床的手順、診断的手順、実験的手順、他の手順、例えば、ゲ ル電気泳動、サザンまたはドットブロットハイブリダイゼーション、またはPCR において使用される程度の精製度で単離されることが意図される。核酸を他の手 順に使用する前に、核酸を単離するために使用され得る数多くの手順があること が、この技術分野の当業者には容易に理解される。これらには、細胞の溶解、次 いでゲル濾過またはアニオン交換クロマトグラフィー、DNAを高濃度のカオトロ ピック塩の存在下で、ガラスビーズ形態のシリカ、フィルターまたはケイソウ土 (diatoms)に結合させること、あるいは核酸のエタノール沈澱を包含するが、こ れらに限定されない。 本発明の核酸は、プラス鎖およびマイナス鎖RNAならびにDNAを包含し得、そし て天然由来の生物中に見いだされるゲノムおよびサブゲノム核酸を包含すること を意味する。本発明において意図される核酸は、ゲノムの二本鎖および一本鎖DN A、相補的なプラス鎖cRNAおよびmRNA、および、これらから生産される相補的cDN Aおよび本明細書において提供される単離された核酸に、選択的または特異的に ハイブリダイズするか、あるいはこの核酸をコードする任意の核酸を包含する。 本発明は、配列表の配列番号７および配列番号１１として記載されているヌク レオチド配列を含む核酸に選択的にハイブリダイズし得、そしてこの核酸の存在 を検出するか、あるいはこの核酸を増幅するために使用し得る、単離された核酸 を提供する。ストリンジェンシー条件は、PCRプロトコルにおいて典型的に使用 されている条件であり得る。特に、高ストリンジェンシー条件下で配列番号７お よび配列番号１１に記載される核酸にハイブリダイズ(あるいはこの核酸を増幅) し、そしてハイブリダイズされる配列番号７および配列番号１１の核酸のセグメ ントに対して少なくとも70％の相補性を有する核酸もまた提供される。選択的に ハイブリダイズする核酸は、例えば、プライマーまたはプローブがハイブリダイ ズする核酸を有するR．henselaeまたはその遺伝的ホモログの存在を検出するた めのプローブまたはプライマーとして使用され得る。従って、本発明は、標本中 のR．henselaeおよびその遺伝的ホモログを検出し、そしてそのことによって被 検体における感染を検出する方法を提供する。この方法は、被検体からの標本 中の選択的にハイブリダイズする核酸の存在を検出する工程を包含し、核酸の存 在は、R．henselaeまたは遺伝的ホモログによる感染を示す。 高ストリンジェンシー条件下で配列番号７の核酸に選択的または特異的にハイ ブリダイズし、そしてそれがハイブリダイズするセグメントに対して約85％の配 列相補性を有する核酸もまた提供される。実施例３において示されるように、４ 種の関連Rochalimaea種のhtrA遺伝子配列は、最も類似するR．quintanaに対して 約85％から約92％の全配列の同一性を示す。 本発明はまた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件下で、配列表の配列番号１１ として記載されている核酸に選択的にハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレ オチド長の核酸を提供する。PCRは当該分野で広範囲に使用されているので、PCR の条件は当該分野で広く知られており、そして当業者には容易に理解される。こ れらの条件は、多くの生化学試薬供給者によって提供される標準化されたPCRキ ット中のPCR装置に付随する指示書に記述されており、そして多くの記事および 標準テキストで記述されている。 本発明はまた、配列表の配列番号１１として記載されている核酸に特異的にハ イブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチド長の単離された核酸を提供する。 ハイブリダイズは、60℃で5×SSC(I×SSC＝容積１リットルのH₂O中の8.765グラ ムの塩化ナトリウムおよび4.410グラムのクエン酸ナトリウム、pH7.0中)のハイ ブリダイゼーションのストリンジェンシー条件下で、次いで、室温で2×SSCおよ び0.1％SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)の初期洗浄のストリンジェンシー条件下、 および50℃で0.5%SSCおよび0.1％SDS下のストリンジェンシー条件下での２回の 最終洗浄で行われる。 従って、本発明は、配列表の配列番号７および配列番号１１として記載されて いるポリペプチドからなるポリペプチドの精製されたホモログを提供する。この ようなホモログは、そのゲノムが本発明の精製されたポリペプチドのホモログを コードする、他の細菌種から得られ得る。例えば、実施例４は、配列番号１１の 17kDaタンパク質のホモログが検出され得る免疫スクリーニングアッセイを提供 する。細菌性のまたはその他の配列番号１１のホモログをコードする核酸を単離 するための方法としては、核酸ハイブリダイゼーション法によって、またはポリ メラーゼ連鎖反応(PCR)手法を通じて、ホモログをコードすると考えられる種の ゲノムをスクリーニングする方法が挙げられるが、これに限定されない。スクリ ーニングに適した材料としては、ラムダ、コスミド、酵母、哺乳類またはプラス ミドクローニングベクター中にクローン化された適切な種のcDNAまたはゲノムラ イブラリ、単離されそしてサザンブロット分析に供されたDNA、単離されそして ノーザンブロット分析に供されたRNA、およびPCRのテンプレートとして使用され る単離されたDNAまたはRNAが挙げられるが、これらに限定されない。 また本明細書で核酸を説明するために使用されているように、用語「選択的に ハイブリダイズする」および「特異的にハイブリダイズする」は、ときどきランダ ムにハイブリダイズする核酸、ならびに他の属からのヒートショックタンパク質 をコードする核酸を除外する。このハイブリダイズする核酸は、例えば、本発明 のタンパク質をコードする遺伝子の存在および場所を検出するためのプローブま たはプライマーとして使用され得る。このハイブリダイズする核酸は、ポリペプ チドをコードし得、そしてそのため、適切なベクターおよび宿主中に位置して、 抗原、機能的に類似の抗原、または抗原性ポリペプチドフラグメントを生産し得 る。 本発明の選択的にハイブリダイズする核酸は、ハイブリダイズされる配列のセ グメントおよび鎖に対して、少なくとも80％、85％、90％、95％、97％、98％お よび99％の相同性を有し得る。この核酸は、少なくとも12から4000ヌクレオチド 長であり得る。従って、この核酸配列は、抗原の代替コーディング配列であり得 、または抗原をコードする核酸の存在を検出するためのプローブまたはプライマ ーとして使用され得る。プライマーとして使用する場合、本発明は、核酸の異な る領域に選択的にハイブリダイズする少なくとも２つの核酸を含み、所望の領域 を増幅するような組成物を提供する。種特異的抗原をコードする遺伝子の存在を 検出する目的のために、ハイブリダイズする核酸(プローブまたはプライマー)と ハイブリダイズされる配列(試料からのDNA)との間の相補性の程度は、少なくと も、他の種の核酸または無関係のタンパク質とのランダムなハイブリダイスを除 外するに十分であるべきてあり、そして配列は他の種の核酸または無関係のタン パク質とのランダムなハイブリダイズを除外するに十分な長さであるべ きである。図４は、相補性とプローブの長さとの間の関係を示す。 選択的にハイブリダイズする核酸はまた、Rochalimaea属またはこの属の種の サブセットに対して選択的であり得る。たとえば、プライマーCAT1およびCAT2は R．quintanaおよびR．henselaeの両方からの産物を選択的に増幅し、これは、種 特異的核酸でプローブされ得る。本発明は、選択的にハイブリダイズする核酸の 範囲の例を提供し、その結果、ストリンジェントな条件下で、非選択的にハイブ リダイズする核酸から選択的にハイブリダイズする核酸を区別するために必要と される相補性の程度が、各核酸について明確に決定され得る。 「高ストリンジェンシー条件」とは、ハイブリダイゼーションプロトコルで使用 される洗浄条件のことをいう。一般に、洗浄条件は、温度と、変性温度が研究下 でのハイブリッドのＴ_M計算値より約５〜20℃低い温度になるように選択された 塩濃度との組合せである。温度および塩濃度は、予備実験で実験的に容易に決定 される。予備実験では、リファレンスDNAの試料をフィルター上に固定化し、そ して目的のプローブまたはタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズさせ、 そして次に異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄する。例えば、本発明の選 択的にハイブリダイズする核酸のための高ストリンジェンシー条件を実施例３に 示す。特定のストリンジェンシー条件は容易に試験され、そして変更されるパラ メータは当業者には容易に明らかとなる。例えば、反応緩衝液中のMgCl₂濃度は 、プライマーがテンプレートに結合する特異性を増大させるために変更され得る が、この化合物がハイブリダイゼーション反応において使用される濃度範囲は狭 く、従って、適切なストリンジェンシーレベルは容易に決定される。例えば、18 ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションは、 ６×SSPE中で見積もられたＴ_Mより５〜10℃低い温度で行われ、次いで、２×SSP E中で同じ温度で洗浄される(29)。このようなオリゴヌクレオチドのＴ_Mは、各Ａ またはＴヌクレオチドについては２℃、そして各ＧまたはＣについては４℃差し 引いて見積もられ得る。従って50％がＧ＋Ｃの18ヌクレオチドプローブは、約54 ℃のＴ_Mを有する。同様に、18ヌクレオチドプライマーまたはプローブの出発塩 濃度は約100〜200mMである。従って、このような18ヌクレオチドプライマーまた はプローブのためのストリンジェント条件はＴ_M約54℃および出発塩濃度約 150mMであり、そして予備実験に従って改変される。Tm値もまた、市販のコンピ ューターソフトウェア(例えば、OLIGO^TM)を使用して種々の条件について計算さ れ得る。 さらに、本発明の核酸は、遺伝子コードの縮重を受けていない配列番号７およ び配列番号１１のコーディング配列に対して(すなわち、コーディング配列中の 非「ゆらぎ」ヌクレオチド(ゆらぎヌクレオチドは通常コドンの第３番目のヌクレ オチトにある)に対して)、少なくとも80％の相同性を有する。好ましくは、この 核酸は、遺伝子コードの縮重を受けていない配列番号７および配列番号１１のコ ーディングヌクレオチドに対して、90％以上、好ましくは95％、あるいはより好 ましくは99％の相同性を有する。 本発明の核酸の改変もまた、この核酸でコードされるポリペプチドの本質的な 構造および機能が維持される限りは、意図される。同様に、プライマーまたはプ ローブとして使用されるフラグメントは、選択的増幅のために十分な相補的塩基 が存在する限りは、置換され得る。 当業者は、全遺伝子ならびに短いヌクレオチドフラグメントを合成するための ルーチンの方法を用いて、本発明の核酸を容易に得ることができる。例えば、配 列表で提供されているような核酸を得るための手法は、本出願中で特に提供され ている。さらに、かなりの改変を伴わずに使用され得るさらなる方法が当該分野 において提供される。Ferrettiら(38)およびWosnickら(39)は、既知配列の遺伝 子を合成するためのルーチンの方法を示す。より詳細には、Ferrettiらは、合成 オリゴヌクレオチドからの1057塩基対の合成ウシロドプシン遺伝子の合成を教示 する。合成された遺伝子は、既知配列に対して正確であり(603頁、第１文)、こ の遺伝子合成法の信頼性を例証している。さらにWosnickらは、トウモロコシの グルタチオン-トランスフェラーゼ(GST)遺伝子を、効率のよい１工程アニーリン グ／連結プロトコルを用いて合成することを教示する。この手法もまた完全な合 成遺伝子を100％の信頼性で生産し、このことがこのプロトコルのルーチンの性 質を例証している。 本明細書に記載されているように、この核酸は発現されて本発明の抗原性ポリ ペプチドを提供し得る。 診断キット 本発明は、さらにネコ引っ掻き病の診断のためのキットを提供する。このよう なキットは、ELISAキットであり得、そして基質、抗原、一次抗体および二次抗 体（適切な場合）、ならびに他の任意の必要な試薬（例えば、上記のような検出 可能な成分、酵素基質、および呈色試薬）を含有し得る。あるいは、本発明の診 断キットは、R．henselae抗原に特異的な核酸配列を検出するように構成され得 、核酸配列の検出のための基質および試薬（例えば、実施例１に示される基質お よび試薬）のような標準的なキット構成成分を含有する。あるいは、診断キット はIFAキットであり得、これは一般に、下記の実施例２に記載の構成成分および 試薬を含有する。R．henselae感染は、組織および体液（例えば、血液および血 清）中のR．henselaeに特異的な核酸を検出することにより診断され得るので、 キットが本明細書に教示される核酸検出方法を利用して構成され得ることは、当 業者に明白である。診断キットは、さらにポジティブおよびネガティブコントロ ール試験を含むことが意図される。 本発明の診断キットに含有される特定の試薬および他の構成成分は、キットに おいて実施される特定の診断方法に従って、当該分野で入手可能な試薬および構 成成分から選択され得る。このようなキットは、被検体由来の組織および液体サ ンプル、ならびに被検体の組織または液体から得られた微生物の培養物において 、それと共に特異的に結合するR．henselae抗原および抗体を検出するために用 いられ得る。 本発明のキットはまた、細菌性血管腫症を診断する方法に用いられ得る。 ワクチン 本発明により、ワクチンもまた提供され、これは、免疫原量（immunogenic am ounr）の非病原性Rochalimaea henselaeまたはその免疫原性特異的決定因子（im munogenically specific determinant）および薬学的に受容可能なキャリアーを 含有する。あるいは、ワクチンは、R．henselaeおよびR.quintanaの両方に特異 的に結合する抗体に特異的に結合する抗原性ポリペプチド、ならびに薬学 的に受容可能なキャリアーを含有し得る。 本発明の非病原性R．henselae抗原は、免疫原量のR．henselae抗原および薬学 的に受容可能なキャリアーを含有するワクチンの構築に用いられ得る。このR．h enselae抗原は、死滅R．henselae、改変した生存R．henselae、またはR．hensel aeの免疫原性フラグメント（抗原性ポリペプチド）であり得る。あるいは、イン タクトなR．henselaeおよび免疫原性フラグメントの混合物が用いられ得る。次 いでワクチンは、被検体にワクチンを投与することにより、被検体においてネコ 引っ掻き病を予防する方法に用いられ得る。ワクチンはまた、被検体にワクチン を投与することにより、被検体において細菌性血管腫症を予防する方法にも用い られ得る。さらに、他の疾患症候群がR．henselae感染と関係があるという事実 は、このような疾患もまた、本発明のワクチンの使用により予防され得ることを 意味する。予防方法は、被検体がヒトである場合、または同様に被検体がネコの ような非ヒト動物である場合に役立つ。 例えば、ワクチンは、配列番号７の核酸によりコードされる抗原性タンパク質 を含有し得る。このタンパク質（配列番号７および８）は、R．henselae熱ショ ックタンパク質である。本発明の精製熱ショックタンパク質は、死滅R．hensela e全体に対して惹起したウサギ血清中の抗体に強く結合する。R.quintana由来の 相同なタンパク質もまた、ワクチンの基礎であり得る。ワクチンにおける抗原の 使用をさらに精密にするために、標準的な方法が以下に記載のように用いられて 、免疫原性および免疫原量が決定され得る。 ワクチンはまた、配列番号11の核酸によりコードされる抗原性タンパク質を含 有し得る。実施例４は、配列番号11の単離された核酸によりコードされる17kDa タンパク質が、R．henselaeの主要な免疫優性抗原であり、それ故、このタンパ ク質がR．henselae感染に対する保護に有効なワクチンの開発のための候補を提 供する証拠を提供する。 ワクチンはまた、高ストリンジェンシー条件下で配列番号７または配列番号11 の核酸と選択的にハイブリダイズする核酸によりコードされ、そしてR．hensela eに特異的である抗原性ポリペプチドフラグメントを含有し得る。R．henselaeお よびR.quintana htrA遺伝子の配列は、配列類似性が高い領域を共 有するので、これらの領域によりコードされるポリペプチドは、両方の種に特異 的であり得、そしてCSDおよびBAの両方に対するワクチンにおいて用いられ得る 。 本発明のワクチン中の薬学的に受容可能なキャリアーは、生理食塩水または他 の適切なキャリアーを含有し得る（１）。アジュバントはまた、ワクチンのキャ リアーの一部であり得る。この場合、アジュバントは、用いられる特定のR．hen selae抗原、投与の様式、および被検体に基づく標準的な判定基準により選択さ れ得る（２）。投与方法は、経口法、舌下法、または注射による方法であり得、 これは、用いられる特定のワクチンおよび投与される被検体に依存する。 ワクチンが予防薬または治療薬として用いられ得ることは、上記から認識され 得る。従って、疾患を有する被検体は、ワクチンを利用して処置され得る。さら に、このようなワクチン接種により、動物とヒトとの間の疾患の伝播が予防され 得る。例えば、ネコまたはイヌが、免疫され、それによりヒトが曝される危険性 の多くを予防する。 R．henselae抗原の免疫原量は、標準的な手順を用いて決定され得る。手短に は、種々の濃度の推定上不活化（非病原性）された免疫原特異的決定因子が調製 され、動物に投与され、そして各濃度に対する動物の免疫学的応答（すなわち、 抗体産生）が測定される。 従って、本発明は、被検体にワクチンを投与することにより、R．henselae感 染および関連した疾患を予防または処置する方法を提供する。 本発明の他の組成物は、リガンド（例えば抗体）に結合した精製R．henselae を包含する。用語「精製」は、血清、血液、または他の体液の他の成分、あるい はインビボでR．henselaeと関連する他のタンパク質を実質的に含有しない抗原 、抗体、および他のリガンドを記述するために本明細書中で用いられる。 基質に結合した精製R．henselae抗原およびR．henselae抗原と特異的に結合す るリガンドもまた意図される。このような、R．henselae抗原に特異的に結合す る精製リガンドは、抗体であり得る。抗体は、標準的な方法により得られるモノ クローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、この目的のために特異的に 作成されたハイブリドーマ細胞株により分泌され得る（14）。同様に、R． henselae抗原に結合するポリクローナル抗体は、本発明の範囲内にある。ポリク ローナル抗体はまた、標準的な免疫および精製プロトコルにより得られ得る（14 ）。 抗体は、基質に結合されるか、または検出可能部分で標識されるか、あるいは 結合および標識の両方が行われ得る。本発明の組成物で意図される検出可能部分 は、診断方法の記載において上記で列挙した部分であり、蛍光マーカー、酵素的 マーカー、および放射性マーカーを包含する。 本出願の組成物はさらに、R．henselae抗原と特異的に結合した抗体（一次抗 体）の特有の部分に反応性である抗体を含有する。一次抗体に結合する抗体は、 二次抗体として知られ、そしてさらに検出可能成分を含有し得る。上記のように 、R．henselae抗原と特異的に結合する一次抗体への二次抗体の結合は、R．hens elae抗原との一次抗体の結合の検出を容易にする。 単離されたR．henselaeの免疫原性特異的決定因子またはフラグメントもまた 提供される。このような決定因子を得る方法は、ワクチンの構築に関する上記の とおりである。 以下の実施例は、説明することを意図しており、本発明を限定することを意図 しない。実施例は、用いられ得るものの代表であるが、当業者に公知の他の手順 も代替的に用いられ得る。 実施例１ R．henselaeの同定 以前に無症候性のHIV抗体陽性であった40歳の男性を、日々の発熱（daily fev er）、極度の疲労、食欲不振、および10Kgの減量の２ヶ月間の病歴のために入院 させた。入院の５週間後、入院の１日目および８日目に採取した血液培養物は、 Rochalimaea様生物について陽性であると報告された。塹壕熱との推定的診断に 基づいて、患者にドキシサイクリンの21日間の過程（100mg、１日２回）を開始 した；その48時間後、患者は解熱した。血液、尿、骨髄、および気管支肺胞の洗 浄液の培養物は、ミコバクテリアおよび真菌類について陰性のままであった。治 療の中断から６週間後、発熱、食欲不振、および倦怠感が再発した。この 時点で採取した血液培養物は、再びRochalimaea様生物に関して陽性であり、そ して１ヶ月間のドキシサイクリンでの処置（上記と同一用量）を、即時性の陽性 応答により再開した。発熱の２度目の再発の後、患者は、２ヶ月間のドキシサイ クリン（上記と同一用量）を完了した。その後の６ヶ月間に繰り返し採取した血 液培養物は陰性であり、そして患者の初期感染に関連する症状は再発しなかった 。単離された生物は、下記では、「Houston-1単離物」と称される。これは、R． henselaeのプロトタイプ単離物であると考えられる。この生物は、受託番号4988 2でAmerican Type Culture Collection（ATCC，Beltsville，MD）に寄託されて いる。 Ａ．タイプカルチャー ２つのRochalimaea単離物（２つの異なる認識種を表す）を、American Type C ulture Collection（ATCC，Beltsville，MD）から得た。Rochalimaea quintana （ATCC VR-358）およびR.vinsonii（ATCC VR-152）を、５％脱線維素ヒツジ血液 を補充したトリプシン大豆アガー（tryptic soy agar）上で35℃にて、５％二酸 化炭素大気下で日常的に培養した。Rickettsia prowazekii、単離物Breinl（ATC C VR-142）を、Vero細胞培養物中で培養し、そしてリケッチアを含有する細胞質 抽出物を、Regneryら（25）により作製した。 Ｂ．増殖特性 １．患者の血液由来の生物（Houston-1単離物）の単離および培養。 患者からの血液を、直接、Wampole Isostatチューブ（Wampole Laboratories ，Cranberry，N.J.）中に採取するか、または単に、EDTAを含有するVacutainer チューブ（Becton Dickinson，Rutherford，N.J.）中に採取した；単離物を、両 方の出発調製物を用いて作製した。この生物を、有意に力価を喪失することなく 、凍結（-85℃）、EDTA処理血液から再単離した。初代単離を、５％ヒツジ血液 （BBL，Becton Dickinson，Cockeysville，Md.）を含有する市販の脳心臓浸出液 アガー(brain heart infusion agar)(BHLA)、５％ヒツジ血液（BBL）を補充した トリプシン大豆アガー（TSA）、および５％ウサギ血液（BBL）を含有する心臓 浸出アガー(heart infusion agar)(HIA)上で行った。培養物を、５％二酸化炭素 を含有する、加湿したインキュベーターにおいて35℃で維持した。細菌使用プレ ートを、日常的に検査した。他で記載されるように、Houston-1単離物を、患者 の疾患発症の過程の間（抗生物質治療中断後の発熱の再発後を含む）に、種々の 時間で血液から培養した。R．henselaeの単離培養物を得るための鍵となるのは 、この緩徐に増殖する生物が検出可能なコロニーを形成するのに十分な期間、培 養物を増殖させることである。 市販のBHIA-ヒッジ血液、TSA-ヒツジ血液、またはHIA-ウサギ血液のいずれか で培養した場合、発熱性の患者からの血液は、特徴的なコロニーを産生した。こ れは、９〜10日間のインキュベーション後に確認され得た。患者の血液における コロニー形成生物のおよその力価は、抗生物質治療の第２過程に続く発熱の再発 後、１ミリリットル当たり30であった。初代コロニーは、深く陥入しており（カ リフラワー様）、堅固であり、粘着性であり、そしてアガーの表面に頑強に埋め 込まれていた。患者の血液から単離した全ての元の個々のコロニーは、同様の形 態学的特性および増殖特性を有した。継代培養プレートの精密な検査により、播 種後６日目に微小なコロニーの形成が示された（ただし、この時点では、明確な コロニー形態は、明らかではなかった）。新しいコロニーの多数の継代の後、コ ロニーが明視化するインキュベーション時間は、実質的に減少し、そして個々の コロニーは、３〜４日後に識別され得た。陥入したコロニーの形態は、多数の比 較的速い継代の後では、顕著には見られなくなった。コロニーの増殖は、インキ ュベーション時間により制限されず、そしてコロニーは、数週間の期間にわたっ て次第により大きく増殖し続けた。 Houston-1単離物のこれらの後者の初期増殖特性のいくつかは、ATCC Rochalim aea型株について記載される特性と対照的であった。ATCC Rochalimaea型株は、 代表的に、継代において遅れることなく比較的迅速に増殖し、光沢がある、平滑 なコロニーを有し、そして同様にはアガーに埋め込まれなかった。同様に、ATCC から入手したRochalimaea種単離物は、培養細胞の表面で迅速に増殖したが、初 期Houston-1単離物質（material）は、Vero細胞単層に播種した場合、類似した 全身性の感染症を生成しなかった。従って、これは、真核細胞との 共培養が、初代単離のための選択方法でないことを示唆する。固体培地上での更 なる研究室継代後のHouston-1単離物（そしておそらく、より多数の継代歴に関 してATCC型株により類似する）は、真核生物の単層上で迅速に増殖する能力につ いて再試験しなかった。 チョコレートアガーまたはTSA-ヒツジ血液のいずれかへのこの生物の再播種後 、22℃または44℃の大気においては増殖しなかったが、30℃および35℃では、良 好に増殖した。コロニーは、35℃でCO₂を添加しないで培養した場合よりも、35 ℃でCO₂（８％）下でインキュベートした場合のほうが僅かに大きなサイズに増 殖した。Slaterら、(30)により、他のRochalimaea単離物について以前に記載さ れたように、プレートをろうそくビン（candle jars）においてインキュベート した場合、継代培養における増殖もまた、HIA-ウサギ血液またはTSA-ヒツジ血液 で達成された。Sabouraud-ブドウ糖培地において、増殖は観察されなかった。新 しく単離されたHouston-1因子の増殖特性は、Rochalimaeaの十分に樹立された型 の種の増殖特性と対照的であった。継代とともに、新規因子のコロニーの形態お よび増殖速度は、他のRochalimaea型の種のコロニーの形態および増殖速度に、 より密接に類似し始めた。R．henselaeは、培養条件が面倒（fastidious）であ り、そして緩徐に増殖する生物であるようであるが、標準的な実験手順により培 養され得る。Houston-１単離物の比較的速い増殖（継代培養の間が４日間）を、 新しいコロニーが最初に見られ得るようになったすぐ後のそれらを多数回継代す ることにより達成した。半自動の臨床的な細菌の単離手順（これはしばしば液体 培地に基づくアッセイに依存する）は、外因性の二酸化炭素気体の非存在下では 、初代Rochalimaea単離物の培養/検出に適し得ない。さらに、このような培養物 は、一般に初代単離物の増殖を検出するのに十分なインキュベーション期間の間 維持されない。 静止した液体培地におけるHouston-1単離物を培養する予備的な試みは、個々 の生物の濁った懸濁物を産生しなかった；しかし、血液アガープレート由来の播 種物質は、限定された数の大きな粘着性の凝集体の増殖中心として作用するよう であった。Bactek660 6Aまたは7Aボトル（Becton Dickinson，Cockeysville，Md ）へのアガーで増殖した生物の再播種は、非感染コントロールと比較して増殖 指数を変化するには増殖が十分でなかった。 ２．別のRochalimaea単離物。 ４つのRochalimaea様単離物（微生物の同定のために、以前にCenters for Dis ease Control and Prevention（CDC）に提出された）を、Houston-1単離物と比 較し、そしてRochalimaea種と認識した。これらの単離物の内の２つは、オクラ ホマの患者から回収し、１つの単離物は、明らかにアーカンソーで疾患を獲得し た患者に起源した。そして第４の単離物は、カリフォルニア州サンディエゴ郡に 起源した。この最後の単離物は、現在、最初のRochalimaea単離物の１つを表す 。本発明者は、この最後の単離物がHIV感染個体から報告（1986年11月）された 最初の単離物の１つと同様に近年に作製されたことに気付いているからである。 Ｃ．臨床生化学分析 生化学試験は、標準的方法(16)および予め形成された酵素(Innovative Diagno stic Systems，Inc.，Atlanta，Ga.)の存在について試験するRapID ANA II Syst emを用いて行った。運動性についての試験は、運動性アガーにおける増殖特性の 観察および暗視野顕微鏡観察による桿菌の直接観察を含む。カタラーゼの存在は 、コロニーを過酸化水素中に乳濁化し、そしてカバーガラスの下に形成される微 小な泡の存在をチェックすることにより試験した。オキシダーゼの存在は、テト ラメチル-p-フェニレンジアミンを使用して試験した。 ペプチダーゼの産生を除いて、Houston-1単離物は、代表的な臨床手順により 試験したとき生化学的に不活性であった。特定の予め形成された酵素の検出によ り嫌気性生物の臨床的な同定のために主に設計されたRapID ANA IIシステムはま た、好気性生物を同定することが困難であると同定するに有用である。RapID AN A IIシステムは、Houston-1単離物の分析に使用されたとき、ロイシルグリシン 、グリシン、プロリン、フェニルアラニン、アルギニン、およびセリンの切断を 含み、同定番号000671を得る限られた数の酵素基質切断反応を検出した。現在、 この同定番号に関連する微生物は存在していないが、Rochalimaea属のメン バーは、まだ商業的診断データベース(Rapid ID ANA II Code Compendium，Inno vative Diagnostic Systems，Atlanta，Georgia，1989)の一部分ではない。陰性 臨床アッセイは、カタラーゼ、ウレアーゼ、エスクリン加水分解、運動性、硝酸 塩還元、およびオキシダーゼに対するこれらの試験を含めた。 Ｄ．染色および形態学的特徴 Houston-1単離物の４日間培養物を、コロニーを含む血液アガープレートにリ ン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を大量に注ぎ、次いで細菌学的ループを用いてアガ ー表面から粘着コロニーを穏やかにかきとることによって、顕微鏡観察用に調製 した。この材料の少量のアリコートを、清浄な顕微鏡用スライド上に直接載せ、 加熱固定し、そしてGimenez染色で染色した。その他の材料は、グルタルアルデ ヒドで固定し、そして電子顕微鏡観察のために調製した。簡単に述べれば、グル タルアルデヒド固定材料を、Nucleopore filter(0.2μmポアサイズ、Nucleopore Corp.，Pleasanton，Calif.)上に濾過し、そしてSorenson緩衝液(pH5.0)で３回 洗浄した。濾過材料を、１％の三酸化オスミウム中で２時間処理し、そして再び Sorenson緩衝液で３回洗浄した。この標本を、徐々に変化する一連の増加する濃 度のエタノール(30％〜100％)中で脱水した。脱水した標本を、ヘキサメチルジ シリザン(Polysciences，Inc.，Warrington，Pa.)中に２時間浸漬し、そして次 にデシケーター中で一晩乾燥させた。最後に、この標本を、スタブ上に置き、金 でスパッタリングコートし、そしてPhilips(model 515)走査電子顕微鏡を用いて 観察した。 数代の継代培養の後に得られた、４日間培養物からの急速に増殖する生物は、 Gimenez組織学的染色により容易に染色された。そのように染色された生物は、 小さな赤色桿菌として、しばしば僅かに湾曲して見えた。より長い培養ではある が、しかしなお生存可能なコロニーから得られた生物は、Gimenez染色の取り込 みに抵抗した。光学顕微鏡に首尾良く用いられた材料はまた、走査電子顕微鏡用 に調製され、そして観察された。Gimenez染色材料、および種々の培養実験の間 に注目された増殖性質の観察についてと同様に、走査電子顕微鏡で観察された生 物は、粘着凝集体を形成して見え、遊離して存在する生物は相対的にほとんどな かった。観察された生物の平均サイズは、長さ約２μm×幅0.5〜0.6μmであった 。個々の顕微鏡用調製物内で観察されたすべての生物は、おそらくは、複数世代 の産物を含むが、サイズが比較的均一に見えた。 Ｅ．脂肪酸分析 全細胞脂肪酸分析を、空気中で35℃てインキュベートし、そしてチョコレート アガー上での４日間増殖後に回収されたR.henselae，sp．nov．(Houston-1)培養 物について行った。脂肪酸メチルエステルを、Hewlett Packard series II 5890 ガスクロマトグラフ(Miller，L.，T．Berger，”Bacterial identification by gas chromatography of whole cell fatty acids.”Hewlett-Packard applicati on note 228-41，Hewlett-Packard，Avondale，Pa.，1985)上でクロマトグラフ を行い、そして標準混合物(Microbial-ID，Newark，Del.)の保持時間とサンプル の保持時間をコンピューター支援比較を用いて同定した。 Houston-1単離物の全細胞脂肪酸分析後観察された主要な脂肪酸は、オクタデ セン酸(C_18:1、54〜56％)、オクタデカン酸(C_18:0、18〜20％)、およびヘキサデ カン酸(C_16:0、17％)であった。他の検出可能な脂肪酸の不在は、Brucella属の メンバーを除くほとんどすべての他の細菌の同定を排除した。この脂肪酸パター ンは、R.quintanaおよび他の最近のRochalimaea様単離物(30)で観察されたパタ ーンと似ていた。 Ｆ．16S rRNA 遺伝子配列分析 １．DNA抽出、増幅およびクローニング。 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅用にDNAを、R.quintana、R.vinsonii、および R.henselae(Houston-1単離物)の純粋培養物から、先に記載(29)のように、ドデ シル硫酸ナトリウム(SDS)/プロテイナーゼ溶解、次いでフェノール/クロロホル ム抽出を用いて抽出した。得られる水相を、Centricon 30濃縮器(Amicon Corp. ，Danvers，Mass.)を用いて濃縮し、そして２mlのTES(10mM Tris、pH8.0；１mM EDTA；10mM NaCl)を用いて３回洗浄した。 PCR増幅を、熱サイクラーおよびGeneAmp試薬(Perkin Elmer-Cetus、Norwalk、 Conn.)を用いて実施した。先に研究されたすべてのユーバクテリア(eubacteria) から、２つの別のPCR産物として、16SリボソームRNA遺伝子の約92％を増幅する ことが知られている２対の「ユニバーサル(universal)」縮重プライマーを用い て、後にクローニングおよび配列分析のために用いられる産物のPCR合成をプラ イムした。各プライマーの５'末端は改変されて、独特な制限エンドヌクレアー ゼ部位を含みクローニングを容易にした。各サンプルを：94℃、１分；48℃、２ 分；66℃、１分30秒での３サイクル、次いで：88℃、１分；52℃、２分；68℃、 １分30秒での27サイクルで増幅した。 得られるPCR産物を、1.0％アガロースゲルから単離し、そしてpUC19(29)中に クローン化した。クローンを、T7 DNAポリメラーゼ(SEQUENASE，U.S.Biochemica ls，Cleaveland，Ohio)による二本鎖配列決定を用いて配列決定した。単離物の それぞれを増幅し、クローン化し、そしてPCR取り込みの読み誤りを防ぐために 少なくとも２回配列決定した；不一致が検出された場合、第３の独立の配列を生 成した。その広範な増幅範囲のためユニバーサルプライマーを用いるPCR反応物 中に汚染細菌DNAを導入しないように大きな注意を払った。各16S rRNA遺伝子配 列に対するGenBank受託番号は以下の通りである：R．quintana，M73228；R．vin sonii，M73230；R．henselae(R．americanaとして提出された)，M73229。 ユニバーサルプライマーは、２つの別のPCR産物として約1400ヌクレオチドのr RNA遺伝子配列の増幅を可能にした。プライマーEC11およびEC12(Wilsonら(26)に より用いられたPOmodおよびPC3modプライマーの改変版)を用いて生成された、16 S rRNA遺伝子の5'側半分に相当する、767塩基対(bp)産物は、Houston-1単離物、 R.quintanaおよびR.vinsoniiが増幅された場合に観察された。これらのプライマ ーを用いてDNAテンプレートを含まないネガティブコントロールを増幅した場合 、産物は観察されなかった。同様に、プライマーEC ９およびEC10(Wilsonら(40) により用いられたプライマーP3modおよびPC ５の改変版)を用いて生成された、1 6S rRNA遺伝子の3'側半分に相当する、737bp産物は、Houston-1単離物、R.quint anaおよびR.vinsoniiを用いた場合に観察された。DNAのないコントロールではPC R産物は見られなかった。これらのPCR産物をク ローン化および配列決定した。 ２．DNA配列決定 比較および整列のために用いられた16S rRNA遺伝子配列は、クローン化PCR産 物のそれぞれについて３つの独立配列の共通部分(consensus)をとることにより 得られた。Houston-1単離物について得られた第１および第２の配列は、一致し ない３つのヌクレオチドを有し、そしてR.vinsoniiに対する第１および第２の配 列は、２つの両義性を有していた。両方の場合において、第３の配列は、これら の両義性な位置において、２つの先の配列の１つと一致し、そしてこれを共通部 分としてとった。配列間の時折の不一致は、ポリメラーゼ-ヌクレオチド取り込 みエラーの結果であると推定された。完全配列を、Genetics Computer GroupのG apプログラムを用いる整列のために用いた。Houston-1単離物の配列を、GenBank のファイル上の16S rRNA遺伝子配列と比較し、そしてこの配列はR.quintanaと最 も大きい相同性(98.7％)を、そして関連がより遠い生物からの16S rRNA遺伝子配 列とより小さい相同性(表１)を示した。 本発明者らの実験室で、本発明者らは、R.quintana(Fuller株)からの16S rRNA 遺伝子を配列決定し、そしてそれが、Weisbergら(35)により先に報告され、そし てGenBankから得た配列と僅かに異なっていることを見出した。本発明者らのデ ータを用いて、本発明者らは、Houston-1単離物からの16S rRNA遺伝子配列が、R .quintanaに98.7％関連し、そしてR.vinsoniiに99.3％関連していることを見出 した。このR.quintanaおよびR.vinsonii配列は、98.9％関連していることが見出 された。Houston-1単離物とR.vinsoniiとの間に見られる0.7％の16S rRNA遺伝子 配列相違は、Rickettsia prowazekiiおよびRickettsia typhiについて報告され ている0.5％の相違より大きい。これらの２つのRickettsiaの種は、Rochalimaea が属するRickettsiales目の中の明らかに異なる種である。 BAの推定の病因因子に対してRelmanら(28)により決定された16S rRNA遺伝子部 分配列(GenBank Acc．#M59459)は、R.henselae，sp．nov.のHouston-1単離物か ら得られた16S rRNA遺伝子配列の相当する部分と同一であることが見出された( 表１)。Oklahoma単離物の１つから得られた16S rRNA遺伝子部分配列は、 Houston-1単離物から得られた16S rRNA遺伝子配列と同一である。これらの完全 に相同な配列は、原因因子が１つであり、そして同じ種類であることを示す。Ho uston-1単離物とRochalimaeaの他のタイプの種との間で注目された16S rRNA遺伝 子配列間の変動（表１）は、Houston-1単離物がRochalimaea属内の新しい種であ ることを示す。 さらに、R.henselae 16S rRNA遺伝子配列は、多年に渡りこの疾患の診断に用 いられているCSD皮膚試験抗原中に存在する。 従って、16S rRNAサブユニットをコードする核酸は、R.henselaeに特異的であ り、そして他の生物の16S rRNA DNA配列または試験サンプル中の16S rRNA DNA配 列に対して比較されて、R.henselaeの存在を検出し得る。 Ｇ．クエン酸シンターゼ遺伝子PCR/RFLP分析 制限エンドヌクレアーゼ長多形性(RFLP)分析をPCR増幅DNAに適用した。このDN Aは、rickettsiaのクエン酸シンターゼ遺伝子の部分から、約381ヌクレオチド長 のPCR産物の合成を開始することが先に示されている非縮重オリゴヌクレオチド( 25)を用いてプライムされた。Rickettsia prowazekiiからの染色体DNAを、PCR合 成および消化のボジティブコントロールとして用いた；DNAテンプレートを含ま ないコントロールを常にPCR増幅に含めた。 １．DNA消化および電気泳動。 PCR技法により増幅された特定遺伝子のRFLP分析は、rickettsiaの遺伝子型お よび種を同定するために有用である。ほとんどすべてのrickettsia種、およびR. quintana由来のクエン酸シンターゼ遺伝子の部分のPCR増幅をプライムするため に適切であることが先に示されたオリゴヌクレオチドを、Houston-1単離物およ びR.vinsoniiから精製されたDNAからのDNA増幅をプライム（prime）するそれら の能力について試験した。PCR産物は、先に報告された条件に匹敵する条件を用 いることにより容易に生成された。簡単に述べれば、PCR増幅を、GeneAmp DNA増 幅試薬キット(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，Connecticut)とともに提供される プロトコールを用いて、100μｌ容量で実施した。代表的には、１μｌの非希釈 細胞質抽出DNAをPCRテンプレートとして用いた。DNA増幅を、Perkin-Elmer Cetu s DNAサーマルサイクラー中で、変性(95℃で20秒間)、アニーリング(48℃で30秒 間)、および伸長(60℃で２分間)の35サイクルを用いて行った。 DNAのPCR増幅を、少量のPCR産物の迅速アガロース電気泳動により確認した。 制限およびエンドヌクレアーゼ消化を、標準的技法(29)に続いて、20μｌのPCR 反応混合物を用いて行い、そしてインキュベーションは37℃であった。制限エン ドヌクレアーゼはすべてNew England BioLabs，Beverly，Massachusettsから得 た。dye-Ficollロード混合液(29)を添加した後、消化した反応物を、標準的手順 (29)により作成された1.5mm厚の８％ポリアクリルアミド垂直ゲル(Bio-Rad Labo ratories，Richmond，California)上に載せた。ゲルを、簡単な垂直電気泳 動チャンバー(Bethesda Research Laboratories，Life Technologies，Inc.，Ga ithersburg，Maryland)中、80ボルトで４時間泳動した。次いでゲルを、UV光源( 365nm；Spectronic Corp.，Westbury，New York)で照射する前に、エチジウムブ ロマイドで染色し、そしてPolaroid type 655 P/Nフィルム(Polaroid Corp.，Ca mbridge，Massachusetts)で写真撮影した。 消化したDNAフラグメントを分離し、そしてRegneryら(25)により先に記載され た標準的な電気泳動プロトコールおよび方法を用いて分析した。２つまたはそれ 以上の単離物の相同PCR/RFLP消化物間で観察された同時に移動するDNAフラグメ ントの数を計数した。同時に移動するDNAフラグメントの数由来のデータを用い て、Upholt(32)により記載されそして次に関連細菌間の配列の相違を推定するた めに他の者により用いられた方法により、配列関連性の推定を引き出した。 ３つのすべての非切断Rochalimaeaクエン酸シンターゼPCR産物は、Rickettsia 属のメンバーに対して生成されたもの(約381bp)より僅かに大きかった(約400bp) 。異なるRichalimaea単離物から得られたPCR増幅クエン酸シンターゼ産物のサイ ズ間の変動が注目された。PCR増幅産物を、７つの制限エンドヌクレアーゼで消 化し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。明らかな違いが、種々 の単離物由来のPCR増幅クエン酸シンターゼ配列の消化バターンの多くで見られ た；PCR/RFLP分析は、その他の単離物遺伝子型の迅速鑑別を可能にした。 PCR増幅されたクエン酸シンターゼ特異的DNAを７つの制限エンドヌクレアーゼ で消化することにより生成されたDNAフラグメントの数を、同時に移動するフラ グメントの数とともに図１に表とする。同時移動するフラグメントの百分率の数 値解析に由来する配列相違の推定値は、検査された単離物のすべてが、認識され たrickettsia種間でのクエン酸シンターゼ配列の相違に対する同様な推定値(例 えば２〜６％)に等しいかまたはそれを超える、実質的に推論されるクエン酸シ ンターゼ配列の相違(６〜11％)を有することを示す。 PCR/RFLP分析は、R.henselae，sp．nov.,遺伝子型を、R.quintanaまたはR.vin soniiのいずれかの遺伝子型から明瞭に鑑別した。Oklahoma(２つの単離物)、Ark ansas(１つの単離物)、およびSouthern California(１つの単離物)か らの他のRochalimaea様単離物由来のクエン酸シンターゼ特異的PCR産物の複数制 限エンドヌクレアーゼ消化物は、本明細書で適用されたPCR/RFLP法に従って、検 査された単離物のすべてが互いに、そしてR.henselae(Houston-1単離物)に同じ であることを示した。 ネコ引っ掻き病および細菌性血管腫症に加えて、この生物の疾患スペクトルは 変化し得、そして熱病および菌血症および細菌性肝臓紫斑病の症候群を含み得る 。従って、本明細書で記載される核酸法を用いて、これらの疾患症候群に関連す るR.henselaeの存在を検出し得る。 実施例２ 血清学的方法 感染の分布と流行の評価を始めるため、そしてまたR.henselaeで誘発される疾 患の完全なスペクトルの規定を補助するために、R.henselae抗原と特異的に反応 する抗体を検出する免疫蛍光アッセイ(IFA)試験を開発した。感染性生物は、γ 線照射による不活化により非病原性とした。 Ａ．R.henselae 抗原決定因子の調製 赤血球濃縮アガー培地上で培養され、そして次に溶液で維持されたR.henselae 桿菌は、先に記載のように自己凝集する傾向がある；この凝集は、十分に分散し たIFA抗原の生成を妨げる。自己凝集の阻害は、個々のRochalimaea生物がどん欲 に粘着するVero細胞とのR.henselaeの同時培養により達成された。簡単に述べれ ば、R.henselae細胞をVero細胞と４日間液体培地で培養する。液体培地の大部分 をデカンテトした後、ガラスビーズを培養フラスコに加え、そして残りの培地中 で穏やかに撹拌する。ビーズを用いたこの撹拌はVero細胞およびそれらに粘着す るR.henselae細胞をフラスコ壁から解放する。Vero細胞と複合体化したR.hensel ae細胞を、次いでγ線照射により不活化する(非病原性にする)。抗原および抗血 清を、標準的技法により、IFA試験のために調製した。 Ｂ．抗血清(抗体)の調製 簡単に述べれば、単離されたR.henselae培養物から得られ、そしてPBS中に懸 濁されたR.henselae抗原をウサギに接種し、ウサギにこの抗原と特異的に反応す る抗体を生成させる。この動物から血液サンプルを採取し、そして赤血球細胞を 除去し抗血清を得る。次いで、R.henselae抗体を含む血清に、硫酸アンモニウム を添加し、抗血清からγグロブリン(IgG)を沈殿させる。 Ｃ．IFA この実施例のIFAは、簡単に述べれば以下のように実施する：上記で調製され たVero細胞に結合したR.henselae抗原決定因子を、12ウェルの顕微鏡スライドの ウェル中にスポットし、そしてR.quintana(Fuller単離物)の第２のスポットもま たウェル中に置く。これらのスポットを風乾し、そして次に10分間アセトン固定 する。試験される抗血清の連続希釈物(例えば1/32、1/64など、希釈終点)を、抗 原とともに対のウェルに置く。次いでスライドを37℃で30分間湿潤チャンバー内 でインキュベートし、そしてその後PBSで３回洗浄し、蒸留水ですすぎ、そして 風乾する。次いでフルオレセイン標識ヤギ抗ヒトIgGを、各ウェルにスポットし 、そしてスライドを上記のようにインキュベートし、洗浄し、すすぎそして風乾 する。緩衝化グリセロールを、光学的増強のためにウェルに添加し、そして次に スライドを蛍光顕微鏡観察により分析し、R.henselae抗原と特異的に反応する抗 体の存在を検出する。 別の方法では、上記で精製されたR.henselae特異的抗体を、フルオレセインの ような検出可能な部分で直接標識し得る(14)。 すべてのIFA測定において、R.henselaeまたはR.quintana感染を培養確認され たヒト由来の抗血清をポジティブコントロールとして用いた。 ネコ引っ掻き病と疑われる40人の患者からの血清を、IFAにより、R.henselae 抗原との反応性について評価した。35人(87.5％)の患者が、1/64血清終点希釈物 に等しいかまたはそれを超えたR.henselaeに対する抗体力価を有していた(図２) 。多くの患者が1/1024を超える力価の血清を有していた。病気の急性および回復 相の間に収集された血清が、幾人の患者から入手できた。異な る力価を有しそして1/64に等しいかそれを超える力価を有する少なくとも１つの 標本を含む５セットの対の血清のうち、３つが抗体力価において４倍の上昇また は低下を示した。３つのさらなる血清の対のセットは、力価の変化について評価 できなかった。なぜなら、両方の血清が、1/1024(アッセイされる最大力価)また はそれを超える力価の、R.henselae抗原と特異的に反応する抗体を有していたか らてある。1/64、またはそれを超える力価を有する８つの血清はまた、1/32を超 えないR.quintanaに対する低い抗体力価を有していた。これらの血清のそれぞれ では、R.henselaeと特異的に反応する抗体の力価は、R.quintanaに対する力価に 対して、少なくとも４倍勝っていた。 自分自身が健康な個体であると同定したヒトから集めた107の血清を、契約提 供者(Worldwide Biologics，Cincinnati，OH)から得た。これらの血清をIFAによ りR.henselaeおよびR.quintanaと反応する抗体について試験した場合、101(94％ )が1/64より少ない力価を有していた(図３)。1/64に等しいか、またはそれより 大きいR.henselae抗原に対する抗体力価を有していた６つの血清のうち、３つが かなり上昇した抗体力価(即ち、1/512および1/1024)を有していた。これらの血 清提供者の間では、1/16を超えるR.quintanaに対する抗体力価は検出されなかっ た。 種々の疾患を有するヒトからの血清を、R.henselaeと特異的に反応する潜在的 な抗体の存在について評価した。1/64に等しいかまたはそれより小さい力価がブ ルセラ症を有する10人のうち２人で検出されたが、この２つの低いレベルの陽性 血清学的応答は、微小凝集により検出されるBrucella abortusに対する抗体の増 加する力価と相関しなかった。Lyme病の患者からの３つの血清のうちの１つは、 R.henselaeに対して1/64の力価を有していた。ツラレミアの患者からの血清およ びYersinia entercolitica感染の患者からの血清は、1/64に等しいかまたはそれ より大きいR.henselaeに対する抗体力価を示さなかった。診断キット中の試薬と して用いた多くの他の参照ヒト抗体を、R.henselae IFA試験で評価した。これら の血清はいずれも1/64またはそれ以上でR.henselaeに対する抗体の力価を示さな かった。参照血清は、以下に対するヒト抗血清を含んでいた：Mycoplasma pneum oniae、Treponema pallidum、Coxiella burnetii、 Ehrlichia chaffeensis、chlamydia群、斑点熱病群rickettsiae、チフス群ricke ttsiae、水痘、帯状庖疹、A型インフルエンザ、アデノウイルス、２型デング熱 ウルルス、単純ヘルペス、A群コクサッキーウイルス、２型ポリオウイルス、サ イトメガロウイルス、風疹、Ｉ型ヒト免疫不全ウイルス、ならびにαフェトプロ テインおよびリウマチ様因子。 R.henselaeと特異的に反応する高力価ヒト抗体およびR.quintanaに対する抗体 を含む血清は、IFA試験で「A.felis」抗原と反応しなかった。「A.felis」抗原 に対して惹起された超免疫ウサギ抗血清およびモノクローナル抗体は、R.hensel ae全細胞抗原と反応しなかった。 R.quintana(Fuller単離物)に感染したヒトボランティアから得た高力価R.quin tana抗体(1/1024希釈終点)は、R.henselae抗原と識別可能な反応を生じなかった (〈1/16希釈終点)。同様に、最小(〈1/32希釈終点)R.quintana抗体力価は、培養 陽性R.henselae感染患者からの高い力価の(例えば〉1/1024希釈終点)血清を、用 いたときに注目された。 従って、IFA試験でアッセイしたとき、R.henselaeおよびR.quintana(Fuller単 離物)抗原に対するヒト血清学的応答は種特異的であることが理解され、そしてR .henselae抗原で観察される抗体反応が、R.henselae以外の任意の種による抗原 刺激に起因したことはありそうにない。 見かけ上健康な血清提供者の間で見出されたR.henselaeと特異的に反応する抗 体の有意に上昇したレベルが低い羅患率で存在したことは、R.henselae感染が比 較的に一般的であり得ることを示す。 ネコ引っ掻き病と臨床的に診断された40人の患者のうち、35人(87.5％)が、1/ 64に等しいかまたはそれを超えるR.henselae抗原に対する血清抗体力価を有して おり、そして血清のいくつかの対のセットが４倍変化した力価を示した。R.hens elae抗原またはそれと特異的に反応する抗体を検出するこの方法は、ネコ引っ掻 き病の患者を同定するための有用な診断ツールを提供し、そしてそれによって、 臨床診断のみに頼ること、薬学的に認可されていないCSD皮膚試験抗原調製物の 使用、および外科的生検の必要性を減少させる。 本明細書で例示されたネコ引っ掻き病を診断する方法は、細菌性血管腫症の診 断に同様に効果的に適用され得る。なぜなら両疾病の病因因子は、R.henselaeで あるからである。また、R.henselae感染は、熱病および菌血症の症候群および細 菌性肝臓紫斑病のような他の症候群と関連するので、上記の血清学的、免疫細胞 化学的、細胞学的および核酸検出方法が、これら疾病の診断に有効に使用され得 る。 実施例 ３ PCRによる、R．henselaeaおよびR．quintanaの検出 Ａ．細菌株 PCRおよびハイブリダイゼーションアッセイの特異性を評価するために使用し た全ての細菌の株を、表２に挙げる。Rochalimaea spp.を、５%脱フィブリン化 ウサギ血液を補充した心臓浸出液アガープレート（heart infusion agar plate ）（HIA-RB）（BBL，Rockville，Md）上で、５%CO₂の存在下、34℃で３〜５日間 、インキュベートして増殖させた。Bartonella bacilliformisを、28℃で６〜８ 日間、HIA-RB上で、CO₂を補充せずに培養した。A.felisを、チャコール酵母抽出 アガープレート（Carr-Scarborough Microbiologicals，Decatur，Ga.）上で、 ２〜３日間32℃で、CO₂を伴わずに増殖させた。 Ｂ．臨床サンプル CSDで臨床的に診断した患者からの25個のサンプルを、PCRアッセイのさらなる 例を評価するために使用した（表３）。全てのCSD症例は、医師により臨床的に 診断され、そして他の明らかな診断の非存在下で、局所的リンパ節症およびネコ との接触があった。サンプルを使用した全ての患者は、患者＃６（表３）を除い て、この定義に適合した。この患者はネコ接触の既知の履歴を有さなかった。サ ンプルのうち16個は新鮮なリンパ節バイオプシー標本であり、９個はリンパ節吸 引液であった。さらに、他の生物が単離された非CSD患者由来の５個のリンパ節 吸引液をネガティブコントロールとして包含した。同様に、非CSD患者由来の３ 個のリンパ節バイオプシーをさらなるネガティブコントロールとして使用した。 実施例２に示した間接的蛍光抗体試験によって、数人の患者に対して血清学を行 った（血清が利用可能な場合）。 リンパ節バイオプシー標本およびリンパ節吸引液の両方に由来する新鮮な凍結 組織が、適切なサンプルであった。 Ｃ．DNA 抽出 DNAを、以前に記載された手順（４）の改変を用いて、細菌細胞、リンパ節、 組織、またはリンパ節吸引液から抽出した。簡略に述べると、標準的なサイズ（ 85mm）のHIA-RBプレートの約1/8から採取された細菌増殖を、300μｌのPCR希釈 液（10mM Tris，10mM NaCl，１mM EDTA，pH8.0）に再懸濁した。リンパ節組織に ついて、サンプル（約100mg）を、最少の必須培地（0.5ml）中でディスポーザブ ルのホモジナイザーを用いて分散させた。この50〜100μlのホモジネートをPCR 希釈液で300μlに希釈した。リンパ節吸引液（50〜100μl）を再懸濁し、PCR希 釈液で300μlに希釈した。次いで、サンプルに1.0%ドデシル硫酸ナトリウム（SD S）およびプロテインキナーゼＫを添加し、100ng/μｌの最終濃度にした。そし てサンプルを２時間55℃でインキュベートした。インキュベーション後、溶解物 を、フェノール飽和緩衝液とクロロホルム／イソアミルアルコール（24:1）との 50:50混合物で、３〜４回抽出した。得られた水性上清をPCR希釈液で2.0mlに希 釈し、Centricon 30フイルター（Amicon，Danver Mass.）により濾過し、そして PCR希釈液の2.0mlのアリコートで２回以上洗浄した。得られるフィルター保持物 質（retentate）（40μｌの平均容量）を回収し、PCRのテンプレートとして使用 した。DNA抽出を行う毎に、上記のように厳密に試薬ブランクをプロセスし、全 ての抽出緩衝液および試薬がRochalimaea DNAを混入していないことを確実にし た。 Ｄ．PCR プライマーおよびハイブリダイゼーションプローブの設計 R．henselae DNAのライブラリーをベクターλ ZapII（5）中に構築した。ライ ブラリーを、８つのモノクローナル抗体のプールまたはウサギ超免疫血清のいず れかで、抗原タンパク質の発現についてスクリーニングした。ウサギ抗R．hense lae血清に反応性の60キロダルトン抗原を発現するクローンを単離し、そして遺 伝子を配列決定した（６）（GenBank Accession L20127）。推定アミノ酸配列は 、Escherichia coliに由来するhtrA座（17）と37%の配列相同性（配列全体にわ たって）を有することが示された。以下のプライマー対をPCR増殖に使用した：C ATI 5’GATTCAATTGGTTTGAA(GおよびA)GAGGCT 3’(配列番号１および ２)およびCAT2 5’TCACATCACCAGG(AおよびG)CGTATTC 3’(配列番号３および４) （図４）、これらはR．henselaeおよびR．quintana由来の414塩基対（bp）フラ グメントの両方を規定する。20塩基対オリゴヌクレオチドプローブRH1（配列番 号５）およびRQ1（配列番号６）（図４）を種特異的ハイブリダイゼーションプ ローブとして使用した。 Rochalimaeaの他の３種由来の同じ遺伝子の部分的なヌクレオチド配列（150〜 200ヌクレオチド）を、保存されたPCRプライマーを使用して得た。プライマー対 htr5（5’AATCTAGATTGCTTTCGCTATTCCGGC3’(配列番号８)）およびhtr6（5’AAGG ATCCATTTGTTCGCACTTGTAGAAG 3’(配列番号９)）を用いたPCRにより、４つのRoch alimaea種のそれぞれから650塩基対産物の増幅を得た。これらの増幅産物から得 られた他の３つの種の150〜200塩基対配列が、R．henselae配列と85〜92%保存さ れていることが見出された。htrA遺伝子が存在する証拠は、B．bacilliformis（ Rochalimaea spp.に系統発生的に密接に関連する生物（21、27））において見出 されなかった。B．bacilliformisが、上昇した温度では増殖しない（ある程度、 機能的なhtrA遺伝子産物の欠損のためであり得る特徴）ので、この観察は興味深 い。 Ｅ．PCR アッセイ 細菌、新鮮なリンパ節組織、またはリンパ節吸引液から調製したDNAを、PCRア ッセイのテンプレートとして使用した。臨床サンプルから抽出した（非希釈のお よび1:10に希釈した）テンプレートDNAの５μｌ部分を、各PCRアッセイに使用し た。細菌単離物から抽出されたDNAの適切な濃度を、標準DNAの既知量と並べたア ガロースゲル電気泳動により決定した。希釈した細菌DNA（約１ng）をプライマ ー特異性の最初の決定のために使用した。続いての臨床サンプルにおけるPCRの ために、R．henselaeまたはR．quintanaのいずれかから抽出した10pg（10μｌ中 ）のDNAをポジティブコントロールとして使用し、そしてDNA抽出ブランクおよび 水（それぞれ10μｌ）をネガティブコントロールとして使用した。GeneAmp試薬 （Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，Conn.）キットを全てのPCRアッセイに使用し た。縮重プライマーCAT1およびCAT2を重合反応をプライムす る（prime）ために使用した。プライマー混合物は、ほぼ等量のR．quintana（配 列番号２および４）およびR．henselae（配列番号１および３）プライマー配列 を含んでいた。増幅を、9600型サーマルサイクラー（Perkin-Elmer）で、94℃で ５分間、予め変性し、続いて94℃で30秒間；50℃で60秒間；および70℃で45秒間 を35サイクル行うことにより達成した。各PCRアッセイ由来の10μｌを1.2%アガ ロースゲルにより電気泳動し、エチジウムブロミドで染色し、写真を撮った。41 4bpバンドの存在を陽性と見なした。臨床標本から抽出されたDNAの各サンプルも また、プライマー対GHPCR1およびGHPCR2（36）を用いて増幅した。このプライマ ー対は、ヒト成長ホルモン遺伝子の保存領域から422bpフラグメントを増幅し、 増幅可能なDNAの好結果の抽出物についてのポジティブコントロールとして使用 した。プライマー対GHPCR1およびGHPCR2を用いて増幅できない臨床サンプル由来 のDNA抽出物は、さらなる研究から除外した。 Ｆ．PCR アッセイの特異性 上記の条件下、そして精製テンプレートDNAを用いて、12個の全てのR．hensel ae単離物および４個の全てのR．quintana単離物が、予測される414bpフラグメン トの増幅DNAを生じた（表２）。R．vinsonii、B．bacilliformis、およびA．fel isについては、増幅産物は見られなかった。R．elizabethaeはこのプライマー対 を用いて増幅されたが、産物は、R．henselaeおよびR．quintanaについて予測さ れる414bpよりもはるかに大きかった（約1300bp）。したがって、414bpPCR産物 は、R．henselaeおよびR．quintanaに特異的であるようである。約50〜60bpのPC R産物が、時々、DNAを有さないコントロールにおいて観察され、おそらくプライ マーダイマーに対応する。 縮重プライマーCAT1およびCAT2はR．henselaeおよびR．quintanaの単離物内で 十分に保存されているようである。 バイオプシー（12/16、75%陽性）よりも吸引液（9/9、100%陽性）を用いて、 よい成功が得られた。これはおそらく変動する節（したがって、吸引され得る） と変動しない節との間での本来の相違のためである。リンパ節または吸引液のい ずれかから抽出されたDNA量を標準化するにおいて困難に遭遇する。発明者らは 総溶解手順（total lsates procedure）を利用したので、RNAおよびDNAの両方が 得られた。溶解物の吸光度の測定は、十分なDNA濃度の指標にはならない。した がって、発明者らは、非希釈テンプレートおよび1:10希釈でのテンプレートのサ ンプルの両方を増幅に使用した。 Ｇ．ドット-ブロットハイブリダイゼーション PCR産物の同一性を確認するために、およびR．henselaeおよびR．quintanaテ ンプレートから増幅された産物の区別を可能にするために、ドットブロットハイ ブリダイゼーションアッセイを表２に挙げた細菌から増幅されたPCR産物に対し て行った。オリゴヌクレオチドプローブRH1およびRQ1をこの目的のために使用し た。Genius５標識キット（Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind.）を用い て、ターミナルトランスフェラーゼにより、ジゴキシゲニン-ddUTPヌクレオチド を各オリゴヌクレオチドの３'末端に移すことによって、RH1およびRQ1を非放射 性標識した。ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイのために、５μｌ の各PCR産物を、100mMエチレンジアミン四酢酸を含有する0.5μlの４ M NaOHの 添加により、10分間変性させた。１μｌアリコートを２枚のナイロンメンブレン （Boehringer Mannheim）にそれぞれにスポットし、そしてDNAをUV照射（Strata linker，Stratagene，La Jolla，Calif.）によってナイロンに架橋させた。次い で、ナイロンメンブレンを、Genius ７、発光検出キット（Boehringer Mannhei m）の標準的なプレハイブリダイゼーション溶液を用いて、１時間、62℃でブロ ックした。標準的なハイブリダイゼーション溶液は、0.1% N-ラウリルサルコシ ン、0.02% SDS、および1.0%ブロッキング試薬（Boehringer Mannheim）を含有 する５×SSC（１×SSC＝0.15 MNaClおよび0.015Mクエン酸ナトリウム）であった 。次いで、ハイブリダイゼーションを、62℃（両方のプローブに対して、T_M−８ ℃）、１時間、２pmol/mlの濃度でRH1またはRQ1のいずれかを含有する新鮮なプ レハイブリダイゼーション溶液中で行った。次いで、ハイブリダイズさせたメン ブレンを、0.1% SDSを含有する２×SSC中、それぞれ、15分間、室温で２回洗浄 した。その後、0.1% SDSを有する0.5×SSC中、52℃で、それぞれ15分間、２回洗 浄した。次いで、ハイブリダイ ズしたフィルターをブロックし、アルカリホスファターゼ結合抗体と反応させ、 洗浄し、そして製造業者の指示（Genius ７キット、Boehringer Mannheim）に 従ってLumigen PPD化学発光基質中に浸した。得られたフィルターを、５〜20分 間、Ｘ線フィルムに感光させ、そしてフィルムを現像した。 Ｈ．ドット-ブロットハイブリダイゼーションアッセイの特異性 プローブRH1でハイブリダイズしたR．henselaeの12個の単離物全てからPCR産 物を増幅した。R．quintanaの４個の単離物全てからのPCR産物を、プローブRQ1 でのみハイブリダイズした。プローブRH1もRQ1もいずれも、R．elizabethae、R ．vinsonii、B．bacilliformis、またはA．felisからのPCR産物と、ハイブリダ イズしなかった。したがって、ドット-ブロットハイブリダイゼーションアッセ イは、R．henselaeおよびR．quintanaから増幅されたPCR産物間の区別を可能に した。 オリゴヌクレオチドプローブ（RHIおよびRQI）は、種特異的ではあるが、種間 で十分に保存されているようである。 Ｉ．臨床サンプルに対するPCRおよびドット-ブロットアッセイ 臨床サンプルにおけるR．henselaeおよびR．quintanaの検出についてのPCRお よびドットブロットアッセイを評価するために、CSD症例由来の16サンプルの新 鮮なリンパ節組織および９サンプルの吸引液に、これらの技術を適応した。25サ ンプルのうち21（84%）が、R．henselaeまたはR．quintanaの特徴である414bp産 物を生成した（表３）。CSDの疑いのある患者のリンパ節バイオプシーサンプル およびリンパ節吸引液から得られた代表的なPCR産物を、電気泳動した。２つの サンプルが、テンプレートDNAを増幅前に1:10に希釈した場合にのみ、特徴的な4 14bpバンドを生成した。これらのサンプルの代表は＃９である。＃９の増幅は大 量の白血球DNAにより阻害されるようである。テンプレートDNAを含有するサンプ ルを、増幅前に1:10希釈した場合、414bpバンドが明瞭に生成された。特徴的な4 14bpフラグメントは、非CSD症例由来の８つのいずれのリンパ節組織サンプルか らも、DNA抽出ブランクからも増幅されなかった。 臨床サンプルから増幅されたPCR産物の同一性を確認するために、およびR.qui ntanaにより引き起こされる感染と、R．henselaeにより引き起こされるそれらの 感染とを区別するために、種特異的プローブRH1およびRQ1を用いてドット-ブロ ットハイブリダイゼーションを行った。特徴的な414bpフラグメントを生成する ために増幅した21サンプル全てからのPCR産物は、R．henselae特異的プローブRH 1とハイブリダイズした。逆に、これらのサンプルのいずれもR.quintana-特異的 プローブRQ1とハイブリダイズしなかった。したがって、本研究の全てのPCR陽性 サンプル（11の異なる状態において、CSDの疑いのある患者由来（表３））は、R ．henselaeに関連するが、R．quintanaとは関連しないようであった。アガロー スゲル電気泳動により決定されたように414bpフラグメントを増幅できなかった サンプルは、いずれのプローブにもハイブリダイズしなかった。 本結果は、AIDS患者の間に見られるBAおよび他の日和見性感染（ある場合は、 R．henselaeにより引き起こされ、そして他の場合はR．quintanaにより引き起こ され得る）とは異なり、CSDが、主として（または、おそらく独占的に）、R．he nselaeにより引き起こされるようであることを示す。 本明細書で記載したPCRアッセイについて、CSDの疑いのある症例由来の84%陽 性サンプルは、CSDの疑いのある患者由来のサンプルの２つの異なる群に対する 血清学的手段により観察された84%および88%陽性と事実上同一である（24、37） 。PCRにより本明細書で試験したCSD症例由来の22のサンプルもまた、血清学によ り試験した（表３）。これらのうち21（95%）が、１:64以上のIFA力価を有した 。したがって、血清陽性個体から回収されたこれらの３つのサンプルは、PCRア ッセイにより陰性であった。これらの明らかな不一致は、一部、CSDの後期段階 における患者由来のリンパ節中に、完全な生物がないためであり得る。実際、Ge rberらは、長引いた（lingering）細胞仲介性免疫応答、および得られる細菌侵 入ではなく肉芽腫性反応が、CSDの主な発病機構であり得ることを仮定している( 13)。あるいは、リンパ節組織に存在するPCRのインヒビターが存在し得、これは 達成されるアッセイの最適な感受性を妨げる。 PCRアッセイは、初期診断に利点を与える。なぜなら、検出可能な体液性免疫 応答を有している患者に依存しないからである。さらにPCRアッセイは、R．hens elae感染をR．quintana感染と区別する。CSDについての迅速で特異的な試験は、 診断の実験室確認のための培養および血清学の代替法を臨床医に与える。それゆ え、臨床医はリンパ腫のような悪性腫瘍を除外し、そして抗生物質療法を考慮に 入れることが可能になる。CSDを処置することにおける抗生物質の有効性は明ら ではないが、４つの抗生物質（リファンピン、シプロフロキサシン、トリメトプ リム-スルファメトキサゾール、および硫酸ゲンタマイシン）での処置の成功が 報告されており（19）、そしてインビトロで、R．henselaeは、多くの一般的な 抗生物質に感受性である（９）。 実施例４ R．henselaeの抗原性フラグメントの同定 Rochalimaea henselae DNAのライブラリーを、ネコ引っ掻き病(CSD)と診断さ れ、そして間接蛍光抗体(IFA)アッセイによって決定されたRochalimaeaに対する 抗体を有する患者由来の血清のプールを使用して、クローニングベクターλZapI I中に構築し、そして抗原性タンパク質の発現についてスクリーニングした。10 個の免疫反応性ファージを、インビボ切除によって組換えプラスミドとしてサブ クローン化した。10個の組換え体は全て、ヒト血清のプールを使用した免疫ブロ ット分析によって検査された場合、約17キロダルトン(kDa)のタンパク質を発現 した。10個の組換えプラスミドのそれぞれの制限エンドヌクレアーゼ消化は、７ つの異なるプロファイルを示し、このことは、クローニングの偏り（cloning bi as）が17kDaの抗原を発現するクローンを繰り返し単離する理由ではないことを 示唆した。17kDaの抗原をコードする遺伝子を配列決定し、そしてこれか148アミ ノ酸のオープンリーディングフレームと16,893ダルトンの予測分子量とをコード することを示した。推論されるアミノ酸配列のアミノ末端は性質が疎水性であり 、サイズおよび組成がグラム陰性細菌に見られるシグナルペプチドと同様であっ た。推論されるアミノ酸配列の残りの部分はより親水性であり、表面に露出する エピトープを表し得る。発現ベクターPinPoint Xa-2中に、 17kDaの抗原をビオチン化融合タンパク質としてさらにサブクローン化すること により、CSD患者由来の個々の血清サンプルと免疫ブロットにおいて高度に反応 する30kDaのタンパク質が得られた。免疫ブロット分析における30kDaの融合タン パク質との反応性とIFAアッセイによって得られた結果との間の一致は、IFA陽性 では92％(n=13)、そしてIFA陰性では88％(n=9)であった。組換え体が発現した17 kDaのタンパク質は、CSDおよびRochalimaea感染の血清学的診断のための抗原と しての価値を有すべきであり、ネコにおけるRochalimaeaによる長期感染および この生物がヒトへさらに広がる可能性を防止するためのサブユニットワクチンの 開発を試みるさらなる研究を保証する。 Ａ．Rochalimaea の培養 Rochalimaea株を、５％のウサギ脱繊維素血液(BBL，Cockeysville，Md)を補っ たハートインフュージョンアガー上で増殖させた。本実施例で述べられている全 ての実験では、R．henselaeのHouston-1株およびR．quintanaのFuller株を使用 した。培養物を、34℃にて５％CO₂の存在下でインキュベートした。十分な増殖( ３〜４日)後、細菌細胞を、滅菌されたアプリケータで回収し、TE緩衝液(10mM T ris pH8.0，１mM EDTA)中に懸濁した。細菌を、必要に応じて遠心分離により濃 縮した。次いで、細菌細胞を、以後の免疫ブロット分析のために凍結し、そして 保存するか、または以下にその概要が示されるようにそのDNAを抽出した。 Ｂ．R ．henselae DNAライブラリーの構築 λ ZAPIIベクター(Stratagene，Torrey Pines，Calif.)を使用し、A-Tリッチ な生物のDNAライブラリーを構築するために特に開発された新規の方法(５)を使 用して、R．henselae DNAのλファージライブラリーを調製した。プロティナー ゼＫ(100ng/μl)の存在下で1.0％SDSを用いて、55℃にて90分間、細菌細胞を溶 解することによって、総(染色体および染色体外)DNAを、R．henselaeのHouston- 1株から単離した。得られた溶解物を、フェノールとクロロホルムとの50:50混合 物を用いて４回抽出した。0.3Mまで酢酸ナトリウムを、および2.5容 量の無水エタノールを加えることによって、核酸を水性相から沈澱させた。沈澱 物を遠心分離によって回収し、10ng/μｌのリボヌクレアーゼＡを含むTE緩衝液 中に再懸濁した。抽出されたDNAを、酵素活性(スター活性)を促進する条件下で 、制限エンドヌクレアーゼEcoRIを用いて消化した。このスター活性は特異性が 低く、従って通常条件下でのEcoRIを用いた切断よりもさらにランダムである。E coRIスター活性により生成されたDNAフラグメントは、EcoRI切断ベクター中へ効 率的にクローン化される(5)。得られたDNAを、0.7％アガロースゲルによる電気 泳動およびglass milk(GeneClean)Bio101、Vista、Calif.)への吸着による精製 によって、長さが３〜８キロベースペアのフラグメントについてサイズ選択した 。精製された同じサイズのDNAを、EcoRI切断しアルカリホスファターゼ処理され たλ ZAPIIベクターに連結した。次いで、組換えファージコンカテマーを、Giga pack packaging extract(Stratagene、Torrey Pines、Calif.)を使用して、λ粒 子中へパッケージした。パッケージした後、ライブラリーのアリコートを、NZY アガープレート上にEscherichia coli XLI株(Stratagene、Torrey Pines、Calif .)をプレートすることによって、組換え体の割合について滴定およびアッセイし た。ライブラリーを、パッケージされた全連結反応物をプレートすることによっ て増幅し、そしてファージ希釈緩衝液(10mM Tris pH8.0、10mM MgCl₂、0.1％ゼ ラチン)中に組換え体を一晩拡散させることによって回収した。 Ｃ．組換えクローンの免疫スクリーニング ヒト血清との免疫反応性について組換えファージをスクリーニングするために 、NZYアガーの150mmプレート当たり約30,000の密度でλファージクローンをプレ ートした。42℃で３〜４時間(プラークがかろうじて見えるまで)のインキュベー ションの後、プレートに、１mMのイソプロピルβ−Ｄ−チオグラクトピラノシド (IPTG)を浸潤させたニトロセルロースフィルターを重ね、そしてインキュベーシ ョンを37℃でさらに３時間続けた。次いで、フィルターを、0.1％Tween 20を含 むTris緩衝化生理食塩水(pH 8.0)(TBST)中で２回洗浄し、そして5.0％の脱水ス キムミルク(Difco、Detroit、Mich.)を含むTBSTで１時間室温にてブロックした 。次いで、フィルターを、CSDと臨床的に診断された患者由来の血清サン プル(５％スキムミルクを含むTBST中に1:300に希釈)のプールと、２時間反応さ せた。この血清サンプルのプールは、CSDと診断された患者に由来し、そして上 記(42)のように行われたRochalimaeaについての間接蛍光抗体(IFA)アッセイによ って決定された1:1024またはそれ以上の力価を有することが示された、10個体の 血清からなった。次いで、フィルターを、TBSTを用いて４回洗浄し、そして西洋 ワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗ヒトIgG(５％スキムミルクを含むTB ST中に1:3000に希釈)とこのフィルターとを１時間室温にて反応させることによ って、結合した抗体を検出した。フィルターをTBST中で４回洗浄し、そしてTMB メンブレン基質(Kirkegaard and Perry、Gaithersburg、Md)を使用して発色させ た。 Ｄ．組換えファージミドのレスキューと分析 免疫反応性組換えファージを数ラウンドのプラーク精製した後、単離されたフ ァージプラークを、製造者(Stratagene、Torrey Pines、Calif.)の指示に従って 、λファージ組換え体からpBluescript由来プラスミド中へサブクローン化した 。簡単に述べると、λ組換え体に感染したE．coli XL1 MRF'細胞をR408ヘルパー ファージで重複感染させることによって、挿入されたRochalimaea DNAを含むλ ZAPIIベクターのpBluescript部分をレスキューした。次いで、これらの組換えフ ァージミドを使用して、XL1 MRF'細胞を感染させた。この細胞中で、これらの組 換えファージミドは、アンピシリンでの選択時にプラスミドとして複製する。こ の手順により、Rochalimaea DNA挿入物を有するpBluescript由来組換えプラスミ ドを収容するコロニーが得られる。これらの組換えプラスミドを、DNAのさらな る分析および配列決定のため、ならびにE．coli中で発現される、プラスミドに コードされたRochalimaeaタンパク質の免疫ブロット分析のために使用した。 Ｅ．免疫ブロット分析 個々の抗原に対するヒト抗体の応答を分析するために、RochalimaeaおよびE． coli組換え体の全細胞溶解物を、SDS-PAGEおよびび免疫ブロット分析にかけた。 Rochalimaeaを上記のように増殖した。E．coli組換え体を、100μg/mlのアン ピシリンを含むLBブロス中37℃にて、振盪しながら、対数増殖中期まで増殖させ 、そして１mMのIPTGを加えた。インキュベーションを、37℃にてさらに２時間、 振盪しながら続け、そして遠心分離によって細胞を回収した。得られた細胞ペレ ットを、SDS-PAGE用サンプル緩衝液(２％SDS、50mM Tris pH 8.0)中で、５分間 100℃にて可溶化した。 可溶化したRochalimaeaおよびE．coli組換え細胞タンパク質を、８〜16％勾配 のSDS-PAGE mini gel(Novex、San Diego、Calif.)により電気泳動した。得られ た細胞タンパク質を、クーマシーブリリアントブルーを用いて直接染色するか、 またはmini-transfer装置(Bio-Rad、Richmond、Calif.)を使用してニトロセルロ ースに移した。タンパク質をニトロセルロースに電気的に移した後、得られたフ ィルターを抗血清と反応させ、そして本実施例の「組換えファージクローンの免 疫スクリーニング」の章に記載されるように処理した。 Ｆ．ファージミドDNAの配列決定 組換え体由来のプラスミドDNAを、アルカリ溶解によってミニプレップ(mini-p rep)から調製した。得られたプラスミドDNAを、制限エンドヌクレアーゼ消化の ために、および直接、ジデオキシチェーンターミネーション法による二本鎖プラ スミド配列決定のために、使用した。Zhang(44)の方法によるアルカリ変性、お よびそれに続く³⁵S dATPを使用するT7 DNAポリメラーゼ(Sequenase、US Biochem ical)を用いる鎖伸張および終止を使用してプラスミドを配列決定した。配列決 定したDNAを、変性６％アクリルアミド−尿素ゲルにより電気泳動し、得られた ゲルを10％酢酸および５％メタノールで固定した。真空乾燥の後、ゲルを約12〜 24時間、Ｘ線フィルムに曝し、そして現像した。プラスミドを、M13の正方向ま たは逆方向プライマーを用いて、または配列決定が進行するに従って、R．hense lae挿入物から合成されたプライマーを使用して、配列決定した。さらに17kDaの 抗原遺伝子の位置を決定するため、そしてさらなる配列決定のために、制限フラ グメントを標準的方法(20)によってpUC19中にサブクローン化し、免疫ブロット 分析によって発現について検査した。 Ｇ．融合タンパク質の構築 推測の17kDa抗原遺伝子の正体(identity)を確認し、そしてE．coli中での最適 な発現を可能にするために、遺伝子融合技術を使用した。５'末端プライマー(5 ’AAAAGCTTGAAAAAATATAGCTTAGTCAC 3'、配列番号13)上にHindIII部位(下線部)を 、そして３'末端プライマー(5’AAGGATCCAGAAATGCTCTCAAAC 3'、配列番号14)上 にBamHI部位(下線部)を含む、推定の17kDa抗原遺伝子配列由来のPCRプライマー を設計した。これらの独特な制限部位は、方向的およびインフレームのクローニ ングを容易にする。R．henselaeのHouston-1株由来のDNAを、GeneAmp試薬および Taqポリメラーゼおよび熱サイクラー(Perkin Elmer、Norwalk、Conn.)を使用し て、94℃で１分間、48℃で２分間、および68℃で1.5分間の35サイクルにより増 幅した。得られたPCR産物を、HindIIIおよびびBamHIを用いて切断し、ゲル精製 し、そして発現ベクターPinPoint Xa-2に連結して、ベクター(Promega、Madison 、Wisc.)の13kDaビオチン化タグ配列と抗原との融合物を生成した。このタグ配 列は、生産者によって操作されており、他のE．coli細胞タンパク質からビオチ ン化融合タンパク質を迅速に精製することを可能にする。タグ配列からのタンパ ク質の切断を可能にするエンドプロテアーゼ切断部位もまた存在する。E．coli XL-1 MRF'株(Stratagene、Torrey Pines、Calif.)を形質転換するために、連結 混合物を使用した。制限エンドヌクレアーゼ分析によって潜在的クローンを検査 して、正確なサイズの挿入物の存在を確認した。正確なサイズの挿入物を含むク ローンを、LBブロス中で対数増殖初期まで増殖させ、そして１mM IPTGを用いて 誘導し、そして増殖をさらに２時間続けた。E．coli細胞を遠心分離によって回 収し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンを使用 する免疫ブロット分析によってビオチン化融合タンパク質の発現について検査し た。ビオチン化融合タンパク質を発現するクローンを、CSD患者由来の血清プー ル、ならびにCSD患者およびコントロール由来の個々の血清サンプルとの反応性 について検査した。これらの血清は、終点力価(endopoint titer)を決定するた めに、先にIFAにかけられていた。 Ｈ．免疫反応性クローンの同定および特徴付け 約1.2×10⁶個の組換えファージクローンを得た。得られたライブラリーの質を マーカー遺伝子のクローニング効率についてアッセイすることによって予め調べ た(３)。この報告の目的のために、16S rRNA遺伝子を選択し、そしてこれがクロ ーンの0.125％とハイブリダイズすることを示した。これらの結果は、ランダム クローニングについて予測されたものに近く、そしてすべてのDNAフラグメント が、R.henselaeライブラリーに現れていることを示唆する。CSDであると診断さ れた患者由来の血清のプールを用いてスクリーニングされた、300,000個のR.hen selae組換えファージの約0.2〜0.3％が、免疫反応性であった。これらの免疫反 応性組換え体のうち10個を、さらなる研究のために選択し、そして３または４ラ ウンドのプラーク精製により単離した。10個すべてを、pBluescriptをベースと したファージミドとしてサブクローン化し、そしてE．coli SOLR株(Stratagene 、Torrey Pines、Calif.)に感染させるために使用した。10個のサブクローンの それぞれは、CSD患者由来の血清のプールと免疫ブロットで高度に反応する同じ1 7kDa抗原の合成を支配するようである。プラスミドベクターpBluescript SKのみ を収容するE．coli XL-1のコントロール株は、同じ免疫反応性17kDa抗原を発現 しなかった。Vero細胞と同時培養されたR.henselaeによるこの抗原の発現は、認 識可能ではないが、R.henselae生物は、血液アガー上で増殖する場合、わずかに 17kDa抗原を発現するようであった。R.quintanaもまた、CSD患者由来のプールさ れた血清と反応する17kDa抗原を発現した。このことは、この抗原(またはその部 分)がR.henselaeとR.quintanaとの間で共有され得ることを示唆した。R.hensela eおよびE．coliクローンによって発現された17kDa抗原は、CSDの病歴のない患者 由来のコントロールヒト血清プールと反応しなかった。この血清プールからの抗 体応答は、多様な異なるR.henselae抗原に方向付けられているようではなかった 。14kDa、68kDaおよび84kDaのおよその分子量を有する主要な免疫反応性抗原が 、17kDa、32kDaおよび48kDaに認められる主要でないバンド(minor band)に加え て、R.henselaeで見られる。E．coli中で発現した17kDa抗原は、R.henselae中で 発現するようなタンパク質よりずっと強くこの血清プールと反応するようてある 。これらの結果は、17kDa抗原が高度に免疫反応性であるが、R.henselaeにおい て高レベルで発現しないと いうことを意味する。 Ｉ．17-kDa 抗原をコードする遺伝子の分析 クローニングの偏りは、17-kDa抗原を発現するクローンがこのような頻度で単 離される理由の説明になるかどうかを決定するため、制限エンドヌクレアーゼ分 析を行った。EcoRIによる17-kDa抗原を発現する全部で10個の組換え体由来のプ ラスミドの消化は、７つの異なるプロファイルを示した。従って、17-kDa抗原発 現クローンが、単離された最初の10個のクローンを表すにもかかわらず、少なく とも７つの異なるDNAフラグメントは全遺伝子を含む。これらの結果は、クロー ニングの偏りが、ライブラリー中のDNAの特定のフラグメントの過剰発現量によ って同じ抗原発現クローンを単離するのに役割を果たさないことを示す。従って 、これらの結果は、R．henselaeに関して免疫反応性のバンドをほとんど示さな いという結果とともに、17-kDa抗原がCSD患者により認識される少ない免疫優性 抗体の１つであり得ることを示唆する。 CSD患者からの血清のプールと反応する17-kDa抗原の遺伝子を、2.2キロベース のEcoRIフラグメント内で位置決定し、そして全フラグメントを配列決定した。1 7-kDa抗原をコードする遺伝子を、CSD患者からの血清プールを用いたサブクロー ニングおよび免疫ブロット分析により、単一のオープンリーディングフレームに 位置決定した。この遺伝子は、lacZ αペプチドの方向でpUC19内にサブクローン 化するとき、E．coliにおける17-kDa抗原の合成のみを指示した。従って、R．he nselaeプロモーターは、この遺伝子の上流に存在しないか、またはE．coliでは 機能しないかのいずれかである。同定された２つの推定の開始メチオニンのいず れかに依存する160または148のアミノ酸のいずれかでなるオープンリーディング フレームは、機能的である。第１の潜在的な開始メチオニンは、E.coli中のコン センサスリボゾーム結合部位に類似するポリプリン豊富な配列により先行される (40)。第２の潜在的な開始メチオニンは、コンセンサスE．coliリボゾーム結合 部位と同一の配列により８塩基先行される。仮に第２の潜在的な開始メチオニン が翻訳の開始のために使用されるならば、148のアミノ酸および16,893ダルトン の予想分子量を有する推定のタンパク質が得られる。第１の潜 在的な開始メチオニンが使用される場合、これは、予想される分子サイズ(18,24 5ダルトン)より免疫ブロット上で観察される17-kDaの見かけの分子サイズに近い 。17-kDa抗原遺伝子の推定のアミノ酸配列は、GenBankデータベース中の任意の 他の細菌タンパク質とは有意なホモロジーを共有していない。仮に第２の潜在的 な開始メチオニンを使用すると、推定アミノ酸配列は細菌膜会合タンパク質とい くつかの類似性を共有する。最初の18のアミノ酸は本来疎水性であり、そして直 接のアミノ末端に２つのリシン残基(２および３残基)を含有する。このタイプの モチーフは、リシン残基が膜のリン脂質、および膜貫通配列または膜アンカー配 列由来の以下の疎水性残基と相互作用する代表的な細菌外表面タンパク質である (43)。E．coliコンセンサスシグナルペプチダーゼ切断部位(A-X-A)と同一のアミ ノ酸配列は、第２の推定のイニシエーターコドン以後の18-20残基に存在する。 この部位をR．henselaeシグナルペプチダーゼにより切断して、17-kDa抗原の成 熟な形態を生じるかどうかは知られていない。17-kDa抗原遺伝子配列から推定さ れた残りの130のアミノ酸残基は、主として親水性または中性であり、長い疎水 性ドメインを有しない。 この２つの潜在的な開始メチオニンのいずれかが翻訳の開始のために使用され るにも関わらず、別の長いオープンリーディングフレームとの短い重複が存在す る。17-kDa抗原遺伝子の上流を示すリーディングフレームは、少なくとも示され る別の380のヌクレオチド上流に続く。このオープンリーディングフレームの全 配列はまだ得られていない。17-kDa抗原遺伝子は、この未同定オープンリーディ ングフレームのプロモーター上流から転写されるオペロンの一部であるようであ る。同様に、第２の未同定のオープンリーディングフレームは、17-kDa抗原遺伝 子の3'末端に重複し、そして少なくとも別の700のヌクレオチドに続く。細菌の 転写ターミネーターの特徴である、安定なループおよびステム型の二次構造を形 成し得る配列は、17-kDa抗原遺伝子のすぐ下流には見られない。この第３のオー プンリーディングフレームは、17-kDa抗原遺伝子とその上流の潜在的な遺伝子と を伴う単一のプロモーターから同時転写される遺伝子であり得る。E．collコン センサス-35(TTGACA)および-10(TATAAT)プロモーター配列に対して正確な間隔お よびホモロジーを有する17-kDa抗原遺伝子の上流の領域は存在しな い(41)。しかし、Rochalimaeaプロモーター配列はE．coliのそれと異なり得る。 潜在的なプロモーター配列の欠失およびベクターlacZプロモーターの方向にクロ ーン化されるときのみの17-kDa抗原の発現は、この遺伝子が上流の遺伝子と同時 に転写されるというさらなるデータを提供する。 Ｊ．遺伝子融合構築 高度に発現されたハイブリッド融合タンパク質を作成するために、2〜148のア ミノ酸残基をコードする遺伝子の一部を、配列表に配列番号12および配列番号13 として記載されているプライマーを用いるPCR増幅により合成した。この遺伝子 のメチオニン残基を欠いた全タンパク質の、発現ベクターPinPoint Xa-2の13-kD aビオチン化タグ配列へのイン-フレーム融合(第２のメチオニンが翻訳の開始で あると推定する)を可能にするPCRプライマーを選択した。この結果、ベクターpX a-2のlacZプロモーターの制御下で抗原(カルボキシ末端部分)に融合したタグ配 列(アミノ末端部分)からなる融合タンパク質が得られる。この30-kDa融合タンパ ク質は、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したステレプトアビジンを用いる免 疫ブロット分析により測定されるように、E．coliで効率的に発現される。E．co li株XL-1 MRF'中のpXa-2ベクターに融合した非関連遺伝子の８-kDa部分からなる コントロールは、約21-kDaのビオチン化されたタンパク質を発現する。約26-kDa の見かけの分子量を有する天然に存在するビオチン化タンパク質は、３つクロー ンの全てに発見される。この天然に存在するビオチン化タンパク質は、ベクター 製造業者(Promega Corp.，Madison，Wisc.)による、組換えDNA目的のためのE．c oliのK-12株全てに観察されている。 Ｋ．融合タンパク質の免疫反応性 CSD患者からの個々の血清サンプルおよびコントロールとの30-kDaの融合タン パク質の反応性を測定するために、免疫ブロット分析を行った。個々の血清サン プルを融合タンパク質を含有するクローンにより発現されたタンパク質と反応さ せたとき、IFAアッセイによりRochalimaeaに対する抗体について陽性である13個 の血清サンプルのうち12個も、30-kDa組換え融合タンパク質と反応した。 同様に、IFAにより陰性である９個の血清サンプルのうち８個は、免疫ブロット により30-kDaの融合タンパク質とは反応しなかった。免疫ブロットストリップを 30-kDaの融合タンパク質の反応性についてのみ測定する場合、CSDの臨床的診断 とIFA力価とに良好な相関がある。これらの結果はまた、CSD患者由来の血清によ り認識される17-kDA抗原の優性なエピトープが融合タンパク質内に保持されるこ とを示す。 本出願を通じて、種々の刊行物を括弧内の番号によって参照している。これら の刊行物の引用の全ては以下の通りである。これらの刊行物の開示は、本発明の 関連する先行技術をより充分に記載するために、全体で本明細書中に参考として 援用されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 レグナリー， ラッセル エル. アメリカ合衆国 ジョージア 30084， タッカー， リブシー ロード 4090 (72)発明者 アンダーソン， バート イー. アメリカ合衆国 ジョージア 30084， タッカー，サマーローク ドライブ 2473 (54)【発明の名称】 ＲＯＣＨＡＬＩＭＡＥＡ ＨＥＮＳＥＬＡＥおよびＲＯＣＨＡＬＩＭＡＥＡ ＱＵＩＮＴＡＮＡ の核酸ならびにＲＯＣＨＡＬＩＭＡＥＡ ＨＥＮＳＥＬＡＥおよびＲＯＣＨＡＬＩＭＡＥＡ Ｑ ＵＩＮＴＡＮＡ感染を診断するための方法および組成物

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列表に配列番号１１として示されるアミノ酸配列をコードする、単離され た核酸。 ２．前記核酸が発現するに適切なベクター中の請求項１に記載の単離された核酸 。 ３．前記核酸が発現するに適切な宿主中の請求項２に記載のベクター。 ４．長さが少なくとも１５ヌクレオチドの単離された核酸であって、ポリメラー ゼ連鎖反応の下で請求項１に記載の核酸と選択的にハイブリダイズし得る、核酸 。 ５．長さが少なくとも１５ヌクレオチドの単離された核酸であって、６０℃およ び５×SSCのストリンジェンシー条件下、これに続く、室温、２×SSCおよび0.1 ％SDSである最初の洗浄条件下、および５０℃、0.5×SSCおよび0.1％SDSのスト リンジェンシー条件での２回の第２の洗浄下で請求項１に記載の核酸と特異的に ハイブリダイズし得る、核酸。 ６．請求項５に記載の単離された核酸によってコードされる、精製された抗原性 ポリペプチド。 ７．配列表に配列番号１１として示されるアミノ酸配列を有する、精製された抗 原性ポリペプチド。 ８．配列表に配列番号７として規定されるヌクレオチド配列中のヌクレオチドか らなる、単離された核酸。 ９．前記核酸が発現するに適切なベクター中の請求項８に記載の核酸。 １０．前記核酸が発現するに適切な宿主中の請求項９に記載のベクター。 １１．高ストリンジェンシー条件下で請求項８に記載の核酸と特異的にハイブリ ダイズする単離された核酸であって、そして該核酸がハイブリダイズする鎖のセ グメントと少なくとも85％の配列相補性を有する、核酸。 １２．請求項８に記載される核酸によってコードされる、精製された抗原性タン パク質。 １３．請求項８に記載される核酸によってコードされる、抗原性ポリペプチドフ ラグメント。 １４．配列表に配列番号５として規定されるヌクレオチド配列中のヌクレオチド を含有する、Rochalimaea henselaeに特異的な単離された核酸。 １５．配列表に配列番号６として規定されるヌクレオチド配列中のヌクレオチド を含有する、Rochalimaea quintanaに特異的な単離された核酸。 １６．配列表に配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４として示 される核酸の混合物。 １７．被検体における現在および以前のネコ引っ掻き病(cat scratch disease) を診断する方法であって、該被検体由来のサンプルにおけるRochalimaea hensel aeの存在を検出する工程を包含し、ここで、該検出工程が、 該被検体由来の液体サンプルまたは組織サンプルと、配列表に配列番号１１と して示されるポリペプチドと特異的に結合する、検出可能量の精製された抗体と を接触させる工程、 該抗体とポリペプチドとの結合を検出する工程、および 特異的結合の存在と、該被検体におけるネコ引っ掻き病とを相関させる工程、 を包含する、方法。 １８．被検体における現在および以前のネコ引っ掻き病を診断する方法であって 、該被検体由来のサンプルにおけるRochalimaea henselaeの存在を検出する工程 を包含し、ここで、該検出工程が、 該被検体由来の液体サンプルまたは組織サンプルと、配列表に配列番号７とし て示されるポリペプチドと特異的に結合する、検出可能量の精製された抗体とを 接触させる工程、 該抗体とポリペプチドとの結合を検出する工程、および 特異的結合の存在と、該被検体におけるネコ引っ掻き病とを相関させる工程、 を包含する、方法。 １９．R．henselaeと特異的に結合する抗体の存在を検出することによって、被 検体における現在および以前のネコ引っ掻き病を診断する方法であって、ここで 、該検出工程が、 該被検体由来の、抗体を含有する液体サンプルまたは組織サンプルと、配列表 に配列番号７として示される、所定量の精製されたポリペプチドとを接触させる 工程、 該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程、および 該ポリペプチドと特異的に結合する抗体の存在と、該被検体におけるネコ引っ 掻き病とを相関させる工程、 を包含する、方法。 ２０．R．henselaeと特異的に結合する抗体の存在を検出することによって、被 検体において現在および以前のネコ引っ掻き病を診断する方法であって、ここで 、該検出工程が、 該被検体由来の、抗体を含有する液体サンプルまたは組織サンプルと、配列表 に配列番号１１として示される所定量の精製されたポリペプチドとを接触させる 工程、 該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程、および 該ポリペプチドと特異的に結合する抗体の存在と、該被検体におけるネコ引っ 掻き病とを相関させる工程、 を包含する、方法。 ２１．R．henselaeと特異的に結合する抗体の存在を検出することによって、被 検体における現在および以前のネコ引っ掻き病を診断する方法であって、ここで 、該検出工程が、 該被検体由来の、抗体を含有する液体サンプルまたは組織サンプルと、配列表 に配列番号１１として示されるアミノ酸配列をコードする核酸と特異的にハイブ リダイズし得る核酸によってコードされる所定量の精製されたポリペプチドとを 、６０℃および５×SSCのストリンジェンシー条件下、これに続く、室温、２×S SCおよび0.1％SDSである最初の洗浄条件下、および５０℃、0.5×SSCおよび0.1 ％SDSのストリンジェンシー条件での２回の第２の洗浄下で接触させる工程、 該ポリペプチドと該抗体との結合を検出する工程、および 該ポリペプチドと特異的に結合する抗体の存在と、該被検体におけるネコ引っ 掻き病とを相関させる工程、 を包含する、方法。 ２２．被検体における現在および以前のネコ引っ掻き病を診断する方法であって 、該被検体由来のサンプルにおけるRochalimaea henselaeの存在を検出する工程 を包含し、ここで、Rochalimaea henselaeの存在が、配列表に配列番号１１とし て示されるアミノ酸配列をコードする核酸の存在を検出することによって決定さ れる、方法。 ２３．前記核酸が、核酸増幅技術を利用して検出される、請求項２２に記載の方 法。 ２４．前記被検体がヒトである、請求項２２に記載の方法。 ２５．被検体における細菌性血管腫症を診断する方法であって、 該被検体由来のサンプルにおけるRochalimaea henselaeの存在を検出する工程 であり、Rochalimaea henselaeの存在が、配列表に配列番号５として示されるア ミノ酸をコードする核酸の存在を検出することによって決定される、工程、およ び、 Rochalimaea henselaeの存在と、該被検体における細菌性血管腫症の存在とを 相関させる工程、 を包含する、方法。 ２６．被検体における細菌性血管腫症を診断する方法であって、 Rochalimaea quintanaに特異的な核酸の存在を検出することによって、該被検 体由来のサンプルにおけるRochalimaea quintanaの存在を検出する工程であり、 該Rochalimaea quintanaに特異的な核酸が、配列表に配列番号６として規定され るヌクレオチド配列中のヌクレオチドからなる、工程、および、 Rochalimaea quintanaの存在と、該被検体における細菌性血管腫症の存在とを 相関させる工程、 を包含する、方法。 ２７．被検体における細菌性血管腫症を診断する方法であって、 Rochalimaea quintanaに特異的な核酸の存在を検出することによって、該被検 体由来のサンプルにおけるRochalimaea quintanaの存在を検出する工程であり、 該Rochalimaea quintanaに特異的な核酸が、配列表に配列番号１１として規定さ れるヌクレオチド配列中のヌクレオチドからなる、工程、および、 Rochalimaea quintanaの存在と、該被検体における細菌性血管腫症の存在とを 相関させる工程、 を包含する、方法。 ２８．被検体におけるネコ引っ掻き病または細菌性血管腫症を診断する方法であ って： (ａ)配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなるプライマ ー混合物を使用して該被検体由来のDNAを増幅する工程； (ｂ)工程(ａ)由来の増幅DNAと配列番号５の核酸からなるプローブとを接触さ せ、そして該プローブと該増幅DNAとのハイブリダイゼーションを検出する工程 であり、ハイブリダイゼーションの存在がR．henselaeの存在を示し、これがネ コ引っ掻き病と相関づけられる、工程；および、 (ｃ)工程(ａ)由来の増幅DNAと、配列番号６の核酸からなるプローブとを接触 させ、そして該プローブと該増幅DNAとのハイブリダイゼーションを検出する工 程であり、ハイブリダイゼーションの存在がR．quintanaの存在を示し、これが 細菌性血管腫症と相関づけられる、工程 を包含する、方法。