DE69535156T2

DE69535156T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur diagnose von rochalimaea henselae und rochalimaea quintana infektion

Info

Publication number: DE69535156T2
Application number: DE69535156T
Authority: DE
Inventors: L. Russell Tucker REGNERY; E. Burt Tucker ANDERSON
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1994-05-18
Filing date: 1995-05-18
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2015-05-19
Also published as: US5736347A; CA2190359A1; JPH10507902A; CA2190359C; JP3689426B2; EP0759988B1; AU699416B2; AU2592995A; EP0759988A1; DE69535156D1; WO1995031549A1; ATE335821T1

Description

Stand der Technik
Die Katzenkratzkrankheit (CSD) war schon seit vielen Jahren von großem klinischem und mikrobiologischem Interesse. Man schätzt, dass in den Vereinigten Staaten jährlich 7000 Fälle der Katzenkratzkrankheit auftreten. Aufgrund der Schwierigkeiten beim Diagnostizieren der CSD und ihrer möglicherweise verwirrenden klinischen Ähnlichkeit mit anderen Krankheitsyndromen kann es jedoch sein, dass die Zahl der tatsächlichen Fälle der CSD in den Vereinigten Staaten eher in der Nähe von 70 000 pro Jahr liegt. CSD wird als eine subakute regionale Lymphadenitis beschrieben, die in einem zeitlichen Zusammenhang mit dem Kratzer oder Biss einer Katze steht, und sie kann in einigen Fällen zu einer Meningoenzephalitis führen.
Die Diagnose der CSD war ein Problem, da das ätiologische Agens der Krankheit früher noch nicht identifiziert worden war. Ein nicht-identifiziertes Bakterium („bacillus") wurde in Biopsien von Patienten mit CSD unter Verwendung der Warthin-Starry-Färbung sichtbar gemacht, konnte jedoch aufgrund von Schwierigkeiten beim Herstellen einer isolierten Kultur noch nicht identifiziert werden. Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass das ätiologische Agens von CSD „Afipia felis" ist (7). Trotz dieser Arbeiten war es bisher nicht möglich, dieses Agens zu isolieren oder es auf andere Weise mit den meisten der an der Katzenkrankheit leidenden Personen zu assoziieren.
Eine klinisch verwandte Krankheit, die bazilläre Angiomatose (BA), ist ein Leiden, das durch multiple Tumoren oder Schwellungen gekennzeichnet ist, welche auf einer Proliferation der Blutgefäße beruhen. BA tritt häufig in Verbindung mit einem Immunmangelzustand, insbesondere bei einer HIV-Infektion, auf. Ein nicht-identifiziertes Bakterium (bacillus") wurde in den angiomatösen Geweben unter Verwendung der Warthin-Starry-Färbung sichtbar gemacht (28). Es wurde gezeigt, dass die aus den angiomatösen Geweben extrahierte DNA ein Fragment eines 16S-rRNA-Gens enthält, das mit dem 16S-rRNA-Gen von Rochalimaea quintana verwandt, jedoch nicht identisch ist. Aus einer reinen Kultur des Organismus wurde diese DNA nicht erhalten (28). Diesen Forschem ist es nicht gelungen, einen infektiösen Organismus aus Geweben von Pa tenten zu isolieren, und sie waren deshalb auch nicht in der Lage, die in Geweben festgestellten DNA-Sequenzen eindeutig einem identifizierbaren krankheitsauslösenden Organismus zuzuordnen. Weder der in diesen Geweben festgestellte Organismus noch der tatsächliche Erreger der Krankheit ließen sich identifizieren.
Somit konnte(n) das (die) ätiologische(n) Agens (Agenzien) sowohl von CSD als auch von BA trotz intensiver Forschung und trotz weit verbreiteter Effekte der Krankheiten nicht identifiziert werden. Die vorliegende Erfindung beschreibt die Identifizierung eines Organismus, der hier R. henselae genannt wird, welcher der Erreger der beiden Krankheiten ist.
R. quintana wurde mit verschiedenen klinischen Syndromen in Zusammenhang gebracht, umfassend persistierendes Fieber mit Bakteriämie bei normalen und immunsupprimierten Individuen (18, 23, 30, 34). Trotz des Zusammenhangs von R. quintana mit einer Krankheit wurde R. quintana nicht eindeutig für die CSD verantwortlich gemacht. Aufgrund der Kontroverse, welche die Ätiologie der CSD umgibt, und der Verbindung von R. quintana mit einer Krankheit des Menschen besteht ein Bedarf für ein Verfahren, mit dem jeder dieser Organismen in Lymphknotengewebe aus CSD-Patienten direkt nachgewiesen werden kann.
Die Erfindung erfüllt diesen Bedarf, indem sie ein Nucleinsäure-basiertes Verfahren zum Nachweisen einer R. quintana-Infektion in einem Individuum bereitstellt. Die isolierten Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung machen es möglich, dass Primer und Sonden für ein solches Nucleinsäure-basiertes Nachweissystem einfach entworfen werden können.
Außerdem besteht ein Bedarf, das Vorliegen einer Infektion eines Patienten durch R. henselae schnell identifizieren zu können. Eine schnelle und effiziente Bestimmung solcher Infektionen wird dazu beitragen, dass man die früher zweifelhaften Symptome, die mit einer Infektion durch R. henselae assoziiert sind, diagnostizieren kann und dass man auf diese Weise einfacher ein geeignetes Behandlungsschema aufstellen kann.
Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf, indem sie gereinigte antigene Polypeptide bereitstellt, die erforderlich sind, um das Vorliegen von R. henselae-Antikörpern nachzuweisen, die im Serum von solchen Patienten zirkulieren, die gegenwärtig mit R. henselae infiziert sind oder die früher damit infiziert waren. Diese gleichen gereinigten antigenen Polypeptide können eingesetzt werden, um Antikörper herzustellen, die selbst in einem Verfahren eingesetzt werden können, mit dem das Vorliegen von R. henselae-Antigen, das in einem Individuum vorliegt, nachgewiesen werden kann und mit dem deshalb bestimmt werden kann, ob ein Individuum gegenwärtig mit R. henselae infiziert ist oder früher damit infiziert war.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Diagnostizieren der Katzenkratzkrankheit und ein Verfahren zum Diagnostizieren der bazillären Angiomatose bei einem Individuum, indem das Vorliegen von Rochalimaea henselae oder einer immunogen spezifischen Determinante davon in einer aus dem Individuum erhaltenen Probe nachgewiesen wird. Außerdem werden durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren der Katzenkratzkrankheit und ein Verfahren zum Diagnostizieren der bazillären Angiomatose in einem Individuum bereitgestellt, indem das Vorliegen von Antikörpern, welche an antigene Determinanten von R. henselae binden, in einer aus dem Individuum erhaltenen Probe nachgewiesen wird.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin isolierte Nucleinsäuren bereit, die immunogene Polypeptide von R. henselae codieren.
Außerdem werden Vektoren bereitgestellt, welche die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfassen. Wenn man die Vektoren dann im Expressionssystem eines Wirts einsetzt, können Reagenzien mit antigenen Polypeptiden für diagnostische und prophylaktische Anwendungen hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Rochalimaea quintana-Infektion in einem Individuum, indem das Vorliegen einer Nucleinsäure, die für Rochalimaea quintana spezifisch ist, in einer Probe nachgewiesen wird, die vorher von dem Individuum erhalten wurde.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Anzahl von gemeinsam wandernden DNA-Fragmenten und den geschätzten Prozentsatz einer Sequenzdivergenz unter Organismen, die mit R. henselae verwandt sind. Die Ziffern in Klammern (entlang der Diagonale) geben die Gesamtzahl von Fragmenten an, die bei der Analyse jeder Art verwendet wurden. Brüche im oberen rechten Sektor geben die Zahl von gemeinsam wandernden DNA-Fragmenten für jedes Paar von Arten, geteilt durch die Zahl von Fragmenten, die bei beiden Arten vorliegen, an. Die Ziffern im unteren linken Sektor entsprechen dem bestimmten Prozentsatz von Sequenzdivergenzen.
2 zeigt die Verteilung von R. henselae-spezifischen Antikörpertitern bei Personen, bei denen ein Katzenkratzkrankheits-Syndrom diagnostiziert wurde.
3 zeigt die Verteilung von R. henselae-spezifischen Antikörpertitern bei gesunden Personen.
4 zeigt das Ausrichten (Alignment") von Nucleotidsequenzen für die drei Regionen des Antigen-Gens, entsprechend den Primern CAT1 und CAT2 und den Oligonucleotid-Sonden RH1 und RQ1. Die Antigen-Gensequenzen wurden für eine maximale Homologie ausgerichtet, indem nur der Teil verwendet wurde, der den Primer- und Sondensequenzen entsprach. Die Sequenzen für R. henselae und entsprechende Ba sensubstitutionen (aus der R. henselae-Sequenz) für andere Arten sind angegeben, und konservierte Positionen sind durch Pünktchen dargestellt. Das Komplement von PCR-Primer CAT2 ist dargestellt [CAT2 (C)].
Genaue Beschreibung der Erfindung
Gereinigtes R. henselae-Antigen
Die Erfindung stellt immunogen spezifische Proteine oder antigene Polypeptidfragmente von R. henselae bereit. Diese immunogen spezifischen Proteine oder Polypeptide sind diejenigen, die spezifisch an Antikörper binden, welche spezifisch an R. henselae binden. Die immunogen spezifischen Proteins oder Polypeptidfragmente von R. quintana sind diejenigen, die spezifisch an Antikörper binden, welche spezifisch an R. quintana binden. Ein spezifisches Binden bedeutet die Abwesenheit einer Kreuzreaktivität mit Antikörpern oder Antigenen von Organismen, die nicht die angegebenen Arten sind. Es ist so gemeint, dass ein Antigen oder Antikörper, der sowohl für R. henselae als auch für R. quintana spezifisch ist, an Antikörper oder Antigene aus diesen beiden Bakterien binden kann, nicht jedoch an Antikörper oder Antigene aus anderen Organismen.
Eine immunogen spezifische Determinante von R. henselae oder R. quintana kann aus dem ganzen Organismus durch chemisches oder mechanisches Aufschließen des Organismus isoliert werden. Z.B. kann ein Kohlenhydratanteil des Organismus durch Standardverfahren erhalten werden, wie Spalten des Organismus mit einer Protease, um Proteinanteile zu entfernen.
Andererseits kann ein Proteinanteil von R. henselae oder R. quintana erhalten werden, indem der ganze Organismus mit einem ionischen Detergens, wie Natriumdodecylsulfat, oder einem nicht-ionischen Detergens, wie Triton X-100 (C₃₄H₆O₁₁, durchschnittlich) oder Ethylphenyl-Polyethylenglykol (NP-40, Shell Oil Company), behandelt wird. Die auf diese Weise erhaltenen Proteinfragmente können wie vorstehend beschrieben auf Immunogenität und Spezifität getestet werden. Andere immunogen spezifische Determinanten des Organismus können durch die vorstehend beschriebenen Standardverfahren erhalten werden.
Immunogen spezifische Determinanten oder antigene Polypeptide der vorliegenden Erfindung können erhalten werden, indem ein Vektor synthetisiert wird, der eine Nucleinsäuresequenz umfasst, welche eine immunogen spezifische Determinante von R. henselae oder R. quintana codiert. Hier werden Beispiele von Nucleinsäuren bereitgestellt, die immunogene Determinanten von und R. henselae codieren, insbesondere in den Beispielen 3 und 4. Danach kann der Vektor in einen Wirt eingebracht werden, in dem die immunogen spezifische Determinante synthetisiert werden kann. Die Auswahl einer Nucleinsäuresequenz, welche eine immunogen spezifische Determinante codiert, kann durch Screening von Clonbanken der DNA des Organismus durchgeführt werden.
Kurz gesagt werden die Bakterien lysiert und die DNA anhand eines Standardverfahrens unter Verwendung von 1 % Natriumdodecylsulfat und Proteinase K extrahiert. Anschließend wird die resultierende DNA mit der Restriktionsendonuclease EcoRI partiell gespalten, Größen-fraktioniert und Gel-gereinigt (Agarose-Gel-Elektrophorese) und danach in den Lambda-Phagenvektor Lambda ZapII anhand von Standardverfahren, wie in Maniatis et al. (20) beschrieben, cloniert. Die rekombinanten Plaques werden auf Antigenproduktion gescreent, und zwar durch einen ELISA, bei dem die primären Antikörper menschliche oder nicht-menschliche (z.B. Katzen-) Seren von Rekonvaleszenten sind, absorbiert mit einem E. coli-Lysat. Andererseits kann das durch die rekombinanten Clone erzeugte Antigen gescreent werden, indem das Antigen exprimiert und das Antigen sodann mit einem Antikörper-enthaltenden Serum inkubiert wird, das von Patienten erhalten wurde, bei denen die Katzenkratzkrankheit diagnostiziert wurde. Anschließend können diejenigen rekombinanten Clone, die R. henselae-spezifisches Antigen exprimieren, durch herkömmliche Verfahren identifiziert werden (14). Danach werden Antigen-exprimierende Clone subcloniert und sequenziert. Sodann können Sonden hergeleitet werden, die für die jeweilige Art spezifisch sind.
Die Subclone, welche artspezifische Antigene exprimieren, werden sequenziert, und aus der hergeleiteten Aminosäuresequenz können entsprechende synthetische Peptide konstruiert werden, die als diagnostische Antigene oder Immunogene eingesetzt werden können. Alternativ könnten rekombinante Antigene, die aus Polypeptidexprimierenden Vektoren in einer geeigneten Wirtszelllinie synthetisiert wurden, durch Affinitätschromatographie, Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, Schnelle-Peptid-Flüssig-Chromatographie („fast peptide liquid chromatography", FPLC), Hochdruck-Flüssig-Chromatographie und dergleichen gereinigt werden.
Z.B. stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nucleinsäure wie im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 11 angegeben bereit, welche ein Polypeptid mit einem offenen Leseraster von 148 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von etwa 17 kDa (17 Kilodalton) codiert. Wie in Beispiel 4 gezeigt wird, bindet dieses gereinigte Polypeptid spezifisch an Antikörper, die im Serum von Patienten vorliegen, bei denen die Katzenkratzkrankheit diagnostiziert wurde. Dieses isolierte Polypeptid stellt somit ein geeignetes Reagens für diagnostische Anwendungen bereit.
Sobald die Aminosäuresequenz des Antigens zur Verfügung steht, ist es auch möglich, unter Verwendung von Standardverfahren der Peptidsynthese Peptidfragmente zu synthetisieren, die zu immunreaktiven Regionen des Antigens homolog sind, und diese Fragmente unter Verwendung herkömmlicher Verfahren auf ihre Antigenität zu testen (14). Diese antigenen Fragmente können auch durch Einführen, Deletion oder Modifikation bestimmter Aminosäurereste in den hergeleiteten Sequenzen modifiziert werden. Somit ist die Synthese oder Reinigung einer extrem großen Zahl von Peptiden möglich, die von den bereitgestellten Antigenen hergeleitet sind.
Genauso können Fragmente der bereitgestellten antigenen Polypeptide für eine Peptidsynthese in vivo in Peptid-Expressionsvektoren cloniert werden. Solche in vivo-synthetisierten Polypeptide können anhand von Verfahren, wie Affinitäts-Chromatographie, einfach gereinigt werden.
Die Aminosäuresequenzen der vorliegenden Polypeptide können einen immunreaktiven Teil des Antigens enthalten, der mit Sequenzen verknüpft ist, die so entworfen sind, dass sie eine gewisse zusätzliche Eigenschaft, z.B. eine Löslichkeit, bereitstellen. Die Aminosäuresequenzen der Polypeptide können auch Sequenzen umfassen, in denen eine oder mehrere Aminosäuren durch eine andere Aminosäure substituiert wurde/n, um eine gewisse zusätzliche Eigenschaft bereitzustellen, etwa um Aminosäuren zu entfernen bzw. anzufügen, die zu einer Disulfidbindung in der Lage sind, um die biologische Haltbarkeit zu steigern, die Enyzmaktivität zu verändern oder Wechselwirkungen mit dem Säuregehalt des Magens zu verändern. In jedem Fall muss das Peptid eine biologisch aktive Eigenschaft, wie Immunreaktivität, Immunogenität usw., besitzen.
Ein nicht-pathogenes R. henselae- oder R. quintana-Antigen kann hergeleitet werden, indem der Organismus unter Verwendung von Standardverfahren modifiziert wird. Z.B. kann das Ganzzell-Antigen einer Gammabestrahlung unterworfen werden, um den Organismus nicht-pathogen zu machen. Andere Standardverfahren zum Inaktivieren von Ganzzell-Antigen umfassen die Behandlung mit β-Propiolacton oder Formalin (14).
Bestimmung von Antigenität und Spezifität
Die Antigenität und Spezifität der immunogenen Fragmente (antigenen Polypeptide) oder modifizierten ganzen Bakterien können durch herkömmliche Verfahren bestimmt werden. Kurz gesagt werden verschiedene Konzentrationen einer mutmaßlichen, inaktivierten (nicht-pathogenen) immunogen spezifischen Determinante hergestellt und an ein Tier verabreicht, und sodann wird die immunologische Antwort (d.h. die Produktion von Antikörpern) eines Tiers auf jede Konzentration bestimmt. Die Mengen eines Antigens oder inaktivierten oder modifizierten lebenden Organismus, die verabreicht werden, hängen vom Individuum, z.B. ein Mensch oder eine Katze, vom Zustand des Individuums, von der Größe des Individuums usw. ab. Danach kann ein auf diese Weise mit dem nicht-pathogenen Antigen geimpftes Tier mit dem pathogenen Organismus in Kontakt gebracht werden, um die mögliche Impfwirkung der immunogen spezifischen Determinante zu testen. Die Spezifität einer mutmaßlichen immunogen spezifischen Determinante kann bestimmt werden, indem Seren oder eine andere Flüssigkeit aus dem geimpften Tier auf Kreuzreaktivität mit anderen Arten getestet werden (14).
Serologische Diagnose
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Diagnostizieren der Katzenkratzkrankheit bei einem Individuum bereit, umfassend das Nachweisen des Vorliegens von Rochalimaea henselae oder einer immunogen spezifischen Determinante davon (nachstehend insgesamt mit „R. hensenlae-Antigen" bezeichnet) in einer von einem Individuum erhaltenen Probe. Das Individuum kann ein Mensch oder ein anderes Tier sein. In der Verwendung hier kann eine „immunogen spezifische Determinante" auf einem intakten R. henselae vorliegen oder ein antigenes Fragment von R. henselae sein.
Anhand der vorliegenden Entdeckung, dass das Vorliegen von R. henselae mit der Katzenkratzkrankheit, bazillären Angiomatose und Milz-Leber-Peliose in Zusammenhang steht, können zahlreiche bekannte Verfahren zum Nachweisen von Bakterien eingesetzt werden, um R. henselae nachzuweisen und eine Krankheit zu diagnostizieren. In einem Beispiel des Verfahrens zum Diagnostizieren der Katzenkratzkrankheit wird der Schritt zum Nachweisen von R. henselae-Antigen durchgeführt, indem eine Flüssigkeits- oder Gewebeprobe von dem Individuum mit einer Menge eines gereinigten Liganden, z.B. von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, welche spezifisch an R. henselae-Antigen binden, in Kontakt gebracht wird und die Reaktion des Liganden mit R. henselae-Antigen nachgewiesen wird. Hier ist es so gemeint, dass der Begriff „Antikörper" einen intakten Antikörper, ein Fragment eines Antikörpers oder ein anderes Reagens (Ligand) einschließt, der/das nicht-zufällig an das Antigen bindet. Die Flüssigkeitsprobe des vorliegenden Verfahrens kann eine beliebige Körperflüssigkeit umfassen, die R. henselae enthalten würde, z.B. Blut, Plasma und Serum. Andere mögliche Beispiele von Körperflüssigkeiten umfassen Urin, Sputum, Schleim und dergleichen.
In einer alternativen Ausführungsform kann das Verfahren zum Diagnostizieren der Katzenkratzkrankheit der vorliegenden Erfindung so sein, dass das Vorliegen von R. henselae bestimmt wird, indem das Vorliegen eines Antikörpers aus dem Individuum nachgewiesen wird, der spezifisch an R. henselae-Antigen bindet. Das Vorliegens eines Antikörpers, der spezifisch an R. henselae bindet, zeigt das Vorliegen einer Infektion durch R. henselae an. Der hier verwendete Begriff „bindet spezifisch" bedeutet, dass ein Antikörper oder ein anderer Ligand nicht wesentlich mit einem beliebigen Antigen kreuzreagiert oder daran bindet, welches nicht das eine angegebene Antigen, in diesem Fall das R. henselae-Antigen, ist.
Wenn das Verfahren zum Diagnostizieren der Katzenkratzkrankheit durchgeführt wird, indem das Vorliegen eines Antikörpers, der spezifisch mit R. henselae-Antigen reaktiv ist (d.h. spezifisch daran bindet), nachgewiesen wird, kann der Schritt zum Nachweisen des Vorliegens eines Antikörpers, der spezifisch mit R. henselae-Antigen reaktiv ist, z.B. die Schritte des Inkontaktbringens einer Flüssigkeits- oder Gewebeprobe von dem Individuum mit einer Menge von R. henselae-Antigen, welches an einen Anti körper bindet, der spezifisch an R. henselae bindet, und des Nachweisens der Bindung des R. henselae-Antigens an den Antikörper umfassen. Man geht davon aus, dass das verwendete Antigen spezifisch an Antikörper gegen R. henselae binden wird, die im Verlauf einer R. henselae-Infektion produziert wurden. Ein Verfahren zum Durchführen einer solchen Diagnose wird in Beispiel 2 erläutert.
Das Nachweisen der Reaktion des Liganden mit R. henselae-Antigen kann durch die Verwendung eines Liganden, der an eine nachweisbare Einheit gebunden ist, erleichtert werden. Eine solche nachweisbare Einheit ermöglicht dann einen visuellen Nachweis eines Niederschlags oder einer Farbänderung, einen visuellen Nachweis durch Mikroskopie oder einen automatischen Nachweis durch Spektrometrie oder radiometrische Messung oder dergleichen. Beispiele von nachweisbaren Einheiten umfassen Fluorescein und Rhodamin (für Fluoreszenzmikroskopie), Meerrettich-Peroxidase (für entweder Lichtmikroskopie oder Elektronenmikroskopie und einen biochemischen Nachweis), Biotin-Streptavidin (für Licht- oder Elektronenmikroskopie) und alkalische Phosphatase (für biochemischen Nachweis durch Farbänderung). Das Nachweisverfahren und die nachweisbare Einheit, die verwendet werden, können aus der vorstehenden Aufzählung oder anderen geeigneten Beispielen durch die Standardkriterien, die für solche Auswahlverfahren angewendet werden, ausgewählt werden (14).
In den diagnostischen Verfahren der vorliegenden Erfindung kann der Schritt zum Nachweisen der Reaktion des Liganden mit R. henselae-Antigen weiterhin in geeigneten Fällen unterstützt werden, indem ein sekundärer Antikörper oder ein anderer Ligand verwendet wird, der entweder spezifisch an ein anderes Epitop oder unspezifisch an den Liganden oder gebundenen Antikörper bindet.
In dem diagnostischen Verfahren, in welchem das Vorliegen eines Antikörpers nachgewiesen wird, der spezifisch an R. henselae-Antigen bindet, kann das R. henselae-Antigen an ein Substrat gebunden und mit einer Flüssigkeitsprobe, wie Blut, Plasma oder Serum, in Kontakt gebracht werden. Diese Probe kann direkt vom Patienten entnommen werden, oder sie kann in einer partiell gereinigten Form vorliegen. Auf diese Weise werden Antikörper, die für R. henselae-Antigen spezifisch sind (der primäre Antikörper), spezifisch an das gebundene R. henselae-Antigen binden. Danach kann ein sekundärer Antikörper, der an eine nachweisbare Einheit gebunden oder damit markiert ist, zugegeben werden, um den Nachweis des primären Antikörpers zu verstärken. Im Allgemeinen wird der sekundäre Antikörper nach seiner Fähigkeit, an mehreren Stellen auf dem primären Antikörper zu binden, ausgewählt. Somit können z.B. mehrere Moleküle des sekundären Antikörpers an jeden primären Antikörper binden, so dass der primäre Antikörper besser nachgewiesen werden kann.
Nachweisverfahren, wie Immunfluoreszenz-Tests (IFA) und heterogene Enzym-Immunassays („enzyme linked immunosorbent assays", ELISA), können einfach so angepasst werden, dass der Nachweis von sowohl R. henselae-Antigen als auch Antikörpern, die spezifisch daran binden, erreicht werden kann. Ein Beispiel eines IFA-Protokolls wird in Beispiel 2 bereitgestellt. Die indirekten immuncytochemischen Verfahren, die in Beispiel 2 beschrieben werden, können allgemein für den Nachweis von Antigenen oder Antikörpern angewendet werden, die für einen Organismus spezifisch sind. Ein ELISA-Verfahren, das für die Diagnose der Katzenkratzkrankheit, welche auf dem Nachweis von menschlichen IgG-Antikörpern beruht, geeignet ist, kann z.B. wie folgt aussehen: (1) Binden des Antigens (R. henselae-Antigens) an ein Substrat; (2) Inkontaktbringen des gebunden Antigens mit einer Serumprobe, welche Antikörper enthält, die mit R. henselae-Antigen reaktiv sind, aus einem Individuum; (3) Inkontaktbringen des Vorstehenden mit einem Anti-Mensch-IgG-Antikörper (sekundären Antikörper), der an eine nachweisbare Einheit gebunden ist (z.B. Meerrettich-Peroxidase-Enzym oder alkalische Phosphatase-Enzym); (4) Inkontaktbringen des Vorstehenden mit dem Substrat für das Enzym; (5) Inkontaktbringen des Vorstehenden mit einem Farbreagens; (6) Feststellen einer Farbänderung beim Vorliegen von IgG-Antikörper, der spezifisch an R. henselae-Antigen bindet. Ein indirekter „enzyme linked immunosorbent assay" (ELISA) für IgG-Antikörper gegen R. henselae sieht kurz gesagt wie folgt aus: Polystyrol-Platten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden werden mit R. henselae- oder negativem Kontrollantigen beschichtet und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag werden zu jeder Vertiefung nacheinander zweifache serielle Verdünnungen von Testseren und fünf negative Kontrollseren, Maus-Anti-Mensch-IgG, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase, und schließlich das Substrat ABTS (2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzothiazolinsulfonat]) zugegeben. Zwischen den Schritten werden die Platten jeweils eine Stunde bei 37°C inkubiert und danach dreimal mit 0,1 % Tween 20 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) gewaschen. Verdünnungen von Seren werden als positiv angesehen, wenn der Unterschied in der Absorption zwischen dieser Serumprobe, wenn sie mit R. henselae-Antigen getestet wird, und dem negativen Kontrollantigen den Mittelwert plus 3 Standardabweichungen der fünf negativen Kontrollseren, die sowohl mit R. henselae- als auch mit negativen Kontrollantigenen getestet wurden, übersteigt.
Eine Modifikation des vorstehenden ELISA, die für die Diagnose der Katzenkratzkrankheit und bazillären Angiomatose, welche auf dem Nachweis von menschlichen IgM-Antikörpern beruht, geeignet ist, kann wie folgt aussehen: (1) Binden eines Anti-Mensch-IgM-Antikörpers, der in der Lage ist, mit einem menschlichen IgM-Antikörper zu reagieren, an ein Substrat (Antikörper-Einfangen); (2) Inkontaktbringen des gebundenen Antikörpers mit einer Serumprobe von einem Individuum; (3) Inkontaktbringen des Vorstehenden mit R. henselae-Antigen; (4) Inkontaktbringen des Vor stehenden mit einem Anti-R. henselae-Antikörper des Kaninchens; (5) Inkontaktbringen des Vorstehenden mit einem Anti-Kaninchen-Antikörper, der an eine nachweisbare Einheit gebunden ist (z.B. Meerrettich-Peroxidase-Enzym); (6) Inkontaktbringen des Vorstehenden mit einem Substrat für das Enzym; (7) Inkontaktbringen des Vorstehenden mit einem Farbreagens; (8) Feststellen einer Farbänderung beim Vorliegen eines IgM-Antikörpers, der spezifisch mit R. henselae-Antigen reaktiv ist. Für den IgM-Einfang-ELISA werden Polystyrol-Platten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden mit Anti-Mensch-IgM-Antikörper der Ziege beschichtet, worauf serielle zweifache Verdünnungen von Seren, einschließlich fünf negativer Kontrollen, R. henselae- oder negativer Kontrollantigene, R. henselae-Hyperimmun-Kaninchen-Antiseren und Ziegen-Anti-Kaninchen, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase, und das Substrat (ABTS) folgen. Zwischen den Schritten werden die Platten jeweils eine Stunde bei 37°C inkubiert und danach dreimal mit 0,1 % Tween 20 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) gewaschen. Verdünnungen von Seren werden als positiv angesehen, wenn der Unterschied in der Absorption zwischen dieser Serumprobe, wenn sie mit R. henselae-Antigen getestet wird, und dem negativen Kontrollantigen den Mittelwert plus 3 Standardabweichungen der fünf negativen Kontrollseren, die sowohl mit R. henselae- als auch mit negativen Kontrollantigenen getestet wurden, übersteigt.
Alternativ können Verfahren, wie Immunblot-Analyse, einfach angepasst werden, um das Vorliegen von R. henselae-Antigen und Antikörpern, die spezifisch daran binden, nachzuweisen. Ein Beispiel einer Immunblot-Analyse wird in Beispiel 4 bereitgestellt. Die in Beispiel 4 beschriebene Immunblot-Analyse eignet sich für den Nachweis von Antigenen oder Antikörpern, die für den ganzen Organismus spezifisch sind, oder von Antigenen oder Antikörpern, die nur für ein Fragment des ganzen Organismus spezifisch sind. Eine Immunblot-Analyse, die für den Nachweis von R. henselae-Antigen oder Antikörpern, die für R. henselae spezifisch sind, wirksam ist, kann z.B. wie folgt aussehen: (1) Züchten rekombinanter Vektoren, die R. henselae-codierende Nucleinsäuren enthalten, in einem Wirt, der für die Expression der rekombinanten Nucleinsäure geeignet ist; (2) Induzieren des Wirts, dass er die rekombinante Nucleinsäure exprimiert; (3) Solubilisieren des Wirts, so dass das durch den Vektor exprimierte Polypeptid freigesetzt wird; (4) Elektrophorese der freigesetzten Polypeptide auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen; (5) Überführen der Proteine auf Nitrocellulose-Membranen; (6) Inkubieren der Nitrocellulose-Membranen mit Serum aus Patienten, die möglicherweise mit R. henselae infiziert sind; und (7) Nachweisen des gebundenen Antigens oder Antikörpers durch Umsetzen der Filter mit Ziegen-Anti-Mensch-IgG, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase.
In einem anderen immunologischen Verfahren, das zum Nachweisen einer R. henselae-Infektion nützlich sein kann, werden monoclonale Antikörper zum Nachweisen von Antikörpern, die spezifisch an R. henselae-Antigen binden, eingesetzt. Kurz gesagt wird Serum von dem Individuum mit R. henselae-Antigen, das an ein Substrat gebunden ist (z.B. eine ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen), inkubiert. Überschüssiges Serum wird gründlich abgewaschen. Anschließend wird ein markierter (Enzym-gekoppelter, floureszierender, radioaktiver usw.) monoclonaler Antikörper mit dem vorher umgesetzten Antigen-Serum-Antikörper-Komplex inkubiert. Das Ausmaß der Hemmung der Bindung des monoclonalen Antikörpers im Vergleich zur Kontrolle (kein Patientenserum-Antikörper) wird gemessen. Der Grad der Hemmung des monoclonalen Antikörpers ist ein sehr spezifischer Test für eine bestimmte Art, da er auf der Bindungsspezifität eines monoclonalen Antikörpers beruht.
Außerdem kann ein Mikro-Agglutinationstest verwendet werden, um das Vorliegen von R. henselae in einem Individuum nachzuweisen. Kurz gesagt werden Latexperlen (oder rote Blutkörperchen) mit R. henselae-Antigen beschichtet und mit Serum von dem Individuum gemischt, so dass Antikörper in dem Gewebe oder in den Körperflüssigkeiten, die spezifisch an R. henselae-Antigen binden, sich mit dem Antigen vernetzen, wodurch es zur Agglutination kommt. Die agglutinierten Antigen-Antikörper-Komplexe bilden einen Niederschlag, der mit bloßem Auge sichtbar ist. In einer Modifikation des vorstehenden Tests können Antikörper, die spezifisch reaktiv an R. henselae-Antigen binden, an die Perlen gebunden werden, und das Antigen im Serum kann dadurch nachgewiesen werden. Auch andere Flüssigkeiten eines Individuums können wirksam eingesetzt werden.
Außerdem wird der Antikörper, wie in einem typischen Sandwich-Test, an ein Substrat gebunden und mit einem R. henselae-Antigen inkubiert. Danach wird ein sekundärer markierter Antikörper an Epitope gebunden, die durch den ersten Antikörper nicht erkannt werden, und der sekundäre Antikörper wird nachgewiesen.
Die spezifischen Reagenzien und Protokolle zur Verwendung in den vorstehend beschriebenen Nachweisverfahren und ähnlichen indirekten immuncytochemischen Verfahren können aus denjenigen, die dem Fachmann verfügbar sind, anhand von Standardkriterien ausgewählt werden (14).
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Diagnostizieren einer klinischen bazillären Angiomatose bei einem Individuum durch Nachweisen des Vorliegens von R. henselae-Antigen in einer von dem Individuum erhaltenen Probe bereit. Der Schritt zum Nachweisen des Vorliegens von R. henselae kann unter Verwendung der gleichen Protokolle durchgeführt werden, die vorstehend für die Diagnose der Katzenkratzkrankheit beschrieben sind.
Da auch R. quintana mit BA assoziiert ist, stellt die vorliegende Erfindung außerdem ein Verfahren zum Diagnostizieren der klinischen bazillären Angiomatose in einem Individuum durch Nachweisen des Vorliegens von R. quintana-Antigen in dem Individu um bereit. Der Schritt zum Nachweisen des Vorliegens von R. quintana kann unter Verwendung der gleichen Protokolle durchgeführt werden, die vorstehend für die Diagnose der Katzenkratzkrankheit beschrieben sind.
Nucleinsäuren und Nucleinsäure-basierte Diagnose
In den diagnostischen Verfahren der vorliegenden Erfindung kann das Vorliegen von R. henselae auch bestimmt werden, indem das Vorliegen einer Nucleinsäuresequenz, die für R. henselae spezifisch ist, nachgewiesen wird. Auf diese Weise kann die CSD diagnostiziert werden, indem in einer Patientenprobe eine Nucleinsäure nachgewiesen wird, die für R. henselae spezifisch ist. Die Nucleinsäure kann nachgewiesen werden, indem das Vorliegen eines Amplifikationsprodukts nach einer Polymerasekettenreaktion (PRC) oder einem anderen Routine-Amplifikationsverfahren unter Verwendung artspezifischer Primer nachgewiesen wird. Andererseits kann die Nucleinsäure durch das Testen unspezifischer Amplifikationsprodukte einer PCR mit einer artspezifischen Sonde nachgewiesen werden, wie in Beispiel 3 erläutert wird. Außerdem kann eine artspezifische Sonde in einem in situ-Hybridisierungsprotokoll eingesetzt werden, um das Vorliegen einer Nucleinsäuresequenz, die für den Organismus spezifisch ist, z.B. in Lymphknoten-Biopsiegewebe von einem Patienten nachzuweisen, von dem man annimmt, dass er an BA oder CSD leidet.
Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren einer gegenwärtigen oder früheren R. quintana-Infektion in einem Individuum durch Nachweisen des Vorliegens einer Nucleinsäuresequenz, die für R. quintana spezifisch ist, durch Routineverfahren wie hier beschrieben bereit. Durch Nachweisen von R. quintana kann die bazilläre Angiomatose diagnostiziert werden, da R. quintana mit BA assoziiert ist (15).
Wie nachstehend anhand von Beispielen noch genauer beschrieben wird, kann eine Nucleinsäuresequenz, die für R. henselae spezifisch ist, Nucleinsäuren umfassen, welche die 16S ribosomale RNA-Untereinheit codieren. Alternativ kann die für R. henselae spezifische Nucleinsäuresequenz Nucleinsäuren umfassen, welche die Citratsynthase codieren. Es ist offensichtlich, dass der Fachmann die hier beschriebenen Verfahren zum Nachweisen des Citratsynthase-Gens und des 16S ribosomalen RNA-Gens einsetzen kann, um andere Nucleinsäuresequenzen nachzuweisen, die für R. henselae spezifisch sind. Beispiele anderer Sequenzen, die für R. henselae spezifisch sind, können die Gene für ein Hitzeschockprotein, andere antigene Proteine und bestimmte metabolische und synthetische Enzyme umfassen. Die Spezifität dieser Sequenzen für R. henselae kann bestimmt werden, indem ein computergesteuerter Vergleich mit bekannten Sequenzen, die in GenBank, einer Computer-Datenbank, katalogisiert sind, unter Verwendung z.B. des Computerprogramms Gap von Genetics Computer Group durchgeführt wird, welches die katalogisierten Sequenzen auf Ähnlichkeiten mit dem fraglichen Gen durchsucht.
Beispiel 3 beschreibt Beispiele von Nucleinsäuren, die für R. henselae und R. quintana spezifisch sind. Z.B. besteht eine für R. henselae spezifische Nucleinsäure aus den Nucleotiden in der Nucleotidsequenz, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 7 definiert ist, die hier lediglich zur Erläuterung angegeben ist. Dieses Gen, htrA, codiert das antigene Hitzeschockprotein von R. henselae. Eine Nucleinsäure, die aus den Nucleotiden in der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 5 definierten Nucleotidsequenz besteht, die hier auch lediglich zur Erläuterung angegeben ist, ist von SEQ ID NO: 7 hergeleitet und ist auch für R. henselae spezifisch (SEQ ID NO: 8).
Eine Nucleinsäure, die für R. quintana spezifisch ist, umfassend die Nucleotide in der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 6 definierten Nucleotidsequenz, ist hier lediglich zur Erläuterung angegeben. Diese Nucleinsäure ist als eine artspezifische Sonde zum Nachweisen einer R. quintana-Infektion wie in Beispiel 3 dargestellt geeignet. Nachdem die partielle Nucleotidsequenz für das R. quintana-htrA-Gen bereitgestellt wurde, kann der Rest der Sequenz einfach unter Verwendung von Standardverfahren erhalten werden, wie sie etwa in Beispiel 1 und an anderer Stelle hier beschrieben werden. Außerdem kann anhand der erfindungsgemäßen Angaben der Sequenz des htrA-Gens für R. henselae für andere Sequenzen in dem entsprechenden R. quintana-htrA-Gen routinemäßig bestimmt werden, ob diese für R. quintana spezifisch sind, indem bloß die vollständige Sequenz erhalten und dann Segmente in den in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren auf Spezifität getestet werden.
In Beispiel 4 wird ein weiteres Beispiel einer für R. henselae spezifischen Nucleinsäure beschrieben, die aus der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 11 angegebenen Nucleotidsequenz besteht. Die Immunanalyse dieses 17-kDa-Polypeptids legt nahe, dass dieses Polypeptid das immundominante Antigen von R. henselae ist und dass es deshalb ein geeignetes Immunreagens darstellt, welches in diagnostischen und prophylaktischen Anwendungen eingesetzt werden kann. Unter Berücksichtigung der Entdeckung der Nucleinsäuresequenz des 17-kDa-Polypeptids wird für einen Fachmann auf dem Fachgebiet klar sein, dass Nucleinsäure-Reagenzien, wie Primer und Sonden, einfach entworfen und dann in einem Nucleinsäure-Nachweissystem verwendet werden können, um das Vorliegen einer Nucleinsäure, welche das 17-kDa-Protein codiert, nachzuweisen.
Mit isolierte Nucleinsäure" ist gemeint, dass die Nucleinsäure mindestens von einigen der anderen Komponenten des natürlich vorkommenden Organismus, z.B. den Zellstruktur-Komponenten, abgetrennt ist. Das Isolieren der Nucleinsäuren kann somit durch Verfahren erreicht werden, wie Zelllyse, gefolgt von einer Phenol- plus Chloroform-Extraktion, gefolgt von einer Ethanol-Fällung der Nucleinsäuren (20). Es ist nicht so gemeint, dass die isolierten Nucleinsäuren unbedingt vollständig rein von Nicht-Nucleinsäure-Komponenten sein müssen, sondern vielmehr dass die isolierten Nuclein säuren bis zu einem Reinigungs-Grad isoliert werden, dass sie in einem klinischen, diagnostischen, experimentellen oder anderen Verfahren, wie Gel-Elektrophorese, Southern- oder Dot-Blot-Hybridisierung oder PCR, eingesetzt werden können. Für den Fachmann wird klar sein, dass es eine Vielzahl von Verfahren gibt, die zum Isolieren der Nucleinsäuren eingesetzt werden können, bevor diese in anderen Verfahren verwendet werden. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf eine Lyse der Zelle, gefolgt von Gelfiltration oder Anionenaustausch-Chromatographie, Binden von DNA an Silica in Form von Glasperlen, Filtern oder Kielselguren in Gegenwart von hohen Konzentrationen von chaotropen Salzen, oder Ethanol-Fällung der Nucleinsäuren.
Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können Positiv- und Negativ-Strang-RNA und außerdem DNA einschließen, wobei es so gemeint ist, dass sie genomische und subgenomische Nucleinsäuren, die in den natürlich vorkommenden Organismen gefunden werden, einschließen sollen. Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung schließen doppelsträngige und einzelsträngige DNA des Genoms, komplementäre Positiv-Strang-cRNA und mRNA und daraus hergestellte komplementäre cDNA sowie eine beliebige Nucleinsäuren, die selektiv oder spezifisch mit den hier bereitgestellten isolierten Nucleinsäuren hybridisieren oder diese codieren kann, ein.
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nucleinsäuren bereit, die selektiv mit Nucleinsäuren, welche die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 11 angegebene Nucleotidsequenz umfassen, hybridisieren können und dafür eingesetzt werden können, das Vorliegen dieser nachzuweisen oder diese zu amplifizieren. Als Stringenzbedingungen können solche verwendet werden, die typischerweise in PCR-Protokollen eingesetzt werden. Insbesondere wird außerdem eine isolierte Nucleinsäure bereitgestellt, die mit der in SEQ ID NO: 11 dargestellten Nucleinsäure unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert (oder diese amplifiziert) und die eine Komplementarität von mindestens 70 % mit dem Segment der Nucleinsäure von SEQ ID NO: 11 aufweist, mit dem sie hybridisiert. Die selektiv hybridisierenden Nucleinsäuren können z.B. als Sonden oder Primer zum Nachweisen des Vorliegens von R. henselae oder eines genetischen Homologs davon verwendet werden, welches die Nucleinsäure aufweist, mit welcher der Primer oder die Sonde hybridisiert. Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen von R. henselae und genetischer Homologe davon in einer Probe und damit zum Nachweisen einer Infektion in einem Individuum bereit, umfassend das Nachweisen des Vorliegens einer selektiv hybridisierenden Nucleinsäure in einer Probe von dem Individuum, wobei das Vorliegen der Nucleinsäure eine Infektion mit R. henselae oder einem genetischen Homolog davon anzeigt.
Wie in Beispiel 3 dargestellt zeigen die htrA-Gensequenzen der vier verwandten Rochalimaea-Arten eine Gesamt-Sequenzidentität von etwa 85 % bis etwa 92 % mit R. quintana, das am ähnlichsten ist.
Außerdem stellt die Erfindung eine Nucleinsäure mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden bereit, die unter Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Bedingungen mit der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 11 dargestellten Nucleinsäure selektiv hybridisiert und die eine Komplementarität von mindestens 80 % damit aufweist. Da die PCR auf dem Fachgebiet verbreitet eingesetzt wird, sind die Bedingungen für eine PCR allgemein bekannt und dem Fachmann geläufig. Diese Bedingungen sind in Bedienungsanleitungen, die den PCR-Apparaturen beigelegt sind, und in standardisierten PCR-Kits, welche durch zahlreiche Lieferanten biochemischer Reagenzien bereitgestellt werden, sowie in vielen Artikeln und Standardtexten angegeben.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung isolierte Nucleinsäure mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden bereit, die eine Komplementarität von 80 % mit der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 11 dargestellten Nucleinsäure aufweist und damit spezifisch hybridisiert unter Hybridisierungs-Stringenzbedingungen von 60°C und 5X SSC (1X SSC = 8,765 g Natriumchlorid und 4,410 g Natriumcitrat in einem Volumen von 1 Liter H₂O, pH 7,0), gefolgt von den anfänglichen Stringenz-Waschbedingungen bei Raumtemperatur, 2X SSC und 0,1 % SDS (Natriumdodecylsulfat) und zwei Waschgängen am Ende unter den Stringenzbedingungen von 50°C, 0,5 % SSC und 0,1 % SDS.
Somit stellt die vorliegende Erfindung ein gereinigtes Homolog der Polypeptide, welche aus den im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 11 dargestellten Polypeptiden bestehen, bereit. Ein solches Homolog kann aus anderen Bakterienarten erhalten werden, deren Genom ein Homolog der gereinigten Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert. Z.B. wird in Beispiel 4 ein Immunscreening-Test bereitgestellt, in welchem ein Homolog des 17-kDa-Proteins von SEQ ID NO: 11 nachgewiesen werden kann. Verfahren, die zum Isolieren einer Nucleinsäure eingesetzt werden, welche ein bakterielles oder anderes Homolog zu SEQ ID NO: 11 codieren, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Screening des Genoms einer Art, von der angenommen wird, dass sie ein Homolog codiert, durch Nucleinsäure-Hybridisierungsverfahren oder durch Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Verfahren. Materialien, die für das Screening geeignet sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf cDNA- oder genomische Banken der geeigneten Art, cloniert in Lambda-, Cosmid-, Hefe-, Säuger- oder Plasmid-Clonierungsvektoren, DNA, isoliert und einer Southern-Blot-Analyse unterworfen, RNA, isoliert und einer Northern-Blot-Analyse unterworfen, und isolierte DNA oder RNA, eingesetzt als Matrize für die PCR.
Die Begriffe „selektiv hybridisieren" und „spezifisch hybridisieren", die hier auch zum Beschreiben von Nucleinsäuren verwendet werden, schließen gelegentlich zufällig hybridisierende Nucleinsäuren und Nucleinsäuren aus, welche Hitzeschockproteine von anderen Gattungen codieren. Die hybridisierenden Nucleinsäuren können z.B. als Son den oder Primer zum Nachweisen des Vorliegens eines Gens, weiches ein Protein der Erfindung codiert, und zum Nachweisen dessen Position eingesetzt werden. Die hybridisierende Nucleinsäure kann ein Polypeptid codieren und kann somit in einen geeigneten Vektor und Wirt eingebracht werden, um das Antigen, ein funktionell ähnliches Antigen oder ein antigenes Polypeptidfragment zu produzieren.
Die selektiv hybridisierenden Nucleinsäuren der Erfindung können eine Komplementarität von mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % und 99 % mit dem Segment oder Strang der Sequenz, mit der sie hybridisieren, aufweisen. Die Nucleinsäuren können eine Länge von mindestens 15 bis zu 4000 Nucleotiden aufweisen. Somit kann die Nucleinsäure eine alternative codierende Sequenz für das Antigen sein, oder sie kann als eine Sonde oder Primer zum Nachweisen des Vorliegens der das Antigen codierenden Nucleinsäure verwendet werden. Bei der Verwendung als Primer stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, die mindestens zwei Nucleinsäure einschließen, welche mit verschiedenen Regionen einer Nucleinsäure selektiv hybridisieren, so dass eine gewünschte Region amplifiziert wird. Für den Zweck, das Vorliegen des artspezifischen Antigen-codierenden Gens nachzuweisen, sollte der Grad an Komplementarität zwischen der hybridisierenden Nucleinsäure (Sonde oder Primer) und der Sequenz, mit der sie hybridisiert (DNA aus einer Probe), mindestens groß genug sein, und die Sequenz sollte lange genug sein, um eine zufällige Hybridisierung mit einer Nucleinsäure einer anderen Art oder eines nicht-verwandten Proteins auszuschließen. 4 erläutert den Zusammenhang zwischen Komplementarität und Sondenlänge.
Die selektiv hybridisierende Nucleinsäure kann auch für die Gattung, Rochalimaea, oder eine Untergruppe von Arten in der Gattung selektiv sein. Z.B. amplifizieren die Primer CAT1 und CAT2 selektiv ein Produkt aus sowohl R. quintana als auch R. henselae, das sodann mit einer artspezifischen Nucleinsäure anhand von Sonden getestet werden kann. Die Erfindung stellt Beispiele eines Spektrums von selektiv hybridisierenden Nucleinsäuren bereit, so dass der Grad der Komplementarität, der erforderlich ist, um selektiv hybridisierende von nicht-selektiv hybridisierenden Nucleinsäuren unter stringenten Bedingungen zu unterscheiden, für jede Nucleinsäure eindeutig bestimmt werden kann.
„Bedingungen hoher Stringenz" bezieht sich auf die Waschbedingungen, die in einem Hybridisierungsprotokoll eingesetzt werden. Im Allgemeinen sollten die Waschbedingungen eine Kombination von Temperatur und Salzkonzentration sein, die so gewählt werden, dass die Denaturierungstemperatur etwa 5 bis 20°C unter dem berechneten T_M-Wert des untersuchten Hybrids liegt. Die Temperatur- und Salzbedingungen werden einfach in vorausgehenden Experimenten rechnerisch bestimmt, in denen Proben einer Referenz-DNA, immobilisiert an Filter, mit der Sonde oder der Proteincodierenden Nucleinsäure von Interesse hybridisiert werden und danach unter Bedin gungen unterschiedlicher Stringenzen gewaschen werden. Z.B. sind in Beispiel 3 Bedingungen hoher Stringenz für die vorliegenden selektiv hybridisierenden Nucleinsäuren angegeben. Die spezifischen Stringenzbedingungen werden einfach getestet, und die veränderten Parameter sind für den Fachmann einfach ersichtlich. Z.B. können die im Reaktionspuffer verwendeten MgCl₂-Konzentrationen so verändert werden, dass die Spezifität erhöht wird, mit welcher der Primer an die Matrize bindet, wobei der Konzentrationsbereich dieser in Hybridisierungsreaktionen verwendeten Verbindung jedoch eng ist und deshalb der richtige Stringenzspiegel einfach bestimmt werden kann. Z.B. können Hybridisierungen mit Oligonucleotid-Sonden mit einer Länge von 18 Nucleotiden bei 5 bis 10°C unter dem bestimmten T_M-Wert in 6X SSPE durchgeführt und danach bei der gleichen Temperatur in 2X SSPE gewaschen werden (29). Der T_M-Wert eines solchen Oligonucleotids kann bestimmt werden, indem für jedes A- oder T-Nucleotid 2°C und für G oder C 4°C zugelassen werden. Eine aus 18 Nucleotiden bestehende Sonde mit 50 % G + C würde somit einen ungefähren T_M-Wert von 54°C haben. Genauso wäre die Ausgangs-Salzkonzentration eines/einer aus 18 Nucleotiden bestehenden Primers oder Sonde etwa 100 bis 200 mM. Somit wären stringente Bedingungen für einen/eine solchen/solche aus 18 Nucleotiden bestehenden/bestehende Primer oder Sonde ein T_M-Wert von etwa 54°C und eine Ausgangs-Salzkonzentration von etwa 150 mM, und könnte demgemäß durch vorausgehende Experimente modifiziert werden. T_M-Werte können auch für eine Vielzahl von Bedingungen berechnet werden, indem eine kommerziell verfügbare Computersoftware genutzt wird (z.B. OLIGO^TM).
Die Nucleinsäuren der Erfindung können eine Homologie von mindestens 80 mit den codierenden Nucleotiden von SEQ ID NO: 11, die nicht der Degeneration des genetischen Codes unterliegen, d.h. mit den Nicht-„Wobble"-Nucleotiden (wobei die „Wobble"-Nucleotide üblicherweise das dritte Nucleotid in einem Codon sind) in der codierenden Sequenz aufweisen. Vorzugsweise werden die Nucleinsäuren eine Homologie von 90 %, oder stärker bevorzugt von 95 %, oder noch stärker bevorzugt von 99 mit den codierenden Nucleotiden von SEQ ID NO: 11, die nicht der Degeneration des genetischen Codes unterliegen, aufweisen.
Außerdem sind Modifikationen der Nucleinsäuren der Erfindung gemeint, so lange die essentielle Struktur und Funktion des durch die Nucleinsäuren codierten Polypeptids erhalten bleibt. Genauso können Fragmente, die als Primer oder Sonden verwendet werden, Substitutionen aufweisen, so lange genügend komplementäre Basen für eine selektive Amplifikation vorliegen.
Der Fachmann kann einfach die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung erhalten, indem er Routineverfahren zum Synthetisieren eines vollständigen Gens oder auch kürzerer Nucleotidfragmente einsetzt. Z.B. werden in der Anmeldung Verfahren zum Herstellen von Nucleinsäuren spezifisch dargestellt, etwa von solchen, die im Se quenzprotokoll angegeben sind. Weiterhin sind zusätzliche Verfahren nach dem Stand der Technik verfügbar, die ohne signifikante Modifikation eingesetzt werden können. Ferretti et al. (38) und Wosnick et al. (39) zeigen Routineverfahren zum Synthetisieren eines Gens mit einer bekannten Sequenz. Insbesondere beschreiben Ferretti et al. die Synthese eines aus 1057 Basenpaaren bestehenden synthetischen Rinder-Rhodopsin-Gens aus synthetischen Oligonucleotiden. Das synthetisierte Gen entsprach originalgetreu der bekannten Sequenz (erster Satz, Seite 603), dies zeigt die Zuverlässigkeit dieses Verfahrens der Gensynthese. Außerdem beschreiben Wosnick et al. die Synthese eines Mais-Glutathion-Transferase- (GST-) Gens unter Verwendung eines effizienten einstufigen Annealing/Ligations-Protokolls. Auch durch dieses Verfahren wurde ein vollständiges synthetisches Gen mit einer Wiedergabetreue von 100 % hergestellt, dies macht die routinemäßige Natur dieses Protokolls deutlich.
Wie hier beschrieben können die Nucleinsäuren exprimiert werden, um antigene Polypeptide der Erfindung bereitzustellen.
Diagnose-Kits
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen Kit für die Diagnose der Katzenkratzkrankheit bereit. Ein solcher Kit kann ein ELISA-Kit sein und kann das Substrat, Antigen, primäre und sekundäre Antikörper, sofern angebracht, und beliebige andere erforderliche Reagenzien, wie nachweisbare Einheiten, Enzymsubstrate und Farbreagenzien wie vorstehend beschrieben umfassen. Der Diagnose-Kit der vorliegenden Erfindung kann alternativ so konstruiert sein, dass er Nucleinsäuresequenzen, die für R. henselae-Antigen spezifisch sind, nachweist, wobei er die Standard-Kit-Komponenten umfasst, wie das Substrat und die Reagenzien, wie sie in Beispiel 1 für den Nachweis von Nucleinsäuresequenzen angegeben sind. Der Diagnose-Kit kann alternativ ein IFA-Kit sein, der allgemein die Komponenten und Reagenzien umfasst, die im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben sind. Da eine R. henselae-Infektion diagnostiziert werden kann, indem Nucleinsäuren, die für R. henselae spezifisch sind, in Gewebe und Körperflüssigkeiten, wie Blut und Serum, nachgewiesen werden, wird es für den Fachmann offensichtlich sein, dass ein Kit konstruiert werden kann, der die hier beschriebenen Verfahren des Nucleinsäurenachweises nutzt. Es ist so zu verstehen, dass die Diagnose-Kits weiterhin einen positiven und negativen Kontrolltest umfassen.
Die bestimmten Reagenzien und andere Komponenten, die in den Diagnose-Kits der vorliegenden Erfindung enthalten sind, können aus denjenigen ausgewählt werden, die für den Fachmann gemäß dem spezifischen, in dem Kit durchgeführten Diagnoseverfahren verfügbar sind. Solche Kits können eingesetzt werden, um R. henselae-Antigen und Antikörper, die spezifisch daran binden, in Gewebe und Körperflüssigkeiten von einem Individuum und in Kulturen von Mikroorganismen, die aus dem Gewebe oder den Flüssigkeiten eines Individuums erhalten wurden, nachzuweisen.
Die Kits der vorliegenden Erfindung können auch in einem Verfahren zum Diagnostizieren der bazillären Angiomatose eingesetzt werden.
Impfstoffe
Außerdem wird durch die vorliegende Erfindung ein Impfstoff bereitgestellt, der eine immunogene Menge eines nicht-pathogenen Rochalimaea henselae oder einer immunogen spezifischen Determinante davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Alternativ kann der Impfstoff ein antigenes Polypeptid, das spezifisch an Antikörper bindet, die spezifisch sowohl an R. henselae als auch R. quintana binden, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.
Das nicht-pathogene R. henselae-Antigen der vorliegenden Erfindung kann zum Konstruieren eines Impfstoffs eingesetzt werden, der eine immunogene Menge von R. henselae-Antigen und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Dieses R. henselae-Antigen kann abgetötete, modifizierte lebende oder immunogene Fragmente (antigene Polypeptide) von R. henselae darstellen. Alternativ können Gemische aus intaktem R. henselae und immunogenen Fragmenten verwendet werden. Danach kann der Impfstoff in einem Verfahren zum Verhindern der Katzenkratzkrankheit bei einem Individuum eingesetzt werden, indem der Impfstoff an das Individuum verabreicht wird. Der Impfstoff kann auch in einem Verfahren zum Verhindern der bazillären Angiomatose bei einem Individuum verwendet werden, indem der Impfstoff an das Individuum verabreicht wird. Weiterhin bedeutet die Tatsache, dass noch andere Krankheitssyndrome mit einer R. henselae-Infektion assoziiert sind, dass auch solche Krankheiten durch die Verwendung der Impfstoffe der vorliegenden Erfindung verhindert werden können. Die Verfahren zum Verhindern funktionieren dann, wenn das Individuum ein Mensch ist, oder genauso auch dann, wenn das Individuum ein Tier, das kein Mensch ist, z.B. eine Katze ist.
Außerdem kann der Impfstoff das antigene Protein umfassen, das durch die Nucleinsäure von SEQ ID NO: 11 codiert ist. Beispiel 4 macht deutlich, dass das 17-kDa-Protein, das durch die isolierte Nucleinsäure von SEQ ID NO: 11 codiert ist, das hauptsächliche immundominante Antigen von R. henselae darstellt und dieses Protein somit einen Kandidaten für die Entwicklung eines erfolgreichen Impfstoffs zum Schutz vor einer R. henselae-Infektion bereitstellt.
Der Impfstoff kann auch ein antigenes Polypeptidfragment enthalten, das durch eine Nucleinsäure codiert ist, die selektiv mit den Nucleinsäuren von SEQ ID NO: 11 unter Bedingungen mit hoher Stringenz hybridisiert und für R. henselae spezifisch ist. Da die Sequenzen der R. henselae- und der R. quintana-htrA-Gene gemeinsame Regionen mit einer hohen Sequenzähnlichkeit haben, kann ein durch diese Regionen codiertes Polypeptid für beide Arten spezifisch sein und kann in dem Impfstoff gegen sowohl CSD als auch BA eingesetzt werden.
Der pharmazeutisch verträgliche Träger in dem Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann Kochsalzlösung oder andere geeignete Träger (1) umfassen. Außerdem kann ein Adjuvans ein Teil des Trägers des Impfstoffs sein, in diesem Fall kann die Auswahl durch Standardkriterien aufgrund des bestimmten verwendeten R. henselae-Antigens, der Verabreichungsart und des Individuums erfolgen (2). Die Verabreichungsverfahren können über orale oder sublinguale Routen oder durch Injektion erfolgen, abhängig von dem bestimmten verwendeten Impfstoff und dem Individuum, an den er verabreicht wird.
Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, dass der Impfstoff als prophylaktisches oder therapeutisches Mittel eingesetzt werden kann. Somit können Individuen mit der Krankheit unter Verwendung des Impfstoffs behandelt werden. Weiterhin kann die Verbreitung der Krankheit unter Tieren und Menschen durch eine solche Impfung verhindert werden. Z.B. kann eine Katze oder ein Hund immunisiert werden, wodurch ein Großteil des Expositionsrisikos für Menschen verhindert wird.
Immunogene Mengen von R. henselae-Antigen können unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt werden. Kurz gesagt werden verschiedene Konzentrationen einer mutmaßlichen, inaktivierten (nicht-pathogenen) immunogen spezifischen Determinante hergestellt, an ein Tier verabreicht und die immunologische Antwort (d.h. die Produktion von Antikörpern) eines Tiers auf jede Konzentration bestimmt.
Somit stellt die Erfindung Verfahren zum Verhindern oder Behandeln einer R. henselae-Infektion und der damit zusammenhängenden Krankheit bereit, indem der Impfstoff an ein Individuum verabreicht wird.
Andere Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen ein gereinigtes R. henselae, gebunden an einen Liganden, z.B. einen Antikörper. Der Begriff „gereinigt" wird hier verwendet, um Antigene, Antikörper und andere Liganden zu beschreiben, die im Wesentlichen frei sind von anderen Komponenten von Serum, Blut oder anderen Körperflüssigkeiten oder anderen Proteinen, die in vivo mit R. henselae assoziiert sind.
Außerdem sind ein gereinigtes R. henselae-Antigen, das an ein Substrat gebunden ist, und ein Ligand, der spezifisch an R. henselae-Antigen bindet, gemeint. Ein solcher gereinigter Ligand, der spezifisch an R. henselae-Antigen bindet, kann ein Antikörper sein. Der Antikörper kann ein monoclonaler Antikörper sein, der durch Standardverfahren erhalten wird. Der monoclonale Antikörper kann durch eine Hybridomzelllinie ausgeschieden werden, die spezifisch für diesen Zweck erzeugt wurde (14). Genauso liegen polyclonale Antikörper, die an R. henselae-Antigen binden, im Umfang der vorliegenden Erfindung. Der polyclonale Antikörper kann auch durch die herkömmlichen Immunisierungs- und Reinigungsverfahren (14) erhalten werden.
Der Antikörper kann an ein Substrat gebunden oder mit einer nachweisbaren Einheit markiert werden, oder er kann sowohl gebunden als auch markiert werden. Die im Zusammenhang mit der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gemeinten nachweisbaren Einheiten sind diejenigen, die vorstehend in der Beschreibung der Diagnoseverfahren angegeben sind, umfassend fluoreszierende, enzymatische und radioaktive Marker.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Anmeldung umfassen weiterhin einen Antikörper, der mit einem einmaligen Teil eines Antikörpers reaktiv ist, welcher spezifisch an R. henselae-Antigen bindet (primärer Antikörper). Der Antikörper, der an den primären Antikörper bindet, ist als ein sekundärer Antikörper bekannt und kann weiterhin eine nachweisbare Einheit umfassen. Wie vorstehend beschrieben erleichtert die Bindung des sekundären Antikörpers an den primären Antikörper, welcher spezifisch an R. henselae-Antigen bindet, den Nachweis der Bindung des primären Antikörpers an das R. henselae-Antigen.
Außerdem wird eine isolierte immunogen spezifische Determinante oder Fragment von R. henselae bereitgestellt. Die Art und Weise, wie solche Determinanten erhalten werden, entspricht der vorstehenden Beschreibung zum Konstruieren von Impfstoffen.
Die folgenden Beispiele sollen lediglich der Erläuterung der Erfindung dienen. Bezüglich der Ausführungsformen ist es so zu verstehen, dass die Beispiele in keiner Weise die vorliegende Erfindung einschränken sollen. Zwar können sie für diejenigen Verfahren typisch sein, die verwendet werden können, jedoch können alternativ auch andere Verfahren eingesetzt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Beispiel 1
Identifizierung von R. henselae
Ein früher symptomloser HIV-Antikörper-positiver 40 jähriger Mann wurde mit einer zweimonatigen Krankengeschichte von täglichem Fieber, extremer Müdigkeit, Appetitlosigkeit und einem Gewichtsverlust von 10 kg aufgenommen. Fünf Wochen nach der Aufnahme wurde festgestellt, dass die am ersten und achten Tag der Hospitalisierung genommenen Blutkulturen für einen Rochalimaea-ähnlichen Organismus positiv waren. Mit der vermutlichen Diagnose von Fünftagefieber („Trench fever") wurde bei dem Patienten mit einer 21-tägigen Doxycyclin-Behandlung begonnen (100 mg, zweimal am Tag); nach 48 Stunden war er fieberfrei. Blut-, Urin-, Knochenmark- und Bronchoalveolar-Lavageflüssigkeits-Kulturen blieben für Mykobakterien und Pilze negativ. Sechs Wochen nach Beendigung der Therapie traten Fieber, Appetitlosigkeit und Unwohlsein wieder auf. Die zu diesem Zeitpunkt genommenen Blutkulturen waren wieder für einen Rochalimaea-ähnlichen Organismus positiv, und erneut wurde eine Behandlung mit Doxycyclin für einen Monat (gleiche Dosis wie vorstehend) begonnen, worauf eine unmittelbare und positive Reaktion erfolgte. Nach einem zweiten Rückfall mit Fieber wurde der Patient schließlich zwei Monate mit Doxycyclin behandelt (gleiche Dosis wie vorstehend). Wiederholte Blutkulturen, die in den folgenden sechs Wochen genommen wurden, waren negativ, und es traten keine mit seiner ursprünglichen Infektion zusammenhängenden Symptome mehr auf. Der isolierte Organismus wird nachstehend als „Houston-1-Isolat" bezeichnet, der als das Prototyp-Isolat von R. henselae angesehen wird. Der Organismus ist bei der American Type Culture Collection (ATCC, Beltsville, MD) unter der Ninterlegungsnummer 49882 hinterlegt.
A. Kulturen von Typen
Zwei Rochalimaea-Isolate, die zwei unterschiedliche anerkannte Arten repräsentierten, wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Beltsville, MD) erhalten. Rochalimaea quintana (ATCC VR-358) und R. vinsonii (ATCC VR-152) wurden routinemäßig bei 35°C in einer 5 % CO₂-Atmosphäre auf tryptischem Sojaagar, angereichert mit 5 % defibriniertem Schafsblut, gezüchtet. Rickettsia prowazekii, Isolat Breinl (ATCC VR-142), wurde in Vero-Zellkulturen gezüchtet und zytoplasmatische Extrakte, die Rickettsiae enthielten, wurden durch Regnery et al. (25) hergestellt.
B. Wachstumseigenschaften
1. Isolieren und Kultivieren des Organismus aus dem Blut des Patienten (Houston-1-Isolat)
Das Blut des Patienten wurde entweder direkt in ein „Wampole Isostat"-Röhrchen (Wampole Laboratories, Cranberry, N.J.) oder einfach in ein „Vacutainer"-Röhrchen, enthaltend EDTA (Becton Dickinson, Rutherford, N.J.), entnommen; Isolate wurden unter Verwendung beider Ausgangspräparate hergestellt. Der Organismus wurde aus gefrorenem (–85°C), EDTA-behandeltem Blut ohne signifikanten Verlust des Titers erneut isoliert. Primäre Isolierverfahren erfolgten auf kommerziellem Hirn-Herz-Agar („Brain Heart Infusion Agar", BHIA), enthaltend 5 % Schafsblut (BBL, Becton Dickinson, Cockeysville, Md.), tryptischem Sojaagar (TSA), angereichert mit 5 % Schaftblut (BBL), und Herz-Agar („Heart Infusion Agar", HIA), enthaltend 5 % Kaninchenblut (BBL). Die Kulturen wurden in einem angefeuchteten Inkubator, enthaltend 5 % CO₂, bei 35°C gehalten. Bakteriologische Platten wurden routinemäßig untersucht. Wie an anderer Stelle angegeben, wurde das Houston-1-Isolat aus Blut zu verschiedenen Zeitpunkten während des Verlaufs der Krankheitsepisoden des Patienten gezüchtet, einschließlich nach dem Wiederauftreten von Fieber nach dem Beenden der antibiotischen Therapie. Der entscheidende Punkt, um isolierte Kulturen von R. henselae zu erhalten, besteht darin, die Kultur lange genug wachsen zu lassen, so dass dieser langsam wachsende Organismus nachweisbare Kolonien bilden kann.
Wenn das Blut von dem fiebernden Patienten entweder auf kommerziellem BHIA-Schafsblut, TSA-Schafsblut oder HIA-Kaninchenblut gezüchtet wurde, ergab es charakteristische Kolonien, die nach neun bis zehn Tagen Inkubation sichtbar waren. Der ungefähre Titer von koloniebildenden Organismen im Blut des Patienten betrug 30 pro ml nach dem Wiederauftreten des Fiebers anschließend an das zweite Behandlungsschema mit dem Antibiotikum. Primäre Kolonien waren tief eingefaltet (Blumenkohl-ähnlich), fest, haftend und in der Oberfläche des Agars zäh festhaltend eingebettet. Alle ursprünglichen einzelnen Kolonien, die aus dem Blut des Patienten isoliert wurden, hatten ähnliche morphologische Merkmale und Wachstumseigenschaften. Die genaue Untersuchung von subkultivierten Platten zeigte sechs Tagen nach dem Beimpfen die Bildung winziger Kolonien, wobei zu diesem Zeitpunkt noch keine deutliche Kolonienmorphologie zu sehen war. Nach mehreren Passagen von frischen Kolonien nahm die Inkubationszeit, bis die Kolonien sichtbar wurden, wesentlich ab, wobei nach drei bis vier Tagen einzelne Kolonien festgestellt werden konnten. Die eingefaltete Morphologie der Kolonien war nach mehreren, relativ schnellen Passagen immer weniger stark ausgeprägt. Das Koloniewachstum war nicht auf die Inkubationszeit beschränkt, vielmehr wuchsen die Kolonien wuchsen in einem Zeitraum von mehreren Wochen immer größer.
Mehrere dieser letzteren anfänglichen Wachstumseigenschaften des Houston-1-Isolats standen im Gegensatz zu denjenigen, die für die ATCC-Stämme vom Typ Rochalimaea festgestellt wurden, die typischerweise relativ schnell, ohne Verzögerung beim Passagieren wuchsen, die glänzende glatte Kulturen hatten und die nicht ähnlich im Agar eingebettet waren. Und auch obwohl die von ATCC erhaltenen Isolate von Rochalimaea-Arten sich schnell auf der Oberfläche von gezüchteten Zellen vermehrten, führte das Material des anfänglichen Houston-1-Isolats zu keiner ähnlichen generalisierten Infektion, wenn es auf Monolayer Vero-Zellen geimpft wurde, dies legt somit nahe, dass eine Co-Kultivierung mit eukaryotischen Zellen nicht das Verfahren der Wahl für eine primäre Isolierung ist. Das Houston-1-Isolat wurde nach zusätzlichen Laborpassagen auf Feststoffmedium (wobei dies vielleicht eher den ATCC-Typ-Stämmen hinsichtlich der erfolgten extensiveren Passagen entsprach) nicht erneut auf die Fähigkeit getestet, auf eukaryotischen Monolayern schnell zu wachsen.
Nach einer erneuten Impfung des Organismus auf entweder Schokoladenagar oder TSA-Schafsblut erfolgte kein Wachstum in Luft bei 22°C oder 42°C, jedoch ein gutes Wachstum bei 30°C und 35°C. Kolonien wuchsen auf eine etwas größere Größe, wenn sie in CO₂ (8 %) bei 35°C inkubiert wurden, als wenn sie ohne Zusatz von CO₂ bei 35°C gezüchtet wurden. Außerdem wurde ein Wachstum einer Subkultur auf HIA-Kaninchenblut oder TSA-Schafsblut erhalten, wenn die Platten in Kerzengefäßen („candle jars") inkubiert wurden, wie früher von Slater et al. (30) für andere Rochalimaea-Isolate beschrieben wurde. Auf Sabouraud-Dextrose-Medium wurde kein Wachstum festgestellt. Die Wachstumseigenschaften des frisch isolierten Houston-1- Isolats stand im Gegensatz zu denjenigen von Arten vom gut-etablierten Rochalimaea-Typ. Beim Passagieren begannen die Koloniemorphologie und die Wachstumsgeschwindigkeit des neuen Agens denjenigen anderer Arten vom Rochalimaea-Typ immer ähnlicher zu werden. Obwohl R. henselae ein anspruchsvoller und langsam wachsender Organismus zu sein scheint, kann er durch herkömmliche Laborverfahren gezüchtet werden. Ein relativ schnelles Wachstum (vier Tage zwischen den Subkulturen) des Houston-1-Isolats wurde durch mehrere Passagen von frischen Kolonien, kurz nachdem sie erstmals sichtbar wurden, erreicht. Es kann sein, dass halbautomatische klinische Verfahren zum Isolieren von Bakterien, die häufig auf Flüssigmedien-basierten Tests beruhen, in Abwesenheit von exogenem gasförmigem CO₂ zum Züchten/Nachweisen von primären Rochalimaea-Isolaten möglicherweise nicht geeignet sind. Außerdem werden solche Kulturen im Allgemeinen nicht für einen so langen Inkubationszeitraum gehalten, der ausreichend wäre, um das Wachstum eines primären Isolats nachzuweisen.
Bei einleitenden Versuchen, das Houston-1-Isolat in stationären Flüssigkeitsmedien zu kultivieren, konnten keine trüben Suspensionen von einzelnen Organismen hergestellt werden; jedoch schien das von einer Blutagarplatte stammende Impfmaterial als Foci für das Wachstum einer begrenzten Zahl von großen kohäsiven Aggregaten zu wirken. Eine erneute Impfung von auf Agar gezüchteten Organismen in Bactek 660 6A- oder 7A-Flaschen (Becton Dickinson, Cockeysville, Md.) führte im Vergleich zu nicht-infizierten Kontrollen zu keinem ausreichenden Wachstum, um den Wachstumsindex zu ändern.
2. Weitere Rochalimaea-Isolate
Vier Rochalimaea-ähnliche Isolate, die früher den „Centers for Disease Control and Prevention" (CDC) für eine mikrobielle Identifizierung vorgelegt worden waren, wurden mit dem Houston-1-Isolat und anerkannten Rochalimaea-Arten verglichen. Zwei dieser Isolate wurden aus Patienten in Oklahoma gewonnen, ein Isolat stammte aus einem Patienten, der sich seine Krankheit offensichtlich in Arkansas zugezogen hatte, und ein viertes Isolat stammte aus San Diego County, Kalifornien. Dieses letzte Isolat stellt zurzeit eines der ersten Rochalimaea-Isolate, von denen wir Kenntnis haben, dar, das in den letzten Jahren gemacht wurde, und außerdem ist es eines der ersten, von einem HIV-infizierten Individuum beschriebenen Isolate (November, 1986).
C. Klinische biochemische Analyse
Biochemische Tests wurden anhand von Standardverfahren (16) und unter Verwendung des RapID ANA II Systems, welches auf das Vorliegen von vorher gebildeten Enzymen testet (Innovative Diagnostic Systems, Inc., Atlanta, Ga.), durchgeführt. Tests auf Motilität umfassten die Beobachtung von Wachstumseigenschaften in Motilitätsagar und die direkte Beobachtung von Bakterien („bacilli") anhand der Dunkelfeldmikrosko pie. Das Vorliegen von Katalase wurde getestet, indem eine Kolonie in Wasserstoffperoxid emulgiert und dann festgestellt wurde, ob sich unter einem Deckgläschen mikroskopisch kleine Bläschen bildeten. Das Vorliegen von Oxidase wurde durch die Verwendung von Tetramethyl-p-phenylendiamin getestet.
Mit Ausnahme für die Produktion von Peptidasen war das Houston-1-Isolat biochemisch inert, wenn es durch typische klinische Verfahren getestet wurde. Das RapID ANA II System, das ursprünglich für die klinische Identifizierung von anaeroben Organismen durch Nachweisen spezifischer, vorher gebildeter Enzyme entworfen worden war, eignet sich auch zum Identifizieren von schwierig zu identifizierenden aeroben Organismen. Wenn das RapID ANA II System für die Analyse des Houston-1-Isolats eingesetzt wurde, wies es eine begrenzte Zahl von Enzym-Substrat-Spaltreaktionen nach, welche die Spaltung von Leucylglycin, Glycin, Prolin, Phenylalanin, Arginin und Serin einschlossen, dies führte zu einer Identifizierungsnummer 000671. Zurzeit ist mit dieser Identifizierungsnummer kein bekannter Mikroorganismus assoziiert, jedoch sind Mitglieder der Gattung Rochalimaea bisher noch in der kommerziellen diagnostischen Datenbank enthalten (Rapid ID ANA II Code Compendium, Innovative Diagnostic Systems, Atlanta, Georgia, 1989). Negative klinische Tests schlossen diejenigen ein, bei denen auf Katalase, Urease, Aesculin-Hydrolyse, Motilität, Nitratreduktion und Oxidase getestet wurde.
D. Färbung und morphologische Eigenschaften
Vier Tage alte Kulturen des Houston-1-Isolats wurden für die Mikroskopie zubereitet, indem eine Blutagarplatte, welche die Kolonien enthielt, mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) überspült wurde und danach die anhaftenden Kolonien mit einer Impföse vorsichtig von der Agaroberfläche abgelöst wurden. Ein kleines Aliquot dieses Materials wurde direkt auf einen sauberen mikroskopischen Objektträger gebracht, hitzefixiert und mit Gimenez-Farbstoff angefärbt. Anderes Material wurde mit Glutaraldehyd fixiert und für die Elektronenmikroskopie zubereitet. Kurz gesagt wurde das Glutaraldehyd-fixierte Material auf einem Nucleopore-Filter (0,2 μm Porengröße, Nucleopore Corp., Pleasanton, Calif.) filtriert und dreimal mit Sorenson-Puffer (pH 5,0) gewaschen. Das filtrierte Material wurde in 1 % Osmiumtetroxid zwei Stunden behandelt und erneut dreimal mit Sorenson-Puffer gewaschen. Die Proben wurden in einer Reihe stufenweise zunehmender Konzentrationen von Ethanol (30 % bis 100 %) dehydratisiert. Die dehydratisierten Proben wurden in Hexamethyldisilizan (Polysciences, Inc., Warrington, Pa.) für zwei Stunden eingetaucht und danach über Nacht in einem Trockner getrocknet. Schließlich wurden die Proben auf einen mit Gold „Sputter"-beschichteten Träger aufgebracht und mit einem Scanning-Elektronenmikroskop von Philips (Modell 515) untersucht.
Schnell proliferierende Organismen aus vier Tage alten Kulturen, die nach mehreren Subpassagen erhalten wurden, wurden mit dem histologischen Gimenez-Farbstoff prompt angefärbt. Die auf diese Weise gefärbten Organismen erschienen als kleine rote Bakterien („bacilli"), die häufig leicht gebogen waren. Organismen, die von älteren, jedoch noch ganz gut lebensfähigen Kolonien erhalten wurden, nahmen keinen Gimenez-Farbstoff auf. Das Material, das erfolgreich für die Lichtmikroskopie eingesetzt wurde, wurde auch für ein Scanning-Elektronenmikroskop zubereitet und damit untersucht. Wie bei dem Gimenez-gefärbten Material und bei den Beobachtungen von Wachstumseigenschaften, die während verschiedener Züchtungsexperimente festgestellt wurden, schienen die mit dem Scanning-Elektronenmikroskop betrachteten Organismen kohäsive Aggregate zu bilden, wobei relativ wenige Organismen frei vorlagen. Die durchschnittliche Größe der sichtbar gemachten Organismen lag etwa bei einer Länge von 2 μm und einer Breite von 0,5 bis 0,6 μm. Alle Organismen, die in einzelnen mikroskopischen Präparaten, welche vermutlich die Produkte mehrerer Generationen einschließen, festgestellt wurden, schienen in der Größe relativ einheitlich zu sein.
E. Fettsäureanalyse
Die Fettsäureanalyse ganzer Zellen wurde an Kulturen von R. henselae, sp. nov. (Houston-1), durchgeführt, die bei 35°C in Luft inkubiert und nach vier Tagen Wachstum auf Schokoladenagar geerntet wurden. Fettsäuremethylester wurden auf einem Hewlett Packard Series II 5890 Gaschromatographen chromatographiert (Miller, L., T. Berger, „Bacterial identification by gas chromatography of whole cell fatty acids", Hewlett-Packard Gebrauchsanweisung („application note") 228-41, Hewlett-Packard, Avondale, Pa., 1985) und anhand eines computerunterstützten Vergleichs von Retentionszeiten der Probe mit denjenigen eines Standardgemisches identifiziert (Microbial-ID, Newark, Del.).
Die hauptsächlichen Fettsäuren, die nach einer Fettsäureanalyse ganzer Zellen des Houston-1-Isolats festgestellt wurden, waren Octadecensäure (C_18:1, 54 bis 56 %), Octadecansäure (C_18:0, 18 bis 20 %) und Hexadecansäure (C_16:0, 17 %). Das Fehlen anderer nachweisbarer Fettsäuren schloss eine Identifizierung beinahe aller anderer Bakterien aus, mit Ausnahme von Mitgliedern der Gattung Brucella. Dieses Fettsäuremuster ist demjenigen ähnlich, das bei R. quintana und anderen kürzlichen Rochalimaea-ähnlichen Isolaten festgestellt wurde (30).
F. 16S-rRNA-Gensequenzanalyse
1. DNA-Extraktion. Amplifikation und Clonierung
DNA für die Polymerasekettenreaktion- (PCR-) Amplifikation wurde aus reinen Kulturen von R. quintana, R. vinsonii und R. henselae (Houston-1-Isolat) extrahiert, indem eine Natriumdodecylsulfat- (SDS-)/Proteinase-K-Lyse verwendet wurde, worauf eine Phenol/Chloroform-Extraktion folgte, wie früher beschrieben (29). Die resultierende wässrige Phase wurde unter Verwendung eines Centricon 30-Konzentrators (Amicon Corp., Danvers, Mass.) eingeengt und dreimal mit 2 ml TES (10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA; 10 mM NaCl) gewaschen.
Die PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung eines Thermozyklers und von GeneAmp-Reagenzien (Perkin Elmer-Cetus, Norwalk, Conn.) durchgeführt. Zwei Paare von „universellen" degenerierten Primern, von denen bekannt war, dass sie bei allen bisher untersuchten Eubakterien etwa 92 % des 16S-ribosomalen RNA-Gens als zwei getrennte PCR-Produkte amplifizieren, wurden als Primer für die PCR-Synthese von Produkten eingesetzt, die anschließend für die Clonierung und Sequenzanalyse verwendet wurden. Das 5'-Ende jedes Primers war so modifiziert, dass es einmalige Restriktionsendonucleasestellen enthielt, wodurch die Clonierung erleichtert wurde. Jede Probe wurde drei Zyklen lang amplifiziert bei: 94°C, 1 Minute; 48°C, 2 Minuten; 66°C 1 Minute 30 Sekunden, gefolgt von 27 Zyklen bei: 88°C, 1 Minute; 52°C 2 Minuten; 68°C, 1 Minute 30 Sekunden.
Die resultierenden PCR-Produkte wurden aus einem 1,0 % Agarose-Gel isoliert und in pUC19 cloniert (29). Die Clone wurden unter Verwendung der Doppelstrang-Sequenzierung mit T7-DNA-Polymerase (SEQUENASE, U.S. Biochemicals, Cleveland, Ohio) sequenziert. Jedes Isolat wurde mindestens zweimal amplifiziert, cloniert und sequenziert, um zu verhindern, dass PCR-Einbaufehler abgelesen wurden; wenn Diskrepanzen nachgewiesen wurden, wurde eine dritte unabhängige Sequenz hergestellt. Sehr sorgfältig wurde darauf geachtet, dass bei Verwendung der universellen Primer wegen ihres breiten Amplifikationsspektrums keine kontaminierende bakterielle DNA in die PCR-Reaktionen eingeführt wurde. Die GenBank Hinterlegungsnummern für die jeweiligen 16S-rRNA-Gensequenzen sind wie folgt: R. quintana, M73228; R. vinsonii, M73230; R. henselae (beantragt als R. americana), M73229.
Universelle Primer machten eine Amplifikation von etwa 1400 Nucleotiden der rRNA-Gensequenz als zwei getrennte PCR-Produkte möglich. Produkte mit 767 Basenpaaren (bp), entsprechend der 5'-Hälfte des 16S-rRNA-Gens, hergestellt unter Verwendung der Primer EC11 und EC12 (modifizierte Versionen der Primer POmod und PC3mod, die von Wilson et al. verwendet wurden (26)) wurden festgestellt, wenn das Houston-1-Isolat, R. quintana und R. vinsonii amplifiziert wurden. Kein Produkt wurde festgestellt, wenn diese Primer verwendet wurden, um eine negative Kontrolle, die keine DNA-Matrize enthielt, zu amplifizieren. Genauso wurde ein 737-bp-Produkt, das der 3'-Hälfte des 16S-rRNA-Gens entsprach, hergestellt mit den Primern EC9 und EC10 (modifiziert Versionen der Primer P3mod und PCS, die von Wilson et al. verwendet wurden (40)), festgestellt, wenn das Houston-1-Isolat, R. quintana und R. vinsonii verwendet wurden. Kein PCR-Produkt war in der Kontrolle ohne DNA zu sehen. Diese PCR-Produkte wurden cloniert und sequenziert.
2. DNA-Sequenzierung
Die 16S-rRNA-Gensequenzen, die zum Vergleichen und für das Ausrichten („Alignment") verwendet wurden, wurde erhalten, indem für jedes clonierte PCR-Produkt eine übereinstimmende Sequenz („Consensus") aus drei unabhängigen Sequenzen genommen wurde. Die für das Houston-1-Isolat erhaltenen ersten und zweiten Sequenzen wiesen drei nicht übereinstimmende Nucleotide auf, und die ersten und zweiten Sequenzen für R. vinsonii hatten zwei Mehrdeutigkeiten. In beiden Fällen stimmte eine dritte Sequenz an diesen mehrdeutigen Positionen mit einer der zwei vorherigen Sequenzen überein und wurde als die übereinstimmende Sequenz („Consensus") genommen. Man nahm an, dass die gelegentliche fehlende Übereinstimmung zwischen Sequenzen das Ergebnis von Polymerase-Nucleotid-Einbaufehlern war. Die gesamte Sequenz wurde für ein Alignment eingesetzt, wobei das Gap-Programm der Genetics Computer Group verwendet wurde. Die Sequenz des Houston-1-Isolats wurde mit 16S-rRNA-Gensequenzen auf der Datei der GenBank verglichen und zeigte die größte Homologie mit R. quintana (98,7 %) und geringere Homologien mit 16S-rRNA-Gensequenzen aus Organismen, die nicht so nah verwandt waren (Tabelle 1).
In unserem Labor sequenzierten wir das 16S-rRNA-Gen aus R. quintana (Fuller-Stamm) und fanden, dass es sich etwas von der Sequenz unterschied, die früher von Weisberg et al. (35) beschrieben worden war und die von GenBank erhalten wurde. Anhand unserer Daten fanden wir, dass 16S-rRNA-Gensequenz aus dem Houston-1-Isolat zu 98,7 % mit R. quintana verwandt war, und dass sie zu 99,3 % mit R. vinsonii verwandt war. Für die R. quintana- und R. vinsonii-Sequenzen wurde gefunden, dass sie zu 98,9 % verwandt waren. Der Unterschied von 0,7 % in der 16S-rRNA-Gensequenz, der zwischen dem Houston-1-Isolat und R. vinsonii zu sehen war, ist größer als der Unterschied von 0,5 %, der für Rickettsia prowazekii und Rickettsia typhi beschrieben wurde. Diese zwei Arten von Rickettsia sind deutlich unterschiedliche Arten in der Ordnung Rickettsiales, zu der Rochalimaea gehört.
Es wurde gefunden, dass die partielle 16S-rRNA-Gensequenz, die von Relman et al. (28) (GenBank Hinterlegungsnummer #M59459) für das mutmaßliche ätiologische Agens von BA bestimmt wurde, mit dem entsprechenden Teil der 16S-rRNA-Gensequenz identisch war, die aus dem Houston-1-Isolat von R. henselae, sp. nov., erhalten wurde (Tabelle 1). Partielle 16S-rRNA-Gensequenzen, die aus einem der Oklahoma-Isolate erhalten wurden, sind mit 16S-rRNA-Gensequenzen identisch, die aus dem Houston-1-Isolat erhalten wurden. Diese vollständig homologen Sequenzen machen deutlich, dass die verursachenden Agenzien ein und dieselbe Art darstellen. Die bei den 16S-rRNA-Gensequenzen zwischen dem Houston-1-Isolat und Arten anderen Typs von Rochalimaea festgestellte Variation (Tabelle 1) zeigt, dass das Houston-1-Isolat eine neue Art innerhalb der Gattung Rochalimaea darstellt.
Außerdem liegt die R. henselae-16S-rRNA-Gensequenz in CSD-Hauttest-Antigenen vor, die viele Jahre für die Diagnose dieser Krankheit verwendet wurden.
Somit ist die Nucleinsäure, welche die 16S-rRNA-Untereinheit codiert, für R. henselae spezifisch und kann mit den 16S-rRNA-DNA-Sequenzen von anderen Organismen verglichen oder zum Testen von Proben eingesetzt werden, um das Vorliegen von R. henselae nachzuweisen. Tabelle 1: Nähe der Verwandtschaft zwischen dem 16S-rRNA-Gen des Houston-1-Isolats und verschiedener Eubakterien

^a Die gesamte 16S-rRNA-Gensequenz (wenn verfügbar) wurde für das Alignment verwendet. Die Sequenzen von R. henselae, Houston-1-Isolat, R. vinsonii und R. quintana wurden in unserem Labor bestimmt, alle anderen Sequenzen wurden von GenBank erhalten.
^b Partielle 16S-rRNA-Gensequenz von Relman et al. (28).

G. PCR/RFLP-Analyse des Citrat-Synthase-Gens
Die Restriktionsendonuclease-Längenpolymorphismus- (RFLP-) Analyse wurde an PCR-amplifizierter DNA durchgeführt, die mit nicht-degenerierten Oligonucleotiden geprimt wurde, für die früher gezeigt worden war, dass sie die Synthese von PCR-Produkten mit einer Länge von etwa 381 Nucleotiden aus einem Teil des Citrat-Synthase-Gens von Rickettsia initiieren (25). Chromosomale DNA aus Rickettsia prowazekii wurde als positive Kontrolle für die PCR-Synthese und Spaltung verwendet; außerdem wurden in den PCR-Amplifikationen immer Kontrollen laufen gelassen, die keine DNA-Matrize enthielten.
1. DNA-Spaltung und Elektrophorese
Die RFLP-Analyse spezifischer Gene, die durch die PCR-Technik amplifiziert wurden, eignet sich zum Identifizieren von Genotypen und Arten von Rickettsia. Oligo nucleotide, für die früher gezeigt wurde, dass sie für das Primen einer PCR-Amplifikation eines Teils der Citrat-Synthase-Gene aus fast allen Rickettsia-Arten und außerdem aus R. quintana geeignet sind, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, eine DNA-Amplifikation einer DNA zu primen, die aus dem Houston-1-Isolat und aus R. vinsonii gereinigt wurde. PCR-Produkte wurden einfach unter Verwendung von Bedingungen hergestellt, die mit den früher beschriebenen Bedingungen vergleichbar waren. Kurz gesagt wurde die PCR-Amplifikation in 100-μl-Volumina unter Verwendung der Protokolle durchgeführt, die mit dem GeneAmp DNA-Amplifikations-Reagens-Kit geliefert wurden (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut). Typischerweise wurde 1 μl einer unverdünnten zytoplasmatischen Extrakt-DNA als PCR-Matrize eingesetzt. Die DNA-Amplifikation wurde in einem Perkin-Elmer Cetus DNA-Thermozykler durchgeführt, wobei 35 Zyklen mit Denaturierung (20 Sekunden bei 95°C), Annealing (30 Sekunden bei 48°C) und Verlängerung (2 Minuten bei 60°C) verwendet wurden.
Die PCR-Amplifikation der DNA wurde durch eine schnelle Agarose-Elektrophorese einer kleinen Menge des PCR-Produkts nachgewiesen. Die Restriktions- und Endonucleasespaltung erfolgte mit 20 μl des PCR-Reaktionsgemisches, wobei Standardverfahren (29) verfolgt und Inkubationen bei 37°C durchgeführt wurden. Alle Restriktionsendonucleasen wurden von New England BioLabs, Beverly, Massachusetts, erhalten. Nach der Zugabe von Farbstoff-Ficoll-Auftragegemisch („dye-Ficoll loading mixture") (29) wurden die gespaltenen Reaktionsgemische auf 1,5 mm dicke senkrechte 8 % Polyacrylamid-Gele (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.), die durch Standardverfahren hergestellt wurden (29), aufgetragen. Die Gele wurden vier Stunden bei 80 Volt in einfachen senkrechten Elektrophoresekammern (Bethesda Research Laboratories, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland) laufen gelassen. Danach wurden die Gele mit Ethidiumbromid gefärbt, und anschließend wurden sie mit einer UV-Lichtquelle (365 nm; Spectronic Corp., Westbury, New York) angestrahlt und mit einem Polaroid-Film Typ 655 P/N (Polaroid Corp., Cambridge, Massachusetts) fotografiert.
Gespaltene DNA-Fragmente wurden getrennt und analysiert, wobei herkömmliche Elektrophorese-Protokolle und Verfahren, die früher von Regnery et al. (25) beschrieben wurden, verwendet wurden. Die Anzahl von gemeinsam laufenden DNA-Fragmenten wurde bestimmt, die bei homologen PCR/RFLP-Spaltprodukten von zwei oder mehreren Isolaten festgestellt wurden. Die Ergebnisse der Anzahl von gemeinsam laufenden DNA-Fragmenten wurden verwendet, um die Abschätzung der Sequenz-Verwandtschaft nach den Verfahren herzuleiten, die von Upholt beschrieben wurden (32) und die anschließend von anderen eingesetzt wurden, um die Sequenz-Divergenz zwischen verwandten Bakterien zu bestimmen.
Alle drei nicht-gespaltenen Citrat-Synthase-PCR-Produkte von Rochalimaea waren etwas größer (etwa 400 bp) als diejenigen, die für Mitglieder der Gattung Rickettsia hergestellt wurden (etwa 381 bp). Eine Variation wurde zwischen den Größen von PCR-amplifizierten Citrat-Synthase-Produkten festgestellt, die von verschiedenen Rochalimaea-Isolaten erhalten wurden. PCR-amplifizierte Produkte wurden mit sieben Restriktionsendonucleasen gespalten und einer Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterworfen. Offensichtliche Unterschiede waren in vielen der Spaltproduktmuster PCR-ampliflzierter Citrat-Synthase-Sequenzen aus den verschiedenen Isolaten zu sehen; die PCR/RFLP-Analyse machte eine rasche Differenzierung anderer Isolat-Genotypen möglich.
Die Anzahl von DNA-Fragmenten, die durch Spaltung der PCR-amplifizierten Citrat-Synthase-spezifischen DNA mit sieben Restriktionsendonucleasen hergestellt wurden, ist in 1 zusammen mit der Anzahl von gemeinsam laufenden Fragmenten angegeben. Die Werte der Sequenzdivergenz, hergeleitet durch rechnerische Analyse des prozentualen Anteils von gemeinsam laufenden Fragmenten, zeigen, dass alle untersuchten Isolate eine wesentliche, hieraus gefolgerte Divergenz der Citrat-Synthase-Sequenz aufweisen (6 bis 11 %), welche gleich groß oder größer ist als ähnliche Werte für die Divergenz der Citrat-Synthase-Sequenz unter bekannten Rickettsia-Arten (z.B. 2 bis 6 %).
Die PCR/RFLP-Analyse grenzte den Genotyp von R. henselae, sp. nov., klar von demjenigen von entweder R. quintana oder von R. vinsonii ab. Mehrere Restriktionsendonuclease-Spaltungen der Citrat-Synthase-spezifischen PCR-Produkte aus anderen Rochalimaea-ähnlichen Isolaten aus Oklahoma (zwei Isolate), Arkansas (ein Isolat) und Südkalifornien (ein Isolat) zeigten, dass alle untersuchten Isolate gemäß den hier verwendeten PCR/RFLP-Verfahren miteinander und mit R. henselae (Houston-1-Isolat) identisch sind.
Es ist klar, dass das Krankheitsspektrum dieses Organismus zusätzlich zur Katzenkratzkrankheit und bazillären Angiomatose möglicherweise variabel sein kann und ein Syndrom mit Fieber und Bakteriämie sowie eine bazilläre Peliosis hepatis umfassen kann. Somit können die hier beschriebenen Nucleinsäureverfahren verwendet werden, um das mit diesen Krankheitssyndromen assoziierte Vorliegen von R. henselae nachzuweisen.
Beispiel 2
Serologische Verfahren
Ein Immunfluoreszenz-Test (IFA) wurde entwickelt, um Antikörper nachzuweisen, die spezifisch mit R. henselae-Antigen reaktiv sind, hiermit wurde der Anfang gemacht, die Verteilung und Prävalenz einer Infektion zu untersuchen, und außerdem dazu beigetragen, das ganze Spektrum der durch R. henselae induzierten Krankheit zu definieren. Infektiöse Organismen wurden nicht-pathogen gemacht, indem sie durch Gammabestrahlung inaktiviert wurden.
A. Herstellung einer antigenen Determinante von R. henselae
Wie früher beschrieben neigen R. henselae-Bakterien („bacilli"), die auf Erythrocyten-angereicherten Agarmedien gezüchtet und danach in Lösung gehalten werden, dazu, zu auto-agglutinieren; durch dieses Verklumpen wird verhindert, dass ein gut dispergiertes IFA-Antigen hergestellt werden kann. Die Hemmung der Auto-Agglutination wurde durch ein gemeinsames Kultivieren von R. henselae mit Vera Zellen erreicht, an welche sich einzelne Rochalimaea-Organismen stark anheften. Kurz gesagt werden R. henselae-Zellen in flüssigem Medium zusammen mit Vero-Zellen vier Tage gezüchtet. Nach Dekantieren des Großteils des flüssigen Mediums werden Glasperlen in den Kulturkolben zugegeben und im restlichen Medium vorsichtig bewegt. Durch dieses Bewegen mit den Perlen werden die Vero-Zellen und die daran haftenden R. henselae-Zellen von den Wänden des Kolbens abgelöst. Danach werden die mit den Vero-Zellen komplexierten R. henselae-Zellen durch Gammabestrahlung inaktiviert (nicht-pathogen gemacht). Antigen und Antiseren für IFA-Tests wurden durch Standardverfahren hergestellt.
B. Herstellen von Antiseren (Antikörpern)
Kurz gesagt wird das R. henselae-Antigen, das aus isolierten R. henselae-Kulturen erhalten und in PBS suspendiert wurde, in ein Kaninchen geimpft, um in dem Kaninchen die Produktion von Antikörpern zu induzieren, die spezifisch mit dem Antigen reaktiv sind. Eine Blutprobe wird aus dem Tier entnommen, sodann werden die roten Blutkörperchen entfernt, so dass Antiseren erhalten werden. Anschließend wird das Serum, das R. henselae-Antikörper enthält, einer Fällung mit Ammoniumsulfat unterworfen, wodurch Gammaglobuline (IgG) aus dem Antiserum ausgefällt werden.
C. IFA
Der IFA dieses Beispiels wird kurz gesagt wie folgt durchgeführt: Die vorstehend hergestellte Vero-Zellen-assoziierte antigene Determinante von R. henselae wird in eine Vertiefung eines mikroskopischen Objektträgers mit 12 Vertiefungen getüpfelt, und außerdem wird ein zweiter Tüpfelpunkt von R. quintana (Fuller-Isolat) in die Vertiefung eingebracht. Die Tüpfelpunkte werden luftgetrocknet und danach zehn Minuten mit Aceton fixiert. Serielle Verdünnungen der Antiseren, die getestet werden, (z.B. 1/32, 1/64 usw., Endpunkt der Verdünnung) werden in die gepaarten Vertiefungen mit dem Antigen eingebracht. Danach werden die Objektträger in einer feuchten Kammer 30 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend dreimal mit PBS gewaschen, mit destilliertem Wasser gespült und luftgetrocknet. Sodann wird in jede Vertiefung Fluoresceinmarkiertes Anti-Mensch-IgG der Ziege getüpfelt und die Objektträger wie vorstehend inkubiert, gewaschen, gespült und getrocknet. Gepuffertes Glycerin wird zu den Vertie fungen zugegeben, um die optische Auflösung zu verbessern, und danach werden die Objektträger durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert, wodurch das Vorliegen von Antikörper nachgewiesen wird, der mit R. henselae-Antigen spezifisch reaktiv ist.
In einem alternativen Verfahren kann der vorstehend gereinigte R. henselae-spezifische Antikörper direkt mit einer nachweisbaren Einheit, wie Fluorescein, markiert werden (14).
In allen IFA-Bestimmungen wurden Antiseren aus Menschen mit R. henselae- oder R. quintana-Infektionen, die durch Kultur bestätigt wurden, als positive Kontrollen eingesetzt.
Seren von 40 Patienten, bei denen vermutet wurde, dass sie an der Katzenkratzkrankheit leiden, wurden durch IFA auf Reaktivität mit R. henselae-Antigen getestet. 35 Patienten (87,5 %) hatten Antikörpertiter gegen R. henselae, die einer Serum-Endpunkt-Verdünnung von 1/64 entsprachen oder darüber lagen (2). Zahlreiche Patienten hatten Seren mit Titern, die über 1/1024 lagen. Von einigen Patienten waren Seren verfügbar, die während Akut- und Rekonvaleszenz-Phasen der Erkrankung gewonnen worden waren. Von fünf Sätzen von gepaarten Seren, die unterschiedliche Titer aufwiesen und mindestens eine Probe mit einem Titer, der 1/64 entsprach oder darüber lag, enthielten, zeigten drei vierfache Zunahmen oder Abnahmen des Antikörperliters. Drei weitere gepaarte Sätze von Seren konnten nicht auf eine Änderung im Titer untersucht werden, da beide Seren Antikörper, der mit R. henselae-Antigen spezifisch reaktiv war, in einem Titer von 1/1024 (der höchste getestete Titer) oder darüber aufwiesen. Acht der Seren mit einem Tier von 1/64 oder darüber hatten niedrige Antikörper-Titer gegen R. quintana, die nicht über 1/32 lagen. In jedem dieser Seren lag der Titer des Antikörpers, der mit R. henselae spezifisch reaktiv war, mindestens vierfach über dem Titer gegen R. quintana.
107 Seren, die von Personen gewonnen wurden, die sich selbst als gesunde Individuen bezeichneten, wurden von einem professionellen Lieferanten (Worldwide Biologicals, Cincinnati, OH) erhalten. Wenn diese Seren durch IFA auf Antikörper, der für R. henselae und R. quintana reaktiv war, getestet wurden, hatten 101 (94 %) Titer von weniger als 1/64 (3). Von den sechs Seren, die Antikörpertiter gegen R. henselae-Antigen von 1/64 oder mehr aufwiesen, hatten drei deutlich erhöhte Antikörpertiter (d.h. 1/512 und 1/1024). Unter den Serumspendern wurden keine Antikörpertiter gegen R. quintana, die über 1/16 hinausgingen, nachgewiesen.
Seren von Personen mit einer Vielzahl von Krankheiten wurden auf das Vorliegen von möglichen Antikörpern getestet, die spezifisch mit R. henselae reaktiv waren. Titer von weniger als oder gleich 1/64 wurden in zwei von zehn Personen mit Brucellose nachgewiesen, jedoch korrelierten die zwei niedrigen positiven serologischen Antworten nicht mit steigenden Titern von Antikörper gegen Brucella abortus, die durch Mikroag glutination nachgewiesen wurden. Eines von drei Seren von Patienten mit Lyme-Krankheit hatte einen Titer gegen R. henselae von 1/64. Seren von Patienten mit Tularämie und Seren von Patienten mit Yersinia enterocolitica-Infektionen zeigten keine Antikörpertiter gegen R. henselae, die gleich oder größer waren als 1/64. Eine Reihe anderer Referenzantikörper des Menschen, die als Reagenzien in diagnostischen Kits verwendet wurden, wurden mit dem R. henselae-IFA-Test untersucht. Keines dieser Seren zeigte einen Titer von Antikörper gegen R. henselae von 1/64 oder darüber. Die Referenzen umfassten menschliche Antiseren gegen: Mycoplasma pneumoniae, Treponema pallidum, Coxiella burnetii, Ehrlichia chaffeensis, Chlamydia-Gruppe, Rickettsiae der Fleckfieber-Gruppe, Richettsiae der Typhus-Gruppe, Varicella zoster, Influenza Typ A, Adenovirus, Dengue-Virus Typ 2, Herpes simplex, Coxackievirus Gruppe A, Poliovirus Typ 2, Cytomegalovirus, Rubella, menschliches Immunmangelvirus Typ I („human immunodeficiency virus type I") und außerdem alpha-Fetoprotein und Rheumafaktoren.
Seren, die in hohen Titern menschliche Antikörper, die mit R. henselae reaktiv waren, und Antikörper für R. quintana enthielten, reagierten im IFA-Test nicht mit „A. felis"-Antigen. Hyperimmun-Kaninchen-Antiseren und monoclonale Antikörper, die gegen „A. felis"-Antigen gerichtet waren, waren mit R. henselae-Ganzzellen-Antigen nicht reaktiv.
Ein in hohem Titer vorliegender R. quintana-Antikörper (1/1024 Verdünnungs-Endpunkt), der von einem mit R. quintana (Fuller-Isolat) infizierten menschlichen Freiwilligen erhalten wurde, ergab keine feststellbare Reaktion mit R. henselae-Antigen (<1/16 Verdünnungs-Endpunkt). Genauso wurden minimale (<1/32 Verdünnungs-Endpunkt) R. quintana-Antikörpertiter festgestellt, wenn Serum mit hohem Titer (z.B. >1/1024 Verdünnungs-Endpunkt) von einem Kultur-positiven R. henselae-infizierten Patienten verwendet wurde.
Somit ist zu sehen, dass menschliche serologische Antworten auf R. henselae- und R. quintana- (Fuller-Isolat) Antigene, wie sie im IFA-Test bestimmt werden, artspezifisch sind, und es ist unwahrscheinlich, dass die mit R. henselae-Antigen festgestellten Antikörperreaktionen auf einer antigenen Stimulation durch eine beliebige Art, die nicht R. henselae war, beruhten.
Mit einer niedrigen Prävalenz wurden signifikant erhöhte Spiegel von Antikörper, der spezifisch mit R. henselae reaktiv ist, bei offensichtlich gesunden Serumspendern gefunden, dies zeigt, dass die R. henselae-Infektion möglicherweise relativ verbreitet ist.
Von 40 Patienten, bei denen die Katzenkratzkrankheit klinisch diagnostiziert wurde, hatten 35 (87,5 %) Serum-Antikörpertiter gegen R. henselae-Antigen, die 1/64 entsprachen oder darüber lagen, und mehrere gepaarte Sätze von Seren zeigten vierfache Änderungen im Titer. Dieses Verfahren zum Nachweisen von R. henselae- Antigen oder Antikörpern, die spezifisch damit reaktiv sind, stellt ein geeignetes diagnostisches Werkzeug zum Identifizieren von Patienten mit Katzenkratzkrankheit bereit und reduziert dadurch die Abhängigkeit von der klinischen Diagnose alleine, von der Verwendung pharmazeutisch nicht-anerkannter CSD-Hauttest-Antigenpräparate und davon, dass eine chirurgische Biopsie erforderlich ist.
Das hier beispielhaft dargestellte Verfahren zum Diagnostizieren der Katzenkratzkrankheit kann genauso wirksam für die Diagnose der bazillären Angiomatose eingesetzt werden, da R. henselae ein ätiologisches Agens der beiden Krankheiten ist. Da außerdem die R. henselae-Infektion mit anderen Krankheitssyndromen assoziiert ist, wie einem Syndrom mit Fieber und Bakteriämie und bazillärer Peliosis hepatis, können die vorstehend beschriebenen serologischen, immunzytochemischen, zytologischen und Nucleinsäure-Nachweisverfahren wirksam eingesetzt werden, um diese Krankheiten zu diagnostizieren.
Beispiel 3
Nachweisen von R. henselae und R. quintana durch PCR
A. Bakterienstämme
Alle Bakterienstämme, die zum Testen der Spezifität des PCR- und Hybridisierungstests verwendet wurden, sind in Tabelle 2 aufgelistet. Rochalimaea spp. wurden auf Herz-Agarplatten („Heart Infusion Agar Plates"), angereichert mit 5 % defibriniertem Kaninchenblut (HIA-RB) (BBL, Rockville, Md.), gezüchtet, wobei sie drei bis fünf Tage bei 34°C in Gegenwart von 5 % CO₂ inkubiert wurden. Bartonella bacilliformis wurde auf HIA-RB für sechs bis acht Tage bei 28°C ohne zusätzliches CO₂ gezüchtet. A. felis wurde auf Aktivkohle-Hefeextrakt-Agarplatten (Carr-Scarborough Microbiologicals, Decatur, Ga.) zwei bis drei Tage bei 32°C ohne CO₂ gezüchtet. Tabelle 2: Isolate, deren DNA zum Testen der Spezifität der PCR-Primer und Oligonucleotid-Sonden verwendet wurde

^a Das 414 bp PCR-Produkt wurde nicht festgestellt. Ein größeres Produkt von etwa 1300 bp wurde aus R. elizabethae amplifiziert, das jedoch weder mit der Sonde RH1 noch mit der Sonde RQ1 hybridisierte.
^* Bezeichnet Typstamm für die Art

B. Klinische Proben
25 Proben von Patienten mit klinisch diagnostizierter CSD wurden verwendet, um ein weiteres Beispiel eines PCR-Tests zu untersuchen (Tabelle 3). Alle CSD-Fälle wurden durch einen Arzt klinisch diagnostiziert und wiesen regionale Lymphadenopathie auf und hatten Katzenkontakt, wobei andere offensichtliche Diagnosen fehlten. Bei allen Patienten, deren Proben verwendet wurden, traf diese Definition zu, außer bei Patient #16 (Tabelle 3), der keine Anamnese mit Katzenkontakt hatte. 16 dieser Proben waren frische Lymphknotenbiospieproben, und neun waren Lymphknotenaspirate. Außerdem wurden fünf Lymphknotenaspirate von Nicht-CSD-Patienten, von denen andere Organismen isoliert wurden, als negative Kontrollen aufgenommen. Genauso wurden drei Lymphknotenbiopsien von Nicht-CSD-Patienten als zusätzliche negative Kontrollen verwendet. Die Serologie wurde bei einigen Patienten (wenn Serum verfügbar war) durch den indirekten Fluoreszenz-Antikörpertest, der in Beispiel 2 erläutert ist, durchgeführt.
Geeignete Proben waren frisches eingefrorenes Gewebe sowohl aus Lymphknotenbiopsieproben als auch aus Lymphknotenaspiraten. Tabelle 3: Informationen und PCR/Dot-Blot-Ergebnisse bei CSD-Patienten

^a Die Serologie wurde durch den indirekten Fluoreszenz-Antikörpertest wie früher beschrieben (23) durchgeführt. Ein Anti-Rochalimaea-Titer von 1/64 oder höher wurde als positiv angesehen.
^b Zwei repräsentative negative Kontrollen von Nicht-CSD-Fällen, aus denen andere Bakterien isoliert wurden.

C. DNA-Extraktion
DNA wurde aus Bakterienzellen, Lymphknotengewebe oder Lymphknotenaspiraten extrahiert, wobei Modifikationen eines früher beschriebenen Verfahrens (4) verwendet wurden. Kurz gesagt wurden gezüchtete Bakterien, die von etwa 1/8 einer HIA-RB-Platte mit Standardgröße (85 mm) geerntet wurden, in 300 μl PCR-Verdünnungsmittel (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert. Für Lymphknotengewebe wurden Proben (etwa 100 mg) unter Verwendung eines Einweg-Homogenisators in Minimalmedium (0,5 ml) dispergiert und 50 bis 100 μl dieses Homogenisats mit PCR-Verdünnungsmittel auf 300 μl verdünnt. Lymphknotenaspirate (50 bis 100 μl) wurden mit PCR-Verdünnungsmittel resuspendiert und auf 300 μl verdünnt. Danach wurden die Proben mit Natriumdodecylsulfat (SDS) auf 1,0 % gebracht, Proteinase K wurde auf eine Endkonzentration von 100 ng/μl zugegeben, und sodann wurden die Proben zwei Stunden bei 55°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Lysate drei- bis viermal mit einem 50:50-Gemisch von Puffer-gesättigtem Phenol und Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Der resultierende wässrige Überstand wurde mit PCR-Verdünnungsmittel auf 2,0 ml verdünnt, durch ein Centricon-30-Filter (Amicon, Danver Mass.) filtriert und noch zweimal mit 2,0 ml Aliquots des PCR-Verdünnungsmittels gewaschen. Der anschließende Filterrückstand (durchschnittliches Volumen 40 μl) wurde gesammelt und als Matrize für die PCR verwendet. Für jeden DNA-Extraktionslauf wurde eine Reagens-Blindprobe genauso wie vorstehend beschrieben laufengelassen, um sicherzustellen, dass weder die Extraktionspuffer noch die Reagenzien mit Rochalimaea-DNA verunreinigt waren.
D. Design von PCR-Primern und Hybridisierungssonden
Eine Bank von R. henselae-DNA wurde in dem Vektor Lambda ZapII (5) konstruiert. Die Bank wurde entweder mit einem Pool von acht monoclonalen Antikörpern oder mit Kaninchen-Hyperimmunserum auf Expression von antigenen Proteinen gescreent. Ein Clon, der ein mit dem Anti-R. henselae-Serum des Kaninchens reaktives 60-Kilodalton-Antigen exprimierte, wurde isoliert und das Gen sequenziert (6) (GenBank Hinterlegung („Accession") L20127). Es wurde gezeigt, dass die hergeleitete Aminosäuresequenz eine Sequenzhomologie von 37 % (über die gesamte Sequenz) mit dem für Escherichia coli beschriebenen htrA-Locus (17) hatte. Das Primerpaar CAT1 5'-GATTCAATTGGTTTGAA (G und A) GAGGCT-3' (SEQ ID NOs: 1 und 2) und CAT2 5'-TCACATCACCAGG (A und G) CGTATTC-3' (SEQ ID NOs: 3 und 4) (4), welches ein aus 414 Basenpaaren (bp) bestehendes Fragment aus sowohl R. henselae als auch R. quintana definiert, wurde für die PCR-Amplifikation eingesetzt. Als artspezifische Hybridisierungssonden wurden die aus 20 Basenpaaren bestehenden Oligonucleotidsonden RH1 (SEQ ID NO: 5) und RQ1 (SEQ ID NO: 6) (4) verwendet.
Partielle Nucleotidsequenzen (150 bis 200 Nucleotide) des gleichen Gens aus den drei anderen Arten von Rochalimaea wurden unter Verwendung konservierter PCR-Primer erhalten. Die PCR mit dem Primerpaar htr5 (5'-AATCTAGATTGCTTTCGCTATTCCGGC-3' (SEQ ID NO: 8)) und htr6 (5'-AAGGATCCATTTGTTCGCACTTGTAGAAG-3' (SEQ ID NO: 9)) führte zur Amplifikation eines 650-Basenpaar-Produkts von jeder der vier Rochalimaea-Arten. Für die 150-200-Basenpaar-Sequenzen der anderen drei Arten, die aus diesen Amplifikationsprodukten erhalten wurden, wurde gefunden, dass sie bezüglich der R. henselae-Sequenz zu 85 bis 92 % konserviert sind. Kein Hinweis auf das Vorliegen des htrA-Gens wurde in B. bacilliformis, einem mit Rochalimaea spp. phylogenetisch nah verwandten Organismus, gefunden (21, 27). Diese Beobachtung ist interessant, da B. bacilliformis nicht bei erhöhten Temperaturen wächst, ein Merkmal, das zum Teil auf das Fehlen eines funktionellen htrA-Gen-Produkts zurückzuführen sein könnte.
E. PCR-Tests
DNA, die aus Bakterien, frischem Lymphknotengewebe oder Lymphknotenaspiraten hergestellt worden war, wurde als Matrize für die PCR-Tests verwendet. Für jeden PCR-Test wurden 5-μl-Portionen der Matrizen-DNA (unverdünnt und 1:10 verdünnt), die aus den klinischen Proben extrahiert worden war, eingesetzt. Die ungefähre Konzentration der aus bakteriellen Isolaten extrahierten DNA wurde durch Agarose-Gel-Elektrophorese anhand der Nähe zu bekannten Mengen einer Standard-DNA bestimmt. Verdünnte bakterielle DNA (etwa 1 ng) wurde für die anfängliche Bestimmung der Primer-Spezifität verwendet. Für die anschließende PCR an klinischen Proben wurden 10 pg (in 10 μl) DNA, die entweder aus R. henselae oder aus R. quintana extrahiert worden war, als positive Kontrolle eingesetzt, und die Blindprobe der DNA-Extraktion und Wasser (jeweils 10 μl) wurden als negative Kontrollen verwendet. Für alle PCR-Tests wurde das Reagens-Kit von GeneAmp (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn.) verwendet. Das degenerierte Primerpaar CAT1 und CAT2 wurde zum Primen der Polymerisierungsreaktionen eingesetzt. Das Primergemisch umfasste etwa gleiche Mengen der Primersequenzen von R. quintana (SEQ ID NOs: 2 und 4) und von R. henselae (SEQ ID NOs: 1 und 3). Die Amplifikation wurde erreicht, indem zuerst fünf Minuten bei 94°C vordenaturiert wurde, worauf 35 Zyklen mit 94°C, 30 Sekunden; 50°C, 60 Sekunden; und 70°C, 45 Sekunden in einem Thermozykler, Modell 9600 (Perkin-Elmer), folgten. 10 μl aus jedem PCR-Test wurden einer Elektrophorese durch ein 1,2 % Agarose-Gel unterworfen, mit Ethidiumbromid gefärbt und fotografiert. Das Vorliegen einer 414-bp-Bande wurde als positiv angesehen. Außerdem wurde jede aus den klinischen Proben extrahierte DNA-Probe mit dem Primerpaar GHPCR1 und GHPCR2 (36) amplifiziert. Dieses Primerpaar amplifiziert ein 422-bp-Fragment aus einer konservierten Region des menschlichen Wachstumshormon-Gens und dient als positive Kontrolle für die erfolg reiche Extraktion von amplifizierbarer DNA. DNA-Extrakte aus klinischen Proben, die mit dem Primerpaar GHPCR1 und GHPCR2 nicht amplifiziert wurden, wurden aus der weiteren Studie ausgeschlossen.
F. Spezifität des PCR-Tests
Unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen und mit gereinigter Matrizen-DNA ergaben alle zwölf R. henselae-Isolate und alle vier R. quintana-Isolate das vorausgesagte 414-bp-Fragment amplifizierter DNA (Tabelle 2). Keine Amplifikationsprodukte wurden für R. vinsonii, B. bacilliformis und A. felis festgestellt. R. elizabethae wurde mit diesem Primerpaar amplifiziert, jedoch war das Produkt viel größer (etwa 1300 bp) als die für R. henselae und R. quintana vorausgesagten 414 bp. Somit scheint das 414-bp-PCR-Produkt für R. henselae und R. quintana spezifisch zu sein. Gelegentlich wurde ein PCR-Produkt von etwa 50 bis 60 bp in der Kontrolle ohne DNA festgestellt, dieses entspricht vermutlich einem Primer-Dimer.
Die degenerierten Primer CAT1 und CAT2 scheinen innerhalb der Isolate von R. henselae und R. quintana gut konserviert zu sein.
Bei der Verwendung von Aspiraten wurden größere Erfolge erzielt (9/9, 100 % positiv) als bei der Verwendung von Biopsien (12/16, 75 % positiv), die beruht möglicherweise auf dem gegebenen Unterschied zwischen Knoten, die fluktuierend sind und somit aspiriert werden können, und solchen, bei denen das nicht der Fall ist. Es ist schwierig, die DNA-Menge zu standardisieren, die aus Lymphknoten oder Aspiraten extrahiert wurde. Da wir ein Gesamtlysat-Verfahren einsetzten, wurde sowohl RNA als auch DNA erhalten, und somit würde das Messen der Absorption der Lysate ein schlechter Indikator für die DNA-Konzentration sein. Demgemäß verwendeten wir jede Matrizenprobe für die Amplifikation unverdünnt und in einer 1:10-Verdünnung.
G. Dot-Blot-Hybridisierung
Um die Identität der PCR-Produkte zu bestätigen und die Unterscheidung von Produkten, die aus R. henselae- und aus R. quintana-Matrizen amplifiziert wurden, möglich zu machen, wurde ein Dot-Blot-Hybridisierungstest an den PCR-Produkten, die aus den in Tabelle 2 angegebenen Bakterien amplifiziert wurden, durchgeführt. Für diesen Zweck wurden die Oligonucleotidsonden RH1 und RQ1 verwendet. RH1 und RQ1 wurden nicht-isotopisch markiert, indem ein Digoxigenin-ddUTP-Nucleotid unter Verwendung der terminalen Transferase auf das 3'-Ende jedes Oligonucleotids übertragen wurde, hierfür wurde das Markierungs-Kit Genius 5 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) eingesetzt. Für die Dot-Blot-Hybridisierungstests wurden 5 μl jedes PCR-Produkts durch Zugabe von 0,5 μl 4 M NaOH, enthaltend 100 mM Ethylendiamintetraessigsäure, zehn Minuten denaturiert. Ein-μl-Aliquots wurden auf jede von zwei Nylonmembranen (Boehringer Mannheim) getüpfelt und die DNA sodann durch UV-Bestrahlung mit dem Nylon vernetzt (Stratalinker, Stratagene, La Jolla, Calif.). Danach wurden die Nylonmembranen eine Stunde bei 62°C blockiert, wobei die Standard-Vorhybridisierungslösung aus dem Lumineszenz-Nachweis-Kit Genius 7 (Boehringer Mannheim) verwendet wurde. Die Standard-Hybridisierungslösung war 5X SSC (1X SSC = 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat), enthaltend 0,1 % N-Laurylsarcosin, 0,02 % SDS und 1,0 % Blockierungsreagens (Boehringer Mannheim). Danach wurde die Hybridisierung bei 62°C (T_M –8°C für beide Sonden) eine Stunde in frischer Vorhybridisierungslösung durchgeführt, die entweder Sonde RH1 oder RQ1 in einer Konzentration von 1 pMol/ml enthielt. Anschließend wurde die hybridisierte Membran zweimal für jeweils 15 Minuten in 2X SSC, enthaltend 0,1 % SDS, bei Raumtemperatur gewaschen, worauf zwei Waschgänge von jeweils 15 Minuten bei 52°C in 0,5X SSC mit 0,1 % SDS folgten. Sodann wurde das hybridisierte Filter blockiert, mit einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten Antikörper umgesetzt, gewaschen und dann in das Chemilumineszenz-Substrat Lumigen-PPD gemäß den Anweisungen des Herstellers (Genius 7 Kit, Boehringer Mannheim) eingetaucht. Das resultierende Filter wurde mit einem Röntgenfilm für fünf bis 20 Minuten in Kontakt gebracht und der Film anschließend entwickelt.
H. Spezifität des Dot-Blot-Hybridisierungstests
Die PCR-Produkte, die aus allen zwölf Isolaten von R. henselae amplifiziert wurden, hybridisierten mit der Sonde RH1. Die PCR-Produkte aus allen vier Isolaten von R. quintana hybridisierten nur mit der Sonde RQ1. Weder die Sonde RH1 noch die Sonde RQ1 hybridisierte mit den PCR-Produkten aus R. elizabethae, R. vinsonii, B. bacilliformis oder A. felis. Somit ermöglicht der Dot-Blot-Hybridisierungstest die Unterscheidung zwischen den PCR-Produkten, die von R. henselae und die von R. quintana amplifiziert wurden.
Die Oligonucleotidsonden (RH1 und RQ1) sind artspezifisch und scheinen innerhalb der Art gut konserviert zu sein.
I. PCR- und Dot-Blot-Tests an klinischen Proben
Um die PCR- und Dot-Blot-Tests zum Nachweisen von R. henselae und R. quintana in klinischen Proben zu testen, wurden diese Verfahren an 16 Proben von frischem Lymphknotengewebe und neun Aspiraten aus CSD-Fällen angewendet. 21 der 25 Proben (84 %) erzeugten das 414-bp-Produkt, das für R. henselae oder R. quintana charakteristisch ist (Tabelle 3). Repräsentative PCR-Produkte, die aus Lymphknotenbiopsieproben und Lymphknotenaspiraten von Patienten mit Verdacht auf CSD erhalten wurden, wurden einer Elektrophorese unterworfen. Zwei Proben erzeugten die charakteristische 414-bp-Bande nur dann, wenn die Matrizen-DNA vor der Amplifikation 1:10 verdünnt wurde. Typisch für diese Proben ist #9, deren Amplifikation durch große Mengen von Leukozyten-DNA gehemmt zu werden scheint. Wenn die Probe, welche die Matrizen-DNA enthielt, vor der Amplifikation 1:10 verdünnt wurde, wurde die 414-bp- Bande deutlich produziert. Das charakteristische 414-bp-Fragment wurde aus keiner der acht Lymphknotengewebeproben von Nicht-CSD-Fällen oder aus Blindproben der DNA-Extraktion amplifiziert.
Um die Identität der PCR-Produkte zu bestätigen, die aus den klinischen Proben amplifiziert wurden, und um diejenigen Infektionen, die durch R. henselae verursacht wurden, von den durch R. quintana verursachten zu unterscheiden, wurde eine Dot-Blot-Hybridisierung unter Verwendung der artspezifischen Sonden RH1 und RQ1 durchgeführt. Die PCR-Produkte aus allen 21 Proben, die so amplifiziert wurden, dass das charakteristische 414-bp-Fragment produziert wurde, hybridisierten mit der R. henselae-spezifischen Sonde RH1. Dagegen hybridisierte keine dieser Proben mit der R. quintana-spezifischen Sonde RQ1. Somit scheinen alle der hier untersuchten PCR-positiven Proben von Patienten mit Verdacht auf CSD in elf verschiedenen Staaten (Tabelle 3) mit R. henselae, und nicht mit R. quintana assoziiert zu sein. Keine der Proben, welche das 414-bp-Fragment nicht amplifizierte, hybridisierte mit einer der Sonden.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die CSD, anders als BA und andere opportunistische Infektionen, die in einigen Fällen durch R. henselae und in anderen durch R. quintana verursacht sein können, hauptsächlich (oder vielleicht ausschließlich) durch R. henselae verursacht zu sein scheint.
Die 84 % positiven Proben von Fällen mit Verdacht auf CSD bei dem hier beschriebenen PCR-Test sind im Grunde genommen identisch mit den 84 % und 88 % Positiven, die durch serologische Verfahren bei zwei getrennten Gruppen von Proben von Patienten mit Verdacht auf CSD ermittelt wurden (24, 37). 22 der hier durch PCR getesteten Proben von CSD-Fällen wurden auch durch Serologie getestet (Tabelle 3). 21 hiervon (95 %) hatten einen IFA-Titer von 1:64 oder größer. Somit waren drei Proben, die von seropositiven Individuen gewonnen worden waren, im PCR-Test negativ. Diese offensichtliche Diskrepanz beruht möglicherweise zum Teil auf dem Fehlen von intakten Organismen in den Lymphknoten aus Patienten in den späteren Stadien der CSD. Tatsächlich haben Gerber et al. postuliert, dass die noch verbleibende zellvermittelte Immunantwort und die resultierende ganulomatöse Reaktion, und nicht die bakterielle Invasion, der wichtigste pathogene Mechanismus von CSD sein könnten (13). Andererseits könnten in Lymphknotengewebe Inhibitoren von PCR vorliegen, die verhindern, dass eine optimale Empfindlichkeit des Tests erreicht wird.
Der PCR-Test bietet den Vorteil einer frühen Diagnose, da er nicht davon abhängig ist, dass der Patient eine nachweisbare humorale Immunantwort hervorbringt. Außerdem unterscheidet der PCR-Test R. henselae- von R. quintana-Infektionen. Ein schneller und spezifischer Test für die CSD bietet dem klinischen Arzt zum Bestätigen der Diagnose im Labor eine Alternative zur Kultur oder Serologie, wodurch der Arzt in die Lage versetzt wird, maligne Erkrankungen, wie Lymphom, auszuschließen und eine antibiotische Therapie ins Auge zu fassen. Obwohl die Wirksamkeit von Antibiotika bei der Behandlung der CSD immer noch unsicher ist, wurde über eine erfolgreiche Behandlung mit vier Antibiotika (Rifampin, Ciprofloxacin, Trimethoprim-Sulfamethoxazol und Gentamicinsulfat) berichtet (19), und außerdem ist R. henselae in vitro gegenüber zahlreichen üblichen Antibiotika empfindlich (9).
Beispiel 4
Identifizierung von antigenen Fragmenten von R. henselae
Eine Bank von Rochalimaea henselae-DNA wurde in dem Clonierungsvektor Lambda ZapII konstruiert und auf die Expression von antigenen Proteinen gescreent, indem ein Pool von Seren von Patienten verwendet wurde, bei denen die Katzenkratzkrankheit (CSD) diagnostiziert worden war und die Antikörper gegen Rochalimaea aufwiesen, wie durch den indirekten Fluoreszenzantikörper-Test (IFA-Test) bestimmt wurde. Zehn immunreaktive Phagen wurden als rekombinante Plasmide durch in vivo-Exzision subcloniert. Alle zehn Rekombinanten exprimierten ein Protein von etwa 17 Kilodalton (kDa), wenn sie durch Immunblot-Analyse unter Verwendung des Pools von menschlichen Seren untersucht wurden. Die Restriktionsendonuclease-Spaltung von jedem der zehn rekombinanten Plasmide zeigte sieben unterschiedliche Profile, dies legt nahe, dass der Grund für das wiederholte Isolieren von Clonen, die das 17-kDa-Antigen exprimierten, kein Clonierungsfehler („cloning bias") war. Das Gen, welches das 17-kDa-Antigen codiert, wurde sequenziert, und es wurde gezeigt, dass es ein offenes Leseraster von 148 Aminosäuren und eine vorausgesagte Molekülmasse von 16 893 Daltons codiert. Der Aminoterminus der hergeleiteten Aminosäuresequenz war hydrophober Natur und in Größe und Zusammensetzung ähnlich wie Signalpeptide, die in gramnegativen Bakterien gefunden werden. Der Rest der hergeleiteten Aminosäuresequenz war hydrophiler und repräsentiert möglicherweise Oberflächen-exponierte Epitope. Die weitere Subclonierung des 17-kDa-Antigens als ein biotinyliertes Fusionsprotein in dem Expressionsvektor PinPoint Xa-2 führte zu einem 30-kDa-Protein, das auf Immunblots mit einzelnen Serumproben von Patienten mit CSD hochreaktiv war. Die Übereinstimmung zwischen der Reaktivität mit dem 30-kDa-Fusionsprotein bei der Immunblot-Analyse und den durch den IFA-Test erhaltenen Ergebnissen betrug 92 %, n = 13 für IFA-Positive, und 88 %, n = 9 für IFA-Negative. Das rekombinante exprimierte 17-kDa-Protein sollte als ein Antigen für die serologische Diagnose von CSD und Rochalimaea-Infektionen von Nutzen sein und rechtfertigt weitere Untersuchungen, mit denen versucht wird, eine Untereinheit-Vakzine zu entwickeln, mit welcher eine langfristige Infektion durch Rochalimaea in Katzen und das Potential für die weitere Ausbreitung des Organismus auf Menschen verhindert werden können.
A. Kultivieren von Rochalimaea
Rochalimaea-Stämme wurden auf Herz-Agar („Heart Infusion Agar"), angereichert mit 5 % defibriniertem Kaninchenblut (BBL, Cockeysville, Md.), gezüchtet. Für alle in diesem Beispiel beschriebenen Experimente wurden der Houston-1-Stamm von R. henselae und der Fuller-Stamm von R. quintana verwendet. Die Kulturen wurden bei 34°C in Gegenwart von 5 % CO₂ inkubiert. Nachdem die Bakterienzellen ausreichend gewachsen waren (nach drei bis vier Tagen), wurden sie mit sterilen Applikatoren geerntet und in TE-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) suspendiert. Die Bakterien wurden nach Bedarf durch Zentrifugation eingeengt. Danach wurden die Bakterienzellen eingefroren und für eine anschließende Immunblot-Analyse gelagert, oder die DNA wurde wie nachstehend beschrieben extrahiert.
B. Konstruieren einer R. henselae-DNA-Bank
Die Lambda-Phagen-Bank von R. henselae-DNA wurde unter Verwendung des Lambda-ZAPII-Vektors (Stratagene, Torrey Pines, Calif.) anhand eines neuen Verfahrens hergestellt, das speziell zum Konstruieren von DNA-Banken von A-T-reichen Organismen entwickelt worden war (5). Die gesamte (chromosomale und extrachromosomale) DNA wurde aus dem Houston-1-Stamm von R. henselae isoliert, indem die Bakterienzellen mit 1,0 % SDS in Gegenwart von Proteinase K (100 ng/μl) für 90 Minuten bei 55°C lysiert wurden. Das resultierende Lysat wurde viermal mit einem 50:50-Gemisch aus Phenol und Chloroform extrahiert. Die Nucleinsäuren wurden aus der wässrigen Phase ausgefällt, indem Natriumacetat auf 0,3 M und 2 ½ Volumina von absolutem Ethanol zugegeben wurden. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert und in TE-Puffer mit 10 ng/μl Ribonuclease A resuspendiert. Die extrahierte DNA wurde mit der Restriktionsendonuclease EcoRI unter Bedingungen gespalten, welche die Enzymaktivität fördern (Sternaktivität). Diese Sternaktivität ist weniger spezifisch und somit zufälliger als die Spaltung mit EcoRI unter normalen Bedingungen. Die mit EcoRI-Sternaktivität erzeugten DNA-Fragmente werden effizient in EcoRI-gespaltene Vektoren cloniert (5). Die resultierende DNA wurde nach der Größe auf Fragmente mit einer Länge von 3 bis 8 Kilobasenpaare selektiert, indem eine Elektrophorese durch ein 0,7 Agarose-Gel und eine Reinigung durch Adsorption an Glasmilch (GeneClean, Bio101, Vista, Calif.) durchgeführt wurden. Die gereinigte und größenselektierte DNA wurde an den EcoRI-gespaltenen, mit alkalischer Phosphatase behandelten Lambda-ZapII-Vektor ligiert. Anschließend wurden die rekombinanten Phagen-Konkatamere unter Verwendung des Verpackungsextrakts Gigapack (Stratagene, Torrey Pines, Calif.) in Lambda-Partikel verpackt. Nach dem Verpacken wurde ein Aliquot der Bank titriert und auf den Prozentsatz von Rekombinanten getestet, indem es zusammen mit dem Escherichia coli-Stamm XL1 (Stratagene, Torrey Pines, Calif.) auf NZY-Agarplatten plattiert wurde. Die Bank wurde durch Plattieren der gesamten verpackten Ligierungsreaktion amplifi ziert und durch Übernacht-Diffusion der Rekombinanten in Phagen-Verdünnungspuffer (10 mM Tris, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 0,1 % Gelatine) gewonnen.
C. Immunscreening von rekombinanten Clonen
Zum Screening von rekombinanten Phagen auf Immunreaktivität mit menschlichen Seren wurden Lambda-Phagenclone mit einer Dichte von etwa 30 000 pro 150-mm-Platte von NZY-Agar plattiert. Nach einer drei- bis vierstündigen Inkubation bei 42°C (bis die Plaques gerade sichtbar wurden) wurden auf die Platten Nitrocellulose-Filter gelegt, die mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) imprägniert waren, und die Inkubation wurde weitere drei Stunden bei 37°C fortgesetzt. Danach wurden die Filter zweimal in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,1 % Tween 20 enthielt, pH 8,0, (TBST), gewaschen und mit TBST, enthaltend 5,0 % Magermilchpulver (Difco, Detroit, Mich.), eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Sodann wurden die Filter mit einem Pool von Serumproben (1:300 verdünnt in TBST mit 5 % Magermilch) von Patienten, bei denen CSD klinisch diagnostiziert worden war, zwei Stunden umgesetzt. Dieser Pool von Serumproben bestand aus zehn individuellen Seren von Patienten, bei denen CSD diagnostiziert worden war und für die gezeigt wurde, dass sie einen Titer von 1:1024 oder mehr aufwiesen, wobei dies durch den indirekten Fluoreszenzantikörper-Test (IFA-Test) auf Rochalimaea, der wie früher beschrieben durchgeführt wurde (42), bestimmt wurde. Anschließend wurden die Filter viermal mit TBST gewaschen und der gebundene Antikörper nachgewiesen, indem die Filter mit Ziegen-Anti-Mensch-IgG, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, (verdünnt 1:3000 in TBST mit 5 % Magermilch), eine Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt wurden. Die Filter wurden viermal in TBST gewaschen und die Färbung unter Verwendung eines TMB-Membran-Substrats entwikkelt (Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, Md.).
D. Rettung und Analyse von rekombinanten Phagemiden
Nach mehreren Runden Plaque-Reinigung des immunreaktiven rekombinanten Phagen wurden die isolierten Phagenplaques aus den Lambda-Phagenrekombinanten in von pBluescript hergeleitete Plasmide gemäß den Anweisungen des Herstellers (Stratagene, Torrey Pines, Calif.) subcloniert. Kurz gesagt wurde der pBluescript-Teil des Lambda-ZAPII-Vektors, enthaltend die eingefügte Rochalimaea-DNA, durch Superinfizieren von Lambda-Rekombinanten-infizierten E. coli-XL1-MRF'-Zellen mit dem Helferphagen R408 gerettet. Diese rekombinanten Phagenemide wurden sodann zum Infizieren von XL1-MRF'-Zellen verwendet, wo sie sich bei Selektion mit Ampicillin als Plasmide replizieren. Diese Prozedur führt zu Kolonien, welche von pBluescript hergeleitete rekombinante Plasmide mit Rochalimaea-DNA-Inserten enthalten. Diese rekombinanten Plasmide wurden für die weitere Analyse und das Sequenzieren von DNA sowie für die Immunblot-Analyse von in E. coli exprimierten, Plasmid-codierten Rochalimaea-Proteinen verwendet.
E. Immunblot-Analyse
Um die menschliche Antikörperantwort auf einzelne Antigene zu analysieren, wurden Ganzzellen-Lysate von Rochalimaea und E. coli-Rekombinanten einer SDS-PAGE und Immunblot-Analyse unterworfen. Rochalimaea wurde wie vorstehend beschrieben gezüchtet. E. coli-Rekombinanten wurden in LB-Brühe, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, bei 37°C unter Schütteln bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet, und anschließend wurde 1 mM IPTG zugegeben. Die Inkubation wurde weitere zwei Stunden bei 37°C unter Schütteln fortgesetzt und die Zellen sodann abzentrifugiert. Die resultierenden Zellpellets wurden in Probenpuffer (2 % SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) für die SDS-PAGE für fünf Minuten bei 100°C solubilisiert.
Die solubilisierten Zellproteine von Rochalimaea und E. coli-Rekombinanten wurden einer Elektrophorese durch 8 bis 16 % Gradienten-SDS-PAGE-Minigele (Novex, San Diego, Calif.) unterworfen. Die resultierenden Zellproteine wurden direkt mit Coomassie-Brilliant-Blue angefärbt oder unter Verwendung einer Mini-Transfer-Apparatur (Bio-Rad, Richmond, Calif.) auf Nitrocellulose überführt. Nach dem Elektrotransfer von Proteinen auf Nitrocellulose wurden die resultierenden Filter mit Antiseren umgesetzt und behandelt, wie es im Abschnitt „Immunscreening von rekombinanten Phagenclonen" dieses Beispiels beschrieben ist.
F. Sequenzieren von Phagemid-DNA
Die Plasmid-DNA aus Rekombinanten wurde aus Minipräparaten durch alkalische Lyse hergestellt. Die resultierende Plasmid-DNA wurde für die Restriktionsendonuclease-Spaltung und direkt für die Sequenzierung doppelsträngiger Plasmide durch das Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahren verwendet. Die Plasmide wurden sequenziert, indem die alkalische Denaturierung durch das Verfahren von Zhang (44) durchgeführt wurde, worauf Kettenverlängerung und Abbruch mit T7-DNA-Polymerase (Sequenase, US Biochemical) unter Verwendung von ³⁵S-dATP folgten. Die sequenzierte DNA wurde einer Elektrophorese durch ein denaturierendes 6 % Acrylamid-Harnstoff-Gel unterworfen, und das resultierende Gel wurde mit 10 % Essigsäure und 5 % Methanol fixiert. Nach einer Vakuumtrocknung wurde das Gel für etwa 12 bis 24 Stunden mit einem Röntgenfilm in Kontakt gebracht und entwickelt. Die Plasmide wurden mit den M13-Vorwärts- oder Rückwärtsprimern oder beim Fortschreiten der Sequenzierung unter Verwendung von Primern sequenziert, die aus dem R. henselae-Insert synthetisiert wurden. Um das 17-kDa-Antigen-Gen noch weiter zu lokalisieren und für eine zusätzliche Sequenzierung, wurden Restriktionsfragmente durch Standardverfahren (20) in pUC19 subcloniert und sodann durch Immunblot-Analyse auf Expression untersucht.
G. Konstruktion eines Fusionsproteins
Verfahren der Genfusion wurden eingesetzt, um die Identität des mutmaßlichen 17-kDa-Antigen-Gens zu bestätigen und seine optimale Expression in E. coli möglich zu machen. PCR-Primer aus den mutmaßlichen 17-kDa-Antigen-Gensequenzen wurden so entworfen, dass sie eine HindIII-Stelle (unterstrichen) am 5'-Ende-Primer (5'-AAAAGCTTGAAAAAATATAGCTTAGTCAC-3', SEQ ID NO: 13) und eine BamHI-Stelle (unterstrichen) am 3'-Ende-Primer (5'-AAGGATCCAGAAATGCTCTCAAAC-3', SEQ ID NO: 14) enthielten. Durch diese einmaligen Restriktionsstellen wird die gerichtete und im-Raster-erfolgende Clonierung erleichtert. Die DNA aus dem Houston-1-Stamm von R. henselae wurde durch 35 Zyklen mit 1 Minute bei 94°C, 2 Minuten bei 48°C und 1,5 Minuten bei 68°C unter Verwendung von GeneAmp-Reagenzien und Taq-Polymerase und eines Thermozyklers (Perkin Elmer, Norwalk, Conn.) amplifiziert. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit HindIII und BamHI gespalten, Gel-gereinigt und mit dem Expressionsvektor PinPoint Xa-2 ligiert, um eine Fusion des Antigens mit der 13-kDa-Biotinylierungs-„Tag"-Sequenz des Vektors (Promega, Madison, Wisc.) herzustellen. Diese Tag-Sequenz wurde vom Hersteller so konstruiert, dass eine schnelle Reinigung von biotinylierten Fusionsproteinen von anderen E. coli-Zellproteinen möglich ist. Außerdem liegen Endoprotease-Spaltstellen vor, so dass die Proteine von der Tag-Sequenz abgespalten werden können. Das Ligierungsgemisch wurde zum Transformieren des E. coli-Stamms XL-1 MRF' (Stragagene, Torrey Pines, Calif.) eingesetzt. Potentielle Clone wurden durch Restriktionsendonuclease-Analyse untersucht, um das Vorliegen des Inserts mit korrekter Größe zu bestätigen. Clone, welche das Insert mit korrekter Größe enthalten, wurden in LB-Brühe bis zur frühen logarithmischen Phase gezüchtet und mit 1 mM IPTG induziert, danach ließ man sie noch weitere zwei Stunden wachsen. Die E. coli-Zellen wurden abzentrifugiert und durch Immunblot-Analyse unter Verwendung von Streptavidin, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase, auf die Expression von biotinylierten Fusionsproteinen untersucht. Clone, die das biotinylierte Fusionsprotein exprimierten, wurden auf Reaktivität mit dem Serumpool von Patienten mit CSD und außerdem mit einzelnen Serumproben von Patienten mit CSD und Kontrollen getestet. Diese Seren waren vorher einem IFA unterworfen worden, um den Endpunkt-Titer zu bestimmen.
H. Identifizieren und Charakterisieren von immunreaktiven Clonen
Etwa 1,2 × 10⁶ rekombinante Phagenclone wurden erhalten. Die Qualität der resultierenden Bank wurde vorher untersucht, indem die Clonierungseffizienz eines Markergens getestet wurde (3). Für den Zweck dieses Berichts wurde das 16S-rRNA-Gen ausgewählt, und es wurde gezeigt, dass es mit 0,125 % der Clone hybridisierte. Diese Ergebnisse sind fast gleich wie diejenigen, die man für eine Zufallsclonierung (random cloning") voraussagt, und dies legt nahe, dass alle DNA-Fragmente in der R. henselae-Bank vorliegen sollten. Etwa 0,2 bis 0,3 % der 300 000 R. henselae-Rekombinanten-Plaques, die mit dem Pool von Seren von Patienten mit der Diagnose von CSD gescreent wurden, waren immunreaktiv. Zehn dieser immunreaktiven Rekombinanten wurden für die weitere Untersuchung ausgewählt und durch drei oder vier Runden Plaque-Reinigung isoliert. Alle zehn wurden als pBluescript-basierte Phagemide subcloniert, und damit wurde sodann der E. coli-Stamm SOLR (Stratagene, Torrey Pines, Calif.) infiziert. Jeder der zehn Subclone scheint die Synthese des gleichen 17-kDa-Antigens zu steuern, das auf Immunblots mit dem Pool von Seren von Patienten mit CSD hochreaktiv ist. Ein Kontrollstamm von E. coli XL-1, der nur den Plasmidvektor pBluescript SK enthielt, exprimierte das gleiche immunreaktive 17-kDa-Antigen nicht. Wenn R. henselae-Organismen auf Blutagar gezüchtet wurden, schienen sie das 17-kDa-Antigen schwach zu exprimieren, obwohl die Expression dieses Antigens durch das auf Verozellen co-kultivierte R. henselae nicht zu erkennen war. Auch R. quintana exprimierte das 17-kDa-Antigen, das mit den gepoolten Seren von CSD-Patienten reagierte, dies legt nahe, dass dieses Antigen (oder Teile davon) möglicherweise bei R. henselae und bei R. quintana gemeinsam vorliegt. Das 17-kDa-Antigen, das durch R. henselae und die E. coli-Clone exprimiert wurde, reagierte nicht mit einem menschlichen Kontroll-Serumpool von Patienten, die keine Krankengeschichte mit CSD hatten. Die Antikörperantwort des Serumpools schien nicht gegen eine Vielzahl verschiedener R. henselae-Antigene gerichtet zu sein. Bei R. henselae sind stark vertretene immunreaktive Antigene mit ungefähren Molekülmassen von 14, 68 und 84 kDa zu sehen, und außerdem noch schwächere Banden bei 17, 32 und 48 kDa. Das in E. coli exprimierte 17-kDa-Antigen scheint mit dem Serumpool viel stärker zu reagieren als das Protein, das in R. henselae exprimiert wird. Diese Ergebnisse bedeuten, dass das 17-kDa-Antigen stark immunreaktiv ist, jedoch in R. henselae nicht mit hohen Spiegeln exprimiert wird.
I. Analyse des Gens. welches das 17-kDa-Antigen codiert
Um zu bestimmen, ob ein Clonierungsfehler („cloning bias") eine Erklärung dafür war, warum Clone, die das 17-kDa-Antigen exprimierten, mit einer solchen Häufigkeit isoliert wurden, wurde eine Restriktionsendonuclease-Analyse durchgeführt. Die Spaltung der Plasmide aus allen zehn Rekombinanten, die das 17-kDa-Antigen exprimierten, mit EcoRI zeigte sieben unterschiedliche Profile. Obwohl es sich bei den zehn ersten isolierten Clonen um 17-kDa-Antigen-exprimierende Clone handelte, enthalten mindestens sieben verschiedene DNA-Fragmente das gesamte Gen. Diese Ergebnisse zeigen, dass kein Clonierungsfehler („cloning bias") dafür verantwortlich ist, dass der gleiche Antigen-exprimierende Clon durch Über-Repräsentation eines bestimmten Fragments von DNA in der Bank isoliert wird. Demgemäß legen diese Ergebnisse, wenn sie mit den Ergebnissen zusammengenommen werden, welche einige wenige immunreaktive Banden für R. henselae zeigen, nahe, dass das 17-kDa-Antigen möglicherweise eines von einigen wenigen immundominanten Antigenen sein könnte, die durch Patienten mit CSD erkannt werden.
Das Gen für das 17-kDa-Antigen, welches mit dem Pool von Seren von Patienten mit CSD reaktiv war, wurde innerhalb eines 2,2 Kilobasen großen EcoRI-Fragments lokalisiert, und das gesamte Fragment wurde sequenziert. Das Gen, welches das 17-kDa-Antigen codiert, wurde durch Subclonierung und Immunblot-Analyse mit dem Serumpool von Patienten mit CSD auf ein einzelnes offenes Leseraster lokalisiert. Dieses Gen steuerte nur die Synthese des 17-kDa-Antigens in E. coli, wenn es in pUC19 in der Richtung des IacZ-Alpha-Peptids subcloniert wurde. Somit fehlt ein R. henselae-Promotor entweder stromaufwärts dieses Gens oder er ist in E. coli nicht funktionell. Das offene Leseraster bestand entweder aus 160 oder aus 148 Aminosäuren, abhängig davon, welche der zwei mutmaßlichen Initiator-Methionine, die identifiziert wurden, funktionell sind. Vor dem ersten möglichen Initiator-Methionin steht eine Polypurinreiche Sequenz, die der Consensus-Ribosomenbindungsstelle in E. coli ähnlich ist (40). Vor dem zweiten möglichen Initiator-Methionin steht in acht Basen eine Sequenz, die mit der Consensus-Ribosomenbindungsstelle von E. coli identisch ist. Wenn man annimmt, dass das zweite mögliche Initiator-Methionin für den Start der Translation verwendet wird, wird ein hergeleitetes Protein mit 148 Aminosäuren und einem vorausgesagten Molekulargewicht von 16 893 Dalton erhalten. Dies liegt näher bei der offensichtlichen Molekülgröße von 17 kDa, die auf Immunblots festgestellt wird, als bei derjenigen, die man voraussagen würde (18 245), wenn das erste mögliche Initiator-Methionin verwendet werden würde. Die hergeleitete Aminosäuresequenz für das 17-kDa-Antigen-Gen hat keine signifikante Homologie mit einem beliebigen anderen bakteriellen Protein in der GenBank-Datenbank. Wenn man davon ausgeht, dass das zweite mögliche Initiator-Methionin verwendet wird, zeigt die hergeleitete Aminosäuresequenz mehrere gemeinsame Ähnlichkeiten mit bakteriellen Membran-assoziierten Proteinen. Die ersten 18 Aminosäuren sind hydrophober Natur und enthalten zwei Lysinreste am unmittelbaren Aminoterminus (Reste zwei und drei). Dieser Typ von Motiv ist für Proteine der äußeren Bakterienoberfläche typisch, wo die Lysinreste mit den Phospholipiden der Membran interagieren und die folgenden hydrophoben Reste eine Membranüberspannende oder Membranankersequenz bilden (43). Eine Aminosäuresequenz, die zu der Consensus-Signal-Peptidase-Spaltstelle von E. coli (A-X-A) identisch ist, liegt an den Resten 18 bis 20 hinter dem zweiten mutmaßlichen Initiator-Codon vor. Es ist nicht bekannt, ob diese Stelle durch Signalpeptidasen von R. henselae gespalten wird, um eine reife Form des 17-kDa-Antigens zu erhalten. Die restlichen 130 Aminosäurereste, die von der Gensequenz des 17-kDa-Antigens hergeleitet sind, sind hauptsächlich hydrophil oder neutral, ohne lange hydrophobe Domänen.
Unabhängig davon, welches der zwei möglichen Initiator-Methionine für den Start der Translation verwendet wird, gibt es eine kurze Überlappung mit einem anderen langen offenen Leseraster. Das stromaufwärts des 17-kDa-Antigen-Gens gezeigte Leseraster setzt sich mindestens noch weitere 380 Nucleotide stromaufwärts des Gezeigten fort. Die gesamte Sequenz dieses offenen Leserasters wurde bisher noch nicht erhalten. Es ist wahrscheinlich, dass das 17-kDa-Antigen-Gen Teil eines Operons ist, welches von einem Promotor stromaufwärts dieses nicht-identifizierten offenen Leserasters aus transkribiert wird. Genauso überlappt ein zweites nicht-identifiziertes offenes Leseraster das 3'-Ende des 17-kDa-Antigen-Gens und setzt sich mindestens noch weitere 700 Nucleotide fort. Unmittelbar stromabwärts des 17-kDa-Antigen-Gens sind keine Sequenzen zu sehen, die in der Lage sind, stabile Sekundärstrukturen vom Typ Schleife und Stamm zu bilden, die für bakterielle Transkriptions-Terminatoren charakteristisch sind. Dieses dritte offene Leseraster ist möglicherweise ein Gen, das aus einem einzigen Promotor zusammen mit dem 17-kDa-Antigen-Gen und dem möglichen, stromaufwärts hiervon liegenden Gen co-transkribiert wird. Es gibt keine Regionen stromaufwärts des 17-kDa-Antigen-Gens mit dem korrekten Abstand und Homologie zu den Consensus- -35 (TTGACA) und -10 (TATAAT) Promotorsequenzen von E. coli (41). Dennoch unterscheiden sich Rochalimaea-Promotorsequenzen möglicherweise von denjenigen von E. coli. Das Fehlen von möglichen Promotorsequenzen und die Expression des 17-kDa-Antigens nur dann, wenn es in der Richtung des Vektor-IacZ-Promotors cloniert wird, sprechen weiterhin dafür, dass dieses Gen zusammen mit einem stromaufwärts liegenden Gen co-transkribiert wird.
J. Konstruktion einer Genfusion
Um ein stark exprimiertes hybrides Fusionsprotein zu erzeugen, wurde der Teil des Gens, welcher die Aminosäurereste 2 bis 148 codiert, durch PCR-Amplifikation unter Verwendung des im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 angegebenen Primersatzes synthetisiert. PCR-Primer wurden ausgewählt, die eine Im-Raster-Fusion des gesamten Proteins (wenn man davon ausgeht, dass das zweite Methionin der Start der Translation ist) minus dem Methioninrest dieses Gens mit der 13-kDa-Biotinylierungs-Tag-Sequenz des Expressionsvektors PinPoint Xa-2 möglich machen. Dies führt zu einem Fusionsprotein, das aus der Tag-Sequenz (aminoterminaler Teil) besteht, welche an das Antigen (carboxyterminaler Teil) fusioniert ist, und zwar unter der Kontrolle des IacZ-Promotors des Vektors pXa-2. Das 30-kDa-Fusionsprotein wird in E. coli effizient exprimiert, dies wurde durch Immunblot-Analyse mit Streptavidin, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase, bestimmt. Eine Kontrolle, welche aus einem 8-kDa-Teil eines nicht verwandten Gens, fusioniert an den Vektor pXa-2, besteht, exprimiert in E. coli-Stamm XL-1 MRF' ein biotinyliertes Protein von etwa 21 kDa. In allen drei Clonen liegt ein natürlich vorkommendes biotinyliertes Protein vor, das eine offen sichtliche Molekülmasse von etwa 26 kDa aufweist. Dieses natürlich vorkommende biotinylierte Protein wurde in allen K-12-Stämmen von E. coli festgestellt, die von dem Vektor-Hersteller (Promega Corp., Madison, Wisc.) für die Zwecke rekombinanter DNA verwendet wurden.
K. Immunreaktivität des Fusionsproteins
Die Reaktivität des 30-kDa-Fusionsproteins mit einzelnen Serumproben von Patienten mit CSD und außerdem mit Kontrollen wurde untersucht, indem eine Immunblot-Analyse durchgeführt wurde. Wenn einzelne Serumproben mit den Proteinen, die durch den das Fusionsprotein enthaltenden Clon exprimiert wurden, umgesetzt wurden, waren 12 von 13 Serumproben, die im IFA-Test auf Antikörper gegen Rochalimaea positiv waren, auch mit dem rekombinanten 30-kDa-Fusionsprotein reaktiv. Genauso reagierten 8 von 9 Serumproben, die im IFA negativ waren, nicht beim Immunblot mit dem 30-kDa-Fusionsprotein. Wenn die Immunblot-Streifen nur auf Reaktivität des 30-kDa-Fusionsproteins untersucht werden, besteht eine gute Übereinstimmung mit der klinischen Diagnose von CSD und dem IFA-Titer. Außerdem zeigen diese Ergebnisse, dass ein dominantes Epitop des 17-kDa-Antigens, das durch Serum von Patienten mit CSD erkannt wird, in dem Fusionsprotein noch enthalten ist.
In dieser Anmeldung sind verschiedene Veröffentlichungen als Referenzen durch Ziffern in Klammern angegeben. Die vollständigen Zitate für diese Veröffentlichungen finden sich im Folgenden.
Referenzen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nucleinsäure, welche die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 11 angegebene Aminosäuresequenz codiert.
Expressionsvektor, welcher das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 umfasst.
Wirtszelle, welche den Expressionsvektor nach Anspruch 2 umfasst.
Isolierte Nucleinsäure mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden, die mit der Nucleinsäure nach Anspruch 1 selektiv hybridisieren kann und eine Komplementarität von mindestens 80 % mit der Nucleinsäure nach Anspruch 1 aufweist, und die a) als ein Primer oder als eine Sonde zum Nachweisen des Vorliegens der Nucleinsäure nach Anspruch 1 eingesetzt werden kann; oder b) zum Herstellen eines Antigens oder antigenen Fragments eingesetzt werden kann, das zum Diagnostizieren von Katzenkratzkrankheit oder bazillärer Angiomatose geeignet ist.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 4, wobei die isolierte Nucleinsäure mit der Nucleinsäure nach Anspruch 1 selektiv hybridisieren kann und eine Komplementarität von mindestens 95 % mit der Nucleinsäure nach Anspruch 1 aufweist.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 4, wobei die isolierte Nucleinsäure mit der Nucleinsäure nach Anspruch 1 selektiv hybridisieren kann und eine Komplementarität von mindestens 99 % mit der Nucleinsäure nach Anspruch 1 aufweist.
Gereinigtes antigenes Polypeptid, das durch die isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 4 codiert ist.
Gereinigtes antigenes Polypeptid, das die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 11 angegebene Aminosäuresequenz aufweist.
Verfahren zum Diagnostizieren einer gegenwärtigen oder früheren Katzenkratzkrankheit, umfassend das Nachweisen des Vorliegens von Rochalimaea henselae in einer vorher von einem Individuum erhaltenen Probe, wobei der Nachweisschritt die Schritte des Inkontaktbringens einer vorher von dem Individuum erhaltenen Flüssigkeits- oder Gewebeprobe mit einer nachweisbaren Menge eines gereinigten Antikörpers, der spezifisch an das im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 11 angegebene Polypeptid bindet, des Nachweisens der Bindung des Antikörpers an das Polypeptid und des Beziehens des Vorliegens einer spezifischen Bindung auf eine Katzenkratzkrankheit bei dem Individuum umfasst.
Verfahren zum Diagnostizieren einer gegenwärtigen oder früheren Katzenkratzkrankheit durch Nachweisen des Vorliegens eines Antikörpers, der spezifisch an R. henselae bindet, wobei der Nachweisschritt die Schritte des Inkontaktbringens einer vorher von einem Individuum erhaltenen, Antikörper-enthaltenden Flüssigkeits- oder Gewebeprobe mit einer Menge des im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 11 angegebenen, gereinigten Polypeptids, des Nachweisens der Bindung des Polypeptids an den Antikörper und des Beziehens des Vorliegens eines Antikörpers, der spezifisch an das Polypeptid bindet, auf eine Katzenkratzkrankheit bei dem Individuum umfasst.
Verfahren zum Diagnostizieren einer gegenwärtigen oder früheren Katzenkratzkrankheit durch Nachweisen des Vorliegens eines Antikörpers, der spezifisch an R. henselae bindet, wobei der Nachweisschritt die Schritte des Inkontaktbringens einer vorher von einem Individuum erhaltenen, Antikörper-enthaltenden Flüssigkeits- oder Gewebeprobe mit einer Menge des gereinigten Polypeptids, das durch die Nucleinsäure codiert ist, die spezifisch mit der Nucleinsäure, welche die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 11 angegebene Aminosäuresequenz codiert, unter den Stringenzbedingungen von 60°C und 5X SSC, gefolgt von der einleitenden Waschbedingung von Raumtemperatur, 2X SSC und 0,1 % SDS und zwei sekundären Waschgängen mit Stringenzbedingungen von 50°C, 0,5 SSC und 0,1 % SDS hybridisieren kann, des Nachweisens der Bindung des Polypeptids an den Antikörper und des Beziehens des Vorliegens eines Antikörpers, der spezifisch an das Polypeptid bindet, auf eine Katzenkratzkrankheit bei dem Individuum umfasst.
Verfahren zum Diagnostizieren einer gegenwärtigen oder früheren Katzenkratzkrankheit, umfassend das Nachweisen des Vorliegens von Rochalimaea henselae in einer vorher von einem Individuum erhaltenen Probe, wobei das Vorliegen von Rochalimaea henselae durch Nachweisen des Vorliegens einer Nucleinsäure bestimmt wird, welche die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 11 angegebene Aminosäuresequenz codiert.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Nucleinsäure unter Verwendung einer Nucleinsäure-Amplifikations-Technik nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Individuum ein Mensch ist.
Verfahren zum Diagnostizieren einer bazillären Angiomatose, umfassend das Nachweisen des Vorliegens von Rochalimaea quintana in einer vorher von einem Individuum erhaltenen Probe durch Nachweisen des Vorliegens einer für Rochalimaea quintana spezifischen Nucleinsäure, wobei die für Rochalimaea quintana spezifische Nucleinsäure aus den Nucleotiden in der im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 11 angegebenen Nucleotidsequenz besteht, und Beziehen des Vorliegens von Rochalimaea quintana auf das Vorliegen einer bazillären Angiomatose bei dem Individuum.
Diagnostisches Kit zum Nachweisen des Vorliegens eines Serumantikörpers, der spezifisch mit Rochalimaea henselae oder einem immunogenen Fragment davon reaktiv ist, umfassend: ein gereinigtes Polypeptid, das eine als SEQ ID NO: 11 angegebene Sequenz aufweist, oder ein immunogenes Fragment davon, gebunden an ein Substrat; und einen sekundären Antikörper, der mit dem Serumantikörper reaktiv ist, welcher spezifisch mit dem gereinigten Polypeptid oder einem immunogenen Fragment davon reaktiv ist.
Diagnostisches Kit nach Anspruch 16, das weiterhin ein Reagens zum Nachweisen einer Reaktion des sekundären Antikörpers mit dem Serumantikörper umfasst.
Verfahren zum Diagnostizieren einer gegenwärtigen oder früheren Katzenkratzkrankheit durch das Nachweisen des Vorliegens eines Antikörpers, der spezifisch an Rochalimaea henselae bindet, wobei der Nachweisschritt die Schritte des Inkontaktbringens einer vorher von einem Individuum erhaltenen, Antikörperenthaltenden Flüssigkeits- oder Gewebeprobe mit einer Menge des 30 kDa Fusionsproteins, hergestellt durch Subclonieren des als SEQ ID NO: 11 angegebenen Rochalimaea henselae-Polypeptids als ein biotinyliertes Fusionsprotein in dem Expressionsvektor PinPoint Xa-2; des Nachweisens der Bindung des 30 kDa Fusionsproteins an den Antikörper; und des Beziehens des Vorliegens eines Antikörpers, der spezifisch an das 30 kDa Fusionsprotein bindet, auf eine Katzenkratzkrankheit bei dem Individuum umfasst.
Verwendung eines Polypeptids, die eine als SEQ ID NO: 11 angegebene Aminosäuresequenz umfasst, oder einer Nucleinsäure, die ein Polypeptid codiert, das eine als SEQ ID NO: 11 angegebene Aminosäuresequenz umfasst, zum Herstellen eines diagnostischen Kits zum Diagnostizieren einer gegenwärtigen oder früheren Katzenkratzkrankheit.
Verwendung eines Polypeptids, das eine als SEQ ID NO: 11 angegebene Aminosäuresequenz umfasst, oder einer Nucleinsäure, die ein Polypeptid codiert, das eine als SEQ ID NO: 11 angegebene Aminosäuresequenz umfasst, zum Herstellen eines diagnostischen Kits zum Diagnostizieren einer bazillären Angiomatose.