DE60222812T2

DE60222812T2 - In leptospira-spezies vorhandene proteine mit repetitiven bakterien-ig-ähnlichen (big-) domänen

Info

Publication number: DE60222812T2
Application number: DE60222812T
Authority: DE
Inventors: Albert I. CEP-40295-001 Salvador KO; Mitermayer CEP-40295-001 Salvador GALVAO REIS; Julio H. CEP-40295-001 Salvador ROSA CRODA; Isadora C. CEP-40295-001 Salvador SIQUEIRA; David A. Haake; James Matsunaga; Lee W. Berkeley RILEY; Michele Barocchi; Tracy A. Berkeley YOUNG
Original assignee: Fundacao Oswaldo Cruz
Current assignee: Fundacao Oswaldo Cruz
Priority date: 2002-05-17
Filing date: 2002-05-20
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2022-05-21
Also published as: EP1514104A1; AU2002308453B2; WO2003098214A1; CA2486345A1; DE60222812D1; EP1514104A4; EP1514104B1; CA2486345C; AU2002308453A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf drei isolierte DNA-Moleküle, die in dem Bakterium Leptospira sp. für Proteine, BigL1, BigL2 und BigL3, codieren, welche repetitive Bakterien-Igartige(Big)-Domänen haben, und auf ihre Verwendung in diagnostischen, therapeutischen und Vakzin-Anwendungen. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die isolierten Moleküle, die für die BigL1-, BigL2- und BigL3-Proteine codieren, für die Diagnose und Prävention einer Infektion mit Leptospira-Spezies eingesetzt, die fähig sind, bei Menschen und anderen Säugern, einschließlich solchen mit veterinärer Bedeutung, Erkrankungen zu verursachen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Spirochäten sind bewegliche, helikal geformte Bakterien und umfassen drei Geni, Leptospira, Borrelia und Treponema, die für Menschen und andere Tiere Pathogene sind. Borrelia und Treponema sind die Auslöser von Erkrankungen, die Lyme-Erkrankung, wiederkehrendes Fieber, Syphilis und Frambösiome umfassen. Leptospira besteht aus einer genetisch mannigfaltigen Gruppe von acht pathogenen und vier nicht-pathogenen, saprophytischen Spezies (1, 2). Leptospiren werden auch nach ihrem Serotypstatus klassifiziert – mehr als 200 pathogene Serotypen wurden identifiziert. Eine strukturelle Heterogenität in den Lipopolysaccharidgruppierungen scheint die Basis für den großen Grad der antigenen Variation, die unter Serotypen beobachtet wird, zu sein (1, 2).
Leptospirose ist eine zoonotische Erkrankung: eine Übertragung auf Menschen erfolgt durch Kontakt mit Haus- oder Wildtier-Reservoiren oder einer Umgebung, die mit ihrem Urin kontaminiert ist. Eine Infektion produziert ein weites Spektrum klinischer Manifestationen. Die frühe Phase der Krankheit ist durch Fieber, Schüttelfrost, Kopfweh und schwere Myalgien gekennzeichnet. Die Erkrankung schreitet in 5 bis 15% der klinischen Infektionen unter Erzeugung schwerer Multisystemkomplikationen, wie z. B. Gelbsucht, Niereninsuffizienz und hämorrhagische Manifestationen, fort (1–4). Schwere Leptospirose ist mit Mortalitätsraten von 5–40% verbunden.
Leptospirose hat eine weltweite Verbreitung. Wegen des großen Spektrums an Tierspezies, die als Reservoire dienen, wird davon ausgegangen, dass es die am weitesten verbreitete zoonotische Erkrankung ist (1). Leptospirose ist traditionell eine wichtige Berufserkrankung unter Risikogruppen, z. B. Militärpersonal, Bauern, Bergleuten, bei Arbeitern in der Entsorgung von Abwasser und Abfall, Tierärzten und Schlachthausarbeitern (1–3). Allerdings sind kürzlich neue Muster der Krankheitsübertragung aufgetreten, die die wachsende Bedeutung von Leptospirose als öffentliches Gesundheitsproblem unterstreichen. In den entwickelten Ländern wurde Leptospirose die Ursache von Ausbrüchen, die mit Freizeitaktivitäten (1) und Sportereignissen (1, 4, 5) verbunden waren. In Brasilien und anderen Entwicklungsländern haben tiefgreifen de Armutsbedingungen große urbane Leptospiroseepidemien, assoziiert mit hoher Mortalität erzeugt (4, 5).
Leptospirose ist zusätzlich zu ihrer Belastung für das öffentliche Gesundheitswesen eine große wirtschaftliche Belastung, da sie die Ursache für eine Erkrankung im Viehbestand und bei Haustieren ist (2). Leptospirose produziert Fehlgeburten, Totgeburten, Unfruchtbarkeit, Unfähigkeit, sich zu entwickeln, verringerte Milchproduktion und Tod bei Tieren, z. B. Kühen, Schweinen, Schafen, Ziegen, Pferden und Hunden, und induziert eine chronische Infektion und ein Verlieren (shedding) von pathogenen Leptospiren in dem Viehbestand (2) und stellt daher wegen der derzeitigen internationalen und nationalen Quarantänebestimmungen eine zusätzliche Quelle für wirtschaftlichen Verlust für die Tierhaltungsindustrie dar.
Die Kontrolle von humaner und Tier-Leptospirose wird durch das derzeitige Fehlen von adäquaten diagnostischen Werkzeugen behindert. Der serologische Standardtest, der mikroskopische Agglutinationstest (MAT), ist für eine schnelle Fallidentifizierung nicht adäquat, da er nur in wenigen Referenzlaboratorien durchgeführt werden kann und Analysen von gepaarten Seren erfordert, um eine ausreichende Sensitivität zu erreichen (1, 2). Die Abhängigkeit vom MAT resultiert in Verzögerungen bei der Feststellung der Ursache von Ausbrüchen, wie es in mehreren Untersuchungen zu sehen ist (1, 2). Enzym-gekoppelte Immunabsorptionsbestimmungen (ELISA) und andere schnelle serologische Tests auf der Basis von Ganzzellenleptospirusantigenpräparationen wurden zur Verwendung als alternatives Verfahren entwickelt, um auf eine leptospirale Infektion durchzumustern, obgleich der MAT noch für eine Fallbestätigung erforderlich ist (1, 2). Auf rekombinantem Antigen basierende serologische Tests werden in großem Umfang beim Screening auf spirochätale Infektionen, z. B. Lyme-Erkrankung und Syphilis, eingesetzt, allerdings wurde die Verwendung von rekombinanten Proteinen für die Serodiagnose von Leptospirose noch nicht umfangreich untersucht. Kürzlich wurde ein rekombinanter Flagellar-Antigen-immuno-capture-Assay für die Serodiagnose von Rinder-Leptospirose beschrieben (6). Ein rekombinantes Hitzeschockprotein, Hsp58, zeigte einen hohen Grad an ELISA-Reaktivität mit Serumproben aus einer kleinen Zahl humaner Patienten (7). Allerdings wurde die Verwendbarkeit von rekombinanten Antigenen für die Serodiagnose von Leptospirose noch nicht in großen Bewertungsstudien untersucht.
Darüber hinaus gibt es keine derzeit verfügbaren wirksamen Interventionen, welche Leptospirose kontrollieren bzw. bekämpfen oder verhindern. Umweltkontrollmaßnahmen sind wegen des Langzeitüberlebens von pathogenen Leptospiren in Boden und Wasser und der Abundanz von Wild- und Haustierreservoiren schwer durchzuführen (1, 3). Anstrengungen wurden auf die Entwicklung einer Schutzimmunisierung als Maßnahme gegen Leptospirose konzentriert. Derzeit verfügbare Vakzine basieren auf inaktivierten Ganzzell- oder Membranpräparationen von pathogenen Leptospiren und scheinen Schutzantworten durch Induktion von Antikörpern gegen leptospirales Lipopolysaccharid zu induzieren (1, 3). Allerdings induzieren diese Vakzine keinen Langzeitschutz gegen eine Infektion. Darüber hinaus stellen sie keine Kreuz protektive Immunität gegen leptospirale Serotypen, die nicht in der Vakzinpräparation enthalten sind, bereit. Die große Zahl von pathogenen Serotypen (> 200) und die Kosten für die Herstellung eines Multi-Serotyp-Vakzins waren die Haupteinschränkungen bei der Entwicklung von wirksamen Vakzinen durch Strategien auf der Basis von Ganzzell- oder Membranpräparationen.
Der Mechanismus der Pathogenese bei der Leptospirose, wie in einer spirochetalen Erkrankung, z. B. Lyme-Erkrankung und Syphilis, basiert auf der Fähigkeit des Pathogens, sich während der frühen Stufe der Infektion innerhalb des Wirts zu verbreiten. Es wird angenommen, dass Membran-assoziierte leptospirale Proteine Wechselwirkungen vermitteln, die einen Eintritt in und eine Dissemination durch Wirtsgewebe ermöglichen. Vermeintliche Oberflächen-assoziierte Virulenzfaktoren dienen als Kandidaten für Vakzinstrategien, die Reaktionen auf diese Faktoren induzieren, welche eine Dissemination im Wirt blockieren. Darüber hinaus wurden Membran-assoziierte Proteine für die Immunantwort während einer Wirtsinfektion zugänglich und bilden daher Targets für den Immunschutz durch Mechanismen, wie Antikörperabhängige Phagocytose und Komplement-vermitteltes Abtöten. Eine Produktion dieser Antigentargets als rekombinante Proteine bietet einen kosteneffektiven Ansatz zur Schutzimmunisierung gegen Leptospirose als ein auf einer Untereinheit basierendes Vakzin. Außerdem kann eine Auswahl von Oberflächen-assoziierten Targets, die unter pathogenen Leptospiren konserviert sind, die Beschränkungen vermeiden, die mit derzeit verfügbaren Ganzzell-Vakzin-Präparationen auftreten.
Eine Hauptbegrenzung auf dem Gebiet der Leptospirose besteht in der Identifizierung von Oberflächen-assoziierten und Wirt-exprimierten Proteinen mit herkömmlichen biochemischen und molekularen Methoden. Aus der Genomsequenz der Spirochäte, Borrelia burgdorferi, wurden mehr als 100 Oberflächen-assoziierte Lipoproteine identifiziert. Basierend auf Genomgröße und Biologie ihres Lebenszyklus wird erwartet, dass Leptospiren eine signifikant größere Anzahl von Oberflächen-assoziierten Targets haben. Derzeit wurden weniger als 10 Oberflächen-assoziierte Proteine durch Isolierung von Membranextrakten, Reinigung und Charakterisierung von Proteinen in diesen Extrakten und molekulare Klonierung dieser Proteintargets charakterisiert (8–14) (12). Eine Immunisierung mit rekombinanten Proteinen für verschiedene identifizierte Targets, LipL32, OmpL1 und LipL41, induziert partielle, aber keine vollständigen Schutzantworten (11, 12).
Um ein umfassenderes Verständnis der leptospiralen Proteinexpression zu entwickeln, haben wir die humorale Immunantwort während der humanen Leptospirose als Reporter von Proteinantigenen, die während einer Infektion exprimiert werden, verwendet. Die Identifizierung von leptospiralen Antigenen, die während einer Infektion exprimiert werden, hat potentiell bedeutende Implikationen für die Entwicklung von neuen serodiagnostischen und immunprotektiven Strategien. Seren von Patienten mit Leptospirose wurden verwendet, um Klone aus einer genomischen Leptospira-DNA-Phagen-Bibliothek zu identifizieren, die immunreaktive Polypeptide exprimieren. Es wurde festgestellt, dass ein Verhältnisanteil dieser Klone für eine neue Fa milie von Membran-assoziierten Leptospira-Proteinen codiert. Die Identifizierung dieser Polynucleotide und Polypeptide und ihre Anwendung zur Diagnose von Leptospirose und zur Induzierung einer Immunantwort auf pathogene Spirochäten ist die Basis für diese Erfindung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf DNA-Moleküle in Leptospira und auf die Polypeptide, die sie codieren, die repetitive Bakterien-Ig-artige Domänen haben. Die Erfindung beschreibt die Isolierung von drei DNA-Molekülen, die ursprünglich von L. kirschneri und L. interrogans stamen, welche Proteine codieren, die hierin als „BigL1", „BigL2" und „BigL3" bezeichnet werden, die Molekülmassen von etwa 110, 205 bzw. 205 kDa haben, die auf der vorhergesagten Aminosäuresequenz der Polypeptide basieren. Die drei Proteine haben 12–13 Tandemrepetiersequenzen von etwa 90 Aminosäuren. Repetiersequenzen von BigL1, BigL2 und BigL3 sind miteinander hoch verwandt (> 90% Aminosäuresequenzidentität) und gehören zu der Familie von Bakterien-Ig-artigen(Big)-Domänen, Gruppierungen, die in Virulenzfaktoren von bakteriellen Pathogenen gefunden werden.
Die DNA-Moleküle, die für Leptospira-Proteine mit Big-Domänen codieren, die hierin „bigL1", „bigL2" und „bigL3" genannt werden, können als heterologe DNA in einen Expressionsvektor zur Herstellung von Peptiden und Polypeptiden inseriert werden. Rekombinante Polypeptide können aus Leihwirten, die mit solchen Expressionsvektoren transformiert wurden, gereinigt werden. Von BigL1, BigL2 und BigL3 abgeleitete Polypeptide sind serologische Marker für eine aktive Infektion und für eine frühere Infektion, da Seren von Leptospirosepatienten und -tieren, die mit pathogener Leptospira infiziert oder immunisiert sind, isolierte Polypeptide erkennen.
Darüber hinaus sind BigL1-, BigL2- und BigL3-Polypeptide aus rekombinanten oder nativen Antigenpräparationen immunogen. Antikörper, die aus Versuchstieren erhalten wurden, welche mit gereinigten rekombinanten BigL1-, BigL2- und BigL3-Polypeptiden immunisiert worden waren, erkennen natives Antigen aus Leptospira und sind zur Detektion von pathogenen Spirochäten in Proben von Subjekten mit einer vermuteten Infektion verwendbar.
Außerdem induzieren BigL1-, BigL2- und BigL3-Polypeptide eine Immunantwort gegen pathogene Spirochäten. Von BigL1, BigL2 und BigL3 abgeleitete Polypeptide; Antikörper gegen diese Polypeptide und Polynucleotide, die für BigL1, BigL2 und BigL3 codieren, können allein oder in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verwendet werden, um eine Infektion mit Leptospira zu behandeln oder zu verhindern. Da Big-Domänen in Proteinen vorhanden sind, die mit Virulenz in anderen bakteriellen Pathogenen assoziiert sind, können diese Gruppierungen verwendet werden, um Infektionen, die nicht mit denen, die durch Leptospira verursacht werden, verwandt sind, zu behandeln oder zu verhindern.
In einer ersten Ausführungsform beschreibt die Offenbarung isolierte DNA-Moleküle für bigL1, bigL2 und bigL3 und die Polypeptide, die durch diese DNA-Moleküle codiert werden. Außerdem wird ein Verfahren zur Herstellung eines Expressionsvektors bereitgestellt, der bigL1-, bigL2- und bigL3-Polynucleotide enthält, und zum Erhalt von im Wesentlichen gereinigten Polypeptiden, die von diesen Sequenzen abgeleitet sind.
Eine zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen Offenbarung beschreibt eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Induzierung von Immunantworten in Subjekten auf pathogene Spirochäten, umfassend eine immunogen wirksame Menge eines Antigens oder mehrerer Antigene, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus BigL1, BigL2, BigL3 und Polypeptiden mit funktionell äquivalenten Sequenzen, in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel.
In einer dritten Ausführungsform beschreibt die Offenbarung ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die spezifisch an BigL1-, BigL2-, BigL3-Polypeptide oder Polypeptide bindet, wobei das Verfahren Inkubieren von Komponenten, die die Verbindung und BigL1-, BigL2- oder BigL3-Polypeptid oder Polypeptide umfassen, unter Bedingungen, die ausreichen, um die Komponenten Wechselwirken zu lassen, und Messung der Bindung der Verbindung an BigL1-, BigL2- oder BigL3-Polypeptid oder Polypeptide umfasst. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Verfahren ein serodiagnostisches Verfahren, das Seren von einem Subjekt mit einer vermuteten aktiven oder früheren Infektion mit Leptospira oder anderen verwandten bakteriellen Pathogenen verwendet.
In einer vierten Ausführungsform beschreibt die Offenbarung ein Verfahren zum Detektieren von Pathogenen in einer Probe, umfassend In-Kontakt-Bringen einer Probe, von der angenommen wird, dass sie eine pathogene Spirochäte enthält, mit einem Reagens, das spezifisch an die Pathogen-spezifische Zellkomponente bindet, und Detektieren der Bindung des Reagenses an die Komponente. In einem anderen Aspekt ist das Reagens, das spezifisch an die Pathogen-spezifische Zellkomponente bindet, ein Antikörper gegen BigL1-, BigL2- oder BigL3-Polypeptid oder Polypeptide.
In einer fünften Ausführungsform beschreibt die Offenbarung einen Kit, der für die Detektion von BigL1-, BigL2- und BigL3-Polypeptiden oder Polypeptiden oder von Antikörpern, die spezifisch an BigL1-, BigL2-, BigL3-Polypeptide oder Polypeptide binden, einsetzbar ist.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorzüge der vorliegenden Offenbarung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung offensichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A und B zeigen eine Southern-Blot-Analyse von bigL-Gensequenzen in Leptospira. Genomische DNA (3 μg/Bahn) aus dem L. interrogans-Stamm Fiocruz L1-130 (Bahnen 1), L. kirschneri-Stamm Rm52 (Bahnen 2) und L. biflexi-Stamm Patoc I (Bahnen 3), verdaut mit NsiI und einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen. Nach Übertragung auf Nitrocellulosemembranen wurden Blots mit DNA-Fragmenten, die für repetitive BigL-Domänen (4.-6. repetitive Domäne von BigL3, 1A) codieren, und mit C-terminalen Regionen von bigL1, bigL2 und bigL3, die für jedes dieser Gene einzigartig sind, sondiert (1B).
2 zeigt ein schematisches Diagramm der genomischen Organisation der Region, die für die BigL1- und BigL3-Proteine in L. kirschneri codiert. Das BigL1-Protein würde ein Signalpeptid (schraffiertes Kästchen) und dreizehn 90-Aminosäuren-Bakterien-Immunglobulin-artige Domänen (ausgefüllte Kästchen) enthalten. Das BigL3-Protein würde ein Signalpeptid, zwölf 90-Aminosäure-Bakterien-Immunglobulin-artige Domänen und eine 793 Aminosäuren große Carboxy-terminale (C-terminale) Domäne enthalten. Die Orte der 2156 bp-Region mit 100% DNA-Sequenz-Identität sind gezeigt. Die Organisation der gezeigten Region wurde in L. interrogans und L. kirschneri konserviert.
3 zeigt die Polymerasekettenreaktion(PCR)-Amplifikation von DNA-Fragmenten aus Stämmen von fünf pathogenen Leptospira-Spezies. Auf der Basis der L. kirschneri- und L. interrogans-Sequenz, die für die BigL3-Region, die den Positionen 46–65 aa entspricht, codiert, wurden degenerierte Primer entwickelt. PCR-Reaktionen wurden aus gereinigter DNA aus fünf pathogenen (L. kirschneri, borgpetersenii, interrogans, santarosai und noguchi) und zwei nicht-pathogenen Spezies (L. biflexi und wolbachii) durchgeführt.
4 zeigt amplifizierte Produkte aus RT-PCR von RNA-Extrakten von L. kirschneri mit bigL1-, bigL2- und bigL3-spezifischen Primern. Reverse Transkriptionsreaktionen (Bahnen „+") wurden an RNA-Extrakten von kultivierten Leptospiren durchgeführt und dann einem Polymerasekettenreaktions(PCR)-Amplifikationsschritt mit Primern unterzogen, die an einzelne Sequenzen in bigL1, bigL2 und bigL3 binden. Eine Amplifikation mit Primern auf der Basis von Sequenzen in lipL45 wurde als Kontrollreaktion durchgeführt, und zwar da sie eine PCR-Reaktion war, für die die Proben keinem reversen Transkriptionsschritt unterzogen worden waren.
5 zeigt die Immunoblotreaktivität von gepoolten Seren aus Patienten und Tierreservoiren, infiziert mit pathogener Leptospira und von Labortieren, immunisiert mit Gesamt-L. interrogans-Antigenpräparation, gegen rekombinantes BigL3-Protein (rBigL3). Eine Western-Blot-Analyse wurde mit gereinigtem rBigL3 (1 μg pro Bahn, Bahnen 3) durchgeführt. Membranen wurden mit Seren von Patienten mit Leptospirose (Bahn A), gesunden Personen (Bahn B), gefangenen Ratten, die mit L. interrogans besiedelt waren (Bahn C), gefangenen Ratten, die nicht mit L. interrogans besiedelt waren (Bahn D), Laborratten, die mit Gesamtantigenpräparationen von in vitro kultivierter L. interrogans immunisiert worden waren (Bahn E), und preimmunen Sera von den Laborratten, die vor Immunisierung gesammelt worden waren (Bahn F), sondiert. Die Reaktivität gegenüber der Gesamt-L. interrogans-Antigenpräparation (Bahnen 1) und rekombinantem LipL32-Protein (rLipL32, Bahnen 2) ist zum Vergleich gezeigt. Die Zahlen auf der linken Seite geben die Positionen und die relativen Mobilitäten (kDa) für Molekülmassenstandards (Invitrogen) an.
6 zeigt eine ELISA-Evaluierung von individueller Patientenseroreaktivität auf rBigL3 während der akuten (Bahnen A) und konvaleszenten (Bahnen B) Phase der Erkrankung an Leptospirose. Seren von 4 Leptospirosepatienten (durchgezogene Linien) und 4 gesunden Personen (gestrichelte Linien) wurden in Verdünnungen von 1:50, 1:100 und 1:200 mit RBigL3 (25–200 ng/Well) inkubiert. Mu- und gamma-Ketten-spezifische Antikörper, konjugiert an Meerrettichperoxidase, wurden verwendet, um IgM- bzw. IgG-Seroreaktivität zu bestimmen. Die mittleren Extinktionswerte (OD 450 nm) und Standardabweichungen sind in den Graphen dargestellt.
7 zeigt die rBigL3-IgM (Abbildung A)- und -IgG (Abbildung B)-Reaktivität von Seren von 29 individuellen Patienten mit Leptospirose während der akuten (Bahnen 2) und konvaleszenten (Bahnen 3) Phase der Erkrankung und von 28 gesunden Personen (Bahnen 1). Seren (1:50-Verdünnungen) und Mu- und gamma-Ketten-spezifische Antikörper, konjugiert an Meerrettichperoxidase, wurden verwendet, um Reaktivität zu bestimmen. Ausgefüllte Balken stellen die mittleren Extinktions (OD 450 nm)-Werte dar.
8 zeigt die Immunoblotreaktivität von einzelnen Patienten mit Leptospirose auf rBigL3 während der akuten (Bahnen 6–9) und konvaleszenten (Bahnen 10–13) Phase der Erkrankung. Eine Western-Blot-Analyse wurde mit gereinigtem rBigL3 (1 μg pro Bahn, Bahnen 3) durchgeführt. Membranen wurden mit Seren, die 1:100 verdünnt waren, sondiert. Gamma-Ketten-spezifische Antikörper, konjugiert an alkalische Phosphatase, wurden verwendet, um die Reaktivität zu dem rekombinanten 58 kD-Protein von Region 1 von BigL3 (2. bis 6. Big-Repetierdomänen) zu bestimmen. Die Reaktivität zu rLipL32 (1 μg pro Bahn) wurde als Vergleich verwendet. Die Mobilität von gereinigtem rBigL32 und rLipL32 (Bahn 14) und Molekülmassenstandards (Bahn 15) sind nach Färbung mit Ponceau-S bzw. Coomassieblau gezeigt.
9 zeigt die Immunoblot-Reaktivität von Ratten-Anti-rBigL3-Antiseren zu rBigL3 und nativem Antigen aus L. interrogans-Lysaten. Immunoblots wurden mit gereinigtem rBigL3 (1 mg/Bahn; Bahnen 3, 5, 7, 9) und Gesamtantigenpräparationen (10⁸ Leptospiren pro Bahn; Bahnen 2, 4, 6 und 8) aus kultivierten Leptospiren hergestellt. Membranen wurden mit gepoolten Seren (Verdünnungen 1:500 [Bahnen 4 und 5], 1:100 [Bahnen 6 und 7] und 1:2500 [Bahnen [8 und 9]] von Ratten, die mit rBigL3 aus E. coli immunisiert waren, die ein kloniertes DNA-Fragment von bigL3 aus L. interrogans exprimieren, sondiert. Pre-immune Seren wurde vor der ersten Immunisierung erhalten und in der Immunoblot-Analyse als Kontrolle (Bahnen 2 und 3) verwendet. Die Mobilität (kDa) von Molekülmassenstandards ist auf der linken Seite der Figur gezeigt.
10 zeigt die Immunoblot-Reaktivität von Kaninchen-Anti-rBigL3-Antiseren für natives Antigen aus Leptospira-Stammlysaten. Immunoblots wurden mit Gesamtantigenpräparationen (10⁸ Leptospira pro Bahn) der folgenden kultivierten Stämme hergestellt: Bahn 1, L. interrogans sv pomona (Typ kennewicki), Stamm RM211, niedrige Passagenzahl; Bahn 2, L. interrogans sv canicola, Stamm CDC Nic 1808, niedrige Passagenzahl; Bahn 3, L. interrogans sv pomona, Stamm PO-01, hohe Passagenzahl; Bahn 4, L. interrogans sv bratislava, Stamm AS-05, hohe Passagenzahl; Bahn 5, L. kirschneri sv grippotyphosa, Stamm RM52, niedrige Passagenzahl; Bahn 6, L. kirschneri sv grippotyphosa, Stamm P8827-2, niedrige Passagenzahl; Bahn 7, L. kirschneri sv grippotyphosa, Stamm 86–89, niedrige Passagenzahl; Bahn 8, L. kirschneri sv grippotyphosa, Stamm Moskva V. hohe Passagenzahl; Bahn 9, L. kirschneri sv mozdok, Stamm 5621, hohe Passagenzahl; Bahn 10, L. kirschneri sv grippotyphosa, Stamm RM52, hohe Passagenzahl. Membranen wurden mit Seren von Kaninchen, die mit rBigL3 aus E. coli, die ein kloniertes DNA-Fragment von bigL3 aus L. kirschneri exprimiert, immunisiert worden waren, sondiert und als Kontrollmaßnahme mit Seren von Kaninchen, die mit rekombinantem L. kirschneri GroEL-Protein immunisiert waren, sondiert. Die Positionen von nativen Genen, die BigL3 und GroEL entsprechen und die Mobilität (kDa) von Molekülmassenstandards sind auf der linken bzw. rechten Seite der Figur gezeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Aus Gründen der Zweckmäßigkeit wird die Bedeutung von bestimmten Ausdrücken und Begriffen, die in der Beschreibung, den Beispielen und den angefügten Ansprüchen verwendet werden, im Folgenden angegeben. Wenn nichts anderes definiert ist, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung, wie sie normalerweise von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird.
BigL – sind Polypeptide von Leptospira sp. mit Tandemwiederholungssequenzen, von denen jede entsprechend ihrer Sequenzhomologie zu Bakterien-Immunoglobulin-artigen(Big)-Domänen ähnlich ist. Big-Domänen liegen in Bakterienproteinen vor, die in bakteriellen Pathogenen, wie z. B. E. coli, Yersinia und Bordetella, exprimiert werden, die Virulenzfunktionen, wie z. B. Wirtszelladhäsion, haben.
Referenzsequenz – ist eine neue Sequenz, die durch Isolierung aus einem natürlichen Organismus oder durch genetische Manipulation erhalten wurde und eine genaue biologische Funktion zeigt, die für die vorliegende Erfindung charakteristisch ist.
Funktionell äquivalente Sequenzen – sind die Sequenzen, die mit einer Referenzsequenz verwandt sind, die das Resultat von Variabilität sind, d. h. jeder Modifikation, spontan oder induziert, in einer Sequenz, die eine Substitution und/oder Deletion und/oder Insertion von Nucleotiden oder Aminosäuren und/oder Verlängerung und/oder Verkürzung der Sequenz an einem ihrer Enden ist, ohne dass dies in einer Modifikation der charakteristischen Funktion der Referenzsequenz resultiert. Funktionell äquivalente Sequenzen umfassen ein Fragment und ein Analogon davon. Mit anderen Worten, funktionell äquivalente Sequenzen sind Sequenzen, die „im Wesentlichen gleich" oder „im Wesentlichen identisch" zu der Referenzsequenz sind, z. B. Polypeptide oder Nucleinsäuren, die wenigstens 80% Homologie bezüglich der Sequenz von Aminosäuren oder Referenznucleinsäuren haben. Die Homologie wird üblicherweise durch ein Softwaresystem gemessen, das Sequenzanalysen durchführt (Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710, University Avenue, Madison, Wis, 53705).
Wie vorher erwähnt wurde, sind Leptospira-Antigene, die während der Wirtsinfektion exprimiert werden, bei der Identifizierung von Targets für Diagnosetests und Vakzine von Bedeutung. Das LipL32-Protein ist eines dieser Targets und wurde als immunodominantes Antigen durch die humorale Immunantwort während der natürlichen Infektion identifiziert. Allerdings ist die Sensitivität von serologischen Tests, die auf einer Detektion von Antikörpern gegen LipL32 in Patientenseren während der akuten Phase der Erkrankung basieren, bei Leptospirose-Detektion begrenzt (siehe Flannery, B: „Evaluation of recombinant Leptospira antigen-based Enzyme-linked Immunosorbent Assays for the serodiagnosis of Leptospirosis" J. Clin. Microbiology 2001; 39(9): 3303–3310; WO9942478 ).
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifizierung der Familie der BigL-Proteine, die mit Spezies spirochätaler Bakterien assoziiert sind, einschließlich solcher, die zu Leptospira gehören.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde die BigL-Proteinfamilie als Targets der humoralen Wirtsimmunantwort, erzeugt während einer Infektion mit pathogener Leptospira oder einer Immunisierung mit pathogener Leptospira oder rekombinanten BigL-Polypeptiden, identifiziert. BigL-Polypeptide und Polynucleotide, die für diese Polypeptide codieren, sind in diagnostischen Tests verwendbar, um eine natürlich vorkommende Infektion in verschiedenen Spezies, einschließlich Menschen und Tierreservoirs, zu identifizieren. Der diagnostische Test, der auf solchen Proteinen basiert, weist eine verbesserte Empfindlichkeit und Spezifität im Vergleich zu diagnostischen Standardtests oder solchen, die in der veröffentlichten Literatur zur Identifizierung von Leptospirose in der Anfangsphase verwendet wurden, auf. Außerdem können BigL-Polypeptide Immunreaktionen induzieren, wenn sie in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunisierung eingesetzt werden.
In der vorliegenden Erfindung werden die drei BigL-Polypeptide mit Molekulargewichten von 128,4 kD, 201,3 kD und 200,4 kD, basierend auf der abgeleiteten Aminosäuresequenz der isolierten Polynucleotide, bigL1, bigL2 und bigL3, die für diese Polypeptide codieren, charakterisiert. Die Aminosäuresequenz der BigL-Polypeptide hat eine Signalsequenz und eine vermeintliche Signalpeptidase-Spaltstelle, die in großem Umfang der spirochätalen Lipobox entspricht; daher sind BigL-Polypeptide Membran-assoziierte Lipoproteine. Die Polypeptide mit 128,4 kD, 201,3 kD und 200,4 kD werden als „BigL1", „BigL2" bzw. „BigL3" bezeichnet.
Obgleich die BigL-Polypeptide der vorliegenden Erfindung ursprünglich aus Leptospira sp. isoliert wurden, sind sie nicht nur zur Induktion der Immunantwort gegen die pathogenen Organismen Leptospira sp. verwendbar, sondern auch gegen anderen Spirochäten-Bakterien und Pathogene, welche Faktoren mit Big-Domänen haben. Außerdem können BigL-Polypeptide für die Diagnose von Infektionen durch Leptospira sp., andere pathogene Spirochäten und bakterielle Pathogene verwendet werden.
Verschiedene Verfahren, die Methodologien des Standes der Technik einbauen, können verwendet werden, um Polynucleotidsequenzen zu erhalten, die für BigL-Polypeptide codieren. Diese Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Isolierung von DNA unter Verwendung einer Hybridisierung genomischer Bibliotheken mit Sonden, um homologe Sequenzen von Nucleotiden zu detektieren; Screening von Antikörpern von Expressionsbibliotheken, um Fragmente von klonierter DNA mit gemeinsamen strukturellen Aspekten zu detektieren; Poly merasekettenreaktion (PCR) in genomischer DNA unter Verwendung von Initiatoren, die fähig sind, eine DNA-Sequenz von Interesse zu rekombinieren, sowie Computer-basierte Suchen in Sequenzdatenbanken nach ähnlichen Sequenzen wie die der bigL-Polynucleotide.
In der vorliegenden Erfindung basierte die Identifizierung der Antigene auf dem Wissen, dass es eine differentielle Expression von Leptospira-Antigenen während der Kultur (in vitro) und während einer Wirtsinfektion (in vivo) gibt. Es wird angenommen, dass eine differentielle Expression von Leptospira-Antigenen für eine Wirtsadaptation während einer Infektion wichtig ist. Wir verwendeten eine Strategie, um immunreaktive Antigene und daher Antigene, die während einer Wirtsinfektion exprimiert werden, zu identifizieren. Seren von Patienten, die mit pathogener Leptospira infiziert waren, wurden verwendet, um Polynucleotidsequenzen aus genomischer Leptospira-DNA-Bibliothek in lambda-Phage auszuwählen, die für immunreaktive Polypeptide codieren.
Die vorliegende Erfindung identifizierte und isolierte drei Polynucleotide mit Nucleotidsequenzen, die SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5 entsprechen, wie auch die Aminosäuresequenzen der entsprechenden Polypeptide BigL1, BigL2 und BigL3, die durch solche Nucleotide codiert werden.
Schritt 1 – Das Screening der positiven Klone bestand im Wesentlichen aus den folgenden Schritten:

(a) Die DNA einer pathogenen Leptospira wurde mit einem geeigneten Enzym geschnitten und in eine spezifische Stelle im lambda-Phage-Genom ligiert. Wirtsbakterien wurden mit dem Phagen infiziert und die resultieren Klone, die nach Induktion von IPTG rekombinante Polypeptide exprimierten, wurden einem Immunoblotprotokoll unterworfen, bei dem eine Membran von Kolonielysaten mit Seren von Patienten mit durch das Labor bestätigter Leptospirose und dann mit einem zweiten Antikörper, konjugiert an Meerrettichperoxidase, der humanes Ig erkannte, linkubiert. Positive Klone wurden durch eine Indikatorreaktion auf Antigen-Antikörper-Komplexe, die auf der Produktion von Farbe basierte, detektiert.
(b) Die Sequenz von klonierten und isolierten Polynucleotiden wurde unter Verwendung von Phagenvektor-spezifischen Sequenzen als Initiatoren der Sequenzierungsreaktion bestimmt. Eine Analyse der Klonsequenzen und die Verwendung einer Primer-Walking-Strategie identifizierte die vollständige Nucleotidsequenz für die Gene, die für BigL1, BigL2 und BigL3 codieren.
(c) Die meisten der erhaltenen positiven Klone enthalten Gene, die die Hitzeschockproteine Hsp58 und DnaK und das Protein der äußeren Membran LipL41 codieren. Allerdings wurden Klone gefunden, welche Gene enthalten, die für Tandemwiederholungen von 190 Aminosäuren codieren, wenn man Vergleiche mit einer Datenbank von Proteinfamilien (Pfam) anstellt, wie Bakterienproteine, Typ Immunglobulin (Big). Mit der Analyse der Klonsequenzen wurden 3 Gene identifiziert, die 12 Tandemwiederholungen für bigL1 und 13 Tandemwiederholungen in bigL2 und bigL3 enthalten.

Schritt 2 – Subklonierunsexression und Reiniun des Proteins

– Zeichnen von zwei Oligonucleotiden mit Basen in Sequenzen von zwei BigL-Proteinen
– Amplifikation des Anfangs-BigL-Teils, der für einen Teil der repetitiven Region codiert, aus solchen Oligonucleotiden durch PCR
– Sequenzieren des Produktes der Amplifikation Subklonieren der Region, die durch das sequenzierte Produkt codiert wird.
– Expression des rekombinanten Proteins.
– Reinigung des rekombinanten Proteins.

Immunoblot-Analysen beweisen, dass Seren von Leptospirose-Patienten und Nagerreservoiren, die mit pathogener Leptospira infiziert sind, Antikörper in erster Linie gegen die BigL-Domäne-Wiederholungen der BigL-Polypeptide produzieren, was anzeigt, dass sie die antigenen Hauptregionen sind, die während einer Infektion erkannt werden.
Was die Polypeptide der vorliegenden Erfindung angeht, so werden sie aus DNA-, cDNA- oder RNA-Sequenzen (und Nucleinsäuresequenzen, die komplementär sind), wie auch ihrer funktionell äquivalenten Sequenz, d. h. solche Sequenzen, die für die ganzen Polypeptide oder einen Teil der Polypeptide codieren, die als BigL1, BigL2 und BigL3 bezeichnet werden, infolge der Variabilität aber nicht identisch sind, gebildet.
Die Polypeptide und Polynucleotide in der vorliegenden Erfindung bestehen aus BigL1, BigL2 und BigL3 und den Polynucleotiden, die für diese Polypeptide codieren; allerdings umfassen sie zusätzlich Polypeptide und Polynucleotide, die eine funktionell äquivalente Sequenz haben.
In der vorliegenden Erfindung können sowohl Polynucleotide als auch Polypeptide natürlicher, synthetischer oder rekombinanten Herkunft sein, die den notwendigen Reinheitsgrad haben, um ihre biologischen Aktivitäten zu erfüllen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Polynucleotide, die für BigL1, BigL2 und BigL3 codieren, die in PCR-Reaktionen verwendet werden, um entweder vollständige oder partielle amplifizierte DNA-Fragmente der bigL-Polynucleotide zu erhalten, für die Zwecke der Detektion von Leplospira in Proben oder der Expression von rekombinanten BigL-Polypeptiden. Im Fall von Initiatoren, die für die Polynucleotidamplifikation in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind sie Oligonucleotide, die aus zwei oder mehr Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden, natürliche oder synthetische, hergestellt sind.
Jeder Initiator wird vorzugsweise so konstruiert, dass er im Wesentlichen ähnlich zu einer flankierenden Region des Sequenzstrangs ist, der das Target zur Amplifikation ist. In diesem Sinne kann ein Initiator funktionell äquivalent konzipiert sein, wenn entsprechende Polymere denselben Prozess erzeugen, ohne identisch zu sein, wenn man die vorgesehene Verwendung oder Anwendung betrachtet.
Polynucleotidsequenzen dieser Erfindung können auch in einen Expressionsvektor, z. B. ein Plasmid, Virus oder ein anderes Vehikel, das für eine rekombinante Klonierung verwendet wird, inseriert werden, welches verwendet wird, um ganze oder partielle Nucleotidsequenzen, die für BigL1, BigL2 und BigL3 oder ihre funktionell äquivalenten Sequenzen codieren, zu inserieren oder einzuarbeiten. Solche Expressionsvektoren enthalten eine Promotorsequenz, die die effiziente Transkription aus einer genetischen Sequenz im Wirt, in dem der Vektor insertiert ist, erleichtert. Solche Wirte können Prokaryoten oder Eukaryoten, einschließlich Mikroorganismen, wie Hefe oder Insekten, und Säuger umfassen. Derartige Verfahren für die Verwendung in der Konstruktion von Expressionsvektoren und für die Expression von rekombinanten Sequenzen, die geeigneterweise so genannt werden, sind den Experten auf diesem Gebiet gut bekannt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern bereit, die an vollständige oder partielle Polypeptide von BigL1, BigL2 und BigL3 oder ihre funktionell äquivalenten Sequenzen binden. Solche Antikörper sind als Forschungswerkzeuge und diagnostische Werkzeuge in der Untersuchung und Diagnose von Spirochäteninfektionen im Allgemeinen und spezifischer in der Entwicklung von Diagnostika und Therapeutika entweder zur Behandlung oder Prävention von Leptospirose verwendbar. Solche Antikörper können allein oder als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, welche diese Antikörper und einen pharmazeutisch verträglichen Träger als ein Teil eines anti-spirochätalen Therapeutikums verwendet.
Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen von BigL-Polypeptiden oder der Polynucleotide, die für diese Polypeptide codieren, als Vakzine, entweder als Vakzin zur Prävention einer Erkrankung, das eine immunprotektive Reaktion auf Infektion oder Kolonisierung mit pathogenen Spirochäten induziert, oder als therapeutisches Vakzin, das einen günstigen Einfluss bei der Verringerung der Dauer oder der Schwere des klinischen Verlaufs einer Erkrankung bei einem Subjektion infolge einer Infektion mit einer pathogenen Spirochäte oder bei der Verringerung des Reservoirzustands eines Trägers einer pathogenen Spirochäte, z. B. bei Schweinen, Kühen, Ratten oder Hunden, die pathogene Spirochäte beherbergen und ausscheiden, für längere Zeiträume bereit. Solche Zusammensetzungen können mit einer immunogen wirksamen Menge eines Antikörpers gegen BigL1, BigL2 bzw. BigL3 oder mit einem oder mehreren von BigL1, BigL2 und BigL3, die aus dem leptospiralen Pathogen isoliert wurden oder rekombinante BigL-Polypeptide sind, oder mit ihren funktionellen äquivalenten Sequenzen in Exzipienzien oder Additiven oder Hilfsstoffen hergestellt werden.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die pharmazeutische Zusammensetzung, die verwendet wird, um eine Immunreaktion auf eine pathogene Spirochäte in einem Individuum, insbesondere auf Leptospira sp. zu induzieren, die eine immunologisch wirksame Menge an BigL1, BigL2 und BigL3 oder ihrer funktionell äquivalenten Sequenz in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel umfasst. Als „Individuum" bezeichnen wir einen Säuger, einschließlich Menschen, Nagern, Haustieren und Labortieren und Viehbestand. Als „immunologisch wirksame Menge" bezeichnen wir eine Menge an BigL-Polypeptid-Antigen, die notwendig ist, um in einem Individuum eine immunologische Antwort gegen Leptospira oder eine andere Spirochäte oder ein anderes bakterielles Pathogen zu induzieren. Die Erfindung stellt ferner einen Kit bereit für:

1 – Detektion eines der Polypeptide BigL1, BigL2 und BigL3 oder ihrer funktionell äquivalenten Sequenzen;
2 – Detektion von Nucleinsäure, die für BigL1, BigL2 und BigL3 oder ihre funktionell äquivalenten Sequenzen codiert;
3 – Detektion von Antikörpern für solche Polypeptide BigL1, BigL2 und BigL3 oder ihre funktionellen äquivalenten Sequenzen.

Der Kit, der für eine Detektion von BigL-Polypeptiden verwendet wird, umfasst solche, die ein Vehikel verwenden, enthaltend einen oder mehrere Aufnahmebehälter, wobei ein erster Aufnahmebehälter ein Bindungsreagens für BigL1, BigL2 und BigL3 oder ihre funktionell äquivalenten Sequenzen enthält.
Der Kit, der für die Detektion von Polynucleotiden, die für BigL-Polypeptide codieren, verwendet wird, umfasst solche, die ein Vehikel verwenden, enthaltend einen oder mehrere Aufnahmebehälter, wobei ein erster Aufnahmebehälter ein Polynucleotid enthält, das an die Nucleinsäuresequenz, die für BigL1, BigL2 und BigL3 codiert, oder an ihre funktionell äquivalenten Sequenzen hybridisiert.
Der Kit, der zum Detektieren von Antikörpern gegen BigL-Polypeptide einsetzbar ist, umfasst solche, die ein Vehikel verwenden, enthaltend einen oder mehrere Aufnahmebehälter, wobei ein erster Aufnahmebehälter ein Polypeptid von BigL1, BigL2 und BigL3 oder ihren funktionell äquivalenten Sequenzen enthält.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der Beispiele näher beschrieben, wobei diese jedoch nicht als für die vorliegende Erfindung beschränkend angesehen werden sollten.
BEISPIEL 1:
Beispiel 1 A: Bakterienstämme, Plasmide und Medien
Leptospira kirschneri, Serotyp grippotyphosa, Stamm RM52, wurde während eines Ausbruchs von Schweineabortion im Jahre 1983 isoliert. L. interrogans, Serotyp copenhageni, Stamm Fiocruz (L1-130), wurde aus dem Blut eines humanen Leptospirose-Patienten isoliert. L. kirschneri, Serotyp grippotyphosa, Stamm RM52 und andere leptospirale Stämme wurden vom National Leptospirosis Reference Center (National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, U.S. Department von Agriculture, Ames, Iowa) erhalten. Leptospirale Stämme wurden bei 30°C in Johnson-Harris-Rinderserumalbumin-Tween80-Medium (Bovuminar PLM-5 Microbiological Media, Intergen, (2)) kultiviert. Proben des RM52-Isolats mit niedriger Passagenzahl wurden entweder in flüssigem Stickstoff gelagert oder wenigstens 200 Passagen in flüssigem Medium unterzogen, um eine Form mit hoher Passagenzahl zu erzeugen. Der Stamm mit hoher Passagenzahl war unfähig, bei beliebiger Dosis eine letale Infektion bei Hamstern zu erzeugen und war nur bei einer Dosis von 10 durch intraperitoneale Inokulation fähig, Hamster zu infizieren.
Escherichia coli XL1-Blue MRF'⎕mcraA)183⎕mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F'proAB lacI^q7⎕M15 Tn10 (Tetra)] (Stratagene) und E. coli PLK-F' (endA1 gyrA96 hsdR17 lac^– recA1 relA1 supE44 thi-1 [F'lacI^q7⎕M15]) wurden als die Wirtsstämme für eine Infektion mit λZap II-(Stratagene) und λTrip1Ex-(Clontech)Vektoren verwendet. E. coli SOLR (e14^–[mcrA], ⎕[mcrCB-hsdSM-mrr]171 sbcC recB recJ umuC::Tn5[Kan^r] uvrC lac gyrA96 relA1 thi-1 endA1 λ^r, [F' pro AB lacI^qZ⎕M15], Su^– [nicht-supprimierend] und E. coli BM25.8 (supE44 thi ⎕lac-proAB [F'traD36 proAB+, lacI^q7⎕M15] λimm434(kan^r) Pl(cam^r) hsdR(rK^12-mK^12-)) wurden für die in vivo-Exzision des pBluescript- bzw. pTriplEx-Phagemids verwendet. BLR(DE3)pLysS [F^– ompT hsdSB (rB-mB-) gal dem _(srl-recA)306::Tn10(TcR) (DE3) pLysS(CmR)) (Novagen) wurde als der Wirtsstamm für den pRSET-Expressionsvektor (Invitrogen) verwendet. E. coli-Stämme wurden in LB, supplementiert mit 100 μg/ml Ampicillin, 100 μg/ml Carbenicillin oder 25 μg/ml Chloramphenicol, wo es zweckmäßig ist, wachsen gelassen. Die Antibiotika wurden von Sigma bezogen.
Beispiel 1B: Isolierung und Charakterisierung von bigL-Genen:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Identifizierung und Isolierung der bigL-Gene. Genomische DNA wurde aus dem virulenten Stamm L. kirschneri, Serotyp grippotyphosa, Stamm RM52, mit niedriger Passagenzahl nach dem Verfahren von Yelton und Charon (15) hergestellt. Genomische DNA wurden aus einem klinischen Isolat von L. interrogans, Serotyp copenhageni, Stamm Fiocruz L1-130, hergestellt, wobei ein Kit für genomische DNA verwendet wurde (Qiagen). Der QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) wurde verwendet, um gereinigte DNA zu erhalten. Die genomische DNA wurde mit Tsp509I partiell verdaut und nach den gelieferten Instruktionen an λTriplEx-Arme ligiert (Clontech). Der Gigapack III Gold Packaging Extract (Stratagene) wurde verwendet, um ligierte, verdaute genomische DNA in λ-Köpfe zu packen. Der Phagentiter der Bibliothek wurde durch Infektion von E. coli XL1-Blue bestimmt.
Für ein Screening einer genomischen Bibliothek wurden etwa 10³ kbE auf einen E. coli XL1-Blue-Rasen plattiert, auf Nitrocellulosemembran (Schleicher & Schuell) transferiert, mit IPTG sensibilisiert und wie empfohlen verarbeitet (Schleicher & Schuell). Der Nitrocellulosefilter wurde mit 5% Magermilch in Tris-gepufferter Salzlösung (pH 7,8) mit 0,05% Tween 20 (TEST) oder Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4) mit 0,05% Tween 20 (PEST) blockiert und für 1 Stunde mit gepoolten Seren, 1:50 verdünnt, von Patienten mit durch Labor bestätigter Leptospirose inkubiert. Es wurden Seren von Patienten gesammelt, die in urbanen Epidemien in Brasilien zwischen 1996 und 1999 identifiziert worden waren, und zwar während der konvaleszenten Phase der Erkrankung, und diese wurden mit E. coli-Lysaten vor einer Verwendung zur Entfernung von Antikörpern auf E. coli pre-absorbiert. Die Membranen wurden dreimal mit TEST oder PEST gewaschen und für mehr als 1 Stunde mit Kaninchen- oder Ziege-Anti- Humanimmunglobulin-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Sigma), in einer Verdünnung von 1:1000 inkubiert. Die Detektion mit NBT (0,3 mg/ml) und BCIP (0,15 mg/ml) oder die Entwicklung mit ECL-Western-Blot-Detection-Reagenzien (Amersham) mit anschließender Belichtung auf Hyperfilm (Amersham) wurde verwendet, um Plaques mit Antigen-Antikörper-Komplexen zu identifizieren.
Jeder positive Plaque wurde bei 4°C in 1 ml SM (0,1 M NaCl, 8 mM MgSO₄, 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 0,01% in Gelatine mit 1–2 Tropfen Chloroform) gelagert. Die lambda-Plaque-Klone, die mit gepoolten Seren reagierten, wurden zwei zusätzlichen Reinigungsstufen unterworfen. Die genomischen DNA-Fragmente, die in lambda-Bacteriophage insertiert waren, wurden ausgeschnitten, indem E. coli SOLR- oder BM25.8-Stämme mit den lambda-Klonen infiziert wurden, wie es vom Lieferanten (Stratagene bzw. Clontech) beschrieben wurden.
Die Sequenz der ersten 500–700 Nucleotide des Inserts wurde unter Verwendung eines Vektor-spezifischen Primers, der benachbart zu dem Insert bindet, erhalten. Eine Nucleotidsequenz-Analyse von 131 Klonen identifizierte 13, die DNA-Fragment-Inserts hatten, von denen gefunden wurde, dass sie für Tandemwiederholungen mit einer Länge von etwa 90 Aminosäuren codieren. Jede der Wiederholungssequenzen wurde anschließend in Pfam 6.6 (http://pfam.wustl.edu/) als zugehörig zu der Big2-Familie von Bakterien-Immunoglobulinartigen (Big)-Domänen identifiziert.
Um Sequenzen, die für Volllängenproteine codieren, entsprechend der vorhergesagten Aminosäuresequenz zu identifizieren, wurden die Nucleotidsequenzen der Klone aus einzelnen Sequenzen, die durch eine Kombination von „primer walking" und Sequenzierung von verschachtelten Deletionen erhalten worden waren, zusammengebaut. Die Deletionen wurden aus den Plasmidklonen durch Entfernung von Restriktionsfragmenten, die sich aus dem Inneren des Inserts in die Multiklonierungsstellen, die das Insert flankieren, erstrecken, erzeugt. Oligonucleotide wurden synthetisiert und von GIBCO BRL oder von Operon erhalten. Es wurde eine inverse PCR (iPCR) durchgeführt, um Sequenzen zu erhalten, die den Rest der Gene und der flankierenden DNA enthalten. Die Sequenzierungsreaktionen wurden von Yale/Keck Core DNA Sequencing Facility und the University of California, Berkeley Sequencing Facility durchgeführt.
Es wurde festgestellt, dass zwei L. kirschneri-Klone und vier L. interrogans-Klone ein Gen codieren, welches Bakterienimmunglobulin-artiges leptospirales Protein eins (bacterial immunoglobulin-like Leptospiral Protein one), bigL1, genannt wird. Die vollständige Nucleotidsequenz von L. kirschneri bigL1 und die vorausgesagte Aminosäuresequenz des Genprodukts sind in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 gezeigt. Sechs L. kirschneri-Klone wurden gefunden, die ein zweites Gen codieren, welches bigL2 genannt wird. Die vollständige Nucleotidsequenz von L. kirschneri bigL2 ist in SEQ ID NO: 3 gezeigt. L. kirschneri bigL2 scheint ein Pseudogen zu sein, bei dem ein Extra-Adeninrest am Nucleotid 1011 auftritt, was in einer Rasterverschiebungsmutation stromabwärts vom TAG-Stoppcodon resultiert. Durch das Antikörper-Screening mit gepoolten Patientenseren konnten allerdings lambda-Klone mit DNA-Fragmenten, die für bigL2-Genprodukte codieren, identifiziert werden, wahrscheinlich weil die klonierten Fragmente die Rasterverschiebungsmutation nicht haben und in einer Orientierung insertiert wurden, die eine Expression des Produktes erlaubt, das durch Patientenseren erkannt wurde. Die vorausgesagte Aminosäuresequenz des L. kirschneri-bigL2-Genprodukts, ohne die Rasterverschiebungsmutation, ist in SEQ ID NO: 4 gezeigt. Es wurde ein fünfter L. interrogans-Klon gefunden, der für mehrere Big-Wiederholungen codiert, von denen ursprünglich angenommen wurde, dass sie zu BigL1 gehören. Allerdings wurde festgestellt, dass die stromaufwärts gelegene DNA, die von diesem fünften L. interrogans-Klon codiert wird, sich von der stromaufwärts gelegenen Sequenz von bigL1 unterscheidet. Eine Sequenzierung der Regionen, die das bigL1-Gen flankieren, zeigte, dass der fünfte L. interrogans-Klon einem dritten Gen, bigL3 genannt, entspricht, das stromabwärts von bigL1 ist (2). Die vollständige Nucleotidsequenz für bigL3 wurde aus der L. kirschneri-DNA erhalten und ist in SEQ ID NO: 5 gezeigt. Die vorausgesagte Aminosäuresequenz des L. kirschneri-bigL3-Genprodukts ist in SEQ ID NO: 6 gezeigt.
Alle drei bigL-Gene codieren für ein Signalpeptid und eine vermeintliche Signalpeptidasespaltstelle, die in großem Umfang der spirochätalen Lipobox entspricht, wie sie vorher definiert wurde (Haake, D. A. 2000. Spirochetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology. 146: 1491–1504). Ein Vergleich der Sequenzen von bekannten spirochätalen Lipoproteinen zeigt, dass die spirochätale Lipobox viel lockerer definiert ist als die E. coli-Lipobox. Während z. B. die meisten E. coli-Lipoproteine Leu in der 3-Position bezüglich Cys haben, können spirochätale Lipoproteine auch eine Reihe von anderen hydrophoben Aminosäuren in dieser Position haben, einschließlich Val, Phe und Ile. E. coli-Experimente, die eine ortsspezifische Mutagenese von Aminosäuren, die auf Cystein folgen, involvieren, zeigen, dass saure Reste ein Sortieren von Lipoproteinen zu der cytoplasmatischen Membran verursachen. Die Sequenzanalye von leptospiralen Lipoproteinen zeigt, dass ein ähnliches Sortierungssignal in diesen Bakterien vorliegt. Lip31 ist zum Beispiel das einzige Lipoprotein, das eine ungehinderte (nicht ausgeglichene negative Ladung) in den ersten zwei Aminosäuren nach Cystein hat, und ist auch das einzige Lipoprotein, das ausschließlich zu der cytoplasmatischen Membran sortiert wird. Wie die äußeren Membran-Lipoproteine LipL32 und LipL41 haben die BigL-Proteine ungeladene Aminosäuren in den Positionen +2 und +3, was anzeigt, dass sie zu der äußeren Membran sortiert werden.
Nach ihren Signalpeptiden würden alle drei Proteine eine Reihe von Tandemwiederholungen mit einer Länge von 90 Aminosäuren enthalten. Das reife BigL1-Protein würde fast aus dreizehn Wiederholungen bestehen, während dagegen BigL2 und BigL3 jeweils Wiederholungen enthalten, gefolgt von großen Carboxy-terminalen Domänen. Obgleich es einen hohen Grad an Sequenzvariation unter den 31 einzelnen Wiederholungen, die in den drei Proteinen gefunden werden, gibt, wurden alle Wiederholungen durch die Pfam-Datenbank als Bakterienimmunglobulin-artige Big-Protein-Familie mit E-Werten so niedrig wie 4 × e^–30 identifiziert.
Die L. interrogans- und L. kirschneri-Versionen von bigL1, bigL2 und bigL3 waren mit > 90% dna- und Aminosäuresequenz-Identität hoch verwandt. In beiden Spezies gibt es eine Re gion der DNA-Sequenz-Identität, die die 5'-Enden von bigL1 und bigL3 involviert (2). Die Region mit Sequenzidentität erstreckt sich in beiden Genen vom Anfangs-ATG-Startcodon bis zur Position 1890 bp. Die große Region mit DNA-Sequenzidentität zwischen bigL1 und bigL3 resultiert in einer identischen Aminosäuresequenz für die ersten 630 Aminosäuren (Positionen 1–630) von BigL1 (SEQ ID NO: 2) und BigL3 (SEQ ID NO: 6). Diese Identitätsregion entspricht den ersten sechs BigL-Domänenwiederholungen.
BEISPIEL 2
Beispiel 2A: Charakterisierung der bigL-Gene und Detektion von bigL-DNA und -RNA
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verteilung von mehreren Kopien von bigL-Genen unter Leptospira-Species, und Verfahren, um bigL-DNA- und -RNA in Proben zu detektieren.
Southern-Blot-Analyse
Eine Southern-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um mehrere Kopien von bigL-Genen in genomischer DNA aus L. interrogans, Stamm Fiocruz L1-130, L. kirschneri, Stamm RM52, und L. biflexi, Stamm Patoc I, zu identifizieren. DNA-Restriktions- und Modifizierungsenzyme wurden von New England Biolabs bezogen. Genomische DNA wurde aus 500 ml 7-Tage-Kulturen von Leptospira-Zellen mit dem Blood and Cell Culture kit (Qiagen, Valencia, Kalifornien) extrahiert. Etwa 3 μg DNA wurden mit 5–20 Einheiten NsiI über Nacht in einem Endvolumen von 50 μl verdaut. Die DNA wurde dann mit Phenol:Chloroform:Isoamyl gereinigt und mit 100% kaltem Ethanol und 3M Natriumacetat präzipitiert und mit 70%igem Ethanol gewaschen. Gereinigte DNA wurde dann mit 5–20 Einheiten PacI über Nacht in einem Endvolumen von 25 μl verdaut. Die zweifach verdaute DNA wurde in einem 0,8% Agarosegel bei 20 V über Nacht getrennt. Das Gel wurde dann zweimal für 30 Minuten in Denaturierungspuffer (1,5 M NaCl, 0,5 N NaOH) und zweimal für 30 Minuten in Neutralisierungspuffer (1 M Tris (pH 7,4), 1,5 M NaCl) inkubiert. Genomische DNA wurde auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Ind.) nach dem von Southern beschriebenen Verfahren transferiert.
Sonden wurden mit dem PCR Dig Probe Synthesis-Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) synthetisiert. Die Reaktionen wurden nach Angaben des Herstellers in einem Endvolumen von 50 μl kombiniert. Die Temperaturzyklen für die Amplifikation waren 94°C für 5 min, 94°C für 30 s, 57°C für 30 s und 72°C für 1 min mit einer abschließenden Extensionszeit von 7 min nach ingesamt 35 Zyklen. Die Sondensequenzen waren wie folgt: um die bigL-DNA-Fragmente zu amplifizieren, welche für BigL-repetitive Domänen codieren, wurde eine bigL3-DNA-Sequenz ausgewählt, die der Region entspricht, die für BigL3-repetitive Domänen 4–6 codiert, BigL3_395 gat-ttt-aaa-gtt-aca-caa-gc und BigL3_573 aaa-ccg-gac-tac-tta-cct-ttc-c; und um bigL-DNA-Fragmente zu amplifizieren, die für jedes der bigL-Gene spezifisch sind, wurden Sequenzen ausgewählt, die für C-terminale Regionen der BigL-Genprodukte codieren: BigL1.2078p, tta-cgg-cta-cag-gta-m-tta-cg und BigL1.2691p att-gga-aga-ttt-cca-agt-aac-c, BigL2.5121p tat- cta-cgc-tgc-aaa-tgg und BigL2.5865p ttg-ttg-gcg-ata-cgt-ccg, BigL3.5071p cat-aac-tct-cct-cat-aac-a und BigL3.5548p tat-gta-gag-ata-aga-tcc.
Die UV-vernetzte Membran wurde einer Vorhybridisierung bei 42°C für 1 Stunde in Dig Easy Hybridization-Lösung (Roche) unterworfen. Vor der Hybridisierung wurden die Digmarkierten Sonden für 10 Minuten gekocht und schnell für 5 Minuten auf Eis transferiert. Die denaturierten Sonden wurden mit Hybridisierungslösung gemischt und über Nacht mit der Membran bei 42°C inkubiert. Nach der Hybridisierung wurden die Membranen zweimal 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 2XSSC (NaCl, Natriumcitrat), 0,1% SDS gewaschen. Die Membranen wurden dann zweimal für 30 Minuten bei 42°C mit 0,1 SSC, 0,1% SDS gewaschen. Die Membranen wurden für 1–3 Minuten auf einen Biomax ML-Film (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.) zur Detektion von chemilumineszenten Produkten belichtet.
Die 1A und 1B zeigen die Resultate der Southern-Blots. Sonden, die DNA-Sequenzen entsprechen, die für BigL-Wiederholungen codieren, hybridisierten an mehrere DNA-Fragmente in L. kirschneri und interrogans (1A). Im Gegensatz dazu wurde keine Hybridisierung mit verdauter genomischer DNA aus nicht-pathogenem L. biflexi identifiziert. Sonden, die auf Sequenzen basieren, die für spezifische C-terminale Regionen für jedes der L. interrogans-bigL-Genprodukte codieren, hybridisierten an ein einziges Fragment in der verdauten L. interrogans-Genom-DNA, wodurch bestätigt wurde, dass es nur eine Kopie jedes der drei bigL-Gene gibt, die in Beispiel 1 identifiziert wurden (1B). Diese Resultate veranschaulichen ein Verfahren zur Identifizierung spezifisch pathogener Leptospira auf der Basis der Detektion von DNA-Fragmenten, die in nicht-pathogenen Leptospiren nicht gefunden werden.
Beispiel 2B: PCR-Detektion von bigL-Gen-Sequenzen in genomischer Leptospira-DNA
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verteilung von bigL-Gen in pathogener Leptospira. Um bigL-Gene in anderen Leptospira-Species zu detektieren, wurden degenerierte Primer auf der Basis einer Anordnung für bigL-Gene aus L. kirschneri, Stamm RM52, und L. interrogans, Stamm Fiocruz L1-130, identifiziert in Beispiel 1, entwickelt. Die Sequenz des „upstream"-Primers, BigL-1up bezeichnet, ist 5'-(GC)AAAGTTG(TC)(AG)(TC)G(TG)CTTGGCC-3', die den Positionen 46–65 in bigL1 und bigL3 (SEQ ID NO: 1 und 5) bezüglich A des Startcodons entspricht. Die Sequenz des „downstream"-Primers, BigL-2dn genannt, ist 5'-(GC)(AT)ACC(AG)TC(CT)GAAAA(AG)AT(AT)CC-3', die den Positionen 506-487 in bigL1 und bigL3 (SEQ ID NO: 1 und 5) entspricht, und zwar bezogen auf A des Startcodons. Jeder Primer ist 20 Nucleotide lang. Diese Primer wurden so entwickelt, dass sie an bigL2 in den Positionen 97–116 und 590–571 bezüglich des A im Startcodon von bigL2 anlagern (SEQ ID NO: 3).
PCR-Reaktionen wurden mit gereinigter genomischer DNA aus Leptospira-Stämmen mit hoher und niedriger Passagenzahl durchgeführt. In 3 wurden amplifizierte DNA-Fragmente in PCR-Reaktionen mit genomischer DNA von Stämmen in allen vier evaluierten pathogenen Species identifiziert. Die Fragmente hatten die vorausgesagte elektrophoretische Mobilität, basierend auf den Sequenzen von bigL1/bigL3 (461 bp) und bigL2 (494 bp). Amplifizierte DNA- Fragmente wurden in den zwei evaluierten nicht-pathogenen Leptospira-Species nicht identifiziert. Daher zeigt dieses Beispiel die Anwendung dieses PCR-Verfahrens zur spezifischen Identifizierung von DNA aus pathogener Leptospira in Proben.
Beispiel 2C: Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion(RT-PCR)-Detektion von Leptospira-bigL-RNA
Dieses Beispiel veranschaulicht die Detektion von bigL-RNA in Proben. L. kirschneri, Stamm R52, wurde zur späten exponentiellen Phase wachsen gelassen und die Gesamt-RNA wurde aus 1 × 10¹⁰ leptospiralen Zellen unter Verwendung des Heißphenolverfahrens extrahiert und in Wasser nach Ethanol-Präzipitation (ref) resuspendiert. Ungefähr 2 μg leptospiraler RNA wurden mit 6 Einheiten DNase I (Ambion) in 70 μl DNase I-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ in 1X RNA-Secure von Ambion) für 30 Minuten bei 37°C verdaut. Um DNase I zu inaktivieren, wurden 1,75 μl 25 mM EDTA zugesetzt, um die Reaktion zu beenden, und das Enzym wurde durch Wärme für 5 min bei 70°C abgetötet. Eine RT-PCR wurde unter Verwendung von ~200 ng leptospiraler RNA und Omniscript RT durchgeführt, wie es vorgeschrieben ist (Qiagen). Die folgenden Primer wurden verwendet, um die reverse Transkriptase-Reaktion auszulösen:
Die PT-Reaktionen wurden einer DNA-PCR unter Verwendung von Taq-Polymerase (Qiagen) unterworfen. Vor der PCR wurden die folgenden Primer zu den Reaktionen gegeben:
Zusammen mit den Primer, die für die reverse Transkription zugesetzt wurden, werden PCR-Produkte mit 500 bp, 479 bp, 440 bp und 438 bp erwartet. Um eine PCR durchzuführen, wurden die Reaktionsgemische in einen Techne Progene-Thermocycler gegeben. Auf einen anfänglichen Denaturierungsschritt von 95°C für 1 min folgten 30 Zyklen aus Denaturierung bei 95°C für 30 s, Annealing bei 53°C für 30 s und Extension bei 72°C für 30 s. Eine abschließende 72°C-Inkubation wurde 30 s danach durchgeführt.
Die Resultate in 4 zeigen, dass das RT-PCR-Verfahren BigL3-Transkripte und die Kontroll-LipL46-Transkripte detektieren kann. BigL1- und BigL2-Transrkripte wurden nicht identifiziert, was anzeigt, dass, während BigL3 in Leptospira exprimiert wird, BigL1 und BigL2 nicht exprimiert werden können. Darüber hinaus demonstrieren diese Resultate die Anwendung des RT-PCR-Verfahrens zur Identifizierung von BigL-Gentranskripten in Proben.
BEISPIEL 3
Expression und Reinigung von rekombinanten BigL-Proteinen
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung der DNA-Sequenzen von bigL-Genen, um rekombinante BigL-Polypeptide zu exprimieren und zu reinigen. Zwei Oligonucleotidpaare wurden zur Verwendung bei der Expression von zwei Regionen von L. interrogans-BigL3 entwickelt. Die erste Region war eine Region innerhalb BigL3, die den 2. bis 6. repetitiven Domänen entspricht und entsprach den Positionen 131 bis 649 von SEQ ID NO: 6 in der L. kirschneri-BigL3-DNA-Sequenz. Es wurden Oligonucleotide auf der Basis der Sequenz von lambda-L. interrogans-BigL3-Klonen, die in Beispiel 1 identifiziert worden waren, entwickelt, und ihre Sequenzen sind:
Es wurde eine PCR-Amplifikation mit den Oligonucleotiden 45B-1 und 45B-2 und gereinigter L. interrogans-Genom-DNA durchgeführt, um DNA-Fragmente zu erhalten. Diese Fragmente wurden mit XhoI- und NcoI-Enzymen (New Biolabs) verdaut und dann in den pRSETA-Expressionsvektor (Invitrogen) ligiert (16). Das klonierte Produkt wurde unter Verwendung Vektor-spezifischer Primer und eines „primer walking" sequenziert und die Sequenz des 1557 bp-Produkts ist in SEQ ID NO: 7 gezeigt. Die vorausgesagte Sequenz des codierten 519-Aminosäure-Polypeptids, das als BigL3-Region 1 bezeichnet wird, ist in SEQ ID NO: 8 gezeigt.
Es wurde eine zweite Region zur Expression ausgewählt, die die endständigen 200 Aminosäuren der C-terminalen Region von L. interrogans-BigL3 enthielt. Diese Region entsprach den Aminosäurepositionen 1687–1886 von SEQ ID NO: 6 in L. kirschneri-BigL3. Die Oligonucleotide, die verwendet wurden, um diese Region zu klonieren, sind:
Es wurde eine PCR-Amplifikation mit den Oligonucleotiden BIGLCTERM1 und BIGLCTERM2 und gereinigter L. interrogans-Genom-DNA durchgeführt, um DNA-Fragmente zu erhalten. Diese Fragmente wurden mit XhoI- und EcoRI-Enzymen (New Biolabs) verdaut und dann in dem pRSETA-Expressionsvektor (Invitrogen) ligiert (16). Das klonierte Produkt wurde unter Verwendung Vektor-spezifischer Primer und „primer walking" sequenziert und die Nucleotidsequenz des 600 bp-Produkts ist in SEQ ID NO: 9 gezeigt. Die vorausgesagte Sequenz des codierten 200-Aminosäure-Polypeptids, das als BigL3-Region 2 bezeichnet wird, ist in SEQ ID NO: 10 gezeigt.
Rekombinante Proteine, die rBigL-Regionen 1 und 2, wurden in BL21(DE3)-pLysogen (Invitrogen) exprimiert. Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG; 2 mM Endkonzentration, Life Technologies) wurde zu Kulturen von E. coil BLR(DE3)pLysS (Novagen), transformiert mit pRSET-Plasmiden, die für leptospirale DNA-Fragmente codieren, zur Expression von His6-Fusionsproteinen, in der log-Phase gegeben. 6M Guanidinhydrochlorid wurde verwendet, um Kulturpellets zu solubilisieren und His6-Fusionsproteine wurden durch Affinitätschromatographie mit Ni2+-Nitrilotriessigsäure-Agarose (Qiagen und Pharmacia) gereinigt. Die Reinheit der eluierten His6-Fusionsproteine wurde durch Gelelektrophorese und Färbung mit Coomassie-Brilliantblau bestimmt. Proteine wurden gegen PBS, 10% (V/V) Glycerin, 0,025% (G/V) Natriumazid dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Proteinkonzentration mit Bicinchoninsäure bestimmt (42). In 7 ist eine mit Ponceau-S (Sigma Chem Co)-gefärbte Nitrocellulosemembran nach Transfer der gereinigten BigL3-Region 1 gezeigt. Die relative Mobilität des gereinigten BigL3 war ähnlich der geschätzten Molekülmasse von annähernd 58 kD, die auf der Basis der vorausgesagten Aminosäuresequenz des rekombinanten Proteins errechnet worden war.
BEISPIEL 4
Beispiel 4A: Detektion von Antikörpern gegen rekombinante BigL-Proteine
Dieses Beispiel erläutert zwei unter mehreren Verfahren, die BigL-Polypeptide verwenden, um Antikörper in Subjektproben zu detektieren. Darüber hinaus stellt dieses Beispiel Verfahren für serodiagnostische Kits zur Identifizierung einer Infektion bei Subjekten, von denen angenommen wird, dass sie eine Infektion beherbergen, bereit.
Immunoblot-Detektion von Antikörpern gegen BigL-Polypeptide in Proben von infizier ten Subjekten
Gereinigtes rekombinantes BigL3-Region 2-Polypeptid (1 μg/Bahn) (Beispiel 3) wurde einer Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid 12%-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter Verwendung eines diskontinuierlichen Puffersystems unterzogen und auf Nitrocellulosemembranen (Osmomics) transferiert, wie vorher beschrieben wurde (17). Das Nitrocellulosefilter wurde mit TEST mit 5% Magermilch blockiert, für mehr als 1 Stunde mit gepoolten Seren aus Patienten mit durch Labor bestätigter Leptospirose, gefangenen Ratten (Rattus norvegicus)-Reservoiren von Leptospira, die Urin- und Nierenkulturen hatten, die auf pathogene Leptospira positiv waren, und Versuchslaborratten und -kaninchen, die mit L. interrogans, Serotyp copenhageni, Stamm Fiocruz L1-130, Gesamtlysaten immunisiert worden waren, inkubiert. Als Kontrollexperimente wurden Inkubationen mit Seren von gesunden Individuen aus Brasilien, gefangenen Ratten, die keine Kultur oder serologischen Beweis für eine Leptospira-Infektion hatten, und von Laborratten und -kaninchen vor Immunisierung, durchgeführt. Die Seren wurden vor Verwendung 1:100 verdünnt. Nach dem Waschen wurden die Membranen mit Ziege-anti-humanegamma-Kette-Antikörper, konjugiert an alkalische Phosphatase (Sigma), 1:1000 verdünnt, für mehr als 1 Stunde inkubiert. Antigen-Antikörper-Komplexe wurden durch Farbreaktion mit NBT (0,3 mg/ml) und BCIP (0,15 mg/ml) detektiert. Gepoolte Seren von Leptospirose-Patienten, gefangenen Ratten, die mit pathogenen Leptospiren infiziert waren, erkannten gereinigtes rekombinantes BigL3-Region 1-Protein stark. Allerdings zeigten Ratten, die mit Leptospira-Gesamtlysaten immunisiert waren, keine sichtbare Bindung an das BigL3-Polypeptid, was anzeigt, dass, obgleich BigL3 in kultivierten Leptospiren exprimiert wird (Beispiel 2, 4), es eine differentielle Expression des bigL3-Gens geben kann. In vitro können keine ausrei chenden Mengen an nativem BigL3-Protein vorliegen, während Leptospiren während einer natürlichen Infektion in vivo ausreichende Mengen an BigL3 produzieren, um eine starke Immunantwort zu induzieren. Darüber hinaus veranschaulicht dieses Beispiel, dass ein Spektrum von Tieren eine Immunantwort auf BigL3 während einer Infektion produziert, sowie die Detektion dieser Immunantwort und dass die Detektion von Antikörpern auf rekombinantes BigL3-Polypeptid als Verfahren zur Identifizierung einer Infektion bei Subjekten verwendet werden kann.
Um die Verwendung eines Detektionsverfahrens für Antikörper gegen rekombinantes BigL3-Polypeptid weiter zu illustrieren, wurde eine Immunoblot-Evaluierung mit Individuumseren von Patienten mit Labor-bestätigter Leptospirose, von gesunden Individuen aus Brasilien und USA und von Patienten, die mit anderen Diagnosen als Leptospirose im Krankenhaus waren oder in Ambulantkliniken beurteilt wurden. Der Mikroagglutinationstest und eine Kulturisolierung wurde verwendet, um die Diagnose Leptospirose bei Patienten mit klinisch manifestierter Erkrankung zu bestätigen (5). Die Sammlung von Seren von Leptospirose-Patienten erfolgte während einer fünf-Jahres-Überwachung bezüglich Leptospirose in Salvador, Brasilien. Die Sammlung von Seren von Kontrollindividuen wurde von vorher existierenden Serumbanken von hospitalisierten und klinischen Patienten und gesunden Individuen aus Salvador, Brasilien, und durch Spenden vom Center for Disease Control and Prevention, USA, erhalten. Eine Liste der verwendeten Seren ist in Tabelle 1 gezeigt. Seren, die 1:100 verdünnt worden waren, wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren analysiert. Die Feststellung einer sichtbaren Verfärbung der 1 μg-Bande des rekombinanten BigL3-Region 1-Polypeptids im Immunoblot wurde als positive Reaktion angesehen.
8 veranschaulicht, dass Seren von einzelnen Leptospirose-Patienten mit rekombinantem BigL3 reagieren. Tabelle 1 fasst die Feststellungen zusammen, die demonstrieren, dass mehr als 90% der hospitalisierten Patienten und etwa 70% der ambulanten Patienten mit Leptospirose auf rBigL3 während einer aktiven Infektion reagieren. Alle (100%) Leptospirose-Patienten reagieren während der konvaleszenten Phase ihrer Erkrankung auf rBigL3. Tabelle 2 vergleicht Seroreaktivität auf rBigL3 mit Standarddiagnosetests. Die rBigL3-Seroreaktivität war während der Anfangsphase der Erkrankung größer als die, die für Standarddiagnosetests beobachtet wurde. Gesunde Individuen aus den USA und 88% der gesunden Individuen aus Brasilien reagieren nicht auf rBigL3, was beweist, dass diese Reaktion auf rBigL3 spezifisch ist. Die Spezifität der Reaktion steigt auf 100%, Wenn sie auf der Basis der Häufigkeit der IgM-Seroreaktivität unter gesunden brasilianischen Individuen errechnet wird. Zusammen veranschaulichen diese Feststellungen, dass das Verfahren Verwendbarkeit als serologischer Marker einer aktiven Infektion hat und die Basis für einen Kit ist, der für eine Diagnose für Leptospirose verwendet werden kann.
Tabelle 1 fasst auch die Resultate für rBigL3-Seroreaktivität in endemischen Regionen, die ein hohes Risiko für Leptospirose haben, zusammen. 25% der Bevölkerung, die in diesen Regionen wohnt, zeigt rBigL3-IgG-Seropositivität, was anzeigt, dass diese Reaktion ein nützlicher Marker zur Identifizierung einer früheren Infektion sein kann. Unter Patienten mit bestätigter Leptospirose waren 56% während des Zeitraums zwei Jahre nach ihrer Infektion mit Leptospirose seroreaktiv gegen rBigL3 (Tabelle 2). In dem Zeitraum zwischen 2 und 4 Jahren nach Infektion mit Leptospirose zeigten 18% rBigL3-Seroreaktivität. Zusammen veranschaulichen diese Feststellungen, dass ein Kit auf der Basis des Immunblot-Verfahrens eine frühere Infektion mit Leptospirose detektieren kann.
Beispiel 413: ELISA-basierte Detektion von Antikörpern gegen BigL-Polypeptide in Proben von infizierten Subjekten
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass ELISA-Verfahren beim Detektieren von Antikörpern gegen BigL-Polypeptide und bei der Identifizierung von Patienten mit Leptospirose unter solchen mit vermuteter Infektion nützlich sind. Polystyrol-Mikrotiterplatten mit flachem Boden (Corning) wurden bei 4°C über Nacht mit His₆-Fusion-rBigL3, 0,5–100 ng/Well, suspendiert in 0,05 M Natriumcarbonat, pH 9,6, beschichtet (16). Die Platten wurden zweimal mit destilliertem Wasser und dreimal mit PBS, 0,05% (V/V) Tween 20 (PEST) gewaschen. Die Platten wurden mit Blockierungslösung (PEST/1% [G/V] Rinderserumalbumin) für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und nach vier Waschgängen mit PEST bis zur Verwendung bei –20°C gelagert. Die Wells wurden mit 50 μl-Seren, 50- bis 200-fach in Blockierungslösung verdünnt, für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Bewegung inkubiert. Nach vier Waschgängen mit PEST wurden Wells mit 50 μl von 5000- bis 20.000-fach Verdünnungen von anti-humane μ- oder γ-Kette-Ziegenantikörpern, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (Sigma), für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Bewegung inkubiert. Danach wurden die Platten zweimal mit PEST und dreimal mit PBS gewaschen und mit 50 μl/Well 0,01% (G/V) 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin in Substratpuffer (0,03% [V/V] Wasserstoffperoxid, 25 mM Citronensäure, 50 mM Na₂HPO₄, pH 5,0] für 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Farbreaktion wurde durch Zusatz von 25 μl 2N H₂SO₄ gestoppt und die Extinktion bei 450 nm wurde in einem Emax-Mikroplatten-Lesegerät (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) gemessen.
Es wurden Anfangsassays durchgeführt, um die Antigenkonzentration (μg/Well) zu bestimmen, die am besten zwischen ELISA-Reaktionen von Serumproben von durch Labor bestätigten Leptospirose-Fällen (n = 4) und gesunden Individuen aus einem endemischen Bereich für Leptospirose in Brasilien (n = 4) unterschied. Checkerboard-Titrationen wurden mit 50-, 100- oder 200-fachen Serumverdünnungen und Antigenkonzentrationen pro Well von 25, 50, 100 und 200 ng durchgeführt. 6 veranschaulicht, dass signifikant höhere Extinktionswerte bei allen Serumverdünnungen und rBigL3-Polypeptid-Konzentrationen für Leptospirose-Patienten als für Kontrollinviduen beobachtet wurden.
In anschließenden Assays zur Bestimmung der Sensitivität und Spezifität wurden Platten mit 50 ng rBigL3 beschichtet. Inkubationen wurden mit 50- und 10.000-fachen Verdünnungen von primären Seren bzw. sekundärem Antikörper-Konjugat durchgeführt. Individuumserumpro ben wurden zweifach getestet und der Mittelwert der zwei Messungen wurde zur Analyse errechnet. Gepaarte Messungen, die sich um mehr als 10% unterschieden, wurden erneut getestet. Eine positive Kontrollserumprobe, die mit allen rekombinanten Antigenen reagierte, und eine negative Kontrollserumprobe wurde zweifach bei jeder Platte als Qualitätskontrollmaßnahme eingeschlossen. 7 veranschaulicht, dass Leptospirose-Patienten in der akuten Phase der Erkrankung signifikant höhere Extinktionen für IgM- und IgG-Seroreaktivität als Kontrollindividuen hatten (7). Diese Differenzen erhöhten sich, wenn Extinktionswerte für Patienten in der konvaleszenten Phase der Erkrankung verglichen wurden. Diese Experimente veranschaulichen, dass ein ELISA-basiertes Verfahren zum Detektieren von Antikörpern gegen rBigL3-Polypeptid zu Identifizieren einer Infektion mit Leptospirose nützlich ist und als Kit zur Diagnose verwendet werden kann.
BEISPIEL 5
Induktion einer Immunantwort gegen Leptospira in Subjekten
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass eine Immunantwort gegen BigL-Proteine durch Immunisierung mit rekombinanten BigL-Proteinen induziert werden kann. Gereinigtes rekombinantes BigL3-Polypeptid, das von L. interrogans stammte, wurde mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren erhalten. Laborratten (Stamm Wistar) wurden mit 40 μg rBigL3 in Freund's-Adjuvans (Sigma) immunisiert und subkutan inokuliert. Zusätzliche Immunisierungen wurden mit 20 μg rBigL3 in den Wochen 3 und 6 durchgeführt. Blut wurde 7 Wochen nach der ersten Immunisierung gesammelt und zu Serum verarbeitet. Immunoblots mit rBigL3 (1 μg/Bahn) wurden wie in Beispiel 4 hergestellt. 9 veranschaulicht die Seroreaktivität von mit rBigL3 immunisierten Ratten. rBigL3 war ein wirksames Immunogen, das Immunoblot-rBigL3-Seroreaktivität mit Titern von größer als 1:2500 nach insgesamt drei Immunisierungen induziert. Darüber hinaus erkannten Antikörper, die gegen rBigL3-Polypeptid entwickelt worden waren, native Antigene in Leptospira-Gesamtlysaten (10⁸ Leptospiren pro Bahn) (9). Eine Bande mit einer relativen Mobilität von 200 kD wird in Immunoblot schwach gefärbt, während es intensiver gefärbte Banden mit geringerer relativer Mobilität gibt, die den Abbau des 200 kD-Proteins oder von BigL-Proteinen mit hohem Molekulargewicht darstellen können. Seroreaktivität gegen diese nativen Antigene ist spezifisch, da in den pre-immunen Seren keine Reaktionen beobachtet werden.
Immunogenitätsexperimente wurden mit gereinigten rekombinanten BigL-Polypeptiden, die von L. kirschneri stammten, durchgeführt. Gereinigte rekombinante Proteine wurden auf ein präparatives 12% SDS-PAGE-Gel aufgeladen und durch Elektrophorese in das Trennungsgel wandern gelassen. Eine Bande, die 100–200 μg rekombinantes Protein enthielt, wurde aus dem Gel ausgeschnitten, getrocknet, zu Pulver vermahlen, in 1 ml Wasser gelöst, mit 1 ml Freund's vollständigem Adjuvans (Sigma) vermischt und subkutan und intramuskulär in weiße Neuseelandkaninchen (Harlan Sprague Dawley), die frei von leptospiralen Antikörpern waren, inokuliert. Zusätzliche Immunisierungen mit ähnlichen Mengen an Fusionsprotein in gepulvertem Acrylamidgel, vermischt mit Freund's unvollständigem Adjuvans (Sigma), wurden vier und acht Wochen nach der ersten Immunisierung verabreicht. Blut von den Kaninchen wurde zehn Wochen nach der ersten Immunisierung gesammelt und zu Serum verarbeitet (Harlow, 1988). Immunoblots wurden wie vorher beschrieben (Guerreiro et al Infect Immun 2001) mit Konzentrationen von 108 Leptospiren pro Bahn durchgeführt.
10 veranschaulicht, dass eine Immunisierung mit rBigL3, das von L. kirschneri abgeleitet ist, hohe Level an Antikörpertiter gegen native BigL3-Polypeptide in L. kirschneri und anderen pathogenen Leptospira-Species, z. B. L. interrogans, induziert. Zusammen veranschaulichen diese Feststellungen, dass eine Immunisierung mit rBigL3-Polypeptiden eine Immunantwort gegen andere Species pathogener Spirochäten als die Species, die zur Entwicklung des rekombinanten rBigL3-Polypeptids verwendet wurden, induziert. Darüber hinaus können die Antikörper, die durch dieses Immunisierungsverfahren produziert werden, eingesetzt werden, um pathogene Spirochäten in Proben zu detektieren.
Schließlich beweist dieses Beispiel, dass das Vorliegen von nativen BigL-Polypeptiden in virulenten Stämmen mit niedriger Kulturpassagenzahl und nicht avirulenten abgeschwächten Stämmen hoher Passagenzahl beobachtet wird (10). Seren von mit rBigL3 immunisierten Kaninchen erkannten ein vorausgesagtes 200 kDa, das BigL3 entspricht, in Leptospira-Gesamtlysaten von virulenten und nicht avirulenten abgeschwächten Stämmen. Dieses Beispiel veranschaulicht, dass BigL-Proteine Marker für Virulenz sind und dass Antikörper gegen BigL-Proteine als Verfahren zur Identifizierung virulenter Stämme eingesetzt werden können. Da BigL selbst ein Virulenzfaktor sein kann, wird eine Induktion einer Immunantwort gegen BigL-Proteine, wie in dem Beispiel demonstriert wurde, zur Anwendung als ein Vakzin einsetzbar sein.
Entsprechend wird die Erfindung nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt.
Literaturstellen:

1. Levett PN. Leptospirosis. Clin. Microbiol Rev. 2001; 14(2): 296–326.
2. Faine SB, Adler B, Bolin C, Perolat P. Leptospira and leptospirosis. 2. Ausgabe Melbourne, Australia: MediSci; 1999.
3. Farr RW. Leptospirosis. Clin. Infect Dis. 1995; 21(1): 1–6; quiz 7–8.
4. Lomar AV, Diament D, Torres JR. Leptospirosis in Latin America. Infect Dis Clin North Am. 2000; 14(1): 23–39, vii-viii.
5. Ko AI, Galvao Reis M, Ribeiro Dourado CM, Johnson WD, Jr., Riley LW. Urban epidemic of severe leptospirosis in Brazil. Salvador Leptospirosis Study Group. Lancet. 1999; 354(9181): 820–5.
6. Bughio NI, Lin M, Surujballi OP. Use of recombinant flagellin protein as a tracer antigen in a fluorescence polarization assay for diagnosis of leptospirosis. Clin Diagn Lab Immunol. 1999; 6(4): 599–605.
7. Park SH, Ahn BY, Kim MJ. Expression and immunologic characterization of recombinant heat shock protein 58 of Leptospira species: a major target antigen of the humoral immune response. DNA Cell Biol. 1999; 18(12): 903–10.
8. Haake DA, Walker EM, Blanco DR, Bolin CA, Miller MN, Lovett MA. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 1991; 59(3): 1131–40.
9. Haake DA, Champion CI, Martinich C, et al. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J. Bacteriol. 1993; 175(13): 4225–34.
10. Haake DA, Martinich C, Summers TA, et al. Characterization of leptospiral outer membrane lipoprotein LipL36: downregulation associated with late-log-phase growth and mammalian infection. Infect Immun. 1998; 66(4): 1579–87.
11. Haake DA, Mazel MK, McCoy AM, et al. Leptospiral outer membrane proteins OmpL1 and LipL41 exhibit synergistic immunoprotection. Infect Immun. 1999; 67(12): 6572–82.
12. Haake DA, Chao G, Zuerner RL, et al. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infect Immun. 2000; 68(4): 2276–85.
13. Shang ES, Exner MM, Summers TA, et al. The rare outer membrane protein, OpmL1, of pathogenic Leptospira species is a heat-modifiable porin. Infect Immun. 1995; 63(8): 3174–81.
14. Shang ES, Summers TA, Haake DA. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding LipL41, a surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 1996; 64(6): 2322–30.
15. Yelton DB, Charon NW. Cloning of a gene required for tryptophan biosynthesis from Leptospira biflexa serovar patoc into Escherichia coli, Gene. 1984; 28(2): 147–52.
16. Flannery B, Costa D, Carvalho FP, et al. Evaluation of recombinant Leptospira antigen-based enzyme-linked immunosorbent assays for the serodiagnosis of leptospirosis. Journal of Clinical Microbiology. 2001; 39(9): 3303–3310.
17. Guerreiro H, Croda J., Flannery B, et al. Leptospiral proteins recognized during the humoral immune response to leptospirosis in humans. Infect Immun. 2001; 69(8): 4958–68.

SEQUENZPROTOKOLLE
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Im Wesentlichen gereinigtes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID NO: 2 angegeben ist.
Isoliertes Polynucleotid-Segment, das eine Sequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer Polynucleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz codiert, wie sie in SEQ ID NO: 2 angegeben ist, und (b) einer Polynucleotidsequenz SEQ ID NO: 1.
Im Wesentlichen gereinigtes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID NO: 4 angegeben ist.
Isoliertes Polynucleotid, das eine Sequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer Polynucleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz codiert, wie sie in SEQ ID NO: 4 angegeben ist, und (b) einer Polynucleotidsequenz SEQ ID NO: 3.
Im Wesentlichen gereinigtes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID NO: 6 angegeben ist.
Isoliertes Polynucleotid, das eine Sequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer Polynucleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz codiert, wie sie in SEQ ID NO: 6 angegeben ist, und (b) einer Polynucleotidsequenz SEQ ID NO: 5.
Im Wesentlichen gereinigte Polypeptidsequenz, ausgewählt aus SEQ ID NO: 8.
Isoliertes Polynucleotid-Segment, das eine Sequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer Polynucleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz codiert, wie sie in SEQ ID NO: 8 angegeben ist, und (b) einem Polynucleotid SEQ ID NO: 7.
Im Wesentlichen gereinigte Polypeptidsequenz, ausgewählt aus SEQ ID NO: 10.
Isoliertes Polynucleotid-Segment, das eine Sequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer Polynucleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 10 angegeben ist, codiert; (b) einer Polynucleotidsequenz SEQ ID NO: 9.
Antikörper, die spezifisch an das im Wesentlichen gereinigte Polypeptid, das in den Ansprüchen 1, 3, 5, 7 oder 9 definiert ist, binden.
Verfahren zum Detektieren von Pathogenen in einer Probe, umfassend In-Kontakt-Bringen einer Probe, von der angenommen wird, dass sie eine pathogene Spirochäte enthält, mit einem Reagens, das spezifisch an die Pathogen- spezifische Zellkomponente bindet, und Detektieren der Bindung des Reagens an die Komponente, wobei die Komponente ausgewählt wird aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 und 10.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Reagens, das die Pathogen-spezifische Zellkomponente bindet, ein Antikörper gegen das BigL1-, BigL2-, oder BigL3-Polypeptid oder Polypeptide von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ist.
Kit, der für die Detektion von BigL1-, BigL2- und BigL3-Polypeptiden oder von Antikörpern, die an BigL1-, BigL2-, BigL3-Polypeptide oder Polypeptide binden, einsetzbar ist, wobei die im Kit vorliegenden Proteine ausgewählt sind aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder 10, oder Antikörpern, die spezifisch an die genannten Proteine binden, einsetzbar ist.