DE60316189T2 - P153- und p156-antigene zur immundiagnose von ehrlichiose in hunden und menschen und verwendungen davon - Google Patents

P153- und p156-antigene zur immundiagnose von ehrlichiose in hunden und menschen und verwendungen davon Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekular- und Immundiagnostik. Im Speziellen betrifft die vorliegende Erfindung Spezies-spezifische immunreaktive Proteinorthologen (∼200 kDa) von Ehrlichia canis und Ehrlichia chaffeensis, die verwendbar sind für die Spezien-spezifische Diagnose von Hunde-Ehrlichiosis und menschlicher monozytrophischer Ehrlichiosis.
  • Monozytische Hunde-Ehrlichiosis ist eine potenziell fatale Zeckenbisskrankheit bei Hunden mit weltweiter Verbreitung hauptsächlich verursacht durch den Rickettsienerreger Ehrlichia canis (Huxsoll et al., 1970). E. canis ist ein notwendiges intrazelluläres Bakterium, das Tropismus für Monozyten und Makrophagen aufweist (Nyindo et al., 1971) und persistente Infektionen in dem Wirbeltierwirt hervorruft (Harrus et al., 1998). Die Krankheit ist charakterisiert durch drei Stadien: Das akute Stadium, das 2 bis 4 Wochen dauert; das subklinische Stadium, in dem Hunde persistent infiziert für Jahre verbleiben können, aber keine klinischen Anzeichen aufweisen, gefolgt von der chronischen Phase, in der sich bei vielen Hunden die Krankheit stufenweise auf Grund von Knochenmarkshypoplasie verschlechtert und die Prognose weniger positiv wird (Troy et al., 1990).
  • Ehrlichia canis infiziert und verursacht Ehrlichiosis in Tieren, die zur Canidae-Familie gehören. Hunde-Ehrlichiosis besteht aus einer akuten und einer chronischen Phase. Die akute Phase ist charakterisiert durch Fieber, serös nasalen und okularen Ausfluss, Appetitlosigkeit, Depression und Gewichtsverlust. Die chronische Phase ist charakterisiert durch schwerwiegende Panzytopenie, Epistaxis, Hämaturie, Blut im Stuhl in Verbindung mit mehr schwerwiegenden klinischen Anzeichen der akuten Krankheit. Hunde sprechen gut auf Doxycyclin an, wenn sie frühzeitig während des Verlaufs der Krankheit behandelt werden. Chronisch infizierte Hunde dagegen sprechen nicht gut auf das Antibiotikum an. Deshalb ist die frühzeitige Diagnose für die Behandlung von Hunde-Ehrlichiosis sehr bedeutend.
  • Die Behandlung der Krankheit in der akuten Phase ist für die beste Prognose wichtig. Hämatologische Unregelmäßigkeiten wie Leukopenie und Thrombozytopenie liefern oft nützliche Anzeichen von Hunde-Ehrlichiosis und sind wichtige Faktoren bei der anfänglichen Diagnose (Troy et al., 1990). Dennoch ist die Diagnose schwierig, da die klinische Darstellung von Hunde-Ehrlichiosis nicht spezifisch ist.
  • Die Diagnose von Hunde-Ehrlichiosis über serologische Verfahren wie dem indirekten Fluoreszenz-Antikörpertest (IFA) ist aufgrund seiner Einfachheit, Zuverlässigkeit und Kosteneffizienz zum Standardverfahren geworden (Troy et al., 1990). Dennoch schließen Defizite des indirekten Fluoreszenz-Antikörpertests die Unfähigkeit ein, eine Spezienspezifische Diagnose zu machen, aufgrund von antigener Kreuzreaktivität mit anderen sehr ähnlichen Ehrlichia-Arten, die Hunde infizieren (E. chaffeensis, E. ewingii, Anaplasma phagocytophilum und A. platys). Subjektive Interpretationen können ebenfalls zu falschnegativen Ergebnissen führen, oder zu falsch-positiven, verursacht durch kreuzreaktive Antigene. Andere diagnostische Verfahren wie die Polymerasekettenreaktion (PCR) sind für den spezifischen Nachweis von E. canis entwickelt worden und wären nach Dokumentationen sensitiver als Zellkulturisolation, dieses Verfahren benötigt jedoch spezialisierte Schulung und teures Equipment (McBride et al., 1996). Die Isolation des Organismus ist zeitintensiv, und nur wenige Laboratorien sind konsistent erfolgreich mit diesem Verfahren. Außerdem werden zusätzliche Tests bei der Benutzung dieses Verfahrens benötigt, um das Isolierte für die Bestimmung einer spezifischen Ätiologie zu charakterisieren.
  • Gemeinsame serologische kreuzreaktive Antigene für E. canis und E. chaffeensis sind dokumentiert worden. Einige von den hauptserologischen kreuzreaktiven Proteinen weisen eine Molekularmasse von 28 bis 30 kDa auf (Chen et al., 1997; Rikihisa et al., 1994), und es ist inzwischen bekannt, dass diese Proteine von homologen Multigenfamilien kodiert werden (Ohashi et al, 1998 a, b). Es gibt 22 bzw. 25 Homologe aber nicht identische p28-Gene, die in E. chaffeensis und E. canis identifiziert und sequenziert wurden. Ähnliche Intraspezien und Interspezifische Stammhomologie wurde zwischen den p28-Proteinen von E. canis und E. chaffeensis beobachtet, was die serologische Kreuzreaktivität von diesen Proteinen erklärt (McBride et al., 1999).
  • Ein kürzlicher Bericht stellte dar, dass das rP28-Protein von E. chaffeensis ein unsensitives Mittel in der Diagnose von menschlicher monozytrophischer Ehrlichiosis (HME) war (Yu et al., 1999a). Der eigentliche Grund hierfür scheint die Variabilität des P28-Proteins bei verschiedenen Stämmen von E. chaffeensis zu sein (Yu et al., 1999b). Umgekehrt sind die p28-Gene, die in E. canis identifiziert wurden, erhalten bei geographisch verstreuten Stämmen, und das E. canis rP28 ist bewiesenermaßen nützlich für die Diagnose von Hunde-Ehrlichiosis (McBride et al., 1999; Ohashi 1998a). Andere homologe immunreaktive Proteine einschließlich der Glycoproteine in E. canis (gp140) und E. chaffeensis (gp120) sind kloniert worden (Yu et al., 1997, 2000). Die Reaktivität des rgp120 von E. chaffeensis hat dem indirekten Fluoreszenz-Antikörper für die Serumdiagnose von menschlicher monozytotropischen Ehrlichiosis gut entsprochen und vorausgehende Studien mit dem rgp140 von E. canis deuten daraufhin, dass es ein sensitives und zuverlässiges immundiagnostisches Antigen sein könnte (Yu et al., 1999a, 2000).
  • Der Stand der Technik ist unzureichend in Bezug auf spezifische Antigene für serologische und molekulare Diagnostik von E. canis und E. chaffeensis genauso wie Verfahren für solche Verwendung. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese lange Notwendigkeit und das Bedürfnis auf diesem Gebiet.
  • Ein höchst immunreaktives 43 kD Protein (p43) von Ehrlichia canis wurde identifiziert (U.S. Pat. Nr. 6,355,777). Als ein immundiagnostisches Antigen, wies das p43 eine 96 %-ige Genauigkeit im Vergleich mit dem indirekten Fluoreszenz-Antikörpertest auf und stellte eine Spezien-spezifische Diagnose von E. canis-Infektionen zur Verfügung. Weitere Untersuchungen offenbarten, dass das E. canis p43 den N-terminalen Teil eines Proteins mit einer prognostizierten molekularen Masse von 153 kD, dem größten immunreaktiven Protein beschrieben in Ehrlichia spp., repräsentiert. Analysen von rekombinant expremierten Fragmenten des p153 durch Proteingelelektrophorese zeigten eine größer als prognostizierte molekulare Masse (∼10 bis 30 %) und die Präsenz von Kohlenhydratglykanen in N- und C-terminalen Fragmenten, die andeuten, dass das p153 ein Glykoprotein ist.
  • Eine BLAST-Suche wurde für die verfügbare E. chaffeensis-Genomsequenz (95 %) durchgeführt, und das Gen, das den p153 Orthologen kodiert, wurde in E. chaffeensis identifiziert. Die E. canis p153 (4263-bp)- und E. chaffeensis p156 (4389-bp)-Gene hatten ähnliche chromosomale Positionen, stromabwärts von den homologen (∼87 %) Desoxyguanosintriphosphat-Triphosphohydrolase-Genen und homologen (∼90 %) intergenen Sequenzen vorangehend den offenen Leserastern. Nukleinsäuresequenzhomologie (50 %) wurde zwischen den Glykoprotein-Genen, die durch vorherige Funde in Bezug auf genetische Divergenz des p43-Genfragments bestätigt wurden, und den p153- und p156-Proteinen, die Aminosäureähnlichkeiten von 32 % aufwiesen, beobachtet. Ein natives E. canis-Protein mit einer Molekularmasse von 200 kD reagierte mit Antiserum, das gegen die N-terminale Region (p43) des p153 produziert wurde, so dass nahe liegend ist, dass das native Protein nachtranslational modifiziert wurde. Ebenso umfasst ein rekombinantes Protein die N-terminale Region des E. chaffeensis p156, größer migriert als prognostiziert (200 kD), und Kohlenhydrat wurde auf dem rekombinanten Protein nachgewiesen. Ein hauptimmunreaktives Epitop wurde in diesem N-terminalen Fragment identifiziert. Die chromosomale Position, Aminosäurehomologie und biophysikalische Eigenschaften bestätigen die Schlussfolgerung, dass die p153- und p156-Glykoproteine (bezeichnet als gp200s) Spezien-spezifische immunreaktive Orthologen sind.
  • In den N-(P43)- und C-terminalen Regionen des E. canis p153 und der N-terminalen Region des E. chaffeensis p156 Orthologen sind wichtige immunreaktive Epitope identifiziert worden, die wichtig sein werden für serologische Diagnostiken und Impfstoffe. Darüber hinaus sind Gene, die diese Proteine kodieren, Spezien-spezifisch und werden für die Entwicklung von molekularbasierten Diagnostiken nützlich sein.
  • Andere und weitere Aspekte, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der derzeitig bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung offensichtlich werden. Diese Ausführungsformen werden für den Zweck der Offenbarung gemacht.
  • Es sei auf die genauere Beschreibung der oben kurz zusammengefassten Erfindung in Bezug auf die bestimmten Ausführungsformen in den beigefügten Abbildungen hingewiesen, so dass die oben genannten Eigenschaften, Vorteile und Gegenstände der Erfindung, genau wie Anderes, was deutlich werden wird, erreicht und im Detail verstanden werden kann. Diese Abbildungen bilden einen Teil der Beschreibung. Dennoch muss beachtet werden, dass die beigefügten Abbildungen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen und deshalb nicht als Limitierung in ihrem Umfang betrachtet werden dürfen.
  • 1A und 1B zeigen, das Lipman-Pearson-Aminosäurealignment von E. chaffeensis p156 (obere Linie) und den E. canis p153 (untere Linie) Proteinorthologen. Aminosäureidentitäten, konservierte (:) und halb-konservierte (.) Substituenten werden in der Mitte gezeigt.
  • 2A und 2B zeigen die Expression von rekombinanten Proteinfragmenten von E. canis p153 (A) und E. chaffeensis (B) und die Detektion mit dem Anti-V5-Antikörper. E. canis p153, Reihe 1, N-terminales Fragment (1107-bp, nt-1-1107), Reihe 2, inneres Fragment (910-bp, nt-1080-1990), Reihe 3, inneres Fragment (1000-bp, nt-1950-2950) und Reihe 4, C-terminales Fragment (1280-bp, nt-2940-4220). E. chaffeensis p156, Reihe 1, N-terminales Fragment (1545-bp, nt-125-1675), Reihe 2, inneres Fragment (1365-bp, nt-1685-3050) und Reihe 3, C-terminal (1365-bp, nt-2950-4315).
  • 3A zeigt den Western-Immuno-Blot des E. canis p153 rekombinanten Fragmentes. Reihe 1, N-terminales Fragment (1107-bp, nt-1-1107), Reihe 2, inneres Fragment (910-bp, nt-1080-1990), Reihe 3, inneres Fragment (1000-bp, nt-1950-2950) und Reihe 4, C-terminales Fragment (1280-bp, nt-2940-4220).
  • 3B zeigt den Kohlenhydratnachweis des entsprechend aufgereinigten rekombinanten Fragmentes des E. canis p153, das unter Verwendung des pRSET-Expressionsvektors in E. coli expremiert wurde. Glykane, angehängt an die rekombinanten Proteine, wurden oxidiert, mit Biotin markiert und mit Streptavidin-Alkalinphosphatase detektiert.
  • 4A zeigt einen Western-Blot der E. chaffeensis p156 rekombinanten Fragmente (Reihe 1–3) mit menschlichem (linke Tafel) und Hundeserum (rechte Tafel). Reihe 1, E. chaffeensis p156 N-terminales Fragment (1545-bp, nt-125-1675), Reihe 2, inneres Fragment (1365-bp, nt-1685-3050) und Reihe 3, C-terminal (1365-bp, nt-2950-4315). Die rekombinant expremierten Proteine stellen ∼95 % des E. chaffeensis p156 dar.
  • 4B zeigt den Kohlenhydratnachweis der drei entsprechenden rekombinanten E. chaffeensis p156 Proteine (Reihe 1–3).
  • 5 zeigt einen Western-Blot, der die Proteine des vollständigen E.canis Zelllysats mit polyklonalen Antiserum von einem mit E. canis infizierten Hund (Reihe 1) und antirekombinantes p43 (gp200) (Reihe 2) und antirekombinantes gp140 (Reihe 3) polyklonales Kaninchenserum.
  • Die E. canis p43-Gensequenz wurde bereits als 1173-bp beschrieben (U.S. Pat. Nr. 6,355,777), aber weitere Analyse offenbarte einen DNA-Sequenzierungsfehler, der zu einem künstlichen Stopkodon und einer gekürzten Gensequenz führte. Unter Verwendung des Primer-Adaptor-Gen-Wanderungs-Verfahrens (primer-Adaptor gene walking method), wurde eine zusätzliche 4.5-kbp Sequenz stromabwärts von der 2.4-kbp in dem Original p43-Klon bestimmt. Die nicht komplette p43-Gensequenz wurde durch die Offenbarung eines offenen Leserasters von 4263-bp vervollständigt, das ein Protein mit einer vorhergesagten Molekularmasse von 153 kD kodiert (bezeichnet als p153). Stromaufwärts von dem p153-Gen befindet sich ein offenes Leseraster, das eine Desoxyguanosintriphosphat-Triphosphohydrolase kodiert und eine intergene nicht kodierende Region, die dem p153-Gen, das eine hohe Nukleinsäurehomologie (87 % bzw. 90 %) zwischen E. canis und E. chaffeensis aufweist, vorangeht.
  • Eine BLAST-Suche der E. chaffeensis-Genomsequenz mit dem 2.4-kbp p43-Klon identifizierte eine höchst homologe Nukleinsäuresequenz. Ein großes offenes Leseraster (4389 bp) ungefähr identisch in der Größe zu dem E. canis p153 wurde in demselben chromosomalen Bereich gefunden, in Bezug auf die stromaufwärts homologe Kodierung und intergene Nukleinsäuresequenz und kodierend ein Protein mit einer prognostizierten Molekularmasse von 156 kD (p156). Es wurde zwischen den E. canis p153- und dem E. chaffeensis p156-Genen eine Nukleinsäuresequenzhomologie von (∼50 %) beobachtet; dennoch weisen die Proteine eine gesamte Aminosäuresequenzähnlichkeit von 32 % auf (1).
  • Genkonstrukte, expremiert in E. coli, die das E. chaffeensis p156-Protein (nt-125-1670; nt-1685-3050) und vier rekombinante Fragmente von E. canis p153 (nt-1-1107 (p43); nt-1080-1990; nt-1950-2950; nt-2940-4220) darstellen, wurden in E. coli expremiert (2). Die E. canis N-terminalen (nt-1-1107) und C-terminalen (nt-2940-4220) rekombinant expremierten Proteine wiesen eine hohe Immunreaktivität auf (3A). Dennoch war nur das N-terminale Fragment (nt-125-1670) von E. chaffeensis p156 immunreaktiv (4A).
  • Die E. canis (nt-1-1107 und nt-2940-4420) und E. chaffeensis p156 rekombinanten Proteinfragmente (nt-125-1607) wanderten weiter als erwartet in der SDS-PAGE, was darauf hindeutet, dass nachtranslationale Modifikation dieser Fragmente stattgefunden hatte. Anschließend wurden Kohlenhydrate in den E. canis p153- und E. chaffeensis p156-Peptidfragmenten nachgewiesen (3A und 4B).
  • Anti-p43-Antikörper reagierten mit einem nativen Protein von ungefähr 200 kD aus dem vollständigen E. canis Zelllysat. Darüber hinaus wurde dieses 200 kD Protein auch von Sera eines mit E. canis infizierten Hundes erkannt (5). Eine Teilgensequenz, zuvor identifiziert als p43 (N-terminaler Teil von p153), wurde der GenBank Zugangsnummer AF252298 zugeordnet. Die geänderte Sequenzierung, kodierend p153, wurde der GenBank Zugangsnummer AY156950 zugeordnet.
  • Die chromosomale Position, Aminosäurehomologie und biophysikalische Eigenschaften unterstützen die Schlussfolgerung, dass die p153- und p156-Glykoproteine (bezeichnet als gp200s) Spezien-spezifische immunreaktive Orthologen sind. Diese Proteine finden potenzielle Verwendung in der Impfstoffentwicklung und können als sensitive und zuverlässige serumdiagnostische Wirkstoffe für die Diagnose von Ehrlichia-Infektionen verwendet werden. Dieses wird durch vorherige Funde bestätigt, die die Immunreaktivität und die potenzielle Verwendung von dem E. canis p43 als serodiagnostisches Antigen zeigten (U.S. Pat. Nr. 6,355,777). Die Reaktion mit Antikörpern gegen p43 hatte eine 100 %-ige Übereinstimmung mit Proben, die einen indirekten Fluoreszenzantikörper (IFA)-Titer von >40 hatten und mit verschiedenen Proben mit einem indirekten Fluoreszenzantikörper-Titer von <40 reagierten. Die schwache Reaktivität von verschiedenen indirekten Fluoreszenzantikörper-negativ-Proben mit den p43-Antikörpern deutet darauf hin, dass das p43-Protein ein sensitiveres serodiagnostisches Antigen sein könnte. Die in der vorliegenden Erfindung präsentierten Ergebnisse zeigen, dass p43 ein Teil eines größeren p156-Proteins in E. canis ist.
  • Die aktuelle Erfindung ist auf isolierte Polynukleotide, die das Ehrlichia canis immunreaktive Oberflächenprotein p153 und das Ehrlichia chaffeensis p156-Protein kodieren, gerichtet. Vorzugsweise kodieren die isolierten Polynukleotide die Proteine mit den Aminosäurensequenzen gezeigt in SEQ ID NO:1 und 2. Andernfalls kann die DNA in der Nukleotidsequenz in Bezug auf die Degeneration des genetischen Kodes abweichen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Vektoren, die diese isolierten Polynukleotide und notwendige regulatorische Elemente für die Expression von der DNA in einer Zelle umfassen; isolierte und aufgereinigte p153- und p156-Proteine; und Antikörper, die gegen diese Proteine gerichtet sind.
  • Die vorliegende Erfindung ist darüber hinaus gerichtet auf die Verwendung der p153- und p156-Proteine bei der Herstellung von Impfstoffen gegen Hunde- und menschliche Ehrlichiosis. Zusätzlich sind Verfahren zur Bestimmung, ob ein Hund oder Mensch mit einem Ehrlichia-Spezien infiziert ist, bereitgestellt, durch die Bestimmung, ob Hundeserum mit dem p153- oder p156-Protein reagiert. Die verwendeten Proteine können aus rekombinanten Quellen stammen, und Western-Blot-Analyse könnte verwendet werden, um die Reaktion des Serums auf die Proteine zu detektieren. Da auch die Reaktion mit vorherigen isoliertem E. canis p28-Protein ein zuverlässiger Marker einer E. canis-Infektion ist, könnte die Diagnose aus der Bestimmung der Immunreaktivität auf das p153-Protein, gp140, und das p28-Antigen von Ehrlichia canis bestehen.
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auch auf ein serodiagnostisches Kit zur Untersuchung, ob ein Hund oder Mensch mit einer Ehrlichia-Spezies infiziert ist. Das Kit umfasst immobilisierte Proteine (p153 oder p156) wie hier offenbart, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2 bzw. die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:1 haben, geeignete Verdünnungspuffer für Hundeserum, zweite Anti-Hundserumantikörper, gebunden an ein Reportermolekül, und geeignete Reagenzien zum Nachweis des Reportermoleküls. Mögliche Verfahren zur Immobilisierung der Antigene schließen die Bindung an Membrane oder Mikrotiterplatten ein. Das Reportermolekül könnte Luziferase, Meerrettichperoxidase, Beta-Galaktosidase oder ein Fluoreszentmarker sein.
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung können konventionelle molekularbiologische, mikrobiologische und rekombinante DNA-Techniken innerhalb der Fähigkeiten auf diesem Gebiet verwendet werden. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur erklärt. Siehe zum Beispiel, Maniatis, Fritsch & Sambrook, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); „DNA Cloning; A Practical Approach, „Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotdie Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
  • Der Begriff "Wirt" wie hier verwendet, schließt nicht nur Prokaryoten, sondern auch Eurkaryoten wie zum Beispiel Hefe-, Pflanzen- und Tierzellen ein. Ein rekombinantes DNA-Molekül oder Gen, das ein Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, kann verwendet werden, um einen Wirt zu transformieren unter Verwendung von irgendeiner der gebräuchlichen Techniken, die dem normalen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind. Prokaryotische Wirte können E. coli, S tymphimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis einschließen. Eukaryotische Wirte schließen Hefen wie zum Beispiel Pichia pastoris, Säugetierzellen und Insektenzellen ein.
  • Im Allgemeinen werden Expressionsvektoren, die Promotorsequenzen enthalten, die die effiziente Transkription der eingefügten DNA-Fragmente fördern, in Verbindung mit dem Wirt verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Anfangspunkt der Replikation, Promotor(en), Terminator(en), sowie spezifische Gene, die in der Lage sind, eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen bereitzustellen. Die transformierten Wirte können entsprechend bekannter Mittel auf diesem Gebiet fermentiert und kultiviert werden, um ein optimales Zellwachstum zu erreichen. Verfahren, die einem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die geeignete transkriptionale und translationale Kontrollsignale enthalten. Siehe zum Beispiel die Techniken beschrieben in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage), Cold Spring Harbor Press, N.Y.
  • Der Begriff „Primer" wie hier verwendet, bezieht sich auf Oligonukleotide, auch wenn diese natürlicherweise in einem isolierten Restriktionsverdau oder synthetisch-produziert vorkommen, die in der Lage sind, als Startpunkt der Synthese zu fungieren, wenn sie unter Bedingungen eingesetzt werden, in denen die Synthese von einem Primerextensionsprodukt komplementär zu einem Nukleinsäurestrang eingeleitet wird. Die Bedingungen schließen die Anwesenheit von Nukleotiden und einem induzierendem Wirkstoff wie einer DNA-Polymerase und einer geeigneten Temperatur und pH-Wert ein. Die Primer können entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein und müssen ausreichend lang sein, um als Primer für die Synthese des gewünschten Extensionsproduktes in der Anwesenheit des induzierenden Wirkstoffs zu fungieren. Die genaue Länge der Primer wird abhängig sein von vielen Faktoren einschließlich Temperatur, Quelle der Primer und dem verwendeten Verfahren. Für diagnostische Anwendungen zum Beispiel umfasst ein Oligonukleotidprimer typischerweise 15 bis 25 oder mehr Nukleotide abhängig von der Komplexität der Zielsequenz. Primer mit einer geringeren Nukleotidzahl können ebenfalls verwendet werden.
  • Die Primer hierin wurden ausgewählt, um „im Wesentlichen" komplementär zu verschiedenen Strängen einer bestimmten Ziel-DNA-Sequenz zu sein. Das bedeutet, dass die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren entsprechenden Strängen zu hybridisieren. Deshalb braucht die Primer-Sequenz nicht die exakte Sequenz des Templates wiederzugeben. Beispielsweise könnte ein nicht-komplementäres Nukleotidfragment an das 5'-Ende des Primers angehängt sein, mit dem Rest der Primer-Sequenz, die komplementär zu dem Strang ist. Alternativ können nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen in den Primer eingelagert sein, vorausgesetzt, dass die Primer-Sequenz eine ausreichende Komplementarität mit der Sequenz hat oder daran hybridisiert und somit das Template für die Synthese des Extensionsprodukts bildet.
  • Die folgenden Beispiele werden für den Zweck der Illustration verschiedener Ausführungsformen der Erfindung gegeben und sollen die vorliegende Erfindung in keiner Weise limitieren.
  • BEISPIEL 1
  • Charakterisierung der E. canis p153- und E. chaffeensis p156-Proteine
  • Wie zuvor beschrieben wurde das E. canis p43-Protein von einer Lambda Zap II-Expressionsbibliothek identifiziert (McBride et al., 2001; U.S. Pat. Nr. 6,355,777). Der Original 2.4-kb-Klon bestand aus einem offenen Leseraster (ORF), das ein Desoxyguanisintriophosphat-Triphosphohydrolase-Gen und einen stromabwärts 229-bp intergenen Bereich kodiert, vorangehend an das verkürzte p43-Genfragment. Ein Primer-Adapter PCR-Verfahren wurde verwendet um die komplette Sequenz des p43 offenen Leserasters zu untersuchen, wobei die E. canis genomische DNA als Template verwendet wurde (Jake, North Carolina-Strang). Die Amplifikate wurden direkt mit den Primern sequenziert, die für die Amplifikation verwendet wurden oder in TOPO/TA für Sequenzanalyse kloniert. Der E. chaffeensis Orthologe (p156-Gen) wurde durch die Durchführung einer BLAST-Suche der E. chaffeensis-Genomsequenz mit dem gesamten E. canis p43-Klon (2.4-kb) identifiziert.
  • Die E. canis p156- und E. chaffeensis p156-Gene wurden in große Fragmente (1 bis 1,5-kbp) geteilt, in einen pUni/V5-His-TOPO Echo Donor-Vektor kloniert und mit pBAD Thio-E oder pRSET Echo Akzeptorexpressions-Vektoren rekombiniert. Die rekombinanten Proteine wurden für 4 Stunden nach Induktion mit Arabinose oder IRTG expremiert. Der Glykannachweis der expremierten rekombinanten Proteine wurde unter Verwendung eines Immuno-Blot-Kits für den Glykoproteinnachweis (Bio-Rad) nach dem Membran-Markierungsprotokoll durchgeführt. Das E. chaffeensis rekombinante Dsb-Protein, wie vorher beschrieben (McBride et al., 2002), wurde in E. coli expremiert und als ein Ehrlichiales-negativ-Kontrollprotein für die Glykoproteinnachweisstudien verwendet. Das vollständige E. canis Zelllysat wurde durch Gelelektrophorese unter Verwendung von Gradientengelen (4–12 % Bis-Tris, Novagen) getrennt und unter Verwendung einer halbtrockenen Transfereinheit (Bio-Rad) auf reine Nitrozellulose gegeben. Immuno-Blots, wie vorher beschrieben, wurden durchgeführt (McBride et al., 2001).
  • Diskussion
  • Die starke Immunreaktivität des Klons, der den N-terminalen (p43) Teil des E. canis p153 enthält, führte zu seiner anfänglichen Identifikation und Charakterisierung (McBride et al., 2001). Beim Vergleich mit den Ergebnissen des indirekten Fluoreszenzantikörper-Tests zum Nachweis von Antikörpern gegen E. canis in Hunden, wies das p43 eine exzellente Sensitivität und Spezifität auf. Zusätzlich schien das p43 einen Spezien-spezifischen Nachweis bereitzustellen, da antirekombinante p43 polyklonale Antikörper nicht mit E. chaffeensis infizierten DH82-Zellen reagierten. Die Identifikation des p153 Orthologen in E. chaffeensis (p156), der genetisch divergent ist und einen niedrigen Grad von Aminosäurehomologie aufweist, bestätigt vorherige Funde, dass das p43-Protein ein Spezien-spezifisches Antigen ist und deshalb ein exzellentes Spezien-spezifisches immundiagnostisches Antigen sein würde. Hauptsächlich sind lineare B-Zell-Epitope in den N-(p43) und C-terminalen Regionen des p153-Proteins anwesend.
  • Das p43 rekombinante Protein weist eine größere Molekularmasse als prognostiziert auf (∼30 % oder ∼10 kDa), was anfänglich nicht bemerkt wurde. Die zuvor berichteten ehrlichialen Glykoproteine gp120 und gp140 waren 60 bis 100 % größer als erwartet. Obwohl der Grad der Molekularmassenabweichung deutlich kleiner war, wurde durch Kohlenhydratnachweis der angelagerten Glykane bestätigt, dass das p43-Protein ein Glykoprotein ist. Konsistent mit den p43-Funden weisen die expremierten E. chaffeensis p156-rekombinanten Genfragemente eine größere als erwartete Molekularmasse auf, und Kohlenhydrat wurde in diesen Fragmenten detektiert. Zusätzlich wies das C-tenninale Fragment des E. canis p153 ebenfalls eine größere Molekularmasse auf als erwartet (∼10 % oder 6 kDa).
  • Als das p43-Gen identifiziert wurde, reagierte ein entsprechendes natives. E. canis-Protein aus vollständigen Zelllysaten nicht mit den Anti-p43-Antisera. Basierend auf den hier präsentierten Funden, kann dieser Widerspruch der Tatsache zugeschrieben werden, dass das p43-Gen einen unvollständigen offenen Leseraster darstellt und es kein 43 kD-Protein kodiert. Zusätzlich benötigt die große Molekularmasse dieses Proteins (>150 kD) besondere Aufmerksamkeit bei Gelelektrophoresebedingungen, um eine konsistente Identifikation dieses Proteins durch einen Immuno-Blot zu erhalten. Das 200 kD-Protein in vollständigen Zelllysaten von E. canis war stark immunreaktiv mit dem Anti-p43 polyklonalen Antikörper. Die Molekularmasse von diesem Protein stimmt mit der prognostizierten Masse des p153, gekoppelt mit einigen Glykanen, die zu einer Erhöhung der Molekularmasse beitragen, überein. Dieser Fund ist außerdem mit der Molekularmasse der E. chaffeensis p156-rekombinanten Fragmente konsistent, die fast das gesamte offenen Leseraster darstellen.
  • Glykoproteine von Ehrlichia spp. sind einige der ersten solcher Proteine, die in pathogenen Bakterien charakterisiert werden. Die bisher entdeckten ehrlichialen Glykoproteine werden konsistent und stark von Antikörpern in infizierten Patienten und Tieren erkannt. Diese einmaligen Oberflächen-exponierten immunreaktiven Proteine haben ein Potential in der Impfstoffentwicklung, und diese Proteine können wichtige Komponenten der Untereinheit Impfstoffe sein.
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  • Alle Patente und Publikationen, die in dieser Beschreibung genannt wurden, sind hinweisend auf das Level eines Fachmanns auf diesem Gebiet, die diese Erfindung betrifft. Diese Patente und Publikationen werden hierin durch Referenzen im selben Ausmaß berücksichtigt als ob jede einzelne Publikation spezifisch und individuell angegeben ist, um durch Referenz eingebunden zu sein.
  • Ein Fachmann aus diesem Bereich wird bereitwillig einsehen, dass die vorliegende Erfindung gut geeignet ist, die Gegenstände nachzuvollziehen und die genannten Ziele und Vorteile zu erreichen, genauso wie das Innewohnende darin. Die gegenwärtigen Beispiele zusammen mit den Verfahren, Handlungsweisen, Behandlungen, Molekülen und spezifische Verbindungen wie hierin beschrieben, sind derzeitig exemplarisch repräsentativ für bevorzugte Ausführungsformen und beabsichtigen nicht die Limitierung des Umfangs der Erfindung. Änderungen darin und andere Verwendungen werden solchen Fachleuten auf dem Gebiet einfallen, die den Umfang der Erfindung wie durch den Umfang der Ansprüche erfassen.
  • SEQUENZLISTE
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  • Figure 00170001
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  • Figure 00190001
  • Figure 00200001

Claims (14)

  1. DNA, die für ein immunreaktives Oberflächenprotein p153 von Ehrlichia canis oder ein immunreaktives Oberflächenprotein p156 von Ehrlichia chaffeensis kodiert, wobei die DNA eine DNA ist, die das p153-Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR:2 bzw. das p156-Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR:1 kodiert.
  2. Vektor umfassend die DNA nach Anspruch 1 und regulatorische Elemente, die für die Expression der DNA in einer Zelle notwendig sind.
  3. Wirtszelle transfiziert mit dem Vektor nach Anspruch 2.
  4. Wirtszelle nach Anspruch 3, wobei die Zelle eine Bakterienzelle, eine Säugerzelle, eine Pflanzenzelle oder eine Insektenzelle ist.
  5. Immunreaktives Oberflächenprotein p153 von Ehrlichia canis oder immunreaktives Oberflächenprotein p156 von Ehrlichia chaffeensis mit der in SEQ ID NR:2 bzw. in SEQ ID NR:1 gezeigten Aminosäuresequenz.
  6. Antikörper gerichtet gegen das p153- oder das p156-Protein nach Anspruch 5.
  7. Impfstoff gegen Ehrlichiose in Hunden, wobei der Impfstoff das p153- oder das p156-Protein nach Anspruch 5 umfasst.
  8. Verwendung von p153-Protein aus Ehrlichia canis mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR:2 oder von p156-Protein von Ehrlichia chaffeensis mit der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR:1 bei der Herstellung eines Diagnostiziermittels, um Serum eines Hundes auf seine Reaktion auf die Proteine zu testen, für die Bestimmung, ob der Hund mit einer Ehrlichia-Spezies infiziert ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Protein ein rekombinantes Protein ist und/oder wobei der diagnostische Test mittels einer Western-Blot-Analyse ausgeführt wird.
  10. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Diagnostiziermittel mit einem weiteren Diagnostiziermittel, das das p28-Protein von Ehrlichia canis umfasst, kombiniert wird.
  11. Kit umfassend: a) mindestens eines der Ehrlichia-Antigene p153, mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR:2, und p156, mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR:1, auf einem Träger immobilisiert; b) einen Puffer, um das Hundeserum zu verdünnen; c) einen gegen Hundeserum gerichteter zweiter Antikörper, der mit einem Reportermolekül verknüpft ist; und d) ein Reagenz, um das Reportermolekül nachzuweisen.
  12. Kit nach Anspruch 11, wobei der Träger eine Membran oder eine Mikrotiterplatte ist und/oder wobei das Reportermolekül Luziferase, Meerrettichperoxidase, β-Galaktosidase oder eine Fluoreszenzmarkierung ist.
  13. Verfahren zur Bestimmung, ob ein Hund mit einer Ehrlichia-Spezies infiziert worden ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Extrahieren der DNA aus dem bereits zuvor von dem Hund erhaltenen Blut; – Durchführen der PCR-Vervielfältigung auf der DNA mit Oligonukleotidprimern, die für das p153-Gen von Ehrlichia canis, das ein p153-Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR:2 kodiert, oder für das p156-Gen von Ehrlichia chaffeensis, das ein p156-Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR:1 kodiert, spezifisch sind; – Auftrennen des resultierenden PCR-Produkts nach der Größe, und – Nachweisen eines PCR-Vervielfältigungsprodukts passender Größe, wobei der positive Nachweis eines Vervielfältigungsprodukts passender Größe die Infektion mit Ehrlichia canis oder Ehrlichia chaffeensis anzeigt.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das PCR-Vervielfältigungsprodukt mittels Gelelektrophorese nachgewiesen wird.
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