WO2000022134A2 - Testkit zur diagnose von borreliosen und neue borrelia-antigene für die impfstoffentwicklung - Google Patents

Testkit zur diagnose von borreliosen und neue borrelia-antigene für die impfstoffentwicklung Download PDF

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WO2000022134A2
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cultivated
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Markus Simon
Reinhard Wallich
Michael Kramer
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a method and a reagent kit for diagnosing Lyme disease by detecting anti-Borrelia antibodies. Furthermore, new Borrelia cells, lysates, fractions and antigens from such cells and their use as detection reagents or as immunogens are disclosed.
  • Lyme disease is a tick-borne infectious disease caused by the spirochete Borrelia burgdorferi.
  • the disease is a chronic progressive infection that affects many organs, such as the skin, central and peripheral nervous system, heart, liver, kidney, musculoskeletal system, and joints.
  • Various symptoms such as acute arthritis and neuroborreliosis, can disappear spontaneously, but usually recur episodically.
  • Spirochetes have been isolated from untreated patients repeatedly, and there are numerous signs of persistent infection even after one? Antibiotic therapy. Since reliable treatment of this disease by antibiotic therapy is therefore difficult, great efforts are made to investigate the pathogen itself and the host's immune response to infection with B. burgdorferi.
  • a high titer of antibodies against B. burgdorferi is usually found in the course of the infection, but in many cases they do not provide protection against the infection.
  • BbK2.10 B. burgdorferi protein
  • SDS gel SDS gel
  • Stevenson et al. Infect. Immun. 63 (1995), 4535-4539
  • OspC protein OspC with a molecular mass of approx.
  • Fikrig et al. (Immunity 6 (1997), 531-539) describe an in vivo expression of B. burgdorferi antigens with molecular masses of 35 and 37 kDa (p35 and p37), which are designated as potential candidates for the serodiagnosis of Lyme disease, whereby it is assumed that common serotests cannot detect antibodies that are directed against antigens expressed in vivo.
  • Reading frames can be obtained. Finding a hypothetical open However, reading frames do not indicate any selective in vivo expression of the derived hypothetical polypeptide.
  • the present invention provides a new detection method which, above all, allows the detection of selectively expressed immunogenic structures of Borrelia in vivo.
  • the invention thus relates to a method for diagnosing Lyme disease by detecting anti-Borrelia antibodies against Borrelia antigens expressed in vivo.
  • a detection reagent is used which contains several Borrelia antigens
  • Selectively expressed in vivo antigens of Borrelia according to the present invention are expressed in vivo by at least a factor of 2, preferably by at least a factor of 5 and particularly preferably by at least a factor of 10 than in vitro (cultivation conditions example 1 .1).
  • a detection reagent is preferably used which contains a combination of at least two, preferably at least three, selectively expressed Borrelia antigens.
  • the detection reagent can be formed from lysates of Borrelia cells cultured in vivo, immunogenic fractions or constituents of such Lysate or Borrelia cells or isolated antigens, which can be native or recombinant antigens which can optionally be biochemically or molecular biologically modified ( eg addition, deletion or substitution variants or peptide fragments).
  • Borrelia cells which express a suitable antigen pattern can be obtained by in vivo cultivation in a device provided with a semipermeable membrane in the peritoneal cavity of an experimental animal, for example rats or mice. From the Borrelia cells obtainable in this way, total lysates (for example by lysis with SDS) or fractions or individual components thereof (for example by chromatographic separation, isoelectric focusing, etc.) can be obtained, which are used as detection reagents for the diagnosis of Borreliosis can be.
  • SDS total lysates
  • fractions or individual components thereof for example by chromatographic separation, isoelectric focusing, etc.
  • the detection reagent is brought into contact with a sample to be examined, preferably an antibody-containing body fluid, in particular serum, but also, for example, cerebrospinal fluid, from a potentially infected organism, in particular a mammal, for example a human, and the reaction of antigens from the Detection reagent with potentially present antibodies (in the case of an infection with Borrelia) in the sample.
  • a sample to be examined preferably an antibody-containing body fluid, in particular serum, but also, for example, cerebrospinal fluid, from a potentially infected organism, in particular a mammal, for example a human
  • the antigen-antibody reaction can be determined in the usual way.
  • the determination is carried out by Western blot, a preparation which preferably contains several antigens, for example separated by gel electrophoresis and then brought into contact with the sample.
  • the determination can also be carried out by other immunological methods, for example ELISA or immunofluorescence.
  • a mixture of monoclonal antibodies against Borrelia antigens can be used as a marker.
  • the method according to the invention is basically suitable for the detection of all Borrelia organisms.
  • the organisms are preferably selected from the group of human pathogenic spirochetes, consisting, for example, of B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii and B. afzelii.
  • the Borrelia are selected from B. burgdorferi sensu lato organisms.
  • a specific example of a suitable Borrelia strain is B. burgdorferi ZS7 (DSM 5527).
  • the detection method according to the invention allows a much more reliable diagnosis of borreliosis than the methods of the prior art.
  • the in-vitro cultivated Borrelia compared to known in-vitro-cultivated Borrelia one or more additional antigens, i.e. express immunogenic polypeptides which have a molecular mass in the polyacrylamide SDS gel of approximately 9.5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 and 102 kDa.
  • the detection reagent particularly preferably contains one or more Borrelia antigens which are encoded by:
  • SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 and 35 encode nucleotide sequences for new in vivo expressed B. burgdorferi ZS7 antigens or partial sequences thereof the in SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 and 36 amino acid sequences shown.
  • the present invention also includes those sequences which hybridize with it under stringent conditions.
  • hybridization according to the present invention is used as in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press (1989), 1,101 to 1,104). Accordingly, one speaks of a hybridization under stringent conditions if, after washing for 1 hour with 1 x SSC and 0.1% SDS at 55 ° C., preferably at 62 ° C.
  • the present invention encompasses a sequence which hybridizes under such washing conditions with one of the nucleotide sequences shown in the sequence listing or a nucleotide sequence corresponding therewith in the context of the degeneration of the genetic code.
  • the present invention also covers nucleotide sequences which have a homology of at least 70%, particularly preferably at least 80%, to the nucleotide sequences shown in the sequence listing at the nucleotide level.
  • the homology H in percent is calculated using the following formula:
  • nucleotide sequences can be obtained from organisms selected from the group of human pathogenic spirochetes, in particular from Borrelia, or by mutagenesis (eg site-specific mutagenesis) of the specifically disclosed nucleotide sequences.
  • the nucleotide sequences have a length of at least 15, particularly preferably at least 20 nucleotides.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be present in a vector.
  • This vector can be any prokaryotic or eukaryotic vector on which the nucleotide sequence is preferably under the control of an expression signal (promoter, operator, enhancer etc.).
  • prokaryotic vectors are chromosomal vectors such as bacteriophages (e.g. bacteriophages ⁇ ) and extrachromosomal vectors such as plasmids, circular plasmid vectors being particularly preferred.
  • Suitable prokaryotic vectors are e.g. in Sambrook et al., supra, chap. 1 to 4.
  • the nucleic acid can also be present in a eukaryotic vector, e.g. a yeast vector or a vector suitable for higher cells (e.g. a plasmid vector, viral vector or plant vector).
  • a eukaryotic vector e.g. a yeast vector or a vector suitable for higher cells (e.g. a plasmid vector, viral vector or plant vector).
  • a vector suitable for higher cells e.g. a plasmid vector, viral vector or plant vector.
  • Another object of the invention is a cell which expresses one or more antigens which i) react with anti-Borrelia immune serum from organisms infected with Borrelia, ii) are not or only slightly expressed by Borrelia cultivated in vitro and iii) by Borrelia cultivated in vivo are strongly expressed, the antigens having a molecular mass in the polyacrylamide SDS gel of approximately 9.5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 and 102 kDa.
  • the Borrelia antigens are particularly preferably encoded by nucleic acids as indicated above.
  • the cells can be Borrelia cells cultivated under suitable conditions.
  • heterologous cells ie non-Borrelia cells which have been transformed with a nucleic acid or a vector according to the invention and can therefore express Borrelia antigens.
  • heterologous cells are prokaryotic cells, preferably gram-negative prokaryotic cells, in particular E. coli cells.
  • the cells can also be eukaryotic cells, such as fungal cells (eg yeast), animal or plant cells.
  • Borrelia cells which produce suitable antigens are, as already stated, obtainable by in vivo cultivation in a device provided with a semi-permeable membrane, e.g. a dialysis tube, in the peritoneal cavity of an experimental animal, preferably a rat or a mouse.
  • a semi-permeable membrane e.g. a dialysis tube
  • Heterologous cells which produce suitable antigens can be obtained by transformation with antigen-encoding nucleic acids or vectors and subsequent cultivation under suitable conditions which lead to expression of the antigen.
  • Another object is a lysate of a cell according to the invention e.g. a total lysate and an immunogenic fraction of the cell or lysate, this immunogenic fraction containing one or more Borrelia antigens which are not or only slightly expressed by Borrelia cultivated in vitro.
  • Yet another object of the invention are Borrelia antigens which i) react with anti-Borrelia immune serum from organisms infected with Borrelia, ii) are not or only slightly expressed by Borrelia cultivated in vitro and iii) strongly expressed by Borrelia cultivated in vivo.
  • these antigens have a molecular mass as previously indicated.
  • the antigens are particularly preferably encoded by a nucleic acid according to the invention as indicated above. It is further preferred that it contains at least one six amino acids, preferably at least eight amino acids and particularly preferably at least ten amino acids long section of the SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24 and 36 comprise or and that they include the amino acid sequences shown in these sequence listing or have at least an amino acid level of at least 60%, preferably at least 80% and particularly preferably at least 90% identical sequence. Identity I is determined in percent using the formula
  • N N / L * 100%, where N stands for the number of identical amino acids of the two sequences compared and L for the length of the sequence section used for the comparison.
  • antigens can be used in the form of lysates, cell fractions or in isolated form.
  • the antigens are available in isolated form, e.g. by immuno-absorption of a Borrelia lysate with immobilized anti-Borrelia immune serum or monoclonal antibodies against Borrelia proteins in order to separate non-immunogenic components of the lysate, and subsequent separation of the antigens according to size or / and charge, e.g. by gel electrophoresis, HPLC and / or isoelectric focusing.
  • isolated antigens can also be obtained by recombinant methods.
  • a cell is preferably transformed with a nucleic acid molecule or vector according to the invention transformed cell is cultivated under conditions in which expression of the antigen takes place and the antigen is isolated from the cell and / or from the culture supernatant.
  • the antigen according to the invention can be obtained both as a fusion polypeptide and as a non-fusion polypeptide.
  • the lysates, fractions and antigens according to the invention can be used as detection reagents for anti-Borrelia antibodies and as immunogens for generating anti-Borrelia antibodies.
  • the invention thus also relates to a reagent kit for the detection of anti-Borrelia antibodies which, in addition to other test components, contains one or more Borrelia antigens which (i) react with anti-Borrelia immune serum from organisms infected with Borrelia, (ii) from in in vitro cultivated Borrelia are not or only slightly expressed and (iii) are strongly expressed by in vivo cultivated Borrelia.
  • the invention also relates to an immunogenic composition which can optionally be used as a vaccine and contains one or more Borrelia antigens which (i) react with anti-Borrelia immune serum from organisms infected with Borrelia and (ii) Borrelia cultivated in vitro are not or only slightly expressed and (iii) are strongly expressed by Borrelia cultivated in vivo, and, if appropriate, physiologically acceptable carriers, for example physiologically acceptable carrier liquids. such as saline solutions, and auxiliaries, for example immunological adjuvants, such as Freund's adjuvant, aluminum phosphate, etc.
  • physiologically acceptable carriers for example physiologically acceptable carrier liquids.
  • physiologically acceptable carrier liquids such as saline solutions, and auxiliaries, for example immunological adjuvants, such as Freund's adjuvant, aluminum phosphate, etc.
  • the antigens contained in the immunogenic composition are used in particular in the form of recombinant polypeptides or lipoproteins, which are isolated by isolating the corresponding gene, e.g. from a B. burgdorferi expression gene bank, and cloning into heterologous organisms such as E.coli, mammalian cells, insect cells etc. can be produced.
  • the present invention also relates to nucleic acid molecules which code for Borrelia antigens as stated above and recombinant vectors which contain at least one copy of a nucleic acid molecule according to the invention, preferably in operative association with an expression signal.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be used as nucleic acid vaccines for combating and / or preventing diseases caused by infection with Borrelia.
  • the formulation as a nucleic acid vaccine can, for example, according to Eur. J. Immunol. 26 (1996), 2831-2840.
  • SEQ ID No. 1 and 2 the 151 amino acid long sequence of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 1 together with the corresponding 456 bp long DNA sequence
  • SEQ ID NO. 3 and 4 the 1 27 amino acid long sequence of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 3 together with the corresponding 384 bp long DNA sequence
  • SEQ ID NO. 7 and 8 the 300 amino acid long sequence of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 7 together with the corresponding 903 bp long DNA sequence (P78.a).
  • SEQ ID NO. 9 and 10 the 163 amino acid long sequence of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 9 together with the corresponding 492 bp long DNA sequence (P78.b).
  • SEQ ID NO. 1 1 and 12 the 264 amino acid long sequence of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 1 1 together with the corresponding 795 bp long DNA sequence (P719).
  • SEQ ID NO. 13 and 14 the 488 amino acid sequence of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 13 together with the corresponding 1467 bp long DNA sequence (P71919).
  • SEQ ID NO. 1 5 and 16 the 89 amino acid partial sequence of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 15 together with the corresponding 269 bp long DNA sequence (P718).
  • SEQ ID NO. 17 and 18 the partial sequence of 79 amino acids long of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 17 together with the corresponding 239 bp long DNA sequence (P72).
  • SEQ ID NO. 19 and 20 the 242 amino acid sequence of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 1 9 together with the corresponding 729 bp long DNA sequence (P73.a).
  • SEQ ID NO. 21 and 22 the 1 31 amino acid partial sequence of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 21 together with the corresponding 396 bp long DNA sequence (P73.b).
  • SEQ ID NO. 23 and 24 the 1 71 amino acid partial sequence of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 23 together with the corresponding 51 6 bp long DNA sequence (P76.a).
  • SEQ ID NO. 25 and 26 the partial sequence of 225 amino acids long of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 25 together with the corresponding 675 bp long DNA sequence (P76.b).
  • SEQ ID NO. 27 and 28 the 1 18 amino acid partial sequence of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 27 together with the corresponding 354 bp long DNA sequence (Bb1).
  • SEQ ID NO. 29 and 30 the partial sequence of 1 34 amino acids long of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 29 together with the corresponding 402 bp long DNA sequence (pBb 1 5).
  • SEQ ID NO. 31 and 32 the partial sequence of 127 amino acids long of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 31 together with the corresponding 381 bp long DNA sequence (pBb18).
  • SEQ ID NO. 33 and 34 the 46-amino acid partial sequence of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 33 together with the corresponding 138 bp long DNA sequence (pBb29).
  • SEQ ID NO. 35 and 36 the 1 17 amino acid partial sequence of an in vivo expressed antigen from B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 35 together with the corresponding 351 bp long DNA sequence (pBb74).
  • FIG. 1 shows the result of a Western blot, in which immune serum from mice experimentally infected with B. burgdorferi was tested against cell lysates from in vitro and in vivo cultivated borrelia bacteria.
  • B. Burgdorferi was grown in vitro according to known methods using Barbour / Stoenner / Kelly medium (cf., for example, Barbour, Yale J. Biol. Med. 57 (1984), 521-525) at 33 ° C. 1 .2 mice and infection with B. burgdorferi
  • mice of the strains AKR / N (H-2 k ), C57BL / 6 (H-2 b ), BALB / c (H-2 d ) and CB-17 are (H-2 d ) were bred under specific pathogen-free conditions .
  • Female animals between 6 and 8 weeks old were used for the experiments.
  • the mice were subcutaneously (sc) with 1 x 10 3 low-passage (two to four in vitro passages) organisms B. burgdorferi of the strain ZS7 (Schaible et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1 990), 3768 -3772) vaccinated in the tail or infected by ticks.
  • BALB / c mice were vaccinated with 1000 or 10 8 Borrelia in the tail or infected by ticks.
  • the immune serum (IS) was collected over a period of around 3 months.
  • Normal mouse serum (NMS) was collected from naive BALB / c mice.
  • Borrelia (B. burgdorferi, B. garinii and B. afzellii) were expanded in semipermeable dialysis tubes in the peritoneum of rats.
  • Dialysis tubes from Roth (molecular weight cut-off 12-14 kDa) were used. One side of the tube was tied with dental floss and the tied side turned inside out. The tubes prepared in this way were autoclaved.
  • the autoclaved dialysis tubes were briefly rinsed with medium (Barbour / Stoenner / Kelly medium; see 1 .1). Then about 2.5 ml of an in vitro expanded culture of spirochetes (5 x 10 6 / ml) were filled in and the tube was tied with autoclaved dental floss.
  • Protruding tube pieces and floss ends were cut off.
  • the tubes were rinsed well with medium from the outside and stored in a petri dish with a lid in the incubator.
  • the dialysis tubing thus prepared was surgically inserted into the Peritoneal envelope of Lewis rats implanted under anesthesia.
  • the dialysis tubes were removed at various times after implantation.
  • the organisms were removed from the dialysis tubes, washed 3 ⁇ in PBS and in SDS sample buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% (v / v) glycerol, 2% (v / v) SDS) added. Aliquots were frozen at -20 ° C.
  • the lysates obtained according to 1.4 were separated by polyacrylamide SDS gel electrophoresis.
  • a 12.5% bis / acrylamide gel (ready-made solution from BioRad, cat. No. 161-0158) was used in conjunction with a 4.5% bis / acrylamide collective gel.
  • the fractionated proteins were transferred electrophoretically to a nitrocellulose membrane using known methods. This nitrocellulose membrane was then cut into individual strips and incubated with an immune serum from the mouse (1 .3) or human sera for the detection of anti-Borrelia antibodies potentially present in the serum.
  • High molecular DNA from the B. burgdorferi strain ZS7 was purified after cultivation in modified Kelly's medium.
  • the spirochetes were pelleted by centrifugation at 10,000 g and washed three times in PBS buffer.
  • the dry pellet was resuspended in 10 ml TE (10 mmol / l Tris, 1 mmol / l EDTA, pH 7.4), treated with lysozyme (5 mg / ml) for 15 minutes at 30 ° C. and the DNA by adding 1 ml of 20% SDS released.
  • After adding 1.5 ml of NaCl (5 mol / l) the solution was extracted with an equal volume of phenol, followed by extraction with chloroform.
  • the DNA was then precipitated by adding 2 volumes of absolute ethanol and incubating at -20 ° C overnight. After centrifugation the residue was dissolved in 0.5 ml TE and with DNAse free RNAse A (20 ug / ml (incubated for 45 minutes at 55 ° C, followed by 1 hour treatment with Proteinase K (0.1 tg / ml) at 37 ° C. The solution was brought up to 0.3 mol / l NaOAc adjusted and extracted with phenol-chloroform as described above, After precipitation with ethanol, the DNA was taken up again in TE.
  • High molecular weight DNA was broken down into fragments of approx. 0.5-3 kb by ultrasound treatment for three seconds.
  • T4 DNA polymerase (30 minutes at 37 ° C) and Klenow enzyme (5 minutes at 20 ° C) were used to smooth the ends of the DNA fragments generated.
  • Blunt-ended DNA was ligated into the BamHI site of an expression vector pUEXI using an adapter cloning strategy (Bresan and Stanley (1,987) Nucl. Acids. Res. P. 1056).
  • the proportion of recombinant colonies forming units was determined as follows: randomly selected colonies were picked and saturated until 2 ml selection medium (LB with 25 ⁇ g / ml ampicilin) grown.
  • the plasmid DNA was isolated by the usual alkaline lysis method and then cut with BamHI. More than 50% of the plasmids analyzed contained on average> 1.5 kb long DNA insertions.
  • the cells were plated on 24x24 cm plates at a density of 7,000 pfu per plate and incubated overnight at 30 ° C. After transferring the colonies to nitrocellulose filters (NC), the expression of ß-
  • Galactosidase fusion proteins by incubation at 42 ° C for two hours induced.
  • the filters were transferred to Whatman 3 MM paper treated with 5% SDS and incubated at 95 ° C for about 25 minutes.
  • the proteins were then electroblotted using conventional semi-dry western blotting equipment.
  • immunoreactive clones were identified by expression screening using anti-B.burgdorferi antisera. Unspecific binding sites on the NC filters were saturated by incubation with PBS containing 0.2% (weight per volume) gelatin and 3 mmol / l NaN 3 at room temperature for four hours.
  • the filters were then incubated with antisera from mice infected with B. burgdorferi for 18 hours with constant shaking.
  • the filters were diluted 1: 10,000 a peroxidase-labeled F (ab) 2 preparation of rabbit anti-mouse IgG antibodies for 1.5 hours at room temperature with constant shaking. The filters were washed again as described above and then incubated with diaminobenzidine as the peroxidase substrate. Positive clones were subjected to sequence analysis.
  • Strip D was treated with immune sera from Balb / c mice experimentally infected with 10 8 ZS7 Borrelia.
  • Strips A were treated with immune sera from Balb / c mice experimentally infected with 10 3 ZS7 Borrelia (pool of immune sera between 30 and 40 days after infection).
  • Strips C and E were treated with immune sera from Balb / c mice immunized with the fusion protein GST-BapA (C) and with the fusion protein GST-pG (E), respectively.
  • Polyclonal mouse immune sera showed a restricted pattern of 3 or 4 bands (molecular mass approx. 34, 39, 41 and 51 kDa) on in vitro expanded Borrelia.
  • an additional twelve additional bands (molecular mass approx. 9.5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 and 102 kDa) were detected with the same immune serum on Borrelia cells expanded in vivo.
  • in vivo cultivated borrelia, lysates, fractions or components thereof can thus make a significant contribution to the reliable diagnosis of borreliosis.
  • the DNA sequences identified in 2.2 were cloned into the commercially available vector pUEX1 and expressed in E.coli MC1061 as non-fusion proteins.
  • An immune response could be stimulated in mice by using lysates and selectively expressed in vivo antigens from Borrelia cultivated in vivo as an immunogen.
  • mice The lysates and antigens were administered 3 times to the mice subcutaneously in the tail root in intervals of 7 to 10 days in amounts of 5 to 10 ⁇ g in 100 ⁇ l adjuvant (ABM 3, from Sebak, Aidenbach, Germany).

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Abstract

Die Erfindung betrifft Borrelia-Antigene, die in vivo nicht oder gering exprimiert werden, die in vivo stark exprimiert werden und die mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren. Weiterhin wird auch die Verwendung von solchen Antigenen zur Diagnose einer Borreliose durch Nachweis von Anti-Borrelia-Antikörpern, Borrelia-Zellen, die solche Antigene exprimieren, Lysate, Fraktionen und Antigene aus solchen Zellen und deren Verwendung als Nachweisreagenzien bzw. als Imunogene offenbart.

Description

Testkit zur Diagnose von Borreliosen und neue Borrelia-Antigene für die Impfstoff entwicklung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Reagenzienkit zur Diagnose einer Borreliose durch Nachweis von Anti-Borrelia-Antikörpern. Weiterhin werden neue Borrelia-Zellen, Lysate, Fraktionen und Antigene aus solchen Zellen und deren Verwendung als Nachweisreagenzien bzw. als Immuno- gene offenbart.
Die Lyme-Borreliose ist eine von Zecken übertragene Infektionskrankheit, die durch die Spirochäte Borrelia burgdorferi hervorgerufen wird. Die Krankheit ist eine chronische progressive Infektion, die viele Organe, wie etwa die Haut, das zentrale und periphere Nervensystem, das Herz, die Leber, die Niere, das muskuluskelettale System und Gelenke befällt. Verschiedene Symptome, wie etwa akute Arthritis und Neuroborreliose, können spontan verschwinden, treten jedoch zumeist episodisch wieder auf. Spirochäten wurden wiederholt aus unbehandelten Patienten isoliert, und es gibt zahlreiche Anzeichen für persistente Infektionen selbst nach eine? Therapie mit Antibiotika. Da eine zuverlässige Behandlung dieser Krankheit durch Therapie mit Antibiotika deshalb schwierig ist, werden große Anstrengungen unternommen, den Erreger selbst und die Immunantwort des Wirts auf Infektion mit B. burgdorferi zu erforschen. Bei den von der Lyme-Krankheit betroffenen Personen wird zwar zumeist ein hoher Titer an Antikörpern gegen B. burgdorferi im Verlauf der Infektion festgestellt, die jedoch in vielen Fällen keinen Schutz gegen die Infektion bewirken.
Champion et al. (Infect. Immun. 62 (1994), 2653-2661 ) beschreiben ein als EppA bezeichnetes Polypeptid von B. burgdorferi B31 , welches ein
Molekulargewicht von ca. 18 kDa aufweist und nicht-während einer in vitro-
Kultivierung, sondern nur im Laufe einer Infektion exprimiert wird. Akins et al. (Mol. Microbiol. 18 (1995), 507-520) beschreiben ein als BbK2.10 bezeichnetes B. burgdorferi-Protein, das nicht in vitro, sondern nur während einer Infektion exprimiert wird. BbK2.10 hat ein Molekulargewicht im SDS- Gel von ca. 25 kD. Stevenson et al. (Infect. Immun. 63 (1995), 4535-4539) beschreiben eine temperaturabhängige differenzielle Expression von B. burgdorferi-Antigenen. Neben dem Protein OspC mit einer Molekularmasse von ca. 25 kDa wird in den B. burgdorferi-Stämmen B31 und N40 eine differenzielle Expression von Antigenen mit Molekularmassen von 16, 19, 37, 38, 45 und 52 kDa bzw. 18, 20, 3 und 45 kDa gefunden, die in einer in vitro-Kultur bei 35°C stärker als bei 23°C exprimiert werden. De Silva et al. (J. Infect. Dis. 177 (1998), 395-400) beschreiben, dass Immunseren aus mit B. burgdorferi infizierten Mäusen zwar eine protektive Wirkung gegen in vitro-kultivierte Spirochäten, nicht aber aus Zecken oder infizierten Mäusen stammenden Spirochäten aufweisen.
Wallich et al. (Infection and Immunity 63 (1995), 3327-3335) beschreiben ein in vivo exprimiertes Lipoprotein pG mit einem Molekulargewicht von 22 kDa und die Analyse des zugehörigen Gens OspG (GenBank AE000786- GI2690016).
Fikrig et al. (Immunity 6 (1997), 531 -539) beschreiben eine in vivo Expression von B. burgdorferi-Antigenen mit Molekularmassen von 35 und 37 kDa (p35 und p37), die als potentielle Kandidaten für die Serodiagnose der Lyme-Krankheit bezeichnet werden, wobei vermutet wird, dass gängige Serotests Antikörper, die gegen in vivo exprimierte Antigene gerichtet sind, nicht zu erfassen vermögen.
Fräser et al. (Nature 390 (1997), 580-586) beschreiben die Ergebnisse der
Sequenzierung des Genoms von B. burgdorferi und die Computeranalyse des Informationsgehalts dieses Genoms, wodurch hypothetische offene
Leserahmen erhalten werden. Das Auffinden eines hypothetischen offenen Leserahmens lässt jedoch keinerlei Hinweis auf eine selektive in vivo Expression des hergeleiteten hypothetischen Polypeptids zu.
Derzeit gibt es kein zuverlässiges serologisches Nachweisverfahren zur Diagnose einer Borrelien-Infektion. Überraschenderweise wurdefestgestellt, daß die Ursache hierfür darin besteht, dass mit bisher angewandten Methoden nur derjenige Anteil von Antikörpern mit Spezif ität für die von den Borrelien in vitro exprimierten Antigene nachgewiesen werden kann, jedoch eine große Anzahl von individuellen Antikörperspezifitäten, nämlich solche, die gegen die in vivo exprimierten Antigene gerichtet sind, die während einer Infektion ausgebildet werden, nicht erfasst werden.
Durch die vorliegende Erfindung wird eine neue Nachweismethode bereitgestellt, die vor allem den Nachweis von selektiv in vivo exprimierten immunogenen Strukturen von Borrelien erlaubt. Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Diagnose einer Borreliose durch Nachweis von Anti-Borrelia-Antikörpern gegen in vivo exprimierte Borrelia-Antigene. Dabei wird insbesondere ein Nachweisreagenz verwendet, das mehrere Borrelia- Antigene enthält, die
i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden.
Selektiv in vivo exprimierte Antigene von Borrelien gemäß vorliegender Erfindung werden in vivo um mindestens den Faktor 2, vorzugsweise um mindestens den Faktor 5 und besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 10 stärker als in vitro (Kultivierungsbedingungen Beispiel 1 .1 ) exprimiert. Vorzugsweise verwendet man ein Nachweisreagenz, das eine Kombination von mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei selektiv in vivo exprimierten Borrelia-Antigenen enthält. Das Nachweisreagenz kann gebildet sein aus Lysaten von in vivo kultivierten Borrelia-Zellen, immunogenen Fraktionen oder Bestandteilen solcher Lysate oder Borrelia-Zellen oder isolierten Antigenen, wobei es sich um native oder um rekombinante Antigene handeln kann, die gegebenenfalls biochemisch oder molekularbiologisch verändert sein können (z.B. Additions-, Deletions- oder Substitutionsvarianten oder Peptidfragmente).
Borrelia-Zellen, die ein geeignetes Antigenmuster exprimieren, sind erhältlich durch in vivo Kultivierung in einer mit einer semipermeablen Membran versehenen Vorrichtung in der Peritonealhöhle eines Versuchstiers, z.B. Ratten bzw. Mäusen. Aus den auf diese Weise erhältlichen Borrelia-Zellen können Gesamt-Lysate (z.B. durch Lyse mit SDS) oder Fraktionen oder einzelne Bestandteile davon (z.B. durch chromatographische Auftrennung, isoelektrische Fokussierung, etc.) gewonnen werden, die als Nachweisreagenzien für die Diagnose von Borreliosen eingesetzt werden können. Hierzu wird das Nachweisreagenz mit einer zu untersuchenden Probe, vorzugs- weise einer Antikörper enthaltenden Körperflüssigkeit, insbesondere Serum, aber auch beispielsweise Cerebrospinalflüssigkeit, aus einem potentiell infizierten Organismus, insbesondere einem Säugetier, z.B. einem Menschen, in Kontakt gebracht und die Reaktion von Antigenen aus dem Nachweisreagenz mit potentiell (bei einer Infektion mit Borrelien) in der Probe vorhandenen Antikörpern bestimmt. Die Bestimmung der Antigen- Antikörper-Reaktion kann auf übliche Weise erfolgen. Beispielsweise erfolgt die Bestimmung durch Western Blot, wobei eine Präparation, die vorzugsweise mehrere Antigene enthält, z.B. gelelektrophoretisch aufgetrennt und dann mit der Probe in Kontakt gebracht wird. Alternativ kann die Bestim- mung auch durch andere immunologische Verfahren, z.B. ELISA oder Immunfluoreszenz, erfolgen. Eine Mischung monoklonaler Antikörper gegen Borrelia-Antigene kann als Marker verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich zum Nachweis aller Borrelia-Organismen geeignet. Vorzugsweise werden die Organismen ausgewählt aus der Gruppe der humanen pathogenen Spirochäten, bestehend z.B. aus B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii und B. afzelii. Am meisten bevorzugt werden die Borrelien aus B. burgdorferi sensu lato Organismen ausgewählt. Ein spezifisches Beispiel für einen geeigneten Borrelienstamm ist B. burgdorferi ZS7 (DSM 5527).
Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren erlaubt aufgrund des Vorhanden- seins von zusätzlichen in vivo exprimierten Antigenen eine wesentlich zuverlässigere Diagnostik von Borreliosen als die Verfahren des Standes der Technik.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die in vivo kultivierten Borrelien gegenüber bekannten in vitro kultivierten Borrelien ein oder mehrere zusätzliche Antigene, d.h. immunogene Polypeptide, exprimieren, die eine Molekularmasse im Polyacrylamid-SDS-Gel von ca. 9,5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 und 102 kDa aufweisen.
Besonders bevorzugt enthält das Nachweisreagenz ein oder mehrere Borrelia-Antigene, die kodiert sind von:
(a) einer der in SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33 und 35 gezeigten Nukleotidsequenzen,
(b) einer den Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des geneti- sehen Codes entsprechenden Sequenz und
(c) einer mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Sequenz.
Die in SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33 und 35 gezeigten Nukleotidsequenzen kodieren für neue in vivo exprimierte Antigene aus B. burgdorferi ZS7 oder Teilsequenzen davon mit den in SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 und 36 gezeigten Aminosäuresequenzen.
Neben den in den Sequenzprotokollen gezeigten Nukleotidsequenzen und diesen Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenzen umfaßt die vorliegende Erfindung auch solche Sequenzen, die damit unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press (1989), 1.101 bis 1.104) verwendet. Demnach spricht man von einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 x SSC und 0,1 % SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C, insbesondere für eine Stunde im 0,2 x SSC und 0, 1 % SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62 °C und besonders bevorzugt bei 68 °C noch ein positives Hybridis- ierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit einer der in den Sequenzprotokollen gezeigten Nukleotidsequenzen oder einer damit im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz hybridisierende Sequenz wird von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Darüber hinaus erfaßt die vorliegende Erfindung auch Nukleotidsequenzen, die auf Nukleotidebene eine Homologie von mindestens 70%, besonders bevorzugt von mindestens 80% zu den in den Sequenzprotokollen dargestellten Nukleotidsequenzen aufweisen. Die Homologie H in Prozent wird dabei nach folgender Formel berechnet:
H = n/l * 100%, wobei n für die Anzahl identischer Nukleotide der beiden miteinander verglichenen Sequenzen und I für die Länge des zum Vergleich herangezogenen Sequenzabschnitts stehen. Derartige Nukleotidsequenzen sind aus Organismen ausgewählt aus der Gruppe der humanen pathogenen Spirochäten, insbesondere aus Borrelien, oder durch Mutagenese (z.B. ortsspezifische Mutagenese) der konkret offenbarten Nukleotidsequenzen erhältlich. Die Nukleotidsequenzen weisen eine Länge von mindestens 15, besonders bevorzugt von mindestens 20 Nukleotiden auf.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können in einem Vektor vorliegen. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryon- tischer Vektor sein, auf dem sich die Nukleotidsequenz vorzugsweise unter Kontrolle eines Expressionssignals (Promotor, Operator, Enhancer etc.) befindet. Beispiele für prokaryontische Vektoren sind chromosomale Vektoren wie etwa Bakteriophagen (z.B. BakteriophageΛ) und extrachromo- somale Vektoren wie etwa Plasmide, wobei zirkuläre Plasmidvektoren besonders bevorzugt sind . Geeignete prokaryontische Vektoren sind z.B. bei Sambrook et al., supra, Kap. 1 bis 4, beschrieben.
Andererseits kann die Nukleinsäure auch in einem eukaryontischen Vektor vorliegen, z.B. einem Hefevektor oder einem für höhere Zellen geeigneten Vektro (z.B. einem Plasmidvektor, viralem Vektor oder Pflanzenvektor). Derartige Vektoren sind beispielsweise bei Sambrook et al., supra, Kap. 16, beschrieben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zelle, die ein oder mehrere Antigene exprimiert, die i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien-infizierten Organismen reagieren, ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder nur gering exprimiert werden und iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden, wobei die Antigene eine Molekularmasse im Polyacrylamid-SDS-Gel von ca. 9,5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 und 102 kDa aufweisen. Besonders bevorzugt werden die Borrelia-Antigene kodiert von Nukleinsäuren wie zuvor angegeben. Bei den Zellen kann es sich einerseits um unter geeigneten Bedingungen kultivierte Borrelia-Zellen handeln. Andererseits kann es sich jedoch auch um heterologe Zellen handeln, d.h. Nicht-Borrelia- Zellen, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und daher Borrelia-Antigene exprimieren können. In einer bevorzugten Ausführungsform sind solche heterologen Zellen prokaryontische Zellen, vorzugsweise gram-negative prokaryontische Zellen, insbesondere E.coli Zellen. Andererseits können die Zellen jedoch auch eukaryontische Zellen sein, wie etwa Pilzzellen (z.B. Hefe), tierische oder pflanzliche Zellen.
Borrelia-Zellen, die geeignete Antigene produzieren, sind - wie bereits ausgeführt - erhältlich durch in vivo Kultivierung in einer mit einer semiper- meablen Membran versehenen Vorrichtung, z.B. einem Dialyseschlauch, in der Peritonealhöhle eines Versuchstiers, vorzugsweise einer Ratte oder einer Maus.
Heterologe Zellen, die geeignete Antigene produzieren, sind durch Trans- formation mit Antigen-kodierenden Nukleinsäuren oder Vektoren und anschließende Kultivierung unter geeigneten Bedingungen, die zu einer Expression des Antigens führen, erhältlich.
Noch ein weiterer Gegenstand ist ein Lysat einer erfindungsgemäßen Zelle z.B. ein Gesamt-Lysat sowie eine immunogene Fraktion der Zelle oder des Lysats, wobei diese immunogene Fraktion ein oder mehrere Borrelia- Antigene enthält, die von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder nur gering exprimiert werden.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Borrelia-Antigene, die i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden.
Vorzugsweise haben diese Antigene eine Molekularmasse wie zuvor angegeben. Besonders bevorzugt sind die Antigene von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure wie zuvor angegeben kodiert. Weiterhin ist bevorzugt, daß sie mindestens einen sechs Aminosäuren, vorzugsweise mindestens acht Aminosäuren und besonders bevorzugt mindestens zehn Aminosäuren langen Abschnitt der in SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24 und 36 gezeigten Aminosäuresequenzen umfassen oder/und daß sie die in diesen Sequenzprotokollen gezeigten Aminosäuresequenzen oder eine auf Aminosäureebene dazu mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 80% und besonders bevorzugt mindestens 90% identische Sequenz aufweisen. Die Bestimmung der Identität I in Prozent erfolgt dabei nach der Formel
I = N/L * 100%, wobei N für die Anzahl identischer Aminosäuren der beiden miteinander verglichenen Sequenzen und L für die Länge des zum Vergleich her- angezogenen Sequenzabschnitts stehen.
Diese Antigene können in Form von Lysaten, Zellfraktionen oder in isolierter Form eingesetzt werden. In isolierter Form sind die Antigene erhältlich, z.B. durch Immunabsorption eines Borrelien-Lysats mit immobilisiertem Anti- Borrelia-Immunserum bzw. monoklonalen Antikörpern gegen Borrelien- proteine, um nichtimmunogene Bestandteile des Lysats abzutrennen, und anschließende Auftrennung der Antigene nach Größe oder/und Ladung, z.B. durch Gelelektrophorese, HPLC oder/und isoelektrische Fokussierung.
Alternativ können isolierte Antigene auch durch rekombinante Methoden gewonnen werden. Hierzu wird eine Zelle vorzugsweise mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül oder Vektor transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression des Antigens stattfindet und das Antigen aus der Zelle oder/und aus dem Kulturüberstand isoliert. Dabei kann das erfindungsgemäße Antigen sowohl als Fusionspolypeptid als auch als Nicht-Fusionspolypeptid gewonnen werden.
Noch eine weitere Möglichkeit zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Antigene in isolierter Form - insbesondere wenn sie nur Teilabschnitte der natürlichen Sequenzen enthalten - besteht in einer chemischen Synthese durch bekannte Methoden, z.B. nach Merryfield. Dabei können auch chemisch derivatisierte oder/und modifizierte Aminosäurebausteine (blockierte Seitengruppen oder/und D-Aminosäuren) in die Sequenz eingefügt werden.
Die erfindungsgemäßen Lysate, Fraktionen und Antigene können als Nachweisreagenzien für Anti-Borrelia-Antikörper sowie als Immunogene zur Erzeugung von Anti-Borrelia-Antikörpern eingesetzt werden. Die Erfindung betrifft somit auch einen Reagenzienkit zum Nachweis von Anti-Borrelia- Antikörpern, der neben anderen Testkomponenten ein oder mehrere Borrelia- Antigene enthält, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden.
Schließlich betrifft die Erfindung auch eine immunogene Zusammensetzung, die gegebenenfalls als Vakzin eingesetzt werden kann und ein oder mehrere Borrelia-Antigene enthält, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren und (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden, sowie gegebenenfalls physiologisch annehmbare Trägerstoffe, z.B. physiologisch annehmbare Trägerflüssigkei- ten wie Salzlösungen, und Hilfsstoffe, z.B. immunologische Adjuvanzien, wie etwa Freund'sches Adjuvans, Aluminiumphosphat etc. enthält.
Die in der immunogenen Zusammensetzung enthaltenen Antigene werden insbesondere in Form von rekombinanten Polypeptiden oder Lipoproteinen eingesetzt, die durch Isolierung des entsprechenden Gens, z.B. aus einer B. burgdorferi-Expressionsgenbank, und Klonierung in heterologe Organismen, wie etwa E.coli, Säugerzellen, Insektenzellen etc., herstellbar sind.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch Nukleinsäuremoleküle, die für Borrelia-Antigene wie zuvor angegeben kodieren und rekombinante Vektoren, die mindestens eine Kopie eines erfindungsgemäßen Nukleinsäu- remoleküls vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einem Expressionssignal enthalten. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können als Nukleinsäure-Vakzine zur Bekämpfung oder/und Prävention von durch Infektion mit Borrelien hervorgerufenen Krankheiten verwendet werden. Die Formulierung als Nukleinsäurevakzin kann beispielsweise gemäß Eur. J. Immunol. 26 (1996), 2831 -2840, erfolgen.
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele erläutert werden. Es zeigen:
SEQ ID No. 1 und 2 die 151 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo ex primierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 1 zusam- men mit der korrespondierenden 456 bp langen DNA-Sequenz
(P721 5.a).
SEQ ID NO. 3 und 4 die 1 27 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 3 zusammen mit der korrespondierenden 384 bp langen DNA-Sequenz
(P721 5.b) . SEQ ID NO. 5 und 6 die 122 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 5 zusammen mit der korrespondierenden 369 bp langen DNA-Sequenz (P7215.C).
SEQ ID NO. 7 und 8 die 300 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 7 zusammen mit der korrespondierenden 903 bp langen DNA-Sequenz (P78.a) .
SEQ ID NO. 9 und 10 die 163 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 9 zusammen mit der korrespondierenden 492 bp langen DNA-Sequenz (P78.b).
SEQ ID NO. 1 1 und 12 die 264 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 1 1 zusammen mit der korrespondierenden 795 bp langen DNA-Sequenz (P719).
SEQ ID NO. 13 und 14 die 488 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 13 zusammen mit der korrespondierenden 1467 bp langen DNA-Sequenz (P71919).
SEQ ID NO. 1 5 und 16 die 89 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 15 zusammen mit der korrespondierenden 269 bp langen DNA-Sequenz (P718).
SEQ ID NO. 17 und 18 die 79 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 17 zusammen mit der korrespondierenden 239 bp langen DNA-Sequenz (P72).
SEQ ID NO. 19 und 20 die 242 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 1 9 zusammen mit der korrespondierenden 729 bp langen DNA-Sequenz (P73.a) .
SEQ ID NO. 21 und 22 die 1 31 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 21 zusammen mit der korrespondierenden 396 bp langen DNA-Sequenz (P73.b) .
SEQ ID NO. 23 und 24 die 1 71 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 23 zusammen mit der korrespondierenden 51 6 bp langen DNA-Sequenz (P76.a) .
SEQ ID NO. 25 und 26 die 225 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 25 zusammen mit der korrespondierenden 675 bp langen DNA-Sequenz (P76.b).
SEQ ID NO. 27 und 28 die 1 18 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 27 zusammen mit der korrespondierenden 354 bp langen DNA-Sequenz ( Bb1 ) .
SEQ ID NO . 29 und 30 die 1 34 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 29 zusammen mit der korrespondierenden 402 bp langen DNA-Sequenz (pBb 1 5) . SEQ ID NO. 31 und 32 die 127 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 31 zusammen mit der korrespondierenden 381 bp langen DNA-Sequenz (pBb18).
SEQ ID NO. 33 und 34 die 46 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 33 zusammen mit der korrespondierenden 138 bp langen DNA-Sequenz (pBb29).
SEQ ID NO. 35 und 36 die 1 17 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7, in SEQ ID NO. 35 zusammen mit der korrespondierenden 351 bp langen DNA-Sequenz (pBb74).
Fig. 1 das Ergebnis eines Westernblots, bei dem Immunserum von experimentell mit B. burgdorferi infizierten Mäusen gegenüber Zellysaten von in vitro und in vivo kultivierten Borrelien getestet wurde.
Beispiel 1
. Material und Methoden
1.1 In vitro Kultivierung von B. Burgdorferi
Die in vitro Kultivierung von B. Burgdorferi erfolgte nach bekannten Methoden unter Verwendung von Barbour/Stoenner/Kelly-Medium (vgl. z.B. Barbour, Yale J. Biol. Med. 57 (1984), 521 -525) bei 33°C. 1 .2 Mäuse und Infektion mit B. burgdorferi
Ausgewachsene Mäuse der Stämme AKR/N (H-2k), C57BL/6 (H-2b), BALB/c (H-2d) und C.B.-17 seid (H-2d) wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gezüchtet. Zwischen 6 und 8 Wochen alte weibliche Tiere wurden für die Experimente verwendet. Die Mäuse wurden subkutan (s.c.) mit 1 x 103 niedrigpassagierten (zwei bis vier in vitro Passagen) Organismen B. burgdorferi des Stammes ZS7 (Schaible et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1 990), 3768-3772) in den Schwanz geimpft oder über Zecken infiziert.
1 .3 Polyklonales Immunserum
BALB/c-Mäuse wurden mit 1000 bzw. 108 Borrelien in den Schwanz geimpft oder über Zecken infiziert. Das Immunserum (IS) wurde über einen Zeitraum von rund 3 Monaten gesammelt. Normales Mausserum (NMS) wurde von naiven BALB/c-Mäusen gesammelt.
1 .4 in vivo Kultivierung von Borrelien
Borrelien (B. burgdorferi, B. garinii und B. afzellii) wurden in semipermeablen Dialyseschläuchen im Peritoneum von Ratten expandiert. Es wurden Dialyseschläuche der Firma Roth (Molekulargewicht-Ausschlussgrenze 12- 14 kDa) verwendet. Eine Seite des Schlauchs wurde mit Zahnseide zugebunden und die abgebundene Seite nach innen umgestülpt. Die so präparierten Schläuche wurden autoklaviert. Die autoklavierten Dialyseschläuche wurden kurz mit Medium (Barbour/Stoenner/Kelly-Medium; siehe 1 .1 ) gespült. Dann wurden ca. 2,5 ml einer in vitro expandierten Kultur von Spirochäten (5 x 106/ml) eingefüllt und der Schlauch mit autoklavierter Zahnseide zugebunden. Überstehende Schlauchstücke und Zahnseiden- enden wurden abgeschnitten. Die Schläuche wurden von außen gut mit Medium abgespült und in einer Petrischale mit Deckel im Brutschrank gelagert. Die so präparierten Dialyseschiäuche wurden chirurgisch in die peritoneale Hülle von Lewis-Ratten unter Anästhesie implantiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Implantation wurden die Dialyseschläuche entnommen. Die Organismen wurden aus den Dialyseschläuchen entfernt, 3 x in PBS gewaschen und in SDS-Probenpuffer (62,5 mM Tris-HCI, pH 6,8, 10 % (v/v) Glycerin, 2 % (v/v) SDS) aufgenommen. Aliquots wurden bei - 20°C eingefroren.
1.5 Western Blot
Die gemäß 1 .4 erhaltenen Lysate wurden durch Polyacrylamid-SDS- Gelelektrophorese aufgetrennt. Es wurde ein 12,5 % Bis/Acrylamid-Gel (Fertiglösung von BioRad, Kat.-Nr. 161 -0158) in Verbindung mit einem 4,5 % Bis/Acrylamid-Sammelgel verwendet. Nach der Gelelektrophorese wurden die fraktionierten Proteine nach bekannten Methoden elektrophoretisch auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Diese Nitrozellulosemembran wurde dann in Einzelstreifen geschnitten und mit einem Immunserum aus der Maus (1 .3) oder Humanseren zum Nachweis potentiell im Serum vorhandener Anti-Borrelia-Antikörper inkubiert.
1.6 DNA-Präparation aus B. burgdorferi
Hochmolekulare DNA aus dem B. burgdorferi Stamm ZS7 wurde nach Kultivierung in modifiziertem Kelly's Medium gereinigt. Die Spirochäten wurden durch Zentrifugation bei 10.000 g pelletiert und dreimal in PBS- Puffer gewaschen. Das trockene Pellet wurde in 10 ml TE (10 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA, pH 7,4) resuspendiert, mit Lysozym (5 mg/ml) 15 Minuten lang bei 30°C behandelt und die DNA durch Zugabe von 1 ml 20%igem SDS freigesetzt. Nach Zugabe von 1 ,5 ml NaCI (5 mol/l) wurde die Lösung mit einem gleichen Volumen an Phenol extrahiert, gefolgt von einer Extraktion mit Chloroform. Die DNA wurde dann durch Zugabe von 2 Volumina absolutem Ethanol und Inkubation bei -20°C über Nacht gefällt. Nach Zentrifugation wurde der Rückstand in 0,5 ml TE gelöst und mit DNAse freier RNAse A (20 μg/ml( 45 Minuten lang bei 55 °C inkubiert, gefolgt von einer einstündigen Behandlung mit Proteinase K (0, 1 tg/ml) bei 37°C. Die Lösung wurde auf 0,3 mol/l NaOAc eingestellt und mit Phenol- Chloroform wie oben beschrieben extrahiert. Nach Fällung mit Ethanol wurde die DNA wieder in TE aufgenommen.
1.7 Herstellung einer B. burgdorferi Genbank
Hochmolekulare DNA wurde durch drei Sekunden lange Ultraschallbehandlung in ca. 0,5-3 kb lange Fragmente zerlegt. T4-DNA-Polymerase (30 Minuten bei 37°C) und Klenow-Enzym (5 Minuten bei 20°C) wurden dazu verwendet, um die Enden der erzeugten DNA-Fragmente zu glätten. DNA mit glatten Enden wurde in die BamHI-Stelle eines Expressionsvektors pUEXI unter Verwendung einer Adapter-Klonierungsstrategie ligiert (Bresan und Stanley (1 987) Nucl. Acids. Res. S. 1056). Nach einem Größenselektionsschritt durch eine Molekularsieb-Chromatographie über Sepharyl S- 1000 und Transformation von kompetenten Wirtszellen E.coli (MC 1061 ) wurde der Anteil an rekombinanten Kolonien bildenden Einheiten (pfu) wie folgt bestimmt: zufällig ausgewählte Kolonien wurden gepickt und bis zur Sättigung in 2 ml Selektionsmedium (LB mit 25 μg/ml Ampicilin) angezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde nach der üblichen alkalischen Lysis-Methode isoliert und anschließend mit BamHI geschnitten. Mehr als 50% der analysierten Plasmide enthielten durchschnittlich > 1 ,5 kb lange DNA- Insertionen.
1.8 Screening einer B. burgdorferi ZS7-Genbank
Die Zellen wurden auf 24x24 cm Platten bei einer Dichte von 7.000 pfu pro Platte ausplattiert und über Nacht bei 30°C inkubiert. Nach dem Transfer der Kolonien auf Nitrocellulosefilter (NC) wurde die Expression von ß-
Galactosidase-Fusionsproteinen durch zweistündige Inkubation bei 42°C induziert. Die Filter wurden auf ein Whatman 3 MM-Papier transferiert, das mit 5% SDS behandelt worden war, und etwa 25 Minuten lang bei 95 °C inkubiert. Dann wurden die Proteine elektrogeblottet unter Verwendung einer üblichen Apparatur zum halbtrockenen Westernblotting. Nach DNase- Behandlung der NC-Filter wurden immunreaktive Klone durch ein Ex- pressions-Screening unter Verwendung von Anti-B.burgdorferi-Antiseren identifiziert. Unspezifische Bindungsstellen auf den NC-Filtern wurden durch vierstündige Inkubation mit PBS, enthaltend 0,2 % (Gewicht pro Volumen) Gelatine und 3 mmol/l NaN3 bei Raumtemperatur abgesättigt. Anschließend wurden die Filter mit Antiseren von mit B. burgdorferi infizierten Mäusen 18 Stunden lang unter andauerendem Schütteln inkubiert. Nach gründlichem Waschen (PBS + 1 % (Volumen/Volumen) Triton X-100; PBS + 0,5 mol/l Natriumchlorid; PBS + 1 mol/l Natriumchlorid; jeder Schritt 10 Minuten) wurden die Filter mit der 1 : 10.000 Verdünnung einer Peroxidase-markierten F(ab)2-Präparation von Kaninchen-Anti-Maus-lgG-Antikörpern 1 ,5 Stunden lang bei Raumtemperatur unter andauerndem Schütteln inkubiert. Die Filter wurden wieder, wie oben beschrieben, gewaschen und dann mit Diamino- benzidin als Peroxidasesubstrat inkubiert. Positive Klone wurden einer Sequenzanalyse unterzogen.
2. Ergebnisse
2.1 Verwendung als Nachweisreagenz
Fig. 1 zeigt das Ergebnis eines Tests, bei dem Immunserum von experimentell mit B. burgdorferi infizierten Mäusen gegenüber Zellysaten von in vitro (1 .1 ) und in vivo (1 .4) kultivierten Borrelien getestet wurden. Der Western Blot ist in 5 Streifen (D, A, B, C, E) aufgeteilt. Die einzelnen Streifen enthalten folgende Spuren: Laufspur 1 in vitro kultivierte Borrelien,
Laufspur 2 in vivo kultivierte Borrelien (7 Tage), Laufspur 3 in vivo kultivierte Borrelien (1 2 Tage). Die Behandlung der einzelnen Streifen war wie folgt:
Streifen D wurde mit Immunseren von experimentell mit 108 ZS7 Borrelien infizierten Balb/c-Mäusen behandelt.
Streifen A wurden mit Immunseren mit von experimentell mit 103 ZS7 Borrelien infizierten Balb/c-Mäusen (Pool von Immunseren zwischen 30 und 40 Tagen nach der Infektion) behandelt.
Für die Behandlung von Streifen B wurden Immunseren von experimentell mit 103 Borrelien infizierten Balb/c-Mäusen (Pool von Immunseren zwischen 100 und 140 Tagen nach Infektion) verwendet.
Die Behandlung der Streifen C und E erfolgte mit Immunseren von mit dem Fusionsprotein GST-BapA (C) bzw. mit dem Fusionsprotein GST-pG (E) immunisierten Balb/c-Mäusen.
Polyklonale Maus-Immunseren (1.3) zeigten ein restringiertes Muster von 3 bzw. 4 Banden (Molekularmasse ca. 34, 39, 41 und 51 kDa) auf in vitro expandierten Borrelien. Im Gegensatz dazu wurden mit demselben Immunserum zusätzlich zwölf weitere Banden (Molekularmasse ca. 9,5, 18, 1 9, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 und 102 kDa) auf in vivo expandierten Borrelien erkannt.
Die Verwendung von in vivo kultivierten Borrelien, Lysaten, Fraktionen oder Bestandteilen davon kann somit einen wesentlichen Beitrag zur zuverlässigen Diagnostik von Borreliosen leisten.
2.2 Identifizierung von selektiv in vivo exprimierten Antigenen
Das Ergebnis der Sequenzanalyse von 18 B. burgdorferi ZS7 DNA-Sequenzen, die für selektiv in vivo exprimierte Antigene kodieren, ist in SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33 und 35 dargestellt.
2.3 Expressionsklonierung von B. burgdorferi Antigenen
Die in 2.2 identifizierten DNA-Sequenzen wurden in den kommerziell erhältlichen Vektor pUEX1 kloniert und in E.coli MC1061 als Nichtfusions- proteine exprimiert.
2.4 Verwendung als Immunogen
Durch Verwendung von Lysaten und selektiv in vivo exprimierten Antigenen aus in vivo kultivierten Borrelien als Immunogen konnte in Mäusen eine Immunantwort stimuliert werden.
Die Lysate und Antigene wurden den Mäusen 3 x im Abstand von 7 bis 10 Tagen in Mengen von 5 bis 10 μg in 100 μl Adjuvans (ABM 3, Fa. Sebak, Aidenbach, Deutschland) subkutan in die Schwanzwurzel appliziert.
3 Wochen nach der letzten Immunisierung wurde den Mäusen für eine Dauer von 3 bis 4 Monaten Serum abgenommen. Der Gehalt an Anti- Borrelia-Antikörpern wurde bestimmt.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Diagnose einer Borreliose durch Nachweis von Anti- Borrelia-Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nachweisreagenz verwendet, das mehrere Borrelia- Antigene enthält, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man als Nachweisreagenz Lysate von in vivo kultivierten Borrelia-
Zellen oder immunogene Fraktionen oder Bestandteile solcher Lysate oder Borrelia-Zellen verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Borrelien ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus den immunpathogenen Spezies B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii und B. afzellii.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Borrelien aus B. burgdorferi-Organismen ausgewählt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet. daß das Nachweisreagenz ein oder mehrere Borrelia-Antigene enthält, die eine Molekularmasse im Polyacrylamid-SDS-Gel von ca. 9,5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 oder 102 kDa aufweisen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daßdas Nachweisreagenz ein oder mehrere Borrelia-Antigene enthält, die kodiert sind von
(a) einer der in SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33 und 35 gezeigten Nukleotidsequenzen,
(b) einer den Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Sequenz und
(c) einer mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Sequenz, wobei eine Hybridis- ierung noch nach Waschen für eine Stunde mit 1 x SSC und
0, 1 % SDS bei 55 °C nachweisbar ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Nachweisreagenz mit einer zu untersuchenden Probe in
Kontakt bringt und die Reaktion von Antigenen aus dem Nachweisreagenz mit potentiell in der Probe vorhandenen Antikörpern bestimmt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung der Reaktion durch Western Blot, ELISA oder Immunfluoreszenz erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet. daß man als Probe eine Körperflüssigkeit, insbesondere Serum, verwendet.
10. Zelle, die ein oder mehrere Antigene exprimiert, die (i) mit Anti- Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden, wobei die Antigene eine Molekularmasse im Polyacrylamid-SDS-Gel von ca. 9,5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 oder/und 102 kDa aufweisen.
1 1 . Zelle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigene kodiert sind von (a) einer der in SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 ,
23, 25, 27, 29, 31 , 33 und 35 gezeigten Nukleotidsequenzen,
(b) einer den Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Sequenz und
(c) einer mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Sequenz, wobei eine Hybridisierung noch nach Waschen für eine Stunde mit 1 x SSC und 0, 1 % SDS bei 55 °C nachweisbar ist.
12. Zelle nach Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Borrelia-Zelle ist.
1 3. Zelle nach Anspruch 1 2, erhältlich durch in vivo Kultivierung in einer mit einer semipermeablen Membran versehenen Vorrichtung in der Peritonealhöhle eines Versuchstiers.
14. Zelle nach Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie eine heterologe Zelle ist.
15. Lysate einer Zelle nach einem der Ansprüche 10 bis 14.
16. Immunogene Fraktion einer Zelle nach einem der Ansprüche 10 bis 14 oder eines Lysats nach Anspruch 15, die ein oder mehrere Borrelia-Antigene enthält, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden.
17. Borrelia-Antigene, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden, wobei die Antigene eine Molekularmasse im Polyacrylamid-SDS-Gel von ca. 9,5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 oder 102 kDa aufweisen.
18. Borrelia-Antigene, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden, wobei die Antigene kodiert sind von (a) einer der in SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 1 3, 1 5, 1 7, 1 9, 21 ,
23, 25, 27, 29, 31 , 33 und 35 gezeigten Nukleotidsequenzen,
(b) einer den Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Sequenz und
(c) einer mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Sequenz, wobei eine Hybridisierung noch nach Waschen für eine Stunde mit 1 x SSC und 0, 1 % SDS bei 55 °C nachweisbar ist.
19. Antigene nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 8 und besonders bevorzugt mindestens 10 Aminosäuren langen Abschnitt der in SEQ ID NO. 1 bis 12 und/oder 15 bis 36 gezeigten
Aminosäuresequenzen umfassen.
20. Antigene nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie die in SEQ ID NO. 1 bis 12 und/oder 15 bis 36 gezeigten
Aminosäuresequenzen oder eine dazu mindestens 60% identische Sequenz aufweisen.
21 . Antigene nach einem der Ansprüche 17 bis 20, die durch rekom- binante Expression oder chemische Peptidsynthese hergestellt sind.
22. Antigene nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß sie durch rekombinante Expression in einem heterologen Wirtsorganismus, insbesondere E.coli, hergestellt sind.
23. Verwendung von Lysaten nach Anspruch 15, Fraktionen nach Anspruch 16 und Antigenen nach einem der Ansprüche 17 bis 22 als Nachweisreagenzien für Anti-Borrelia-Antikörper.
24. Verwendung von Antigene als Nachweisreagenzien für Anti-Borrelia- Antikörper, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden, wobei die Antigene kodiert sind von (a) der in SEQ ID NO. 13 gezeigten Nukleotidsequenz, (b) einer der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Sequenz und
(c) einer mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Sequenz, wobei eine Hybridis- ierung noch nach Waschen für eine Stunde mit 1 x SSC und
0, 1 % SDS bei 55°C nachweisbar ist.
25. Verwendung von Lysaten nach Anspruch 15, Fraktionen nach Anspruch 16 und Antigenen nach einem der Ansprüche 17 bis 22 als Immunogene zur Erzeugung von Anti-Borrelia-Antikörpern.
26. Verwendung von Antigenen als Immunogene zur Erzeugung von Anti- Borrelia-Antikörpern, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden, wobei die Antigene kodiert sind von
(a) der in SEQ ID NO. 13 gezeigten Nukleotidsequenz,
(b) einer der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Sequenz und
(c) einer mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Sequenz, wobei eine Hybridisierung noch nach Waschen für eine Stunde mit 1 x SSC und 0, 1 % SDS bei 55 °C nachweisbar ist.
27. Reagenzienkit zum Nachweis von Anti-Borrelia-Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß er neben anderen Testkomponenten mehrere Borrelia-Antigene enthält, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden.
28. Immunogene Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere Borrelia-Antigene, die eine Molekularmasse im Polyacrylamid-SDS-Gel von ca. 9,5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 oder 102 kDa aufweisen, enthält.
29. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß sie physiologisch annehmbare Träger- und Hilfsstoffe enthält.
30. Nukleinsäuremolekül, das für ein Borrelia-Antigen kodiert ausgewählt aus
(a) einer der in SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33 und 35 gezeigten Nukleotidsequenzen, (b) einer den Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Sequenz und (c) einer mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Sequenz, wobei eine Hybridisierung noch nach Waschen für eine Stunde mit 1 x SSC und 0, 1 % SDS bei 55 °C nachweisbar ist.
31 . Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 30 enthält.
32. Vektor nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäuremolekül operativ mit einem Expressionssignal verknüpft ist.
33. Immunogene Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nukleinsäure nach Anspruch 30 oder einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 31 oder 32 enthält.
34. Immunogene Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nukleinsäure ausgewählt aus
(a) der in SEQ ID NO. 1 3 gezeigten Nukleotidsequenz,
(b) einer der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Sequenz und
(c) einer mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Sequenz, wobei eine Hybridisierung noch nach Waschen für eine Stunde mit 1 x SSC und 0, 1 % SDS bei 55 °C nachweisbar ist, oder einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 31 oder 32 enthält.
35. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie physiologisch annehmbare Träger- und
Hilfsstoffe enthält.
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