DE19847142A1

DE19847142A1 - Testkit zur Diagnose von Borreliosen und neue Borrelia-Antigene für die Impfstoffentwicklung

Info

Publication number: DE19847142A1
Application number: DE19847142A
Authority: DE
Inventors: Markus Simon; Reinhard Wallich; Michael Kramer
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1998-10-13
Filing date: 1998-10-13
Publication date: 2000-04-27
Also published as: WO2000022134A2; AU6338399A; WO2000022134A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Reagenzienkit zur Diagnose einer Borreliose durch Nachweis von Anti-Borrelia-Antikörpern. Weiterhin werden neue Borrelia-Zellen, Lysate, Fraktionen und Antigene aus solchen Zellen und deren Verwendung als Nachweisreagenzien bzw. als Immunogene offenbart.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Reagenzienkit zur Diagnose einer Borreliose durch Nachweis von Anti-Borrelia-Antikörpern. Weiterhin werden neue Borrelia-Zellen, Lysate, Fraktionen und Antigene aus solchen Zellen und deren Verwendung als Nachweisreagenzien bzw. als Immuno gene offenbart.

Die Lyme-Borreliose ist eine von Zecken übertragene Infektionskrankheit, die durch die Spirochäte Borrelia burgdorferi hervorgerufen wird. Die Krankheit ist eine chronische progressive Infektion, die viele Organe, wie etwa die Haut, das zentrale und periphere Nervensystem, das Herz, die Leber, die Niere, das muskuluskelettale System und Gelenke befällt. Verschiedene Symptome, wie etwa akute Arthritis und Neuroborreliose, können spontan verschwinden, treten jedoch zumeist episodisch wieder auf. Spirochäten wurden wiederholt aus unbehandelten Patienten isoliert, und es gibt zahlreiche Anzeichen für persistente Infektionen selbst nach einer Therapie mit Antibiotika. Da eine zuverlässige Behandlung dieser Krankheit durch Therapie mit Antibiotika deshalb schwierig ist, werden große Anstrengungen unternommen, den Erreger selbst und die Immunantwort des Wirts auf Infektion mit B. burgdorferi zu erforschen. Bei den von der Lyme-Krankheit betroffenen Personen wird zwar zumeist ein hoher Titer an Antikörpern gegen B. burgdorferi im Verlauf der Infektion festgestellt, die jedoch in vielen Fällen keinen Schutz gegen die Infektion bewirken.

Champion et al. (Infect. Immun. 62 (1994), 2653-2661) beschreiben ein als EppA bezeichnetes Polypeptid von B. burgdorferi B31, welches ein Molekulargewicht von ca. 18 kDa aufweist und nicht während einer in vitro- Kultivierung, sondern nur im Laufe einer Infektion exprimiert wird. Akins et al. (Mol. Microbiol. 18 (1995), 507-520) beschreiben ein als BbK2.10 bezeichnetes B. burgdorferi-Protein, das nicht in vitro, sondern nur während einer Infektion exprimiert wird. BbK2.10 hat ein Molekulargewicht im SDS- Gel von ca. 25 kD. Auch das Außenmembranprotein OspG von B. burgdorferi, welches ein Molekulargewicht von 22 kD aufweist, wird vorzugsweise während der Infektion exprimiert (Wallich et al., Infect. Immun. 63 (1995), 3327-3335). Stevenson et al. (Infect. Immun. 63 (1995), 4535-4539) beschreiben eine temperaturabhängige differenzielle Expression von B. burgdorferi-Antigenen. Neben dem Protein OspC mit einer Molekularmasse von ca. 25 kDa werden in den B. burgdorferi-Stämmen B31 und N40 eine differenzielle Expression von Antigenen mit Molekularmassen von 16, 19, 37, 38, 45 und 52 kDa bzw. 18, 20, 3 und 45 kDa gefunden, die in einer in vitro-Kultur bei 35°C stärker als bei 23°C exprimiert werden. Fikrig et al. (Immunity 6 (1997), 531-539) beschreiben eine in vivo- Expression von B. burgdorferi-Antigenen mit Molekularmassen von 35 und 37 kDa, die als potenzielle Kandidaten für diagnostische Tests oder Impfstoffe für die Lyme-Krankheit bezeichnet werden. De Silva et al. (J. Infect. Dis. 177 (1998), 395-400) beschreiben, dass Immunseren aus mit B. burgdorferi infizierten Mäusen zwar eine protektive Wirkung gegen in vitro kultivierte Spirochäten, nicht aber aus Zecken oder infizierten Mäusen stammenden Spirochäten aufweisen.

Derzeit gibt es kein zuverlässiges serologisches Nachweisverfahren zur Diagnose einer Borrelien-Infektion. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die Ursache hierfür darin besteht, dass mit bisher angewandten Methoden nur derjenige Anteil von Antikörpern mit Spezifität für die von den Borrelien in vitro exprimierten Antigene nachgewiesen werden kann, jedoch eine große Anzahl von individuellen Antikörperspezifitäten, die während einer Infektion ausgebildet werden, nicht erfasst werden.

Durch die vorliegende Erfindung wird eine neue Nachweismethode bereitgestellt, die vor allem den Nachweis von selektiv in vivo exprimierten immunogenen Strukturen von Borrelien erlaubt. Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Diagnose einer Borreliose durch Nachweis von Anti-Borrelia-Antikörpern gegen in vivo exprimierte Borrelia-Antigene. Dabei wird insbesondere ein Nachweisreagenz verwendet, das ein oder mehrere Borrelia-Antigene enthält, die

a) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organis men reagieren,
b) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und
c) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden.

Selektiv in vivo exprimierte Antigene von Borrelien gemäß vorliegender Erfindung werden in vivo um mindestens den Faktor 2, vorzugsweise um mindestens den Faktor 5 und besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 10 stärker als in vitro (Kultivierungsbedingungen Beispiel 1.1) exprimiert.

Vorzugsweise verwendet man als Nachweisreagenz, das eine Kombination von mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei selektiv in vivo exprimierten Borrelia-Antigenen enthält. Das Nachweisreagenz kann gebildet sein aus Lysaten von in vivo kultivierten Borrelia-Zellen, immunogenen Fraktionen oder Bestandteilen solcher Lysate oder Borrelia-Zellen oder isolierten Antigenen, wobei es sich um native oder um rekombinante Antigene handeln kann, die gegebenenfalls biochemisch oder molekularbio logisch verändert sein können (z. B. Additions-, Deletions- oder Substitu tionsvarianten oder Peptidfragmente).

Borrelia-Zellen, die ein geeignetes Antigenmuster exprimieren, sind erhältlich durch in vivo Kultivierung in einer mit einer semipermeablen Membran versehenen Vorrichtung im Peritoneum eines Versuchstiers, z. B. Ratten bzw. Mäusen. Aus den auf diese Weise erhältlichen Borrelia-Zellen können Gesamt-Lysate (z. B. durch Lyse mit SDS) oder Fraktionen oder einzelne Bestandteile davon (z. B. durch chromatographische Auftrennung, isoelektri sche Fokussierung, etc.) gewonnen werden, die als Nachweisreagenzien für die Diagnose von Borreliosen eingesetzt werden können. Hierzu wird das Nachweisreagenz mit einer zu untersuchenden Probe, vorzugsweise einer Antikörper enthaltenden Körperflüssigkeit, insbesondere Serum, aber auch beispielsweise Cerebrospinalflüssigkeit, aus einem potentiell infizierten Organismus, insbesondere einem Säugetier, z. B. einem Menschen, in Kontakt gebracht und die Reaktion von Antigenen aus dem Nachweisrea genz mit potentiell (bei einer Infektion mit Borrelien) in der Probe vorhande nen Antikörpern bestimmt. Die Bestimmung der Antigen-Antikörper-Reaktion kann auf übliche Weise erfolgen. Beispielsweise erfolgt die Bestimmung durch Western Blot, wobei eine Präparation, die vorzugsweise mehrere Antigene enthält, z. B. gelelektrophoretisch aufgetrennt und dann mit der Probe in Kontakt gebracht wird. Alternativ kann die Bestimmung auch durch andere immunologische Verfahren, z. B. ELISA oder Immunfluoreszenz, erfolgen. Eine Mischung monoklonaler Antikörper gegen Borrelia-Antigene kann als Marker verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich zum Nachweis aller Borrelia-Organismen geeignet. Vorzugsweise werden die Organismen ausgewählt aus der Gruppe der humanen pathogenen Spirochäten, bestehend z. B. aus B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii und B. afzellii. Am meisten bevorzugt werden die Borrelien aus B. burgdorferi sensu lato Organismen ausgewählt. Ein spezifisches Beispiel für einen geeigneten Borrelienstamm ist B. burgdorferi ZS7 (DSM 5527).

Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren erlaubt aufgrund des Vorhanden seins von zusätzlichen in vivo exprimierten Antigenen eine wesentlich zuverlässigere Diagnostik von Borreliosen als die Verfahren des Standes der Technik.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die in vivo kultivierten Borrelien gegenüber bekannten in vitro kultivierten Borrelien ein oder mehrere zusätzliche Antigene, d. h. immunogene Polypeptide, exprimieren, die eine Molekularmasse im Polyacrylamid-SDS-Gel von ca. 9,5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 und 102 kDa aufweisen.

Besonders bevorzugt enthält das Nachweisreagenz ein oder mehrere Borrelia-Antigene, die kodiert sind von:

a) einer der in Fig. 1 bis 13 gezeigten Nukleotidsequenzen,
b) einer den Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des geneti schen Codes entsprechenden Sequenz und
c) einer mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Sequenz.

Die in den Fig. 1 bis 13 gezeigten Nukleotidsequenzen kodieren für neue in vivo exprimierte Antigene aus B. burgdorferi ZS7 oder Teilsequenzen davon mit den ebenfalls in den Fig. 1 bis 13 gezeigten Aminosäurese quenzen.

Neben den in den Fig. 1 bis 13 gezeigten Nukleotidsequenzen und diesen Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes ent sprechenden Nukleotidsequenzen umfaßt die vorliegende Erfindung auch solche Sequenzen, die damit unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press (1989), 1.101 bis 1.104) verwendet. Demnach spricht man von einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C, insbesondere für eine Stunde im 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridi sierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit einer der in den Fig. 1 bis 7 gezeigten Nukleotidsequenzen oder einer damit im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz hybridisierende Sequenz wird von der vorliegenden Erfindung umfaßt.

Darüber hinaus erfaßt die vorliegende Erfindung auch Nukleotidsequenzen, die auf Nukleotidebene eine Homologie von mindestens 70%, besonders bevorzugt von mindestens 80% zu den in den Fig. 1 bis 13 dargestellten Nukleotidsequenzen aufweisen. Derartige Nukleotidsequenzen sind aus Organismen ausgewählt aus der Gruppe der humanen pathogenen Spirochäten, insbesondere aus Borrelien, oder durch Mutagenese (z. B. ortsspezifische Mutagenese) der konkret offenbarten Nukleotidsequenzen erhältlich. Die Nukleotidsequenzen weisen eine Länge von mindestens 15, besonders bevorzugt von mindestens 20 Nukleotiden auf.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können in einem Vektor vorliegen. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryon tischer Vektor sein, auf dem sich die Nukleotidsequenz vorzugsweise unter Kontrolle eines Expressionssignals (Promotor, Operator, Enhancer etc.) befindet. Beispiele für prokaryontische Vektoren sind chromosomale Vektoren wie etwa Bakteriophagen (z. B. Bakteriophage λ) und extrachromo somale Vektoren wie etwa Plasmide, wobei zirkuläre Plasmidvektoren besonders bevorzugt sind. Geeignete prokaryontische Vektoren sind z. B. bei Sambrook et al., supra, Kap. 1 bis 4, beschrieben.

Andererseits kann die Nukleinsäure auch in einem eukaryontischen Vektor vorliegen, z. B. einem Hefevektor oder einem für höhere Zellen geeigneten Vektro (z. B. einem Plasmidvektor, viralem Vektor oder Pflanzenvektor). Derartige Vektoren sind beispielsweise bei Sambrook et al., supra, Kap. 16, beschrieben.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zelle, die ein oder mehrere Antigene exprimiert, die

a) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organis men reagieren,
b) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder nur gering exprimiert werden und
c) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden, wobei die Antigene eine Molekularmasse im Polyacrylamid-SDS-Gel von ca. 9,5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 und 102 kDa aufweisen.

Besonders bevorzugt werden die Borrelia-Antigene kodiert von Nukleinsäu ren wie zuvor angegeben. Bei den Zellen kann es sich einerseits um unter geeigneten Bedingungen kultivierte Borrelia-Zellen handeln. Andererseits kann es sich jedoch auch um heterologe Zellen handeln, d. h. Nicht-Borrelia- Zellen, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. einem erfin dungsgemäßen Vektor transformiert sind und daher Borrelia-Antigene exprimieren können. In einer bevorzugten Ausführungsform sind solche heterologen Zellen prokaryontische Zellen, vorzugsweise gram-negative prokaryontische Zellen, insbesondere E.coli Zellen. Andererseits können die Zellen jedoch auch eukaryontische Zellen sein, wie etwa Pilzzellen (z. B. Hefe), tierische oder pflanzliche Zellen.

Borrelia-Zellen, die geeignete Antigene produzieren, sind - wie bereits ausgeführt - erhältlich durch in vivo Kultivierung in einer mit einer semiper meablen Membran versehenen Vorrichtung, z. B. einem Dialyseschlauch, im Peritoneum eines Versuchstiers, vorzugsweise einer Ratte oder einer Maus.

Heterologe Zellen, die geeignete Antigene produzieren, sind durch Trans formation mit Antigen-kodierenden Nukleinsäuren oder Vektoren und anschließende Kultivierung unter geeigneten Bedingungen, die zu einer Expression des Antigens führen, erhältlich.

Noch ein weiterer Gegenstand ist ein Lysat einer erfindungsgemäßen Zelle z. B. ein Gesamt-Lysat sowie eine immunogene Fraktion der Zelle oder des Lysats, wobei diese immunogene Fraktion ein oder mehrere Borrelia- Antigene enthält, die von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder nur gering exprimiert werden.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Borrelia-Antigene, die

Vorzugsweise haben diese Antigene eine Molekularmasse wie zuvor angegeben. Besonders bevorzugt sind die Antigene von einer erfindungs gemäße Nukleinsäure wie zuvor angegeben kodiert. Weiterhin ist bevorzugt, daß sie mindestens einen sechs Aminosäuren, vorzugsweise mindestens acht Aminosäuren und besonders bevorzugt mindestens zehn Aminosäuren langen Abschnitt der in den Fig. 1 bis 13 gezeigten Aminosäuresequen zen umfassen oder/und daß sie die in den Fig. 1 bis 13 gezeigten Aminosäuresequenzen oder eine auf Aminosäureebene dazu mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 80% und besonders bevorzugt mindestens 90% identische Sequenz aufweisen.

Diese Antigene können in Form von Lysaten, Zellfraktionen oder in isolierter Form eingesetzt werden. In isolierter Form sind die Antigene erhältlich, z. B. durch Immunsorption eines Borrelien-Lysats mit immobilisiertem Anti- Borrelia-Immunserum bzw. monoklonalen Antikörpern gegen Borrelien proteine, um nichtimmunogene Bestandteile des Lysats abzutrennen, und anschließende Auftrennung der Antigene nach Größe oder/und Ladung, z. B. durch Gelelektrophorese, HPLC oder/und isoelektrische Fokussierung.

Alternativ können isolierte Antigene auch durch rekombinante Methoden gewonnen werden. Hierzu wird eine Zelle vorzugsweise mit einem erfin dungsgemäßen Nukleinsäuremolekül oder Vektor transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression des Antigens stattfindet und das Antigen aus der Zelle oder/und aus dem Kulturüberstand isoliert. Dabei kann das erfindungsgemäße Antigen sowohl als Fusionspolypeptid als auch als Nicht-Fusionspolypeptid gewonnen werden.

Noch eine weitere Möglichkeit zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Antigene in isolierter Form - insbesondere wenn sie nur Teilabschnitte der natürlichen Sequenzen enthalten - besteht in einer chemischen Synthese durch bekannte Methoden. Dabei können auch chemisch derivatisierte oder/und modifizierte Aminosäurebausteine (blockierte Seitengruppen oder/und D-Aminosäuren) in die Sequenz eingefügt werden.

Die erfindungsgemäßen Lysate, Fraktionen und Antigene können als Nachweisreagenzien für Anti-Borrelia-Antikörper sowie als Immunogene zur Erzeugung von Anti-Borrelia-Antikörpern eingesetzt werden. Die Erfindung betrifft somit auch einen Reagenzienkit zum Nachweis von Anti-Borrelia- Antikörpern, der neben anderen Testkomponenten ein oder mehrere Borrelia- Antigene enthält, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden.

Schließlich betrifft die Erfindung auch eine immunogene Zusammensetzung, die gegebenenfalls als Vakzin eingesetzt werden kann und ein oder mehrere Borrelia-Antigene enthält, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren und (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden, sowie gegebenenfalls physiologisch annehmbare Trägerstoffe, z. B. physiologisch annehmbare Trägerflüssigkei ten wie Salzlösungen, und Hilfsstoffe, z. B. immunologische Adjuvanzien, wie etwa Freund'sches Adjuvans, Aluminiumphosphat etc. enthält.

Die in der immunogenen Zusammensetzung enthaltenen Antigene werden insbesondere in Form von rekombinanten Polypeptiden oder Lipoproteinen eingesetzt, die durch Isolierung des entsprechenden Gens, z. B. aus einer B. burgdorferi-Expressionsgenbank, und Klonierung in heterologe Organismen, wie etwa E.coli, Säugerzellen, Insektenzellen etc., herstellbar sind.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch Nukleinsäuremoleküle, die für Borrelia-Antigene wie zuvor angegeben kodieren und rekombinante Vektoren, die mindestens eine Kopie eines erfindungsgemäßen Nukleinsäu remoleküls vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einem Expressions signal enthalten. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können als Nukleinsäure-Vakzine zur Bekämpfung oder/und Prävention von durch Infektion mit Borrelien hervorgerufenen Krankheiten verwendet werden. Die Formulierung als Nukleinsäurevakzin kann beispielsweise gemäß Eur. J. Immunol. 26 (1996), 2831-2840, erfolgen.

Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele erläutert werden. Es zeigen:

Fig. 1 die 151 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten. Antigens aus B. burgdorferi ZS7 zusammen mit der korrespon dierenden 456 bp langen DNA-Sequenz (P7215.a).

Fig. 2 die 127 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7 zusammen mit der korrespon dierenden 384 bp langen DNA-Sequenz (P7215.b).

Fig. 3 die 122 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7 zusammen mit der korrespon dierenden 369 bp langen DNA-Sequenz (P7215.c).

Fig. 4 die 300 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7 zusammen minder korrespon dierenden 903 bp langen DNA-Sequenz (P78.a).

Fig. 5 die 163 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7 zusammen mit der korrespon dierenden 492 bp langen DNA-Sequenz (P78.b).

Fig. 6 die 264 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7 zusammen mit der korrespon dierenden 795 bp langen DNA-Sequenz (P719).

Fig. 7 die 488 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7 zusammen mit der korrespon dierenden 1467 bp langen DNA-Sequenz (P71919).

Fig. 8 die 89 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo exprimier ten Antigens aus B. burgdorferi ZS7 zusammen mit der korrespondierenden 269 bp langen DNA-Sequenz (P718).

Fig. 9 die 79 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo exprimier ten Antigens aus B. burgdorferi ZS7 zusammen mit der korrespondierenden 239 bp langen DNA-Sequenz (P72).

Fig. 10 die 242 Aminosäuren lange Sequenz eines in vivo exprimierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7 zusammen mit der korrespon dierenden 729 bp langen DNA-Sequenz (P73.a).

Fig. 11 die 131 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo ex primierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7 zusammen mit der korrespondierenden 396 bp langen DNA-Sequenz (P73.b).

Fig. 12 die 171 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo ex primierten Antigens aus B. burgdorferi ZS7 zusammen mit der korrespondierenden 516 bp langen DNA-Sequenz (P76.a).

Fig. 13 die 225 Aminosäuren lange Teilsequenz eines in vivo ex primierten Antigens aus S. burgdorferi ZS7 zusammen mit der korrespondierenden 675 bp langen DNA-Sequenz (P76.b).

Fig. 14 das Ergebnis eines Westernblots, bei dem Immunserum von experimentell mit B. burgdorferi infizierten Mäusen gegenüber Zellysaten von in vitro und in vivo kultivierten Borrelien getestet wurde.

Beispiel 1 1. Material und Methoden 1.1 In vitro Kultivierung von B. Burgdorferi

Die in vitro Kultivierung von B. Burgdorferi erfolgte nach bekannten Methoden unter Verwendung von Barbour/Stoenner/Kelly-Medium (vgl. z. B. Barbour, Yale J. Biol. Med. 57 (1984), 521-525) bei 33°C.

1.2 Mäuse und Infektion mit B. burgdorferi

Ausgewachsene Mäuse der Stämme AKR/N (H-2^k), C57BL/6 (H-2^b), BALB/c (H-2^d) und C.B.-17 scid (H-2^d) wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gezüchtet. Zwischen 6 und 8 Wochen alte weibliche Tiere wurden für die Experimente verwendet. Die Mäuse wurden subkutan (s.c.) mit 1 × 10³ niedrigpassagierten (zwei bis vier in vitro Passagen) Organismen B. burgdorferi des Stammes ZS7 (Schaible et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 3768-3772) in den Schwanz geimpft oder über Zecken infiziert.

1.3 Polyklonales Immunserum

BALB/c-Mäuse wurden mit 1000 bzw. 108 Borrelien in den Schwanz geimpft oder über Zecken infiziert. Das Immunserum (IS) wurde über einen Zeitraum von rund 3 Monaten gesammelt. Normales Mausserum (NMS) wurde von naiven BALB/c-Mäusen gesammelt.

1.4 In vivo Kultivierung von Borrelien

Borrelien (B. burgdorferi, B. garinii und B. afzellii) wurden in semipermeablen Dialyseschläuchen im Peritoneum von Ratten expandiert. Es wurden Dialyseschläuche der Firma Roth (Molekulargewicht-Ausschlussgrenze 12-14 kDa) verwendet. Eine Seite des Schlauchs wurde mit Zahnseide zugebunden und die abgebundene Seite nach innen umgestülpt. Die so präparierten Schläuche wurden autoklaviert. Die autoklavierten Dialyse schläuche wurden kurz mit Medium (Barbour/Stoenner/Kelly-Medium; siehe 1.1) gespült. Dann wurden ca. 2,5 ml einer in vitro expandierten Kultur von Spirochäten (5 × 10⁶/ml) eingefüllt und der Schlauch mit autoklavierter Zahnseide zugebunden. Überstehende Schlauchstücke und Zahnseiden enden wurden abgeschnitten. Die Schläuche wurden von außen gut mit Medium abgespült und in einer Petrischale mit Deckel im Brutschrank gelagert. Die so präparierten Dialyseschläuche wurden chirurgisch in die peritoneale Hülle von Lewis-Ratten unter Anästhesie implantiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Implantation wurden die Dialyseschläuche entnommen. Die Organismen wurden aus den Dialyseschläuchen entfernt, 3 × in PBS gewaschen und in SDS-Probenpuffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6, 8, 10% (v/v) Glycerin, 2% (v/v) SDS) aufgenommen. Aliquots wurden bei -20°C eingefroren.

1.5 Western Blot

Die gemäß 1.3 erhaltenen Lysate wurden durch Polyacrylamid-SDS- Gelelektrophorese aufgetrennt. Es wurde ein 12,5% Bis/Acrylamid-Gel (Fertiglösung von BioRad, Kat.-Nr. 161-0158) in Verbindung mit einem 4,5% Bis/Acrylamid-Sammelgel verwendet. Nach der Gelelektrophorese wurden die fraktionierten Proteine nach bekannten Methoden elektrophoretisch auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Diese Nitrozellulosemembran wurde dann in Einzelstreifen geschnitten und mit einem Immunserum aus der Maus (1.3) oder Humanseren zum Nachweis potentiell im Serum vorhandener Anti-Borrelia-Antikörper inkubiert.

1.6 DNA-Präparation aus B. burgdorferi

Hochmolekulare DNA aus dem B. burgdorferi Stamm ZS7 wurde nach Kultivierung in modifiziertem Kelly's Medium gereinigt. Die Spirochäten wurden durch Zentrifugation bei 10.000 g pelletiert und dreimal in PBS- Puffer gewaschen. Das trockene Pellet wurde in 10 ml TE (10 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA, pH 7,4) resuspendiert, mit Lysozym (5 mg/ml) 15 Minuten lang bei 30°C behandelt und die DNA durch Zugabe von 1 ml 20%igem SDS freigesetzt. Nach Zugabe von 1,5 ml NaCl (5 mol/l) wurde die Lösung mit einem gleichen Volumen an Phenol extrahiert, gefolgt von einer Extraktion mit Chloroform. Die DNA wurde dann durch Zugabe von 2 Volumina absolutem Ethanol und Inkubation bei -20°C über Nacht gefällt. Nach Zentrifugation wurde der Rückstand in 0,5 ml TE gelöst und mit DNAse freier RNAse A (20 µg/ml (45 Minuten lang bei 55°C inkubiert, gefolgt von einer einstündigen Behandlung mit Proteinase K (0,1 µg/ml) bei 37°C. Die Lösung wurde auf 0,3 mol/l NaOAc eingestellt und mit Phenol- Chloroform wie oben beschrieben extrahiert. Nach Fällung mit Ethanol wurde die DNA wieder in TE aufgenommen.

1.7 Herstellung einer B. burgdorferi Genbank

Hochmolekulare DNA wurde durch drei Sekunden lange Ultraschall behandlung in ca. 0,5-3 kb lange Fragmente zerlegt. T4-DNA-Polymerase (30 Minuten bei 37°C) und Klenow-Enzym (5 Minuten bei 20°C) wurden dazu verwendet, um die Enden der erzeugten DNA-Fragmente zu glätten. DNA mit glatten Enden wurde in die BamHl-Stelle eines Expressionsvektors pUEXI unter Verwendung einer Adapter-Klonierungsstrategie ligiert (Bresan und Stanley (1987) Nucl. Acids. Res. S. 1056). Nach einem Größenselek tionsschritt durch eine Molekularsieb-Chromatographie über Sepharyl S-1000 und Transformation von kompetenten Wirtszellen E.coli (MC 1061) wurde der Anteil an rekombinanten Kolonien bildenden Einheiten (pfu) wie folgt bestimmt: zufällig ausgewählte Kolonien wurden gepickt und bis zur Sättigung in 2 ml Selektionsmedium (LB mit 25 µg/ml Ampicilin) angezüch tet. Die Plasmid-DNA wurde nach der üblichen alkalischen Lysis-Methode isoliert und anschließend mit BamHl geschnitten. Mehr als 50% der analysierten Plasmide enthielten durchschnittlich ≧ 1,5 kb lange DNA- Insertionen.

1.8 Screening einer B. burgdorferi ZS7-Genbank

Die Zellen wurden auf 24 × 24 cm Platten bei einer Dichte von 7.000 pfu pro Platte ausplattiert und über Nacht bei 30°C inkubiert. Nach dem Transfer der Kolonien auf Nitrocellulosefilter (NC) wurde die Expression von β- Galactosidase-Fusionsproteinen durch zweistündige Inkubation bei 42°C induziert. Die Filter wurden auf ein Whatman 3 MM-Papier transferiert, das mit 5% SDS behandelt worden war, und etwa 25 Minuten lang bei 95°C inkubiert. Dann wurden die Proteine elektrogeblottet unter Verwendung einer üblichen Apparatur zum halbtrockenen Westernblotting. Nach DNAse- Behandlung der NC-Filter wurden immunreaktive Klone durch ein Ex pressions-Screening unter Verwendung von Anti-B. burgdorferi-Antiseren identifiziert. Unspezifische Bindungsstellen auf den NC-Filtern wurden durch vierstündige Inkubation mit PBS, enthaltend 0,2% (Gewicht pro Volumen) Gelatine und 3 mmol/l NaN₃ bei Raumtemperatur abgesättigt. Anschließend wurden die Filter mit Antiseren von mit B. burgdorferi infizierten Mäusen 18 Stunden lang unter andauerendem Schütteln inkubiert. Nach gründlichem Waschen (PBS + 1% (Volumen/Volumen) Triton X-100; PBS+0,5 mol/l Natriumchlorid; PBS+1 mol/l Natriumchlorid; jeder Schritt 10 Minuten) wurden die Filter mit der 1 : 10.000 Verdünnung einer Peroxidase-markierten F(ab)₂-Präparation von Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Antikörpern 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur unter andauerndem Schütteln inkubiert. Die Filter wurden wieder, wie oben beschrieben, gewaschen und dann mit Diamino benzidin als Peroxidasesubstrat inkubiert. Positive Klone wurden einer Sequenzanalyse unterzogen.

2. Ergebnisse 2.1 Verwendung als Nachweisreagenz

Fig. 14 zeigt das Ergebnis eines Tests, bei dem Immunserum von experi mentell mit B. burgdorferi infizierten Mäusen gegenüber Zellysaten von in vitro (1.1) und in vivo (1.4) kultivierten Borrelien getestet wurden. Der Western Blot ist in 5 Streifen (D, A, B, C, E) aufgeteilt. Die einzelnen Streifen enthalten folgende Spuren:
Laufspur 1 in vitro kultivierte Borrelien,
Laufspur 2 in vivo kultivierte Borrelien (7 Tage),
Laufspur 3 in vivo kultivierte Borrelien (12 Tage).

Die Behandlung der einzelnen Streifen war wie folgt:

Streifen D wurde mit Immunseren von experimentell mit 10⁸ ZS7 Borrelien infizierten Balb/c-Mäusen behandelt.

Streifen A wurden mit Immunseren mit von experimentell mit 10³ ZS7 Borrelien infizierten Balb/c-Mäusen (Pool von Immunseren zwischen 30 und 40 Tagen nach der Infektion) behandelt.

Für die Behandlung von Streifen B wurden Immunseren von experimentell mit 10³ Borrelien infizierten Balb/c-Mäusen (Pool von Immunseren zwischen 100 und 140 Tagen nach Infektion) verwendet.

Die Behandlung der Streifen C und E erfolgte mit Immunseren von mit dem Fusionsprotein GST-BapA (C) bzw. mit dem Fusionsprotein GST-pG (E) immunisierten Balb/c-Mäusen.

Polyklonale Maus-Immunseren (1.3) zeigten ein restringiertes Muster von 3 bzw. 4 Banden (Molekularmasse ca. 34, 39, 41 und 51 kDa) auf in vitro expandierten Borrelien. Im Gegensatz dazu wurden mit demselben Immunserum zusätzlich zwölf weitere Banden (Molekularmasse ca. 9,5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 und 102 kDa) auf in vivo expandierten Borrelien erkannt.

Die Verwendung von in vivo kultivierten Borrelien, Lysaten, Fraktionen oder Bestandteilen davon kann somit einen wesentlichen Beitrag zur zuverlässi gen Diagnostik von Borreliosen leisten.

2.2 Identifizierung von selektiv in vivo exprimierten Antigenen

Das Ergebnis der Sequenzanalyse von 7 B. burgdorferi ZS7 DNA-Sequenzen, die für selektiv in vivo exprimierte Antigene kodieren, ist in den Fig. 1 bis 13 dargestellt.

2.3 Expressionsklonierung von B. burgdorferi Antigenen

Die in 2.2 identifizierten DNA-Sequenzen wurden in den kommerziell erhältlichen Vektor pUEX1 kloniert und in E.coli MC1061 als Nichtfusions proteine exprimiert.

2.4 Verwendung als Immunogen

Durch Verwendung von Lysaten und selektiv in vivo exprimierten Antigenen aus in vivo kultivierten Borrelien als Immunogen konnte in Mäusen eine Immunantwort stimuliert werden.

Die Lysate und Antigene wurden den Mäusen 3 × im Abstand von 7 bis 10 Tagen in Mengen von 5 bis 10 µg in 100 µl Adjuvans (ABM 3, Fa. Sebak, Aidenbach, Deutschland) subkutan in die Schwanzwurzel appliziert.

3 Wochen nach der letzten Immunisierung wurde den Mäusen für eine Dauer von 3 bis 4 Monaten Serum abgenommen. Der Gehalt an Anti- Borrelia-Antikörpern wurde bestimmt.

Claims

1. Verfahren zur Diagnose einer Borreliose durch Nachweis von Anti- Borrelia-Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nachweisreagenz verwendet, das ein oder mehrere Borrelia-Antigene enthält, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nachweisreagenz Lysate von in vivo kultivierten Borrelia- Zellen oder immunogene Fraktionen oder Bestandteile solcher Lysate oder Borrelia-Zellen verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Borrelien ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus den immunpathogenen Spezies B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii und B. afzellii.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Borrelien aus B. burgdorferi-Organismen ausgewählt werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Nachweisreagenz ein oder mehrere Borrelia-Antigene enthält, die eine Molekularmasse im Polyacrylamid-SDS-Gel von ca. 9,5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 oder 102 kDa aufweisen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Nachweisreagenz ein oder mehrere Borrelia-Antigene enthält, die kodiert sind von

a) einer der in den Fig. 1 bis 13 gezeigten Nukleotidsequen zen,
b) einer den Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Sequenz und
c) einer mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Sequenz.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Nachweisreagenz mit einer zu untersuchenden Probe in Kontakt bringt und die Reaktion von Antigenen aus dem Nachweis reagenz mit potentiell in der Probe vorhandenen Antikörpern bestimmt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung der Reaktion durch Western Blot, ELISA oder Immunfluoreszenz erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Probe eine Körperflüssigkeit, insbesondere Serum, verwendet.

10. Zelle, die ein oder mehrere Antigene exprimiert, die (i) mit Anti- Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden, wobei die Antigene eine Molekularmasse im Polyacrylamid-SDS-Gel von ca. 9,5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 oder/und 102 kDa aufweisen.

11. Zelle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigene kodiert sind von

12. Zelle nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Borrelia-Zelle ist.

13. Zelle nach Anspruch 12, erhältlich durch in vivo Kultivierung in einer mit einer semipermeablen Membran versehenen Vorrichtung im Peritoneum eines Versuchstiers.

14. Zelle nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine heterologe Zelle ist.

15. Lysate einer Zelle nach einem der Ansprüche 10 bis 14.

16. Immunogene Fraktion einer Zelle nach einem der Ansprüche 10 bis 14 oder eines Lysats nach Anspruch 15, die ein oder mehrere Borrelia-Antigene enthält, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden.

17. Borrelia-Antigene, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden.

18. Antigene nach Anspruch 17, die eine Molekularmasse im Polyacryl amid-SDS-Gel von ca. 9,5, 18, 19, 30, 32, 33, 62, 70, 80, 90, 100 oder 102 kDa aufweisen.

19. Antigene nach Anspruch 17 oder 18, die kodiert sind von

20. Antigene nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 8 und besonders bevorzugt mindestens 10 Aminosäuren langen Abschnitt der in Fig. 1 bis 13 gezeigten Aminosäuresequenzen umfassen.

21. Antigene nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie die in Fig. 1 bis 13 gezeigten Aminosäuresequenzen oder eine dazu mindestens 60% identische Sequenz aufweisen.

22. Antigene nach einem der Ansprüche 18 bis 21, die durch rekom binante Expression oder chemische Peptidsynthese hergestellt sind.

23. Antigene nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch rekombinante Expression in einem heterologen Wirtsorganismus, insbesondere E.coli, hergestellt sind.

24. Verwendung von Lysaten nach Anspruch 15, Fraktionen nach Anspruch 16 und Antigenen nach einem der Ansprüche 17 bis 23 als Nachweisreagenzien für Anti-Borrelia-Antikörper.

25. Verwendung von Lysaten nach Anspruch 15, Fraktionen nach Anspruch 16 und Antigenen nach einem der Ansprüche 17 bis 23 als Immunogene zur Erzeugung von Anti-Borrelia-Antikörpern.

26. Reagenzienkit zum Nachweis von Anti-Borrelia-Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß er neben anderen Testkomponenten ein oder mehrere Borrelia- Antigene enthält, die (i) mit Anti-Borrelia-Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden.

27. Immunogene Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere Borrelia-Antigene, die (i) mit Anti-Borrelia- Immunserum aus mit Borrelien infizierten Organismen reagieren, (ii) von in vitro kultivierten Borrelien nicht oder gering exprimiert werden und (iii) von in vivo kultivierten Borrelien stark exprimiert werden sowie gegebenenfalls physiologisch annehmbare Träger- und Hilfsstoffe enthält.

28. Nukleinsäuremolekül, das für ein Borrelia-Antigen kodiert ausgewählt aus

29. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 28 enthält.

30. Vektor nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäuremolekül operativ mit einem Expressionssignal verknüpft ist.

31. Immunogene Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nukleinsäure nach Anspruch 28 oder einen rekom binanten Vektor nach Anspruch 29 oder 30 sowie gegebenenfalls physiologisch annehmbare Träger- und Hilfsstoffe enthält.