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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung und Diagnose von bakteriellen
Infektionen, insbesondere von grampositiven Kokken, insbesondere
Enterococci.
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Der
weitverbreitete Gebrauch von Antibiotika und anderen Mitteln (z.B.
Penicillin, Vancomycin, Methicillin, Cephalosporin, Tetracyclin,
Chloramphenicol, Glycopeptide und Aminoglycoside) zur Behandlung
bakterieller Infektionen hat zu der raschen Entwicklung von gegenüber diesen
Mitteln resistenten Bakterien geführt (siehe z.B. CDC, 1993,
JAMA, 270: 1796; IDCP, 1996, Infect. Dis. Pract., 5: 1-2; Spera,
R.V. und Farber, B.F., 1994, Drugs, 48: 678-688) und viele Bakterien
besitzen eine mehrfache Arzneimittelresistenz. Dies erweist sich
als besonderes Problem in klinischen Umgebungen (Morris, J.G. et
al., 1995, Ann. Intern. Med., 123: 250-259; Boyce, J.M. et al.,
J. Clin. Micro., 32: 1148-1153). Bakterien, die besonders problematisch
sind, sind Enterococci und Staphylococci.
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Enterococci
sind die zweithäufigsten
im Krankhaus erlangten Infektionen in den USA, die zu intraabdominalen
Abszessen, Endocarditis, Infektionen des Harnwegs und des Weichgewebes
und zur Sepsis (mit einer hohen Sterblichkeit von 34 bis 68 %) führen. Sie
sind nun resistent gegen Ampicillin, Gentamicin und zunehmend Vancomycin.
VRE (Vancomycin-resistente Enterococci) sind derzeit nicht behandelbar
und verantwortlich für
14 % Sepsis in der Intensivpflege. Es hat einen 20fachen Anstieg
von VRE zwischen 1989 und 1993 gegeben (CDC National Nosocomial
Infection Surveillance; WHO Report, 1996).
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Staphylococcus
aureus ist einer der häufigsten
Gründe
für Hautinfektionen,
Sepsis, Osteomyelitis und Endocarditis. 26 % von S. aureus-Isolaten
in Frankreich (1989) und 38,3 % in den USA (1991) 38,3 %, waren multi-resistente
MRSA (Methicillin-resistente S. aureus). Das MRSA ist resistent
gegenüber
allen Antibiotika außer
Vancomycin, wobei die Sterblichkeit von MRSA-Sepsis 40 % beträgt. Dennoch
ist die Verwendung von Vancomycin eines der letzten Mittel, da es
zu Nephrotoxizität,
Knochenmarkstoxizität
und zum „Red
Man Syndrom" führen kann.
Die Übertragung
einer Vancomycin-Resistenz von einem VRE auf S. aureus wurde in
einem Labor und klinisch mit gewissen Spezies von Staphylococcus
demonstriert. Es gibt eine signifikante Wahrscheinlichkeit, dass
dies mit S. aureus in Patienten auftreten kann und zur Bildung eines
Bakteriums führen
würde,
dass durch derzeitige Therapien nicht behandelbar ist.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein bakterielles ABC-Transporterprotein oder ein
immunogenes Frag ment hiervon für
die Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen
oder tierischen Körpers
bereitgestellt. Ebenso wird ein bakterielles ABC-Transporterprotein
oder ein immunogenes Fragment hiervon bereitgestellt, das bei der
Herstellung von einem Arzneimittel verwendet wurde.
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ABC-Transporter
sind bekannt (Faith, M.J. und Kolter, R., 1993, Microbiological
Reviews, 57 (4): 995-1017; Borenkamp, S.J. und St. Geme, J.W. III,
1994, Infection and Immunity, 62: 3320-2238). Dennoch besitzen sie
weder eine therapeutische Anwendung, noch wurde eine solche von
jemandem vorgeschlagen. Gleichzeitig wurden bislang keine Mittel
zur Neutralisierung derer Aktivität für eine therapeutische Anwendung vorgeschlagen.
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Besondere
Verwendungen der ABC-Transporterproteine oder immunogenen Fragmente
schließen deren
Verwendung als Immunogene, z.B. als Impfstoffe, ein.
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Der
Bezug zu ABC-Transporterproteinen betrifft sowohl Einführungs-
als auch Ausführungsproteine. Der
Bezug zu immunogenen Fragmenten ist ebenso ein Bezug zu Analogen
von immunogenen Fragmenten, insbesondere Mimotopen (Geysen, H.M.
et al., 1987, Journal of Immunological Methods, 102: 259-274; Geysen,
H.M. et al., 1988, J. Mol. Recognit., 1 (1): 32-41).
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Ein
Bakterium kann ein Enterococcus sein, z.B. ausgewählt aus
der Gruppe von E. faecium, E. faecalis, E. avium, E. gallinarium,
E. durans, E. mundtii und E. casseflavus.
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Der
experimentelle Bereich (s. unten) beschreibt insbesondere ABC-Transporterproteine
vom Typ Enterococ cus mit Gewichten von 97 und 54 kDa. Somit kann
das ABC-Transporterprotein ein Enterococcus-Protein ausgewählt aus
der Gruppe von immunodominant konservierten Antigenen mit 97 und
54 dDa sein.
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Die
immunodominant konservierten Antigene mit 97 und 54 kDa vom Typ
Enterococcus sind per se nicht neu (Clark, I.M. und Burnie, J.P.,
1993, Serodiagn. Immunother. Infect. Disease, 5: 85-92; Sulaiman,
A. et al., 1996, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 15: 826-829).
Dennoch sind sie bisher weder identifiziert oder vorgeschlagen worden
als ABC-Transporterproteine, noch wurden sie für eine therapeutische Anwendung
vorgeschlagen. Ebensowenig wurden Mittel vorgeschlagen, die sie
neutralisieren.
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Ein
immunogenes Fragment kann eine ATP-Bindungsstelle oder einen Teil
hiervon enthalten. Spezifische (therapeutisch nützliche) Epitope sind bestimmt
worden, um durch die ATP-Bindungsstellen der ABC-Transporter ausgebreitet
zu werden. So können
diese oder neutralisierende Mittel, die spezifisch für diese
sind, therapeutisch verwendet werden. Gleichzeitig können Mittel,
die diese binden, diagnostisch verwendet werden.
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Ein
immunogenes Fragment vom Typ Enterococcus kann die Sequenz SEQ ID
NO: 3 besitzen und wird durch die ABC-Transporter von z.B. E. faecium
und E. faecalis verbreitet.
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Ein
immunogenes Fragment von E. faecium kann die Sequenz SEQ ID NO:
4 besitzen.
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Es
wurde eine Anzahl von Epitopen, die für E. faecium spezifisch sind,
gefunden und somit kann das immuno gene Fragment die Sequenz von
einer der Sequenzen SEQ ID NOs: 5 bis 8 besitzen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden ebenso neutralisierende Mittel, die für ein bakterielles ABC-Transporterprotein
oder ein immunogenes Fragment hiervon spezifisch sind, für die Verwendung
in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen
Körpers
bereitgestellt.
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Ein
neutralisierendes Mittel kann bei der Herstellung eines Arzneimittels
verwendet werden.
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Neutralisierende
Mittel sind bekannt und können
Antikörper
und Antigen-bindende Fragmente hiervon (Harlow, E. und Lane, D., „Antibodies – A Laboratory
Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 1988), Ribozyme
und Antisense-Nukleinsäureketten
einschließen.
Andere neutralisierende Mittel sind dem Fachmann leicht geläufig.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ebenso ein Verfahren zur Behandlung des menschlichen
oder tierischen Körpers
bereitgestellt, das die Behandlung eines Patienten mit einem bakteriellen
ABC-Transporterprotein
oder einem immunogenen Fragment hiervon oder einem neutralisierenden
Mittel, das hierzu spezifisch ist gemäß der vorliegenden Erfindung,
umfasst.
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Arzneimittel
gemäß der vorliegenden
Erfindung können
zusätzlich
einen pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsstoff
oder Vehikel enthalten (Remington's Pharmaceutical Sciences and Pharmacopea, 1984,
Mack Publishing Company, Easton, PA, USA).
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird auch ein bakterielles ABC-Transporterprotein oder
ein immunogenes Fragment hiervon für die Verwendung in einem Verfahren
zur Diagnose des menschlichen oder tierischen Körpers bereitgestellt. Der ABC-Transporter
oder das immunogene Fragment hiervon kann in einem Diagnostizierverfahren
verwendet werden.
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Das
Bakterium kann ein Enterococcus sein, z.B. ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus E. faecium, E. faecalis, E. avium, E. gallinarium,
E. durans, E. mundtii und E. casseflavus.
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Das
ABC-Transporterprotein kann ein Protein vom Typ Enterococcus sein
ausgewählt
aus der Gruppe der immunodominant konservierten Antigene mit 97
und 54 kDa.
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Ein
immunogenes Fragment kann eine ATP-Bindungsstelle oder einen Teil
hiervon aufweisen.
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Das
Bakterium kann ein Enterococcus sein, wobei das immunogene Fragment
die Sequenz SEQ ID NO: 3 aufweist. Das Bakterium kann ein E. faecium
sein, wobei das immunogene Fragment die Sequenz SEQ ID NO: 4 aufweist.
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Das
Bakterium kann E. faecium sein, wobei das immunogene Fragment eine
von den Sequenzen SEQ ID NOs: 5-8 besitzt.
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Erfindungsgemäß wird ebenso
ein Bindungsmittel (d.h. Binder), das spezifisch gegenüber einem
bakteriellen ABC-Transporterprotein oder einem immunogenen Fragment
hiervon gemäß der vorliegenden
Erfindung ist, zur Verwendung in einem Diagnostizierverfahren des
menschlichen oder tierischen Körpers
bereitgestellt.
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Erfindungsgemäß wird ebenfalls
ein Bindungsmittel bereitgestellt, das gegenüber einem bakteriellen ABC-Transporterprotein
oder einem immunogenen Fragment hiervon gemäß der vorliegenden Erfindung
spezifisch ist, das in einem Diagnostizierverfahren verwendet wird.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird auch ein Bindungsmittel gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt,
das bei der Herstellung eines diagnostischen Test-Kits verwendet
wird.
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Bindungsmittel
schließen
jedes Mittel ein, das in der Lage ist, das Protein oder das immunogene
Fragment hiervon zu detektieren. Diese sind bekannt und schließen z.B.
Antikörper
und Antigen-bindende Fragmente hiervon ein.
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Erfindungsgemäß wird ebenso
ein Diagnostizierverfahren für
den menschlichen oder tierischen Körper bereitgestellt, das die
Verwendung eines bakteriellen ABC-Transporters oder eines immunogenen
Fragmentes hiervon oder eines Bindungsmittels, das hierzu gemäß der vorliegenden
Erfindung spezifisch ist, umfasst.
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Erfindungsgemäß wird ein
diagnostisches Testverfahren für
ein bakteriellen ABC-Transportersystem oder ein immunogenes Fragment
hiervon gemäß der vorliegenden
Erfindung bereitgestellt, das folgende Schritte umfasst:
- i) Reaktion eines Bindungsmittels gemäß der vorliegenden
Erfindung mit einer Probe eines Patienten;
- ii) Detektion einer Reaktion zwischen dem Bindungs mittel und
dem Antigen und
- iii) Korrelation der Detektion der Reaktion mit der Anwesenheit
des Proteins oder eines immunogenen Fragmentes hiervon.
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Eine
Probe des Patienten kann z.B. ein Dialysat oder ein Serum eines
Patienten sein.
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Das
Bindungsmittel kann einen Antikörper
umfassen, wobei das diagnostische Testverfahren die folgenden Schritte
umfasst:
- i) Reaktion eines Antikörpers gemäß der vorliegenden
Erfindung mit einer Probe eines Patienten;
- ii) Detektion einer Antikörper-Antigen-Bindungsreaktion
und
- iii) Korrelation der Detektion der Antikörper-Antigen-Bindungsreaktion mit der Anwesenheit
des Proteins oder einem immunogenen Fragment hiervon.
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Erfindungsgemäß wird ebenso
ein diagnostisches Testverfahren für einen Antikörper, der
gegen ein bakterielles ABC-Transporterprotein oder ein immunogenes
Fragment hiervon gemäß der vorliegenden
Erfindung spezifisch ist, bereitgestellt mit den folgenden Schritten:
- i) Reaktion eines ABC-Transporterproteins oder
eines immunogenen Fragmentes hiervon gemäß der vorliegenden Erfindung
mit Patienten-Antiseren;
- ii) Detektion einer Antikörper-Antigen-Bindungsreaktion
und
- iii) Korrelation der Detektion der Antikörper-Antigen-Bindungsreaktion mit der Anwesenheit
von Antikörpern,
die gegen das bakterielle ABC- Transporterprotein
oder ein immunogenes Fragment hiervon spezifisch sind.
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Bereitgestellt
wird auch ein Kit von Teilen zur Durchführung eines diagnostischen
Tests gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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Es
wird auch ein Diagnostizierverfahren bereitgestellt, das die Verwendung
eines bakteriellen ABC-Transporterproteins
oder eines immunogenen Fragmentes hiervon oder eines Bindungsmittels,
das hierzu spezifisch ist gemäß der vorliegenden
Erfindung, bereitgestellt.
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Die
vorliegenden Erfinder waren erfolgreich bei der Isolierung von zwei
immunodominant konservierten Antigenen vom Typ Enterococcus und
haben festgestellt, dass überraschenderweise
Antikörper,
die gegenüber
diesen Antigenen spezifisch sind, verwendet werden können, um
eine effektive Therapie für
Enterococcus-Infektionen
bereitzustellen.
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Das
Antigen kann in einem Verfahren zur Behandlung oder Diagnose des
menschlichen oder tierischen Körpers
verwendet werden.
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Das
Antigen kann als ein Immunogen verwendet werden. Somit kann das
Antigen verwendet werden, um eine immunogene Antwort in Patienten
zu stimulieren und sie so vor Infektionen durch diese Bakterien
zu schützen.
Das Antigen kann z.B. als Impfstoff verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenso einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes
Fragment hiervon bereit, das gegenüber einem Antigen gemäß der vorliegenden
Erfindung spezifisch ist. Der Antikörper oder ein Antigen-bindendes
Fragment hiervon kann bei der Diagnose oder Behandlung von Infektionen
durch Enterococcus oder Staphylococcus verwendet werden. Im Falle
von Bakterien, die eine vielfache Arzneimittel-Resistenz aufweisen, insbesondere solche,
für die
derzeit keine Arzneimitteltherapie besteht, stellt die Verwendung
von Antikörpern,
die für
die Bakterien spezifisch sind, eine neue und hoch effektive Form
der Behandlung für
die Infektion dar.
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Die
Rolle, die Antikörper
in Enterococcus- und Staphylococcus-Infektionen spielen, ist bislang
nicht vollständig
bestimmt worden (Moellerin, R.C., 1995, In: Mandell, G.L., Bennett,
J.E. und Dolin, R. (eds.), Mandell, Douglas and Bennett's Principles and
Practice of Infectious Diseases, Fourth Edn., Churchill Livingstone, 1826-1835).
Aitchison, E.J. et al. (1986, J. Med. Microbiol., 1: 161-167) untersuchte
die Oberflächenkomponenten
eines mit Endocarditis verbundenen Isolats von E. faecalis unter
Verwendung von SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gelelektrophorese)
und Western-Blot. Ein bedeutenderes Hüllprotein-Antigen vom Molekulargewicht
53 kDa wurde in E. faecalis bestimmt (und nicht in E. faecium) und
andere gängige
Antigene von E. faecalis hatten Molekulargewichte von 65, 63, 56,
49,5, 30 und 21 kDa. Sie fanden ebenso heraus, dass das Wachstum
von E. faecalis in Serum zur Imitation der in vivo-Wachstumsbedingungen
in Endocarditis-Patienten das antigene Muster änderte, mit nur zwei großen Antigenen
mit Molekulargewichten von 56 und 53 kDa, die mit Seren von Patienten
mit Endocarditis reagieren. Sie schlugen vor, dass diese Antigene
ein diagnostisches Potential besitzen können. Burnie, J.P. et al. (1987,
J. Clin. Pathol., 40: 1149-1158) entdeckten die Rolle des Immunoblottings
in der Diagnose von Kultur negativer Endocarditis und Endocarditis
vom Typ Enterococcus. Sie fanden heraus, dass in Endocarditis vom
Typ E. faecalis eine starke IgM-Antwort auf E. faecalis-Banden von
112, 88 bis 90 und 45 bis 47 kDa und eine starke IgG-Antwort auf
88 bis 90 und 45 bis 47 kDa-Banden bestand. Das 112 kDa Antigen
von E. faecalis wurde später
zur Entwicklung eines indirekten Enzym-verknüpften Immunosorbent-Assay (ELISA)
für die
Diagnose von Endocarditis vom Typ E. faecalis verwendet (Burnie,
J. P. und Clark, I., 1989, J. Immunol. Methods, 123: 217-225). Die
drei Patienten mit E. faecium-Infektion zeigten eine starke IgG-Antwort
auf Banden von 82 bis 90 kDa.
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Der
Antikörper
kann ein ganzer Antikörper
oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon sein und kann im allgemeinen
zu jeder Immunoglobulinklasse gehören. Somit kann er z.B. ein
Immunoglobulin-M-Antikörper
oder ein Immunoglobulin-G-Antikörper
sein. Der Antikörper
oder das Fragment kann tierischen Ursprungs sein, z.B. von einem
Säugetier,
und kann von Mäusen,
Ratten, Schafen oder Menschen stammen. Es kann ein natürlicher
Antikörper
oder ein Fragment hiervon oder, wenn gewünscht, ein rekombinantes Antikörper-Fragment sein, d.h.
ein Antikörper
oder Antikörperfragment,
das unter Verwendung von rekombinanter DNA-Techniken hergestellt wurde.
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Besondere
rekombinante Antikörper
oder Antikörperfragmente
schließen
folgendes ein: (1) solche mit einer Antigen-Bindungsstelle, von
der zumindest ein Teil von einem anderen Antikörper stammt, z.B. solche, in
denen die hypervariablen oder komplementären Bestimmungsregionen eines
Antikörpers
in die variablen Netzwerksregionen eines zweiten unterschiedlichen
Antikörpers
gepfropft wurden (wie z.B. in
EP
239 400 beschrieben); (2) rekombinante Antikörper oder
Fragmente, in denen von Fv verschiedene Sequenzen durch von Fv verschiedene
Sequenzen von anderen, hiervon verschiedenen Antikörpern substituiert
sind (wie beschrieben z.B. in
EP
171 496 ,
EP 173 494 und
EP 194 276 ) oder (3) rekombinante
Antikörper
oder Fragmente, die im wesentlichen die Struktur eines natürlichen
Immunoglobulins aufweisen, aber in denen der Hinge-Bereich eine unterschiedliche
Anzahl von Cystein-Resten
im Vergleich zu dem in natürlichen
Immunoglobulin gefundenen besitzen, aber worin ein oder mehrere
Cystein-Reste in einer Oberflächentasche
des rekombinanten Antikörpers
oder Fragmentes an der Stelle eines Aminosäurerestes, der in natürlichem
Immunoglobulin anwesend ist, vorliegen (wie z.B. beschrieben in
PCT/GB88/00729 (WO 89/01782)).
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Der
Antikörper
oder das Antikörperfragment
können
polyklonalen, monoklonalen oder rekombinanten Ursprungs sein. Er
kann spezifisch für
mindestens ein Epitop sein.
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Antigen-bindende
Antikörperfragmente
schließen
z.B. Fragmente ein, die durch proteolytische Spaltung eines ganzen
Antikörpers
erhalten wurden, z.B. die Fragmente F(ab')2, Fab' oder Fab oder Fragmente, die durch
rekombinante DNA-Techniken erhalten wurden, z.B. Fv-Fragmente (wie
z.B. in PCT/GB88/0747 (WO 89/02465) beschrieben).
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Die
Antikörper
gemäß der Erfindung
können
unter Verwendung bekannter immunologischer Techniken hergestellt
werden. Somit kann z.B. jedem geeigneten Wert das Protein injiziert
und das Blut gesammelt werden, um den gewünschten polyclonalen Antikörper nach
angemessener Reinigung und/oder Konzentrierung zu erhal ten (z.B.
durch Affinitätschromatographie
unter Verwendung des immobilisierten Proteins als Affinitätsmedium).
Alternativ können
Splenozyten oder Lymphozyten vom mit dem Protein injizierten Wirt
erhalten und unter Verwendung z.B. der Methode nach Kohler et al.
(1976, Eur. J. Immunol., 6: 511) immortalisiert werden, wobei die
resultierenden Zellen isoliert werden, um eine einzelne genetische
Linie zur Herstellung monoclonaler Antikörper zu erhalten. Die Antikörperfragmente
können
unter Verwendung konventioneller Techniken hergestellt werden, z.B.
durch enzymatische Verdauung mit Pepsin oder Papain. Wo die Herstellung
rekombinanter Antikörper
gemäß der vorliegenden
Erfindung erwünscht
ist, können
diese z.B. unter Verwendung der Verfahren, wie sie in
EP 171 469 ,
EP 173 494 ,
EP 194 276 und
EP 239 400 beschrieben sind, hergestellt
werden.
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Erfindungsgemäße Antikörper können mit
einem detektierbaren Marker markiert werden oder können mit
einem Wirkungsmolekül,
z.B. einem Arzneimittel, beispielsweise einem antibakteriellen Mittel,
einem Toxin oder einem Enzym, unter Verwendung konventioneller Verfahren
konjugiert werden, so dass sich die Erfindung auf solche markierte
Antikörper
oder Antikörper-Konjugate
erstreckt.
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Solche
Antikörper
können
z.B. in transgenen Tieren, z.B. transgenen Schafen, exprimiert werden
und können
unter Verwendung existierender transgener Expressionssysteme erhalten
werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden ebenso Verfahren zur Behandlung und Diagnose von
Infektionen aufgrund von Enterokokken bereitgestellt, die die Verwendung
eines immunodominant konservierten Anti gens gemäß der vorliegenden Erfindung
oder eines Antikörpers,
der hierzu spezifisch ist, oder eines Antigen-bindendes Fragmentes
hiervon, umfassen.
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Die
Erfindung wird durch die folgende Beschreibung mit Bezug auf die
verschiedenen Figuren der begleitenden Zeichnungen, die alleine
anhand von Beispielen Immunoblots von infizierten und mit VRE kolonisierten
Patienten zeigen, weiter ersichtlich.
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1 zeigt
Immunoblots für
die IgM-Antwort für
fünf Patienten
vor und nach der VRE-Infektion
(Spuren 1 und 2, 3 und 4, 5 und 6, 7 und 8, 9 bzw. 10). Spur 11
ist ein Immunoblot für
die IgM-Antwort eines Patienten nach der VRE-Infektion. Alle Patienten
hatten eine Sepsis (Tabelle 2);
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2 zeigt
die IgG-Antwort von Patienten vor und nach der VRE-Infektion. Die
Spuren 1 bis 15 sind vor der Infektion von allen zehn Replikanten
und die nach der Infektion von fünf
der Replikanten (Tabelle 2). Die Spuren sind: 1 (post, Patient 1),
2 (post, Patient 2), 3 (post, Patient 3), 4 (prä, Patient 4), 5 (post, Patient 4)
, 6 (prä,
Patient 5) , 7 (post, Patient 5), 8 (prä, Patient 6), 9 (post, Patient
6), 10 (prä,
Patient 7), 11 (post, Patient 7), 12 (prä, Patient 8), 13 (post, Patient
8), 14 (post, Patient 9), 15 (post, Patient 10). Spur 16 ist eine Coomassie
blau befleckte PVDF-Membran des VRE-Extrakts. Spur 17 enthält Molekulargewichtsmarker.
Die Molekulargewichte der Banden sind wie markiert; und
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3 zeigt
sequentielles IgM (Spuren 1 und 2) und sequentielles IgG (Spuren
3 und 4) eines Patienten mit einer S. aureus Sepsis, der sich erholte,
geblottet gegen den Extrakt von MRSA.
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EXPERIMENTELLES
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Die
Beispiele, die sich auf Staphilococcus beziehen, sind alleine zu
illustrativen Zwecken angegeben.
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Die
folgenden Experimente zeigen die Anwesenheit von immunodominant
konservierten Antigenen von Staphilococcus mit einem Molekulargewicht
von 69 und 37 kDa. Patienten, die MRSA-Infektionen überlebten,
produzierten einen erhöhten
Grad an Antikörpern
gegen diese Antigene, wohingegen die Verstorbenen keine Antikörper gegen
diese Antigene besaßen.
Um die Antigene zu charakterisieren, wurde eine Genom-Bibliothek
für MRSA
aufgebaut und auf Antigene überprüft, die
durch das peritoneale Dialysat erkannt wurden, wobei zwei Klone
isoliert wurden. Antikörper
vom peritonealen Dialysat, die an das Expressionsprodukt der isolierten
Klone gebunden waren, wurden von dem Expressionsprodukt getrennt
und an das 69 kDa MRSA-Antigen gebunden, wodurch sich zeigte, dass
das gleiche Epitop sowohl von dem 69 kDa-Antigen und dem isolierten
Klon entwickelt wurde. Die klonierte MRSA-DNA wurde sequenziert
und vermeintliche Aminosäuresequenzen
von zwei offenen Leserahmen (ORFs) wurden erhalten und analysiert.
Die Analyse schloss den Vergleich zu den Sequenzen des Expressionsprodukts,
das durch die direkte Aminosäuresequenzierung
erhalten wurde, den Vergleich des theoretischen Molekulargewichts
zu dem beobachteten Molekulargewicht des Expressionsprodukts und
den Vergleich zu den Sequenzen des bekannten Pro teins ein. Dies
zeigte, dass zwei der vermutlichen Aminosäurensequenzen (SEQ ID NOs:
10 und 11 und korrespondierende DNA-Sequenz SEQ ID NO: 9) mögliche Expressionsprodukte
waren. Der Sequenzvergleich dieser Aminosäuresequenzen mit der BLAST-
und BEAUTY-Sucheinrichtung
zeigte, dass sie in hohem Grade homolog zu den IstA- bzw. IstB-Protein
von Bacillus thuringiensis waren (Menou et al., 1990, J. of Bacteriology,
172: 6689-6696). Das Epitop-Mapping von SEQ ID NO: 10 (genannt MRSA1)
identifizierte drei Epitope (SEQ ID NOs: 12-14; MRSA 1a, MRSA 1b
bzw. MRSA 1c), während
das Epitop-Mapping von SEQ ID NO: 11 (genannt MRSA 2) ein Epitop (SEQ
ID NO: 15; genannt MRSA 2a) identifizierte. Es stellte sich heraus,
dass der gegen das Antigen spezifische Antikörper in Versuchstieren schützend war,
weswegen das Antigen und die Mittel, die dessen Funktion neutralisieren,
therapeutisch verwendbar sind. Gleichzeitig können Bindungsmittel, die spezifisch
an das Antigen binden, diagnostisch verwendbar sein. Immunogene
Fragmente der Antigene können
anstelle der Antigene selbst für
die Diagnose und Therapie verwendet werden.
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Die
folgenden Experimente identifizieren immunodominant konservierte
Antigene von gegenüber
Vancomycin resistenten Enterococcus faecium (VRE) mit Molekulargewichten
von 54 und 97 kDa. Patienten, die VRE-Infektionen überleben, produzieren einen
erhöhten
Grad an Antikörpern
gegen Antigene, während
Verstorbene einen unveränderten
oder verringerten Grad an Antikörpern
gegen das Antigen während
des Verlaufs der Infektion aufweisen. Um die Antigene zu charakterisieren,
wurde eine Genom-Bibliothek für
VRE aufgebaut und auf Antigene überprüft, die
durch ein peritoneales Dialysat erkannt wurden, und zwei Klone wurden isoliert.
Die Antikörper
des peritonealen Dialy sats, die an das Expressionsprodukt des isolierten
Klons gebunden wurden, wurden von dem Expressionsprodukt getrennt
und an das 97 kDa VRE-Antigen gebunden, wobei gezeigt wurde, dass
das gleiche Epitop sowohl von dem 97 kDa-Antigen und dem isolierten
Klon entwickelt wurde. Die klonierte VRE-DNA wurde anschließend sequenziert
und die vermutlichen Aminosäuresequenzen der
sechs offenen Leserahmen (ORFs) wurden erhalten und analysiert.
Die Analyse schloss den Vergleich zu der Sequenz des Expressionsprodukts,
das durch die direkte Aminosäuresequenzierung
erhalten wurde, den Vergleich des theoretischen Molekulargewichts
mit dem beobachteten Molekulargewicht des Expressionsprodukts und
den Vergleich zu den Sequenzen der bekannten Proteine ein. Dies
zeigte, dass nur eine der vermutlichen Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 2;
kodiert für
die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1) mit dem Expressionsprodukt korrespondieren
konnte. Der Sequenzvergleich hiervon mit den BLAST- und BEAUTY-Sucheinrichtungen
zeigte, dass es in hohem Grade homolog zu dem bekannten ABC-Transporterprotein,
insbesondere zu ATPase-Bindungsstellen
innerhalb des ABC-Transporters ist. Epitop-Mapping von SEQ ID NO:
2 identifizierte ein generisches und fünf spezifische Epitope (SEQ
ID NOs: 3-8), die zu Bereichen innerhalb des ABC-Transporters, insbesondere in und um
die ATP-Bindungsstellen
korrespondiert. Seren und Dialysate der Patienten, die an die 97
kDa- und 54 kDa-Antigene binden, und die Epitope waren in einem
Versuchstier schützend,
somit können
Mittel, die die Funktion des ABC-Transporters der Erreger, wie z.B.
Bakterien und Pilze, neutralisieren, für therapeutische Zwecke verwendet
werden. Die Mittel, die spezifische ABC-Transporter detektieren, können ebenso
diagnostisch verwendet werden.
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Immunoblot
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Herstellung des Antigens
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Das
Antigen wurde durch das folgende Verfahren hergestellt. Unter Verwendung
eines klinischen Isolats von einem gegenüber Vancomycin resistenten
Enterococcus, eines epidemischen Strangs 16 von MRSA, eines epidemischen
Strangs 2 von MRSA, des Oxford S. aureus und eines klinischen Isolats
von S. epidermis wurden 10 ml von Gehirn-Herz-Infusionsmedium (Oxoid)
mit dem Organismus geimpft und man ließ es bei 37 °C unter aeroben
Bedingungen 4 h lang wachsen. Dies wurde zu 300 ml des gleichen
Mediums zugegeben und auf einem kreisförmigen Schüttler bei 37 °C 24 h lang
inkubiert. Die Kultur wurde bei 2500 g 15 min lang zentrifugiert,
in 10 ml von 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) resuspendiert und wie zuvor
erneut pelletiert. Der Organismus wurde dann in einer hydraulischen
Presse (Enkoping, Schweden) bei –20 °C fragmentiert, bei 13000 rpm 30
min lang zentrifugiert und die überstehende
Lösung
(enthaltend Antigen) bei –20 °C aufbewahrt.
Im Anschluss wurden Proben des Antigens für das VRE und MRSA 16 hergestellt,
indem man sie bei 30 °C
und bei 37 °C
in der Gegenwart von 3 μg/ml
Vancomycin wachsen ließ.
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Seren
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Die
gesammelten Seren wurden bakteriologischen, virologischen und biochemischen
Laboratorien für Routineuntersuchungen übermittelt.
Es wurde bei –20 °C bis zum
Immunoblot gelagert.
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Patientengruppen
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Patienten
der Gruppe 1 mit Sepsis hatten Zeichen und Symptome (z.B. Pyrexia),
die im Einklang mit der Infektion zu einem Zeitpunkt, wenn VRE von
den Blutkulturen isoliert wurde, steht. Diese Bakterien waren während der
zweiten Einweisung für
die Chemotherapie gegen hämatologische
bösartige
Tumore (meistens Leukämien)
neutropenisch. Neutropenie wurde als eine neutrophile Zahl von < 1,0 × 109/l definiert. Das Serum vor und nach der
Infektion wurde aufbewahrt und parallel getestet. Diese wurden in
die Gruppen Überlebender und
Verstorbener (solche mit positiven Blutkulturen mit einem VRE, das
für die
Chemotherapie unempfänglich war
und die starben) separiert.
-
Zusätzlich war
das peritoneale Dialysat eines einzelnen Patienten mit Peritonitis
aufgrund eines VRE verfügbar.
-
Als
Gruppe 2 Patienten wurden solche betrachtet, die mit VRE kolonisiert
waren, insofern, dass zum Zeitpunkt der Isolierung dieser Organismen
diese Patienten keine Zeichen oder Symptome einer Infektion, die auf
VRE zurückzuführen ist,
aufwiesen. Diese Gruppe wurde eingeteilt in die Gruppen 2a und 2b.
Patienten der Gruppe 2a waren Patienten, von denen alle zu irgendeinem
Zeitpunkt ihrer Krankheit neutropenisch waren. Daher wird diese
Untergruppe als kolonisierte neutropenische Patienten bezeichnet.
Patienten der Gruppe 2b waren allesamt Patienten der Nierenpflege
oder Intensivpflege und keiner von diesen war neutropenisch. Diese
Untergruppe wird als kolonisierte, nicht-neutropenische Patienten
bezeichnet. Seren, die nach der Kolonisierung genommen wurden, wurden
nur von Patienten der Gruppe 2 aufbewahrt, weil die Kolo nisierung
intermittierend sein kann und in jedem einzelnen Patienten ist es
nicht klar, wann genau sie das erste Mal kolonisiert werden oder
ob sie vielleicht während
einer vorherigen Einweisung kolonisiert wurden.
-
Patienten
der Gruppe 3 waren die Kontrollgruppe für die VRE-Studie. Das Serum
wurde routinemäßig von
schwangeren Frauen aus vorgeburtlichen Pflegekliniken der Gemeinde
gesammelt. Der Grad an VRE in der Gemeinde ist zur Zeit niedrig
und die Mehrheit der Frauen sollte hiermit nicht in Kontakt kommen.
Patienten aus dem Krankenhaus wurden aufgrund der Möglichkeit,
dass sie unbekanntermaßen
mit VRE kolonisiert wurden, nicht als eine Kontrollgruppe eingesetzt.
-
Gruppe
4 waren Patienten mit einer Sepsis aufgrund eines MRSA, wobei die
positiven Blutkulturen mit einer Vancomycin-Therapie behandelt wurden.
Gepaarte Seren waren vor und nach der Sepsis verfügbar. Zusätzlich war
das peritoneale Dialysat eines einzelnen Patienten mit Peritonitis
aufgrund eines MRSA verfügbar.
-
Gruppe
5 waren Patienten, die mit einem MRSA kolonisiert waren, die keine
klinischen Zeichen einer Infektion zeigten.
-
Patienten
der Gruppe 6 waren die Kontrollgruppe für die MRSA-Studie. Das Serum
wurde routinemäßig von
schwangeren Frauen aus pränatalen
Pflegekliniken der Gemeinde gesammelt.
-
Gruppe
7 waren Patienten mit einer Sepsis aufgrund eines MSSA (Methicillin-sensitives
S. aureus), wobei die positiven Blutkulturen erfolgreich behandelt
wurden. Gepaarte Seren waren vor und nach der Sepsis verfügbar.
-
Herstellung
des Polyacrylamid-Gels
-
Ein
1,5 mm dickes Polyacrylamid-Gel wurde in der vertikalen Gel-Apparatur
von einem Protean IIxi Cell (Biorad) hergestellt. Ein 10 % Auflösungsgel
wurde zunächst
eingegossen und zum Polymerisieren 60 min bei Raumtemperatur belassen.
Ein Kamm mit zehn Bahnen wurde auf dessen Oberseite angeordnet und
das Sammelgel wurde darum und auf die Oberseite des Separierungsgels
gegossen. Dieses wurde 30 min zum Polymerisieren belassen. Das folgende
wurde zur Herstellung des Gels unternommen: Separierungsgel
| 30%
Acrylamid/0,8% Bisacrylamid
(Ultra pure Protogel, National
diagnostics) | 25
ml |
| Separierungsgel-Puffer
(siehe unten) | 14,06
ml |
| 10%
SDS | 0,75
ml |
| Destilliertes
Wasser | 35,2
ml |
| 10%
Ammoniumpersulfat | 350 μl |
| TEMED | 37,5 μl |
Separierungsgel-Puffer
| Tris | 24,22
g |
| Destilliertes
Wasser | 40
ml |
-
Einstellung
des pHs auf 8,8 mit konzentrierter HCl, anschließend Verdünnung auf 100 ml mit destilliertem
Wasser. Sammelgel
| 30%
Acrylamid/0,8% Bisacrylamid | 3,6
ml |
| Sammelgel-Puffer
(siehe unten) | 7,3
ml |
| 10%
SDS | 0,3
ml |
| Destilliertes
Wasser | 19
ml |
| 10%
Ammoniumpersulfat | 300 μl |
| TEMED | 30 μl |
Sammelgel-Puffer
| Tris | 6,05
g |
| Destilliertes
Wasser | 90
ml |
-
Einstellung
des pHs auf 6,8 mit konzentrierter HCl.
-
Probenherstellung
-
Das
Antigen, das auf diesem Gel eingesetzt werden sollte, wurde mit
einem Crack-Puffer und destilliertem Wasser aufgelöst. Dies
waren epidemische Stränge
16 von VRE und MRSA, die man bei 37 °C für alle Seren wachsen ließ. Fünf Antikörper-positive
Seren von VRE-Sepsis-Fällen wurden
gegen VRE getestet, das bei 30 °C
und bei 37 °C
in der Gegenwart von Vancomycin (3 µg/ml) gewachsen war. Für zwei Antikörper-positive
Seren von MRSA-Sepsis-Patienten wurden gegen MRSA 2 und das Oxford
S. aureus Immunoblots durchgeführt.
-
Mit
acht weiteren Seren wurden Immunoblots gegen das Antigen, das von
S. epidermis erhalten wurde, den epidemischen Strang 16 von MRSA,
der bei 30 °C
gewachsen war, den epidemischen Strang 16 von MRSA, bei 37 °C gewachsen,
jeweils in Gegenwart von Vancomycin (3 µg/ml) durchgeführt. Vielfache
des folgenden wurden gekocht, wenn die Menge des Proteins in diesem
Verhältnis
zu guten Resultaten des Immunoblots führte: überstehende Lösung (enthaltend
Antigen), 15 µl;
des tilliertes Wasser, 10 µl;
Crack-Puffer, 25 µl. Crack-Puffer
| 20%
SDS | 4
ml |
| Sammelpuffer | 1
ml |
| Destilliertes
Wasser | 4
ml |
| 2-Mercaptoethanol | 0,4
ml |
| Glycerol | 0,6
ml |
-
Bromophenol
blau – eine
kleine Menge wurde zugesetzt, bis der Puffer blau war.
-
Jeder
Well wurde mit 50 µl
der obigen Mischung beladen. Die regenbogenfarbenen Protein-Molekulargewichtsmarker
(Amersham Life Science) wurden auf jedem Gel in einer Bahn verwendet.
20 µl
des Markers wurden mit 20 µl
des Crack-Puffers vor der Beladung gekocht. Die Molekulargewichtsmarker
waren: Myosin 220000, Phosphorylase B 97400, Rinderserumalbumin
66000, Ovalbumin 46000, carbonische Anhydrase 30000, Trypsin-Inhibitor
21500 und Lysozyme 14300 (alle Molekulargewichte in Daltons).
-
Gel-Elektrophorese
-
Der
Elektrophorese-Puffer wurde in den Elektrophorese-Tank und in die
Zellen oberhalb des Gels gegeben. Dies stellte das diskontinuierliche
Puffersystem dar. Die Elektrophorese wurde bei einem konstanten Strom
von 40 mA pro Gel, mit Wasserkühlung,
durchgeführt.
Es lief bis die Farbstofffront gerade aus dem Gel herausgelaufen
ist. Elektrophorese-Puffer
| Tris | 18.96
g |
| Glycin | 12
g |
| SDS | 3
g |
| Destilliertes
Wasser | 1
l |
-
Transblot
-
Das
Gel wurde vorsichtig zwischen den Glasplatten entfernt und das Sammelgel
beseitigt. Das Separierungsgel wurde dann auf Nitrocellulosepapier
(Biorad) aufgetragen und dieses wurde zwischen dem Filterpapier
eingehüllt.
Das Nitrocellulose- und Filterpapier war zuvor in einem Transblot-Puffer
aufgeweicht worden. Dies wurde in dem Transblot-Tank (Hoefer) gegeben,
der den Transblot-Puffer enthielt. Die Spannung wurde 45 min lang
am Maximum gehalten und das System wurde mit Wasser gekühlt. Die
Nitrocellulose wurde entfernt und man ließ sie über Nacht in 3 % Rinderserumalbumin
(BSA) bei 4 °C
blockieren. Transblot-Puffer
| Tris | 9,07
g |
| Glycin | 43,2
g |
| Methanol | 750
ml |
| Destilliertes
Wasser | 3
l |
Tris-Lösung zur
Herstellung einer 3%igen BSA
| Natriumchlorid | 9
g |
| Tris | 1,2
g |
| Destilliertes
Wasser | 1
l |
-
Sondierung
und Färbung
des Antikörpers
-
Das
Nitrocellulose-Papier wurde in Streifen geschnitten, die die Wells
wiederspiegeln, und jeder wurde in einen separaten Bereich in einen
Inkubationscontainer gegeben. Zu jedem Streifen wurde BSA-Lösung (3 %)
zugegeben und genügend
adäquates
Serum zugesetzt, um eine 1:10-Verdünnung zu erzielen. Diese wurden
bei Raumtemperatur 2 h lang geschüttelt. Die Streifen wurden
dann in einer Waschlösung
30 min lang gewaschen, wobei die Lösung alle 6 min gewechselt
wurde. Anschließend
wurde mit alkalischer Phosphatase konjugiertes, anti-humanes Immunoglobulin,
1:1000 verdünnt
in 3 % BSA (Sigma), zugesetzt. Der hauptsächliche Immunoblot für das Serum
von kolonisierten oder infizierten Patienten trat für IgA, IgM
und IgG auf. Somit erforderte dies drei Streifen pro Serum, eines
inkubiert mit anti-humanem
IgA, eines mit anti-humanem IgM und eines mit anti-humanem IgG.
Die Kontrollgruppe hatte einen Streifen, der mit allen drei anti-humanen
Immunoglobulin zur gleichen Zeit inkubiert war. Diese wurden 1 h
lang bei Raumtemperatur geschüttelt
und der Waschschritt wurde wiederholt. Das Substrat wurde durch
Zusatz von 660 µl
von Nitro-Blue-Tetrazolium-Lösung
und 330 µl
von 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat-Lösung zu 100 ml eines alternativen
alkalischen Phosphatase-Substrat-Puffers
hergestellt und 4 ml hiervon wurden zu jedem Streifen zugesetzt
und 20 min lang geschüttelt.
Dies stellte sich als die Zeit für
die Streifen heraus, die ausreichte, dass sie gut gefärbt waren. Waschlösung
| Natriumchlorid | 4,5
g |
| Tween
20 | 0,25
ml |
| Destilliertes
Wasser | 500
ml |
Nitro-Blue-Tetrazolium-Lösung
| Nitro-Blue-Tetrazolium | 0,05
g |
| 70%
N,N-dimethylformamid | 1
ml |
5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat
(BCIP)-Lösung
| BCIP | 0,05
g |
| 70%
N,N-dimethylformamid | 1
ml |
Alkalische
Phosphatase-Substrat-Puffer
| Tris | 1,12
g |
| Natriumchlorid | 0,58
g |
| Magnesiumchlorid | 0,1
g |
| Destilliertes
Wasser | 100
ml |
Einstellung des pHs auf 9,5.
-
Ergebnisse
-
Gegenüber Vancomycin
resistente Enterococci
-
Die
Immunoblots (Tabelle 1 und 2;
1 und
2)
zeigten mehrfache Antigen-Banden, von denen vier immunodominant
waren (97, 57, 54 und 40 kDa). Diese Antigene wurden zwischen Isolaten
konserviert und präsentiert,
wenn die Stränge
mit oder ohne Vancomycin gewachsen waren. IgG wurde gegen die 97 kDa-Bande
in elf von zwölf
Patienten, die eine Sepsis überlebt
hatten, erzeugt und es war in zwölf
der neutropenischen Patienten, die keine Sepsis entwickelten, vorhanden.
IgM wurde in acht und IgA in vier der Patienten mit Sepsis erzeugt.
Im Falle des 54 kDa Antigens zeigten zehn Patienten mit einer Sepsis
eine IgM- Antwort und
fünf eine
IgA-Antwort. Vier Patienten, die neutropisch waren und keine Sepsis
entwickelten, hatten eine IgM-Antwort. Ein Patient mit chronischer,
ambulanter peritonealer Dialyse und Körperflüssigkeitsinfektion aufgrund
von VRE zeigte eine IgM-Antwort
auf die 97 und 54 kDa-Banden des Serums und Dialysats und keine IgG-Antwort.
Das Dialysat wurde für
die Überprüfung der
Expressionsbibliothek (siehe unten) verwendet. Tabelle
1
Tabelle
2
- a
- = trat auf, in gepaartem
Serum, von Null
- i
- = erhöht, in gepaartem
Serum, mindestens Verdopplung der Intensität
- c
- = konstant
- d
- = abgenommen, in gepaartem
Serum mindestens die Hälfte
der Intensität
-
Schlussfolgerung
-
Die
97 und 54 kDa Antigene des Enterococcus sind immunodominant und
können
therapeutisch und diagnostisch verwendet werden. Weitere Immunoblots
zeigten die Anwesenheit der Antigene, wenn das VRE bei 30 °C und in
Gegenwart von Vancomycin bei 37 °C
gewachsen war.
-
Gegen Methicillin resistentes
S. aureus
-
Immunoblot-Seren
(Tabelle 3;
3) zeigten Antigene von einem
offenbaren Molekulargewicht von 31 bis 120 kDa. Die am meisten immunodominanten
Banden waren bei 69 und 37 kDa. In der Sepsis-Gruppe trat ein gesteigertes
IgM oder IgG in drei von fünf
Patienten gegen die 69 kDa-Bande auf. Bzw. trug die Anzahl für die 37
kDa-Bande 4 für
IgM und 3 für
IgG. Diese Antikörper
waren in verstorbenen Patienten abwesend, aber in einigen Patienten
anwesend, die kolonisiert worden waren und die Infektion nicht entwickelt
hatten. Sie waren ebenso in einer geringen Anzahl der Kontrollseren
von schwangeren Frauen anwesend. Das peritoneale Dialysat reagierte
mit der 37 kDa-Bande (IgG) und der 69 kDa-Bande (IgM und IgG) und
wurde zur Überprüfung der
Expressionsbibliothek (siehe unten) verwendet. Tabelle
3
- i
- = gesteigert
- c
- = konstant
-
Schlussfolgerungen
-
Patienten
serokonvertieren zu dem 37 kDa-Antigen, wenn sie sich erholen und
aus Immunogenität
gegenüber
dem 69 kDa-Antigen entwickeln. Somit können die 37 und 69 kDa-Antigene
therapeutisch und diagnostisch verwendet werden. Äquivalente
Banden bei 120, 84, 69, 53 und 37 kDa wurden durch Immunoblots in
MRSA-Strang 2 und Oxford S. aureus und bei 120, 69 und 37 kDa in
S. epidermidis ebenso gezeigt.
-
Antikörper-Therapie
VRE
-
Um
das therapeutische Potential eines Antikörpers, der spezifisch gegenüber dem
E. faecium-Antigen ist, zu testen, wurden zehn Kontrollmäuse mit
200 µl
einer Kochsalzlösung
injiziert und zehn Testmäuse
wurden mit 200 µl
von Antikörper-Serum
eines Patienten, der sich von einer Sepsis erholt hat, injiziert.
1 Stunde später
wurden die Mäuse
jeweils mit 100 µl
von 5 × 108 Kolonien bildenden Einheiten (CFU) von
gegenüber Vancomycin
resistenten E. faecium injiziert.
-
Von
den zehn Kontrollmäusen
starben acht, während
vier der Testmäuse
starben, was zeigt, dass Antikörper,
die gegenüber
den immunodominanten Antigenen des Enterococcus spezifisch sind,
therapeutisch verwendet werden können.
-
VRE
-
Zwei
Sätze von
30 weiblichen CD-1-Mäusen
mit jeweils 22 g Gewicht wurden über
die Schwanzvene mit 3 × 109/100 µl
Bolus eines gegenüber
Vancomycin resistenten E. faecium infiziert. Die infizierten Mäuse wurden
nachfolgend entweder mit 200 µl
eines peritonealen Dialysat-Fluids (wie zuvor beschrieben) eines
Patienten mit CAPD-Peritonitis aufgrund von VRE (Gruppe A), oder
mit 200 µl
eines normalen Fluids injiziert (Gruppe B).
-
Nach
48 h starben von 30 in Gruppe A 5, während in Gruppe B von 30 9
starben.
-
MRSA
-
Serum
wurde von zwei Patienten erhalten. Patient 1 hatte sich von einem
subphrenischen Abszess, der mit Vancomycin behandelt worden war,
erholt. Die Serumantikörper
von Patient 1 waren positiv sowohl für das 37 als auch das 69 kDa-Antigen.
Patient 2 wurde für
eine MRSA-Sepsis mit Vancomycin behandelt. Die Serumantikörper von
Patient 2 waren zuvor präimmun
und negativ für
die 37 und 69 kDa-Antigene. Vancomycin-Assays zeigten, dass Patient 2 ein höheren Vancomycin-Level
(30 µg/ml)
als Patient 1 (12 µg/ml)
besaß. 20
CD-1-Mäusen
wurde intravenös
1 × 107 des epidemischen Stanges 16 von MRSA verabreicht
und 2 h später
wurden zwei Gruppen von zehn Mäusen
jeweils 100 ml des Serums von Patient 1 oder 2 als einzelnes intravenöses Volumen
verabreicht.
-
Die
Ergebnisse (Tabelle 4) zeigen, dass der Serum-Antikörper, der sowohl für das 37
als auch 69 kDa-Antigen
positiv ist, gegen MRSA schützend
war, mit einer Sterblichkeitsrate von 20 % in der Gruppe, die mit
dem Patienten 1 behandelt wurde (Antikörper positiv sowohl für das 37
als auch das 69 kDa-Antigen), im Vergleich zu einer Sterblichkeitsrate
von 50 % für
die andere Gruppe.
-
-
Herstellung
und Überprüfung der
Genom-Expressionsbibliotheken von Vancomycin
-
Resistenter
Enterococcus und gegen Methicillin resistenter Staphylococcus aureus
-
Es
wurde eine Genom-Bibliothek (eine jeweils für gegen Vancomycin resistente
Enterococcus faecium und mehrfach resistentes Staphylococcus aureus),
in dem Expressions/Klonierungs-Vektor Lambda ZAP Express aufgebaut,
im wesentlichen wie durch Young and Davis (1983, PNAS USA, 80: 1194-1198)
beschrieben. Chromosomale DNA von einem klinischen Isolat wurde
teilweise durch Sau3a verdaut und Fragmente in der Größenordnung
von 2 bis 9 kbp wurden in den Vektor eingesetzt, was zur Herstellung
von β-Galactosidase-Fusionsproteinen
führte.
Jede Bibliothek wurde mit Antikörper-positivem
(37 und 69 kDa-Banden für
MRSA oder 54 und 97 kDa-Banden für
VRE) periotonealen Dialysat-Fluiden (1:100 Verdünnung) von Patienten mit den
jeweiligen Infektionen überprüft. Positive
Klone wurden mittels anti-humanen Immunoglobulin (IgG) von Ziegen (1
in 5000) (Sigma, Poole UK) alkalischer Phosphatase detektiert. Lysogene
wurden von positiven Klonen in Escherichia coli Y1089 gemäß Huynh,
Young and Davies (1985, DNA cloning vol 1, a practical approach,
IRL Press Oxford, p 49-78, Ed. D.M. Glover) hergestellt. Die β-Glactosidase-Fusionsproteine
wurden durch Immunoblots unter Verwendung von peritonealem Dialysat-Fluid
(1:10) und einem monoclonalen Antikörper zu β-Galactosidase (1:1000) detektiert.
Das von den einzelnen positiven Klonen exprimierte Epitop wurde
durch Antigen-Selektion wie von Lyon et al. (1986, PNAS USA, 83:
2989-2993) beschrieben, identifiziert. Hierfür wurde das peritoneale Dialysat-Fluid
einer Affinitätsreinigung
durch Hybridisierung mit positiven rekombinanten Lambda-Plaques
unterzogen. Der gebundene Antikörper
wurde dann mit Glycin-Puffer (pH 2,8) eluiert und für den Immunoblot
der Lysate der relevanten Bakterien verwendet.
-
DNA-Sequenzierung
-
Eine
PCR mit T3 und T7 Vorwärts-
und Rückwärts-Primern wurde zur
Verstärkung
der eingesetzten DNA von Seren-positiven Klonen verwendet. Dies
wurde in das TA-Klonierungssystem (Version 1.3, Invitrogen Corporation,
Oxon, UK) vor der DNA-Sequenzierung unter Verwendung der Dideoxy-Terminierungsmethode (Sequenz
Version 2.0 Kit; United States Biochemical, Cambridge, UK) subkloniert.
Die anfänglichen
Sequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung von Sequenzierungs-Universalprimern
durchgeführt,
wobei die verbleibende Sequenz unter Verwendung einer Primer-Fortschritt-Strategie
durch progressive synthetisierende Sequenzierungs-Primer zur Herstellung
neuer Sequenzierungs-Daten bestimmt wurde.
-
Epitop-Mapping
-
Eine
Serie von überlappenden
Nonapeptiden, die die erhaltenen Aminosäuresequenzen abdecken, wurden
auf Polyethylen-Pins mit Reagenzien von einem Epitop-Scanning-Kit (Cambridge
Research Biochemicals, Cambridge, UK) wie zuvor beschrieben durch
Geysen et al. (1987, Journal of Immunological Methods, 102: 259-274) synthetisiert.
Peptid 1 bestand aus Resten 1 bis 9, Peptid 2 bestand aus Resten
2 bis 10 usw. Dies wurde für
das ABC-Transporterprotein durchgeführt, das von dem VRE (1)
und MRSA1 und MRSA2 von dem MRSA-Klon erhalten wurde. Die Reaktivität von jedem
Peptid mit Patientenseren (verdünnt
1:2000) wurde für IgG
durch ELISA bestimmt. Die Daten wurden als A405 nach 30 min Inkubation
exprimiert. Die Seren waren Antikörper-positiv, 54 und 97 kDa
von Patienten, die sich von der VRE-Sepsis (n=6) erholt hatten,
und die Kontrolle war eine Serumprobe eines Patienten, der nachfolgend
an der durch VRE verursachten Sepsis (n=1) gestorben war. Für MRSA1
und MRSA2 wurden die Seren von Patienten, die sich von der Infektion
erholt hatten (n=3) und die Kontrolle stammte von einem Patienten,
der verstorben war (n=1).
-
MRSA
-
Vier
positive Klone wurden mit dem Dialysat des Patienten detektiert.
Zwei von diesen produzierten ein Fusionsprotein von 180 kDa, das
mit dem peritonealen Dialysat und einem monoclonalen Antikörper, der für β-Galactosidase
spezifisch ist, reagierte. Die Antigen-Auswahl demonstrierte ein
Epitop, das durch beide untersuchte Klone exprimiert wurde, die
mit dem 69 kDa-Antigen des epidemischen Stranges 16 von MRSA reagierten.
Die Sequenzierung zeigte, dass zwei ORFs existierten, die homolog
zu den IstA- und IstB-Proteinen,
die durch die IS232-Insertionssequenz von Bacillus thuringiensis
(Menou et al., 1990, J. of Bacteriology, 172: 6689-6696) exprimiert
wurden, homolog waren.
-
VRE
-
Vier
positive Klone wurden mit dem Dialysat des Patienten detektiert.
Zwei von diesen produzierten ein Fusionsprotein von 140 kDa, das
sowohl mit dem peritonealen Dialysat als auch dem monoklonalen Antikörper gegen β-Galactosidase
reagierte. Die Antigenauswahl zeigte ein Epitop für zwei der
Klone, die mit dem 97 kDa-Antigen des VRE-Stranges reagierten.
-
Die
Sequenzierung demonstrierte eine teilweise Sequenz im Rahmen mit
dem β-Galactosidase-Gen. Die
gesamte Insertgröße war 4,5
kb. Die erhaltene Aminosäuresequenz
produzierte ein Protein mit zwei ATP-bindenden Domänen und eine Sequenz, die zu
der Gruppe von Proteinen der ABC-Transporter homolog waren (Fath
and Kolter, 1993, Microbiological Reviews, 57: 995-1017).
-
Epitop-Mapping
-
Dies
zeigte fünf
Epitope, wie sie von drei oder mehr aufeinanderfolgenden Wells mit
einer mittleren optischen Dichte, die mindestens zwei Standardabweichungen über dem
Ergebnis des Serums des Kontrollpatienten lagen, erhalten wurden.
Für VRE
waren dies SEQ ID NOs: 3-8; für
MRSA1 waren dies SEQ ID NOs: 12-14; und für MRSA2 SEQ ID NO: 15. Sequenzprotokoll
