DE69735207T2

DE69735207T2 - Neuartiges, fibrinogen-bindendes protein, welches von einem koagulase-negativen staphylokokkus abstammt

Info

Publication number: DE69735207T2
Application number: DE69735207T
Authority: DE
Inventors: Bengt Guss; Martin Nilsson; Lars Frykberg; Jan-Ingmar Flock; Martin Lindberg
Original assignee: Biostapro AB
Current assignee: Biostapro AB
Priority date: 1996-06-20
Filing date: 1997-06-18
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2017-06-19
Also published as: US7160990B2; ES2258280T3; WO1997048727A1; JP4173549B2; DE69735207D1; US6733758B1; EP0922056A1; CA2294433A1; EP0922056B1; ATE316979T1; SE9602496D0; JP2001503609A; AU3282597A; US20040209326A1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnologie und befasst sich mit isolierten oder rekombinanten DNA-Molekülen, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die ein Staphylococcus epidermidis-Protein oder Polypeptid mit fibrinogenbindender Aktivität kodiert und dieses Protein oder Polypeptid. Weiterhin umfasst die Erfindung Mikroorganismen (einschließlich Viren), enthaltend die genannten Moleküle und ihre Verwendung bei der Produktion des genannten Proteins oder des Polypeptids und ihre Verwendung in der Biotechnologie. Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung diagnostische und therapeutische Verwendungen des neuen Proteins, z.B. Zusammensetzungen für eine aktive und/oder passive Immunisierung.
Hintergrund der Erfindung
Im letzten Jahrzehnt haben die Koagulase-negativen Staphylokokken (CNS) immer mehr Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Zusammen mit der Entwicklung menschlicher und veterinärmedizinischer Medizinen hat die Zahl zugänglicher Wirte zugenommen. Fortgeschrittene Chirurgiemöglichkeiten, eine verstärkte Verwendung von Biomaterialien, Medikamente mit Zytostatika, Antibiotika und anderen Arzneimittel zusammen mit einer erhöhten Frequenz von antibiotikaresistenten Stämmen von CNS haben die Empfänglichkeit des Wirts erhöht. Betreffend die veterinärmedizinische Wichtigkeit der CNS ist bekannt, dass sie z.B. sowohl eine subklinische als auch eine klinische Entzündung in dem Kuheuter auslösen können. Die Existenz von Bakterien, die spezifisch an Fibrinogen binden, ist seit vielen Jahren bekannt. Die Rolle der Fibrinogenbindung im Wechselwirkungsprozess zwischen dem Wirt und Staphylococcus aureus ist immer noch nicht klar, jedoch wurde die Fibrinogenbindung als ein potenzieller Virulenzfaktor dieser Art z.B. bei der Endokarditis angesehen (Moreillon et al. 1995). Nur ein Protein mit fibrinogenbindenden Eigenschaften wurde bis jetzt beschrieben, das von CNS abstammt, nämlich ein Protein eines Stammes eines Koagulase-negativen S. aureus (Usui Y, Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg, 262 (3), Seiten 287–97). Rekombinante DNA-Techniken wurden bei der Produktion eines fibrinogenbindenden Proteins aus S. aureus verwendet (WO 94/06830). Die vorliegende Erfindung jedoch beschreibt die Charakterisierung und Isolierung eines fibrinogenbindenden Proteins von Staphylococcus epidermidis unter Verwendung von Gen-Klonierungsverfahren. Weiterhin beschreibt die Erfindung unterschiedliche Verfahren zur Messung der fibrinogenbindenden Aktivität auf Zellen von S. epidermidis und die Verwendung dieses Proteins in der Biotechnologie.
Allgemein kann es schwierig sein, ein homogenes und reproduzierbares Produkt zu erhalten, wenn ein solches bindendes Protein direkt aus Staphylokokkenzellen hergestellt wurde. Weiterhin sind Staphylokokken pathogen und benötigen komplexe Kulturmedien, was Komplikationen bei Kultivierungen in großem Umfang involviert. Es besteht daher ein Bedarf an einem neuen Verfahren zur Erzeugung eines fibrinogenbindenden Proteins (oder von Fragmenten davon).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues fibrinogenbindendes Protein, das FIG genannt wird, ein DNA-Molekül, kodierend das Protein und Anwendungen für ihre Verwendung, gemäß den beigefügten Ansprüchen. Die vorliegende Erfindung füllt in besonders bedeutsamer Weise den lange gespürten Bedarf an der Bereitstellung von Verfahren und Mitteln für die Diagnose, Typbestimmung, Behandlung und Prävention von Infektionen, die durch Koagulase-negative S. epidermidis ausgelöst werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die Erfindung wird in näherem Detail im folgenden beschrieben, wobei die beigefügten Beispiele und Figuren weitere Stütze bieten, worin
1 die Adhärenzwerte als Funktion einer Fibrinogen-Beschichtungskonzentration für die S. epidermidis-Stämme 2, 19 und JW27 darstellt (Beispiel 1A),
2 eine prozentuale Inhibition für Antikörper gegen Fibrinogen, im Vergleich mit Antikörpern gegen Fibronektin zeigt (Beispiel 1B),
3 eine prozentuale Inhibition als Funktion einer kompetitierenden Fibrinogenkonzentration zeigt (Beispiel 1C),
4 die Proteaseempfindlichkeit der Adhärenz an Fibrinogen zeigt (Beispiel 1D),
5 die Inhibition der Adhärenz durch einen LiCl-Extrakt zeigt (Beispiel 1E),
6 die vollständige Nukleotidsequenz des fig-Gens des S. epidermidis-Stamms HB und die deduzierte Aminosäuresequenz des kodierten Proteins zeigt. Eine putative ribosomale Bindungsstelle (RBS) ist unterstrichen und eine mögliche Transkriptions-Terminations-hairpin-Schleife ist doppelt unterstrichen. Eine putative Signalsequenz (S) ist durch einen Pfeil angegeben und ein Translationsstopkodon mit einem Sternchen. Der Beginn der nicht-repetitiven N-terminalen Region, die A genannt wird, und die die fibrinogenbindende Aktivität beherbergt, ist durch einen Pfeil angegeben. R zeigt die hoch-repetitive Region an. Das Motiv LPXTG, das an der Zellwandverankerung beteiligt ist, ist in Fettbuchstaben angegeben und die Membran überspannende Region ist durch ein M markiert (Beispiel 3),
7 eine schematische Zeichnung zeigt, die das fibrinogenbindende Protein FIG von S. epidermidis und den Clumpingfactor (ClfA) von S. aureus vergleicht. Die Ähnlichkeit (%) der korrespondierenden Regionen in den Proteinen ist in der Figur zwischen den beiden Proteinstangen angegeben. S ist die Signalsequenz; A der nicht-repetitive Bereich, der die fibrinogenbindende Aktivität beherbergt; R ist der Diaminosäurerest-Repeatbereich; W ist der Bereich, von dem vorgeschlagen wird, dass er an der Zellwandverankerung beteiligt ist und M die Transmembrandomäne. Die angegebenen Zahlen betreffen die Aminosäurepositionen in den jeweiligen Proteinen, wie dargestellt in 6 und in der Referenz (McDevitt et al., 1994) (Beispiel 3),
8 zeigt, wie das GST-FIG-Fusionsprotein an Fibrinogen in dosisabhängiger Weise gefangen wird (Beispiel 10),
9 die Abnahme der bakteriellen Bindung als Funktion des GST-FIG-Fusionsproteins, GST oder FIG (Beispiel 11) zeigt,
10 die relative Adhärenz als Funktion der Serumverdünnung für zwei Präimmunseren und einem Serum gegen GST-FIG bzw. FIG zeigt (Beispiel 12) und
11 die relative bakterielle Adhärenz als Funktion der Serumverdünnung für einerseits Präimmunserum und andererseits Serum gegen GST-FIG zeigt (Beispiel 12).
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes oder ein rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Protein oder Polypeptid mit fibrinogenbindender Aktivität kodiert. Die natürliche Quelle dieser Nukleotidsequenz ist natürlich der S. epidermidis-Stamm HB, jedoch können unter Kenntnis der hier angegebenen Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenz das Gen oder Teile des Gens isoliert oder synthetisch hergestellt werden. Insbesondere kann die Kenntnis der abgeleiteten Aminosäuresequenz für den Teil des Proteins, der für die fibrinogenbindende Aktivität verantwortlich ist, verwendet werden, um synthetische Polypeptide zu erzeugen, die die Fibrinogenbindung erhalten oder inhibieren. Diese Polypeptide können mit verschiedenen Verbindungen, wie z.B. Enzymen, Fluoreszenz, Biotin (der Derivaten davon), Radioaktivität usw. markiert und z.B. in diagnostischen Tests wie ELISA- oder RIA-Techniken verwendet werden.
Zur Erzeugung eines rekombinanten DNA-Moleküls gemäß der Erfindung kann ein geeigneter Klonierungsvehikel oder Vektor, z.B. ein Phagemid, Plasmid oder eine Phagen-DNA mit Hilfe von Restriktionsenzymen gespalten werden, woraufhin die das gewünschte Protein oder Polypeptid kodierende DNA-Sequenz in die Spaltungsstelle inseriert wird, um das rekombinante DNA-Molekül zu bilden. Dieses allgemeine Verfahren ist dem Fachmann wohlbekannt und verschiedene Techniken für ein Spalten und Ligieren von DNA-Sequenzen wurden in der Literatur beschrieben (siehe z.B. US 4,237,224 ; Ausubel et al. 1991; Sambrook et al. 1989). Nichtsdestotrotz wurden jedenfalls gemäß der Kenntnis der vorliegenden Erfinder diese Techniken nicht für den vorliegenden Zweck verwendet. Wenn der S. epidermidis-Stamm HB als Quelle für die gewünschte Nukleotidsequenz verwendet wird ist es möglich, die Sequenz zu isolieren und derartig in einen geeigneten Vektor einzuführen, dass, wie im experimentellen Teil unten beschrieben, oder, da die Nukleotidsequenz hier präsentiert ist, unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion (PCR) das gesamte oder Fragmente des fig-Gens erhalten werden.
Wirte, die verwendet werden können, sind Mikroorganismen (die dazu gebracht werden können, das Protein oder aktive Fragmente davon zu erzeugen), die bakterielle Wirte umfassen können, wie z.B. Stämme von z.B. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus sp., Lactobacillus sp. und weiterhin Hefen und andere eukaryontische Zellen in Kultur. Um eine maximale Expression zu erhalten, können regulatorische Elemente wie Promotoren und Ribosomen-Bindungssequenzen auf bekannte Weise variiert werden. Das Protein oder das aktive Peptid davon können intra- oder extrazellulär erzeugt werden. Um eine gute Sekretion in verschiedenen bakteriellen Systemen zu erhalten, können unterschiedliche Signalpeptide verwendet werden. Um die Reinigung und/oder den Nachweis des Proteins oder Fragments davon zu erleichtern, können diese mit einer Affinitätssäule und/oder einem Enzym fusioniert werden. Dies kann sowohl auf dem genetischen als auch dem Proteinniveau geschehen. Um die Merkmale des Proteins oder Polypeptids davon zu modifizieren, können das Gen oder Teile des Gens z.B. unter Verwendung einer in vitro-Mutagenese oder durch Fusion mit anderen Nukleotidsequenzen, die Polypeptide kodieren, was zu einem Fusionsprotein mit neuen Merkmalen führt, modifiziert werden.
Die Erfindung umfasst so isolierte oder rekombinante DNA-Moleküle, enthaltend eine Nukleotidsequenz, die ein Staphylococcus epidermidis-Protein oder Polypeptid mit fibrinogenbindenden Eigenschaften kodiert. Weiterhin umfasst die Erfindung Vektoren wie z.B. Plasmide und Phagen, enthaltend eine solche Nukleotidsequenz und Organismen, insbesondere Bakterien, wie z.B. Stämme von E. coli, B. subtilis und Staphylococcus sp., worin ein solcher Vektor eingeführt wurde. Alternativ kann eine solche Nukleotidsequenz in das natürliche Genom des Mikroorganismus integriert werden.
Die Anwendung betrifft weiterhin Verfahren zur Erzeugung eines Proteins oder Polypeptids mit der fibrinogenbindenden Aktivität von Protein FIG oder aktiven Fragmenten davon. Gemäß diesem Verfahren wird ein Mikroorganismus, wie oben erklärt, in einem geeigneten Medium kultiviert, woraufhin das resultierende Produkt durch irgendein Trennverfahren, z.B. Ionenaustauschchromatographie oder Affinitätschromatographie, unter Hilfe von Fibrinogen, gebunden an einen unlöslichen Träger, isoliert wird.
Vektoren, insbesondere Plasmide, die die Protein FIG kodierende Nukleotidsequenz oder Teile davon enthalten, können auf vorteilhafte Weise mit einer einfach spaltbaren Restriktionsstelle bereitgestellt werden, wodurch die Nukleotidsequenz, die ein anderes Produkt kodiert, mit der Protein FIG kodierenden Nukleotidsequenz fusioniert werden kann, um ein sogenanntes Fusionsprotein zu exprimieren. Das Fusionsprotein kann durch ein Verfahren isoliert werden, wobei seine Fähigkeit zur Bindung an Fibrinogen verwertet wird, woraufhin die andere Komponente des Systems wie gewünscht aus dem Fusionsprotein freigesetzt werden kann. Diese Technik wurde ausführlich in der WO 84/03103 im Hinblick auf das Protein A-System beschrieben und ist auch im vorliegenden Kontext in analoger Weise anwendbar. Die Fusionsstrategie kann auch verwendet werden, um die fibrinogenbindende Aktivität des Proteins FIG (oder eines Teils davon) durch Fusion mit anderen fibrinogenbindenden Molekülen zu modifizieren, zu erhöhen oder zu verändern.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Gebiet der Biotechnologie, was die Verwendung von bakteriellen Zelloberflächenkomponenten als Immunogene für eine Impfung gegen CNS-Infektionen betrifft. Die Immunisierung unter Verwendung von ganzen Bakterien wird immer eine hoch polyklonale Immunreaktion mit einem niedrigen Niveau von Antikörpern gegen eine gegebene antigene Determinante auslösen. Es wird daher bevorzugt, das Protein, Polypeptid oder die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung für die Immunisierungstherapien zu verwenden. Insbesondere können Immunisierungstherapien als sogenannte passive und aktive Immunisierung durchgeführt werden. Eine passive Immunisierung unter Verwendung des erfinderischen Proteins oder der DNA involviert das Anzüchten von Antikörpern gegen das Protein oder das Protein, kodiert von der verabreichten DNA in einem geeigneten Wirtstier, vorzugsweise einem Säuger, z.B. einem gesunden Blutspender oder einer Kuh, Sammeln und Verabreichen der Antikörper an einen Patienten. Eine bevorzugte Ausführungsform ist die passive Immunisierung eines Patienten vor einem chirurgischen Eingriff, z.B. Operationen, die Fremdimplantate in den Körper involvieren. Eine aktive Immunisierung unter Verwendung des erfinderischen Proteins oder der DNA involviert die Verabreichung des Proteins oder der DNA an einen Patienten, vorzugsweise in Kombination mit einem pharmazeutisch geeigneten immunstimulierenden Mittel. Beispiele für solche Mittel beinhalten die folgenden, sind jedoch nicht auf diese begrenzt: Choleratoxin und/oder Derivate davon, hitzelabile Toxine, wie z.B. E. coli-Toxin und ähnliche Mittel. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann weiterhin konventionelle und pharmazeutisch akzeptable Adjuvantien beinhalten, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunisierungstherapie wohlbekannt sind. Vorzugsweise wird bei einer Immunisierungstherapie unter Verwendung der erfinderischen DNA oder von Fraktionen davon die DNA intramuskulär verabreicht, wobei die DNA in geeignete Plasmidträger eingebaut wird. Ein zusätzliches Gen oder Gene, die ein geeignetes immunstimulierendes Mittel kodieren, können vorzugsweise in dasselbe Plasmid eingebaut werden.
Diese Immunisierungstherapien sind nicht auf die oben beschriebenen Verabreichungswege begrenzt, sondern können natürlich auf jeden der folgenden Verabreichungswege angepasst werden: oral, nasal, subkutan und intramuskulär. Insbesondere sind die oralen und nasalen Verabreichungsverfahren potenziell sehr vielversprechend, insbesondere für Immunisierungen in großem Umfang.
BEISPIELE
Ausgangsmaterialien
Bakterielle Stämme, Phagen und Klonierungsvektoren
Der Staphylococcus epidermidis-Stamm HB wurde von Dr Åsa Ljungh, Lund, Schweden, erhalten.
Der E. coli-Stamm TG1 und der Stamm MC1061 wurden als bakterieller Wirt für die Konstruktion der Bibliothek sowie die Produktion von Phagen-Stammlösungen verwendet. Der E. coli-Phage R408 (Promega, Madison, WI, USA) wurde als Helferphage verwendet.
Der verwendete Phagemidvektor pG8H6 wird bei Jacobsson und Frykberg (1996) beschrieben.
Alle in den Beispielen verwendeten Stämme und Plasmid- oder Phagemidkonstrukte sind im Department of Microbiology an der Schwedischen Universität of Agricultural Sciences, Uppsala, Schweden, erhältlich.
Puffer und Medien
E. coli wurde auf LB-Agarplatten (Luria Bectani broth) oder in LB-Broth (Sambrook et al. 1989) bei 37°C gezüchtet. In geeigneten Fällen wurde das LB-Medium mit Glukose auf eine Endkonzentration von 2% supplementiert. Ampicillin wurde in geeigneten Fällen dem E. coli-Wachstumsmedium zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml zugefügt. Die Staphylokokken wurden bei 37°C auf Blut-Agar-Platten gezüchtet (enthaltend 5% Endkonzentration Rinderblut) oder in Trypton-Soya-Broth (TSB, erhalten von Oxoid, Ltd. Basingstoke, Hants., England) PBS: 0,05 M Natriumphosphat, pH 7,1, 0,9% NaCl. PBS-T: PBS, supplementiert mit TWEEN 20 auf eine Endkonzentration von 0,05%.
Präparation von DNA aus Staphylokokken und Streptokokken
Die Stämme von S. epidermidis oder S. aureus wurden über Nacht in TSB gezüchtet. Am nächsten Morgen wurden die Zellen geerntet und die chromosomale DNA gemäß Löfdahl et al. (1983) hergestellt. Die chromosomale DNA von den Streptokokken wurde früher bereits in der WO 95/07300 beschrieben.
Proteine und andere Reagenzien
Menschliches Fibrinogen wurde von IMCO Ltd. (Stockholm, Schweden) erhalten. Menschliches Serumalbumin (HSA), Fibronektin, IgA, Lactoferrin und Transferrin wurde von Sigma, St. Louis, USA, erhalten. Rinderserumalbumin (Fraktion V, Ria-Grad) wurde von USB (Kat. Nr. 10868) erhalten. α₂-Makroglobulin (α₂M) und Kollagen Typ I wurden von Boehringer Mannheim, Deutschland erhalten. Vitronectin wurde von Bional, Tartu, Estland, erhalten und menschliches IgG von Kabi, Stockholm, Schweden. Elastin wurde von ICN Pharmaceuticals Inc. CA, USA und Pepsin von KEBO LAB, Stockholm, Schweden, erhalten.
Die DNA-Sonden wurden mit α³²P-ATP durch ein Random-Priming-Verfahren (Multiprime DNA labelling system; Amersham Inc., Amersham, England) markiert.
Nitrocellulose (NC) -Filter (Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland) wurden verwendet, um DNA in Hybridisierungsexperimenten oder Proteine in Western-Blot-Techniken zu binden.
Um Proteinproben durch native oder Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zu analysieren, wurde das PHAST-System, erhalten von Pharmacia LKB Biotechnologie, Uppsala, Schweden, gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.
Die verwendeten Oligonukleotide wurden von Pharmacia (Uppsala, Schweden) synthetisiert.
Die Mikrotiterplatten (MaxiSorp, Nunc, Kopenhagen, Dänemark) wurden in dem Panning-Experiment verwendet. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Wizard Minipreps (Promega) hergestellt und die Sequenz der Inserts wurde wie von Jacobsson und Frykberg (1995) beschrieben, bestimmt. Die erhaltenen Sequenzen wurden unter Verwendung des PC-Gene-Programms (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien, USA) analysiert.
Routineverfahren
Die routinemäßig in der Molekularbiologie verwendeten Verfahren werden nicht beschrieben, wie z.B. eine Restriktion von DNA mit Endonuklease, Ligation von DNA-Fragmenten, Plasmidreinigung usw., da diese Verfahren in üblicherweise verwendeten Manuals angetroffen werden (Sambrook et al., 1989, Ausubel et al., 1991). Ligationsreaktionen wurden unter Verwendung der -Ready-To-Go T4-DNA-Ligase (Pharmacia, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Für die Polymerasekettenreaktions-Amplifikation wurde das Gene Amp^TM-Kit, erhalten von Perkin Elmer Cetus, verwendet. Sequenzreaktionen wurden unter Verwendung von "Sequenase, Version 2.0" Kit (United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio, USA) durchgeführt. Alternativ wurde das ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit verwendet und die Proben unter Verwendung des Applied Biosystems 373A DNA Sequencers analysiert.
Beispiel 1:
Die Adhärenz von Staphylococcus epidermidis an immobilisiertes Fibrinogen und Untersuchung der Natur des Bindungsmechanismus (A-E)
Aus Fällen von Peritonitis isolierte Stämme von Staphylococcus epidermidis wurden auf Blut-Agar-Platten bei 37°C über Nacht gezüchtet. Die Bakterien von einer Platte wurden mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) geerntet, einmal gewaschen und die optische Dichte (OD) auf 1,0 eingestellt.
(A) Bakterielle Adhärenz
Fibrinogen wurde in PBS mit 10 mg/ml gelöst und in serieller dreifacher Verdünnung in Mikrotitervertiefungen (Nunc) gegeben, von der Spitze zum Boden hin. Die Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Um unbeschichtete Kunststoffstellen zu bedecken, wurden die Platten mit 2% Rinderserumalbumin 1 Stunde bei 37°C beschichtet. Die Platten wurden mit PBS mit 0,05% TWEEN 20 (PBST) gewaschen. Als nächstes wurden Bakterien in serieller zweifacher Verdünnung in PBST von links nach rechts zu den fibrinogenbeschichteten Mikrotiterplatten zugefügt. Eine bakterielle Adhärenz ließ man 2 Stunden bei 37°C oder 4°C über Nacht zu. Nicht-adhärente Bakterien wurden abgewaschen und die gebundenen Bakterien an der Luft getrocknet. Die kreuzweise Verdünnung von sowohl Fibrinogen als auch Bakterien erlaubt eine Schätzung der bakteriellen Bindung sowohl als Funktion der Fibrinogenkonzentration als auch der Menge der Bakterien. Die Bestimmung der bakteriellen Adhärenz wurde durch optisches Ablesen unter Verwendung eines Mikrotiterplattenablesers bei A 405 durchgeführt. Die Trübheit und die Lichtstreuung, die durch die gebundenen Bakterien ausgelöst wird, führt zu einer Ablesung im Bereich von 0,00 bis 0,20. Ein Beispiel für Adhärenzwerte als Funktion der Fibrinogen-Beschichtungskonzentration ist in 1 für drei unterschiedliche Stämme (2, 19 und JW27) dargestellt. Diese Bedingungen für die Adhärenzbestimmung wurden in den folgenden Experimenten verwendet.
(B) Adhärenzblockierung durch Antikörper gegen Fibrinogen
In einer Modifikation des oben durchgeführten Experiments wurden Antikörper gegen Fibrinogen (anti Fg) (Sigma) 1 Stunde vor Zugabe der Bakterien (OD = 1,0) zu dem immobilisierten Fibrinogen zugefügt. Als Kontrolle wurden Antikörper gegen Fibronectin (anti Fn) (Sigma) in einem separaten Experiment zugefügt. 2 zeigt, dass Antikörper gegen Fibrinogen (Kreise) die Adhärenz besser inhibierten als Antikörper gegen Fibronectin (Quadrate). Die Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unterschiedlichen Experimenten sind dargestellt.
(C) Adhärenzblockierung durch lösliches Fibrinogen
Das lösliche Fibrinogen wurde den Bakterien mit den in 3 angegebenen Konzentrationen zugefügt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert vor Zugabe zu mit Fibrinogen beschichteten Platten, wie oben beschrieben. Die Adhärenz des S. epidermidis-Stamm 19 (ausgefüllte Kreise) wurde mit ungefähr 30% inhibiert. Als Kontrolle wurde die Inhibition des Staphylococcus aureus-Stamm Newman in einem ähnlichen experimentellen Aufbau gemessen (offene Kreise). Mittelwerte und Standardabweichungen von drei separaten Experimenten sind dargestellt. Obwohl eine signifikante Inhibition einer Adhärenz von S. epidermidis erhalten wurde, war die Inhibition von S. aureus stärker ausgeprägt.
(D) Reduktion der Bindung nach einer Proteasebehandlung der Bakterien
Die Bakterien wurden 30 Minuten bei 37°C mit Protease K behandelt, und zwar mit den in 4 angegebenen Konzentrationen, vor einer Addition zu dem immobilisierten Fibrinogen. Die mit Protease behandelten Bakterien wurden extensiv nach der Proteasebehandlung gewaschen, um einen Proteaseverdau des immobilisierten Fibrinogens zu vermeiden. Vier unterschiedliche S, epidermidis-Stämme (2, 19, 269 und HB) und S. aureus (Stamm Newman) wurden in diesem Experiment verwendet. Alle getesteten Stämme zeigten eine Empfindlichkeit gegenüber der Proteasebehandlung, so hängt die Adhärenz an Fibrinogen von einem Oberflächenprotein ab.
(E) Ahärenzblockierung durch einen LiCl-Extrakt von S. epidermidis
S. epidermidis-Zellen, gezüchtet und geerntet wie oben beschrieben, wurden mit 1M LiCl bei 40°C für 2 Stunden unter kontinuierlichem vorsichtigem Rühren behandelt. Die Bakterien wurden zentrifugiert und der bakterienfreie Überstand wurde gefiltert und gegen PBS dialysiert. Oberflächenassoziierte Proteine, gebunden an die Zellen durch hydrophobe Wechselwirkungen, wurden dadurch freigesetzt. Dieser LiCl-Extrakt, von dem man annahm, dass er ein fibrinogenbindendes Protein enthielt, wurde verwendet, um die Adhärenz von S. epidermidis an immobilisiertes Fibrinogen auf die folgende Weise zu inhibieren: LiCl-Extrakt bei unterschiedlichen Verdünnungen wurde dem immobilisierten Fibrinogen zugefügt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und die Bakterien für den Adhäsionstest zugefügt. 5 zeigt, dass die Adhärenz besser war, je mehr der LiCl-Extrakt verdünnt wurde; d.h., dass eine adhäsionsinsinhibitorische Verbindung in dem LiCl-Extrakt vorliegt. Es werden zwei unabhängige Experimente dargestellt.
Beispiel 2:
Isolierung eines Klons, der eine fibrinogenbindende Aktivität exprimiert
Eine Genbibliothek des S. epidermidis-Stamm HB wurde auf die von Jacobsson und Frykberg (1996) beschriebene Weise erzeugt. Staphylokokken-DNA wurde statistisch durch Beschallung fragmentiert. Die Bibliothek führte zu 4 × 10⁷ unabhängigen Klonen, die nach Amplifikation einen Titer von 2 × 10¹⁰ KBE/ml aufwiesen. Zweihundert Mikroliter der Bibliothek wurden zu jeder der drei fibrinogenbeschichteten Vertiefungen zugefügt und 4 Stunden bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die Vertiefungen wurden extensiv mit PBS-T und einmal mit 50 mM Na-Citrat/140 mM NaCl, pH 5,4 gewaschen. Schließlich wurden die gebundenen Phagen schrittweise in demselben Puffer mit abnehmendem pH (3,4 und 1,8) eluiert. Die Eluate von den drei Vertiefungen wurden mit 2 M Tris-HCl, pH 8,6 neutralisiert. Aliquots der Eluate wurden verwendet, um E. coli TG1-Zellen zu infizieren, die daraufhin über Nacht auf LA-Platten, enthaltend Glukose und Ampicillin, gezüchtet wurden. Die Kolonien (erhalten nach Infektion von TG1-Zellen mit dem Phagen und eluiert bei pH 3,4 und 1,8 in dem primären Panning) wurden durch Resuspension in LB-Medium gesammelt und mit Helferphagen R408 [10¹⁰ Plaque-bildende Einheiten (pfu)] infiziert, um angereicherte Phagenlösungen zu erzeugen. Daraufhin wurden die infizierten Bakterien mit 4 ml 0,5% Weichagar vermischt und auf eine LA-Platte mit Ampicillin gegossen. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Phagen wie von Jacobsson und Frykberg (1996) beschrieben, gesammelt. Der resultierende Phagenstamm wurde wiederum gegen Fibrinogen einem Panning, wie oben beschrieben, unterzogen.
Das in Tabelle 1 dargestellte Ergebnis zeigt, dass es eine Anreicherung an Klonen mit einer Affinität für Fibrinogen gibt. Tabelle 1
Beispiel 3:
DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse
Acht Kolonien, die von dem zweiten Panning (pH 3,4), gegen Fibrinogen, wie beschrieben in Beispiel 2 abstammten, wurden für die weiteren Untersuchungen gewählt. Phagemid-DNA aus diesen Kolonien wurde hergestellt und teilweise sequenziert. Sieben der Klone schienen dasselbe Insert zu enthalten. Einer dieser siebe Klone, der pSE100 genannt wird, wurde für die weiteren Studien gewählt. Gereinigte Phagemid-DNA von dem Klon pSE100 wurde durch Restriktionskartierung analysiert, was ergab, dass das Phagemid ein Insert von ungefähr 1,8 Kilobasenpaaren (Kb) enthielt. Die Nukleotidsequenzen (nt) der vollständigen Inserts von pSE100 wurden bestimmt und die nt und abgeleiteten Aminosäuresequenzen (aa) wurden unter Verwendung des PC-Gene-Programms analysiert. Diese Analyse ergab, dass das Insert von pSE100 einen offenen Leserahmen von 1.745 nt (Sequenzprotokoll) enthält. So kodiert das Insert ein 582 aa-Protein, das Protein FIG genannt wird (und das korrespondierende Gen wird als fig bezeichnet), mit einer berechneten molekularen Masse von ~65 kDa (Sequenzprotokoll). Weiterhin zeigt die Sequenzanalyse, dass das Insert von pSE100 sich im richtigen Leserahmen mit den Vektorsequenzen in den 5'- und 3'-Enden befindet. Dies bedeutet, dass das Insert zu einer Fusion mit dem pel-Leader und dem myc-Tail (Sequenzprotokoll) führt und dass die nativen 5'- und 3'-Enden des fig-Gens in dem pSE100-Klon nicht vorliegen.
Um das fehlende 5'- und 3'-Ende des fig-Gens zu erhalten, wurde eine Southern-Blot-Analyse unter Verwendung einer chromosomalen DNA von dem Stamm HB, verdaut mit verschiedenen Restriktionsenzymen, durchgeführt. Die Sonde wurde wie folgt hergestellt: zwei Oligonukleotide (5'CAACAACCATCTCACACAAC3' und 5'CATCAAATTGATATTTCCCATC3') wurden verwendet, um unter Verwendung von PCR ein ~1,3 Kb-Fragment von dem Insert von pSE100 zu amplifizieren. Die PCR-erzeugten Fragmente wurden mit 32P unter Verwendung eines statistischen Priming markiert. Nach einer Hybridisierung unter Verwendung stringenter Bedingungen wurde der NC-Filter gewaschen und einer Autoradiographie unterzogen. Das Ergebnis zeigte, dass die XbaI-Spaltung eine einzelne Bande mit einer Größe von ~6 Kb ergab. Das korrespondierende Fragment wurde darauffolgend in einen XbaI-verdauten pUC18-Vektor ligiert. Nach der Transformation wurden Klone, die das ~6 Kb XbaI-Fragment beherbergten, durch Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung derselben Sonde wie bei dem Southern-Blot-Experiment identifiziert. Ein solcher Klon, der pSE101 genannt wird, wurde für die weiteren Untersuchungen gewählt. Die DNA-Sequenzanalyse zeigte, dass das fig-Gen aus einem offenen Leserahmen mit 3291 nt besteht, kodierend ein Protein, das FIG genannt wird, mit 1097 aa mit einer berechneten molekularen Masse von ungefähr 119 kDa (6).
Das FIG-Protein besteht aus etlichen typischen Merkmalen, die bei Gram-positiven Zelloberflächen-gebundenen Proteinen angetroffen werden, wie einer N-terminalen Signalsequenz und einem C-terminalen aa-Motiv LPDTG, gefolgt von einer Strecke von 17 hydrophoben Aminosäuren, endend in einer Strecke von geladenen Aminosäuren (6). Folgend auf die Signalsequenz gibt es einen Bereich, der A genannt wird, mit 773 aa. Das Insert von pSE100 enthält die Sequenz, korrespondierend zu Rest 75 bis 656 der A-Region (7). Auf die A-Region folgt eine hoch-repetitive Region mit 216 aa, bestehend aus Tandem-Repeat-Asparaginsäure und Serinresten, genannt R (6 und 7). Der Dipeptidbereich besteht aus einer 18 by Sequenzeinheit (Consensus von GAX TCX GAX TCX GAX AGX), was sich 36mal wiederholt. Die 18 bp-Sequenz wird fast vollständig durch die gesamte R-Region perfekt gehalten, mit der Ausnahme der zweiten Einheit, die abgekürzt ist, bestehend aus nur 12 der 18 by und dem 3'-Ende der Region, wo die Konsensussequenz leicht unterbrochen ist (Einheiten 32, 34 und 36). Die Veränderungen in den letzteren Einheiten führen auch zu einem Aminosäureaustausch, was das DS-Repeat unterbricht.
Unter Verwendung der deduzierten Aminosäuresequenz von Protein FIG wurden Proteindatenbanken im Hinblick auf eine Sequenzähnlichkeit untersucht. Interessanterweise zeigte die Suche, dass die höchste Bewertung für den Clumpingfactor (ClfA) von S. aureus erhalten wurde (7). Dieses Protein bindet Fibrinogen und es wurde hierfür gezeigt, dass es eine Aggregation von Bakterien in Gegenwart von Plasma unterstützt. Neben Ähnlichkeiten im N- und C-terminalen Teil, kodierend die Signalsequenz bzw. die Zellmembran überspannende Domäne ist die besonders ins Auge fallende Ähnlichkeit mit dem Clumpingfactor der repetitive R-Bereich. Sowohl beim ClfA als auch beim FIG-Protein wird der DS-Repeatbereich von derselben 18 by Konsensuseinheit kodiert. Bei einem Vergleich der Nukleotidsequenzen von fig und ClfA zeigt sich, dass die R-Regionen eine umfassende Homologie aufweisen. Zusätzlich zeigt das Protein FIG auch eine Homologie mit ClfA in der A-Region, der nicht-repetitiven Fibrinogen-Bindungsdomäne (7).
Beispiel 4:
Eigenschaften des fibrinogenbindenden Proteins, kodiert von pSE100
A) Spezifität der Fibrinogenbindung
Das Phagemid pSE100 wurde in kompetente E. coli TG1-Zellen elektroporiert. Nach einem Wachstum über Nacht auf einer LA-Platte (die Ampicillin und Glukose enthielt) wurde eine Kolonie, enthaltend pSE100 über Nacht gezüchtet und mit dem Helferphagen R408 zur Erzeugung einer angereicherten Phagenbasis infiziert. Die resultierende Phagenbasis, die rekombinante Phagen enthielt, die das Insert von pSE100 exprimierten, hatte einen Titer von 3 × 10⁹ KBE/ml. Die Phagenbasis von pSE100 wurde verwendet, um ein Panning gegen 13 unterschiedliche Proteine, geschichtet auf Mikrotitervertiefungen und gegen eine unbeschichtete Vertiefung durchzuführen. Zu jeder Vertiefung, die das jeweilige Protein enthielt (oder zu der unbeschichteten Vertiefung) wurden 200 μl der Phagenbasis von pSE100 zugefügt. Nach dreistündigem Panning bei RT unter leichtem Bewegen wurden die Vertiefungen extensiv gewaschen, wobei PBST verwendet wurde und eine Probe des letzten Waschens wurde gesammelt. Die gebundenen Phagen wurden mit Na-Citratpuffer bei pH 1,8 eluiert. Die eluierten Proben wurden sofort unter Verwendung von 1M Tris-HCl, pH 8,6 neutralisiert. Die eluierten Phagen und die Phagen von der Waschung ließ man separat E. coli TG1-Zellen infizieren und nach der Infektion wurden die Zellen auf LA-Platten, die Ampicillin und Glukose enthielten, ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und die Frequenz der Kolonien wurde gezählt. Das Ergebnis dieses Experiments ist in Tabelle 2 dargestellt, die die fibrinogenbindende Spezifität des Proteins, exprimiert durch pSE100 anzeigt. Tabelle 2
(B) Inhibitionsexperiment
Die pSE100-Phagenbasis wurde auf einen Titer von ~5 × 10⁶ KBE/ml verdünnt. Von dieser Phagenlösung wurden Proben (180 μl) genommen und separat eine Stunde mit unterschiedlichen Konzentrationen Fibrinogen, BSA oder IgG vor einer Übertragung auf fibrinogenbeschichtete Mikrotitervertiefungen inkubiert. Nach dreistündigem Panning bei RT mit leichtem Bewegen wurden die Vertiefungen extensiv unter Verwendung von PBST gewaschen. Die gebundenen Phagen wurden mit Na-Citratpuffer bei pH 1,8 eluiert. Die eluierten Proben wurden direkt unter Verwendung von 1M Tris-HCl, pH 8,6 neutralisiert. Man ließ die eluierten Phagen E. coli TG1-Zellen infizieren und nach der Infektion wurden die Zellen auf LA-Platten, die Ampicillin und Glukose enthielten, ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und die Frequenz der Kolonien gezählt. Das Ergebnis dieses Experiments ist in Tabelle 3 dargestellt, die zeigt, dass die Bindung an Fibrinogen durch Fibrinogen, jedoch nicht durch die anderen getesteten Proteine inhibiert wird. Tabelle 3
Beispiel 5:
Western Blot-Experiment
E. coli-Zellen des Stamms TG1 und MC1061, die pSE100 enthielten, wurden in LB (enthaltend Ampicillin und Glukose) über Nacht bei 37°C gezüchtet. Am nächsten Morgen wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in LB, enthaltend Ampicillin, Glukose und 0,1 M IPTG resuspendiert und weiterhin bei 37°C inkubiert. Zwölf Stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und sowohl die Zellen als auch der Überstand wurden weiterbehandelt. Vier Volumen Aceton wurden dem Überstand zugefügt und das resultierende Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt, an der Luft getrocknet und in eiskaltem PBS resuspendiert. Vor der Elektrophorese wurden die Zellen und das Präzipitat von dem Überstand separat in einem Probenpuffer resuspendiert, enthaltend 2,5% SDS und 5% β-Mercaptoethanol und 2 Minuten gekocht. Nach einer Denaturierung wurden die Proben unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung des PHAST-Systems (Pharmacia) auf einem 8–25%igen Gradientengel unter Verwendung von SDS-Pufferstreifen analysiert. Nachdem die Elektrophorese abgeschlossen war, wurde ein NC-Filter, der vorher in PBS eingeweicht worden war, auf das Gel gegeben und die Temperatur auf 45°C angehoben. Nach ungefähr 45 Minuten wurde der NC-Filter mit 1 ml PBS angefeuchtet, vorsichtig entfernt und in 15 ml PBS, enthaltend 0,1% TWEEN 20-Lösung (PBST 0,1%) für 30 Minuten bei RT unter leichter Bewegung und mit zwei Änderungen von PBST 0,1%-Lösung platziert. Nach der letzten Änderung von PBST 0,1%, wurde Fibrinogen auf eine Endkonzentration von 20 ng/ml zugefügt und der Filter vier Stunden bei RT unter leichter Bewegung inkubiert. Der Filter wurde darauffolgend 3 × 10 Minuten unter Verwendung von PBST 0,1% gewaschen und HRP-konjugierte Kaninchen-antimenschliche Fibrinogenantikörper (DAKO Code A 080, verdünnt 1:500 in PBST 0,1%) wurden zugefügt und der Filter 1 Stunde bei RT unter leichtem Bewegen inkubiert. Nach einem Waschen für 3 × 10 Minuten unter Verwendung von PBST 0,1% des Filters wurde das gebundene Fibrinogen durch Übertragung des Filters auf eine Lösung, enthaltend ein Substrat für die Meerrettichperoxidase (6 ml 4-Chlor-1-naphtol (3 mg/ml in Methanol) +25 ml PBS + 20 μl H₂O₂) visualisiert. Das Ergebnis zeigte, dass ein Fibrinogenbindungsprotein in beiden Arten von Proben (Zellen und Wachstumsmedien) in beiden E. coli-Zellen, die pSE100 beherbergten, angetroffen wurde, während kein solches Protein in den Kontrollkulturen von E. coli TG1 und MC1061 gefunden wurde. Das Fibrinogenbindungsprotein, exprimiert von pSE100, befand sich in der ungefähren Größe wie aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz erwartet.
Beispiel 6:
Das Auftreten des fig-Gens und die Verwendung des fig-Gens zur Identifizierung von S. epidermidis im diagnostischen Test
Gereinigte chromosomale DNA von dem S. aureus-Stamm 8325-4, Streptococcus equi ssp equi-Stamm 196 und ssp zooepidemicus-Stamm Z5, Streptococcus pyogenes-Stamm 2-1047, Streptococcus dysgalactiae-Stamm 8215 wurden unter Verwendung des Restriktionsenzyms EcoRI gespalten. Die gespaltenen Proben ließ man auf einem 0,8%igen Agarosegel zusammen mit chromosomaler DNA des S. epidermidis-Stamms HB, gespalten mit verschiedenen Restriktionsenzymen laufen. Nach Abschluss der Elektrophorese wurden die separaten DNA-Fragmente auf einen NC-Filter unter Verwendung des Vacuum-Blotting-Systems von Pharmacia übertragen. Nach dem Transfer wurde der Filter unter stringenten Bedingungen hybridisiert (in einer Lösung, die 6 × SSC, 5 × Denhart, 0,5% SDS bei 65°C enthielt), wobei eine Sonde verwendet wurde, die basierend auf der Nukleotidsequenz des Inserts von pSE100 entworfen worden war. Diese Sonde war früher wie folgt hergestellt worden, zwei Oligonukleotide: (5'-AGGTCAAGGACAAGGTGAC-3' und 5'-CAACAACCATCTCACACAAC-3') wurden bestellt (Pharmacia) und als Primerpaar in einer PCR (25 Zyklen von 94°C, 1 Minute, 50°C, 30 Sekunden, 72°C, 1 Minute unter Verwendung von Perkin Elmer Cetus Thermal Cycler 480) verwendet, um ein ~150 Bp-Fragment des Inserts von pSE100 zu amplifizieren. Das amplifizierte Material ließ man auf einem Agarosegel laufen und das ~150 Bp-Fragment wurde gereinigt und unter Verwendung von ³²P-dATP und dem Multiprime DNA-Labelling-System (Amersham) radioaktiv markiert. Der Filter wurde über Nacht hybridisiert und darauffolgend in einer Waschlösung (0,2% SSC, 0,1% SDS) bei 60°C gewaschen und autoradiografisch untersucht. Das Ergebnis zeigte, dass keine Hybridisierung bei den Proben nachgewiesen wurde, die von den Streptokokken und S. aureus abstammten, während eine Hybridisierung mit den Proben stattfand, die von dem S. epidermidis-Stamm HB stammten.
Um das Auftreten des fig-Gens in anderen Stämmen von S. epidermidis zu untersuchen, wurde die folgende PCR-Reaktion aufgestellt. Chromosomale DNA von 13 unterschiedlichen klinischen Isolaten von S. epidermidis wurden als Matrizen verwendet. Dieselben Primer und PCR-Bedingungen, wie oben beschrieben, wurden verwendet. Das Ergebnis zeigte, dass ein amplifiziertes Produkt von ~150 Bp nachgewiesen werden konnte (wobei ein 2%iges Agarosegel verwendet wurde), und zwar bei allen Stämmen von S. epidermidis, jedoch nicht in den ursprünglichen Kontrollproben, die chromosomale DNA von S. aureus und S. pyogenes enthielten.
Beispiel 7:
Ein PCR-Amplifikations-Assay für die Analyse von einem korrespondierenden DS-Repeat von verschiedenen Isolaten von S. epidermidis
McDevitt und Foster (Microbiology, 1995, 141:937–943) haben gezeigt, dass sich die DS-Repeat-Regionen bei verschiedenen Isolaten von S. aureus-Stämmen deutlich unterscheiden können. Um zu untersuchen, ob sich die DS-Repeat-Region in S. epidermidis auch in der Größe zwischen unterschiedlichen Isolaten unterscheidet, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Ein Primerpaar (5'-CCGATGAAAATGGAAAGTATC-3' und 5'-TCCGTTATCTATACTAAAGTC-3'), das an das 5'- bzw. 3'-Ende der DS-Repeat-Region des Proteins FIG hybridisierte, wurde verwendet, um die korrespondierende Region in 11 unterschiedlichen Isolaten von S. epidermidis zu amplifizieren. Die Amplifikation wurde wie folgt durchgeführt, nach anfänglicher Denaturierung für 1 min bei 95°C begann ein Zyklus mit einem Denaturierungsschritt 30 Sekunden bei 95°C, gefolgt von einer Annealingzeit von 1 min bei 50°C und einer Elongationszeitspanne von 2 min bei 72°C.
Der Zyklus wurde 25mal wiederholt und endete mit einer abschließenden Elongationsperiode von 7 min bei 72°C. Die PCR-Produkte, die die DS-Region des jeweiligen Stamms repräsentierten, wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Das Ergebnis zeigte, dass eine Bande mit verschiedenen Längen in jeder Probe vorlag. Die Schlußfolgerung hieraus ist, dass diese Verfahrensart als diagnostischer Test verwendet werden kann, um einen "Fingerabdruck" eines bestimmten Stamms zu erhalten. Dies könnte z.B. bei dem Nachweis des Ursprungs einer Infektion nützlich sein.
Beispiel 8:
Die Verwendung des DS-Fragments vom Stamm HB, um andere homologe Gene in Koagulase-positiven und -negativen Staphylokokken zu identifizieren
Ein DNA-Fragment, bestehend aus der DS-Repeat-Region wurde wie folgt konstruiert. Ein Paar von Oligonukleotidprimern (5'-ACTGATCATGATGACTTTAGT-3' und 5'-TCCGTTATCTATACTAAAGTC-3') wurde verwendet, um die DS-Region des Stamms HB unter Verwendung derselben Bedingungen, wie oben beschrieben, durch PCR zu amplifizieren. Die Amplifikation führte zu einem 700 Bp-Fragment, das unter Verwendung eines statistischen Priming radioaktiv (³²P) markiert wurde. Diese Sonde wurde in einer Southern Blot-Analyse unter Verwendung chromosomaler DNA (gespalten mit EcoRI) von verschiedenen Arten von Staphylokokken (S. aureus, S. epidermidis-Stamm HB, S. haemolyticus-Stamm 789 und Stamm SM131, S. lugdunensis, S. schleiferi, S. intermedius, S. lentus, S. sciuri, S. carnosus, S. saprophyticus und S. hyicus) verwendet.
Die Hybridisierung wurde unter stringenten Bedingungen bei 65°C über Nacht durchgeführt. Am nächsten Tag wurde der Filter bei 65°C gewaschen, wobei 2 × SSC, folgend auf die Autoradiografie verwendet wurde. Das Ergebnis zeigte, dass mindestens eine spezifische Bande für die folgenden Arten vorlag: S. aureus, S. epidermidis-Stamm HB, S. haemolyticus-Stamm 789 und Stamm SM131, S. lugdunensis, S. intermedius, S. sciuri, S. carnosus (schwaches Signal) und S. hyicus. Dieses Ergebnis zeigt, dass es möglich ist, die korrespondierenden Regionen in diesen Arten zu klonieren und zu identifizieren.
Beispiel 9:
Produktion von GST-FIG
Durch eine Polymerase-Kettenreaktion wurde ein DNA-Fragment amplifiziert, das einen Teil des fibrinogenbindenden Proteins kodierte. Der obere Primer war GCGGATCCAATCAGTCAATAAACA CCGACGAT und der untere Primer war CGGAATTCTGTTCGGACTGATTTGGAAGTTCC. Die Amplifikation wurde für 30 Zyklen bei 94°C 30 Sekunden, 60°C 30 Sekunden, 72°C 2 Minuten, beginnend mit 94°C für 4 Minuten und endend mit 72°C für 4 Minuten, durchgeführt. Das amplifizierte Fragment wurde mit EcoRI und Bam HI verdaut. Das Plasmid pGXT-4T (Pharmacia, Uppsala, Schweden) wurde mit EcoRI und Bam HI verdaut, mit dem verdauten Fragment vermischt und die Mischung unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase gemäß Standardverfahren ligiert. Die ligierte DNA wurde in den E. coli-Stamm TG1 transformiert. Ein Transformant wurde mit einem Plasmid isoliert, das ein Fusionsprotein kodierte, bestehend aus Glutathion-Thiotransferase und fibrinogenbindendem Protein. Das Protein wurde mit dem Vektorplasmid gemäß den Anweisungen von Pharmacia gereinigt. Das gereinigte GST-FIG-Protein wurde einem Western-Affinitäts-Blot unterzogen. Es wurde einer Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen, auf Nitrocellulosepapier durch passive Diffusion übertragen, das Papier wurde mit Fibrinogen (5 μg/ml) 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt, gefolgt von Kaninchen-anti-Fibrinogen-Antikörpern, konjugiert an HRP. Eine Bande, die zu einem Molekulargewicht von ~100 kDa korrespondierte, wurde beobachtet. Wenn Fibrinogen in einem Kontrollexperiment weggelassen wurde, zeigte sich keine Bande.
Beispiel 10:
Demonstration der Bindung von GST-FIG an stationäres Phasen-Fibrinogen
Mikrotitervertiefungen wurden mit menschlichem Fibrinogen (Sigma Chemicals Co.) mit einer Konzentration im Bereich von 2,5 bis 20 μg/ml bei Raumtemperatur über Nacht beschichtet. Die Platten wurden mit 2%igem Rinderserumalbumin (BSA) für eine Stunde bei 37°C nachbeschichtet. Die Mikrotiterplatten wurden dreimal gewaschen und GST-FIG wurde den Vertiefungen mit Konzentrationen von 25, 50 oder 100 μg/ml (angezeigt durch die drei getrennten Linien in 8) zugefügt und die Platten zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Der Fang von GST-FIG an der Fibrinogenschicht wurde nach dem Waschen durch Antikörper (1.000fach verdünnt), gezüchtet in einer Ratte gegen His-FIG nachgewiesen. Die Bindung der Antikörper wurde nach dem Waschen mit Kaninchen-anti-Ratten-IgG-Antikörpern, konjugiert an HRP, nachgewiesen. Das Substrat für HRP waren OPD-Tabletten (Dakopatts) mit H₂O₂. Die Farbreaktion wurde bei 495 nm gemessen. 8 zeigte, dass GST-FIG an Fibrinogen in dosisabhängiger Weise gefangen wird.
Beispiel 11:
Inhibition der S. epidermis-Adhärenz an Fibrinogen durch FIG
Fibrinogen mit 2 μg/ml wurde verwendet, um Mikrotiterplatten über Nacht bei Raumtemperatur zu beschichten und es wurde, wie oben erklärt, nachbeschichtet. GST-FIG-Fusionsprotein, GST oder FIG wurde mit den in 9 angegebenen Konzentrationen zugefügt. Radioaktiv markierte Bakterien wurden direkt danach zugefügt und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Abnahme der bakteriellen Bindung als Funktion des GST-FIG-Fusionsproteins, GST oder FIG ist in 9 dargestellt. Die Symbole in 9 sind die folgenden: Quadrate: Inhibition durch GST-FIG (Mittel und Standardabweichung von fünf unabhängigen Experimenten sind dargestellt); Dreiecke: Inhibition durch das GST-Trägerprotein; Kreise: Inhibition durch FIG nach einem Thrombinverdau. Nur das Fusionsprotein und die FIG-Moleküle konnten die Bindung inhibieren.
Eine radioaktive Markierung von Bakterien wurde erhalten, indem sie in Gegenwart von tritiumbehandeltem Thymidin (20 μCi/ml, spezifische Aktivität 81 Ci/mmol) für 5 Stunden auf LB gezüchtet wurden.
Die Spaltung von GST-FIG wurde durch Zugabe von Thrombin und Inkubation für 2 Stunden bei 37°C erreicht.
Beispiel 12:
Inhibition der S. epidermidis-Adhärenz an Fibrinogen durch Antikörper gegen GST-FIG und FIG
Fibrinogen, mit 2 mg/ml, wurde verwendet, um Mikrotitervertiefungen über Nacht bei Raumtemperatur zu beschichten und es wurde wie oben nachbeschichtet. Radioaktiv markierter S. epidermidis wurde mit unterschiedlichen Verdünnungen der Seren für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Bakterium-Serum-Mischungen wurden dann den Vertiefungen zugefügt und man ließ eine Adhärenz für zwei Stunden bei 37°C stattfinden. Nicht-adhärente Bakterien wurden abgewaschen und die Menge der adhärenten Bakterien wurde wie in Beispiel 11 oben bestimmt. Vier Serumproben wurden verwendet: 1) Serum von vor einer Immunisierung von Ratte Nr. 1. 2) Serum von vor der Immunisierung von Ratte Nr. 2. 3) Serum von Ratte Nr. 1, immunisiert mit GST-FIG. 4) Serum von Ratte Nr. 2, immunisiert mit FIG, erzeugt durch Thrombinspaltung. Aus 10 kann abgelesen werden, dass die Adhärenz nach Inkubation mit Seren gegen FIG oder gegen das GST-FIG-Fusionsprotein reduziert ist. Unter relativer Adhärenz von 1,0 wird die nach der Inkubation der radioaktiv markierten Bakterien mit phosphatgepufferter Salzlösung erhaltene Adhärenz verstanden.
Das Experiment wurde wiederholt und die Daten von dem Adhärenzblockieren unter Verwendung von Seren, die vor der Immunisierung und Seren, die nach der Immunisierung mit GST-FIG genommen wurden, sind in 11 dargestellt.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurde, die die beste Art und Weise beschreiben, die den Erfindern gegenwärtig bekannt ist, sollte verstanden werden, dass verschiedene Veränderungen und Modifikationen, die für den Fachmann naheliegen würden, durchgeführt werden können, ohne sich vom Umfang der Erfindung, der in den beigefügten Ansprüchen dargestellt ist, zu entfernen.
Referenzliste

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Jacobsson, K. and Frykberg L. (1996) Phage display shotgun cloning of ligand-binding domains of prokaryotic receptors approaches 100% correct clones. BioTechniques 20:1070–1081. Löfdahl, S., Guss, B., Uhlen, M., Philipson, L. and Lindberg, M. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:697–701.
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Zitierte Patente oder Patentanmeldungen: WO 95/07300, US 4,237,224 , WO 84/03103.

SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL – FORTSETZUNG
SEQUENZPROTOKOLL – FORTSETZUNG
Sequenzprotokoll: Eine Partial-Nukleotidsequenz des putativen fig-Gens des S. epidermidis-Stamms HB und die abgeleitete Aminosäuresequenz. Die Vektorsequenzen an der Verbindung der 5'- und 3'-Enden sind angegeben. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Protein oder Polypeptid mit fibrinogenbindender Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Polypeptid eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die in der folgenden Aminosäuresequenz enthalten ist (6):
Protein oder Polypeptid mit fibrinogenbindender Aktivität nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Polypeptid eine Aminosäuresequenz beinhaltet, welche in der folgenden Aminosäuresequenz enthalten ist (6):
Protein oder Polypeptid mit fibrinogenbindender Aktivität nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Polypeptid eine Aminosäuresequenz beinhaltet, welche in der folgenden Aminosäuresequenz enthalten ist (6):
Protein oder Polypeptid mit fibrinogenbindender Aktivität nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Proteins oder Polypeptids die folgende Aminosäuresequenz ist (6):
Isoliertes oder rekombinantes DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, welche für ein Protein oder Polypeptid mit fibrinogenbindender Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1–4 codiert.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Molekül für ein Protein oder Polypeptid nach Anspruch 1 codiert und die folgende Nukleotidsequenz aufweist (6):
Plasmid, Phage oder Phagemid mit einer Nukleotidsequenz nach Anspruch 5 oder 6.
Mikroorganismus mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 5 oder 6.
Mikroorganismus mit mindestens einem Plasmid, Phagen oder Phagemid nach Anspruch 7.
Verfahren zur Herstellung eines fibrinogenbindenden Proteins oder eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass – mindestens ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 5 oder 6 in einen Mikroorganismus eingeschleust wird, – der Mikroorganismus in einem geeigneten Medium kultiviert wird, – das so gebildete Protein durch chromatographische Reinigung isoliert wird.
Verfahren zur Herstellung eines fibrinogenbindenden Proteins oder Polypeptids desselben, dadurch gekennzeichnet, dass – mindestens ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 5 oder 6 exprimiert wird, um ein Protein nach einem der Ansprüche 1–4 auf einem Phagenpartikel herzustellen, – der genannte Phagenpartikel fibrinogenbindende Aktivität aufweist.
Verwendung eines Proteins oder Polypeptids mit fibrinogenbindender Aktivität nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Blockierung der Haftung von Staphylokokken an Oberflächen.
Gegen ein Protein oder Polypeptid mit fibrinogenbindender Aktivität nach einem der Ansprüche 1–4 gerichtete Antikörper.
Verwendung von Antikörpern nach Anspruch 13 zur Herstellung eines Medikaments für therapeutische und prophylaktische Zwecke.
Impfstoff, der ein Protein oder Polypeptid mit fibrinogenbindender Aktivität nach einem der Ansprüche 1–4 enthält.
Impfstoff, der eine DNA-Sequenz nach Anspruch 5 oder 6 enthält.