ES2258280T3 - Nueva proteina de union a fibrinogeno originada a partir de staphylococus coagulasa negativo. - Google Patents
Nueva proteina de union a fibrinogeno originada a partir de staphylococus coagulasa negativo.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA PROTEINA O POLIPEPTIDO QUE SE UNE A FIBRINOGENO, ORIGINADA A PARTIR DE ESTAFILOCOCOS NEGATIVOS PARA COAGULASA. SE PRESENTAN TAMBIEN PROCEDIMIENTOS BIOTECNOLOGICOS PARA PRODUCIR DICHA PROTEINA O POLIPEPTIDO Y UNA MOLECULA DE ADN RECOMBINANTE QUE CODIFICA PARA DICHA PROTEINA (O PARA FRAGMENTOS DE LA MISMA), Y MICROORGANISMOS (INCLUYENDO VIRUS) QUE CONTIENEN DICHA MOLECULA DE ADN RECOMBINANTE. LA INVENCION COMPRENDE ADEMAS LA UTILIZACION TERAPEUTICA Y DIAGNOSTICA DE DICHA PROTEINA Y/O ADN, P.EJ. COMO EQUIPAMIENTO DIAGNOSTICO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA Y/O TIPO DE ESTAFILOCOCOS NEGATIVOS PARA LA COAGULASA Y UNA COMPOSICION DE VACUNA QUE COMPRENDE DICHA PROTEINA O ADN.
Description
Nueva proteína de unión a fibrinógeno originada a
partir de Staphylococus coagulasa negativo.
El invento se refiere al campo de la tecnología
genética y está interesado en las moléculas de ADN, aisladas o
recombinantes, que contienen una secuencia de nucleótidos que
codifica para una proteína o polipéptido de Staphylococcus
epidermidis que tiene actividad de unión a fibrinógeno y con
dicha proteína o polipéptido. Además, el invento comprende
microorganismos (incluidos virus) que contienen las moléculas
antedichas y el uso de los mismos en la producción de la antedicha
proteína o polipéptido y su empleo en biotecnología. Además, el
presente invento comprende usos diagnósticos y terapéuticos de dicha
proteína nueva, p. ej., composiciones para inmunización activa y/o
pasiva.
Durante la pasada década los estafilococos
coagulasa negativos (ECN) han atraído una atención creciente. Junto
con el desarrollo de la medicina humana y veterinaria, ha aumentado
el número de hospedantes susceptibles. La cirugía avanzada, un uso
mayor de biomateriales, la medicación con citostáticos, antibióticos
y otros fármacos, junto con un aumento en la frecuencia de cepas de
ECN resistentes a antibióticos, han aumentado la susceptibilidad del
hospedante. En cuanto a la importancia veterinaria de los ECN, se
sabe que pueden causar, p. ej., tanto inflamación subclínica como
clínica en la ubre bovina. La existencia de bacterias que se unen
específicamente a fibrinógeno se ha conocido durante muchos años. El
papel de la unión a fibrinógeno en el procedimiento de interacción
entre el hospedante y Staphylococcus aureus aún no está
claro, pero la unión a fibrinógeno se ha considerado como un factor
potencial de virulencia de esta especie, por ejemplo, en la
endocarditis (Moreillon et al., 1995). Solamente se ha
descrito hasta la fecha una proteína con propiedades de unión a
fibrinógeno originada a partir de ECN, a saber, una proteína de una
cepa de S. aureus coagulasa negativa (Usui Y, Zentralbl
Bakteriol Mikrobiol Hyg, 262(3): 289-97). Se
han empleado técnicas de ADN recombinante en la producción de una
proteína de unión a fibrinógeno a partir de S. aureus
(documento WO 94/06830). Sin embargo, el presente invento describe
la caracterización y aislamiento de una proteína de unión a
fibrinógeno de Staphylococcus epidermidis empleando
clonación genética. Además, el invento describe métodos diferentes
para medir la actividad de unión a fibrinógeno en células de S.
epidermidis y el empleo de esta proteína en biotecnología.
Generalmente podría ser difícil obtener un
producto homogéneo y reproducible si tal proteína de unión fuese
preparada a partir de células de estafilococo directamente. Además,
los estafilococos son patógenos y necesitan medios de cultivo
complejos, lo que implica complicaciones en los cultivos a gran
escala. Existe, por tanto, la necesidad de un nuevo método para
producir una proteína de unión a fibrinógeno (o fragmentos de la
misma).
El presente invento describe una nueva proteína
de unión a fibrinógeno llamada FIG, una molécula de ADN que
codifica dicha proteína y aplicaciones para su uso, de acuerdo con
las reivindicaciones anexas. De forma importante, el presente
invento llena la largamente sentida necesidad de proporcionar
métodos y medios para el diagnóstico, determinación del tipo,
tratamiento y prevención de las infecciones causadas por S.
epidermidis coagulasa negativo.
El invento se describirá en mayor detalle a
continuación, con ayuda de los ejemplos y figuras adjuntos, en los
que
la Fig. 1 muestra los valores de adherencia como
una función de la concentración del recubrimiento de fibrinógeno
para las cepas 2, 19 y JW27 de S. epidermidis (Ejemplo
1A),
la Fig. 2 muestra el porcentaje de inhibición
para anticuerpos contra fibrinógeno, comparado con anticuerpos
contra fibronectina (Ejemplo 1B),
la Fig. 3 muestra el porcentaje de inhibición
como una función de la concentración del fibrinógeno que compite
(Ejemplo 1C),
la Fig. 4 muestra la sensibilidad de la proteasa
a la adherencia a fibrinógeno (Ejemplo 1D),
la Fig. 5 muestra la inhibición de la adherencia
mediante extracto de LiCl (Ejemplo 1E),
la Fig. 6 muestra la secuencia completa de
nucleótidos del gen fig de la cepa HB de S.
epidermidis y la secuencia de aminoácidos deducida de la
proteína codificada. Un lugar putativo de unión al ribosoma (RBS)
está subrayado y un posible bucle en horquilla de terminación de la
transcripción está subrayado con doble línea. Se indica una posible
secuencia señal (S) con una flecha y con un asterisco el codón de
terminación de la traducción. El inicio de la región terminal N no
repetitiva llamada A, que alberga la actividad de unión a
fibrinógeno, se indica mediante una flecha. R indica la región
altamente repetitiva. El motivo LPXTG implicado en la fijación a la
pared celular se indica en negrita y la región que atraviesa la
membrana se marca con M (Ejemplo 3),
la Fig. 7 muestra un dibujo esquemático que
compara la proteína FIG de unión a fibrinógeno de S.
epidermidis y el factor aglutinante (ClfA) de S. aureus.
La similitud (%) de las correspondientes regiones en las proteínas
se indica en la figura entre las dos barras de proteína. S es la
secuencia señal; A, la región no repetitiva que alberga la actividad
de unión a fibrinógeno; R, la región de repetición de restos de
diamioácidos; W, la región propuesta como implicada en la fijación a
la pared celular y M, el dominio transmembrana. Los números
indicados se refieren a las posiciones de los aminoácidos en las
proteínas respectivas, según se muestra en la Figura 6 y en la
referencia (McDevitt et al., 1994) (Ejemplo 3),
la Fig. 8 muestra cómo la proteína de fusión
GST-FIG se captura con fibrinógeno en una manera
dependiente de la dosis (Ejemplo 10),
la Fig. 9 muestra la disminución de la unión
bacteriana como una función de la proteína de fusión
GST-FIG, GST o FIG (Ejemplo 11),
la Fig. 10 muestra la adherencia relativa como
función de la dilución sérica para dos sueros preinmunes y para un
suero contra GST-FIG y FIG, respectivamente,
(Ejemplo 12) y
la Fig. 11 muestra la adherencia bacteriana
relativa como una función, de un lado, de la dilución sérica para
suero preinmune y, de otro lado, para suero contra
GST-FIG (Ejemplo 12).
El presente invento se refiere a una molécula de
ADN aislada o recombinante que comprende una secuencia de
nucleótidos, la cual codifica para una proteína o polipéptido que
tiene actividad de unión a fibrinógeno. La fuente natural de esta
secuencia de nucleótidos es, por supuesto, la cepa HB de S.
epidermidis, pero con el conocimiento de los nucleótidos y de la
secuencia deducida de aminoácidos presentados aquí, el gen o partes
del gen pueden aislarse o fabricarse sintéticamente. En particular,
el conocimiento de la secuencia deducida de aminoácidos para la
parte de la proteína responsable de la actividad de unión a
fibrinógeno puede emplearse para producir polipéptidos sintéticos,
los cuales retienen o inhiben la unión a fibrinógeno. Estos
polipéptidos pueden marcarse con varios compuestos tales como
enzimas, fluorescencia, biotina (o sus derivados), radiactividad,
etc. y usarse, p. ej., en pruebas diagnósticas como técnicas de
ELISA o RIA.
Para producir una molécula de ADN recombinante,
de acuerdo con el invento, un vehículo o vector de clonación
adecuado, por ejemplo, un fagómido, plásmido o fago de ADN, puede
digerirse con la ayuda de una enzima de restricción después de lo
cual la secuencia de ADN que codifica para la proteína o polipéptido
deseado se inserta dentro del sitio de corte para formar la
molécula de ADN recombinante. Este procedimiento general resulta
bien conocido para un experto, y se han descrito en la bibliografía
varias técnicas para cortar y ligar secuencias de ADN (véase por
ejemplo el documento de EE.UU. 4.237.224; Ausubel et al.,
1991; Sambrook et al., 1989). Sin embargo, a conocimiento
presente de los inventores, estas técnicas no se han empleado para
el propósito presente. Si se emplea la cepa HB de S.
epidermidis como fuente de la secuencia nucleotídica deseada, es
posible aislar dicha secuencia e introducirla dentro de un vector
apropiado de una manera tal como la descrita en la parte
experimental abajo o, dado que la secuencia de nucleótidos se
presenta en esta memoria, emplear una técnica de reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) para obtener el gen fig completo o
fragmentos.
Los hospedantes que pueden emplearse son
microorganismos (que pueden fabricarse para producir la proteína o
fragmentos activos de la misma), los cuales pueden comprender
hospedantes bacterianos tales como cepas de, p. ej., Escherichia
coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus sp., Lactobacillus sp.
y, además, levaduras y otras células eucariotas en cultivo. Para
obtener la máxima expresión, elementos reguladores tales como
promotores y secuencias de unión a ribosomas pueden variarse en una
manera conocida per se. La proteína o el péptido activo de la
misma pueden producirse intra o extracelularmente. Para obtener una
buena secreción en varios sistemas bacterianos podrían emplearse
diferentes péptidos señal. Para facilitar la purificación y/o
detección, la proteína o el fragmento de la misma podrían fusionarse
a un asidero y/o enzima de afinidad. Esto puede llevarse a cabo
tanto a nivel genético como proteico. Para modificar las
características de la proteína o del polipéptido de la misma, el gen
o partes del gen pueden modificarse empleando, p. ej., mutagénesis
in vitro o mediante fusión de otras secuencias de nucleótidos
que codifican polipéptidos que resultan en una proteína de fusión
con características nuevas.
El invento, de este modo, comprende moléculas de
ADN aisladas o recombinantes que contienen una secuencia de
nucleótidos, la cual codifica para una proteína o polipéptido de
Staphylococcus epidermidis que tiene propiedades de unión a
fibrinógeno. Además, el invento comprende vectores tales como, p.
ej., plásmidos y fagos que contienen tal secuencia de nucleótidos, y
organismos, especialmente bacterias como, p. ej., cepas de E.
coli, B. subtilis y Staphylococcus sp., dentro de los
cuales se introduce tal vector. Alternativamente, tal secuencia de
nucleótidos puede integrarse en el genoma natural del
microorganismo.
La aplicación se refiere, además, a métodos para
producir una proteína o polipéptido que tiene la actividad de unión
a fibrinógeno de la proteína FIG o de los fragmentos activos de la
misma. De acuerdo con este método, un microorganismo, según se
expone anteriormente, se cultiva en un medio apropiado, después de
lo cual el producto resultante se aisla mediante algún método de
separación, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, o por
medio de cromatografía de afinidad con la ayuda de fibrinógeno unido
a un soporte insoluble.
Los vectores, especialmente los plásmidos, que
contienen la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína FIG o
partes de la misma pueden, de forma ventajosa, proporcionarse con un
sitio de restricción preparado para su escisión por medio del cual
una secuencia de nucleótidos que codifica para otro producto puede
fusionarse a la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína
FIG, para expresar una, así llamada, proteína de fusión. La proteína
de fusión puede aislarse mediante un procedimiento que utiliza su
capacidad de unión a fibrinógeno, después de lo cual el otro
componente del sistema puede, si se desea, liberarse de la proteína
de fusión. Esta técnica se ha descrito en profundidad en el
documento WO 84/03103 con respecto del sistema de la proteína A y es
aplicable también en el contexto presente de manera análoga. La
estrategia de fusión también puede emplearse para modificar,
aumentar o cambiar la actividad de unión a fibrinógeno de la
proteína FIG (o parte de la misma) por fusión de otras moléculas de
unión a
fibrinógeno.
fibrinógeno.
El presente invento también se aplica al campo de
la biotecnología que concierne al uso de componentes de la
superficie de la célula bacteriana como inmunógenos para vacunación
frente a infecciones de ECN. La inmunización que emplea la bacteria
completa siempre desencadenará una respuesta inmune policlonal con
un bajo nivel de anticuerpos contra un determinante antigénico dado.
Por tanto, es preferible emplear la proteína, polipéptido o ADN de
acuerdo con el presente invento para terapias de inmunización.
Notablemente, las terapias de inmunización pueden conducirse como
las así llamadas inmunización pasiva y activa. La inmunización
pasiva que emplea la proteína o ADN del invento comprende generar
anticuerpos contra dicha proteína o la proteína codificada por el
ADN administrado en un hospedante animal adecuado, preferiblemente
un mamífero, p. ej., un donante de sangre sano o una vaca, reuniendo
y administrando dichos anticuerpos a un paciente. Una realización
preferida es la inmunización pasiva de un paciente previamente a la
cirugía, p. ej., en operaciones que implican implantes foráneos en
el cuerpo. La inmunización activa que usa la proteína o ADN del
invento comprende la administración a un paciente de dicha proteína
o ADN, preferiblemente en combinación con un agente
inmunoestimulante farmacéuticamente apropiado. Ejemplos de tales
agentes incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: toxina
de cólera y/o sus derivados, toxinas lábiles al calor, tales como la
toxina de E. coli y agentes similares. La composición de
acuerdo con el presente invento puede incluir además adyuvantes
convencionales y aceptables farmacéuticamente, bien conocidos para
una persona experta en la técnica de la terapia de inmunización.
Preferentemente, en una terapia de inmunización que emplea el ADN
del invento o fracciones del mismo, dicho ADN se administra
preferentemente intramuscularmente, por medio del cual dicho ADN se
incorpora en vehículos plasmídicos adecuados. Un gen o genes
adicionales que codifican un agente inmunoestimulante adecuado puede
incorporarse preferiblemente en el mismo
plásmido.
plásmido.
Dichas terapias de inmunización no están
restringidas a las vías de administración descritas anteriormente,
sino que pueden adaptarse de forma natural a una cualquiera de las
vías de administración: oral, nasal, subcutánea e intramuscular.
Especialmente los métodos oral y nasal de administración son
potencialmente muy prometedores, en particular para inmunizaciones a
gran escala.
La cepa HB de Staphylococcus epidermidis
se obtuvo del Dr. \ring{A}sa Ljungh, Lund, Suecia.
La cepa TG1 y la cepa MC1061 de E. coli se
emplearon como hospedantes bacterianos para construir la librería y
producir los stocks de fagos. El fago R408 de E. coli
(Promega, Madison, WI, EE.UU.) se empleó como fago ayudante.
El vector fagómido pG8H6 empleado se describe por
Jacobsson y Frykberg (1996).
Todas las cepas y constructos de plásmidos o
fagómidos empleados en los ejemplos están disponibles en el
Departamento de Microbiología de la Universidad Sueca de Ciencias de
la Agricultura, Uppsala, Suecia.
Se cultivó E. coli en placas de agar LB
(medio de Luria Bertani) o en medio LB (Sambrook et al.,
1989) a 37ºC. En los casos apropiados, el medio LB se suplementó con
glucosa hasta una concentración final de 2%. En los casos apropiados
se añadió ampicilina al medio de cultivo de E. coli hasta una
concentración final de 50 \mug/ml. Los estafilococos se cultivaron
a 37ºC en placas de agar sangre (que contienen una concentración
final de sangre bovina del 5%) o en medio de triptona soja (TSB
obtenido de Oxoid, Ltd. Basingstoke, Hants., Inglaterra) PBS: 0,05 M
de fosfato sódico a pH 7,1, 0,9% de NaCl. PBS-T: PBS
suplementado con Tween 20 hasta una concentración final de
0,05%.
Las cepas de S. epidermidis o S.
aureus se cultivaron durante toda la noche en TSB. A la mañana
siguiente las células se recogieron y se preparó el ADN cromosómico
de acuerdo con Löfdahl et al. (1983). El ADN cromosómico a
partir de estreptococos se ha descrito previamente en el documento
WO 95/07300.
El fibrinógeno humano se obtuvo a partir de IMCO
Ltd. (Estocolmo, Suecia). La albúmina del suero humano (HSA),
fibronectina, IgA, lactoferrina y transferrina se obtuvieron de
Sigma (St. Louis, EE.UU.). La albúmina de suero bovino (fracción V,
grado ria) se obtuvo de USB (número de catálogo 10868). La
\alpha_{2}-macroglobulina (\alpha_{2}M) y el
colágeno tipo I se obtuvieron de Boehringer (Mannheim, Alemania). La
vitronectina se obtuvo de Bional, Tartu, Estonia y la IgG humana de
Kabi, Estocolmo, Suecia. La elastina se obtuvo de ICN
Pharmaceuticals Inc., CA, EE.UU. y la pepsina de KEBO LAB,
Estocolmo, Suecia.
Las sondas de ADN se marcaron con
\alpha^{32}P-ATP mediante un método de cebadores
aleatorios (sistema de marcaje de ADN Multiprime, Amersham Inc.,
Amersham, Inglaterra).
Los filtros de nitrocelulosa (NC) (Schleicher
& Schüll, Dassel, Alemania) se emplearon para unir ADN en
experimentos de hibridación o proteínas en técnicas de transferencia
Western.
A fin de analizar las muestras de proteína
mediante electroforesis en gel nativo o de sodio
dodecilsulfato-poliacrilamida
(SDS-PAGE), se empleó el sistema PHAST obtenido de
Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, de acuerdo con las
recomendaciones del proveedor.
Los oligonucleótidos empleados fueron
sintetizados por Pharmacia (Uppsala, Suecia).
Las placas de micropocillos (MaxiSorp, Nunc,
Copenague, Dinamarca) se emplearon en el experimento de sembrado. El
ADN plasmídico se preparó empleando minipreparaciones Wizard
(Promega) y la secuencia de los insertos se determinó según se
describe por Jacobsson y Frykberg (1995). Las secuencias obtenidas
se analizaron empleando el programa de PC-gene
(Intelligenetics, Mountain View, CA, EE.UU.)
Los métodos empleados de forma rutinaria en
biología molecular no se describen, como la restricción de ADN con
endonucleasas, la ligación de fragmentos de ADN, la purificación de
plásmidos, etc., dado que estos métodos pueden encontrarse en los
manuales empleados habitualmente (Sambrook et al., 1989;
Ausubel et al., 1991). Las reacciones de ligación se llevaron
a cabo empleando la ligasa de ADN T4
Ready-To-Go (Pharmacia, Uppsala,
Suecia). Para la amplificación mediante la reacción en cadena de la
polimerasa se empleó el kit Gen Amp^{TM}, obtenido de Perkin Elmer
Cetus. Las reacciones de secuencia se llevaron a cabo empleando el
kit "Sequenasa, versión 2.0" (United States Biochemical
Corporation, Cleveland, Ohio, EE.UU.). Alternativamente, se empleó
el kit de reacción de secuenciación ABI PRISM Dye Terminador Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit y las muestras se analizaron empleando
el secuenciador de ADN 373A de Applied Biosystems.
Las cepas de Staphylococcus epidermidis
aisladas de los casos de peritonitis se cultivaron en placas de agar
sangre a 37ºC durante toda la noche. Las bacterias de una placa se
recogieron con 5 ml de disolución salina de tampón fosfato (PBS), se
lavaron una vez y se ajustó la densidad óptica (OD) a 1,0.
El fibrinógeno se disolvió en PBS a 10 mg/ml y se
añadió en una dilución seriada 3 veces a las microplacas de
titulación (Nunc), de arriba hacia abajo. Las placas se incubaron
durante toda la noche a temperatura ambiente (RT). Para cubrir los
lugares del plástico no recubiertos las placas se cubrieron con 2%
de albúmina de suero bovino durante 1 hora a 37ºC. Las placas se
lavaron con PBS con 0,05% de Tween 20 (PBST). A continuación, las
bacterias se añadieron en dilución seriada de 2 veces en PBST, de
izquierda a derecha, a las microplacas de titulación recubiertas con
fibrinógeno. Se permitió la adherencia bacteriana durante 2 horas a
37ºC o a 4ºC durante toda la noche. Las bacterias que no se
adhirieron se retiraron por lavado y las bacterias unidas se secaron
al aire. La dilución transversa tanto del fibrinógeno como de las
bacterias permite estimar la unión de las bacterias como una función
de la concentración de fibrinógeno y de la cantidad de bacterias. La
determinación de la adherencia bacteriana se llevó a cabo mediante
lectura óptica empleando un lector de microplacas de titulación a A
405. La turbiedad y la dispersión de la luz causadas por las
bacterias unidas da como resultado un intervalo de lectura desde
0,00 hasta 0,20. Un ejemplo de los valores de la adherencia en
función de la concentración de recubrimiento de fibrinógeno se
muestra en la Figura 1 para tres cepas diferentes (2, 19 y JW27).
Estas condiciones para la determinación de la adherencia se
emplearon en los experimentos siguientes.
En una modificación del experimento realizado
anteriormente, se añadieron anticuerpos contra fibrinógeno (anti Fg)
(Sigma) 1 hora antes de añadir bacterias (OD = 1,0) al fibrinógeno
inmovilizado. Como control, los anticuerpos contra fibronectina
(anti Fn) (Sigma) se añadieron en un experimento aparte. La Figura 2
muestra que los anticuerpos contra fibrinógeno (círculos) inhibieron
la adherencia mejor que lo hicieron los anticuerpos contra
fibronectina (cuadrados). Se muestran los valores de la media y los
errores estándar de tres experimentos por sepa-
rado.
rado.
El fibrinógeno soluble se añadió a las bacterias
a las concentraciones indicadas en la Figura 3 y se incubó durante
1 hora a 37ºC antes de su adición a las placas recubiertas de
fibrinógeno, según se describió anteriormente. La adherencia de la
cepa 19 de S. epidermidis (círculos rellenos) se inhibió
hasta aproximadamente un 30%. Como control, la inhibición de la cepa
Newman de Staphylococcus aureus se midió en una estructura
experimental similar (círculos vacíos). Se muestran los valores de
la media y los errores estándar a partir de tres experimentos
separados. Aunque se obtuvo una inhibición significativa de la
adherencia de S. epidermidis, la inhibición de S.
aureus fue más
pronunciada.
pronunciada.
Las bacterias se trataron durante 30 minutos a
37ºC con proteasa K, a las concentraciones indicadas en la Figura
4, antes de la adición al fibrinógeno inmovilizado. Las bacterias
tratadas con proteasa se lavaron ampliamente después del
tratamiento con proteasa para evitar la digestión del fibrinógeno
inmovilizado. Se emplearon cuatro cepas diferentes de S.
epidermidis (2, 19, 269 y HB) y S. aureus (cepa Newman)
en este experimento. Todas las cepas sometidas a ensayo mostraron
sensibilidad al tratamiento de proteasa; de este modo la adherencia
a fibrinógeno depende de una proteína de superficie.
Células de S. epidermidis, cultivadas y
recogidas según se describe anteriormente, se trataron con 1 M de
LiCl a 40ºC durante 2 horas con agitación continua suave. Las
bacterias se centrifugaron y el sobrenadante libre de bacterias se
filtró y dializó frente a PBS. Las proteínas asociadas a la
superficie unidas a las células mediante interacciones hidrofóbicas
se liberan así. Este extracto de LiCl, que contiene presumiblemente
una proteína de unión a fibrinógeno, se empleó para inhibir la
adherencia de S. epidermidis a fibrinógeno inmovilizado de
la siguiente manera: el extracto de LiCl a varias diluciones se
añadió al fibrinógeno inmovilizado y se incubó durante 1 hora a
37ºC. Las placas se lavaron y las bacterias se añadieron para el
ensayo de adhesión. La Fig. 5 muestra que la adherencia era mejor
cuanto más diluido estaba el extracto de LiCl; es decir, un
compuesto inhibidor de la adhesión está presente en el extracto de
LiCl. Se muestran dos experimentos independientes.
Se produjo una genoteca de la cepa HB de S.
epidermidis de la manera descrita por Jacobsson y Frykberg
(1996). El ADN de estafilococo se fragmentó al azar por sonicación.
La librería dio como resultado 4 x 10^{7} clones independientes,
los cuales tras amplificación tenían un título de 2 x 10^{10}
ufc/ml. Doscientos microlitros de la librería se añadieron a cada
uno de los tres pocillos recubiertos con fibrinógeno y se incubaron
durante 4 horas a temperatura ambiente (RT). Los pocillos se lavaron
extensamente con PBS-T y una vez con 50 mM de
Na-citrato/140 mM de NaCl, pH 5,4. Finalmente, los
fagos unidos se eluyeron gradualmente en el mismo tampón con pH
decreciente (3,4 y 1,8). Los eluidos de los tres pocillos se
neutralizaron con 2 M de Tris-HCl, pH 8,6. Alícuotas
de los eluidos se emplearon para infectar células de E. coli
TG1, las cuales subsecuentemente se cultivaron durante toda la noche
sobre placas de LA que contenían glucosa y ampicilina. Las colonias
(obtenidas después de la infección de las células TG1 con el fago y
los eluidos a pH 3,4 y 1,8 en el lavado primario) se recogieron
mediante resuspensión en medio LB y se infectaron con el fago
ayudante R408 [10^{10} unidades formadoras de placa (ufp)] para
producir stocks enriquecidos de fagos. Subsecuentemente, las
bacterias infectadas se mezclaron con 4 ml de 0,5% de agar blando y
se vertieron sobre una placa LA con ampicilina. Después de incubar a
lo largo de la noche a 37ºC los fagos se recogieron según se
describe por Jacobsson y Frykberg (1996). El stock de fagos
resultante se volvió a sembrar frente a fibrinógeno según se
describió anteriormente. El resultado presentado en la Tabla 1
muestra que hay un enriquecimiento de clones que tienen afinidad al
fibrinógeno.
| Sembrado | Ligando | |
| Fibrinógeno | IgG | |
| Primer lavado | 1,6 x 10^{3} ufc/ml | - |
| pH 5,4 | 1,6 x 10^{3} ufc/ml | - |
| pH 3,4 | 2,1 x 10^{3} ufc/ml | - |
| pH 1,8 | 7,0 x 10^{3} ufc/ml | - |
| Segundo lavado | 1,2 x 10^{3} ufc/ml | 2,2 x 10^{2} ufc/ml |
| pH 5,4 | 4,4 x 10^{3} ufc/ml | 6,2 x 10^{2} ufc/ml |
| pH 3,4 | 4,3 x 10^{4} ufc/ml | 1,4 x 10^{3} ufc/ml |
| pH 1,8 | 2,0 x 10^{3} ufc/ml | 8,0 x 10^{2} ufc/ml |
Se eligieron ocho colonias, descritas en el
Ejemplo 2, procedentes del segundo lavado (pH 3,4) frente a
fibrinógeno para estudios adicionales. El ADN fagómido de estas
colonias se preparó y se secuenció parcialmente. Siete de los clones
parecían contener el mismo inserto. Uno de estos siete clones
llamado pSE100 se eligió para estudios adicionales. El ADN del
fagómido purificado a partir del clon pSE100 se analizó mediante
mapa de restricción, el cual reveló que el fagómido contenía un
inserto de \sim1,8 kilopares de bases (kb). Se determinaron las
secuencias de nucleótidos (nt) de los insertos completos de pSE100 y
las secuencias de nt y la de aminoácidos (aa) deducida se
analizaron empleando el programa PC-gen. Este
análisis reveló que el inserto de pSE100 contiene un marco abierto
de lectura de 1.745 nt (listado de secuencias). De este modo, el
inserto codifica una proteína de 581 aa, denominada proteína FIG (y
el correspondiente gen denominado fig), con una masa
molecular calculada de \sim65 kDa (listado de secuencias). Además,
el análisis de la secuencia muestra que el inserto de pSE100 está en
el marco de lectura correcto con las secuencias del vector en los
extremos 5' y 3'. Esto significa que el inserto da origen a una
fusión con el líder pel y la cola myc (lista de
secuencias) y que los extremos nativos 5' y 3' del gen fig no
están presentes en el clon pSE100.
Para obtener el extremo 5' y 3' que falta del gen
fig se llevó a cabo un análisis de transferencia Southern
empleando el ADN cromosómico de la cepa HB digerida con varias
enzimas de restricción. La sonda se preparó como sigue: dos
oligonucleótidos (5'CAACAACCATCTCACACAAC3' y
5'CATCAAATTGATATTTCCCATC3') se emplearon para amplificar por PCR un
fragmento de \sim1,3 kb a partir del inserto de pSE100. Los
fragmentos generados por PCR se marcaron con ^{32}P empleando
cebadores aleatorios. Después de la hibridación, el filtro NC se
lavó empleando condiciones astringentes y se sometió a
autorradiografía. El resultado mostró que el corte XbaI dio
una única banda en tamaño de \sim6 kb. El fragmento
correspondiente se ligó subsecuentemente dentro del vector pUC18
digerido con XbaI. Después de la transformación, los clones
que albergaban el fragmento XbaI de \sim6 kb se
identificaron mediante hibridación de colonias empleando la misma
sonda que en el experimento de transferencia Southern. Uno de tales
clones, llamado pSE101, se escogió para estudios adicionales. El
análisis de la secuencia de ADN mostró que el gen fig
consiste en un marco abierto de lectura de 3.291 nt, que codifica
una proteína llamada FIG de 1.097 aa con una masa molecular
calculada de \sim119 kDa (Figura 6). La proteína FIG consiste en
varias características típicas encontradas entre las proteínas
unidas a la superficie de la célula de Gram positivas, como una
secuencia señal N-terminal y un motivo
C-terminal de aa LPDTG, seguido por un tramo de 17
aa hidrofóbicos que terminan en un tramo de aa cargados (Figura 6).
A continuación de la secuencia señal hay una región, llamada A, de
773 aa. El inserto de pSE100 contiene la secuencia correspondiente a
los restos 75 a 656 de la región A (Figura 7). La región A se sigue
por una región altamente repetitiva de 216 aa compuesta de restos de
ácido aspártico y serina repetidos en tándem, llamada R (Figuras 6 y
7). La región dipétido consiste en una unidad de secuencia de 18 pb
(consenso de GAX TCX GAX TCX GAX AGX) repetida 36 veces. La
secuencia de 18 pb se mantiene casi perfecta a lo largo de la
región R completa, excepto por la segunda unidad que está truncada,
y consiste sólo en 12 de los 18 pb y el extremo 3' de la región
donde la secuencia consenso está ligeramente interrumpida (unidades
32, 34 y 36). Los cambios en las últimas unidades también dan como
resultado un intercambio de aminoácidos que interrumpen la
repetición DS.
repetición DS.
Empleando la secuencia de aminoácidos deducida de
la proteína FIG, las bases de datos de proteínas se escrutaron en
busca de similitudes de secuencia. De forma interesante, la búsqueda
mostró que la mayor puntuación obtenida fue para el factor
aglutinante (ClfA) de S. aureus (Figura 7). Esta proteína se
une a fibrinógeno y se ha mostrado que promueve la agregación de
bacterias en presencia de plasma. Aparte de las similitudes en la
parte N- y C-terminal codificadas por la secuencia
señal y el dominio que atraviesa la membrana celular,
respectivamente, la semejanza más obvia con el factor aglutinante es
la región repetitiva R. En ambos, ClfA y proteína FIG, la región de
repetición DS está codificada por la misma unidad consenso de 18 pb.
La comparación de las secuencias de nucleótidos de fig y
clfA muestra que las regiones R tienen una homología extensa.
Además, la proteína FIG muestra también homología con ClfA en la
región A, el dominio no repetitivo de unión a fibrinógeno (Figura
7).
El fagómido pSE100 se electroporó dentro de
células competentes TG1 de E. coli. Después de cultivarse a
lo largo de la noche en una placa LA (que contenía ampicilina y
glucosa), una colonia que contenía pSE100 se cultivó durante toda
la noche y se infectó con el fago ayudante R408 para producir un
stock de fagos enriquecidos. El almacén de fagos resultante
conteniendo fagos recombinantes que expresaban el inserto de pSE100
tenía un título de 3 x 10^{9} ufc/ml. El almacén de fagos de
pSE100 se empleó para sembrar frente a 13 proteínas diferentes
impregnadas en micropocillos de titulación y a un pocillo no
recubierto. Se añadieron 200 \mul del stock de fago de pSE100 a
cada pocillo conteniendo la proteína respectiva (o al pocillo no
recubierto). Después del sembrado durante tres horas a RT bajo
agitación suave los pocillos se lavaron extensamente, empleando PBST
y se recogió una muestra del último lavado. Los fagos unidos se
eluyeron con tampón citrato sódico a pH 1,8. Las muestras eluidas se
neutralizaron inmediatamente empleando 1 M de
Tris-HCl a pH 8,6. Se permitió que los fagos eluidos
y los fagos de los lavados infectasen separadamente las células de
E. coli TG1 y, después de la infección, las células se
sembraron en placas LA que contenían ampicilina y glucosa. Las
placas se incubaron toda la noche a 37ºC y se contó la frecuencia de
colonias. El resultado de este experimento se presenta en la Tabla
2, la cual muestra la especificidad de unión a fibrinógeno de la
proteína expresada por
pSE100.
pSE100.
\vskip1.000000\baselineskip
| Ligando | Lavado | Eluido a pH 1,8 |
| Fibrinógeno | 1,1 x 10^{4} ufc/ml | 1,4 x 10^{7} ufc/ml |
| \alpha_{2}M | 2,0 x 10^{2} ufc/ml | 2,0 x 10^{3} ufc/ml |
| BSA | < 10^{2} ufc/ml | 8,0 x 10^{2} ufc/ml |
| Colágeno tipo I | 6,0 x 10^{2} ufc/ml | 1,2 x 10^{3} ufc/ml |
| Elastina | 8,0 x 10^{2} ufc/ml | 5,2 x 10^{3} ufc/ml |
| Fibronectina | 6,0 x 10^{2} ufc/ml | 2,4 x 10^{4} ufc/ml |
| HSA | 8,0 x 10^{2} ufc/ml | 2,2 x 10^{3} ufc/ml |
| IgA | 6,0 x 10^{2} ufc/ml | 6,8 x 10^{4} ufc/ml |
| IgG | 4,0 x 10^{2} ufc/ml | 4,4 x 10^{3} ufc/ml |
| Lactoferrina | 6,0 x 10^{2} ufc/ml | 8,2 x 10^{3} ufc/ml |
| Pepsina | 1,8 x 10^{2} ufc/ml | 3,7 x 10^{4} ufc/ml |
| Transferrina | 2,0 x 10^{2} ufc/ml | 2,4 x 10^{3} ufc/ml |
| Vitronectina | < 10^{2} ufc/ml | 2,2 x 10^{3} ufc/ml |
| Plástico | 2,4 x 10^{3} ufc/ml | 9,0 x 10^{3} ufc/ml |
\vskip1.000000\baselineskip
El stock de fago pSE100 se diluyó hasta un título
de \sim5 x 10^{6} ufc/ml. De esta solución de fago se tomaron
muestras (180 \mul) y se incubaron separadamente durante una hora
con diferentes concentraciones de fibrinógeno, BSA o IgG antes de
transferirlas a los micropocillos de titulación recubiertos con
fibrinógeno. Después de panning durante tres horas a RT bajo
agitación suave, los pocillos se lavaron extensamente empleando
PBST. Los fagos unidos se eluyeron con tampón
Na-citrato a pH 1,8. Las muestras eluidas se
neutralizaron inmediatamente empleando 1 M Tris-HCl
a pH 8,6. Se permitió que los fagos eluidos infectaran células de
E. coli TG1 y, tras la infección, las células se sembraron en
placas LA que contenían ampicilina y glucosa. Las placas se
incubaron toda la noche a 37ºC y se contó la frecuencia de colonias.
El resultado de este experimento se presenta en la Tabla 3, la cual
muestra que la unión a fibrinógeno se inhibe por fibrinógeno, pero
no con otras proteínas sometidas a ensayo.
| Concentración de ligandos diferentes | Ligandos solubles | ||
| (\mug/ml) | Fibrinógeno | BSA | IgG |
| 0 | 7,6 x 10^{4} ufc/ml | 7,6 x 10^{4} ufc/ml | 7,6 x 10^{4} ufc/ml |
| 0,1 | 4,4 x 10^{4} ufc/ml | 7,0 x 10^{4} ufc/ml | 6,2 x 10^{4} ufc/ml |
| 1 | 3,6 x 10^{4} ufc/ml | 9,3 x 10^{4} ufc/ml | 9,0 x 10^{4} ufc/ml |
| 10 | 1,5 x 10^{4} ufc/ml | 6,3 x 10^{4} ufc/ml | 7,8 x 10^{4} ufc/ml |
| 100 | 3,8 x 10^{3} ufc/ml | 6,4 x 10^{4} ufc/ml | 7,3 x 10^{4} ufc/ml |
| 1000 | 3,0 x 10^{2} ufc/ml | 6,9 x 10^{4} ufc/ml | 7,6 x 10^{4} ufc/ml |
Las células E. coli de la cepa TG1 y
MC1061 que contenían pSE100 se cultivaron en LB (con ampicilina y
glucosa) toda la noche a 37ºC. A la mañana siguiente las células se
recogieron por centrifugación, se resuspendieron en LB (que contenía
ampicilina, glucosa y 0,1 M de IPTG) y se incubaron de nuevo a 37ºC.
Doce horas más tarde las células se recogieron por centrifugación y,
ambos, las células y el sobrenadante se guardaron. Cuatro volúmenes
de acetona se añadieron al sobrenadante y el precipitado resultante
se reunió por centrifugación, se secó al aire y se resuspendió en
PBS enfriado en hielo. Antes de la electroforesis las células y el
precipitado del sobrenadante se resuspendieron separadamente en un
tampón de muestra que contenía 2,5% de SDS y 5% de
beta-mercaptotetanol y se hirvieron durante dos
minutos. Tras la desnaturalización, las muestras se analizaron al
someterse bajo condiciones reductoras empleando el sistema PHAST
(Pharmacia) en un gel en gradiente 8-25% empleando
tiras de tampón SDS. Una vez se completó la electroforesis se colocó
sobre el gel un filtro NC previamente empapado en PBS y se elevó la
temperatura a 45ºC. Después de \sim45 minutos el filtro NC se
humedeció con 1 ml de PBS, se retiró suavemente y se colocó en 15 ml
de PBS que contenían una solución de 0,1% de Tween 20 (0,1% de PBST)
durante 30 minutos a RT (bajo agitación suave y con dos cambios de
solución de 0,1% de PBST). Después del último cambio de 0,1% de PBST
se añadió fibrinógeno hasta una concentración final de 20 ng/ml y el
filtro se incubó durante cuatro horas a RT bajo agitación suave. El
filtro se lavó subsecuentemente durante 3 x 10 minutos empleando
PBST al 0,1% y se añadieron anticuerpos de conejo contra fibrinógeno
humano conjugados con HRP (DAKO código A 080, diluidos 1:500 en 0,1%
de PBST) y el filtro se incubó durante 1 hora a RT bajo agitación
suave. Una vez lavado el filtro durante 3 x 10 minutos empleando
0,1% de PBST el fibrinógeno unido se visualizó al transferir el
filtro a una solución que contenía un sustrato para la peroxidasa de
rábano (6 ml de
4-cloro-1-naftol [3
mgl/ml en metanol] + 25 ml de PBS + 20 \mul de H_{2}O_{2}). El
resultado mostró que se encontró una proteína de unión a fibrinógeno
en ambos tipos de muestras (células y medio de cultivo) en ambas
células de E. coli que albergaban pSE100, mientras que no se
encontró tal proteína en los cultivos control de E. coli TG1
y MC1061. La proteína de unión a fibrinógeno expresada a partir de
pSE100 tenía el tamaño aproximado al esperado a partir de los
aminoácidos deducidos.
Los ADN cromosómicos, purificados a partir de la
cepa 8325-4 de S. aureus, de la cepa 196 de
Streptococcus equi subsp. equi y de la cepa Z5 de la
subespecie zooepidemicus, de la cepa 2-1047
de Streptococcus pyogenes, de la cepa 8215 de
Streptococcus dysgalactiae, se digirieron empleando la enzima
de restricción EcoRI. Las muestras digeridas se migraron en
un gel de 0,8% de agarosa junto con ADN cromosómico de la cepa HB de
S. epidermidis digerido con varias enzimas de restricción.
Una vez completada la electroforesis, los fragmentos de ADN
separados se transfirieron a un filtro NC empleando el sistema de
transferencia Vacuum de Pharmacia. Después de la
transferencia, el filtro se hibridó bajo condiciones astringentes
(en una solución que contenía 6 x SSC, 5 x Denhart, 0,5% de SDS a
65ºC) empleando una sonda diseñada de acuerdo con la secuencia de
nucleótidos del inserto de pSE100. Esta sonda se había preparado con
anterioridad como sigue, se pidieron dos oligonucleótidos
(Pharmacia):
(5'-AGGTCAAGGA
CAAGGTGAC-3' y 5'-CAACAACCATCTCAC ACAAC-3') y se emplearon como un par de cebadores en una PCR (25 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 30 segundos a 50ºC, 1 minuto a 72ºC, empleando un termociclador 480 de Perkin Elmer Cetus) para amplificar un fragmento de \sim150 pb del inserto de pSE100. El material amplificado se migró en un gel de agarosa y el fragmento de \sim150 pb se purificó y se marcó radiactivamente empleando ^{32}P-dATP y el sistema de marcaje de ADN Multiprime (Amersham). El filtro se hibridó toda la noche y se lavó subsecuentemente en una solución de lavado (0,2% de SSC, 0,1% de SDS) a 60ºC y se autorradiografió. El resultado mostró que no se detectó hibridación en las muestras originadas a partir de estreptococos y S. aureus, mientras que la hibridación tuvo lugar en las muestras procedentes de la cepa HB de S. epidermidis.
CAAGGTGAC-3' y 5'-CAACAACCATCTCAC ACAAC-3') y se emplearon como un par de cebadores en una PCR (25 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 30 segundos a 50ºC, 1 minuto a 72ºC, empleando un termociclador 480 de Perkin Elmer Cetus) para amplificar un fragmento de \sim150 pb del inserto de pSE100. El material amplificado se migró en un gel de agarosa y el fragmento de \sim150 pb se purificó y se marcó radiactivamente empleando ^{32}P-dATP y el sistema de marcaje de ADN Multiprime (Amersham). El filtro se hibridó toda la noche y se lavó subsecuentemente en una solución de lavado (0,2% de SSC, 0,1% de SDS) a 60ºC y se autorradiografió. El resultado mostró que no se detectó hibridación en las muestras originadas a partir de estreptococos y S. aureus, mientras que la hibridación tuvo lugar en las muestras procedentes de la cepa HB de S. epidermidis.
Para investigar la ocurrencia del gen fig
en otras cepas de S. epidermidis se estableció la siguiente
reacción de PCR. El ADN cromosómico de 13 aislados clínicos
diferentes de S. epidermidis se empleó como molde. Se
emplearon los mismos cebadores y las mismas condiciones de PCR que
las descritas anteriormente. El resultado mostró que un producto
amplificado de \sim150 pb se pudo detectar (empleando un gel de 2%
de agarosa) en todas las cepas de S. epidermidis, pero no en
las muestras originales control que contenían ADN cromosómico de
S. aureus y S. pyogenes.
McDevitt y Foster (Microbiology, 1995,
141:937-943) han mostrado que la región de
repetición DS de varios aislados de cepas de S. aureus puede
diferir considerablemente. Para investigar si la región de
repetición DS en S. epidermidis también varía en tamaño entre
los diferentes aislados se llevó a cabo el siguiente experimento. Se
empleó un par de cebadores (5'CCGATGAAAATGGAAAGTATC3' y
5'TCCGTTATCTATACTAAAGTC3') que hibridaba en los sitios 5' y 3',
respectivamente, de la región de repetición DS de la proteína FIG
para amplificar por PCR la región correspondiente en 11 aislados
diferentes de S. epidermidis. La amplificación se llevó a
cabo según sigue: después de la desnaturalización inicial durante 1
min a 95ºC comenzó un ciclo con una etapa de desnaturalización
durante 30 s a 95ºC, seguida de un tiempo de hibridación de 1 min a
50ºC y un periodo de elongación de 2 min a 72ºC. El ciclo se repitió
25 veces y terminó con un periodo final de elongación de 7 min a
72ºC. Los productos de PCR representando la región DS de las
respectivas cepas se analizaron mediante electroforesis en gel de
agarosa. El resultado mostró que estaba presente una banda de
longitud variable en cada muestra. La conclusión de esto es que este
tipo de método puede emplearse como una prueba diagnóstica para
obtener una "huella" de una cepa particular. Esto podría ser
útil en, p. ej., trazar el origen de una infección.
Se construyó un fragmento de ADN consistente en
la región de repetición DS como sigue. Se empleó un par de
oligonucleótidos cebadores (5'ACTGATCATGATGACTTTAGT3' y
5'TCCGTTATCTATACTAAAGTC3') para amplificar por PCR la región DS de
la cepa HB empleando las mismas condiciones a las descritas
anteriormente. La amplificación dio como resultado un fragmento de
\sim700 pb que se marcó radiactivamente (^{32}P) empleando
cebadores aleatorios. Esta sonda se utilizó en un análisis de
transferencia Southern empleando ADN cromosómico (digerido con
EcoRI) de varias especies de estafilococos (S. aureus,
cepa HB de S. epidermidis, cepa 789 y cepa SM131 de S.
haemolyticus, S. lugdunensis, S. schleiferi, S. intermedius, S.
lentus, S. sciuri, S carnosus, S. saprophyticus y S.
hyicus).
La hibridación se llevó a cabo bajo condiciones
astringentes a 65ºC toda la noche. Al día siguiente, el filtro se
lavó a 65ºC, empleando 2 x SSC, seguido de autorradiografía. El
resultado mostró que al menos estaba presente una banda específica
para las siguientes especies: S. aureus, cepa HB de S.
epidermidis, cepa 789 y cepa SM131 de S. haemolyticus, S.
lugdunensis, S. intermedius, S. sciuri, S. carnosus (señal
débil) y S. hyicus. Este resultado muestra que es posible
clonar e identificar las regiones correspondientes en estas
especies.
Mediante la reacción en cadena de la polimerasa,
se amplificó un fragmento de ADN que codificaba una porción de la
proteína de unión a fibrinógeno. El cebador superior fue
GCGGATCCAATCAGTCAATAAACACCGACGAT y el cebador inferior fue
CGGAATTCTGTTCGGACTGATTTGGAAGTTCC. La amplificación se realizó
durante 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC, 2
minutos a 72ºC, comenzando con 94ºC durante 4 minutos y terminando
con 72ºC durante 4 minutos. El fragmento amplificado se digirió con
EcoRI y BamHI. El plásmido pGXT-4T
(Pharmacia, Uppsala, Suecia) se digirió con EcoRI y
BamHI, se mezcló con el fragmento digerido y la mezcla se
ligó con ligasa de ADN T4 de acuerdo con los procedimientos
convencionales. El ADN ligado se transformó dentro de la cepa TG1 de
E. coli. Un transformante se aisló con un plásmido que
codificaba una proteína de fusión compuesta de tiotransferasa de
glutatión y proteína de unión a fibrinógeno. La proteína se purificó
con el vector plasmídico de acuerdo con las instrucciones de
Pharmacia. La proteína GST-FIG purificada se sometió
a transferencia Western de afinidad. Se migró en electroforesis en
gel de poliacrilamida, se transfirió en papel de nitrocelulosa
mediante difusión pasiva, el papel se trató con fibrinógeno (5
\mug/ml) durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido por
anticuerpos de ratón anti-fribrinógeno conjugados a
HRP. Se observó una banda correspondiente a un peso molecular de
aproximadamente 100 kDa. La omisión de fibrinógeno en un experimento
control no exhibió banda.
Los micropocillos de titulación se recubrieron
con fibrinógeno humano (Sigma Chemicals Co.) a una concentración que
variaba desde 2,5 hasta 20 \mug/ml, a temperatura ambiente durante
toda la noche. Las placas se recubrieron después con un 2% de
albúmina sérica bovina (BSA) durante una hora a 37ºC. Las
microplacas de titulación se lavaron tres veces y se añadió
GST-FIG a los pocillos a las concentraciones de 25,
50 o 100 \mug/ml (indicado por tres líneas separadas en la Fig. 8)
y las placas se incubaron durante dos horas a 37ºC. La captura de
GST-FIG a la capa de fibrinógeno se detectó, tras el
lavado, mediante anticuerpos (diluidos 1.000 veces) producidos en
una rata frente a His-FIG. La unión de los
anticuerpos se detectó, tras lavado, con anticuerpos
anti-IgG de rata obtenidos en conejo conjugados con
HRP. El sustrato para HRP fueron tabletas de OPD (Dakopatts) con
H_{2}O_{2}. La reacción de color se midió a 495 nm. La Fig. 8
muestra que el fibrinógeno captura GST-FIG de forma
dosis dependiente.
Se empleó fibrinógeno a 2 \mug/ml para recubrir
los micropocillos de titulación durante toda la noche a temperatura
ambiente y se recubrieron después como anteriormente. Se añadió la
proteína de fusión GST-FIG, GST o FIG a las
concentraciones indicadas en la Fig. 9. Inmediatamente después se
añadieron bacterias marcadas radiactivamente y se incubaron a 37ºC
durante dos horas. En la Fig. 9 se muestra la disminución de la
unión bacteriana en función de la proteína de fusión
GST-FIG, GST o FIG. Los símbolos en la Fig. 9 son
los siguientes: cuadrados -inhibición por GST-FIG
(se muestran la media y DE de cinco experimentos independientes);
triángulos -inhibición por la proteína transportadora GST; círculos
-inhibición por FIG después de digestión con trombina. Sólo la
proteína de fusión y las moléculas de FIG pudieron inhibir la
unión.
El marcaje radioactivo de las bacterias se obtuvo
al cultivarlas en presencia de timidina tritiada (20 \muCi/ml,
actividad específica de 81 Ci/mmol) durante 5 horas en LB.
La escisión de GST-FIG se realizó
mediante la adición de trombina y la incubación a 37ºC durante 2
horas.
Se empleó fibrinógeno a 2 \mug/ml para recubrir
los micropocillos de titulación toda la noche a temperatura ambiente
y se recubrieron después como anteriormente. S. epidermidis
marcadas radiactivamente se incubaron con diluciones diferentes de
sueros durante 1 hora a 37ºC. Las mezclas de
bacterias-sueros se añadieron entonces a los
pocillos y se permitió que la adherencia tuviera lugar durante dos
horas a 37ºC. Las bacterias que no se adhirieron se quitaron lavando
y la cantidad de bacterias adheridas se determinó como en el Ejemplo
11 anterior. Se emplearon cuatro muestras de suero: 1) Suero de la
rata nº 1 antes de la inmunización. 2) Suero de la rata nº 2 antes
de la inmunización. 3) Suero de la rata nº 1 inmunizada con
GST-FIG. 4) Suero de la rata nº 2 inmunizada con FIG
generada mediante escisión con trombina. A partir de la Figura 10
puede observarse que la adherencia se reduce después de la
incubación con sueros contra FIG o contra la proteína de fusión
GST-FIG. Una adherencia relativa de 1,0 indica la
adherencia obtenida tras incubar las bacterias marcadas
radiactivamente con disolución salina de tampón fosfato.
El experimento se repitió y los datos del bloqueo
de la adherencia, empleando los sueros tomados antes de la
inmunización y el suero tomado tras inmunización con
GST-FIG se muestran en la Figura 11.
Aunque el invento se ha descrito con respecto a
sus realizaciones preferidas, que constituyen el mejor modo
conocido en el momento presente para los inventores, debería
entenderse que varios cambios y modificaciones como serían obvios
para cualquier especialista en esta técnica pueden hacerse sin
desviarse del alcance del invento que se expone en las
reivindicaciones adjuntas a la presente memoria.
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Lista de secuencias
(continuación)
\newpage
Lista de secuencias
(continuación)
Lista de secuencias. Una secuencia parcial de
nucleótidos del gen fig putativo de la cepa HB de S.
epidermidis y la secuencia de aminoácidos deducida. Se indican
las secuencias del vector en la conexión de los extremos 5' y
3'.
<110> Guss, Bengt
\hskip1cm Nilsson, Martin
\hskip1cm Frykberg, Lars
\hskip1cm Flock, Jan-Ingmar
\hskip1cm Lindberg, Martin
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva proteína de unión a fibrinógeno
originada a partir de Staphylococcus coagulasa negativo
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<130> 103340500
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<141>
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<160> 15
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<170> PatentIn, versión 2.0
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacaaccat ctcacacaac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcatcaaattg atatttccca tc
\hfill22
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<210> 3
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<211> 18
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus epidermidis
\newpage
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<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgantcngant cnganagn
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtcaagga caaggtgac
\hfill19
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<210> 5
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgatgaaaa tggaaagtat c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccgttatct atactaaagt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgatcatg atgactttag t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggatccaa tcagtcaata aacaccgacg at
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaattctg ttcggactga tttggaagtt cc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1781
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus epidermidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3) .. (1781)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 593
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus epidermidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1744
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus epidermidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 581
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus epidermidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus epidermidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33) .. (3308)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1092
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus epidermidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (16)
1. La proteína o el polipéptido que tiene
actividad de unión a fibrinógeno, caracterizado porque dicha
proteína o polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que se
incluye en la siguiente secuencia de aminoácidos
(Fig. 6):
(Fig. 6):
2. La proteína o el polipéptido que tiene
actividad de unión a fibrinógeno de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque dicha proteína o polipéptido
comprende una secuencia de aminoácidos que se incluye en la
siguiente secuencia de aminoácidos (Fig. 6):
3. La proteína o el polipéptido que tiene
actividad de unión a fibrinógeno de acuerdo con la reivindicación
2, caracterizado porque dicha proteína o polipéptido
comprende una secuencia de aminoácidos que se incluye en la
siguiente secuencia de aminoácidos (Fig. 6):
\vskip1.000000\baselineskip
4. La proteína o el polipéptido que tiene
actividad de unión a fibrinógeno de acuerdo con la reivindicación
3, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de dicha
proteína o polipéptido es la siguiente secuencia de aminoácidos
(Fig. 6):
5. La molécula de ADN aislada o recombinante que
tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína o
polipéptido que tiene actividad de unión a fibrinógeno de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
\vskip1.000000\baselineskip
6. La molécula de ADN recombinante de acuerdo con
la reivindicación 5, caracterizada porque dicha molécula de
ADN codifica para una proteína o polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1 y tiene la siguiente secuencia de nucleótidos (Fig.
6):
7. El plásmido, fago o fagómido que contiene una
secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 5 ó
6.
8. El microorganismo que contiene al menos una
molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 5 ó
6.
9. El microorganismo que contiene al menos un
plásmido, fago o fagómido de acuerdo con la reivindicación 7.
10. El método para producir una proteína o un
polipéptido de unión a fibrinógeno definida en una cualquiera de
las reivindicaciones 1-4, caracterizada
porque
- -
- al menos una molécula de ADN recombinante, de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, se introduce en un microorganismo.
- -
- dicho microorganismo se cultiva en un medio adecuado.
- -
- la proteína así formada se aisla mediante purificación cromatográfica.
11. El método para producir una proteína de unión
a fibrinógeno o polipéptido de la misma, caracterizada
porque
- -
- al menos una molécula de ADN recombinante, de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, se expresa para producir una proteína en una partícula de fago de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
- -
- dicha partícula de fago muestra actividad de unión a fibrinógeno.
12. El empleo de una proteína o polipéptido que
tiene actividad de unión a fibrinógeno, de acuerdo con la
reivindicación 1, para la producción de un medicamento para bloquear
la adherencia de los estafilococos a las superficies.
13. Los anticuerpos producidos contra una
proteína o polipéptido que tiene actividad de unión a fibrinógeno
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1-4.
14. El empleo de anticuerpos de acuerdo con la
reivindicación 13 para la producción de un medicamento con
propósitos terapéuticos y profilácticos.
15. La composición de la vacuna que incluye una
proteína o polipéptido que tiene una actividad de unión a
fibrinógeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1-4.
16. La composición de la vacuna que incluye una
secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6.
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2004
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