JP2001503609A

JP2001503609A - コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に由来する、新規フィブリノーゲン結合たん白質

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Publication number: JP2001503609A
Application number: JP50281998A
Authority: JP
Inventors: グス・ベンクト; ニルソン・マルティン; フリクベルク・ラルス; フロック・ヤン―イングマール; リンドベルク・マルティン
Original assignee: グス・ベンクト; ニルソン・マルティン; フリクベルク・ラルス; フロック・ヤン―イングマール; リンドベルク・マルティン
Priority date: 1996-06-20
Filing date: 1997-06-18
Publication date: 2001-03-21
Anticipated expiration: 2017-06-18
Also published as: JP4173549B2; ATE316979T1; DE69735207T2; US6733758B1; EP0922056A1; ES2258280T3; WO1997048727A1; DE69735207D1; EP0922056B1; US20040209326A1; US7160990B2; CA2294433A1; SE9602496D0; AU3282597A

Abstract

(57)【要約】コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に由来する新規フィブリノーゲン結合たん白質、フィブリノーゲン結合活性を有するたん白質又はポリペプチドをバイオテクノロジーによる製造方法及びこのたん白質（又はそのフラグメント）をコードする組換えＤＮＡ分子、及びこのＤＮＡ組換えＤＮＡ分子を含有する（ウィルスを含めて）微生物。更に、本発明は、このたん白質及び（又は）ＤＮＡの治療に及び診断に使用、たとえばコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の存在及び（又は）種類を決定する診断キット及びこのたん白質又はＤＮＡを含有するワクチン製剤から成る。

Description

【発明の詳細な説明】コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に由来する、新規フィブリノーゲン結合たん白質本発明は、遺伝子工学の分野に関し、フィブリノーゲン結合活性を有するたん白質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する、組換えＤＮＡ分子に関する。更に、本発明は、上記分子を含有する微生物（ウィルスを含めて）、及び上記たん白質又はポリペプチドの産生にこれを使用する方法及びこれをバイオテクノロジーに使用する方法から成る。また、本発明は、上記の新規たん白質、たとえば能動及び（又は）受動免疫用製剤を診断及び治療に使用する方法から成る。発明の背景この１０年間、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）に多大な注目が集っている。ヒト用及び獣医用薬の発展と共に、感受性宿主の数が増加している。ＣＮＳの抗生物質耐性株の頻度の増加と共に、高度の外科手術、バイオ材料、細胞分裂抑制剤及び抗生物質及び他の薬物を用いる薬物治療は、宿主の感受性を増加させる。ＣＮＳの動物の病気治療の重要性に関して、この菌はたとえばウシ乳腺で不顕性炎症も、治療炎症も引き起こすことが知られている。フィブリノーゲンに特異的に結合する細菌の存在は、長い間知られている。宿主とスタフィロコッカスアウレウスの間の相互プロセスでのフィブリノーゲン結合の役割は、まだ明らかではないが、フィブリノーゲン結合はたとえば心内膜炎でこの種のある潜在的なビルレンスファクターとしてみなされている(Moreillon等、1995)。そこにはフィブリノーゲン結合性質を有するたん白質が、ＣＮＳに由来するとは記載されていない。しかし本発明では、遺伝子クローニングを用いてこの様なたん白質のキャラクタリゼーション及び単離を示す。更に、本発明は、ＣＮＳの細胞上でフィブリノーゲン結合性をバイオテクノロジーに使用する方法に関する。一般に、この様な結合たん白質がブドウ球菌細胞から直接調製される場合、均質なかつ再産生可能な生成物を得るのは困難である。更に、ブドウ球菌は病原性であり、複合培養培地を必要とし、これは大規模培養で合併症を伴う。従ってフィブリノーゲン結合たん白質（又はそのフラグメント）を産生する新規方法が必要である。発明の要旨本発明は請求の範囲によればＦＩＧと呼ばれる新規フィブリノーゲン、このたん白質をコードするＤＮＡ分子及びこれを使用するための投与法に関する。重要なことは、本発明がコアグラーゼ陰性細菌によって引き起される感染の診断、種類決定、治療及び予防の方法及び手段を提供することで、長い間望まれていた必要性を満足させる。図面の簡単な説明本発明を、次に後述の例及び図によって詳述する。図１は、Ｓ．エピデルミディス株２，１９及びＪＷ２７に対してフィブリノーゲンコーディング濃度の関数として付着値を示す（例１Ａ）。図２は、フィブリノーゲンに対する抗体と比べて、フィブリノーゲンに対する抗体の阻害率を示す（例１Ｂ）。図３は、競合するフィブリノーゲン濃度の関数として阻害率を示す（例１Ｃ）図４は、フィブリノーゲンへの付着に対するプロテアーゼ敏感性を示す（例１Ｄ）。図５は、ＬｉＣｌ抽出物による付着阻害を示す（例１Ｅ）。図６は、Ｓ．エピデルミディス株からのｆｉｇ遺伝子の完全ヌクレオチド配列及びコードされたたん白質の推定されるアミノ酸配列を示す。推定上のリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）に下線を引き、可能性のある転写終結ヘアピンループに二重の下線を引いた。推定上のシグナル配列（Ｓ）を矢印で、翻訳停止コドンを星印で示す。フィブリノーゲン結合活性が宿す非反復Ｎ-末端域の開始（Ａ）を矢印で示す。Ｒは高度に反復する域を示す。細胞壁固着に関係するモチーフＬＰＸＴＧをボールド体で示し、膜-スパンニング(spanning)域にＭを印す（例３）。図７は、Ｓ．エピデルミディスのフィブリノーゲン結合たん白質とＳ．アウレウスのクラッピング因子（ＣｌｆＡ）を比べる図を示す。たん白質の対応する領域の類似性（％）を２つのたん白質バーの間に数字で示す。Ｓはシグナル配列、Ａはフィブリノーゲン結合活性を宿す非-反復域、Ｒはジアミノ酸残部のくり返し域であり、Ｗは細胞壁固着に関係すると思われる域、及びＭはトランスメンブランドメインである。示された数は、図６に及び文献(McDevitt等1944)に示されているようなそれぞれのたん白質中のアミノ酸位置を示す（例３）。図８は、ＧＳＴ−ＦＩＧ融合たん白質が、販用量依存法でどのようにフィブリノーゲンに捕集されるかを示す（例１０）。図９は、ＧＳＴ−ＦＩＧ融合たん白質、ＧＳＴ又はＦＩＧの関数として細菌性結合の減少を示す（例１１）。図１０は、２つの前免疫血清及びＧＳＴ-ＦＩＧ及びＦＩＧ夫々に対する血清に対する血清希釈の関数として相対付着を示す（例１２）。図１１は、一方で前免疫血清及び他方でＧＳＴ-ＦＩＧに対する血清に対する血清希釈の関数として相対細菌性付着を示す（例１２）。発明の説明本発明は、ヌクレオチド配列を有する組換えＤＮＡ分子に関し、この配列はフィブリノーゲン結合活性を有するたん白質又はポリペプチドをコードする。このヌクレオチド配列の天然の源は勿論Ｓ．エピデルミディス株ＨＢであるが、ここに存在するヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列の知見によれば遺伝子又は遺伝子の部分を単離又は合成によって調製することができる。特にフィブリノーゲン結合活性に関与するたん白質の部分に関して推定されたアミノ酸配列の知見を、フィブリノーゲン結合を保持又は阻害する合成ポリペプチドの産生に使用することができる。このポリペプチドを種々の化合物、たとえば酵素、蛍光、ビオチン（又はその誘導体）、放射能、等で標識し、たとえば診断テスト、たとえばＥＬＩＳＡ-又はＲＩＡ-法中に使用することができる。本発明の組換えＤＮＡ分子の産生に対して、適当なクローニング伝播体又はベクター、たとえばファジミド、プラスミド又はファージＤＮＡは、制限酵素によって切断されていてよく、そこで所望のたん白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は切断部位に挿入され、組換えＤＮＡ分子を生じる。この通常の操作は、当業者によく知られており、ＤＮＡ配列の切断及び連結の種々の方法が文献中に記載されている（たとえば米国特許第4,237,224号明細書、Ausubel等1991， Sambrook等1989）。にもかかわらず、本発明者の知見によれば、これらの方法は本発明の目的に使用されないＳ．エピデルミディス株ＨＢを所望のヌクレオチド配列の源として使用する場合、たとえば下記例に記載する方法でこの配列を単離し、適当なベクターにこれを導くことはできる。あるいはヌクレオチド配列がここに存在する場合、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)-法を使用し、完全なｆｉｇ遺伝子又はこのフラグメントを得ることができる。使用される宿主は、微生物（これはたん白質又はその活性フラグメントを産生するためにつくられている）であり、細菌宿主、たとえば大腸菌、枯草菌、ブドウ球菌、乳酸菌、更にイースト及び他の真核細胞を培養株として有する。最大の発現を得るために、通常の要件、たとえばプロモーター及びリボソーム結合配列を、それ自体公知の方法で変化させてよい。たん白質又はその活性ペプチドを、細胞内又は細胞外に産生することができる。種々の細菌系で良好な分泌作用を得るために、異なるシグナルペプチドを使用することができる。精製及び（又は）検出を容易にするために、たん白質又はそのフラグメントを、親和性ハンドル及び（又は）酵素に融合させることができる。これは遺伝子レベルでも、たん白質レベルでも行うこきができる。たん白質又はそのポリペプチドの特徴を変更するために、遺伝子又は遺伝子の一部を、たとえば試験管内で突然変異誘発を用いて変更するか又は新しい特徴を有する融合たん白質中に生じるポリペプチドをコードする他のヌクレオチド配列の融合によって変更することができる。従って、本発明は、フィブリノーゲン-結合性質を有するたん白質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する組換えＤＮＡ分子から成る。更に、本発明は、ベクター、たとえばこの様なヌクレオチド配列を有するプラスミド及びファージ、及び生物体、特に細菌、たとえば大腸菌、枯草菌及びブドウ球菌 ―これ中にこの様なベクターが導入される―から成る。あるいはヌクレオチド配列を、微生物の天然ゲノム中に組込んでよい。更に本発明は、たん白質ＦＩＧ又はその活性フラグメントのフィブリノーゲン結合活性を有するたん白質又はポリペプチドの産生方法に関する。この方法によれば、上記微生物を適当な培地中で培養し、次いで生じた生成物をいくつかの分離法で、たとえばイオン交換クロマトグラフィー又は不活性キャリヤーに結合するフィブリノーゲンによるアフィニティークロマトグラフィーによって単離する。たん白質ＦＧをコードするヌクレオチド配列又はその一部を含有するベクター、特にプラスミドは、他の生成物をコードするヌクレオチド配列がいわゆる融合たん白質を発現するために、たん白質ＦＧをコードするヌクレオチド配列に融合されることによって容易に切断できる制限部位を有利に提供される。融合たん白質を、フィブリノーゲンへのその結合能力を利用する処理によって単離し、次いで所望ならばこの系の他の成分を融合たん白質から分離してよい。この方法は、たん白質Ａシステムに関してＷＯ84/03103中に詳細に開示され、同様な方法で本発明の内容にも適用できる。融合法を使用して、他のフィブリノーゲン結合分子の融合によってたん白質ＦＩＧ（又はその一部）のフィブリノーゲン結合活性を修飾、増加又は変更してもよい。本発明は、ＣＮＳ感染に対する予防接種用免疫原として細菌細胞表面成分の使用に関係するバイオテクノロジーの分野にも適用される。細菌全体を用いる免疫は、生じた抗原決定因子に対する抗体の低いレベルで、高度に多クローン性の免疫応答を常に誘発する。それ故に免疫治療に本発明のたん白質、ポリペプチド又はＤＮＡを使用するのが好ましい。特に免疫治療はいわゆる受動及び能動免疫として行われる。本発明のたん白質又はＤＮＡを用いる受動免疫は、上記たん白質又は適当な宿主動物、好ましくは哺乳類、たとえば健康血液ドナー又はウシに投与されたＤＮＡによってコードされたたん白質に対する抗体をもたらし、集め、次いでこの抗体を患者に投与することを含む。１つの好ましい実施態様は、外科手術、たとえば体内での異種インプラントを伴う手術前の患者の受動免疫である。本発明のたん白質又はＤＮＡを用いる能動免疫は、このたん白質又はＤＮＡを、好ましくは薬学的に適当な免疫刺激剤と組合せて患者に投与することを含む。この様な剤の例は次のものが挙げられるが、これらに限定されない：コレラトキシン及び（又は）その誘導体、熱に不安定なトキシン、たとえば大腸菌トキシン及び類似の剤。本発明の調製物は、更に免疫治療で当業者によく知られた、通常の薬学的に容認されたアジュバントを含む。好ましくは本発明のＤＮＡ又はその画分を用いる免疫治療で、このＤＮＡは筋肉内に投与されるのが好ましい。それによってこのＤＮＡは適当なプラスミドキャリヤーに導入される。適当な免疫刺激剤をコード化する他の遺伝子１種又はそれ以上は、同一のプラスミドに導入されるのが好ましい。この免疫治療は上記投与方法に制限されないが、勿論次の投与方法のどれかに適合させることができる：経口、鼻内、皮下及び筋肉内。特に経口及び鼻内投与法が特に大規模免疫にとって潜在的に極めて有望である。例出発物質菌株、ファージ及びクローニングベクタースタフィロコッカスエピデルミディス株ＨＢをDr Asa Ljugh，Lund，スウェーデンから得る。大腸菌株ＴＧ１及び株ＭＣ1061を、ライブラリーの構成用及びファージストックの産生用細菌宿主として使用する。大腸菌ファージＲ408（Promega，Madisin ，WI，米国）をヘルパーファージとして使用する。使用されるファジミドベクターpG8H6は、Jacobsson及びFrykberg(1966)中に記載されている。例中で使用されるすべての菌株及びプラスミド-又はファジミド-コンストラクト(Construct)は、Swedish University of Agriculfural Scieme，ウプサラ、スウェーデンの微生物学部で入手することができる。緩衝液及び培地大腸菌をＬＢ(Luria Berfaniブロス)寒天プレート上で又はＬＢブロス（Sambr ook等，1989）中で３７℃で増殖する。適当な場合、ＬＢ培地をグルコースで最終濃度２％に補強する。ブドウ球菌を、血液寒天培地（５％最終濃度のウシ血液を含有）上で又はトリプトン大豆ブロス(Oxoid，Ltd Basingstoke,Hants.，イギリスから得られたＴＳＢ)ＰＢＳ，0.05Ｍリン酸ナトリウムｐＨ7.1，0.9％ＮａＣｌ中で増殖する。ＰＢＳ-Ｔ：トウィーン２０で最終濃度0.05％に補強されたＰＢＳ．ブドウ球菌及びレンサ球菌からＤＮＡの調製Ｓ．エピデルミディス又はＳ．アウレウスの菌株を一晩ＴＳＢ中で増殖する。翌日の朝に、細胞を集め、染色体ＤＮＡ Loefdahl等(1983)に従って調製する。ブドウ球菌からの染色体ＤＮＡは、ＷＯ95/07300中に以前に記載されている。たん白質及び他の試剤ヒトフィブリノーゲンは（IMCO Ltd，ストックホルム、スウェーデン）から得られる。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、フィブロネクチン、ＩｇＡ、ラクトフエリン及びトランスフェリンは（Sigma,セイトルイス米国）から得られる。ウシ血清アルブミン（フラクションV，riaグレード）は、ＵＳＢ(Cat．no．10868)から得られる。α₂マクログロブリン（α₂Ｍ）及びコラーゲンタイプＩは（ベーリンガー、マンハイム、ドイツ）から得られる。ヴィトロネクチンはBionol，Tart u,エストニアから、ヒトＩｇＧはKabi,ストックホルム，スウェーデンから得られる。エラスチンはＩＣＮ Pharmaceuticals Inc．CA，米国から、ペプシンKEBO LAB，ストックホルム、スウェーデンから得られる。ＤＮＡプローブをランダムプライミング法によってα³²P-ATPで標識する（マルチプライムＤＮＡ標識システム；Amersham Inc．Amersham，イギリス）。ニトロセルロース（ＮＣ）フィルター(Schleicher & Schull，Dassel，ドイツ）を使用してハイブリダゼイション実験でＤＮＡを又はウェスタンブロット法でたん白質を結合する。本来の又はドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-P AGE）によってたん白質サンプルを分析するために、Pharmacia LKB Biotechnolo gy,ウプサラ、スウェーデンから得られたPHAST-系を、供給者の推薦に従って使用する。使用されるオリゴヌクレオチドをPharmacia（ウプサラ、スウェーデン）によって合成する。 Micro Wellプレート（Maxisorp，Nunc．コペンハーゲン、デンマーク）を、より分け(panning)実験中に使用する。プラスミドＤＮＡをWizard Minipreps（Pro mega）を用いて調製し、挿入配列をJacobsson及びFrykberg(1995)によって記載されている様に決定する。得られた配列をＰＣ-遺伝子プログラム（Intelligene tics，Mountain View，CA，USA）を用いて分析する。通常の方法分子生物学で通常使用される方法には、たとえばエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの制限、ＤＮＡフラグメントの連結、プラスミド精製が記載されない。というのはこれらの方法が普通に使用されるマニュアル(Sambrook等,1989，Ausubel 等，1991)中に見い出されるからである。連結反応はReady-To-Go T4 ＤＮＡリガーゼ(Pharmacia，ウプサラ、スウェーデン）を用いて行われる。ポリメラーゼ連鎖反応増幅に対して、Perkin Elmer Cetusから得られる遺伝子Amp^TMキットを使用する。配列反応を“配列、ヴァージョン2.0”キット(United States Biochemi cal Corporation，クリーブランド、オハイオ、米国）を用いて行う。あるいはA BI PRISM Dyeターミネーターサイクルシークエンスレディー反応キットを使用し、サンプルをApplied Biosystems 373A DNA Sequencerを用いて分析する。例１：固定化フィブリノーゲンへのスコフィロコッカスエピデルミディスの付着及び結合メカニズム（Ａ−Ｅ）の性質を調査腹膜炎の患者から単離されたスタフィロコッカスエピデルミディス菌株を、血液寒天プレート上で３７℃で一晩増殖する。１枚のプレートから得られた細菌をリン酸塩緩衝された塩類液（ＰＢＳ）５ｍｌで集め、１回洗滌し、光学密度（ＯＤ）を１．０に調整する。（Ａ）細菌付着フィブリノーゲンをＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、段階３-倍希釈でマイクロタイターウエル(Nunc)に先端から底部へ加える。プレートを室温（ＲＴ）で一晩インキュベートする。被覆されていないプラスチック部位をおおうために、プレートを１時間３７℃で２％ウシ血清アルブミンで被覆する。プレートをＰＢＳで0.05％トウィーン２０（ＰＢＳＴ）と共に洗滌する。次いで細菌をＰＢＳＴ中で段階２-倍希釈で左から右へフィブリノーゲン被覆されたマイクロタイタープレートに加える。細菌付着を２時間３７℃で又は４℃で一晩行う。非付着細菌を洗滌し、結合された細菌を空気乾燥する。フィブリノーゲン及び細菌ともに斜めの希釈は、フィブリノーゲン濃度の作用として細菌結合ブロスを及び細菌の量を見積もらせる。細菌付着の決定をＡ４０５でマイクロタイタープレート読取機を用いて光学的に読み取る。結合した細菌によって引き起こされる濁ったかつ軽い分散が0.00〜0.20にわたって読み取れる。フィブリノーゲン被覆濃度の作用としての付着値の例を、３つの異なる菌株（２．１０及びＪＷ２７）に対して図１中に示す。付着測定に関するこれらの条件を、次の実験中に使用する。（Ｂ）フィブリノーゲンに対する抗体による付着妨害上述の行われた実験を変えて、フィブリノーゲンに対する抗体(antiFg)(Sigma )を、細菌（ＯＤ＝１．０）の添加１時間前に固定されたフィブリノーゲンに加える。コントロールとして、フィブリノーゲンに対する抗体(anti Fn)(Sigma)を、別個の実験で加える。図２に、フィブリノーゲンに対する抗体（まる）がフィブロネクチンに対する抗体（四角）よりも良好に付着を阻害することを示す。３つの別々の実験からの平均値及び標準誤差を示す。（Ｃ）可溶性フィブリノーゲンによる付着妨害上述の様にフィブリノーゲンで被覆されたプレートに添加する前に可溶性フィブリノーゲンを図３中に示された濃度で細菌に加え、１時間３７℃でインキュベートする。Ｓ．エピデルミディス株１９（黒まる）の付着を約３０％で阻害する。コントロールとして、スタフィロコッカスアウレウス株Newmanの阻害を、類似の実験機構で測定する（白まる）。３つの別々の実験から平均値及び標準誤差を示す。Ｓ．エピデルミディスの付着の著しい阻害が得られるが、Ｓ．アウレウスの阻害はもっと顕著である。（Ｄ）細菌のプロテアーゼ処理後、結合の減少細菌を、固定化フィブリノーゲンに添加する前に図４中に示した濃度でプロテアーゼＫで３７℃で３０分間処理する。プロテアーゼ処理された細菌を、固定化フィブリノーゲンのプロテアーゼ消化を避けるプロテアーゼ処理の後に広範囲に洗滌する。Ｓ．エピデルミディス（２，１９，２６９及びＨＢ）の４つの異なる菌株及びＳ．アウレウス（菌株Newman)を、この実験で使用する。テストされたすべての菌株は、プロテアーゼ処理に敏感性を示す。したがってフィブリノーゲンへの付着は、表面たん白質に依存する。（Ｅ）Ｓ．エピデルミディスのＬｉＣｌ抽出物による付着妨害上述の様に増殖し、集められたＳ．エピデルミディス細胞を、４０℃で２時間１ＭＬｉＣｌで２時間、連続的に穏やかに攪拌しながら処理する。細菌を遠心分離し、細菌不含上澄液を濾過し、ＰＢＳに対して透析する。疎水性相互作用によって細胞に結合された、表面に結合したたん白質は、それによって遊離される。推定上フィブリノーゲン含有たん白質を含有するこのＬｉＣｌ抽出物を使用して、固定化フィブリノーゲンへのＳ．エピデルミディスの付着を次の方法で阻害する。種々の希釈でのＬｉＣｌ抽出物を、固定化フィブリノーゲンに加え、１時間３７℃でインキュベートする。プレートを洗滌し、細菌を付着テストのために加える。図４は、ＬｉＣｌ抽出物が希釈されればされる程、付着は良好であることを示す。すなわち付着-阻害化合物は、ＬｉＣｌ抽出物中に存在する。２つの独立した実験を示す。例２：フィブリノーゲン結合活性を発現するクローンの単離Ｓ．エピデルミディス株ＨＢの遺伝子ライブラリーを、Jacobsson及びFrykber g(1996)によって記載された方法で産生する。ブドウ球菌ＤＮＡを音波処理によってでたらめに砕く。ライブラリーは４×１０⁷独立クローン中に生じる。これは増幅後２×１０¹⁰cfu/mlの力価を有する。ライブラリーの２００マイクロタイターを３つのフィブリノーゲン被覆されたウエル(Well)の夫々に加え、４時間室温（ＲＴ）でインキュベートする。ウエルを広範囲にＰＢＳＴで洗滌し、１回５０ｍＭクエン酸ナトリウム／１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．４で洗滌する。最後に、結合されたファージを減少するｐＨ（３．４及び１．８）で同一緩衝液中で徐々に溶離する。３つのウエルから得られた溶離液を２Ｍトリス-ＨＣｌ、ｐＨ８．６で中和する。溶離液の分割量を使用して、大腸菌ＴＧ１細胞を感染する。その後これをグルコース及びアンピシリンを含有するＬＡプレート上で一晩増殖する。クローン（ファージでＴＧ１細胞を感染した後得られ、一次より分けでｐＨ３．４及び１．８で溶離される）をＬＢ培地中に再懸濁して集め、ヘルパーファージＲ４０８〔１０¹⁰プラーク-形成単位(pfu)〕で濃厚なファージストックの産生のために感染させる。その後、感染した細菌を０．５％軟寒天４ｍｌと混合し、アンピシリンと共に１つのＬＡプレート上に注ぐ。３７℃で一晩インキュベートした後、ファージをJacobsson及びFrykberg(1996)によって記載されている様に集める。得られたファージストックを上述の様にフィブリノーゲンに対して再びより分けする。表１に示される結果は、フィブリノーゲンに親和性を有するクローンの増加があることを示す。例３：ＤＮＡ配列及び配列分析例２に記載されたフィブリノーゲンに対する第二より分け（ｐＨ３．４）から生じた８つのクローンを、他の研究のために選ぶ。これらのクローンからのファジミドＤＮＡを調製し、部分的に配列する。クローンの７つは同一挿入断片を含有するように思われる。ｐＳＥ１００と呼ばれるこの７つのクローンのうちの１つは、他の研究に選ばれる。クローンｐＳＥ１００からの精製されたファジミドＤＮＡを制限マッピングによって分析する。このマッピングはこのファジミドが〜１．８キロ塩基対（ｋｂ）の挿入断片を含有することを示す。ｐＳＥ１００の完全挿入断片のヌクレオチド（ｎｔ）配列を決定し、ｎｔ及び推定されるアミノ酸（ａａ）配列をＰＣ-遺伝子プログラムを用いて分析する。この分析は、ｐＳＥ１００の挿入断片が１．７４５ｎｔ（配列リスト）の開放型読み枠を含有することを示す。したがって挿入断片は計算上の分子量〜６５ＫＤａ（配列リスト）を有する５８１ａａたん白質―これはたん白質ＦＩＧと呼ばれる（及び対応する遺伝子はｆｉｇと呼ばれる）―をコードする。更に配列分析は、ｐＳＥ１００の挿入断片が５'-及び３'-末端にベクター配列を有する性格な読み枠中にあることを示す。これは、挿入断片がｐｅｌリーダー及びｍｙｃテイル（配列リスト）を有する融合を引き起こすこと及びｆｉｇ遺伝子の本来の５'-及び３'-末端がｐＳＥ１００クローン中に存在しないことを意味する。ｆｉｇ遺伝子の欠損５’及び３’末端を得るために、サザンブロット分析を、種々の制限酵素で消化した菌株ＨＢからの染色体ＤＮＡを用いて実施する。プローブを次の様に調製する；２つのオリゴヌクレオチド（5'CAACAACCATCTCACACAAC3’及び５'CATCAAATTGATATTTCCCATC3）をＰＣＲに使用し、ｐＳＥ１００の挿入断片からの〜１．３ｋｂフラグメントを増幅する。ＰＣＲで発生したフラグメントを、無作為プライミングを用いて３２Ｐ-標識する。ストリンジエント(stringent)条件によるハイブリット形成の後、ＮＣ-フィルターを洗滌し、オートラジオグラフィーに付す。この結果は、ＸｂａＩ開裂が〜６ｋｂの大きさでシングルバンドを生じることを示す。次いで対応するフラグメントを、ｐＵＣ１８ベクターを消化したＸｂａＩに連結する。形質転換後、〜６ｋｂＸｂａＩフラグメントを宿すクローンを、サザンブロット実験中と同じプローブを用いてコロニーハイブリダゼーションによって同定する。ｐＳＥ１０１と呼ばれるこの様なクローン１つは、他の研究に選ばれる。ＤＮＡ配列分析は、ｆｉｇ遺伝子が開放読み枠ａ３２９１ｎｔから成り、これは計算上の分子量〜１９０ｋｂａを有する１０９７ａａのＦＩＧと呼ばれるたん白質をコードする（図６）。ＦＩＧたん白質は、たん白質を結合するグラム陽性細胞表面に見い出されるいくつかの典型的特徴、たとえばＮ-末端シグナル配列及びＣ-末端aa motif LPDTG、次いで荷電ａａのストレッチに終る１７疎水性ａａのストレッチから成る（図６）。シグナル配列の次に、７７３ａａＡと呼ばれる領域がある。ｐＳＥ１００の挿入断片は、Ａ領域の残基７５〜６５６に対応する配列を含有する。Ａ領域の後に前後にくり返されたアスパラギン酸とセリン残基から成る、高度にくり返しの領域２１６ａａ―これをＲと呼ぶ―が続く（図６及び７）。ジペプチド域は３６回くり返される１８ｂｐ配列ユニット（ＧＡＸＴＣＸＧＡＸＴＣＸＧＡＸＡＧＸの配列）から成る。１８ｂｐ配列は、切り詰められた第二ユニット以外のＲ全領域にわたってほとんど完全に維持される。この第二ユニットはほんの１２の１８ｂｐとその領域の３’末端から成り、そこで共通配列は僅かに中断する（ユニット３２，３４及び３６）。あとのユニット中の変化も、ＤＳくり返しを中断するアミノ酸交換を生じる。たん白質ＦＩＧの推定アミノ酸配列を用いて、たん白質データベースを配列類似性に関して選抜する。興味深いことに、この調査は、得られた最高のスコアがＳ．アウレウスのクランピングファクター（ＣｌｆＡ）に対してであることを示す（図７）。このたん白質はフィブリノーゲンを結合し、プラズマの存在下に細菌の凝集を促進することを示している。シグナル配列及び細胞膜スパンニングドメインをコードするＮ-及びＣ-末端部分での類似性の他に、クランピングファクターとのもっとも明白な類似性は、くり返しＲ領域である。ＣｌｆＡでも、ＦＩＧたん白質でも、ＤＳくり返し領域は同一の１８ｂｐ共通ユニットによってコードされる。ｆｉｇ及びＣｌｆＡのヌクレオチド配列を比べることは、Ｒ領域が広範な相同性を有することを示す。更に、たん白質ＦＩＧもＡ領域、非くり返しフィブリノーゲン結合ドメインでＣｌｆＡに相同性を示す。（図７）例４：ｐＳＥ１００からコードされたフィブリノーゲン結合たん白質の性質Ａ）フィブリノーゲン結合の特異性ファジミドｐＳＥ１００を、コンピテント大腸菌ＴＧ１細胞にエレクトロポラートする。ＬＡプレート（アンピシリン及びグルコースを含有）上で一晩増殖後、ｐＳＥ１００を有する１つのコロニーを一晩増殖させ、増加したファージストックの産生にヘルパーファージＲ４０８で感染する。ｐＳＥ１００の挿入断片を発現する組換えファージを有する得られたファージストックは、３×１０⁹cfu/m lの力価を有する。ｐＳＥ１００のファージストックを使用し、マイクロタイターウエル中で被覆された１３の異なるたん白質及び１つの被覆されていないウエルに対してより分ける。夫々のたん白質を含有する夫々のウエル（又は非被覆ウエル）に、ｐＳＥ１００のファージストック２００μｌを加える。３時間、ＲＴで穏やかな攪拌下でより分けた後、ウエルを広範囲にＰＢＳＴを用いて洗滌し、最後の洗滌のサンプルを集める。結合したファージを、クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ１．８で溶離する。溶離されたサンプルを直ちに１Ｍトリス-ＨＣｌｐＨ８．６を用いて中和する。溶離されたファージ及び洗滌からのファージに別々に大腸菌ＴＧ１細胞を感染させ、感染後、細胞をアンピシリン及びグルコースを含有するＬＡプレート上に塗布する。プレートを一晩３７℃でインキュベートし、コロニーの分布をカウントする。この実験の結果を表２中に示す。これは、ｐＳＥ１００によって発現されたたん白質のフィブリノーゲン結合特異性を示す。Ｂ）阻害実験ｐＳＥ１００ファージストックを、〜５×１０⁶cfu/mlの力価に希釈するこのファージ溶液のうちから、サンプル（１８０μｌ）を取り、次いでフィブリノーゲン被覆されたマイクロタイターウエルに移す前に１時間フィブリノーゲン、ＢＳＡ又はＩｇＧの種々の濃度で別々にインキュベートする。３時間ＲＴで穏やかな攪拌下でより分けた後、ウエルをＰＢＳＴで広範囲に洗滌する。結合したファージを、クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ１．８で溶離する。溶離されたサンプルを直ちに１Ｍトリス-ＨＣｌｐＨ８．６を用いて中和する。溶離されたファージに大腸菌ＴＧ１細胞を感染させ、感染後、細胞をアンピシリン及びグルコースを含有するＬＡプレート上に塗布する。プレートを一晩３７℃でインキュベートし、コロニーの分布をカウントする。この実験の結果を表３中に示す。これはフィブリノーゲンへの結合が他のテストされるたん白質を用いてなくてもフィブリノーゲンによって阻害されることを示す。例５：ウェスタンブロット実験ｐＳＥ１００を有する菌株ＴＧ１とＭＣ１０６１の大腸菌をＬＢ（アンピシリンとグルコース）中で一晩３７℃で増殖する。次の朝、細胞を遠心分離して集め、ＬＢ（アンピシリン、グルコース及び０．１ＭＩＰＴＧを含有）中に懸濁し、更に３７℃でインキュベーションする。１２時間後、細胞を遠心分離によって集め、細胞と上澄液共に使用する。アセトン４容量上澄液に加え、生じた沈澱を遠心分離によって集め、空気-乾燥し、氷冷されたＰＢＳ中に再懸濁する。電気泳動の前に、上澄液からの細胞と沈澱を、２．５％ＳＤＳ及び５％ベーターメルカプトエタノールを含有するサンプル緩衝液中に別々に再懸濁し、２分間煮沸する。変性後、サンプルをＳＤＳ-バッファーストリップを用いて８−２５％勾配ゲル上にＰＨＡＳＴ-システム(Pharmacia)によって還元条件下に流して分析する。電気泳動の終了後、ＰＢＳ中に前もって浸漬されたＮＣ-フィルターをゲル上にのせ、温度を４５℃に上げる。〜４５分後、ＮＣ-フィルターをＰＢＳ１mlで湿らせ、穏やかに移動させ、ＲＴで３０分間０．１％トウィーン２０溶液（ＰＢＳＴ０．１％）を含有するＰＢＳ１５ｍｌ中に置く（穏やかな攪拌下に、ＰＢＳＴ０．１％溶液の２回の交替の後、フィブリノーゲンを最終濃度２０ng/mlに加え、フィルターを４時間、ＲＴで穏やかな攪拌下にインキュベートする。フィルターを次いでＰＢＳＴ０．１％で３×１０分間洗滌し、ＨＲＰ-接合されたウサギ抗ヒトフィブリノーゲン抗体（ＤＡＫＯコードＡ０８０、ＰＢＳＴ０．１％中で１：５００に希釈された）を加え、フィルターを１時間ＲＴで穏やかな攪拌下にインキュベートする。ＰＢＳＴ０．１％で３×１０分間フィルターを洗滌後、結合したフィブリノーゲンを、ホースラディシュパーオキシターゼに対する基質を含有する溶液（４-クロロ-１-ナフトール６ｍｌ（メタノール中に３ｍｇ／ｍｌ）＋ＰＢＳ２５ｍｌ＋Ｈ₂Ｏ₂２０μｌ）にフィルターを移すことによって視覚化する。その結果は、フィブリノーゲン結合たん白質がｐＳＥ１００を宿す大腸菌細胞の双方にサンプルの２つのタイプ（細胞及び増殖培地）中に見い出され、一方この様なたん白質は大腸菌ＴＧ１及びＭＣ１０６１のコントロール培養液中に見い出されないことを示す。ｐＳＥ１００から発現されたフィブリノーゲン結合たん白質は、推定されるアミノ酸から発現されるたん白質にほぼ近い大きさである。例６：ｆｉｇ遺伝子の産生及び診断テストでＳ．エピデルミディスを同定するのにｆｉｇ遺伝子の使用Ｓ．アウレウス株８３２５−４、ストレプトコッカスエクイ亜種株１９６及び亜種ズウェピデミカス株Ｚ５、ストレプトコッカスピオゲネス株２−１０４７、ストレプトコッカスディスガラクティエ株８２１５からの精製された染色体ＤＮＡを、制限酵素EcoRIで開裂する。開裂されたサンプルを種々の制限酵素で開裂されたＳ．エピデルミディスからの染色体ＤＮＡと共に０．８％アガロース-ゲル上に流す。電気泳動が終了した後、分離されたＤＮＡフラグメントを、Pharma cia社製のVaccum blottingシステムを用いてＮＣ-フィルターに移す。移動後、フィルターを、ｐＳＥ１００の挿入断片のヌクレオチド配列を主体とする、調製されたプローブを用いてストリンジェント条件（６５℃で６×ＳＳＣ、５×Denh art,０．５％ＳＤＳを含有する溶液中で）したにハイブリット化する。このプローブを前もって次の様に調製する。２つのオリゴヌクレオチド：（5'-AGGTCAAGGACAAGGTGAC-3'及び5'-CAACAACCATCTCACACAAC-3’）を処方し（Ph armacia）、プライマー対としてＰＣＲに使用し（Perkin Elmer Cetus Thermal Cycler ４８０を用いて９４℃、１分、５０℃、３０秒、７２℃、１分の２５サイクル）、ｐＳＥ１００の挿入断片の〜１５０ｂｐフラグメントを増幅する。増幅された素材をアガロースゲル上に流し、〜１５０ｂｐフラグメントを精製し、³² Ｐ-ｄＡＴＰ及びMultiprime ＤＮＡ標識システム(Amersham)を用いて放射活性標識する。フィルターを一晩ハイブリット化し、次いで洗滌液（０．２％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中で６０℃で洗滌し、オートラジオグラフィーする。この結果は、ハイブリダゼーションがストレプトコッカス及びＳ．アウレウスに由来するサンプル中に検出されず、一方ハイブリダゼーションからＳ．エピデルミディス株ＨＢに由来するサンプルに生じることを示す。Ｓ．エピデルミディスの他の菌株中にｆｉｇ遺伝子の発生を調べるために、次のＰＣＲ反応を開始する。Ｓ．エピデルミディスの１３個の異なる臨床による単離物からの染色体ＤＮＡを鋳型として使用する。上述と同一プライマー及び同一ＰＣＲ条件を使用する。結果は、〜１５０ｂｐの増幅生成物がＳ．エピデルミディスのすべての菌株中に検出され（２％アガロースゲルを用いる）、Ｓ．アウレウス及びＳ．ピオゲネスからの染色体ＤＮＡを含有するコントロールサンプルオリジナル中では検出されないことを示す。例７：Ｓ．エピデルミディスの種々の単離物から対応ＤＳくり返し域を分析するためのＰＣＲ増幅 McDevitt及びFoster(Microbiology，1955，141:937-943)によれば、Ｓ．アウレウス株の種々の単離物中のＤＳくり返し域はかなり異なることが示される。Ｓ．エピデルミディス中のＤＳくり返し域が種々の単離物の間で大きさの点でも変化するかどうかを調べるために、次の実験を行う。たん白質ＦＩＧのＤＳくり返し領域の５’及び３’側で夫々ハイブリット化するプライマーの対(5'CCGATGAAA ATGGAAAGTATC3'及び5'TCCGTTATCTATACTAAAGTC3')を使用し、Ｓ．エピデルミディスの１１の異なる単離物中で対応領域をＰＣＲ増幅する。この増幅は次の様に行われる。１分間、９５℃で初期変性した後、サイクルが３０秒間、９５℃で変性段階で始まり、次いで５０℃で１分のアニーリング、７２℃で２分の延長を行う。このサイクルを２５回くり返し、７２℃で７分の最終延長で終る。夫々の株のＤＳ域を示すＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析する。その結果は、種々の長さの１バントが、各サンプル中にあることを示す。これらの結論は、このタイプの方法が特別の菌株の“指紋”を得るために、診断テストとして使用されうることである。これは、たとえば感染源をたどるのに有用である。例８：ゴアグラーゼ-陽性及び陰性-ブドウ球菌中での他の相同遺伝子を同定するために、株ＨＢのＤＳフラグメントの使用ＤＳくり返し域から成るＤＮＡフラグメントを次の様に調製する。オリゴヌクレオチドプライマー(5'ACTGATCATGATGACTTTAGT3'及び5'TCCGTTATCTATACTAAAGTC3 ')を使用して上述と同一条件下で株ＨＢのＤＳ域をＰＣＲ増幅する。この増幅は〜７００ｂｐフラグメントを生じ、これは無作為プライミングによって放射活性（³²Ｐ）で標識される。このプローブを、ブドウ球菌の種々の種（Ｓ．アウレウス、Ｓ．エピデルミディス株ＨＢ、Ｓ．ヘモリティカス株７８９及び株ＳＭ１３１、Ｓ．ラグダネシス、Ｓ．シェライフェリ、Ｓ．インターメディウス、Ｓ．レンタス(lentus)、Ｓ．シウリ、Ｓ．カルノーサス及びＳ．ヒイカス）からの染色体ＤＮＡ（EcoRIで開裂）によってサザンブロット分析に使用する。ハイブリダゼーションを６５℃で一晩ストリンジェント条件下に行う。翌日、フィルターを２×ＳＳＣを用いて６５℃で洗滌し、次いでオートラジオグラフィーする。その結果は、少なくとも１つの特異バンドが次の種にあることを示す：Ｓ．アウレウス、Ｓ．エピデルミディス株ＨＢ、Ｓ．ヘモリティカス株７８９及び株ＳＭ１３１、Ｓ．ラグダネシス、Ｓ．インターメディウス、Ｓ．シウリ、Ｓ．カルノーサス（弱いシグナル）及びＳ．ヒイカス。この結果は、これらの種で対応する域をクローン及び同定することができるこきを示す。例９：ＧＳＴ-ＦＩＧの産生ポリメラーゼ連鎖反応によって、ＤＮＡフラグメントを増幅してフィブリノーゲン結合たん白質の一部をコードする。上位プライマーはGCGGATCCAATCAGTCAATA AACACCGACGAT及び下位プライマーはCGGAATTCTGTTCGGACTGATTTGGAAGTTCC.である。増幅を９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分の３０サイクル行い、９４℃で４分間で開始し、７２℃で４分間で終了する。増幅されたフラグメントを、EcoRI及びＢ_amＨＩで消化する。プラスミドｐＧＸＴ-４Ｔ(Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン）をE_coRI及びＢ_amＨＩで消化し、消化フラグメントと混合し、標準処理に従って混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結する。連結されたＤＮＡを大腸菌株ＴＧ１中で形質転換する。形質転換体をグルタチオンチオトランスフェラーゼ及びフィブリノーゲン結合たん白質から成る融合たん白質をコードするプラスミドで単離する。たん白質をPharmaciaの指示に従ってベクタープラスミドで精製する。精製されたＧＳＴ-ＦＩＧたん白質をウェスタンアフィニティーブロットに付す。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、受動拡散によってニトロセルロースペーパーに移し、このペーパーを２時間室温でフィブリノーゲン（５μｇ／ｍｌ）で処理し、次いでウサギアンチフィブリノーゲン抗体をＨＲＰに接合する。約１００ｋＤａの分子量に相当するバンドが見られる。コントロール実験中のフィブリノーゲン欠落は、バンドを示さない。例１０：ＧＳＴ-ＦＩＧの定常期フィブリノーゲンへの結合の証明マイクロタイターウエルを、室温で一晩２．５〜２０μｇ／ｍｌの濃度でヒトフィブリノーゲン(Sigma Chemicals Co.)で被覆する。プレートを１時間３７℃ で２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で後被覆する。マイクロタイタープレートを３回洗滌し、ＧＳＴ-ＦＩＧを２５，５０又は１００μｇ／ｍｌの濃度で（図８中に３つの別々の線で示す）ウエルに加え、プレートを２時間３７℃でインキュベートする。洗滌後、ＧＳＴ-ＦＩＧのフィブリノーゲン層への捕獲を、Ｈｉｓ^-ＦＩＧに対する、ラット中で喚起された抗体（１００倍に希釈）によって検出する。洗滌後、抗体の結合を、ＨＲＰで接合されたウサギアンチラットＩｇＧ抗体で検出する。ＨＲＰに対する基室はＨ₂Ｏ₂を有するＯＰＤ錠(Dakopatts )である。呈色反応を４９５ｎｍで測定する。図８は、ＧＳＴ-ＦＩＧが、配量添加に依存してフィブリノーゲンに捕獲されるのを示す。例１１：ＦＩＧによるフィブリノーゲンへのＳ．エピデルミディス付着の阻害２μｇ／ｍｌのフィブリノーゲンを使用して、一晩室温でマイクロタイターウエルを被覆し、次いで上述の様に後被覆する。ＧＳＴ-ＦＩＧ融合たん白質、ＧＳＴ又はＦＩＧを図９に示す濃度で加える。放射活性に標識された細菌をその直後に加え、３７℃で２時間インキュベートする。ＧＳＴ-ＦＩＧ融合たん白質、ＧＳＴ又はＦＩＧの作用として細菌結合の減少を図９中に示す。図９の符号は次の通りである：四角-ＧＳＴ-ＦＩＧによる阻害（５つの独立した実験の平均及びＳＥを示す。）；三角-ＧＳＴキャリヤーたん白質による阻害；円形-トロンビン消化後ＦＩＧによる阻害。融合たん白質及びＦＩＧ分子だけが結合を阻害する。細菌の放射活性標識が、ＬＢ中で５時間トリチウム標識されたチミジン（２０ μＣｉ／ｍｌ、比活性８１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下にこれを増殖させて得られる。ＧＳＴ-ＦＩＧの開裂がトロンビンの添加、次いで２時間３７℃でインキュベートによって達成される。例１２：ＧＳＴ-ＦＩＧ及びＦＩＧに対する抗体によってフィブリノーゲンへのエピデルミディス付着の阻害２ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンを使用し、一晩室温でマイクロタイターウエルを被覆し、上述のように後被覆する。放射標識されたＳ．エピデルミディスを１時間３７℃で種々の血清希釈でインキュベートする。次いで細菌-血清混合物をウエルに加え、付着を２時間３７℃で行う。非付着細菌を洗い落し、付着細菌の量を例１１に示した様に測定する。４つの血清サンプルを使用する：１）ラットＮｏ．１から免疫前の血清。２）ラットＮｏ．２から免疫前の血清。３）ＧＳＴ-ＦＩＧで免疫されたラットＮｏ．１からの血清。４）トロンビン開裂によって生じたＦＩＧで免疫されたラットＮｏ．２からの血清。図１０から、ＦＩＧ又はＧＳＴ-ＦＩＧ融合たん白質に対する血清でインキュベーションした後付着が減少するのが分る。相対付着１．０で、リン酸塩緩衝された塩類液で放射標識された細菌のインキュベーション後に得られる付着を意味する。実験をくり返し、免疫前に採取された血清及びＧＳＴ-ＦＩＧで免疫後に採取された血清を用いる付着妨害のデータを図１１中に示す。本発明については、本発明者に現在知られている最善の方法を構成する好ましい実施態様に関して記載されているが、当業者にとって明らかである種々の変化及び変更は下記請求の範囲に記載された、発明の範囲から逸脱することなく行われてよい。引用された特許又は特許出願明細書:WO 95/07300，US 4,237,224，WO 84/03103

【手続補正書】特許法第１８４条の４第４項【提出日】平成９年１１月２０日（１９９７．１１．２０）【補正内容】請求の範囲８．請求の範囲２記載の組換えＤＮＡ分子に於て、そのＤＮＡ分子が次のヌクレオチド配列：又はその相同体１種又はそれ以上を含有することを特徴とする、上記分子。９．請求の範囲２記載の組換えＤＮＡ分子に於て、そのＤＮＡ分子は次のアミノ酸配列：１種又はそれ以上をコードすることを特徴とする上記分子。 10．請求の範囲８記載のヌクレオチド配列１種又はそれ以上を含有するプラスミド、ファージ又はファジミド又はその相同体。 11．請求の範囲９記載のプラスミド、ファージ又はファジミド少なくとも１種を含有する微生物。 12．固定されたフィブリノーゲンを有する表面にブドウ球菌が付着するのを妨害するために、ブドウ球菌の抽出可能な画分を使用する方法。 13．固定されたフィブリノーゲンを有する表面にブドウ球菌の付着を妨害するために、ブドウ球菌から得られた天然フィブリノーゲン結合たん白質又はその一部を使用する方法。 14．表面へのブドウ球菌の付着を妨害するために、請求の範囲１記載のたん白質又はその一部を使用する方法。 15．請求の範囲１記載の固定化たん白質又はそのフラグメントを溶液中でフィブリノーゲンを単離するか又は検出するために使用する方法。 16．診断目的に、たとえばＳ．エピデルミディスの存在を検出するか及び（又は）サンプル中に存在する生物の種類を決定するために、請求の範囲１記載のたん白質又はその一部をコードする遺伝子を使用する方法。 17．請求の範囲８記載のＤＮＡ配列によってコードされた、請求の範囲１記載のたん白質又はペプチドに対してもたらされた抗体。 18．診断目的に、請求の範囲１７記載の抗体を使用する方法。 19．治療及び予防目的に、請求の範囲１７記載の抗体を使用する方法。 20．ブドウ球菌の付着を妨害するために、ブドウ球菌の抽出可能画分に対する抗体を使用する方法。 21．ブドウ球菌の付着を妨害するために、ブドウ球菌から得られた天然フィブリノーゲン結合たん白質に対する抗体を使用する方法。 22．ブドウ球菌の付着を妨害するために、請求の範囲１記載のたん白質又はその一部に対する抗体を使用する方法。 23．免疫原としてブドウ球菌から得られた、フィブリノーゲン結合たん白質又はその一部を使用する方法。 24．免疫原として、請求の範囲１記載のたん白質又はその一部を使用する方法。 25．請求の範囲１記載のたん白質を含むワクチン製剤。 26．請求の範囲８記載のＤＮＡ配列を含むワクチン製剤。 27．請求の範囲１記載のたん白質を哺乳類に投与することを含む能動免疫法。 28．請求の範囲８記載のＤＮＡ配列を哺乳類に投与することを含む能動免疫法。 29．請求の範囲８記載のＤＮＡ配列によってコードされた、請求の範囲１記載のたん白質又はペプチドに対してもたらされた抗体を哺乳類に投与することを含む受動免疫法。【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年７月１０日（１９９８．７．１０）【補正内容】請求の範囲１．フィブリノーゲン結合活性を有するたん白質又はポリペプチドに於て、そのたん白質又はポリペプチドは確認されたコアグラーゼ陰性ブドウ球菌中の株に由来することを特徴とする、上記たん白質又はポリペプチド。２．フィブリノーゲン結合活性を有するたん白質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する組換えＤＮＡ分子に於て、そのたん白質又はポリペプチドは、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌株に由来することを特徴とする、上記分子。３．フィブリノーゲン結合活性を有するたん白質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するプラスミド、ファージ又はファジミドに於て、そのたん白質又はポリペプチドは、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌株に由来することを特徴とする、上記プラスミド、ファージ又はファジミド。４．請求の範囲２記載の少なくとも１種の組換えＤＮＡ分子を含有する微生物。５．請求の範囲３記載の少なくとも１種のプラスミド、ファージ又はファジミドを含有する微生物。６．フィブリノーゲンを結合するたん白質又はそのポリペプチドを産生する方法に於て、請求の範囲２記載の組換えＤＮＡ分子少なくとも１種を微生物中に導入し、この微生物を適当な培地中で培養し、生じたたん白質をクロマトグラフィー精製によって単離することを特徴とする、上記方法。７．フィブリノーゲンを結合するたん白質又はそのポリペプチドを産生する方法に於て、請求の範囲２記載の組換えたん白質少なくとも１種をファージ粒子上で発現させ、そのファージ粒子はフィブリノーゲン結合活性を示すことを特徴とする上記方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人フロック・ヤン―イングマールスウェーデン国、Ｓ―161 28 ブロムマ、ソンガルヴェーゲン、２ (71)出願人リンドベルク・マルティンスウェーデン国、Ｓ―750 07 ウプスラ、ピーオーボックス 7025 インスティトウト・フェル・ミクロビオロギ、スベリゲス・ラントブルクスユニバーシテート (72)発明者グス・ベンクトスウェーデン国、Ｓ―756 52 ウプサラ、ダーク・ハムマルシェルツ・ヴェーク、 238 ベー (72)発明者ニルソン・マルティンスウェーデン国、Ｓ―752 30 ウプサラ、ドラガールブルンスガータン、60 (72)発明者フリクベルク・ラルススウェーデン国、Ｓ―752 29 ウプサラ、スタビー・アレー、７セー (72)発明者フロック・ヤン―イングマールスウェーデン国、Ｓ―161 28 ブロムマ、ソンガルヴェーゲン、２ (72)発明者リンドベルク・マルティンスウェーデン国、Ｓ―750 07 ウプスラ、ピーオーボックス 7025 インスティトウト・フェル・ミクロビオロギ、スベリゲス・ラントブルクスユニバーシテート

Claims

【特許請求の範囲】１．フィブリノーゲン結合活性を有するたん白質又はポリペプチドに於て、そのたん白質又はポリペプチドはコアグラーゼ陰性ブドウ球菌株に由来することを特徴とする、上記たん白質又はポリペプチド。２．フィブリノーゲン結合活性を有するたん白質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する組換えＤＮＡ分子に於て、そのたん白質又はポリペプチドは、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌株に由来することを特徴とする、上記分子。３．フィブリノーゲン結合活性を有するたん白質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するプラスミド、ファージ又はファジミドに於て、そのたん白質又はポリペプチドは、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌株に由来することを特徴とする、上記プラスミド、ファージ又はファジミド。４．請求の範囲２記載の少なくとも１種の組換えＤＮＡ分子を含有する微生物。５．請求の範囲３記載の少なくとも１種のプラスミド、ファージ又はファジミドを含有する微生物。６．フィブリノーゲンを結合するたん白質又はそのポリペプチドを産生する方法に於て、請求の範囲２記載の組換えＤＮＡ分子少なくとも１種を微生物中に導入し、この微生物を適当な培地中で培養し、生じたたん白質をクロマトグラフィー精製によって単離することを特徴とする、上記方法。７．フィブリノーゲンを結合するたん白質又はそのポリペプチドを産生する方法に於て、請求の範囲２記載の組換えたん白質少なくとも１種をファージ粒子上で発現させ、そのファージ粒子はフィブリノーゲン結合活性を示すことを特徴とする上記方法。請求の範囲８記載のＤＮＡ配列によって。 18．診断目的に、請求の範囲１７記載の抗体を使用する方法。 19．治療及び予防目的に、請求の範囲１７記載の抗体を使用する方法。 20．ブドウ球菌の付着を妨害するために、ブドウ球菌の抽出可能画分に対する抗体を使用する方法。 21．ブドウ球菌の付着を妨害するために、ブドウ球菌から得られた天然フィブリノーゲン結合たん白質に対する抗体を使用する方法。 22．ブドウ球菌の付着を妨害するために、請求の範囲１記載のたん白質又はその一部に対する抗体を使用する方法。 23．免疫原としてブドウ球菌から得られた、フィブリノーゲン結合たん白質又はその一部を使用する方法。 24．免疫原として、請求の範囲１記載のたん白質又はその一部を使用する方法。 25．請求の範囲１記載のたん白質を含む、ワクチン製剤。 26．請求の範囲８記載のＤＮＡ配列を含むワクチン製剤。 27．請求の範囲１記載のたん白質を哺乳類に投与することを含む能動免疫法。 28．請求の範囲８記載のＤＮＡ配列を哺乳類に投与することを含む能動免疫法。 29．請求の範囲８記載のＤＮＡ配列によってコードされた、請求の範囲１記載のたん白質又はペプチドに対してもたらされた抗体を哺乳類に投与することを含む受動免疫法。