JP2004510428A

JP2004510428A - ブドウ球菌由来のフォンビルブラント因子結合性タンパク質

Info

Publication number: JP2004510428A
Application number: JP2002532474A
Authority: JP
Inventors: グス・ベント; フリクベルク・ラルス; ヤコブソン・カリン; オーレン・ヨアキム; ニルソン・マルチン
Original assignee: バイオスタプロ・アクチエボラーグ
Priority date: 2000-10-04
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2004-04-08
Also published as: SE0003573D0; EP1328542A1; WO2002028892A1; US20040014178A1; AU2001245002A1

Abstract

ブドウ球菌由来のフォンビルブラント因子結合タンパク質およびポリペプチドが開示されている。さらに、前記タンパク質およびペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子、ならびに、該ＤＮＡ分子を含むプラスミド、ファージおよびファージミド、ならびに、該組み換えＤＮＡ分子またはプラスミド、ファージおよびファージミドを含む微生物および微生物が記載されている。さらに、フォンビルブラント結合タンパク質またはポリペプチドの製造方法、ブドウ球菌の表面付着の阻害方法、固定化タンパク質、抗体、イムノゲン、精製方法、および複合溶液中のフォンビルブラント因子の有無の判定方法も開示されている。

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は遺伝子工学の分野に関し、フォンビルブラント結合活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組み換えＤＮＡ分子に関する。さらに本発明は、前記分子を含む微生物（ウィルスを含む）、および前記タンパク質またはポリペプチドの製造における該微生物の使用ならびにバイオテクノロジーにおけるそれらの使用を含む。
【０００２】
（発明の背景）
ブドウ球菌
コアグラーゼ陽性ブドウ球菌のなかでも、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）は、心内膜炎、骨髄炎、敗血症、創傷感染などのヒトにおける広範な病気の原因となる病原種である（エスパーセン（Ｅｓｐｅｒｓｅｎ）ら、１９９９年）。ブドウ球菌は、体表面への開口を取り巻く多数の汗腺や粘膜が存在する皮膚の部位において最も多く見つけられている。
【０００３】
長い間、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）は非病原性であると考えられてきたが、ここ２０年の間に、ＣＮＳは院内感染において最も頻繁に単離される病原体になってきている。これは主として、院内における免疫不全患者数の増大とともに、ヒト医薬において生物材料が使用されることが多くなったことや多耐性抗菌株が増加したことによるものである。スタフィロコッカス・ルグドネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）（フレニー（Ｆｒｅｎｅｙ）ら、１９８８年）はヒトの正常な皮膚微生物叢に属するＣＮＳであるが、この種は心内膜炎、敗血症や様々な深部組織感染、血管プロテーゼ感染、骨髄炎、皮膚感染などの重篤な感染を引き起こすおそれがある（エスパーセン（Ｅｓｐｅｒｓｅｎ）ら、１９９９年、ウォーサマン（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ）ら、１９９９年）。
【０００４】
ブドウ球菌が宿主内で疾病を引き出す能力は、一般に、宿主の状態と協力して宿主の成分を分解することのできる、付着分子、莢膜多糖類、毒素および酵素などの発現などのいくつかの毒性因子によるものである。宿主細胞および組織の特定の部位または構造において、プラズマ中および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分にブドウ球菌が結合することが、感染開始の主要な段階の１つであると考えられている。この結合は、病原体の細胞外酵素と宿主のリガンドとの間の特異的相互作用によるものである。ある特定の細菌タンパク質とリガンドの間の相互作用は、感染の部位や、疾病の種類や段階などの様々な因子に応じて異なる。病原性ブドウ球菌の細胞外タンパク質の多くが、その結合特性において多機能であるため、それぞれの細胞外タンパク質の役割は、選ばれた単一の結合特性を検討することによって判定することができない。したがって、これらの細菌表面タンパク質を分子レベルで研究することが重要である。研究の１つの目的は、ブドウ球菌によって引き起こされる感染をたたくための新しい戦略を開発するために、個々の細菌／宿主相互作用の分子的機構を研究することであった。この戦略は、宿主成分と相互作用する細胞外タンパク質をコードする細菌遺伝子のクローニングとシーケンシング、および該遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ内で発現させることにより、次なる研究のためにタンパク質の生産を容易にすることであった。生産された組み換えタンパク質について、細菌感染の阻害能および新しいバイオテクノロジーツールとしてのその利用可能性について研究されている（欧州特許１６３６２３号、欧州特許２９４３４９号、欧州特許５０６９２３号、ＷＯ８４／０３１０３）。
【０００５】
フォンビルブラント因子
フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）は、大きな多機能糖タンパク質であり、その成熟型は４つの異なる種類の反復（Ａ〜Ｄ）で配列された２０５０個のアミノ酸からなる。ｖＷＦは、特に高い剪断力条件下において、損傷した血管内の露出上皮化組織に対する血小板の付着および凝集を支持することによって止血の保守に不可欠な要素である。ｖＷＦは約５００ｋＤａの大きさの２量体、または２００００ｋＤａまでの様々な大きさの多量体として存在する。ｖＷＦは、内皮細胞と巨核球によってのみ合成される。内皮細胞は５〜１０μｇ／ｍｌの濃度でｖＷＦのプラズマプール、ならびに、ヴァイベル−パラーデ小体におけるｖＷＦの細胞内貯蔵供給源を生み出す。巨核球は、血小板のα−顆粒内に貯蔵されるｖＷＦを担当する。最大のトロンボゲン形成能力を有するｖＷＦの最も大きな多量体は、これらの異なる貯蔵小室内に存在しており、循環する多量体は一般的にそれより小さいものである。ｖＷＦは２つの別の血小板受容体であるＧＰＩｂ−Ｖ−ＩＸ複合体内の糖タンパク質（ＧＰ）Ｉｂと、ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ（インテグリンαＩＩｂβ３とも呼ぶ）を介して血小板の付着を媒介する。さらに、ｖＷＦは凝結因子ＶＩＩＩの輸送と安定化を行う。ｖＷＦは内皮ビトロネクチン受容体（インテグリンαＶβ３）、ならびに、コラーゲン類（Ｉ，ＩＩＩおよびＶＩ型）、ヘパリン様グルコサミノグリカン類、およびスルファチドなどの様々な内皮下成分にも結合する。フィッシャー（Ｖｉｓｃｈｅｒ）とデ・マールース（ｄｅ　Ｍｅｒｌｏｏｓｅ）（１９９９年）、ヘルマン（Ｈｅｒｒｍａｎｎ）ら（１９９７年）、ルッゲリ（Ｒｕｇｇｅｒｉ）（１９９９年）。多機能ｖＷＦの量の減少は、最も一般的な遺伝子出血疾患であるフォンビルブラント病のいくつかのタイプおよびサブタイプの１つを引き起こす（モールケ（Ｍｏｈｌｋｅ）ら、１９９９年）。
【０００６】
ハートライブ（Ｈａｒｔｌｅｉｂ）ら（２０００年）による以前の報告では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの細胞上に存在するＩｇＧ結合タンパク質Ａが、この細菌種におけるｖＷＦ結合タンパク質であるとクレームしている。本発明はタンパク質Ａに関するものではない。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するｖＷｂ（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる新しいフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）結合タンパク質およびｖＷｂｌ（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ　ｂｉｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、および前記タンパク質をコードするｖＷＢＬＤＮＡ分子、ならびにそれらの使用を開示している。
【０００８】
以下に、本発明を同封の実施例および図面の裏付けのもとにより詳細に説明する。
【０００９】
【図１】
ｖＷｂタンパク質の模式図と、組み換えｖＷｆに対してＳ．ａｕｒｅｕｓファージディスプレイライブラリをパニングした後に得られた様々なファージミドクローンから単離された対応遺伝子ｖＷｂに由来するインサートのアライメントを示した図である。Ｓ：シグナル配列（シグナルペプチダーゼ切断部位は、配列番号：３におけるアミノ酸３５と３６の間にある）。Ｂ：ｖＷｆ結合部位（配列番号：４におけるアミノ酸３６８〜３９３）。括弧内の数字は、配列決定した３２個のクローンのなかから個々のクローンが見つけられた回数を示している。
【００１０】
【図２】
ｖＷＦ結合ドメインを表しているファージミド粒子を用いた結合実験。結合したファージミド粒子の数をｃｆｕ／μｌとして判定した。
【００１１】
【図３】
ｖＷＦ結合ドメインを表しているファージミド粒子を用いた阻害実験。結合したファージミド粒子の数をｃｆｕｍｌ^−１、ｋｃｆｕ（キロｃｆｕ）として判定した。ファージミド粒子は、様々な濃度のｖＷｂに対する抗体（○）または非特異的抗体（□）の存在下においてｖＷｆに対してパニングした。数値は２回の実験の平均±標準偏差である。
【００１２】
【図４】
ｖＷｂｌのＲ部位における１０個の反復単位（Ｒ１〜Ｒ１０）のアライメント。Ｒ１０は他の反復単位に比べて顕著に分散が大きかったので、他の反復単位間の高い類似性をより明確に示すために、別にアライメントを行っている。すべての反復間で完全に保存されているアミノ酸は星印で示し、反復間でよく保存されているアミノ酸は点で示した。数値は、配列番号：２に従うｖＷｂｌにおけるアミノ酸位置を示す。
【００１３】
【図５】
ｖＷｂｌの模式図と、ｒｖＷｆに対するパニング後に得られたファージミドクローン由来のインサートのアライメント。ｖＷｂｌ上の様々な位置は、Ｓ（シグナル配列）、Ａ（非反復部位）およびＲ（１０個の反復単位を包含する）によって示されている。下側のｖＷｂｌ（ＳｌｖＷ１−ＳｌｖＷ７）によって表されるインサートは、ｐＨを低下させることによりファージミド粒子を溶離させたパニングから得たものである。上側のｖＷｂｌ（ＳｌｖＷ８）は、ファージミド粒子が溶離しなかったパニング処理から得たものである。Ｅ．ｃｏｌｉの代わりにＴＧ１細胞をウェルに直接加えて感染させた。数値は配列番号：２によって定義されるｖＷｂｌにおけるアミノ酸位置を示す。
【００１４】
【図６】
組み換え構築物ｖＷｂｌ３ｒによる、固定化ｒｖＷｆへのファージミド（ＳｌｖＷ５）粒子の結合の阻害。ｒｖＷｆでコートしたマイクロタイターウェルを、ｖＷｂｌ３ｒまたはＨＳＡを添加したＰＢＳ、あるいはＰＢＳのみとともに個別に１時間インキュベートした。体積の１０分の１（５０μｌ）をＳｌｖＷ５の５０倍希釈ファージストックに置換した。１時間インキュベートした後、マイクロタイタープレートをＰＢＳＴで洗浄し、結合したファージミド粒子をｐＨを２．１に下げることにより溶離させた。アリコートを用いてＥ．ｃｏｌｉ細胞を感染させ、ＬＡＡ平板にプレーティングした。結果はＣＦＵ／ｍｌ溶離液として示されている。各値は２つの別のウェルからの全４回の感染の平均であり、標準偏差が示されている。
【００１５】
（配列リスト）
配列番号１：Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ由来のｖｗｂｌ遺伝子の完全なヌクレオチド配列。
【００１６】
配列番号２：Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ由来のコード化タンパク質ｖＷｂｌの推定アミノ酸配列。
【００１７】
配列番号３：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のｖｗｂ遺伝子の完全なヌクレオチド配列。
【００１８】
配列番号４：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のコード化タンパク質ｖＷｂｌの推定アミノ酸配列。
【００１９】
配列番号５：ｖＷＦに結合するＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの２４アミノ酸配列のマッピング。
【００２０】
配列番号６：ｖＷＦに結合するＳ．ａｕｒｅｕｓの２６アミノ酸配列のマッピング。
【００２１】
配列番号７〜１６：Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのアミノ酸配列（配列番号：２）における６７アミノ酸長反復単位（Ｒ１〜Ｒ１０）。
【００２２】
配列番号１７：配列番号：４におけるアミノ酸３６〜４５に対応する精製された分泌ｖＷｂタンパク質のＮ末端配列。
（発明の詳細な説明）
本発明は、ｖＷＦ結合活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコオードするヌクレオチド配列からなる組み換えＤＮＡ分子に関する。これらのヌクレオチド配列の天然の起源は、それぞれＳ．ａｕｒｅｕｓのＮｅｗｍａｎ株およびＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの２３４２株であるが、本願で示したヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列の知識を用いれば、それぞれの遺伝子または遺伝子の部分を、それぞれＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの株から単離することもできるし、合成によって作製することもできる。特に、ｖＷＦ結合活性を担う各タンパク質の部分に対する推定アミノ酸配列の知識は、ｖＷＦ結合を保持または阻害する合成ポリペプチドを作成するために用いることができる。これらのポリペプチドは、酵素、蛍光、発光、ビオチン（またはその誘導体）、放射能などの様々な化合物によって標識することができ、たとえば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ技術などの診断試験において用いることができる。
【００２３】
タンパク質がその主たる特性を保持している場合には、そのタンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基にミスマッチが少ないであろうことは技術上周知である。ミスマッチは、１つまたは数個のアミノ酸が置きかわったもの、若しくは、アミノ酸残基の欠失あるいはタンパク質のトランケーションによるものである。このようなミスマッチは天然のタンパク質の遺伝的変異において頻繁に起こる。タンパク質中のアミノ酸残基の１５％までが該タンパク質の主要な特性を保持したまま置換可能である。本発明に従う組み換えＤＮＡ分子の製造に際しては、適切なクローニング伝播体またはベクター、たとえば、プラスミド、ファージミドまたはファージＤＮＡを、制限酵素の力を借りて切断した上で、該切断部位に所望のタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入して組み換えＤＮＡ分子を作成する。この一般的な方法は当業者によって周知であり、ＤＮＡ配列を切断しライゲーションするための様々な技術が文献に記載されている（たとえば、米国特許４，２３７，２２４号、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（１９９１年）、サンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９年））。それでもなお、本願発明者の知識によれば、これらの技術を本目的のために用いていない。Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＮｅｗｍａｎ株およびまたはＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの２３４２株をそれぞれ、所望のヌクレオチド配列の起源として用いる場合には、前記配列を単離し、各配列を下記の実験の部に記載するような方法で適切なベクターに導入することができ、あるいは、ヌクレオチド配列は提示されているので、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、完全なｖｗｂおよび／またはｗｂｌ遺伝子またはそれらの断片を得る。
【００２４】
用いることのできる宿主としては、培養中の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブドウ球菌種、連鎖球菌種、乳酸桿菌種の株などの細菌宿主、さらに培養中の酵母や他の真核細胞等を含みうる微生物（各タンパク質またはその活性断片を製造するために用いることができる）が挙げられる。最大限の発現を得るために、プロモータやリボゾーム結合部位などの調節要素をそれ自体公知の方法で変えてもよい。タンパク質またはその活性ペプチドは、細胞内または細胞外で製造することができる。様々な系において良好な分泌を得るために、様々なシグナルペプチドを用いることができる。精製および／または検出を容易にするために、タンパク質またはその断片は、アフィニティハンドルおよび／または酵素に融合させることもできる。これは遺伝子レベルおよびタンパク質レベルのいずれにおいても実施可能である。各タンパク質またはそのポリペプチドの特徴を改変するために、例えばｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を用いて、あるいは結果として新しい特徴を有した融合タンパク質を与える他のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を融合することにより、遺伝子または遺伝子の一部を改変することができる。
【００２５】
したがって、本発明はｖＷＦ結合特性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＤＮＡ分子からなる。さらに、本発明は、そのようなヌクレオチド配列を含む、例えば、ファージミド、プラスミドおよびファージなどのベクター、およびそのようなベクターが導入された有機体、特に細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ株やブドウ球菌種からなる。あるいは、そのようなヌクレオチド配列は微生物の天然のゲノムに統合してもよい。
【００２６】
本願は、ｖＷｂおよびＷｂｌの各タンパク質あるいはその断片のｖＷＦ結合活性を有するタンパク質またはポリペプチドを製造する方法にも関する。本方法に従えば、上記微生物は適切な培地中で培養され、得られた産物を、例えばイオン交換クロマトグラフィー、あるいは不溶性担体に結合したｖＷＦを用いたアフィニティクロマトグラフィーなどの何らかの分離方法によって単離する。
【００２７】
本発明は、ｖＷＦ結合タンパク質またはその一部を、例えばＭ１３のようなバクテリオファージやその誘導体などの適切なウィルス粒子上で発現させ提示する方法も含む。
【００２８】
ｖｗｂまたはｗｂｌまたはその一部を含むベクター、特にプラスミドには、いわゆる融合タンパク質を発現するために、別の産物をコードするヌクレオチド配列を各ヌクレオチド配列に融合することに利用できる、容易に切開可能な制限部位を設けると有益である。融合タンパク質は、そのｖＷｆへの結合能力を利用した方法によって単離してから、系内の他の成分を所望により融合タンパク質から分離してもよい。この技術はタンパク質Ａの系に関してＷＯ８４／０３１０３に詳細に記載されており、本願においても同様の方法で適用することができる。融合戦略は、ｖＷｂおよびＶｂｌの各タンパク質（またはその一部）の活性を該タンパク質を一緒に融合するか、他のタンパク質と融合するかによって、改変、増大または変更するために用いることができる。
【００２９】
本発明は、ｖＷＦをアフィニティ精製するために用いることもできる。各組み換えｒｖＷＦ結合タンパク質またはその一部を発現させて精製することができ、単離されたタンパク質またはポリペプチドは不溶性担体に結合させることが出来る。固定化されたｖＷＦ結合タンパク質は血清などの溶液からｖＷＦを検出しアフィニティ精製するために用いることができる。本発明は、ブドウ球菌感染に対するワクチン接種のためのイムノゲンとして細菌の細胞外成分を用いることに関するバイオテクノロジーの分野にも適用できる（欧州特許１６３６２３号、欧州特許２９４３４９号、欧州特許５０６９２３号）。全細菌を用いた免疫付与は、所与の抗原性決定基に対する抗体のレベルが低くなった高度なポリクローナル免疫反応を常に誘因する。したがって、免疫付与治療に本発明に従うタンパク質、ポリペプチドまたはＤＮＡを用いることが好ましい。とりわけ、免疫付与治療は、いわゆる受動および能動免疫として行われる。本発明のタンパク質またはＤＮＡを用いた受動免疫には、適切な宿主動物、好ましくは哺乳動物、例えば健常な血液ドナーにおいて、前記タンパク質または投与されたＤＮＡによってコードされるタンパク質に対する抗体を発生させ、回収し、前記抗体を患者に投与することが含まれる。受動免疫のための抗体を発生させる他の方法としては、細胞培養において特異的抗体を産生させることが含まれる。好ましい実施形態の１つとして、例えば体内への異物の移植を伴う手術などの外科治療前の患者への受動免疫があげられる。本発明のタンパク質またはＤＮＡを用いた能動免疫には、前記タンパク質またはＤＮＡを、好ましくは薬学的に適切な免疫刺激剤とともに患者に投与することが伴う。そのような薬剤の例としては、コレラ毒素および／またはその誘導体、Ｅ．ｃｏｌｉ毒素などの易熱性毒素、および類似の薬剤が含まれるが、これらに限定されることはない。本発明に従う組成物は、免疫付与治療の当業者によって周知の従来の薬学的に受容可能なアジュバントをさらに含んでいてもよい。好ましくは、本発明のＤＮＡまたはその断片を用いた免疫付与治療において、前記ＤＮＡは前記ＤＮＡを適切なプラスミド担体に組み込まむように筋肉内投与することが好ましい。適切な免疫刺激剤をコードするさらに別の遺伝子を同一のプラスミド内に好適に組み込むことができる。
【００３０】
前記免疫付与治療は、上述の投与経路に限定されないが、普通は経口、経鼻、皮下および筋肉内のいずれか１つに適合させることができる。
【００３１】
フォンビルブラント因子疾患の治療の１つの方法としては、この因子を、例えばプラズマまたは組み換え技術によって生産された因子（ｒｖＷＦ）を用いて患者に投与することがある。フィッシャー（１９９９年）を参照のこと。開示された発明の１つの用途は、血清などの複合溶液からｖＷＦをアフィニティ精製することがあり、これによりこの因子の精製が容易になる。さらに、本発明は血液やプラズマなどの複合溶液内のｖＷＦ／ｒｖＷＦの濃度を決定するために用いることもできる。
【００３２】
特に、本発明はＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓからなる群より選択されるブドウ球菌由来のフォンビルブラント因子結合タンパク質またはポリペプチドに向けられている。
【００３３】
一実施形態において、タンパク質またはペプチドは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５〜１７、およびそれらの一部からなる抗原決定基からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有している。抗原決定基は、少なくとも５個、通常は少なくとも７個、例えば少なくとも９個のアミノ酸残基からなる開示されたアミノ酸配列の１つの一部を含む。
【００３４】
本発明は、本発明に従うタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列を含む組み換えＤＮＡ分子にも向けられている。
【００３５】
一実施形態において、組み換えＤＮＡ分子は、配列番号：１、配列番号：３と、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５〜１７、およびそれらの一部からなる抗原決定基からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質およびペプチドをコードするヌクレオチド配列とからなる群より選ばれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
本発明はさらに、本発明に従うＤＮＡ分子を含むプラスミド、ファージまたはファージミド、および本発明に従う少なくとも１つの組み換えＤＮＡ分子を含む微生物、あるいは本発明に従う少なくとも１つのプラスミド、ファージまたはファージミドにも向けられている。
【００３７】
本発明の他の態様は、フォンビルブラント因子結合タンパク質またはそのポリペプチドの製造方法であって、
−本発明に従う少なくとも１つの組み換えＤＮＡ分子を微生物中に導入する工程と、
−前記微生物を適切な培地中で培養する工程と、
−上記のように作成されたタンパク質をクロマトグラフィ精製によって単離する工程とを含む方法にも向けられている。
【００３８】
本発明の他の態様は、ファンビルブラント因子結合タンパク質またはそのポリペプチドの製造方法であって、本発明に従う少なくとも１つの組み換えタンパク質をファージ粒子上で発現させて、フォンビルブラント因子結合活性を示すファージ粒子を生産する工程からなる方法と、表面へのブドウ球菌の付着を阻止する方法であって、本発明に従うタンパク質、または本発明に従う抗体を、前記ブドウ球菌、好ましくはＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓおよび／またはＳ．ａｕｒｅｕｓを含む培地に加えることを含む方法とを含む。
【００３９】
本発明のさらに別の態様は、本発明に従う固定化タンパク質またはペプチドに向けられている。タンパク質またはペプチドは、ガラスまたはプラスチック表面、ペプチド、タンパク質または炭水化物、たとえばセファデックスやデキストランなど、および本発明のタンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗原に連結してもよい。これらの抗体は、ブドウ球菌感染を検出するために用いることができる。
【００４０】
本発明のさらに別の態様は、本発明に従うタンパク質またはペプチドを含むイムノゲンに向けられている。イムノゲンはワクチンにおいて好適に用いることができる。
【００４１】
本発明のさらなる態様は、本発明の固定化タンパク質を用いたクロマトグラフィーを含む複合溶液からフォンビルブラント因子を精製する方法と、本発明に従うタンパク質またはペプチドを用いる工程を含む複合溶液内にフォンビルブラント因子が存在するかを判定する方法とを含む。
【００４２】
実施例
出発物質
菌株、ファージ、クローニングベクター
使用したＳ．ａｕｒｅｕｓ株：Ｎｅｗｍａｎ、８３２５−４，Ｗｏｏｄ４６，Ｏ５，Ｌ１４１，Ｕ２，１２，７３。使用したＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ株：Ｇ５−８７，Ｇ２−８９，Ｇ１６−８９，Ｇ６−８７，Ｇ５８−８８，Ｇ６６−８８，Ｇ３Ａ，ＳÅ，２３４２，４９／９０，４９／９１，Ａ２５１は、Åｓａ　Ｌｊｕｎｇｈ（スウェーデン、ルント）より得た。使用したＥ．ｃｏｌｉ株：ＴＧｌ，ＤＨ５−α，ＢＬ２１（ＤＥ３），ｐＬｙｓＳ。
【００４３】
Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１株は、ライブラリの構築とファージストックの作成のための宿主として用いた。Ｅ．ｃｏｌｉファージＲ４０８（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マジソン）はヘルパーファージとして用いた。
【００４４】
ファージミドベクターｐＧ８ＳＡＥＴは、ファージミドライブラリを構築するために用いた（ヤコブソン（Ｊａｃｏｂｓｓｏｎ）とフリクベルグ（Ｆｒｙｋｂｅｒｇ）、１９９９年）。
【００４５】
実施例において使用したすべての菌株およびプラスミドまたはファージミド構築物は、Ｓｗｅｄｉｓｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ内、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（スウェーデン、アップサラ）において入手可能なものである。
【００４６】
緩衝液と培地
Ｅ．ｃｏｌｉは、ルリア・ベルターニ・ブロス（ＬＢ）またはＬＡ平板（１．５％寒天を含むＬＢ）（サンブルークら、１９８９年）中、３７℃で培養した。アンピシリンは最終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるように適時Ｅ．ｃｏｌｉ成長培地に添加した。ブドウ球菌は、血液寒天平板（最終濃度５％のウシ血液を含む）上またはトリプトンソーヤブロス（ＴＳＢ、Ｏｘｏｉｄ社、英国、ハンツ、ベイシンストーク）中において３７℃で培養した。ＰＢＳ：０．０５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１，０．９％　ＮａＣｌ。ＰＢＳ−Ｔ：ＰＢＳにＴＷＥＥＮ２０を最終濃度０．０５％で加えたもの。
【００４７】
ブドウ球菌からのＤＮＡの調製
ブドウ球菌の株をＴＳＢ中で一晩培養した。翌朝、細胞を回収し染色体ＤＮＡを調製した。
【００４８】
タンパク質および他の試薬
ヒトフィブリノーゲンは、（ＩＭＣＯ社、スウェーデン、ストックホルム）より得た。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、フィブロネクチン、ヒトＩｇＧおよびカゼインは、米国セントルイスＳｉｇｍａより入手した。トロンボスポンジンおよびヒトビクロネクチンおよびヒト組み換えファンビルブラント因子は、ÅｓａＬｊｕｎｇ（スウェーデン、ルント）より入手した。ＤＮＡプローブは、ランダムプライミング法（マルチプライムＤＮＡ標識システム；Ａｍｅｒｓｈａｍ社、英国、アマシャム）により^３２Ｐ−ＡＴＰで標識した。ヒトｖＷＦに対する抗体は、Ｋｏｒｄｉａ（オランダ、ライデン）より得た。ｖＷｂタンパク質に対するニワトリ抗体は、ＩｍｍｕｎｓｙｓｔｅｍＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン、アップサラ）によって開発した。様々な実験においてニワトリ抗ｖＷｂ抗体を使用する前に、該抗体をｒｖＷｂカラムによってアフィニティ精製した。ウェスタンブロット技術においては、ニトロセルロース（ＮＣ）フィルタ（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＢｉｏｔｅｃｈまたはＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｌｌ、ドイツ、ダッセル）を用いて、ハイブリダイゼーション実験におけるＤＮＡまたはタンパク質を結合させた。
【００４９】
天然またはドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってタンパク質試料を分析するために、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社（スウェーデン国アップサラ）から得たＰＨＡＳＴシステムを業者の推奨に従って用いた。
【００５０】
使用したオリゴヌクレオチドは、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ＡＢ（Ｔａｂｙ、スウェーデン）によって合成された。マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ、デンマーク、コペンハーゲン）をパニング実験において使用した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ　ＧｍｂＨ、ドイツ、ヒルデン）を用いて調製し、インサートの配列はヤコブソン（Ｊａｃｏｂｓｓｏｎ）およびフライクバーグ（Ｆｒｙｋｂｅｒｇ）（１９９５年、１９９８年）に記載されているようにして決定した。得られた配列は、ＰＣ−遺伝子プログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，米国カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いて解析した。あるいは、得られた配列を解析するためにＮＴＩベクターコンピュータソフトウェア（Ｉｎｆｏｒｍａｘ社、米国、メリーランド州ノースベセスダ）を用いた。
【００５１】
常套的方法
分子生物学において常套的に用いられる方法、たとえばエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの制限、ＤＮＡ断片のライゲーション、プラスミド精製などについては、これらの方法が一般的に用いられるマニュアルに書かれているため本文中では記載しない（サンブルークら、１９８９年、アウスベルら、１９９１年）。ライゲーション反応は、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，スウェーデン、アップサラ）を用いて実施した。ＰＣＲ反応はＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒ（ＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国、マサチューセッツ州ウォータタウン）上で実施した。ＤＮＡシーケンシング反応は、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ染料ターミネータサイクルシーケンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実施し、試料はＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて製造業者の指示に従って解析した。
【００５２】
実施例１：Ｓ．ａｕｒｅｕｓショットガンファージディスプレイライブラリの構築
Ｓ．ａｕｒｅｕｓショットガンファージディスプレイライブラリは、ＪａｃｏｂｓｏｎおよびＦｒｙｋｂｅｒｇ（１９９６年、１９９８年）に記載の原理で構築した。すなわち、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＮｅｗｍａｎ株の染色体ＤＮＡを調製し、様々な時間で超音波処理することにより断片化した。超音波処理されたＤＮＡをアガロースゲル上で分析し、０．５〜５ｋｂの範囲のＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって平滑末端化した。次にこれらのＤＮＡ断片を、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＤＮＡリガーゼキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてｐＧ８ＳＡＥＴファージミド中に挿入した。ライゲーション材料をＥ．ｃｏｌｉＴＧ１にエレクトロポーレーションしたところ、１×１０^７のアンピシリン耐性形質転換体が得られた。エレクトロポーレーション後の細菌の一晩培養物の一部（４ｍｌ）を感染多重度２０で２０分間、ヘルパーファージＲ４０８（１０^１２プラーク形成単位／ｍｌ）に感染させ、アンピシリンを添加したＬＡ平板上に注いだ０．５％軟寒天（ＬＡＡ平板）と混合した。３７℃で一晩インキュベートした後、ＬＢ中で激しく撹拌することによりファージ粒子を軟寒天から遊離させた。懸濁液を１５分間遠心分離し（１５，０００×ｇ）、滅菌濾過（０．４５μｍ）した。ファージディスプレイライブラリの力価は、１．５×１０^９コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌであった。
【００５３】
実施例２：Ｓ．ａｕｒｅｕｓファージディスプレイプラスミドライブラリのｖＷＦに対するパニング
マイクロタイターウェル（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ、デンマーク、コペンハーゲン）を、１９０μｌコーティングバッファ（０．０５ＭＮａＨＣｏ_３、ｐＨ９．５）と混合した１０μｌｖＷＦ（１ｍｇ／ｍｌ）でコートし、室温（ＲＴ）で撹拌しながら１時間インキュベートした。ウェルをリン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。２００μｌのファージミドライブラリをｖＷＦでコートしたウェルに、最終濃度１００μｇ／ｍｌのカゼインとともに添加した。パニングは、室温にて撹拌しながら４時間行った。ＰＢＳ−Ｔでよく洗浄した後、結合したファージを２００μｌの溶離バッファ（０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ２．０）を用いて室温で２分間溶離させた。溶離液を２５μｌの２Ｍトリスバッファ、ｐＨ８．７で中和した。様々な体積（０．００１〜５０μｌ）の溶離液を２５μｌの静止期Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１にＬＢとともに添加して最終体積を２００μｌに調節した。２０〜３０分間感染させ続けた後に懸濁液をＬＡＡ平板上に広げ、感染した細菌の数をｃｆｕ／μｌ溶離液として求めた。平板は３７℃で一晩インキュベートした。コロニーを計数し、１５０個のコロニーを２枚の同一のレプリカ平板に移植し、残りのコロニーは最終体積０．５ｍｌになるようにＬＢ培地中に再懸濁して集めた。この懸濁液を、１０μｌヘルパーファージＲ４０８［１０^１２プラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍｌ）］に感染させ、富化ファージストックを作成した。この感染細菌をＬＡＡ平板上に注がれた５ｍｌの０．５％軟寒天と混合し、３７℃で一晩インキュベートした。その後、軟寒天を掻き取り、５ｍｌのＬＢを添加して、混合物をボルテックス混合し３７℃で３時間激しく撹拌した。次にこのファージミドを１５分間の遠心分離（１５，０００×ｇ）により回収し、上清を滅菌濾過（０．４５μｍ）した。富化ファージストックは次の再パニングに用いるが、再パニングは２時間実施することを除いては上述のパニングと同様にして実施させた。Ｅ−ｔａｇを発現しているクローンの富化およびｖＷＦに対する３回のパニングから得られたｃｆｕの増加を表１に示した。
【００５４】

実施例３：Ｓ．ａｕｒｅｕｓファージディスプレイライブラリに由来するファージミドクローンのスクリーニングおよびシーケンシング
各回のパニングの後、１５０個のコロニーを２枚のレプリカ平板に同一のパターンで採取し、ＮＣフィルタ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、ドイツ、ダッセル）に移植した後、抗Ｅ−ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてファージミド発現タグ（Ｅ−ｔａｇ）の発現をスクリーンニングした。陽性のクローンからファージミドＤＮＡを調製し、インサートのＤＮＡ配列を決定した。得られた配列のアライメントを行ったところ、互いに部分的に重なり合うことが分かった。驚くべきことに、シーケンシングを行ったインサートのどれもが、タンパク質Ａと呼ばれる以前に報告されたＳ．ａｕｒｅｕｓｖＷＦ結合タンパク質と相同性を有しなかった（Ｈａｒｔｌｉｅｂら、２０００年）。様々なファージミドクローンから得られた重複インサートの代表例が図１に示されている。さらに、インサートのアライメントによって、結合活性は、２６アミノ酸長配列（ＴＳＰＴＴＹＴＥＴＴＴＱＶＰＭＰＴＶＥＲＱＴＱＱＱＩ、配列番号：６、配列番号：４におけるアミノ酸３６８〜３９３、配列番号：３のヌクレオチド１１０２〜１１７９に相当）にマッピングされることが判明した。オープンリーティングフレームを有するインサートを有したＮｖＷｂ３２（図１中）と呼ばれる１つのファージミドクローンを次の研究を行うために選んだ。
【００５５】
実施例４：ＮｖＷｂ３２のファージミド粒子の活性
ＮｖＷｂ３２のファージミドストックを以下のようにして調製した。ファージミドを保有するＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞５００μｌに、１０μｌのヘルパーファージＲ４０８（１０^１２ｐｆｕ／ｍｌ）を感染させた。ＬＡＡ平板上の軟寒天中で増殖させた後、ファージミド粒子を上述のようにして回収した。得られたファージストック（２×１０^１０ｃｆｕ／ｍｌ）をファージミド粒子の結合特異性を解析するための実験および阻害実験においても使用した。結合特異性実験において、２００μｌの希釈ファージストック（１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ）を未処理のマイクロタイターウェル（プラスチック）、および２μｇのフィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フォンビルブラント因子、ＩｇＧ、ＨＳＡまたはカゼインのいずれかでコートしたマイクロタイターウェルに対してパニングした。室温で２時間パニングを行った後、ウェルをＰＢＳ−Ｔでよく洗浄し、結合したファージミドを溶離させて、上述のように溶離液のｃｆｕ／μｌを決定するためにＥ．ｃｏｌｉに感染させた。この実験の結果は図２に示されており、ＮｖＷｂ３２がｖＷＦに結合する際に特異性を有することが示されている。
【００５６】
実施例５：組み換えｖＷｂに対する抗体を用いたｖＷＦへのＮｖＷｂ３２結合の阻害
ファージストックＮｖＷｂ３２を希釈し（５×１０^７ｃｆｕ／ｍｌ）、９０μｌを、組み換えｖＷｂに対して非特異的もしくは特異的な様々な濃度のニワトリ抗体１０μｌと混合した（後述）。室温で１時間インキュベートした後、試料をｖＷＦでコートしたマイクロタイターウェルに移植し（１μｇ／ウェル）、さらに２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔでよく洗浄し、結合したファージミドを溶離して、上述のように溶離液のｃｆｕ／μｌを決定するためにＥ．ｃｏｌｉに感染させた。図３に示したように、この実験の結果は、組み換えｖＷｂに対して起こされた抗体がｖＷｂのｖＷＦに対する結合を効率的に阻害することを明確に示している。
【００５７】
実施例６：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のｖＷＦ結合タンパク質をコードする完全な新奇遺伝子（ｖｗｂ）のクローニング
Ｓ．ａｕｒｅｕｓのゲノムは公開されており、ＴＩＧＲ微生物データベース（ｈｔｔｐ：／／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｍｄｂ／ｍｄｂｉｎｐｒｏｇｒｅｓｓ．ｈｔｍｌ）のようなＤＮＡデータベース上で入手可能である。ｖＷｂタンパク質をコードする完全な遺伝子（ｖｗｂと呼ぶ）を得るために、実施例において示された重複インサートのＤＮＡ配列のＤＮＡインサートを用いて、ＴＩＧＲのＳ．ａｕｒｅｕｓゲノムデータベースにおける相同配列を検索した。コンピュータ検索の結果、クローンの重複インサートは、１５５１ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム内に含まれることが分かった（図１）。したがって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＮｅｗｍａｎ株から完全なｖｗｂ遺伝子を単離するために、次の２つのプライマーを設計した。Ｐ１：５’−ＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣ−３’（下流）、Ｐ２：５’−ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＡＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＣ−３’（上流）。これらのプライマーをＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ドイツ、マンハイム）を用いたＰＣＲ実験において、鋳型としてＮｅｗｍａｎ株由来の染色体ＤＮＡとともに用いた。得られたＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理して平滑末端を作り、次にベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にライゲーションした。ライゲーションの一部を次のブルー／ホワイトスクリーニングのために、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５−α中にエレクトロポーレーションした。８個のホワイトコロニーを単離してプラスミドを調製し、それぞれのインサートを制限酵素分析、ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシングによって解析した。完全な遺伝子を含む１つのクローンをさらに特徴付けした。完全なｖｗｂ遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたｖＷｂタンパク質の推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号：３および配列番号：４に示した。
【００５８】
ｖｗｂ遺伝子は、推定シグナル配列を有するがグラム陽性細菌における表面タンパク質に典型的な細胞壁アンカー配列を有しない５１７個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。これによりタンパク質を細菌から取り出して、ｖＷｂを培養上清から精製することができる。
【００５９】
実施例７：組み換えｖＷｂの使用
ｖｗｂ遺伝子の一部を、製造業者の指示に従ってＩｍｐａｃｔＴ７発現システム（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、米国、マサチューセッツ州）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ中で組み換えｖＷｂ（ｒｖＷｂ）として発現させた。ｖｗｂ遺伝子の中央部分をＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅するために、ＰＣＲプライマーＰ３（下流プライマー：５’−ＴＴＡＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＣＣＣＴＧＡＡＴＴＧＡＡＡＧＡＣＴＴ−３’）およびＰ４（上流プライマー：５’−ＡＴＴＡＴＴＡＴＧＣＧＴＧＴＧＡＴＴＴＧＡＡ−３’）を用いた。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩで切断し、ｐＴＹＢ４ベクターにライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ（Ｓ）中にエレクトロポーレーションした。発現したｒｖＷｂは、ニワトリにおける抗体を作成するため、およびｒｖＷｂをＨｉＴｒａｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に連結するために用いた。当該カラムを用いて、特異的な抗ｖＷｂ抗体をニワトリ血清からアフィニティ精製し、様々な実験に用いた。
【００６０】
実施例８：複合溶液からｖＷＦを精製するために組み換えｖＷｂを用いることができる
固定化ｒｖＷｂを含むＨｉＴｒａｐカラムを用いてヒト血清からｖＷｆをアフィニティ精製した。ヒト血清（１５ｍｌ）を（予めＰＢＳで洗浄しておいた）カラムに通し、カラムを１０培体積のＰＢＳと５倍体積のＰＢＳ−Ｔでよく洗浄し、０．１Ｍグリシンバッファを用いてｐＨを３．０に下げることにより結合した物質を溶離させた。溶離液を後述のようにＴＣＡ沈殿させた。ヒトｖＷＦは、抗ｖＷＦ抗体および二次ＨＲＰ標識抗体を用いたウェスタンブロット内で検出した。結合した抗体は、４−クロロ−１−プロパノールを基質として検出した。この結果、組み換えｖＷｂは血清などの複合溶液からｖＷＦをアフィニティ精製するために用いることができることが明確に示された。
【００６１】
実施例９：野生型ｖＷｂの精製
ブドウ球菌の細胞外付着タンパク質（Ｅａｐ）に対する遺伝子が欠失した、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＮｅｗｍａｎ株の同遺伝子型変異株であるＳ．ａｕｒｅｕｓのＮｅｗｍａｎΔＥａｐ株を用いて、ｖＷｂの精製を行った。Ｓ．ａｕｒｅｕｓΔＥａｐ株の培養物（１００ｍｌのＴＳＢ成長培地を含む）を対数増殖期に集菌した。遠心分離後、上清を滅菌濾過し、ニワトリ抗ｖＷｂ抗体が固定化されたＨｉＴｒａｐカラムに通した。１０倍容積のＰＢＳ−Ｔおよび５培容積のＰＢＳでカラムを洗浄した後、０．１Ｍグリシンバッファを用いてｐＨを３．０に下げることにより結合した物質を溶離させた。溶離液は以下のようにしてトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿させた。１ｍｌの溶離液に５０μｌの１００％ＴＣＡを加え、試料を氷上で３０分間維持し、微量遠心機中、１４，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを冷アセトンで洗浄し上述のようにして再度遠心分離した。上清を再度捨て、ペレットを乾燥させてｐＨ７．４のＰＢＳ１０μｌに再懸濁した。精製された分泌ｖＷｂタンパク質のＮ末端配列は、エドマンＮ末端シーケンシングによって決定した。結果として得られた配列は、配列番号：２のアミノ酸３６〜４５に対応するＶＶＳＧＥＫＮＰＹＶ（配列番号：１７）であった。
【００６２】
実施例１０：ｖＷｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
等量のタンパク質溶液を２×サンプルバッファ（１×サンプルバッファ＝６２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％β−メルカプト−エタノール、および０．０１％ブロモフェノールブルー）と混合し、この混合物を５分間煮沸し、これを微量遠心機中、１４，０００回転で５分間遠心分離することにより、ゲル電気泳動用のタンパク質試料を調製した。上清をＰｈａｓｔ　Ｇｅｌ勾配８〜２５％または４〜１５％ゲルおよびＰｈａｓｔ　Ｇｅｌ　ＳＤＳバッファストリップを用いたＰｈａｓｔシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質を拡散ブロットによりニトロセルロース膜にブロットした。ｖＷｂの有無は、抗ｖＷｂ抗体および二次ＨＲＰ標識抗体または^１２５Ｉ標識ｖＷＦのいずれかによって検出した。ｖＷＦを^１２５Ｉで標識するために、ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳヨウ素化試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ、米国、イリノイ州ロックフォード）を用いた。結合した抗体は、４−クロロ−１−ナフトールで検出し、結合した^１２５Ｉ標識ｖＷＦはＫｏｄａｋ　ＢｉｏＭａｘ　ＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ、米国、ニューヨーク州ロチェスター）で検出した。この結果、ｖＷｂがＳ．ａｕｒｅｕｓの培養上清において検出されること、およびｖＷＦがｖＷｂに結合することが明確に示された。
【００６３】
実施例１１：Ｓ．ａｕｒｅｕｓの菌株におけるｖｗｂの有無
様々のＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株（８３２５−４、Ｗｏｏｄ４６、Ｏ２５、Ｌ１４１、Ｕ２、１２、７３）から得た染色体ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社製ＤＮｅａｓｙ　Ｔｉｓｓｕｅキットを用いて調製した。Ｎｅｗｍａｎ株およびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ１９株からのＤＮＡも正の対照および負の対照として本実験において使用した。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、０．７％アガロースゲル上で分離、Ｖａｃｃｕ　Ｇｅｎｅブロッティングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてニトロセルロース膜にブロットした。ＵＶ固定後、フィルタを完全なｖｗｂ遺伝子をスパニングする^３２Ｐ標識プローブによって６５℃で一晩プローブ処理した。適切に洗浄した後、フィルタをＫｏｄａｋ　ＢｉｏＭａｘ　ＭＲフィルム上に−７０℃で２４時間載置してからフィルムを現像した。この結果、調べたすべてのＳ．ａｕｒｅｕｓ株にｖｗｂ遺伝子が存在することが分かった。
【００６４】
実施例１２：スタフィロコッカス・ルグドネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ　ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）ショットガンファージディスプレイライブラリの構築
Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ２３４３株の遺伝子ライブラリは、ＪａｃｏｂｓｏｎおよびＦｒｙｋｂｅｒｇ（１９９６年、１９９８年）に記載の原理で構築した。すなわち、２３４３株の染色体ＤＮＡを調製し、超音波処理により断片化した。超音波処理されたＤＮＡ調製物をアガロースゲル上で分析し、０．５〜５ｋｂの範囲のＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって平滑末端化した。次にこれらのＤＮＡ断片を、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＤＮＡリガーゼキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてｐＧ８ＳＡＥＴファージミド中にライゲーションした。ライゲーション材料をＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞にエレクトロポーレーションしたところ、２×１０^８のアンピシリン耐性形質転換体が得られた。エレクトロポーレーション後の細菌の一晩培養物の一部（４ｍｌ）を感染多重度２０で２０分間、ヘルパーファージＲ４０８（１０^１２プラーク形成単位／ｍｌ）に感染させ、アンピシリンを添加したＬＡ平板上に注いだ０．５％軟寒天（ＬＡＡ平板）と混合した。３７℃で一晩インキュベートした後、ＬＢ中で激しく撹拌することによりファージ粒子を軟寒天から遊離させた。懸濁液を１５分間遠心分離し（１５，０００×ｇ）、滅菌濾過（０．４５μｍ）した。ファージディスプレイライブラリの力価は、１×１０^１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌであった。
【００６５】
実施例１３：Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓファージディスプレイプラスミドライブラリのｖＷＦに対するパニング
マイクロタイターウェル（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ、デンマーク、コペンハーゲン）を、１９０μｌコーティングバッファ（５０ｍＭＮａＨＣｏ_３、ｐＨ９．７）中、最終濃度２５μｇ／ｍｌのヒトｖＷＦ２００μｌで４℃で一晩コーティングした。次に、ウェルをＰＢＳ−Ｔでよく洗浄した後、１ｍｇ／ｍｌカゼインを添加したＰＢＳ−Ｔ２００μｌによって、室温で１時間ブロックした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、０．１ｍｇ／ｍｌのカゼインを添加したＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのファージミドライブラリ２００μｌを加え、ウェルを室温で４時間インキュベートした。溶離前に、ウェルをＰＢＳ−Ｔでよく洗浄し、２００μｌバッファ溶液（５０ｍｌクエン酸ナトリウム；１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ２．０）で溶離した。溶離液を２５μｌの２ＭトリスＨＣＬ、ｐＨ８．７で中和した。その後、２０μｌのＥ．ｃｏｌｉＴＧ１の一晩培養物を、１００μｌまでのＬＢブロスを加えた溶離ファージミド粒子５０μｌに感染させた。３７℃で２０分間インキュベートした後、細胞をＬＡＡ平板上に広げた。３７℃で一晩インキュベートした後、コロニーをＬＢブロスに再懸濁し、プールした。プールした細胞をヘルパーファージＲ４０８に室温で２０分間感染させ、試料を５ｍｌのＬＢ軟寒天（０．５％寒天）と混合し、ＬＡ平板上に注いだ。一晩インキュベートした後、ファージミド粒子を抽出し、上述のようなもう一巡のパニングに供した。Ｅ−ｔａｇを発現しているクローンの富化およびｖＷＦに対する２回のパニングから得られたｃｆｕの増加を表２に示した。
【００６６】
（表２）

実施例１４：ｖＷＦ結合を発現しているＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓに由来するファージミドクローンＳｌｖＷ５の特異性
ＳｌｖＷ５のファージミドストック（図５）に、様々なタンパク質およびプラスチックに対するパニングを行った。結合特異性実験において、１００ｍｌのファージストック（１．３×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ）を未処理のマイクロタイターウェル（プラスチック）、および３０μｇ／ｍｌのフィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フォンビルブラント因子、ＩｇＧ、ＨＳＡまたはカゼインのいずれかでコートしたマイクロタイターウェルに対してパニングした。室温で２時間パニングを行った後、ウェルをＰＢＳ−Ｔでよく洗浄し、結合したファージミドを溶離して、上述のように溶離液のｃｆｕ／μｌを決定するためにＥ．ｃｏｌｉに感染させた。この実験の結果は表３に示されており、ＳｌｖＷ５がｖＷＦに結合する際に特異性を有することが示されている。
【００６７】
（表３）ファージストック（ＳｌｖＷ５）を固定化リガンドに対してパニ
ングした結果
【表１】

ａ　アンピシリンを添加したＬＡ平板上でのＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞の感染後のコロニー形成単位（ＣＦＵ）として求めた。
ｂ　数値は平均±標準偏差（３つの別個のマイクロタイターウェルからの６試料）
ｃ　非コーティングウェル
実施例１５：Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓファージディスプレイライブラリに由来するファージミドクローンのスクリーニングおよびシーケンシング
多数のｖＷＦ結合性クローン（図５）をさらなる研究のために選び、インサートのＤＮＡ配列を決定した。配列分析から、ｖＷＦ結合性をコードする異なる重複インサートが判明した。ヌクレオチド配列をさらに分析したところ、すべてのインサートはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいることが分かった。ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）プログラムを用いたコンピュータ検索で配列の相同性を解析したところ、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ由来のインサートはタンパク質Ａとも、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｖＷｂあるいはデータベース中の他のどの配列とも相同性がないことが分かった。さらに、様々なクローンのインサートを比較することにより、ｖＷＦ結合活性は、２４アミノ酸長配列（ＷＱＹＴＧＱＴＴＴＥＤＧＩＴＴＨＩＹＱＲＩＱＳＥ、配列番号：５）に相当する配列［図５、配列番号：１中のヌクレオチド１３４６〜１３６９］にマッピングされた。
【００６８】
実施例１６：Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ由来のｖＷＦ結合タンパク質をコードする遺伝子のクローニングとシーケンシング
推定ｖＷｆ結合タンパク質をコードする完全な遺伝子を単離するために、２３４２株の染色体ＤＮＡに対するサザンブロット分析を行った。ファージミドクローンＳｌｖＷ２（配列番号：２中のアミノ酸１３９２〜１４６０）をＰＣＲ手順中で標識し、プローブとして用いた。次に４ｋｂまでのＥｃｏＲＩ断片をｐＵＣ１８の対応部位にライゲーションした。配列解析の結果、染色体断片は遺伝子の３’末端を含むが５’末端を欠失していることが分かった。したがって、遺伝子の残りの部分を単離するめに、ＥｃｏＲＩインサートの５’末端から得た断片からなるプローブを用いて、追加のサザンブロット実験を行った。サザンブロット実験からの結果に基づいて、３．２ｋｂまでのＨｉｎｃＩＩ断片をｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にライゲーションし、インサートの配列を決定した。ＥｃｏＲＩ断片およびＨｉｎｃＩＩ断片のアライメントの結果、ＴＴＧコドン（ヌクレオチド２２〜２４、配列番号：１）で始まる６１８０ヌクレオチドの推定ＯＲＦが判明した。このＯＲＦの前には、開始コドンの上流の１０〜１７ヌクレオチドに位置する典型的なリボゾーム結合配列が存在する。ｖｗｂｌと呼ぶ遺伝子は、配列番号：２の２０６０個のアミノ酸からなるｖＷｂｌ（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）と呼ぶ推定タンパク質をコードする。ｖＷｂｌは推定シグナル配列を有し、最も可能性の高い切断部位は、アミノ酸位置４７と４８（配列番号：２）の間に位置する。提案されたシグナル配列に基づくと、成熟ｖＷｂｌは２０１３個のアミノ酸からなり、推定分子量は２６６ｋＤａである。シグナル配列に続いて、１２５５個のアミノ酸からなる「Ａ」と呼ぶ領域（図５を参照）が存在する。Ａ領域は他のタンパク質と明確な類似性を有しないが、ｖＷｂｌの１１３４〜１１３６位に位置する（配列番号：２）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）という興味深いモチーフを有しており、このモチーフは、いくつかの病原体の細胞表面タンパク質中だけでなく哺乳動物における多くのインテグリン結合タンパク質においても見つけられている。Ａ領域には、Ｒ１〜Ｒ１０と呼ぶ１０個の単位からなる反復領域が続き、該各単位は６７個のアミノ酸からなる（配列番号：７〜１６）。１０の反復単位のアライメントを行ったところ、これらの間に高い類似性が見られた（図４）。ｖＷｂｌのＣ末端部分は、グラム陽性細菌の細胞表面結合タンパク質において認められるいくつかの特徴的な特性を有している。
【００６９】
実施例１７：２４個のアミノ酸がｖＷｂｌにおける「最小」ｖＷｆ結合領域を構成する
パニング実験から得られた様々なファージイミドインサートのアライメントを行うことにより、ｖＷｆ結合領域をマッピングした。これは図５に模式的に示されている。ほとんどの反復単位のあいだで高い類似性が認められた（図４）にも関わらず、異なる３つのパニング実験で得られたインサートは、Ｒ２単位（図５中のＳｌｖＷ１−ＳｌｖＷ７）のＣ末端から構成されていた。アライメントに基づくと、ｖＷｂｌにおける「最小」ｖＷｆ結合領域は、ファージミドクローンＳｌｖＷ１およびＳｌｖＷ５から、１４１３〜１４３６位（配列番号：２）の範囲の２４個のアミノ酸からなることが分かった。しかしながら、追加パニング実験においては、パニング手順を変更した。ファージミド粒子を低ｐＨで溶離する代わりに、Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞をウェルに直接添加し、結合したファージミド粒子に感染させた後、細菌をＬＡＡ平板上で分子した。この結果、Ｒ２単位を含むクローンだけでなく、Ｒ５およびＲ６単位（図５中のＳｌｖＷ８）の部分を含むファージミド粒子が単離された。
【００７０】
実施例１８：ファージミドクローンＳｌｖＷ５はｖＷｆに特異的に結合し、結合は領域Ｒ１〜Ｒ３を含む組み換えタンパク質によって阻害される
ｖＷｆに対するｖＷｂｌの結合性を調べるために、ＳｌｖＷ５に由来するファージストックを作成した。ファージストックを７種の宿主タンパク質および非コートマイクロタイターウェルに対して個別にパニングした。この検定に用いたタンパク質は、ｖＷｆ、Ｆｇ、フィブロネクチン、ＩｇＧ、ビトロネクチン、ＨＳＡおよびトロンボスポンジンであった。このアッセイにおいて、ｖＷｆには他のタンパク質に比べて約１０００倍以上のファージミド粒子が結合した（表３）。阻害アッセイにおいては、Ａ領域のＣ末端と反復単位Ｒ１〜Ｒ３（配列番号：２の１２４７〜１５０３位）からなる、ｖＷｂｌｒ３と呼ばれる精製組み換えタンパク質とともに、上記と同じファージストックを使用した。ｖＷｂｌｒ３は、ファージストックの添加前にｖＷｆでコートしたマイクロタイタープレート中でインキュベートした。図６に示したように、ファージ結合は、対照の約９５％阻害された。
【００７１】
実施例１９：Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの臨床分離株は、ｖｗｂｌまたはｖｗｂｌのような遺伝子を有する
Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの臨床分離株のあいだでのｖｗｂｌ遺伝子の分布を調べるために、染色体ＤＮＡを２３４２株および同一種の他の１１の株（Ｇ５−８７，Ｇ２−８９，Ｇ１６−８９，Ｇ６−８７，Ｇ５８−８８，Ｇ６６−８８，Ｇ３Ａ，ＳÅ，４９／９０，４９／９１，Ａ２５１）から精製し、サザンブロット分析に用いた。ＤＮＡ調製物をＥｃｏＲＩで消化し、Ｒ１〜Ｒ１０をカバーする精製ＰＣＲ産物によるサザンブロットで検証した。すべての株はこのプローブと反応した断片を有することが分かった。さらに、各ＤＮＡ試料において、反復領域のすぐ上流および下流の配列に基づいたプライマーを用いてＰＣＲを行った。断片は１０〜１２個の株で増幅された。興味深いことに、ＰＣＲ産物の大きさはまちまちで、ｖｗｂｌにおける多数の反復単位がＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの株の間で異なっていることが分かった。したがって、１０の株は得られたＰＣＲ断片の大きさによって４つの群に分けることができた。
【００７２】
文献
【００７３】
【外１】

【外２】

【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ｖＷｂタンパク質の模式図と、組み換えｖＷｆに対してＳ．ａｕｒｅｕｓファージディスプレイライブラリをパニングした後に得られた様々なファージミドクローンから単離された対応遺伝子ｖＷｂに由来するインサートのアライメントを示した図である。
【図２】
図２は、ｖＷＦ結合ドメインを表しているファージミド粒子を用いた結合実験を示す。
【図３】
図３は、ｖＷＦ結合ドメインを表しているファージミド粒子を用いた阻害実験を示す。
【図４】
図４はｖＷｂｌのＲ部位における１０個の反復単位（Ｒ１〜Ｒ１０）のアライメントを示す。
【図５】
図５はｖＷｂｌの模式図と、ｒｖＷｆに対するパニング後に得られたファージミドクローン由来のインサートのアライメントを示す。
【図６】
図６は、組み換え構築物ｖＷｂｌ３ｒによる、固定化ｒｖＷｆへのファージミド（ＳｌｖＷ５）粒子の結合の阻害を示す。

Claims

ブドウ球菌に由来するフォンビルブラント因子結合タンパク質またはポリペプチド。
ブドウ球菌が、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）およびスタフィロコッカス・ルグドネンシス（Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　Ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質またはペプチド。
配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：５〜１７、ならびにそれらの部分からなる抗原決定基からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する請求項２に記載のタンパク質またはペプチド。
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＤＮＡ分子。
配列番号：１、配列番号：３と、配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：５〜１７、ならびにそれらの部分からなる抗原決定基からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質およびペプチドをコードするヌクレオチド配列と、からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の組み換えＤＮＡ分子。
請求項４または５に記載のＤＮＡ分子を含むプラスミド、ファージ、またはファージミド。
請求項４または５に記載の少なくとも１つの組み換えＤＮＡ分子、または請求項６に記載の少なくとも１つのプラスミド、ファージまたはファージミドを含む微生物。
フォンビルブラント因子結合タンパク質またはそのポリペプチドの製造方法であって、
−微生物中に請求項４または５に記載の少なくとも１つの組み換えＤＮＡ分子を導入する工程と、
−前記微生物を適切な培地中で培養する工程と、
−上記のように産生されたタンパク質をクロマトグラフィによる精製によって単離する工程とを含む方法。
フォンビルブラント因子結合タンパク質またはそのポリペプチドの製造方法であって、
−請求項１または２に記載の少なくとも１つの組み換えタンパク質をファージ粒子上で発現させて、フォンビルブラント因子結合活性を示すファージ粒子を生産する工程を含む方法。
表面へのブドウ球菌の付着を阻害する方法であって、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１３に記載の抗体を、前記ブドウ球菌を含む培地中に添加することを含む方法。
ブドウ球菌は、スタフィロコッカス・ルグドネンシスおよびスタフィロコッカス・アウレウスから選べることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
固定化された、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質またはペプチド。
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体。
請求項１〜３および１２のいずれか１項に記載のタンパク質またはペプチドを含むイムノゲン。
請求項１２に記載の固定化タンパク質を用いたクロマトグラフィーを含む、複合溶液からのフォンビルブラント因子の精製方法。
請求項１〜３および１２のいずれか１項に記載のタンパク質またはペプチドを用いる工程を含む、複合溶液中のフォンビルブラント因子の有無の判定方法。