JPH10313877A - 新規化合物 - Google Patents

新規化合物

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JPH10313877A
JPH10313877A JP10041998A JP4199898A JPH10313877A JP H10313877 A JPH10313877 A JP H10313877A JP 10041998 A JP10041998 A JP 10041998A JP 4199898 A JP4199898 A JP 4199898A JP H10313877 A JPH10313877 A JP H10313877A
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JP
Japan
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polynucleotide
polypeptide
histidine kinase
ile
sequence
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JP10041998A
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Nicola Gail Wallis
ニコラ・ゲイル・ウォリス
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SmithKline Beecham Ltd
SmithKline Beecham Corp
Original Assignee
SmithKline Beecham Ltd
SmithKline Beecham Corp
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Publication date
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    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/12Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1223Phosphotransferases with a nitrogenous group as acceptor (2.7.3)
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒスチジンキナーゼポリペブチドおよびこれ
をコードしているポリヌクレオチド、組換え技術による
かかるポリペプチドの生産方法ならびに抗生物化合物に
ついてスクリーニングするためのこれらの利用方法の提
供。 【解決手段】 配列番号2のアミノ酸1〜861からな
るポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドと少
なくとも70%同一性を有するポリヌクレオチド;前記
ポリヌクレオチドと相補的であるポリヌクレオチド;お
よび前記のいずれかのポリヌクレオチドの少なくとも1
5個の連続塩基からなるポリヌクレオチドからなる群か
ら選択されるポリヌクレオチド配列からなる単離ポリヌ
クレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、新しく同定された
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、その製造および
使用、ならびにその変種、作用薬および拮抗薬、および
その使用に関する。特に、これらに関して、および他に
関して、本発明は、以下に「ヒスチジンキナーゼ」と称
されるヒスチジンキナーゼファミリーの新規ポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドに関する。
【0002】
【従来の技術】抗生物質の開発のための標的としてスタ
フィロコッカス遺伝子および遺伝子生産物を用いるのが
特に好ましい。スタフィロコッカス属は、医学的に重要
な微生物の属を形成する。それらは、侵入的疾患および
毒素原性疾患の2つのタイプを生じることが知られてい
る。侵入的感染は、一般的に、皮膚表面および深層組織
の両方に影響を及ぼす膿瘍形成により特徴付けられる。
スタフィロコッカス・アウレウス(S. aureus)は、癌
患者における菌血症の二次的誘導原因である。骨髄炎、
敗血症性関節炎、敗血症性血栓性静脈炎および急性細菌
性心内膜炎もまた、比較的一般的である。スタフィロコ
ッカス属の毒素原性により得られる少なくとも3つの臨
床症状がある。これらの疾患の発現は、組織侵入および
菌血症とは対照的に外毒素の作用により生じる。これら
の症状としては、スタフィロコッカス食中毒、熱傷様皮
膚症候群およびトキシックショック症候群が挙げられ
る。スタフィロコッカス・アウレウス感染症の頻度は、
過去20年間に劇的に上昇してきた。これは、多抗生物
質耐性菌の出現および弱められた免疫系を有する人口の
増加に帰するものであった。標準的な抗生物質のいくつ
かまたは全てに対して耐性のあるスタフィロコッカス・
アウレウス菌株を単離することは、もはやまれなことで
はない。これにより、新しい抗微生物剤およびこの微生
物についての診断試験の両方の需要が生じた。
【0003】細菌において多くの二成分シグナル変換系
(TCSTS)が同定された(Stock, J. B., Ninfa,
A. J. & Stock, A. M. (1989) Microbiol. Rev. 53, 45
0-490)。これらは、細菌の環境をモニターし、その環
境の変化に適応する該細菌の能力に関係している。これ
らの細菌TCSTSのいくつかは、宿主内でのビルレン
スおよび細菌病原に関係している。
【0004】ヒスチジンキナーゼは、ヒスチジン残基で
自己リン酸化するTCSTSの成分である。次いで、リ
ン酸基をコグネート反応レギュレーター(cognate resp
onseregulator)に移動する。ヒスチジンキナーゼは、
5つの短い保存されたアミノ酸配列を有する(Stock,
J. B., Ninfa, A. J. & Stock, A. M. (1989) Microbio
l. Rev. 53, 450-490, Swanson, R. V., Alex, L. A. &
Simon, M. I. (1994)TIBS 19 485-491)。これらは、
保存されたアスパラギン残基により約100残基後に続
くリン酸化されているヒスチジン残基である。別の15
〜45残基後に、DXGXGモチーフが見られ、別の1
0−20残基の後にFXXFモチーフが続く。別のグリ
シンモチーフGXG上にさらに10−20残基が見られ
る。2つのグリシンモチーフは、ヌクレオチド結合に関
係していると考えられる。ヒスチジンキナーゼのこのフ
ァミリーとしては、リゾビウム・メリロチ(Rhizobium
meliloti)由来のFixLタンパク質が挙げられる。Fi
xLは、酸素濃度を感知することに関係しているFix T
CSTSのヒスチジンキナーゼである(David, M., Dav
eran M.-L., Batut J., Dedieu A., Domergue O., Ghai
J., Hertig C., Boistard P. & Kahn D. (1988), Cell
54:671-683)。
【0005】反応レギュレーターは、TCSTSの成分
である。これらのタンパク質は、ヒスチジンキナーゼか
らリン酸化され、次いで、リン酸化後、しばしば活性化
されるDNA結合ドメインを介して、該反応に影響を及
ぼす。該反応レギュレーターは、約100アミノ酸の保
存N−末端ドメインにより特徴付けられる。反応レギュ
レーターのN−末端ドメイン、およびChe Yにおける
残基D12、D13、D57、T87、T109(Mats
umuta, P., Rydel, J. J., Linzmeier, R. & Vacante,
D. (1984) J. Bacteriol. 160, 36-41)に対応する保持
している5つの機能的に重要な残基は、保存された構造
的特徴を有する(Volz, K. (1993) Biochemistry 32,
11741-11753)。サルモネラ・ティフィムリウム(Salm
onella typhimurium)由来のChe Yの三次元構造(Sto
ck, A. M., Mottonen, J. M., Stock, J. B. & Schutt,
C. E. (1989) Nature, 337, 745-749)およぴエシェリ
キア・コリ(Escherichia coli)由来のChe Yの三次
元構造(Volz, K. & Matsumura, P. (1991) J. Biol. C
hem. 266, 15511-15519)ならびにサルモネラ・ティフ
ィムリウム由来の窒素調節タンパク質CのN−末端ドメ
イン(Volkman, B.F., Nohaile, M. J., Amy, N. K., K
ustu, S. & Wemmer, D. E. (1995) Biochemistry, 34 1
413-1424)は、利用可能であり、バシラス・サチリス
(Bacillus subtilis)由来のSpoOFの二次元構造
(Feher, V. A., Zapf, J. W., Hoch, J.A., Dahlquis
t, F. W., Whiteley, J. M. & Cavanagh, J. (1995) Pr
otein Science, 4, 1801-1814)も同様に利用可能であ
る。これらの構造は、(a/b)5折り畳みを有する。い
くつかの構造残基は、異なる反応レギュレーター配列
間、特にa−ヘリックスからのβ−シート疎水性核およ
び側鎖内の疎水性残基間で保存されている。
【0006】TCSTSにより調節されたプロセスの1
つには、ビルレンスファクター、運動性、抗生物耐性お
よび細胞複製の生産である。TCSTSタンパク質の阻
害薬は、細菌が病原について必要なファクターを生産す
ることから予防することにより細菌が宿主の感染を樹立
し維持することから予防し、これにより、抗菌療法にお
いて利用性を有するであろう。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】明らかに、抗生物活性
について化合物をスクリーニングするのに有用であると
いう利益を有する本発明の新規化合物のようなファクタ
ーが必要とされている。また、かかるファクターを用い
て、感染症、機能不全および疾患の病原におけるそれら
の役割を決定してもよい。かかるファクター、ならびに
感染症、機能不全または疾患の予防、改善または矯正に
おける役割を果たすことができるそれらの拮抗薬および
作用薬の同定および特徴付けもまた必要とされている。
本発明のポリペプチドは、公知のイー・コリ(E. col
i)KdpDヒスチジンキナーゼタンパク質に対するアミ
ノ酸配列相同性を有する。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明は、図5[配列番
号2]に示されたアミノ酸とイー・コリKdpDヒスチジ
ンキナーゼタンパク質などの他のタンパク質の公知のア
ミノ酸配列との間の相同性により新規ヒスチジンキナー
ゼポリペプチドと同定されたポリペプチドを提供するも
のである。さらに、本発明は、ヒスチジンキナーゼポリ
ペプチドをコードしているポリヌクレオチド、特に、本
明細書においてヒスチジンキナーゼと称されるポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチドを提供するもの
である。
【0009】本発明のこの態様の特に好ましい具体例で
は、ポリヌクレオチドは、図1〜図4[配列番号1]に
示される配列からなるヒスチジンキナーゼポリペプチド
をコードしている領域、またはその変種からなる。本発
明の別の特に好ましい具体例では、図5[配列番号2]
に示されるアミノ酸配列からなるスタフィロコッカス・
アウレウス由来の新規ヒスチジンキナーゼタンパク質、
またはその変種がある。
【0010】本発明のこの態様によると、NCIMB受
託番号40771に含まれるスタフィロコッカス・アウ
レウスWCUH 29菌株により発現可能な成熟ポリペ
プチドをコードしている単離核酸分子が提供される。本
発明の別の態様によると、mRNA、cDNA、ゲノム
DNAを含む、ヒスチジンキナーゼ、特にスタフィロコ
ッカス・アウレウスのヒスチジンキナーゼをコードして
いる単離核酸分子が提供される。さらに、本発明の具体
例は、その生物学的、診断学的、予防学的、臨床学的ま
たは治療学的に有用な変種、およびこれを含有してなる
組成物を含む。
【0011】本発明の別の態様によると、治療目的また
は予防目的、特に遺伝的免疫化のための本発明のポリヌ
クレオチドの使用が提供される。本発明のこの態様の特
に好ましい具体例の1つは、ヒスチジンキナーゼの天然
対立遺伝子変種およびそれによりコードされたポリペプ
チドである。本発明の別の態様によると、本明細書にお
いてヒスチジンキナーゼと称されるスタフィロコッカス
・アウレウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学的、
診断学的、予防学的、臨床学的または治療学的に有用な
その変種、およびそれを含有してなる組成物が提供され
る。
【0012】本発明のこの態様の特に好ましい具体例の
1つは、ヒスチジンキナーゼ遺伝子の天然対立遺伝子に
よりコードされているヒスチジンキナーゼポリペプチド
の変種である。本発明のこの態様の好ましい具体例で
は、前記ヒスチジンキナーゼポリペプチドの製造方法が
提供される。
【0013】本発明のさらに別の態様によると、例えば
抗体を含む、抗菌剤として有用なかかるポリペプチドに
対する阻害剤が提供される。
【0014】本発明のこの態様のある好ましい具体例に
よると、ヒスチジンキナーゼ発現をし、例えば、上気道
の感染症(例えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋
炎、甲状腺炎)、下気道の感染症(例えば、蓄膿症、肺
膿瘍)、心臓の感染症(例えば、感染性心内膜炎)、胃
腸の感染症(例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿
瘍)、CNSの感染症(例えば、脳膿瘍)、目の感染症
(例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔お
よび眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎臓および尿道の感染症
(例えば、副睾丸炎、腎臓内および腎周囲膿瘍、トキシ
ックショック症候群)、皮膚の感染症(例えば、膿痂
疹、毛包炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、傷感染、細菌性筋
炎)、骨および関節の感染症(例えば、敗血症性関節
炎、骨髄炎)などの疾患を治療し、遺伝的変異をアッセ
イし、生物にヒスチジンキナーゼポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドを投与して細菌、特にスタフィロコッカ
ス・アウレウス細菌に対する免疫学的応答を生じさせる
ための生産物、組成物および方法が提供される。
【0015】本発明のこの態様および他の態様のある好
ましい具体例によると、ヒスチジンキナーゼポリヌクレ
オチド配列に、特にストリンジェント条件下で、ハイブ
リダイズするポリヌクレオチドが提供される。本発明の
ある好ましい具体例では、ヒスチジンキナーゼポリペプ
チドに対する抗体が提供される。
【0016】本発明のさらに別の態様によると、好まし
くは静菌性または殺菌性の作用薬および拮抗薬でもある
ヒスチジンキナーゼ作用薬および拮抗薬が提供される。
本発明の別の態様では、細胞または多細胞生物への投与
のためのヒスチジンキナーゼポリヌクレオチドまたはヒ
スチジンキナーゼポリペプチドを含有してなる組成物が
提供される。本発明の精神および範囲内の種々の変化お
よび変更は、本明細書の以下の説明および他の部分によ
り当業者に容易に明らかになるであろう。
【0017】用語解説 以下の定義は、本明細書でしばしば用いられる用語の理
解を容易にするために与えられる。「宿主細胞」は、外
因性ポリヌクレオチド配列によって形質転換されたかも
しくはトランスフェクトされたか、または、外因性ポリ
ヌクレオチド配列による形質転換もしくはトランスフェ
クション能を有する細胞である。
【0018】当該技術分野で知られているとおり、「同
一性」は、配列を比較することにより決定される、2つ
以上のポリペプチド配列間または2つ以上のポリヌクレ
オチド配列間の関係である。当該技術分野において、
「同一性」は、また、場合により配列のストリング間の
適合によって決定されることもある、ポリペプチド配列
間またはポリヌクレオチド配列間の配列の関連度をも表
わす。「同一性」および「類似性」は、限定されないが
以下の文献に開示されている方法を含む公知の方法によ
り容易に算出することができる(Computational Molecu
lar Biology, Lesk, A. M. 編, Oxford University Pre
ss, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and
Genome Projects, Smith, D. W. 編, Academic Press,
New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,
Part I, Griffin, A. M. and Griffin, H. G. 編, Hum
ana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in
Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press,
1987;および Sequence Analysis Primer, Gribskov,
M. and Devereux, J. 編, M Stockton Press, New Yor
k, 1991;およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM
J. Applied Math., 48:1073 (1988))。同一性を決定す
るための好ましい方法は、試験された配列間で最大適合
を与えるように設計される。同一性および類似性を決定
するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプロ
グラムにおいて体系化される。2つの配列間の同一性お
よび類似性を決定するための好ましいコンピュータプロ
グラム法としては、限定されないが、GCGプログラム
パッケージ(Devereux, J. ら, Nucleic Acids Researc
h 12(1): 387 (1984))、BLASTP、BLASTN
およびFASTA(Atschul, S. F. ら, J. Molec. Bio
l. 215:403-410 (1990))が挙げられる。BLAST X
プログラムは、NCBIおよび他の供給源から公的に入
手可能である(BLAST Manual, Altschul, S. ら, NCBI
NLM NIH Bethesda, MD 20894;Altshul, S. ら, J. Mo
l. Biol. 215: 403-410 (1990))。
【0019】「単離された」は、その自然状態から「ヒ
トの手によって」変えられたこと、すなわち、自然に生
じる場合は、その初期の環境から変化したかまたは取り
出されたこと、またはその両方を意味する。例えば、生
きている生物中に自然に存在するポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは、「単離されて」いないが、その自然
状態の共存物質から分離された同ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは、本明細書で用いられるように「単離
されて」いる。
【0020】「ポリヌクレオチド」は、一般に、非修飾
RNAもしくはDNAまたは修飾RNAもしくはDNA
であるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌ
クレオチドを表わす。「ポリヌクレオチド」としては、
限定されないが、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖お
よび二本鎖領域または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域
の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、な
らびに、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるRN
A、一本鎖もしくは典型的には二本鎖または三本鎖領域
であるか、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるDN
AおよびRNAからなるハイブリッド分子が挙げられ
る。さらに、本明細書で用いられるポリヌクレオチド
は、RNAもしくはDNAまたはRNAおよびDNAの
両方からなる三本鎖領域を表わす。かかる領域における
鎖は、同一分子由来のものであっても異なる分子由来の
ものであってもよい。該領域は、1つ以上の分子の全て
を含んでもよいが、より典型的には、いくつかの分子の
領域のみを含む。三本鎖ヘリックス領域の分子の1つ
は、しばしば、オリゴヌクレオチドである。本明細書で
用いる場合、「ポリヌクレオチド」なる用語はまた、1
つ以上の修飾塩基を含有する前記DNAまたはRNAを
も含む。したがって、安定性のためまたは他の理由のた
めに修飾された主鎖を有するDNAまたはRNAは、本
明細書で意図される「ポリヌクレオチド」である。さら
にまた、二例だけ挙げるとイノシンなどの一般的ではな
い塩基またはトリチル化塩基などの修飾塩基からなるD
NAまたはRNAは、本明細書で用いられるポリヌクレ
オチドである。当業者に知られている多くの有用な目的
に役立つ非常に様々な修飾がDNAおよびRNAに対し
て行われたことは、認められるであろう。本明細書で用
いる場合、「ポリヌクレオチド」なる用語は、ポリヌク
レオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形
態、ならびに、ウイルスおよび例えば単純型細胞および
複雑型細胞を含む細胞のDNAおよびRNA特徴の化学
的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしば
オリゴヌクレオチドと称される短いポリヌクレオチドを
包含する。
【0021】「ポリペプチド」は、お互いにペプチド結
合または修飾されたペプチド結合によって連結された2
つ以上のアミノ酸からなるペプチドまたはタンパク質を
表わす。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴ
ペプチドおよびオリゴマーと称される短い鎖と、一般に
タンパク質と称される長い鎖との両方を表わす。ポリペ
プチドは、20遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸
を含有する。「ポリペプチド」は、プロセシングおよび
他の翻訳後修飾などの自然のプロセスによるか、また
は、化学的修飾技術によって修飾されたものを含む。か
かる修飾は、基本書、より詳述された研究論文、ならび
に多数の研究文献によく開示されており、それらは、当
業者によく知られている。同一タイプの修飾は、所定の
ポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じかまたは変
動する度合いで存在すると思われる。また、所定のポリ
ペプチドは、多くのタイプの修飾を含んでもよい。修飾
は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカ
ルボキシル末端を含むペプチドのいずれの場所で生じる
こともできる。修飾としては、例えば、アセチル化、ア
シル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共
有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌ
クレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の
共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架
橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共
有架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタマー
トの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、糖鎖
形成、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素
化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解
プロセシング、リン酸化、フェニル化、ラセミ化、糖鎖
形成、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−
カルボキシル化、ヒドロキシル化およびADP−リボシ
ル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなア
ミノ酸のタンパク質へのトランスファー−RNA媒介添
加、ならびに、ユビキチン化が挙げられる。例えば、PR
OTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 第2
版, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Ne
w York (1993) および Wold, F., Posttranslational P
rotein Modifications: Perspectives andProspects,
第1-12頁 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATIO
N OF PROTEINS, B. C. Johnson 編, Academic Press, N
ew York (1983);Seifterら, Meth.Enzymol. 182:626-6
46 (1990) および Rattanら, Protein Synthesis: Post
translational Modifications and Aging, Ann. N. Y.
Acad. Sci. 663:48-62 (1992) を参照。ポリペプチド
は、分枝鎖状であるか、または、分枝鎖を有するかもし
くは有しない環状である。環状、分枝鎖状および分枝鎖
環状ポリペプチドは、翻訳後自然プロセスにより生じ、
同様に、全合成法により製造される。
【0022】本明細書で用いる場合、「変種」は、各々
参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、
本質的な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変種
は、もう1つの参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド
配列において異なる。変種のヌクレオチド配列の変化
は、参照ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプ
チドのアミノ酸配列を変化させる場合も変化させない場
合もある。ヌクレオチド変化により、以下に記載すると
おり、参照配列によりコードされたポリペプチドにおい
てアミノ酸置換、付加、欠失、融合およびトランケーシ
ョン生じる。ポリペプチドの典型的な変種は、もう1つ
の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列において異なる。
一般に、差異は、参照ポリペプチドおよび変種の配列が
全体的に密接に類似しており、多くの領域において同一
であるように制限される。変種および参照ポリペプチド
は、1つ以上の置換、付加、欠失の組み合わせによりア
ミノ酸配列において異なる。置換されたか挿入されたア
ミノ酸は、遺伝暗号によりコードされたものであっても
なくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの
変種は、対立遺伝子変種のように自然のものであるか、
または、自然に生じることが知られていない変種であっ
てもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天
然変種は、突然変異誘発技術により、直接合成により、
および、当業者に知られている他の組換え法により行わ
れる。
【0023】本発明は、以下に詳述する新規ヒスチジン
キナーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関す
る。特に、本発明は、イー・コリKdpDヒスチジンキナ
ーゼポリペプチドとのアミノ酸配列相同性により関係付
けられる、スタフィロコッカス・アウレウスの新規ヒス
チジンキナーゼ遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドに関する。本発明は、特に、各々図1〜図4[配
列番号1]に記載されているヌクレオチド配列および図
5[配列番号2]に記載されているアミノ酸配列を有す
るヒスチジンキナーゼ、ならびに、NCIMB受託番号
40771において寄託されたDNAのヒスチジンキナ
ーゼヌクレオチド配列およびこれによりコードされたア
ミノ酸配列に関する。
【0024】寄託物質 スタフィロコッカス・アウレウス WCUH 29菌株を
含有する寄託物は、スコットランド、アバーディーン・
エイビー2・1アールワイ、セント・マチャー・ドライ
ブ23番のナショナル・コレクションズ・オブ・インダ
ストリア・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド
(National Collections of Industrial and Marin
e Bacteria Ltd.、NCIMB)に1995年9月1
1日に寄託され、NCIMB受託番号40771を割り
当てられた。スタフィロコッカス・アウレウス菌株寄託
物は、本明細書では、「寄託菌株」または「寄託菌株の
DNA」と称される。寄託物質は、全長ヒスチジンキナ
ーゼDNAを含有する菌株であり、受託により「NCI
MB 40771」と称される。寄託物質に含有された
ポリヌクレオチドの配列およびこれによりコードされた
ポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の配列の記載
と矛盾している場合には制御している。
【0025】寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約の約定下に行われた。該
菌株は、変更不可能であり、特許の発行により無制限ま
たは無条件に公衆に放出されるであろう。寄託は、単に
当業者に都合のよいように提供されるものであり、35
U.S.C. §112の下に要求されることなどの寄託
が認可のために必要とされていることを承認するもので
はない。寄託物質を作成し、使用し、または販売するた
めにはライセンスが必要であり、かかるライセンスは、
これにより承諾されるものではない。
【0026】ポリペプチド 本発明のポリペプチドは、図5[配列番号2]に記載さ
れているポリペプチド(特に、成熟ポリペプチド)およ
びポリペプチドおよびフラグメント、特に、ヒスチジン
キナーゼの生物学的活性を有するもの、および図5[配
列番号2]に記載されているポリペプチドに少なくとも
70%同一性を有するものまたは関連部分、好ましく
は、図5[配列番号2]に記載されているポリペプチド
に少なくとも80%同一性を有するもの、好ましくは、
図5[配列番号2]に記載されているポリペプチドに少
なくとも90%類似性(より好ましくは、少なくとも9
0%同一性)を有するもの、さらに好ましくは、図5
[配列番号2]に記載されているポリペプチドに少なく
とも95%類似性(さらに好ましくは、少なくとも95
%同一性)を有するものを含み、一般的少なくとも30
アミノ酸、より好ましくは少なくとも50アミノ酸を含
有するポリペプチドのかかる部分を有するかかるポリペ
プチドの一部をも含む。
【0027】フラグメントは、前記ポリペプチドのアミ
ノ酸配列の全部ではないが一部と全体的に同一であるア
ミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ヒスチジ
ンキナーゼポリペプチドに関して、フラグメントは、
「フリー−スタンディング」であるか、または、それら
が一部または領域を、最も好ましくは、単一の連続領域
として単一の大きなポリペプチドを形成する大きなポリ
ペプチド内で構成される。
【0028】好ましいフラグメントとしては、例えば、
図5[配列番号2]に記載されるアミノ酸配列の一部を
有するトランケーションポリペプチド、または、アミノ
末端を含む残基の連続シリーズまたはカルボキシル末端
を含む残基の連続シリーズなどのその変種が挙げられ
る。宿主細胞、特にスタフィロコッカス・アウレウスに
おける本発明のポリペプチドの分解形態もまた好まし
い。アルファ−ヘリックスおよびアルファ−ヘリックス
形成領域、ベータ−シートおよびベータ−シート形成領
域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル
形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ両親媒性
領域、ベータ両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領
域、基質結合領域、ならびに高抗原性インデックス領域
からなるフラグメントなどの構造的または機能的属性に
より特徴付けられたフラグメントもまた好ましい。
【0029】類似の活性もしくは改良された活性を有す
るかまたは減少した望ましくない活性を有するものを含
む、ヒスチジンキナーゼの活性を媒介するこれらのフラ
グメントである生物学的活性フラグメントもまた好まし
い。動物において、特にヒトにおいて、抗原性または免
疫原性であるこれらのフラグメントも含まれる。特に好
ましくは、スタフィロコッカス・アウレウスの生存率の
ために必須の機能を与えるか、または、個体、特にヒト
における疾患の原因を維持する酵素のレセプタまたはド
メインからなるフラグメントである。
【0030】本発明のポリペプチドのフラグメントであ
る変種は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチ
ドを生産するために用いられる;したがって、これらの
変種は、全長ポリペプチドを生産するための中間体とし
て用いられる。
【0031】ポリヌクレオチド 本発明の別の態様は、図5[配列番号2]に記載されて
いる推定アミノ酸配列を有するヒスチジンキナーゼポリ
ペプチドをコードしている単離ポリペプチドならびにそ
れに密接に関係しているポリヌクレオチドおよびその変
種に関する。図1〜図4[配列番号1]に記載されてい
るポリヌクレオチド配列などの本明細書で提供される情
報を用いて、ヒスチジンキナーゼポリペプチドをコード
している本発明のポリヌクレオチドは、出発物質として
スタフィロコッカス・アウレウス WCUH 29細胞を
用いて細菌から染色体DNAフラグメントをクローニン
グして配列決定し、次いで、全長クローンを得るための
方法などの標準的なクローニングおよびスクリーニング
法を用いて得られる。例えば、図1〜図4[配列番号
1]に記載されている配列などの本発明のポリヌクレオ
チド配列を得るために、典型的には、イー・コリ(E.
coli)またはいくつかの他の適切な宿主におけるスタフ
ィロコッカス・アウレウス WCUH 29の染色体DN
Aのクローンのライブラリーを、部分配列から誘導され
た放射性標識オリゴヌクレオチド、好ましくは17量体
以上のものでプローブする。次いで、ストリンジェント
条件を用いて、プローブのものと同一のDNAを担持し
ているクローンを区別することができる。このようにし
て同定された個々のクローンを、オリジナル配列から設
計された配列決定プライマーを用いて配列決定すること
により、両方向に配列を伸長させて、全遺伝子配列を決
定することが可能である。好都合には、かかる配列決定
は、プラスミドクローンから調製された変性された二本
鎖DNAを用いて行われる。適切な技術は、Maniatis,
T., Fritsch, E. F. および Sambrookら, MOLECULAR CL
ONING, A LABORATORY MANUAL, 第2版;Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yor
k (1989) に開示されている(特に、Screening By Hybr
idization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Str
anded DNA Templates 13.70を参照)。
【0032】本発明の説明では、図1〜図4[配列番号
1]に記載されているポリヌクレオチドは、スタフィロ
コッカス・アウレウス WCUH 29から誘導されたD
NAライブラリーにおいて発見された。図1〜図4[配
列番号1]に記載されているDNA配列は、当該技術分
野でよく知られているアミノ酸残基分子量値を用いて算
出することができる推定分子量を有する図5[配列番号
2]に記載されているアミノ酸残基の数をほぼ有するタ
ンパク質をコードしているオープンリーディングフレー
ムを含有している。本発明のヒスチジンキナーゼは、寄
託された菌株のヒスチジンキナーゼをコードしているD
NAの配列決定の結果により示されるように、ヒスチジ
ンキナーゼファミリーの他のタンパク質に構造的に関係
している。該タンパク質は、公知のタンパク質のうちイ
ー・コリKdpDヒスチジンキナーゼタンパク質に対して
最大の相同性を示す。図5[配列番号2]のヒスチジン
キナーゼは、イー・コリKdpDヒスチジンキナーゼポリ
ペプチドのアミノ酸配列と全長にわたって約27%同一
性を有する。
【0033】本発明は、図1〜図4[配列番号1]にお
けるコード化配列に全長にわたって同一であるポリヌク
レオチド配列を提供するものである。また、本発明によ
り、成熟ポリペプチドまたはそのフラグメントについて
のコード化配列、他のコード化配列を有するリーディン
グフレームにおける成熟ポリペプチドまたはそのフラグ
メントについてのコード化配列、例えば、リーダー配列
または分泌配列、プレ−またはプロ−またはプレプロ−
タンパク質配列をコードしているものなども提供され
る。ポリヌクレオチドは、また、非コード化5'および
3'配列に限定されないが、転写された非翻訳配列、終
止シグナル、リボゾーム結合部位、mRNAを安定化す
る配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、および
さらなるアミノ酸をコードしているさらなるコード化配
列などの非コード化配列も含有する。例えば、融合ポリ
ペプチドの精製を促進するマーカー配列をコードするこ
とができる。本発明のある具体例では、マーカー配列
は、pQEベクター(キアジェン,インコーポレイテッ
ド(Qiagen, Inc.))において提供されるようなヘキ
サ−ヒスチジンペプチド(Gentz ら, Proc. Natl. Aca
d. Sci., USA 86: 821-824(1989))またはHA tag(Wi
lson ら, Cell 37: 767 (1984))である。本発明のポリ
ヌクレオチドとしては、限定されないが、構造遺伝子お
よび遺伝子発現を制御するその天然関連配列からなるポ
リヌクレオチドガ挙げられる。
【0034】本明細書で用いる場合、「ポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチド」なる用語は、本発明
のポリペプチド、特に細菌ポリペプチド、特に図5[配
列番号2]に記載されているアミノ酸を有するスタフィ
ロコッカス・アウレウスのヒスチジンキナーゼのポリペ
プチドをコードしている配列を含むポリヌクレオチドを
包含する。該用語は、コード化および/または非コード
化配列を含有していてもよいさらなる領域と一緒に(例
えば、組み込まれたファージもしくは挿入配列により中
断されているか、または修正している)ポリペプチドを
コードしている単一の連続領域または不連続領域を含む
ポリヌクレオチドをも包含する。
【0035】本発明は、さらに、図5[配列番号2]に
記載されている推定アミノ酸配列を有するポリペプチド
の変種をコードしている本明細書に記載されているポリ
ヌクレオチドの変種に関する。本発明のポリヌクレオチ
ドのフラグメントである変種を用いて、本発明の全長ポ
リヌクレオチドを合成してもよい。
【0036】さらに、特に好ましい具体例は、数個、多
少、5〜10、1〜5、1〜3、2、1または0個のア
ミノ酸残基が置換、欠失または付加を組み合わせてなさ
れている図5[配列番号2]のヒスチジンキナーゼポリ
ペプチドのアミノ酸配列を有するヒスチジンキナーゼ変
種をコードしているポリヌクレオチドである。これらの
うち、サイレト置換、付加および欠失が特に好ましい。
【0037】本発明のさらに好ましい具体例は、図5
[配列番号2]に記載されているアミノ酸配列を有する
ヒスチジンキナーゼポリペプチドをコードしているポリ
ヌクレオチドと全長にわたって少なくとも70%同一の
ポリヌクレオチド;およびかかるポリヌクレオチドと相
補的なポリヌクレオチドである。別法としては、寄託さ
れた菌株のヒスチジンキナーゼポリペプチドをコードし
ているポリヌクレオチドと全長にわたって少なくとも8
0%同一である領域からなるポリヌクレオチドおよびそ
れと相補的なポリヌクレオチドがさらに非常に好まし
い。これに関して、同ポリヌクレオチドと全長にわたっ
て少なくとも90%同一であるポリヌクレオチドは、特
に好ましく、これらの特に好ましいポリヌクレオチドの
うち、少なくとも95%を有するものが特に好ましい。
さらにまた、少なくとも95%を有するもののうち少な
くとも97%を有するものが非常に好ましく、これらの
うち、少なくとも98%を有するものおよび少なくとも
99%を有するものが特に非常に好ましく、少なくとも
99%を有するものがさらに好ましい。
【0038】好ましい具体例は、図1〜図4[配列番号
1]のDNAによりコードされた成熟ポリペプチドと同
一の生物学的機能または活性を実質的に保持するポリペ
プチドをコードしているポリヌクレオチドである。
【0039】本発明は、さらに、前記配列にハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本
発明は、特に、前記ポリヌクレオチドにストリンジェン
ト条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書で用いる場合、「ストリンジェント条件」
および「ストリンジェントハイブリダイゼーション条
件」なる用語は、ハイブリダイゼーションが配列間で少
なくとも95%、より好ましくは、少なくとも97%同
一性がある場合にのみ生じることを意味する。ストリン
ジェントハイブリダイゼーション条件の例は、50%ホ
ルムアミド、5xSSC(150mM NaCl、15mM
クエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(p
H7.6)、5xデンハート溶液、10%硫酸デキスト
ラン、および20mg/mlの変性され剪断されたサケ精子
DNAからなる溶液中、42℃で一夜インキュベート
し、次いで、約65℃で0.1x SSC中でハイブリダ
イゼーション支持体を洗浄することである。ハイブリダ
イゼーションおよび洗浄条件は、よく知られており、Sa
mbrook ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
第2版, Cod Spring Harbor, N. Y., (1989)、特にその
第11章に例示されている。
【0040】本発明は、また、実質的に、配列番号1に
記載されているポリヌクレオチド配列の配列またはその
フラグメントを有するプローブを用いてストリンジェン
ト条件下で配列番号1に記載されているポリヌクレオチ
ド配列について完全な遺伝子を含有する適切なライブラ
リーをスクリーニングし、次いで、DNA配列を単離す
ることにより入手可能なポリヌクレオチド配列からなる
ポリヌクレオチドを提供するものでもある。かかるポリ
ヌクレオチドを得るために有用なフラグメントとして、
例えば、本明細書に記載のプローブおよびプライマーが
挙げられる。
【0041】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
て本明細書にさらに記載するように、例えば、前記本発
明のポリヌクレオチドをRNA、cDNAおよびゲノム
DNAについてのハイブリダイゼーションプローブとし
て用いて、ヒスチジンキナーゼをコードしている全長c
DNAおよびゲノムクローンを単離し、ヒスチジンキナ
ーゼ遺伝子と高い配列類似性を有する他の遺伝子のcD
NAおよびゲノムクローンを単離してもよい。かかるプ
ローブは、一般に、少なくとも15塩基からなるであろ
う。好ましくは、かかるプローブは、少なくとも30塩
基を有するであろうし、少なくとも50塩基を有してい
てもよい。特に好ましいプローブは、少なくとも30塩
基を有するであろうし、50塩基以下を有するであろ
う。
【0042】例えば、ヒスチジンキナーゼ遺伝子のコー
ド化領域を、配列番号1に示された公知のDNAを用い
てスクリーニングすることによって単離して、オリゴヌ
クレオチドプローブを合成してもよい。次いで、本発明
の遺伝子のものと相補的な配列を有する標識オリゴヌク
レオチドを用いて、cDNA、ゲノムDNAまたはmR
NAのライブラリーをスクリーニングして、プローブが
ハイブリダイズするライブラリーのメンバーを決定す
る。
【0043】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、例えば、本明細書においてポリヌクレオチドア
ッセイに関してさらに記載するように、疾患、特にヒト
疾患の治療および該疾患についての診断薬の発見のため
の研究試薬および物質として用いることもできる。
【0044】配列番号1および/または2の配列から誘
導されたオリゴヌクレオチドである本発明のポリヌクレ
オチドを、本明細書のプロセスにおいて、好ましくはP
CRのために用いて、全体的または部分的に本明細書で
同定されたポリヌクレオチドが感染組織において細菌中
で転写されるか否かを決定してもよい。かかる配列は、
病原が得られた感染の段階および感染のタイプの診断に
おいても有用性を有するであろう。
【0045】本発明は、また、成熟タンパク質およびさ
らなるアミノもしくはカルボキシル末端アミノ酸または
成熟ポリペプチドに対する内部のアミノ酸(例えば、成
熟形態が1以上のポリペプチド鎖を有する場合)である
ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供
するものでもある。かかる配列は、前駆体から成熟形態
へのタンパク質のプロセシングにおける役割を果たし、
タンパク質を輸送させ、タンパク質半減期を長くするか
もしくは短くするか、または、とりわけ、アッセイまた
は生産のためのタンパク質の操作を促進する。一般にin
vivoの場合、さらなるアミノ酸は、細胞酵素により成
熟タンパク質から処理される。
【0046】1以上のプロ配列に融合したポリペプチド
の成熟形態を有する前駆タンパク質は、ポリペプチドの
不活性形態である。プロ配列が除去されると、かかる不
活性前駆体は、一般に、活性化される。プロ配列のいく
つかまたは全ては、活性化前に除去される。一般に、か
かる前駆体は、プロタンパク質と呼ばれている。
【0047】要するに、本発明のポリヌクレオチドは、
成熟タンパク質、成熟タンパク質およびリーダー配列
(プレタンパク質と称されている)、プレタンパク質の
リーダー配列ではない1以上のプロ配列を有する成熟タ
ンパク質の前駆体、または一般にポリペプチドの活性お
よび成熟形態を生産するプロセシング工程の間に除去さ
れるリーダー配列および1以上のプロ配列を有するプロ
タンパク質に対する前駆体であるプレプロタンパク質を
コードしている。
【0048】ベクター、宿主細胞、発現 本発明は、また、本発明のポリヌクレオチドからなるベ
クター、本発明のベクターを用いて遺伝子工学処理され
る宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプ
チドの生産に関する。無細胞翻訳系を用いて、本発明の
DNA構築物から誘導されたRNAを用いてかかるタン
パク質を生産することもできる。
【0049】組換え生産については、宿主細胞を遺伝子
工学処理して、発現系またはその一部または本発明のポ
リヌクレオチドを取り込むことができる。ポリヌクレオ
チドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランス
フェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフ
ェクション、トランスベクション、マイクロインジェク
ション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、電気
穿孔法、形質導入、スクレープローディング(scrape l
oading)、弾道導入(ballistic introduction)および
インフェクションのような、Davis ら, BASIC METHODS
IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) および Sambrook ら, M
OLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第2版, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r, N. Y.(1989) などの多くの標準的な研究マニュアル
に開示されている方法によって行うことができる。
【0050】適切な宿主の代表例としては、ストリプト
コッカス、スチフィロコッカス、エンテロコッカス、イ
ー・コリ、ストレプトマイセスおよびバシラス・サチリ
ス細胞などの細菌細胞;酵母細胞およびアスペルギルス
(Aspergillus)細胞などの真菌類細胞;ドロソフィラ
(Drosophila)S2およびスポドプテラ(Spodopter
a)Sf9細胞などの昆虫細胞;CHO、COS、HeLa
ねC127、3T3、BHK、293およびボーエス
(Bowes)黒色腫細胞などの動物細胞;ならびに植物細
胞が挙げられる。
【0051】非常に様々な発現系を用いて、本発明のポ
リペプチドを生産することができる。かかるベクターと
しては、とりわけ、染色体ベクター、エピソームベクタ
ーおよびウイルス誘導ベクター、例えば、細菌プラスミ
ドから、バクテリオファージから、トランスポゾンか
ら、酵母エピソームから、挿入要素から、酵母染色体要
素から、ウイルス(例えば、バキュロウイルス、パポバ
ウイルス、例えば、SV40、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよ
びレトロウイルス)から誘導されたベクター、その組み
合わせから誘導されたベクター、例えば、プラスミドと
バクテリオファージ遺伝要素から誘導されたもの、例え
ば、コスミドおよびファージミドが挙げられる。発現系
構築物は、発現を調節し発生させる制御領域を含有して
よい。一般に、宿主においてポリヌクレオチドを維持、
増殖または発現するのに、および/またはポリペプチド
を発現するのに適しているいずれの系またはベクター
も、これに関しては発現のために用いられる。適切なD
NA配列は、例えばSambrookら, MOLECULAR CLONING, A
A LABORATORY MANUAL, (上掲) に開示されている方法な
どの種々のよく知られており慣用的な技術のいずれによ
っても発現系に挿入される。
【0052】翻訳されたタンパク質の、小胞体の内腔へ
の、細胞周辺腔への、または細胞外環境への分泌のため
には、適切な分泌シグナルは、発現ポリペプチドへ取り
込まれる。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して
内生的であるか、または、それらは、異種シグナルであ
る。本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたは
エタノール沈降法、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン
交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトク
ロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー
を含むよく知られている方法によって組換え細胞培養物
から回収および精製することができる。ポリペプチドが
単離および/または精製の間に変性される場合、タンパ
ク質を再生するためのよく知られている方法を用いて活
性コンホメーションを発生させる。
【0053】診断アッセイ 本発明は、また、診断薬用の本発明のヒスチジンキナー
ゼポリヌクレオチドの使用にも関する。真核生物、特に
哺乳動物、特にヒトにおけるヒスチジンキナーゼの検出
は、疾患の診断のための診断方法を提供するであろう。
ヒスチジンキナーゼ遺伝子からなる生体に感染した真核
生物(本明細書では「個体」とも称する)、特に哺乳動
物、特にヒトは、種々の技術によって核酸レベルで検出
される。診断用核酸は、骨、血液、筋肉、軟骨および皮
膚などの感染した個体の細胞および組織から得られる。
ゲノムDNAは、検出のために直接用いられるか、また
は、分析前にPCRまたは他の増幅技術を用いることに
より酵素的に増幅される。RNAまたはcDNAもまた
同様の方法で用いられる。増幅を用いて、個体に存在す
る原核生物の種および菌株の特徴付けは、原核遺伝子の
遺伝子型の分析により行われる。検出および挿入は、参
照配列の遺伝子型と比較して増幅酸生物のサイズの変化
により検出することができる。点突然変異は、増幅DN
Aを標識ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチド配列へハ
イブリダイズすることにより同定することができる。完
全に適合した配列は、RNase消化によるかまたは融
点の差異により、ミスマッチ二本鎖とは区別することが
できる。DNA配列差異は、また、変性剤を用いるか用
いずに、ゲルにおけるDNAフラグメントの電気泳動移
動度の変化によるかまたは直接DNA配列決定によって
も検出される。Myersら, Science, 230: 1242 (1985)
を参照。特定位置での配列変化は、また、RNaseお
よびS1保護または化学的開裂法などのヌクレアーゼ保
護アッセイによっても示される。例えば、Cottonら, Pr
oc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401 (1985) を
参照。
【0054】本発明の遺伝子における細胞担持突然変異
または多形性は、種々の方法により、DNAレベルで検
出して、例えば、血清型を決定させてもよい。例えば、
RT−PCRを用いて、突然変異を検出することができ
る。例えば、ジーンスキャン(GeneScan)などの自動
化検出システムと組み合わせてRT−PCRを用いるの
が特に好ましい。RNAまたはcDNAはまた、同目
的、PCRまたはRT−PCRのために用いてもよい。
例えば、ヒスチジンキナーゼをコードしている核酸に相
補的なPCRプライマーを用いて、同定し、突然変異を
分析することができる。これらのプライマーは、個体か
ら誘導された試料から単離されたヒスチジンキナーゼD
NAを増幅することめにも用いられる。さらに、本発明
は、5'および/または3'末端から取り出された1、
2、3または4ヌクレオチドを有するこれらのプライマ
ーを提供するものである。該プライマーを用いて、感染
個体から単離された遺伝子を増幅させ、その結果、該遺
伝子をDNA配列の解明のために種々の技術に付す。こ
の方法では、DA配列における突然変異を検出し、これ
を用いて、感染を診断し、血清型を決定し、および/ま
たは感染因子を分類する。
【0055】本発明は、さらに、個体から誘導した試料
から図1〜図4[配列番号1]の配列を有するポリヌク
レオチドの発現の増加したレベルを決定することからな
る、疾患、好ましくは、細菌感染症、より好ましくは、
スタフィロコッカス・アウレウスによる感染症、最も好
ましくは、上気道の感染症(例えば、中耳炎、細菌性気
管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下気道の感染症(例
えば、蓄膿症、肺膿瘍)、心臓の感染症(例えば、感染
性心内膜炎)、胃腸の感染症(例えば、分泌性下痢、脾
臓膿瘍、腹膜後膿瘍)、CNSの感染症(例えば、脳膿
瘍)、目の感染症(例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、
眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎臓およ
び尿道の感染症(例えば、副睾丸炎、腎臓内および腎周
囲膿瘍、トキシックショック症候群)、皮膚の感染症
(例えば、膿痂疹、毛包炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、傷感
染、細菌性筋炎)、骨および関節の感染症(例えば、敗
血症性関節炎、骨髄炎)などの疾患の診断方法を提供す
る。例えば、PCR、RT−PCR、RNase保護、
ノーザンブロット法および他のハイブリダイゼーション
法などのポリヌクレオチドの定量化について当該技術分
野でよく知られている方法のいずれかを用いて、ヒスチ
ジンキナーゼポリヌクレオチドの増加または減少した発
現を測定することができる。
【0056】さらに、正常な対照組織試料と比較したヒ
スチジンキナーゼタンパク質の過剰発現を検出するため
の本発明の診断アッセイを用いて、例えば、感染の存在
を検出する。宿主から誘導された試料におけるヒスチジ
ンキナーゼタンパク質のレベルを決定するために用いる
ことができるアッセイ技術は、当業者によく知られてい
る。かかるアッセイ方法としては、放射性免疫検定法、
競合−結合測定法、ウェスタンブロット分析法およびE
LISAアッセイが挙げられる。
【0057】抗体 本発明のポリペプチドもしくはその変種、またはそれら
を発現する細胞を免疫現として用いて、かかるポリペプ
チドに対して免疫特異的な抗体を生産することができ
る。本明細書で用いる場合、「抗体」としては、モノク
ローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本
鎖抗体、サル化抗体およびヒト化抗体、ならびに、Fab
免疫グロブリン発現ライブラリーの生産物を含むFabフ
ラグメントが挙げられる。
【0058】本発明のポリペプチドに対して生じた抗体
は、慣用的なプロトコールを用いて、ポリペプチドまた
はエピトープ担持フラグメント、アナログまたは細胞
を、動物、好ましくは非ヒトに投与することにより得る
ことができる。モノクローナル抗体の調製については、
連続セルライン培養により凄惨された抗体を提供する当
該技術分野で知られている技術を用いることができる。
例えば、Kohler, G. andMilstein, C., Nature 256: 49
5-497 (1975); Kozborら, Immunology Today 4:72 (198
3); Coleら, 第77-96頁 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND
CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985) におけ
る方法などの種々の方法が挙げられる。
【0059】一本鎖抗体の生産方法(U.S.特許第4,946,
778号)を適用して、本発明のポリペプチドに対する一
本鎖抗体を生産することができる。また、トランスジェ
ニックマウス、または、他の哺乳動物などの他の生体を
用いて、ヒト化抗体を発現してもよい。
【0060】別法としては、ファージ表示法を用いて、
抗ヒスチジンキナーゼをプロセシングするためにスクリ
ーニングされたヒト由来のリンパ球のPCR増幅v−遺
伝子のレパートリーからかまたはナイーブライブラリー
からのポリペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝
子を選択してもよい(McCafferty, J. ら, (1990), Nat
ure 348, 552-554; Marks, J. ら, (1992) Biotechnolo
gy 10, 779-783)。これらの抗体のアフィニティーもま
た、チェーンシャッフリング(chain shuffling)によ
り改良することができる(Clackson, T. ら, (1991) Na
ture 352, 624-628)。
【0061】2つの抗原結合ドメインが存在する場合、
各ドメインは、「二重特異性」抗体と称される異なるエ
ピトープに対して指向される。
【0062】上記抗体を用いて、ポリペプチドを発現す
るクローンを単離または同定して、アフィニティークロ
マトグラフィーによりポリペプチドを精製してもよい。
【0063】したがって、とりわけ、ヒスチジンキナー
ゼ−ポリペプチドに対する抗体を用いて、感染症、特
に、細菌感染症、特に、上気道の感染症(例えば、中耳
炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下気道
の感染症(例えば、蓄膿症、肺膿瘍)、心臓の感染症
(例えば、感染性心内膜炎)、胃腸の感染症(例えば、
分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍)、CNSの感染症
(例えば、脳膿瘍)、目の感染症(例えば、眼瞼炎、結
膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢
炎)、腎臓および尿道の感染症(例えば、副睾丸炎、腎
臓内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群)、
皮膚の感染症(例えば、膿痂疹、毛包炎、皮膚膿瘍、蜂
巣炎、傷感染、細菌性筋炎)、骨および関節の感染症
(例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎)などの疾患を治療
する。
【0064】ポリペプチド変種としては、本発明の特定
の態様を形成する抗原的、エピトープ的または免疫学的
に等価な変種が挙げられる。本明細書で用いる場合、
「抗原的に等価な誘導体」は、本発明のタンパク質また
はポリペプチドに対して生じた場合に病原と哺乳動物宿
主との間の直接物理的相互作用を妨げるある種の抗体に
より特異的に認識されるポリペプチドまたはその等価物
を包含する。本明細書で用いる場合、「免疫学的に等価
な誘導体」なる用語は、適切な形態で用いて脊椎動物に
おいて抗体を生じる場合に抗体が病原と哺乳動物宿主と
の間の直接物理的相互作用を妨げるように作用するペプ
チドまたはその等価物を包含する。
【0065】抗原的または免疫学的に等価な誘導体また
はその融合タンパク質などのポリペプチドを抗原として
用いて、マウスまたはラットもしくはニワトリなどの他
の動物を免疫する。融合タンパク質は、ポリペプチドに
対する安定性を提供する。抗原は、例えばコンジュゲー
ションにより、免疫原性担体タンパク質、例えば、ウシ
血清アルブミン(BSA)またはキーホールリンペット
ヘモシアニン(KLH)と関連する。別法としては、タ
ンパク質もしくはポリペプチド、またはその抗原的もし
くは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピーからな
る多重抗原性ペプチドは、免疫原性を改良するのに充分
に抗原的であり、その結果、担体の使用を不必要にす
る。
【0066】好ましくは、抗体またはその変種を修飾し
て、個体においてそれをあまり免疫原性にしない。例え
ば、個体がヒトである場合、抗体は、「ヒト化」(ここ
で、例えば、Jones, P. ら, (1986), Nature 321, 522-
525 または Tempestら, (1991) Biotechnology 9, 266-
273 に開示されているように、ハイブリドーマ誘導抗体
の相補性決定領域をヒトモノクローナル抗体に移植し
た)されるのが最も好ましい。
【0067】遺伝的免疫化における本発明のポリヌクレ
オチドの使用は、好ましくは、プラスミドDNAの筋肉
への直接注射(Wolffら, Hum Mol Genet 1992, 1:363,
Manthorpeら, Hum. Gene Ther. 1963:4, 419)、特異的
なタンパク質担体と複合体を形成したDNAのデリバリ
ー(Wu ら, J Biol Chem 1989:264, 16985)、DNAの
リン酸カルシウムとの共沈(Benvenisty & Reshe, PNA
S, 1986:83, 9551)、種々の形態のリポソームにおける
DNAの被包化(Kaneda ら, Science 1989:243, 37
5)、粒子衝撃(Tang ら, Nature 1992, 356:152, Eise
nbraunら, DNA Cell Biol 1993, 12:791)およびクロー
ン化レトロウイルスベクターを用いる in vivo 感染(S
eeger ら, PNAS 1984:81, 5849)などの適切なデリバリ
ー法を用いるであろう。
【0068】拮抗薬および作用薬 − アッセイおよび分
子 本明細書で提供されたポリヌクレオチド配列の各々、特
に、DNA配列の各々は、抗菌化合物の発見および開発
に用いられる。例えば、発現により、コード化されたタ
ンパク質を、抗菌薬のスクリーニングのための標的とし
て用いることができる。さらに、コード化タンパク質の
アミノ末端領域をコードしているDNA配列または各m
RNAのシャイン−ダルガーノ配列もしくは他の翻訳促
進配列を用いて、アンチセンス配列を構築して、関心の
あるコード化配列の発現を制御することができる。
【0069】本発明は、ヒスチジンキナーゼポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチドの作用を増強するもの(作用
薬)または遮断するもの(拮抗薬)、特に、静菌薬およ
び/または殺菌薬であるこれらの化合物を同定するため
の化合物のスクリーニング方法を提供するものでもあ
る。スクリーニング方法は、例えば、当業者に知られて
いるマルチウエルフォーマットまたはマルチ試料検出フ
ォーマットを含む高処理技術を含む。
【0070】例えば、作用薬または拮抗薬についてスク
リーンするために、合成反応混合物、例えば膜、細胞エ
ンベロープもしくは細胞壁などの細胞コンパートメン
ト、またはヒスチジンキナーゼポリペプチドおよび標識
基質もしくはかかるポリペプチドのリガンドからなるそ
の調製物を、ヒスチジンキナーゼ作用薬または拮抗薬で
ある候補分子の不在下または存在下でインキュベートす
る。本発明のこの態様において有用な合成反応混合物
は、とりわけ、精製されたかまたは組換え的に発現され
たヒスチジンキナーゼポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドからなる。候補分子のヒスチジンキナーゼポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドをアゴナイズするかまたは
拮抗する能力は、標識リガンドのかかるポリペプチドも
しくはポリヌクレオチドへの減少した結合、または触媒
RNAを用いた場合にかかるポリペプチドまたはかかる
ポリヌクレオチドによるかかる基質からの生成物の減少
した生産において反映される。無償的に、すなわち、ヒ
スチジンキナーゼポリペプチドの効果を誘発せずに、結
合する分子は、良好な拮抗薬であるらしい。よく結合
し、基質からの生成物生産の割合を増加させる分子は、
良好な作用薬であるらしい。基質からの生成物の生産の
割合またはレベルの検出は、リポーター系を用いること
により増強される。これに関して有用であるリポーター
系としては、限定されないが、とりわけ、生成物に転換
されるべきである比色標識基質、ヒスチジンキナーゼの
変化に応答するリポーター遺伝子、放射性標識基質が挙
げられる。これらのアッセイは、本発明のヒスチジンキ
ナーゼのコグネート反応レギュレーターからなるのが好
ましい。図6および図7は、各々、このコグネート反応
レギュレーターの遺伝子およびタンパク質配列を示す。
反応レギュレーターオープンリーディングフレームは、
前向きに、配列番号3のヌクレオチド14の開始および
ヌクレオチド709に末端を有する。配列番号4は、バ
シラス・サチリス由来のPhoP調節タンパク質と34%
同一性の相同性を示す。
【0071】ヒスチジンキナーゼ拮抗薬についてのアッ
セイの別の例は、競合疎開゛アッセイに適している条件
下で、ヒスチジンキナーゼポリペプチドまたはポリヌク
レオチドおよび有効な拮抗薬をヒスチジンキナーゼ結合
分子(かかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結
合する分子)、組換えヒスチジンキナーゼ結合分子、天
然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド
擬態と混合する競合アッセイである。本発明のこの態様
の好ましい具体例は、また、反応レギュレーターからな
る。ヒスチジンキナーゼを、放射性標識または比色化合
物などにより標識して、ヒスチジンキナーゼ結合分子に
結合したかまたは生成物に転換されたヒスチジンキナー
ゼ分子の数を正確に決定して、有効な拮抗薬の効率を評
価することができる。本明細書における記載を用いる
と、当業者は、多くのタイプの競合アッセイを設計し行
うことができる。
【0072】有効な拮抗薬としては、本発明のポリヌク
レオチドまたはポリペプチドに結合し、好ましくは、こ
れにより、その活性を阻害または消失させる、小さな有
機分子、ペプチド、ペプチド擬態、ポリペプチドおよび
抗体が挙げられる。有効な拮抗薬は、また、ヒスチジン
キナーゼ誘発活性を誘発せずにヒスチジンキナーゼ結合
分子上の同部位を結合し、これにより、結合からヒスチ
ジンキナーゼを排除すること、特にヒスチジンキナーゼ
およびそのコグネート反応レギュレーターの相互作用を
防止することなどにより、ヒスチジンキナーゼの作用を
防止する非常に関連しているタンパク質または抗体など
の小さな分子、ペプチド、ペプチド擬態、ポリペプチド
であってもよい。
【0073】有効な拮抗薬としては、ヒスチジンキナー
ゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドの結合部位、特
に反応レギュレーターに結合し該結合部位を占領し、こ
れにより、細胞結合分子への結合を防止し、この結果、
正常な生物学的活性を防止する、小さな分子が挙げられ
る。小さな分子の例としては、限定されないが、小さな
有機分子、ペプチドまたはペプチド様分子、ペプチド擬
態が挙げられる。他の有効な拮抗薬としては、アンチセ
ンス分子が挙げられる(これらの分子の説明のために、
Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUC
LEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSIO
N, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)を参照)。好ま
しい拮抗薬としては、ヒスチジンキナーゼに関連する化
合物およびヒスチジンキナーゼの変種、ならびに、イー
・コリKdpDヒスチジンキナーゼの公知の阻害薬に構造
的に関係している化合物が挙げられる。
【0074】本発明のポリペプチドを用いて、例えば、
細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然
生産混合物などにおいて、小さな分子基質およびリガン
ドの結合を評価してもよい。これらの基質およびリガン
トは、反応レギュレーターなどの天然基質およびリガン
ドであるか、または、構造的または機能的擬態であって
もよい。例えば、Coligan ら, Current Protocols in I
mmunology 1(2): 第5章 (1991) を参照。
【0075】本発明は、また、感染の続発症の原因であ
る病原と哺乳動物宿主との間の初期物理的相互作用を妨
害するための本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド
または阻害薬の使用を提供するものでもある。特に、本
発明の分子は、細菌、特に細菌、特にグラム陽性細菌
の、内在装置上での哺乳動物細胞外マトリックスタンパ
ク質への、または創傷における細胞外マトリックスタン
パク質への付着の防止において用いられ、例えば、哺乳
動物チロシンキナーゼのリン酸化を開始することなどに
よりヒスチジンキナーゼタンパク質媒介哺乳動物細胞侵
入を遮断し(Rosenshine ら, Infect. Immun. 60:2211
(1992));哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質と組
織損傷を媒介する細菌ヒスチジンキナーゼタンパク質と
の間の細菌付着を遮断し;内在装置の移植または他の外
科的手術以外により開始される感染における病原の正常
な進行を遮断する。本発明の拮抗薬および作用薬を用い
て、例えば、特にスタフィロコッカス・アウレウスの、
細菌増殖または他の代謝機能を阻害し、とりわけ、上気
道の感染症(例えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭
蓋炎、甲状腺炎)、下気道の感染症(例えば、蓄膿症、
肺膿瘍)、心臓の感染症(例えば、感染性心内膜炎)、
胃腸の感染症(例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後
膿瘍)、CNSの感染症(例えば、脳膿瘍)、目の感染
症(例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔
および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎臓および尿道の感染症
(例えば、副睾丸炎、腎臓内および腎周囲膿瘍、トキシ
ックショック症候群)、皮膚の感染症(例えば、膿痂
疹、毛包炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、傷感染、細菌性筋
炎)、骨および関節の感染症(例えば、敗血症性関節
炎、骨髄炎)などの疾患を治療または阻害する。
【0076】ワクチン 本発明の別の態様は、個体に、抗体および/またはT細
胞免疫反応を生じさせのに適しているヒスチジンキナー
ゼまたはそのフラグメントもしくは変種を接種して、個
体を、感染、特に細菌感染、特にスタフィロコッカス・
アウレウス感染から予防することからなる、個体、特
に、哺乳動物における免疫学的反応誘発方法に関する。
また、かかる免疫学的反応が細菌複製を遅延させる方法
を提供するものでもある。本発明のさらに別の態様は、
個体に核酸ベクターをデリバリーして、in vivo でのヒ
スチジンキナーゼまたはそのフラグメントもしくは変種
を発現させるためにヒスチジンキナーゼまたはそのフラ
グメントもしくは変種を発現させ、抗体および/または
例えばサイトカイン生産性T細胞もしくは細胞障害性T
細胞を含むT細胞免疫反応を生産して、疾患が既に個体
内で樹立していてもいなくても該疾患から個体を保護す
るなどの免疫学的反応を誘発することからなる、個体に
おける免疫反応誘発方法に関する。該遺伝子の投与方法
の一例は、粒子上でのコーティングとして所望の細胞中
にそれを加速することによる。かかる核酸ベクターは、
DNA、RNA、修飾核酸、またはDNA/RNAハイ
ブリッドからなる。
【0077】本発明のさらなる態様は、免疫学的反応を
誘発可能であるかまたは誘発させた個体中に導入する場
合にかかる個体においてヒスチジンキナーゼまたはそれ
からコードされたタンパク質に対する免疫学的反応を誘
発する免疫学的組成物であって、ヒスチジンまたはそれ
からコードされたタンパク質の抗原をコードし発現する
DNAからなる組換えヒスチジンキナーゼまたはそれか
らコードされたタンパク質からなる免疫学的組成物に関
する。免疫学的反応は、治療学的または予防学的に用い
られ、CTLまたはCD4+ T細胞により生じるもの
のような抗体免疫性または細胞免疫性の形態を取る。
【0078】ヒスチジンキナーゼポリペプチドまたはそ
のフラグメントは、自分自身では抗体を生産しないコタ
ンパク質と融合されるが、第1タンパク質を安定化する
能力および免疫原性特性および保護特性を有するであろ
う融合タンパク質を生産する能力を有している。したが
って、好ましくは、融合された組換えタンパク質は、ヘ
モフィルス・インフルエンゼ(Hemophilus influenza
e)由来のリポタンパク質D、グルタチオン−S−トラ
ンスフェラーゼ(GST)またはベータ−ガラクトシダ
ーゼ(各々、タンパク質を溶解させ、その生産および精
製を促進する大きなコタンパク質)などの抗原性コタン
パク質からなる。さらにまた、コタンパク質は、免疫系
の一般化された刺激を与えるという点でアジュバントと
して作用する。コタンパク質は、第1タンパク質のアミ
ノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに結合される。
【0079】本発明は、本発明のポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドおよび Sato, Y. ら, Science 273: 352
(1996) に開示されているもののような免疫刺激性DN
A配列からなる組成物、特にワクチン組成物、および方
法を提供するものでもある。
【0080】また、本発明は、スタフィロコッカス・ア
ウレウスへの感染の動物モデルにおけるかかる遺伝的免
疫化実験において用いられるDNA構築物において細菌
細胞表面タンパク質の非可変領域をコードすることを示
した前記ポリヌクレオチドまたはその特定のフラグメン
トを用いる方法を提供するものでもあり、特に予防的ま
たは治療的免疫反応を誘発することができるタンパク質
エピトープを同定するのに有用である。このアプローチ
は、哺乳動物、特にヒトにおける、細菌感染、特に、ス
タフィロコッカス・アウレウス感染の予防薬または治療
的処置の開発のために、感染を成功裏に阻止または除去
する動物の必要な器官からの特定の値のモノクローナル
抗体の次なる調製を可能にすると思われる。
【0081】該ポリペプチドを宿主のワクチン注射のた
めに抗原として用いて、例えば損傷組織への細菌の付着
を遮断することなどにより細菌の侵入に対して保護する
特異的抗体を生産してもよい。組織損傷の例としては、
例えば、機械的、化学的もしくは熱的損傷または内在装
置の移植によって生じた皮膚または結合組織における創
傷、または、口、乳腺、尿道または膣などの粘膜におけ
る創傷が挙げられる。
【0082】本発明は、また、適切な担体と一緒に本発
明の免疫学的組換えタンパク質を含有してなるワクチン
製剤を含む。タンパク質は、胃で分解されるので、皮
下、筋肉内、静脈内または皮内投与を含む非経口投与さ
れるのが好ましい。非経口投与に適している製剤として
は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および、製剤を、個体
の体液、好ましくは血液で等張性にする溶質を含有する
水性または非水性無菌注射溶液;ならびに懸濁化剤また
は増粘剤を含む水性および非水性無菌懸濁液剤が挙げら
れる。製剤は、単位投与または多投与容器、例えば、密
閉アンブルおよびバイアル中に提供され、使用直前の無
菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で貯蔵
してもよい。ワクチン製剤は、また、水中油系および当
該技術分野で知られている他の系などの製剤の免疫原性
を増強するためのアジュバンド系を含んでもよい。投与
量は、ワクチンの比活性に依存するであろうし、慣用的
な実験により容易に決定することができる。
【0083】本発明は、ある種のヒスチジンキナーゼタ
ンパク質に言及して記載したが、これは、天然タンパク
質、および組換えタンパク質の免疫原性特性に実質的に
影響を及ぼさない付加、欠失または置換を有する類似の
タンパク質のフラグメントを網羅するものであると解さ
れるべきである。
【0084】組成物、キットおよび投与 本発明は、前記ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド
またはそれらの作用薬もしくは拮抗薬または反応レギュ
レーターを含有してなる組成物にも関する。本発明のポ
リペプチドは、対象物への投与に適している医薬担体な
どの、細胞、組織または生体と一緒に用いるための非無
菌または無菌担体と組み合わせて用いられる。かかる組
成物は、例えば、メディア添加剤または本発明のポリペ
プチドの治療有効量および医薬的に許容される担体また
は賦形剤を含有してなる。かかる担体としては、限定さ
れないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロー
ス、水、グリセロールエタノールおよびその組み合わせ
が挙げられる。製剤は、投与の形態に適しているべきで
ある。本発明は、さらに、本発明の前記組成物の成分の
1種類以上を充填した1個以上の容器からなる診断およ
び医薬パックおよびキットに関する。
【0085】本発明のポリペプチドおよび他の化合物
は、単独で、または、治療化合物などの他の化合物と一
緒に用いられる。
【0086】医薬組成物は、とりわけ、局所経路、経口
経路、肛門経路、膣経路、静脈内経路、腹腔内経路、筋
肉内経路、皮下経路、鼻腔内経路たは経皮経路による投
与を含むいずれの有効な慣用的手段によっても投与され
る。
【0087】治療において、または予防として、活性剤
は、注射可能な組成物として、例えば無菌水性分散液、
好ましくは等張液として、個体に投与される。
【0088】別法としては、組成物は、例えば軟膏剤、
クリーム剤、ローション剤、眼科軟膏剤、滴眼剤、滴耳
剤、うがい薬、含浸包帯剤および縫合糸ならびにエアロ
ゾル剤の形態で、局所投与のために製剤化され、例え
ば、軟膏剤およびクリーム剤において、保存剤、薬物浸
透を助ける溶媒および皮膚軟化薬を含む適切な慣用添加
剤を含有してよい。かかる局所製剤は、また、例えば、
クリーム基剤または軟膏基剤などの適合可能な慣用担
体、およびローション剤のためのエタノールまたはオレ
イルアルコールを含有してもよい。かかる担体は、製剤
の約1重量%〜約98重量%を構成する;より一般的に
は、それらは、製剤の約80重量%までを構成するであ
ろう。
【0089】哺乳動物、好ましくはヒトへの投与につい
ては、活性剤の日用量は、0.01mg/kg〜10mg/k
g、典型的には、1mg/kgであろう。如何なる場合にも
医師は、個体に最も適している現実の投与量を決定する
であろうし、特定個体の年齢、体重および反応により変
化するであろう。上記用量は、平均的なケースの例であ
る。もちろん、高いまたは低い用量範囲が与えられるの
が当然である個々の場合もあり得、これは、本発明の範
囲内である。
【0090】内在装置としては、外科手術的移植、人工
器官装置およびカテーテル、すなわち、個体の身体に導
入され、長期間正しい位置にある装置が挙げられる。か
かる装置としては、例えば、人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャ
ント、尿道カテーテル、連続外来腹膜透析(CAPD)
カテーテルが挙げられる。
【0091】本発明の組成物は、注射によって投与し
て、内在装置の挿入の直前に関連細菌に対する全身効果
を達成する。治療は、手術後、該装置の体内内在時間の
間じゅう継続される。さらに、当該組成物は、また、外
科的手術のために広げられた手術カバーに用いて、細菌
傷感染、特にスタフィロコッカス・アウレウス傷感染を
予防することもできる。
【0092】多くの整形外科医は、人工関節を持つヒト
は、菌血症を生じるかもしれない歯科治療の前に抗生物
的予防について考慮されるべきであると考えている。後
発性の深い感染は、しばしば人工関節を損失させる重篤
な合併症であり、有意な罹患率および死亡率を伴う。し
たがって、この場合、予防的抗生物質の代替品として活
性剤の使用を拡大することが可能である。
【0093】前記治療に加えて、本発明組成物は、一般
に、創傷組織において暴露されたマトリックスタンパク
質への細菌の付着を予防するために創傷治療剤として、
および、抗生物的予防の代替としてまたは抗生物的予防
と組み合わせて歯科治療における予防的使用のために用
いてもよい。
【0094】別法としては、本発明組成物は、内在装置
を挿入直前に浸漬するために用いられる。活性剤は、好
ましくは、創傷または内在装置の浸漬のために、1μg
/ml〜10mg/mlの濃度で存在するであろう。
【0095】ワクチン組成物は、好都合には、注射可能
な形態である。慣用的なアジュバントを用いて、免疫反
応を増強してもよい。ワクチン接種のための適切な単位
用量は、抗原0.5−5μg/kgであり、かかる用量は、
1−3週間おきに1−3回投与されるのが好ましい。本
発明化合物については、所定の用量範囲では、適切な個
体へのそれらの投与を妨げる逆の毒物学的効果は観察さ
れないであろう。
【0096】本明細書で引用した各文献は、引用して本
明細書の記載とする。さらにまた、本出願が優先権を主
張する各特許出願は、これにより引用して本明細書の記
載とする。
【0097】
【実施例】以下の実施例は、詳細に特記しない限り、当
業者によく知られておりかつ慣用的である標準的な技術
を用いて行われる。該実施例は、説明であり、本発明を
限定するものではない。
【0098】実施例1 菌株の選択、ライブラリーの生産および配列決定 イー・コリにおけるスタフィロコッカス・アウレウスの
染色体DNAのクローンのライブラリーから配列番号1
に示すDNA配列を有するポリヌクレオチドを得た。重
複するスタフィロコッカス・アウレウスDNAを含有す
る2つ以上のクローンからの配列決定データを用いて、
配列番号1における隣接するDNA配列を構築した。ラ
イブラリーは、例えば、以下の方法1および方法2など
の慣用的な方法により調製する。標準的な方法によりス
タフィロコッカス・アウレウスWCUH 29から全細
胞DNAを単離し、2つの方法のいずかれによりサイズ
分画化する。
【0099】方法1 針を通過させることにより、全細胞DNAを機械的に剪
断して、標準的な方法に従って、サイズ分画化する。エ
キソヌクレアーゼおよびDNAポリメラーゼでの処理に
より、11kbpまでの大きさのDNAフラグメントを平
滑末端にし、EcoRIリンカーを添加する。該フラグメ
ントを、EcoRIで切断したベクターラムダZapIIに
ライゲートし、該ライブラリーを標準的な方法によりパ
ッケージングし、このパッケージングしたライブラリー
にイー・コリを感染させる。該ライブラリーは、標準的
な方法により増幅される。
【0100】方法2 ライブラリーベクター(例えば、RsaI、PalI、Alu
I、Bshl235I)へのクローニングのための一連の
フラグメントを生じさせるのに適切な制限酵素の一また
はその組み合わせで全細胞DNAを部分加水分解し、標
準的な方法に従って、かかるフラグメントをサイズ分画
化する。EcoRIリンカーを該DNAにライゲートし、
次いで、該フラグメントを、EcoRIで切断したベクタ
ーラムダZapIIにライゲートし、該ライブラリーを標
準的な方法によりパッケージングし、該パッケージング
したライブラリーにイー・コリを感染させる。該ライブ
ラリーは、標準的な方法により増幅される。
【0101】
【配列表】
【0102】配列番号:1 配列の長さ:2700 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列 GAATTCCTAT TGTAAGTTTG ATTGATGTTT GTGTAGGATA GTCTGTACTA AATATAAGCC 60 TAGTCCCATG CTTTCTTTTT GGTTATCTTT AAAATATTTA TTTGATCCTG TGTAAAAAGG 120 CTCGAATATC TTTTGTTGTT CTTCTAAACT AATTCCAGGT CCTTCGTCTA TAACGGCAAA 180 TTCGATTTGT TCATAGCTAG CATAACGAAT AGATAAATTG ATTTTGGTGT CAGTAGAAGT 240 GTGTTTAACT GCATTTTCAA TCAAATTGAA TAAAGCTTGT AAAATCAACT TACTGTCAAT 300 GTGTATAAAC TGTAAATTTA CGGAGGATGA TACAGTTATA CGCTTTTTTA AATGGCGACG 360 TTCTAAAATC ATATCGATTT CTTCTACTAA TTCACTAACG AGATAAGGTT GCAATTTTAT 420 CTGAACATTT GATGACTGTA ATTTTGTTAA TGATAAAATA TTTGTCACTA ATAGATATAA 480 ATACTGACTT TCTTGAAAAC TATGTACAAG TAATTGTTCC TTTTCTATGA TAGACATATC 540 TTTACTATGT GATACTAAAA TATCTAAATT TCCCATAATT GTTGTTAACG GTGTACGTAT 600 GTCATGCGAA ATTGATCTTA AAAAATTTGA ATGTGTCAGT TGACGTTCAG CCTGTAACAT 660 GGATTCTCTC GTTTGTTTAA GTAACGTCAC ATTTTCAACG GCGAGAGAAA GTTCATTTAA 720 CATTGATTCT AATATTGATG CATCATATGG ATTAATCACT TGAGAACTTT GGTAATCAAT 780 GGCTAGAATG CCTTTAATCG GAGATGTGCC AATTGGTATC AACCATTTAT TAATGCCTGG 840 AAATGTATCT GTTGTTGCAC CAGCTTGTCT TTCATTTTTA ATTACCCAGC TTAATGCTTG 900 TTCATGCTGT TGAGTCGTAT TATCGATATG GTTTTGCAAT GGTATTGTTT TAATTACTTT 960 CGATTGATTG ATAACGTATA TAGTAATTGA TTGTTGCAAT AATTGATTAA TTTGGTATCC 1020 AGCATTTATT AGTAAGTTTT CAACTGTATA AGTTTGTTTA ATCGAATCAT TAAATTGAAA 1080 TAATAAATCT GTACGATAAA GTTGCTTTTT AGTAATGGAG TATTGGAATT TAATTTGTTT 1140 TAATAAAGCA CTCGTTAAAA TACTTGTTAA AATGCTAACG ATAAATGTAA TAGGATAGTC 1200 AAAGCGATAT ACTTCAAATG TATATCTAGG TTCCGTAAAA AAATAATTAA AAACAAATAC 1260 GTTAATAATT GCTGCTAAAA AGCCAATGAT GAAGGACCGC GTCCAAATGG ATAATAAAAT 1320 GATGCCGATG AGAAAAATCA TTAAAATAAT CGTACTAGAC TCATGCTTAT CAAGTTGATA 1380 AATCCACAGT CCCATCATTA CACAAATTAT TTGAATCAAA ATCATTTTTA ACATATCTAT 1440 GGCGAAACGT TTGCCTTTAG GACGATAGGG TGATTTGTTC ATTTTCAATT CAACAGGTAT 1500 TTGTTTGATT GGAACGATTT CGATTTTATA GCTATGTTCA AAGGACATTA AATGGTCAAT 1560 TAAAGGTGTA TTGAAAAAGT CTCGCCACTT ATTTCTAATA TGTTGTCCGA TAATTAATTT 1620 GGTTACATCT TGATTTTTAC ACCATTCGTC TAATCCTAAT GCAACGGTTT GGCTATAAAC 1680 TACTTTTACT TTTGCTCCTA ATGATTTTGC AAGCATGAGA TGTTGATGCA CTTGCTTTTG 1740 ACTATCTTTA TATTGCCTGT TTTTTTCGAA TACATCTATA TAAATAGCAG TGAACTTCGC 1800 ATGTTCTTTT TGAGCAATAT GGAATGCCTC TTTAATTACT GCTTCATTAT AAATGCTCCC 1860 ACTAATTGCC ACAGCAATAT GAGGTTTGAG TGACGTTTTA TGGTTGTGTC GGACTTTTTC 1920 TTTATCACTC ATCAAGTCGG CAACTGTTCT TAACGTCAAT GTACGCAGTT CGCTTAGGTG 1980 GGCATACGTA AAGAAATTAC TAAATGCTAC ATCTAGCCTA TCCTTTTTAT ATACCTTGCC 2040 AGCTTTTAAG CGTTTAATTA ATTGTTCAGG TGAGATATCT ACGACTTCTA ATACATCGGC 2100 GCTCATTATG AAATAGTCGG GTACACGTTC TTTAACATGT ACACCGGTCA TCAGTTCAAT 2160 TTGACTACTT AAACTTTCAA TATGTTGAAT GTTCAAAGTG GTATGAACAT CGATACCATG 2220 ATTTAAAATT TCTTCAATAT CCATATATCG TTTCTCATGA CGATCTCTAG AAATATTCGT 2280 ATGTGCTAAC TCATCGATAA GTACTATTGT CGGCGATTCT TCGATTATGC GGTCGACATC 2340 TAAATATTGA AAATGATGAC TACCATGTTT AGTAAAATTG GTTGTGATTT TAGGTAATTG 2400 TTCAGCTAAT GCATTTGTTT CATCACGCTG ATGCGGTTCA ATATATCCTA TTTTAATATC 2460 AACGTTACTT TGAAATAGTT CAATGGCATT TGAAAGCATC TCAAATGTTT TACCAACACC 2520 TGGACTGTAA CCGATGTAAA TTGTTAAAGA TCCACGCTTT TTTCCTATGT TTAGCGATTC 2580 AGTGTTTGAC ATAACCTTCA CCTCGATAGC AATATCATAA TATTCTTCAC AATTAAATGC 2640 TATAAAATTT ATTTCTGCAT ACACATCTTA ATGATTTCTT AATAACTAAG TTTGAAAATT 2700
【0103】配列番号:2 配列の長さ:861 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列 Met Ser Asn Thr Glu Ser Leu Asn Ile Gly Lys Lys Arg Gly Ser Leu 1 5 10 15 Thr Ile Tyr Ile Gly Tyr Ser Pro Gly Val Gly Lys Thr Phe Glu Met 20 25 30 Leu Ser Asn Ala Ile Glu Leu Phe Gln Ser Asn Val Asp Ile Lys Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Glu Pro His Gln Arg Asp Glu Thr Asn Ala Leu Ala Glu 50 55 60 Gln Leu Pro Lys Ile Thr Thr Asn Phe Thr Lys His Gly Ser His His 65 70 75 80 Phe Gln Tyr Leu Asp Val Asp Arg Ile Ile Glu Glu Ser Pro Thr Ile 85 90 95 Val Leu Ile Asp Glu Leu Ala His Thr Asn Ile Ser Arg Asp Arg His 100 105 110 Glu Lys Arg Tyr Met Asp Ile Glu Glu Ile Leu Asn His Gly Ile Asp 115 120 125 Val His Thr Thr Leu Asn Ile Gln His Ile Glu Ser Leu Ser Ser Gln 130 135 140 Ile Glu Leu Met Thr Gly Val His Val Lys Glu Arg Val Pro Asp Tyr 145 150 155 160 Phe Ile Met Ser Ala Asp Val Leu Glu Val Val Asp Ile Ser Pro Glu 165 170 175 Gln Leu Ile Lys Arg Leu Lys Ala Gly Lys Val Tyr Lys Lys Asp Arg 180 185 190 Leu Asp Val Ala Phe Ser Asn Phe Phe Thr Tyr Ala His Leu Ser Glu 195 200 205 Leu Arg Thr Leu Thr Leu Arg Thr Val Ala Asp Leu Met Ser Asp Lys 210 215 220 Glu Lys Val Arg His Asn His Lys Thr Ser Leu Lys Pro His Ile Ala 225 230 235 240 Val Ala Ile Ser Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Ala Val Ile Lys Glu Ala 245 250 255 Phe His Ile Ala Gln Lys Glu His Ala Lys Phe Thr Ala Ile Tyr Ile 260 265 270 Asp Val Phe Glu Lys Asn Arg Gln Tyr Lys Asp Ser Gln Lys Gln Val 275 280 285 His Gln His Leu Met Leu Ala Lys Ser Leu Gly Ala Lys Val Lys Val 290 295 300 Val Tyr Ser Gln Thr Val Ala Leu Gly Leu Asp Glu Trp Cys Lys Asn 305 310 315 320 Gln Asp Val Thr Lys Leu Ile Ile Gly Gln His Ile Arg Asn Lys Trp 325 330 335 Arg Asp Phe Phe Asn Thr Pro Leu Ile Asp His Leu Met Ser Phe Glu 340 345 350 His Ser Tyr Lys Ile Glu Ile Val Pro Ile Lys Gln Ile Pro Val Glu 355 360 365 Leu Lys Met Asn Lys Ser Pro Tyr Arg Pro Lys Gly Lys Arg Phe Ala 370 375 380 Ile Asp Met Leu Lys Met Ile Leu Ile Gln Ile Ile Cys Val Met Met 385 390 395 400 Gly Leu Trp Ile Tyr Gln Leu Asp Lys His Glu Ser Ser Thr Ile Ile 405 410 415 Leu Met Ile Phe Leu Ile Gly Ile Ile Leu Leu Ser Ile Trp Thr Arg 420 425 430 Ser Phe Ile Ile Gly Phe Leu Ala Ala Ile Ile Asn Val Phe Val Phe 435 440 445 Asn Tyr Phe Phe Thr Glu Pro Arg Tyr Thr Phe Glu Val Tyr Arg Phe 450 455 460 Asp Tyr Pro Ile Thr Phe Ile Val Ser Ile Leu Thr Ser Ile Leu Thr 465 470 475 480 Ser Ala Leu Leu Lys Gln Ile Lys Phe Gln Tyr Ser Ile Thr Lys Lys 485 490 495 Gln Leu Tyr Arg Thr Asp Leu Leu Phe Gln Phe Asn Asp Ser Ile Lys 500 505 510 Gln Thr Tyr Thr Val Glu Asn Leu Leu Ile Asn Ala Gly Tyr Gln Ile 515 520 525 Asn Gln Leu Leu Gln Gln Ser Ile Thr Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ser 530 535 540 Lys Val Ile Lys Thr Ile Pro Leu Gln Asn His Ile Asp Asn Thr Thr 545 550 555 560 Gln Gln His Glu Gln Ala Leu Ser Trp Val Ile Lys Asn Glu Arg Gln 565 570 575 Ala Gly Ala Thr Thr Asp Thr Phe Pro Gly Ile Asn Lys Trp Leu Ile 580 585 590 Pro Ile Gly Thr Ser Pro Ile Lys Gly Ile Leu Ala Ile Asp Tyr Gln 595 600 605 Ser Ser Gln Val Ile Asn Pro Tyr Asp Ala Ser Ile Leu Glu Ser Met 610 615 620 Leu Asn Glu Leu Ser Leu Ala Val Glu Asn Val Thr Leu Leu Lys Gln 625 630 635 640 Thr Arg Glu Ser Met Leu Gln Ala Glu Arg Gln Leu Thr His Ser Asn 645 650 655 Phe Leu Arg Ser Ile Ser His Asp Ile Arg Thr Pro Leu Thr Thr Ile 660 665 670 Met Gly Asn Leu Asp Ile Leu Val Ser His Ser Lys Asp Met Ser Ile 675 680 685 Ile Glu Lys Glu Gln Leu Leu Val His Ser Phe Gln Glu Ser Gln Tyr 690 695 700 Leu Tyr Leu Leu Val Thr Asn Ile Leu Ser Leu Thr Lys Leu Gln Ser 705 710 715 720 Ser Asn Val Gln Ile Lys Leu Gln Pro Tyr Leu Val Ser Glu Leu Val 725 730 735 Glu Glu Ile Asp Met Ile Leu Glu Arg Arg His Leu Lys Lys Arg Ile 740 745 750 Thr Val Ser Ser Ser Val Asn Leu Gln Phe Ile His Ile Asp Ser Lys 755 760 765 Leu Ile Leu Gln Ala Leu Phe Asn Leu Ile Glu Asn Ala Val Lys His 770 775 780 Thr Ser Thr Asp Thr Lys Ile Asn Leu Ser Ile Arg Tyr Ala Ser Tyr 785 790 795 800 Glu Gln Ile Glu Phe Ala Val Ile Asp Glu Gly Pro Gly Ile Ser Leu 805 810 815 Glu Glu Gln Gln Lys Ile Phe Glu Pro Phe Tyr Thr Gly Ser Asn Lys 820 825 830 Tyr Phe Lys Asp Asn Gln Lys Glu Ser Met Gly Leu Gly Leu Tyr Leu 835 840 845 Val Gln Thr Ile Leu His Lys His Gln Ser Asn Leu Gln 850 855 860
【0104】配列番号:3 配列の長さ:740 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列 AGGAGACGGT ATAATGCAAT CTAAAATATT GATAATTGAA GATGATCACG CAATCACACA 60 TTTACTTGAT GTTGCATTAA CTTTAGATTA TTACAATGTA ACTACAGCCG ACAATGCCAC 120 ACAAGCACAC TTTAAAATTC AAATTGATAA ACCAGATGTC ATTTTATTAG ATTTAGGTTT 180 ACCAGATAAA GATGGATTAT GTTTGATTTC AGAAATCAGG CAACATACTG ACATTCCTAT 240 CATTGTAATA AGTGCAAGAC AAGAAGAACA CACAATTATT CAAGCTTTAG ATATCGGTGC 300 GAATGACTAT ATGACTAAAC CTTTTAATGT TGATGAGCTT CGGGCACGAA TACGAGTCAT 360 CGAGAGAATC GCTAAGTCAC ATCAAGAAAC TAACATTGTA TTTACTAACG GTTTGCTAAG 420 CATCGACTTT GGCTCCAAAT CTGTTGTTAT TAATAATCAG GAGGTACATT TGACGCCAAA 480 TGAATTTAGC TTGTTAGAAC TATTGTCAAA TCATAAAGGA AAAGTACTCA CTTATGAGAT 540 GATATTAAAA CGAATATATG GCTATGTTAA TAAGACTGAA ATGCCTAGTT TAAGAGTGCA 600 TATGACATCA TTAAGACAAA AACTTTCACA ATGTCATGAG GACGCAAAAG ATATTATTAA 660 AACACATCCA CGCATTGGTT ATCAAATGTT GCAGTGGAAA GAGAAATAAT TAAATAAAAA 720 AGATCGCTGC CATTAAACGA 740
【0105】配列番号:4 配列の長さ:231 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列 Met Gln Ser Lys Ile Leu Ile Ile Glu Asp Asp His Ala Ile Thr His 1 5 10 15 Leu Leu Asp Val Ala Leu Thr Leu Asp Tyr Tyr Asn Val Thr Thr Ala 20 25 30 Asp Asn Ala Thr Gln Ala His Phe Lys Ile Gln Ile Asp Lys Pro Asp 35 40 45 Val Ile Leu Leu Asp Leu Gly Leu Pro Asp Lys Asp Gly Leu Cys Leu 50 55 60 Ile Ser Glu Ile Arg Gln His Thr Asp Ile Pro Ile Ile Val Ile Ser 65 70 75 80 Ala Arg Gln Glu Glu His Thr Ile Ile Gln Ala Leu Asp Ile Gly Ala 85 90 95 Asn Asp Tyr Met Thr Lys Pro Phe Asn Val Asp Glu Leu Arg Ala Arg 100 105 110 Ile Arg Val Ile Glu Arg Ile Ala Lys Ser His Gln Glu Thr Asn Ile 115 120 125 Val Phe Thr Asn Gly Leu Leu Ser Ile Asp Phe Gly Ser Lys Ser Val 130 135 140 Val Ile Asn Asn Gln Glu Val His Leu Thr Pro Asn Glu Phe Ser Leu 145 150 155 160 Leu Glu Leu Leu Ser Asn His Lys Gly Lys Val Leu Thr Tyr Glu Met 165 170 175 Ile Leu Lys Arg Ile Tyr Gly Tyr Val Asn Lys Thr Glu Met Pro Ser 180 185 190 Leu Arg Val His Met Thr Ser Leu Arg Gln Lys Leu Ser Gln Cys His 195 200 205 Glu Asp Ala Lys Asp Ile Ile Lys Thr His Pro Arg Ile Gly Tyr Gln 210 215 220 Met Leu Gln Trp Lys Glu Lys 225 230
【図面の簡単な説明】
【図1】 スタフィロコッカス・アウレウスのヒスチジ
ンキナーゼのポリヌクレオチド配列[配列番号1]の一
部を示す図。開始コドンの補体は、下線で示され、オー
プンリーディングフレームは、配列番号1の逆方向であ
る。
【図2】 スタフィロコッカス・アウレウスのヒスチジ
ンキナーゼのポリヌクレオチド配列[配列番号1]の一
部(図1の続き)を示す図。開始コドンの補体は、下線
で示され、オープンリーディングフレームは、配列番号
1の逆方向である。
【図3】 スタフィロコッカス・アウレウスのヒスチジ
ンキナーゼのポリヌクレオチド配列[配列番号1]の一
部(図2の続き)を示す図。開始コドンの補体は、下線
で示され、オープンリーディングフレームは、配列番号
1の逆方向である。
【図4】 スタフィロコッカス・アウレウスのヒスチジ
ンキナーゼのポリヌクレオチド配列[配列番号1]の一
部(図3の続き)を示す図。開始コドンの補体は、下線
で示され、オープンリーディングフレームは、配列番号
1の逆方向である。
【図5】 図1〜図4のポリヌクレオチド配列の反対の
鎖から推定されるスタフィロコッカス・アウレウスのヒ
スチジンキナーゼのアミノ酸配列[配列番号2]を示す
図。
【図6】 本発明のコグネート反応レギュレーターの遺
伝子の核酸配列[配列番号3]を示す。開始コドン(A
TG)は、太字であり、下線が引かれている。終止コド
ン(TAA)は、下線が引かれている。
【図7】 図6に示される反応レギュレーターのポリペ
プチドのアミノ酸配列[配列番号4]を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI A61K 38/55 ABE C12N 1/15 39/395 ABL 1/19 ABM 1/21 48/00 ACD 9/12 C07K 16/40 9/99 C12N 1/15 C12Q 1/68 Z 1/19 G01N 33/53 D 1/21 33/531 A 5/10 33/573 A 9/12 A61K 37/52 ABJ 9/99 ACV C12Q 1/68 ADB G01N 33/53 ADZ 33/531 37/64 ABE 33/573 C12N 5/00 B //(C12N 15/09 ZNA C C12R 1:445) (C12N 9/12 C12R 1:445) (71)出願人 595047190 スミスクライン・ビーチャム・パブリッ ク・リミテッド・カンパニー SmithKline Beecham p.l.c. イギリス国ミドルセックス・ティーダブリ ュ8・9イーピー、ブレンフォード、ニュ ー・ホライズンズ・コート(番地の表示な し) (72)発明者 ニコラ・ゲイル・ウォリス アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州ウ ェイン、シュガータウン・ロード219番

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 (a)配列番号2のアミノ酸1〜861
    からなるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
    ドと少なくとも70%同一性を有するポリヌクレオチ
    ド; (b)(a)のポリヌクレオチドと相補的であるポリヌ
    クレオチド;および (c)(a)または(b)のポリヌクレオチドの少なく
    とも15個の連続塩基からなるポリヌクレオチドからな
    る群から選択されるポリヌクレオチド配列からなる単離
    ポリヌクレオチド。
  2. 【請求項2】 ポリヌクレオチドがDNAである請求項
    1記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項3】 ポリヌクレオチドがRNAである請求項
    1記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項4】 配列番号1に記載されているヌクレオチ
    ド1〜2700からなる請求項2記載のポリヌクレオチ
    ド。
  5. 【請求項5】 ヒスチジンキナーゼをコードしているヌ
    クレオチドからなる請求項2記載のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項6】 配列番号2のアミノ酸1〜861からな
    るポリペプチドをコードしている請求項2記載のポリヌ
    クレオチド。
  7. 【請求項7】 (a)NCIMB受託番号40771に
    含まれるヒスチジンキナーゼ遺伝子により発現される同
    一成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド
    と少なくとも70%同一性を有するポリヌクレオチド; (b)(a)のポリヌクレオチドと相補的であるポリヌ
    クレオチド;および (c)(a)または(b)のポリヌクレオチドの少なく
    とも15個の塩基からなるポリヌクレオチドからなる群
    から選択されるメンバーからなる単離ポリヌクレオチ
    ド。
  8. 【請求項8】 請求項2記載のDNAからなるベクタ
    ー。
  9. 【請求項9】 請求項8記載のベクターからなる宿主細
    胞。
  10. 【請求項10】 請求項9記載の宿主細胞から該DNA
    によりコードされているポリペプチドを発現させること
    を特徴とするポリペプチドの製造方法。
  11. 【請求項11】 ポリペプチドを発現する細胞の製造方
    法であって、該細胞がベクターに含まれるcDNAによ
    りコードされているポリペプチドを発現するように請求
    項8記載のベクターにより該細胞を形質転換またはトラ
    ンスフェクトすることを特徴とする製造方法。
  12. 【請求項12】 ヒスチジンキナーゼポリペプチドまた
    はフラグメントの製造方法であって、該ポリペプチドま
    たはフラグメントの生産に充分な条件下で請求項9記載
    の宿主を培養することを特徴とする製造方法。
  13. 【請求項13】 配列番号2のアミノ酸1〜861と少
    なくとも70%同一性を有するアミノ酸配列からなるポ
    リペプチド。
  14. 【請求項14】 配列番号2に記載されているアミノ酸
    配列からなるポリペプチド。
  15. 【請求項15】 請求項13記載のポリペプチドに対す
    る抗体。
  16. 【請求項16】 請求項13記載のポリペプチドの活性
    を阻害する拮抗薬。
  17. 【請求項17】 ヒスチジンキナーゼを必要としている
    個体の治療方法であって、請求項13記載のポリペプチ
    ドの治療有効量を該個体に投与することを特徴とする治
    療方法。
  18. 【請求項18】 該ポリペプチドをコードしているDN
    Aを該個体に与え、in vivoで該ポリペプチドを発現さ
    せることにより、ポリペプチドの治療有効量が投与され
    る請求項16記載の方法。
  19. 【請求項19】 ヒスチジンキナーゼポリペプチドを阻
    害することを必要としている個体の治療方法であって、
    請求項16記載の拮抗薬の治療有効量を該個体に投与す
    ることを特徴とする治療方法。
  20. 【請求項20】 請求項13記載のポリペプチドの発現
    に関係する疾患の診断方法であって、 該ポリペプチドをコードしている核酸配列を決定するこ
    とを特徴とする診断方法。
  21. 【請求項21】 宿主由来の試料において請求項13記
    載のポリペプチドの存在について分析することを特徴と
    する診断方法。
  22. 【請求項22】 請求項13記載のポリペプチドに結合
    し、該ポリペプチドの活性を阻害する化合物の同定方法
    であって、 該化合物への結合を可能にするような条件下、該化合物
    の結合(ここで、該結合は、該化合物の結合に応答して
    検出可能なシグナルを提供する能力を有する第二成分に
    関連している)を評価するための該ポリペプチドからな
    る組成物をスクリーンに付されるべき化合物と接触さ
    せ、 該化合物と結合部位との相互作用により生じたシグナル
    の存在または不在を検出することにより、該化合物が結
    合部位に結合し、該結合部位を活性化するかまたは阻害
    するかを決定することを特徴とする同定方法。
  23. 【請求項23】 抗体および/またはT細胞免疫応答を
    生じさせて哺乳動物を疾患から保護するのに適切なヒス
    チジンキナーゼまたはそのフラグメントもしくは変種を
    哺乳動物に接種することを特徴とする、哺乳動物におけ
    る免疫学的応答の誘発方法。
  24. 【請求項24】 免疫学的応答を誘発して抗体および/
    またはT細胞免疫応答を生産させて哺乳動物を疾患から
    保護するために、ヒスチジンキナーゼまたはそのフラグ
    メントもしくは変種をin vivoで発現させるための、ヒ
    スチジンキナーゼフラグメントまたはその変種の発現を
    指向する核酸ベクターを送達することを特徴とする、哺
    乳動物における免疫学的応答の誘発方法。
  25. 【請求項25】 哺乳動物に導入した場合に該哺乳動物
    において所定のヒスチジンキナーゼポリヌクレオチドま
    たはそれによりコードされているタンパク質に対する免
    疫学的応答を誘発するヒスチジンキナーゼポリヌクレオ
    チドをコードし発現するDNAまたはそれによりコード
    されているタンパク質を含有してなる免疫学的組成物。
  26. 【請求項26】 実質的に、配列番号1に記載されてい
    るポリヌクレオチド配列の配列またはそのフラグメント
    を有するプローブを用いてストリンジェントハイブリダ
    イゼーション条件下で配列番号1で示されるポリヌクレ
    オチド配列について完全な遺伝子を含有する適切なライ
    ブラリーをスクリーニングし、次いで、DNA配列を単
    離することにより得ることができるDNA配列からなる
    ポリヌクレオチド。
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