JPH11253180A - 新規ヒスチジンキナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒスチジンキナーゼポリペプチドおよびヒス
チジンキナーゼポリペプチドをコードしているＤＮＡ
（ＲＮＡ）、および組み換え法によるかかるポリペプチ
ドの製造方法、ならびに感染、詳細には細菌感染に対す
る防御のためのヒスチジンキナーゼポリペプチドの使用
方法を提供する。 【解決手段】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して少
なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド、ならびに配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペ
プチドコードしているポリヌクレオチドに対して少なく
とも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにそれら
の製造および使用、ならびにそれらの変種、アゴニスト
およびアンタゴニスト、そしてそれらの使用に関する。
詳細には、これらの点および他の点に関して、本発明
は、ヒスチジンキナーゼファミリーの新規ポリヌクレオ
チドおよびポリペプチド（以下、「ヒスチジンキナー
ゼ」という）に関する。

【０００２】

【従来の技術】ストレプトコッカス属（Streptococci）
は医学的に重要な微生物属を形成しており、ヒトにおい
て、例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静
脈洞炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には例えば脳脊
髄液の感染のごとき髄膜炎を包含する、いくつかの型の
疾患を引き起こすことが知られている。ストレプトコッ
カス属の単離から１００年以上も経過しているため、ス
トレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pn
eumoniae）は、より詳細な研究がなされた微生物の一つ
である。例えば、事実、ＤＮＡが遺伝物質であるという
初期の見解の大部分は、この微生物を用いたGriffithな
らびに、Avery、MacleodおよびMcCartyの研究において
述べられた。ストレプトコッカス・ニューモニアエに関
する研究は膨大であるにも関わらず、この微生物の毒性
に関しては多くの疑問が残されている。抗生物質の開発
のための標的としてストレプトコッカス属の遺伝子およ
び遺伝子産物を用いるのはとりわけ好ましいことであ
る。

【０００３】ストレプトコッカス・ニューモニアエ感染
の頻度は過去２０年間に劇的に上昇している。これは多
重抗生物質耐性株の出現、および免疫系が低下した人の
集団の増加に起因している。いくつかのまたは全ての標
準的な抗生物質に対して耐性を有するストレプトコッカ
ス・ニューモニアエ株を単離することはもはやめずらし
いことではない。この現象がこの生物に対する新しい抗
菌剤、ワクチンおよび診断試験についての必要性を形成
した。病原性に関連したある種のストレプトコッカスの
因子、例えば、きょう膜多糖、ペプチドグリカン、ニュ
ーモリシン、ＰｓｐＡ補体因子Ｈ結合成分、オートリシ
ン、ノイラミニダーゼ、ペプチドパーメアーゼ、過酸化
水素、ＩｇＡ１プロテアーゼが同定されているが、それ
らがすべてではない。さらに、哺乳動物宿主における感
染および疾病の進行中におけるかかる遺伝子の一時的発
現に関してはほとんどわかっていない。細菌は感染の異
なる段階、詳細には感染が確立された時に発現される可
能性がある細菌の遺伝子のセットを発見することは、発
症を妨害しうる新規抗微生物剤のスクリーニングおよび
特徴づけに関する重要な情報を提供する。かかるアプロ
ーチは、既知蛋白についてのより十分な理解を提供する
ことのほかに、従来認識されていなかった標的を同定す
るであろう。

【０００４】多くの２成分シグナルトランスダクション
系（ＴＣＳＴＳ）が細菌において同定されている（Stoc
k, J. B., Ninfa, A. J. & Stock, A. M. (1989) Micro
biol. Rev. 53, 450-490）。これらは周囲の環境をモニ
ターし、その環境の変化に対応する細菌の能力に関与し
ている。これらの細菌のＴＣＳＴＳのいくつかは宿主内
の毒性および細菌性の発病に関与している。ヒスチジン
キナーゼは、ヒスチジンを自己リン酸化するＴＣＳＴＳ
の成分である。次いで、リン酸基は同種の応答レギュレ
ーターに転移される。ヒスチジンキナーゼは５つの短い
保存されたアミノ酸配列を有している（Stock, J. B.,
Ninfa, A. J. & Stock, A. M. (1989) Microbiol. Rev.
53, 450-490、Swanson, R.V., Alex, L. A. & Simon,
M. I. (1994) TIBS 19 485-491）。これらはリン酸化さ
れたヒスチジン残基であり、約１００残基後に保存され
たアスパラギン残基が続いている。さらに１５ないし４
５残基後にＤＸＧＸＧモチーフが見られ、さらに１０〜
２０残基後にＦＸＸＦモチーフがある。さらに１０〜２
０残基行ったところにもう１つのグリシンモチーフＧＸ
Ｇが見られる。２つのグリシンモチーフはヌクレオチド
結合に関与していると考えられる。ヒスチジンキナーゼ
のこのファミリーはバチルス・ズブチリス（Bacillus s
ubtilis）由来のＰｈｏＲ蛋白を包含する。ＰｈｏＲ
は、アルカリ性ホスファターゼ生成に関与する遺伝子を
調節するＴＣＳＴＳのヒスチジンキナーゼである（Sek
i, T., Yoshikawa, H., Takahashi, H. & Saito, H.,
(1988) J. Bacteriol. 170, 5935-5938）。応答レギュ
レーターはＴＣＳＴＳの成分である。これらの蛋白はヒ
スチジンキナーゼによりリン酸化され、次いで、一旦リ
ン酸化されると、しばしばＤＮＡ結合ドメインを介する
応答が活性化される。応答レギュレーターは約１００個
のアミノ酸の保存されたＮ末端ドメインにより特徴づけ
られる。応答レギュレーターのＮ末端ドメインならびに
ＣｈｅＹ（Matsumura, P., Rydel, J. J., Linzmeier,
R. & Vacante, D. (1984) J. Bacteriol. 160, 36-41）
におけるＤ１２、Ｄ１３、Ｄ５７、Ｔ８７およびＫ１０
９に対応する５個の重要な残基を保持していることが、
構造的特徴を形成している（Volz, K. (1993) Biochemi
stry 32, 11741-11753）。Salmonella typhimurium（St
ock, A. M., Mottonen, J. M., Stock,J. B. & Schutt,
C. E. (1989) Nature, 337, 745-749）およびEscheric
hia coli（Volz, K & Matsumura, P. (1991) J. Biol.
Chem. 266, 15511-15519）由来のＣｈｅＹの３次元構
造、およびS.typhimurium由来の窒素調節蛋白ＣのＮ末
端ドメイン（Volkman, B. F., Nohaile, M. J., Amy,
N. K., Kutsu, S. & Wemmer, D. E. (1995) Biochemist
ry, 34 1413-1424）が、Bacillus subtilis由来のＳｐ
ｏＯＦの２次構造（Feher, V. A., Zapf, J. W., Hoch,
J. A., Dahlquist, F. W., Whiteley, J. M. & Cavana
gh, J. (1995) Protein Science, 4, 1801-1814）と同
様に利用可能である。これらの構造は（ａ／ｂ）５折り
畳みを有する。異なる応答レギュレーター配列間で、詳
細にはβ−シート疎水性コアおよびα−ヘリックス由来
の部位においていくつかの構造残基が保存されている。
毒性因子の生成、運動性、抗生物質耐性および細胞複製
はＴＣＳＴＳにより調節されるプロセスである。ＴＣＳ
ＴＳ蛋白の阻害剤は、発症に必要な因子を生成を妨害す
ることにより細菌が宿主感染を確立し維持することを妨
害し、それゆえ、抗細菌療法において有用である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】明らかに、抗生物質活
性に関して化合物をスクリーニングするのに有用である
という目下の利益を有する、本発明新規化合物のごとき
因子に対する必要性がある。かかる因子は、感染、機能
不全および疾病の発生におけるそれらの役割を調べるの
にも有用である。感染、機能不全または疾病の予防、改
善または修正において役割を果たしうる、かかる因子な
らびにそれらのアンタゴニストおよびアゴニストに対す
る必要性もある。

【０００６】本発明ポリペプチドは、既知のバチルス・
ズブチリスのｐｈｏＲ蛋白に対するアミノ酸配列相同性
を有する。Seki et al., "Nucleotide sequence of the
Bacillus subtilis phoR gene", J. Bacteriol. 170(1
2), 5935-5938; SWISS-PROT受託番号P23545参照。Yamad
a et al., "Regulation of the phosphate regulaonof
Escherichia coli: properties of phoR deletion muta
nts and subcellular localization of phoR protein",
Mol. Gen. Genet. 1990 Feb; 220(3): 366-372;および
Makino et al., "Nucleotide sequence of the phoR ge
ne, a regulatory gene for the phosphate regulon of
Escherichia coli", J. Mol. Biol.1986 Dec 5; 192
(3):549-556 も参照。

【０００７】

【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
表１（配列番号：２）に示すアミノ酸配列および既知ア
ミノ酸配列またはバチルス・ズブチリス由来のｐｈｏＲ
蛋白のごとき他の蛋白の配列の間の相同性により、新規
ヒスチジンキナーゼポリペプチドであると同定されたポ
リペプチド提供することが本発明の目的である。ヒスチ
ジンキナーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレ
オチド、詳細には本明細書でヒスチジンキナーゼと命名
されたポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド
を提供することが本発明のさらなる目的である。本発明
の特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、
表１（配列番号：１）に示す配列を含むヒスチジンキナ
ーゼポリペプチドをコードする領域を含み、全長遺伝子
またはその変種が包含される。本発明のもう１つの特に
好ましい具体例において、表１（配列番号：２）のアミ
ノ酸配列を含むストレプトコッカス・ニューモニアエ由
来の新規ヒスチジンキナーゼ蛋白、またはその変種があ
る。本発明のもう１つの態様によれば、寄託株に含まれ
るストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993株によ
り発現可能な成熟ポリペプチドをコードしている単離核
酸分子が提供される。

【０００８】本発明のさらなる態様は、ヒスチジンキナ
ーゼ、詳細にはストレプトコッカス・ニューモニアエの
ヒスチジンキナーゼをコードしている単離核酸分子が提
供され、それにはｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが
包含される。本発明のさらなる具体例は、生物学的、診
断学的、予防的、臨床的もしくは治療的に有用なその変
種、およびそれらを含む組成物を包含する。本発明のも
う１つの態様によれば、治療または予防を目的とした、
特に遺伝学的免疫を目的とした、本発明ポリヌクレオチ
ドの使用が提供される。本発明の特に好ましい具体例に
は、ヒスチジンキナーゼの天然に存在する対立遺伝子変
種およびそれによりコードされるポリペプチドがある。

【０００９】本発明のもう１つの態様において、本明細
書においてヒスチジンキナーゼと称されるストレプトコ
ッカス・ニューモニアエの新規ポリペプチド、ならびに
生物学的、診断学的、予防的、臨床的もしくは治療的に
有用なそのフラグメント、変種および誘導体、および前
記したフラグメントおよびアナログの変種および誘導
体、およびそれらを含む組成物が提供される。本発明の
特に好ましい具体例には、ヒスチジンキナーゼ遺伝子の
天然に存在する対立遺伝子によりコードされるヒスチジ
ンキナーゼポリペプチドの変種がある。本発明の好まし
い具体例において、上記ヒスチジンキナーゼポリペプチ
ドの製造方法がある。本発明のさらに別の態様によれ
ば、例えば、抗体を含め、抗細菌剤として有用なかかる
ポリペプチドの阻害剤が提供される。

【００１０】本発明の特定の好ましい具体例によれば、
ヒスチジンキナーゼ発現の評価、疾病の治療、例えば中
耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸
および心内膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染の
ごとき髄膜炎の治療、遺伝学的変異のアッセイ、ならび
に細菌、特にストレプトコッカス・ニューモニアエ細菌
に対する免疫学的応答を生起するための生物へのヒスチ
ジンキナーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投
与のための、製品、組成物および方法が提供される。

【００１１】本発明のこのおよび他の態様の特定の好ま
しい具体例によれば、特に、厳密な条件下でヒスチジン
キナーゼポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーショ
ンするポリヌクレオチドが提供される。本発明の特定の
好ましい具体例において、ヒスチジンキナーゼポリペプ
チドに対する抗体が提供される。本発明の他の具体例に
おいて、本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの
結合、あるいは相互作用して、それらの活性を阻害また
は活性化する化合物の同定方法が提供され、該方法は、
化合物とポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの間の
結合あるいは他の相互作用を可能にする条件下で、本発
明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをスクリーニン
グすべき化合物と接触させて、化合物との結合あるいは
他の相互作用を評価し（かかる結合または相互作用は、
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと化合物との結合
あるいは相互作用に応答して検出可能なシグナルを提供
することのできる第２の化合物に関連している）、次い
で、化合物とポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの
結合または相互作用から生じるシグナルの存在または不
存在を検出することにより、化合物がポリペプチドまた
はポリヌクレオチドに結合あるいは相互作用して、それ
らの活性を活性化または阻害するかどうかを決定するこ
とを含む。本発明のさらにもう１つの態様によれば、ヒ
スチジンキナーゼのアゴニストおよびアンタゴニスト、
好ましくは静細菌性または殺細菌性アゴニストおよびア
ンタゴニストが提供される。本発明のさらなる態様にお
いて、単細胞または多細胞生物に投与するための、ヒス
チジンキナーゼポリヌクレオチドまたはヒスチジンキナ
ーゼポリペプチドを含む組成物が提供される。開示した
本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾
は、以下の記載を読むこと、および本明細書のその他の
部分を読むことにより、当業者に容易に明らかとなろ
う。

【００１２】用語 以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配列によ
り形質転換もしくはトランスフェクションされた、また
は形質転換またはトランスフェクションすることのでき
る細胞である。

【００１３】当該分野にて周知であるように「同一性」
は、配列を比較して測定されるような、二つまたはそれ
以上のポリペプチド配列間または二つまたはそれ以上の
ポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野におい
て、「同一性」とはまた、時には、かかる配列の２つの
鎖の間の合致により決定されるような２つのポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチド配列間の関連性の程度をも意
味する。「同一性」および「類似性」はともに既知方法
により容易に算出できる（Computational Molecular Bi
ology，Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシテ
ィー・プレス、ニューヨーク、1988年；Biocomputing：
Informatics and Genome Projects，Smith,D.W.編、ア
カデミック・プレス、ニューヨーク、1993年；Computer
Analysisof Sequence Data，パートＩ，Griffin,A.M.
およびGriffin,H.G.編、ヒューマナ・プレス、ニュージ
ャージー、1994年；Sequence Analysis in Molecular B
iology，von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1987
年；およびSequence Analysis Primer，Gribskov,M.お
よびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレス、ニュー
ヨーク、1991年;およびCarillo,H.,およびLipman,D.,SI
AM J., Applied Math., 48:1073(1988)があるがこれら
に限らない）。同一性を決定するための好ましい方法
は、試験する２つの配列間で最も良く適合するように設
計される。同一性および類似性を測定する方法は、公に
利用できるコンピュータープログラムに集成されてい
る。二つの配列間の同一性および類似性を測定する好ま
しいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラム
パッケージ（Devereux,J.ら、NucleicAcids Research 1
2(1):387（1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Atsch
ul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215：403（1990）））を包含
するが、これらに限定されるものではない。一例とし
て、配列番号：１の対照ヌクレオチド配列に対して、例
えば少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチドを挙げると、そのポリヌク
レオチド配列が配列番号：１の対照ヌクレオチド酸配列
のヌクレオチド１００個ごとに５個までのヌクレオチド
の変化を含みうることを除き、そのポリヌクレオチドの
ヌクレオチド配列は対照配列と同一である。言い換える
と、対照酸配列に対して少なくとも９５％同一であるヌ
クレオチド配列を有するポリペプチドを得るためには、
対照配列中の５％までのヌクレオチドが欠失または別の
ヌクレオチドと置換されていてもよく、あるいは対照配
列中の全ヌクレオチドのうち５％までの数のヌクレオチ
ドが対照配列に挿入されたものであってもよい。対照配
列のこれらの変異は、対照ヌクレオチド配列の５’また
は３’末端位置に存在していてもよく、あるいはそれら
の末端位置の間のいずれかの位置に存在していてもく、
対照配列のヌクレオチドに散在していてもよく、あるい
は対照配列内の１個またはそれ以上の一連の群となって
いてもよい。同様に、配列番号：２の対照アミノ酸配列
に対して少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを例に挙げると、そのポ
リペプチド配列が配列番号：２の対照アミノ酸配列のア
ミノ酸１００個ごとに５個までのアミノ酸の変化を含み
うることを除き、そのポリペプチドのアミノ酸配列は対
照配列と同一である。言い換えると、対照アミノ酸配列
に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有
するポリペプチドを得るためには、対照配列中のアミノ
酸の５％までが欠失または他のアミノ酸と置換していて
もよく、あるいは対照配列中の全アミノ酸のうち５％ま
での数のアミノ酸が対照配列中に挿入されたものであっ
てもよい。対照配列におけるこれらの変化は、対照アミ
ノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置に存在して
もよく、あるいはそれらの末端間のいずれかの位置に存
在してもよく、対照配列中に散在していてもよく、ある
いは対照配列内で１個またはそれ以上の一連の群をなし
ていてもよい。

【００１４】「単離」とは、「人の手によって」天然の
状態から変化させられた、すなわち、天然物の場合、そ
の本来の環境から変化または除去あるいはその両方が行
われたことを意味する。例えば、天然において生体に存
在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単
離」されていないが、その天然状態で共存する物質から
分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、本明細書に用いる用語としての「単離」がなされて
いる。

【００１５】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、ポリ
リボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド
をも意味する。従って、「ポリヌクレオチド」は、とり
わけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領
域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混
合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならび
に一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本
鎖もしくはより典型的には二本鎖もしくは三本鎖、また
は一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮ
ＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するがこ
れらに限らない。加えて、本明細書で用いる「ポリヌク
レオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤ
ＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。かかる領域に
おける鎖は同一の分子または異なる分子由来のものでよ
い。この領域はこれらの分子の一つまたはそれ以上の全
てを含んでいてもよいが、より典型的にはいくつかの分
子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つ
は、オリゴヌクレオチドであることがしばしばである。
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」なる用語
は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有する、前
記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。このように、安
定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡま
たはＲＮＡも、本明細書が意図するろところの「ポリヌ
クレオチド」である。さらに、イノシン等の普通でない
塩基、またはトリチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡ
またはＲＮＡ（二つの例だけを示す）も、本明細書での
用語ポリペプチドである。当業者に既知の多くの有用な
目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多くの修
飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリヌク
レオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポリヌ
クレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的に
修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型細胞
および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡおよび
ＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」
は、しばしば、オリゴヌクレオチド（複数でも可）と称
される短鎖ポリヌクレオチドを包含する。

【００１６】本明細書で用いる「ポリペプチド」は、ペ
プチド結合により直鎖で互いに結合している２個または
それ以上のアミノ酸を含むペプチドまたは蛋白をいうの
に用いる。「ポリペプチド」は、当該分野で通常例えば
ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称され
る短鎖、および多くの型があり、当該分野で一般的に蛋
白と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、遺
伝子によりコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ
酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、プロセッ
シングおよび他の翻訳後修飾のような自然の工程によ
り、ならびに化学修飾によるものを包含する。かかる修
飾は基礎的なテキストおよびさらに詳細な論文ならびに
多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当
業者に周知である。同じタイプの修飾がポリペプチド中
にいくつかの部位に同程度または種々の程度で存在して
もよいことが理解されるであろう。修飾は、ペプチド骨
格、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシ末
端を包含するポリペプチドのいずれの場所にあってもよ
い。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、Ａ
ＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘ
ム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ
スホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、
ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋形
成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル
化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアン
カー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、蛋白加水分解プロセッシング、リン
酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、
アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介の蛋白へのアミノ酸
付加、およびユビキチネーションがある。例えば、Prot
eins-Structure and Molecular Properties、第2版、T.
E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク
（1993）に記載されている。例えば、Posttranslationa
l Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson
編、アカデミック・プレス、ニューヨーク（1983）のWo
ld,F., Posttranslational Protein Modifications：Pe
rspective and Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.
Enzymol. 182:626-646（1990）およびRattanら、Protei
n Synthesis：Posttranslational Modifications and A
ging，Ann. N. Y. Acad. Sci. 663:48-62（1992）参
照。ポリペプチドは分枝状あるいは分枝ありまたはなし
の環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝状か
つ環状のポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから生
じるものであってもよく、同様に全く合成的な方法によ
り製造されるものであってもよい。

【００１７】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の変化は、対照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。以下に論じるように、ヌクレオチ
ドの変化は結果的に、対照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合およ
び末端切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別
の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的
には、差異は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、
全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一なもの
に限られる。変種および対照ポリペプチドは、１または
それ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせで起こ
ることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換または
挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コードによりコー
ドされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドの変種は、例えば対立遺伝子変種
のような自然発生的なものでもよく、または自然発生す
ることが知られていない変種でもよい。ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの非自然発生変種は、突然変異技
術または直接的合成、および当業者に知られた他の組み
換え法により製造できる。

【００１８】本発明は、とりわけ、以下に非常に詳細に
説明する、新規ヒスチジンキナーゼポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドに関する。詳細には、本発明は、バチ
ルス・ズブチリス由来のｐｈｏＲポリペプチドに対する
アミノ酸配列相同性により関連付けられる、ストレプト
コッカス・ニューモニアエの新規ヒスチジンキナーゼの
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。Geneba
nk受託番号Ｕ７５４８３参照。特に本発明は、それぞれ
表１（配列番号：１）および表１（配列番号：２）に示
すヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するヒスチ
ジンキナーゼに関し、さらに寄託株中のＤＮＡのヒスチ
ジンキナーゼヌクレオチド配列およびそれによりコード
されるアミノ酸配列に関する。

【００１９】 表１ ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列 （Ａ）ストレプトコッカス・ニューモニアエのヒスチジンキナーゼポリヌクレオ チド配列由来の配列 [配列番号：1]. 5'-1 ATGAAACTAA AAAGTTATAT TTTGGTTGGA TATATTATTT CAACCCTCTT 51 AACCATTTTG GTTGTTTTTT GGGCTGTTCA AAAAATGCTG ATTGCGAAAG 101 GCGAGATTTA CTTTTTGCTT GGGATGACCA TCGTTGCCAG CCTTGTCGGT 151 GCTGGGATTA GTCTCTTTCT CCTATTGCCA GTCTTTACGT CGTTGGGCAA 201 ACTCAAGGAG CATGCCAAGC GGGTAGCGGC CAAGGATTTT CCTTCAAATT 251 TGGAGGTTCA AGGTCCTGTA GAATTTCAGC AATTAGGGCA AACTTTTAAT 301 GAGATGTCCC ATGATTTGCA GGTAAGCTTT GATTCCTTGG AAGAAAGCGA 351 ACGAGAAAAG GGCTTGATGA TTGCCCAGTT GTCGCATGAT ATTAAGACCC 401 CTATCACTTC GATCCAAGCG ACGGTAGAAG GGATTTTGGA TGGGATTATC 451 AAGGAGTCGG AGCAAGCTCA TTATCTAGCA ACCATTGGAC GCCAGACGGA 501 GAGGCTCAAT AAACTGGTTG AGGAGTTGAA TTTTTTGACC CTAAACACAG 551 CTAGAAATCA GGTGGAAACT ACCAGTAAAG ACAGTATTTT TCTGGACAAG 601 CTCTTAATTG AGTGCATGAG TGAATTTCAG TTTTTGATTG AGCAGGAGAG 651 AAGAGATGTC CACTTGCAGG TAATCCCAGA GTCTGCCCGG ATTGAGGGAG 701 ATTATGCTAA GCTTTCTCGT ATCTTGGTGA ATCTGGTCGA TAACGCTTTT 751 AAATATTCTG CTCCAGGAAC CAAGCTGGAA GTGGTGACTA AGCTGGAGAA 801 GGGCCAGCTT TCAATCAGTG TGACCGATGA AGGGCAGGGC ATTGCCCCAG 851 AGGATTTGGA AAATATTTTC AAACGCCTTT ATCGTGTCGA AACTTCGCGT 901 AACATGAAGA CAGGTGGTCA TGGATTAGGA CTTGCGATTG CGCGTGAATT 951 GGCCCATCAA TTGGGTGGGG AAATCACAGT CAGCAGCCAG TACGGTCTAG 1001 GAAGTACCTT TACCCTCGTT CTCAATCTCT CTGGTAGTGA AAATAAAGCC TAA -3'

【００２０】 （Ｂ）この表中のポリヌクレオチド配列から推定されるヒスチジンキナーゼポリ ペプチド配列 [配列番号：2]. NH₂-1 MKLKSYILVG YIISTLLTIL VVFWAVQKML IAKGEIYFLL GMTIVASLVG 51 AGISLFLLLP VFTSLGKLKE HAKRVAAKDF PSNLEVQGPV EFQQLGQTFN 101 EMSHDLQVSF DSLEESEREK GLMIAQLSHD IKTPITSIQA TVEGILDGII 151 KESEQAHYLA TIGRQTERLN KLVEELNFLT LNTARNQVET TSKDSIFLDK 201 LLIECMSEFQ FLIEQERRDV HLQVIPESAR IEGDYAKLSR ILVNLVDNAF 251 KYSAPGTKLE VVTKLEKGQL SISVTDEGQG IAPEDLENIF KRLYRVETSR 301 NMKTGGHGLG LAIARELAHQ LGGEITVSSQ YGLGSTFTLV LNLSGSENKA -COOH

【００２１】 （Ｃ）ポリヌクレオチド配列の具体例 [配列番号：1]. X-(R1)n-1 ATGAAACTAA AAAGTTATAT TTTGGTTGGA TATATTATTT CAACCCTCTT 51 AACCATTTTG GTTGTTTTTT GGGCTGTTCA AAAAATGCTG ATTGCGAAAG 101 GCGAGATTTA CTTTTTGCTT GGGATGACCA TCGTTGCCAG CCTTGTCGGT 151 GCTGGGATTA GTCTCTTTCT CCTATTGCCA GTCTTTACGT CGTTGGGCAA 201 ACTCAAGGAG CATGCCAAGC GGGTAGCGGC CAAGGATTTT CCTTCAAATT 251 TGGAGGTTCA AGGTCCTGTA GAATTTCAGC AATTAGGGCA AACTTTTAAT 301 GAGATGTCCC ATGATTTGCA GGTAAGCTTT GATTCCTTGG AAGAAAGCGA 351 ACGAGAAAAG GGCTTGATGA TTGCCCAGTT GTCGCATGAT ATTAAGACCC 401 CTATCACTTC GATCCAAGCG ACGGTAGAAG GGATTTTGGA TGGGATTATC 451 AAGGAGTCGG AGCAAGCTCA TTATCTAGCA ACCATTGGAC GCCAGACGGA 501 GAGGCTCAAT AAACTGGTTG AGGAGTTGAA TTTTTTGACC CTAAACACAG 551 CTAGAAATCA GGTGGAAACT ACCAGTAAAG ACAGTATTTT TCTGGACAAG 601 CTCTTAATTG AGTGCATGAG TGAATTTCAG TTTTTGATTG AGCAGGAGAG 651 AAGAGATGTC CACTTGCAGG TAATCCCAGA GTCTGCCCGG ATTGAGGGAG 701 ATTATGCTAA GCTTTCTCGT ATCTTGGTGA ATCTGGTCGA TAACGCTTTT 751 AAATATTCTG CTCCAGGAAC CAAGCTGGAA GTGGTGACTA AGCTGGAGAA 801 GGGCCAGCTT TCAATCAGTG TGACCGATGA AGGGCAGGGC ATTGCCCCAG 851 AGGATTTGGA AAATATTTTC AAACGCCTTT ATCGTGTCGA AACTTCGCGT 901 AACATGAAGA CAGGTGGTCA TGGATTAGGA CTTGCGATTG CGCGTGAATT 951 GGCCCATCAA TTGGGTGGGG AAATCACAGT CAGCAGCCAG TACGGTCTAG 1001 GAAGTACCTT TACCCTCGTT CTCAATCTCT CTGGTAGTGA AAATAAAGCC -(R2)n-Y

【００２２】 （Ｄ）ポリペプチド配列の具体例 [配列番号：2]. X-(R1)n-1 MKLKSYILVG YIISTLLTIL VVFWAVQKML IAKGEIYFLL GMTIVASLVG 51 AGISLFLLLP VFTSLGKLKE HAKRVAAKDF PSNLEVQGPV EFQQLGQTFN 101 EMSHDLQVSF DSLEESEREK GLMIAQLSHD IKTPITSIQA TVEGILDGII 151 KESEQAHYLA TIGRQTERLN KLVEELNFLT LNTARNQVET TSKDSIFLDK 201 LLIECMSEFQ FLIEQERRDV HLQVIPESAR IEGDYAKLSR ILVNLVDNAF 251 KYSAPGTKLE VVTKLEKGQL SISVTDEGQG IAPEDLENIF KRLYRVETSR 301 NMKTGGHGLG LAIARELAHQ LGGEITVSSQ YGLGSTFTLV LNLSGSENKA -(R2)n-Y

【００２３】 （Ｅ）ストレプトコッカス・ニューモニアエのヒスチジンキナーゼポリヌクレオ チド配列由来の配列［配列番号：３］（さらなる３’および５’非翻訳配列を包 含） 5'- 1 AGATAGAGAA ACCGAGAGGA CAAACATGAA ACTAAAAAGT TATATTTTGG 51 TTGGATATAT TATTTCAACC CTCTTAACCA TTTTGGTTGT TTTTTGGGCT 101 GTTCAAAAAA TGCTGATTGC GAAAGGCGAG ATTTACTTTT TGCTTGGGAT 151 GACCATCGTT GCCAGCCTTG TCGGTGCTGG GATTAGTCTC TTTCTCCTAT 201 TGCCAGTCTT TACGTCGTTG GGCAAACTCA AGGAGCATGC CAAGCGGGTA 251 GCGGCCAAGG ATTTTCCTTC AAATTTGGAG GTTCAAGGTC CTGTAGAATT 301 TCAGCAATTA GGGCAAACTT TTAATGAGAT GTCCCATGAT TTGCAGGTAA 351 GCTTTGATTC CTTGGAAGAA AGCGAACGAG AAAAGGGCTT GATGATTGCC 401 CAGTTGTCGC ATGATATTAA GACCCCTATC ACTTCGATCC AAGCGACGGT 451 AGAAGGGATT TTGGATGGGA TTATCAAGGA GTCGGAGCAA GCTCATTATC 501 TAGCAACCAT TGGACGCCAG ACGGAGAGGC TCAATAAACT GGTTGAGGAG 551 TTGAATTTTT TGACCCTAAA CACAGCTAGA AATCAGGTGG AAACTACCAG 601 TAAAGACAGT ATTTTTCTGG ACAAGCTCTT AATTGAGTGC ATGAGTGAAT 651 TTCAGTTTTT GATTGAGCAG GAGAGAAGAG ATGTCCACTT GCAGGTAATC 701 CCAGAGTCTG CCCGGATTGA GGGAGATTAT GCTAAGCTTT CTCGTATCTT 751 GGTGAATCTG GTCGATAACG CTTTTAAATA TTCTGCTCCA GGAACCAAGC 801 TGGAAGTGGT GACTAAGCTG GAGAAGGGCC AGCTTTCAAT CAGTGTGACC 851 GATGAAGGGC AGGGCATTGC CCCAGAGGAT TTGGAAAATA TTTTCAAACG 901 CCTTTATCGT GTCGAAACTT CGCGTAACAT GAAGACAGGT GGTCATGGAT 951 TAGGACTTGC GATTGCGCGT GAATTGGCCC ATCAATTGGG TGGGGAAATC 1001 ACAGTCAGCA GCCAGTACGG TCTAGGAAGT ACCTTTACCC TCGTTCTCAA 1051 TCTCTCTGGT AGTGAAAATA AAGCCTAAAA CCCCTTTACA AATCCAG -3'

【００２４】寄託物質 ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0100993株を含有
する寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・イン
ダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッ
ド（ＮＣＩＭＢという）、２３ストリート、マッカード
ライブ、アベルディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランド
に１９９６年４月１１日寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４
０７９４が付与された。寄託したことにより、寄託株を
ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0100993株とい
う。１９９６年４月１７日に、イー・コリ（E. coli）
中のストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993ＤＮ
ＡライブラリーをＮＣＩＭＢに同様に寄託し、受託番号
４０８００を付与された。ストレプトコッカス・ニュー
モニアエ株寄託物を、本明細書では「寄託株」または
「寄託株のＤＮＡ」という。

【００２５】寄託株は全長のヒスチジンキナーゼ遺伝子
を含んでいる。寄託株中に含まれるポリヌクレオチド配
列ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列は、本明細書の配列に関する任意の記載に矛盾
する事象において支配的である。寄託株の寄託は、特許
手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条
約の条件下でなされている。特許が発行されると何らの
制限または条件もなく、最終的に株は分譲される。寄託
は当業者の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.
１１２条のもとに要求されるような、寄託が実施可能要
件であることを承認するものではない。寄託物を製造、
使用または販売するためにはライセンスが必要である
が、そのようなライセンスはここでは賦与されていな
い。

【００２６】ポリペプチド 本発明ポリペプチドは表１［配列番号：２］のポリペプ
チド（詳細には、成熟ポリペプチド）ならびにポリペプ
チドおよびフラグメント、詳細にはヒスチジンキナーゼ
の生物学的活性を有するものを包含し、さらに表１［配
列番号：２］のポリペプチドまたはその重要部分に対し
て少なくとも７０％、好ましくは表１［配列番号：２］
のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有
するポリペプチドおよびフラグメント、より好ましくは
表１［配列番号：２］のポリペプチドに対して少なくと
も９０％の類似性を有し（より好ましくは、少なくとも
９０％の同一性を有し）、さらにより好ましくは表１
［配列番号：２］のポリペプチドに対して少なくとも９
５％の類似性を有する（さらにより好ましくは少なくと
も９５％の同一性を有する）ポリペプチドおよびフラグ
メント、さらに通常には少なくとも３０個、より好まし
くは少なくとも５０個のアミノ酸を含むかかるポリペプ
チドの部分を包含する。

【００２７】また本発明は表１（Ｄ）に示す式のポリペ
プチドを包含し、式中のアミノ末端においてＸは水素で
あり、カルボキシル末端においてＹは水素または金属で
あり、Ｒ₁およびＲ₂はアミノ酸残基、ｎは１ないし１０
００の整数である。Ｎが１より大きいいずれかのＲ基に
より示されるアミノ酸残基の伸長部分はヘテロポリマー
であってもホモポリマーであってもよく、好ましくはヘ
テロポリマーである。

【００２８】フラグメントは、前述のポリペプチドのア
ミノ酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であ
るアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ヒス
チジンキナーゼポリペプチドについては、フラグメント
は「独立して存在（free standing）」しているか、ま
たは一部分もしくは領域を形成することにより、大型の
ポリペプチド内に含まれていてもよく、最も好ましくは
単一の連続した領域、すなわち大型の単一ポリペプチド
として含まれる。好ましいフラグメントは、表１［配列
番号：２］のアミノ酸配列の一部分を有する末端切断さ
れたポリペプチド、またはそれらの変種を包含するが、
その例としてはアミノ末端を含む一連の残基を切断、ま
たはカルボキシル末端を含む一連の残基を切断したもの
がある。宿主、とりわけストレプトコッカス・ニューモ
ニアエにおける、本発明のポリペプチドの分解形態もま
た好ましい。また、構造的または機能的属性により特徴
づけられたフラグメント、例えばアルファーヘリックス
およびアルファーヘリックス形成領域、ベータシートお
よびベータシート形成領域、ターンおよびターン形成領
域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性
領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、
可変領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原
性指標領域を含むフラグメントなども好ましい。ヒスチ
ジンキナーゼ活性を媒介し、あるいは活性を改善し、望
ましくない活性を減じられたフラグメントである生物学
的に活性のあるフラグメントも好ましい。動物、とりわ
けヒトにおいて抗原的または免疫原的なフラグメントも
また含まれる。個体、特にヒトにおけるストレプトコッ
カス・ニューモニアエ の生存に必須の機能、あるいは
疾病を開始または維持する能力を付与する酵素の受容体
またはドメインを含むフラグメントが特に好ましい。本
発明ポリペプチドのフラグメントである変種を、ペプチ
ド合成による対応全長ポリペプチドの製造に使用しても
よく、それゆえ、これらの変種を全長のポリペプチド製
造のための中間体として用いてもよい。本発明ポリヌク
レオチドのフラグメントである変種を用いて本発明の全
長のポリヌクレオチドを合成してもよい。

【００２９】ポリヌクレオチド 本発明の別の態様は単離ポリヌクレオチドに関するもの
であり、それには表１［配列番号：２］の推定アミノ酸
配列を有するヒスチジンキナーゼポリペプチドをコード
する全長遺伝子およびそれに密接に関連するポリヌクレ
オチドおよびそれらの変種が包含される。本明細書に提
供される情報を用いて、例えば表１［配列番号：１また
は３］に示すポリヌクレオチド配列を用い、出発物質ス
トレプトコッカス・ニューモニアエ 0100993細胞からの
染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決
定するために用いるような標準的なクローニングおよび
スクリーニングを用いて、ヒスチジンキナーゼポリペプ
チドをコードしている本発明ポリヌクレオチドを得て、
次いで、全長のクローンを得てもよい。例えば、本発明
ポリヌクレオチド配列、例えば表１［配列番号：１また
は３］に示す配列を得るために、イー・コリ（E.coli）
またはいくつかの他の適切な宿主におけるストレプトコ
ッカス・ニューモニアエ 0100993の染色体ＤＮＡのクロ
ーンの典型的なライブラリーを、部分的配列に由来す
る、好ましくは１７量体またはそれ以上の長さの放射性
標識化オリゴヌクレオチドにてプローブする。プローブ
のＤＮＡに同一であるＤＮＡを担持するクローンは厳密
な条件を用いて区別できる。元の配列から設計した配列
決定プライマーを用いてこのように同定した個々のクロ
ーンを配列決定することにより、両方向で配列が伸長で
きるようになり、全遺伝子配列を決定できる。このよう
な配列決定は便宜的にプラスミドクローンから調製した
変性二本鎖ＤＮＡを用いて実施する。適切な技法につい
ては、Maniatis,T.、Fitsch,F.F.およびSambrookら、Mo
lecular Cloning，A Laboratory Manual、第２版；コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、
コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（198
9）に記載されている（Screening By Hybridization 1.
90およびSequencing Denatured Double-Stranded DNA T
emplates 13.70参照）。本発明の典型例において、表１
［配列番号：１または３］に示すポリヌクレオチドが、
ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0100993由来のＤ
ＮＡライブラリー中に見いだされた。

【００３０】表１［配列番号：１または３］に示すＤＮ
Ａ配列は、表１［配列番号：２］に示すアミノ酸残基数
とほぼ同数のアミノ酸からなる蛋白をコードしている読
み枠を含んでおり、蛋白の推定分子量は、当該分野でよ
く知られたアミノ酸の分子量を用いて算出できる。ヌク
レオチド番号１から１０５０間の配列番号：１のポリヌ
クレオチドは配列番号：２のポリペプチドをコードす
る。停止コドンは配列番号：１のヌクレオチド番号１０
５１から開始する。本発明ヒスチジンキナーゼ蛋白は、
寄託株のヒスチジンキナーゼをコードしているＤＮＡの
配列決定結果により示されるように、シグナルトランス
ダクション蛋白キナーゼファミリーの他の蛋白に構造的
に関連している。本発明蛋白は、知られた蛋白の中でも
バチルス・ズブチリスのｐｈｏＲ蛋白に対して最大の相
同性を示す。表１［配列番号：２］のヒスチジンキナー
ゼ蛋白は、バチルス・ズブチリスのｐｈｏＲポリペプチ
ドのアミノ酸配列に対して、その全長にわたり約３２％
の同一性、そしてその全長にわたり約５１％の類似性を
示す。

【００３１】本発明は、表１［配列番号：１］のコーデ
ィング配列に対して全長にわたり同一であるポリヌクレ
オチド配列を提供する。成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列またはそれらのフラグメント、ならびにその他の
コーディング配列を有する読み枠中の成熟ポリペプチド
のコーディング配列またはそのフラグメント、例えばリ
ーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プレプロ蛋白配列
をコードする配列も本発明により提供される。ポリヌク
レオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、終止シグ
ナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配
列、イントロン、ポリアデニル化シグナル等の転写非翻
訳配列、および付加アミノ酸をコードする付加コーディ
ング配列等の非コーディング５'および３'配列等の非コ
ーディング配列をも含有しうるが、これらに限定するの
ではない。例えば、融合ポリペプチドの精製を促すマー
カー配列をコードすることもできる。本発明のある好ま
しい態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター
（Qiagen, Inc.）中に提供されるようなヘキサ−ヒスチ
ジンペプチド（Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci., US
A， 86:821-824（1989）に記載される）またはＨＡタグ
（Wilsonら、Cell，37:767（1984））である。本発明の
ポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子および遺伝子発現
を調節する天然の配列をも含むが、これらに限定するも
のではない。

【００３２】本発明の好ましい具体例は、ヒスチジンキ
ナーゼポリペプチドをコードいしている、表１の配列番
号：１に示すヌクレオチド１から１０５０までを含むポ
リヌクレオチドである。

【００３３】また本発明は、表１（Ｃ）に示す式のポリ
ヌクレオチドを包含し、式中の５’においてＸは水素で
あり、３’末端においてＹは水素または金属であり、Ｒ
₁およびＲ₂は核酸残基、ｎは１ないし１０００の整数で
ある。いずれかのＲ基により示される核酸残基の伸長部
分はヘテロポリマーであってもホモポリマーであっても
よく、好ましくはヘテロポリマーである。

【００３４】上記した本明細書の用語「ポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポリペプ
チド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包
含し、詳細には、細菌のポリペプチド、より詳細には表
１［配列番号：２］に示すアミノ酸配列を有するストレ
プトコッカス・ニューモニアエのヒスチジンキナーゼの
ポリペプチドを包含する。該用語は、コーディング配列
および／または非コーディング配列を含んでいてもよい
さらなる領域を伴った、ポリペプチドをコードしている
単一の連続領域または不連続領域（例えば、組み込まれ
たファージまたは配列の挿入または配列の編集により分
断されたもの）を含むポリヌクレオチドを包含する。さ
らに本発明は、表１［配列番号：２］の推定アミノ酸配
列を有するポリペプチドの変種をコードする上記ポリヌ
クレオチドの変種にも関する。本発明ポリヌクレオチド
のフラグメントである変種を用いて本発明の全長ポリヌ
クレオチドを合成してもよい。

【００３５】さらに特に好ましい具体例は、表１［配列
番号：２］のヒスチジンキナーゼポリペプチドのアミノ
酸配列を有するヒスチジンキナーゼ変種をコードするポ
リヌクレオチドであり、その中には、いくつか、少し
の、５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１ま
たは０個のアミノ酸残基を置換、欠失または付加を任意
の組み合わせで施したアミノ酸配列を有する。中でもと
りわけ好ましいものは、ヒスチジンキナーゼの特性およ
び活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失
である。

【００３６】本発明のさらに好ましい具体例は、表１
［配列番号：２］に示すアミノ酸配列を有するヒスチジ
ンキナーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオ
チドに対して、その全長にわたり少なくとも７０％の同
一性があるポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレ
オチドに対して相補的なポリヌクレオチドである。ある
いはまた、寄託株のヒスチジンキナーゼポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチドに対してその全長にわ
たり少なくとも８０％同一である領域を含むポリヌクレ
オチド、およびそれに対して相補的なポリヌクレオチド
が最も非常に好ましい。この点に関して、全長で少なく
とも９０％同一であるポリヌクレオチドがとりわけ好ま
しく、中でも少なくとも９５％の同一性を有するものが
特に好ましく、さらに少なくとも９５％の同一性を有す
るものの中でも少なくとも９７％であるのがより好まし
く、中でも少なくとも９８％および少なくとも９９％で
あるのが特に好ましく、さらに少なくとも９９％である
のがより好ましい。特に好ましい具体例は、表１［配列
番号：１］のＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチ
ドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポ
リペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。

【００３７】本発明はさらに本明細書上述の配列にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関
して、本発明は特に厳密な条件で本明細書上述のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密な
ハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同
一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％
である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味
する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例として
は、５０％ホルムアミド。５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５ｘデンハーツ溶液、
１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性
し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２
℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０.
１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄するものである。ハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Samb
rookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第
２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク
（1989）、とりわけその第１１章に実例が示されてい
る。

【００３８】本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーシ
ョン条件で、配列番号：１に示すポリヌクレオチド配列
に関する完全遺伝子を含む適当なライブラリーを、配列
番号：１に示す上記ポリヌクレオチド配列またはそのフ
ラグメントの配列を有するプローブでスクリーニング
し、ＤＮＡ配列を単離することにより得ることのできる
ポリヌクレオチド配列を本質的に含むポリヌクレオチド
をも提供する。かかるポリヌクレオチドを得るために有
用なフラグメントには、例えば本明細書の別の箇所にお
いて説明するプローブおよびプライマー等がある。

【００３９】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明のポリヌ
クレオチドを、ヒスチジンキナーゼをコードするｃＤＮ
Ａ全長およびゲノムクローンを単離するための、および
ヒスチジンキナーゼ遺伝子に高度な配列類似性を有する
その他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離
するための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用の
ハイブリダイゼーションプローブとして使用することが
できる。このようなプローブは通常少なくとも１５塩基
を含む。好ましくはこのようなプローブは少なくとも３
０塩基を有し、少なくとも５０塩基を有していてもよ
い。とりわけ好ましいプローブは少なくとも３０塩基を
有し、５０塩基またはそれ以下である。例えば、ヒスチ
ジンキナーゼ遺伝子のコーディング領域は、配列番号：
１に示すＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチドプロー
ブを合成してスクリーニングすることにより単離でき
る。次いで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有
する標識オリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
ＡまたはｍＲＮＡのライブラリーのスクリーニングに用
い、プローブがライブラリーのいずれのメンバーにハイ
ブリダイゼーションするのかを決定する。

【００４０】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、例えば、疾病とりわけヒトの疾病の治療法およ
び診断法の発見のための研究試薬および材料として使用
でき、とりわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本
明細書でさらに論じる。配列番号：１および／または２
の配列由来のオリゴヌクレオチドである本発明ポリヌク
レオチドを本明細書記載の方法に使用してもよいが、好
ましくはＰＣＲに使用して、本明細書で同定したポリヌ
クレオチドの全体または一部が感染した組織に転写され
るかどうかを決定する。かかる配列が、病原体が達成し
た感染段階および感染型の診断にも有用であることが理
解される。

【００４１】また本発明は、さらなるアミノもしくはカ
ルボキシル末端アミノ酸、または成熟ポリペプチドに内
在するアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドを
コードできるポリヌクレオチドも提供する（例えば成熟
形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）。この
ような配列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセッ
シングに役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半
減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッセイも
しくは製造のための蛋白の操作を容易にすることができ
る。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞性
酵素によりプロセッシングされ、成熟蛋白から取り除か
れる。１またはそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態
のポリペプチドを有する前駆蛋白は、ポリペプチドの不
活性形態でありうる。プロ配列が除去されると、通常に
はこのような不活性前駆体が活性化される。プロ配列の
いくつかまたはすべてを活性化の前に除去できる。通
常、このような前駆体はプロ蛋白と称される。要する
に、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配
列を加えた成熟蛋白（プレ蛋白と称することができ
る）、プレ蛋白のリーダー配列ではない１またはそれ以
上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダ
ー配列および１またはそれ以上のプロ配列を有するプロ
蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコードしていてもよ
く、プロ配列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態
を生成するプロセッシング段階で除去される。

【００４２】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝子操
作される宿主細胞および組換え技法による本発明のポリ
ペプチドの製造にも関する。本発明ＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを用い、無細胞翻訳系を用いてこのような蛋
白を製造できる。組換え体を製造するために、宿主細胞
を遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、また
は本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。
ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davi
sら、Basic Methods in Molecular Biology（1986）；S
ambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manua
l、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク（1989）のように、多くの標準的な実験マニ
ュアルに記載される方法により行うことができ、例えば
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ
キストラン媒介トランスフェクション、トランスベクシ
ョン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介ト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、トラン
スダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入お
よび感染等がある。

【００４３】適当な宿主の代表的なものには、細菌細
胞、例えばストレプトコッカス属（Streptococci）、ス
タフィロコッカス属（Staphylococci）、エンテロコッ
カス属（Enterococci）、イー・コリ（E.coli）、スト
レプトミセス（Streptomyces）およびバチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtiis）細胞；真菌細胞、例えば酵母
細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆
虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Drosophila S2）お
よびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）細胞；動物
細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３
Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Bows）黒色腫細
胞；ならびに植物細胞等がある。

【００４４】本発明のポリペプチドを製造するために非
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来
するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファ
ージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコス
ミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は発
現を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよ
い。この点に関して、一般的には、宿主中にポリヌクレ
オチドを保持、伸長または発現するのに、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した任意の系またはベ
クターを発現に使用できる。周知のおよび通常的な種々
の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入
してもよく、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A
Laboratory Manual（上述）に記載されている。

【００４５】翻訳蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミッ
クスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当
な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的な
ものであってもく、あるいは異種性のシグナルでもよ
い。

【００４６】本発明のポリペプチドは周知の方法によ
り、組換え細胞培養物から回収および精製でき、その方
法には、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよび
レクチンクロマトグラフィー等がある。高速液体クロマ
トグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポリペ
プチドが単離および／または精製中に変性した場合、再
び活性なコンホーメーションにするために、蛋白再生の
ための周知の技法を用いることができる。

【００４７】診断アッセイ 本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のヒ
スチジンキナーゼポリヌクレオチドの使用にも関する。
真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるヒスチジ
ンキナーゼの検出は、疾患の診断のための診断法を提供
する。ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む生物に感染し
た、あるいは感染のおそれのある真核生物（本明細書に
おいて「個体」とも称する）とりわけ哺乳動物、特にヒ
トを種々の方法によりＤＮＡレベルで検出できる。診断
用の核酸は、感染した個体の細胞および組織、例えば
骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚より得ることができ
る。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用してもよく、あるい
は分析の前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いるこ
とにより酵素的に増幅できる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも
また同じ方法で用いることができる。増幅法を用いる
と、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトに存在する原
核生物株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特
徴づけすることができる。対照配列の遺伝子型と比較し
た場合の増幅産物の大きさの変化により、欠失および挿
入を検出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識化ヒ
スチジンキナーゼポリヌクレオチド配列にハイブリダイ
ズさせることにより同定できる。完全に対合した配列は
ＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差により、誤
対合二重らせんから区別できる。変性剤含有または不含
ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動度の変化
を検出することにより、または直接的なＤＮＡの配列決
定により、ＤＮＡ配列の差を検出してもよい。例えばMe
yersら、Science，230:1242（1985）参照。また、特異
的な位置での配列の変化を、ヌクレアーゼ保護アッセ
イ、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的切断
法によって明らかにしてもよい。例えばCottonら、Pro
c. Natl. Acad. Sci., USA， 85:4397-4401 （1985）参
照。

【００４８】本発明の遺伝子の突然変異または多型性を
担持する細胞を、種々の技術により、ＤＮＡレベルで、
例えばセロタイピングすることにより検出してもよい。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出すること
ができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばGeneScan
等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡを同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ
に用いてもよい。例を挙げると、ヒスチジンキナーゼを
コードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーは、突然変
異を同定および分析するのに用いることができる。典型
的なプライマーの例を下表２に示す。

【００４９】 表２ ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチド増幅用プライマー 配列番号： プライマー配列 4 5'- GCTTGATGATTGCCCAGTTGTC -3' 5 5'- GGCCCTTCTCCAGCTTAGTCAC -3' 7 5'-ATGAAACTAAAAAGTTATATTTTGG-3' 8 5'-GGCTTTATTTTCACTACCAGAGAGA-3'

【００５０】本発明はまた、５'および／または３'末端
から１、２、３または４個のヌクレオチド除去したプラ
イマーをも提供する。該プライマーを用いて、感染個体
から単離された遺伝子を増幅してもよく、次いで、該遺
伝子をＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供しても
よい。このように、ＤＮＡ配列における突然変異を検出
し、感染の診断および感染性物質のセロタイピングおよ
び／または分類に使用することができる。

【００５１】本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感
染、より好ましくはストレプトコッカス・ニューモニア
エによる感染、および最も好ましくは、中耳炎、結膜
炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内
膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜
炎のような疾病の診断方法を提供し、該方法は、表１
［配列番号：１］の配列を有するポリヌクレオチドのの
発現レベルの上昇を個体由来の試料から検出することを
特徴とする。ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチドの発
現の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法とし
て当該分野でよく知られたいずれかの方法、例えば増
幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザン
ブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション
法を用いて測定できる。

【００５２】さらに、正常対照組織サンプルと比較し
て、ヒスチジンキナーゼ蛋白の過剰発現を検出するため
の本発明診断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検
出してもよい。宿主由来のサンプル中のヒスチジンキナ
ーゼ蛋白のレベルを決定するために用いることができる
アッセイ技法は、当業者に周知である。かかるアッセイ
法には、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウ
ェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ等があ
る。

【００５３】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞を免疫源として用いて、かかるポリ
ペプチドに免疫特異的な抗体を得ることができる。本明
細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリ
クローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒ
ト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントが包含され、さ
らに免疫グロブリン発現ライブラリーの産物等のＦａｂ
フラグメントも包含される。本発明のポリペプチドに対
して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープが付
いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくは
ヒトはでない動物に通常の実験法を用いて投与すること
により得ることができる。連続的細胞系培養により産生
される抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モ
ノクローナル抗体を調製することができる。例として
は、Kohler， G.およびMilstein, C.，Nature， 256:49
5-497 （1975）； Kozborら、Immunology Today， 4:72
（1983）；Coleら、Monoclonal Antibodies and Cance
r Therapy, Alan R Liss, Inc.、77-96頁（1985）に記
載されるような種々の技法がある。一本鎖抗体の産生の
ために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）
を適用して、本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体を
得ることができる。また、トランスジェニックマウスま
たはその他の生物、例えばその他の哺乳動物を用いてヒ
ト化抗体等の抗体を発現させてもよい。

【００５４】別法として、ファージディスプレイ技法を
用いて、抗−ポリペプチドを有することにつきスクリー
ニングされたヒト・リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ遺伝
子のレパートリーから、抗−ヒスチジンキナーゼを有す
ることについてスクリーニングされたヒトから、あるい
は無処理のライブラリーから、ポリペプチドに対する結
合活性を有する抗体遺伝子を選別することもできる（Mc
Cafferty, J.ら、Nature 348:552-554 （1990）； Mark
s, J.ら、Biotechnology 10:779-783 （1992））。これ
らの抗体の親和性はチェインシャフリング（chain shuf
fling）により改善することもできる（Clackson, T.
ら、Nature 352:624-628 （1991））。

【００５５】二つの抗原結合ドメインが存在する場合、
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。

【００５６】上記抗体を用いてポリペプチドを発現する
クローンを単離または同定してもよく、上記抗体を親和
性クロマトグラフィーにより精製することができる。従
って、とりわけヒスチジンキナーゼに対する抗体を、感
染、とりわけ細菌感染、特に中耳炎、結膜炎、肺炎、菌
血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、最も詳
細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎のような疾
病の治療に用いてもよい。

【００５７】ポリペプチド変種には抗原的、エピトープ
的または免疫学的に等価な変種等があり、本発明の特定
の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明により蛋白またはポリペプチド
に対して生成した場合、病原および哺乳動物宿主間での
即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗体により特
異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含
する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」な
る用語は、脊椎動物において抗体を産生させるのに適し
た処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間
での即時的な物理的相互作用を妨害するように作用する
ペプチドまたはその等価物を包含する。

【００５８】ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に
等価な誘導体、またはそれらの融合蛋白は、マウスまた
はその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫す
るための抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプチ
ドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合すること
により、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモシ
アニン（keyholelimpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結合
することができる。あるいはまた、蛋白もしくはポリペ
プチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等価
なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチド
は、免疫原性を改良するための十分な抗原性を有してい
るので、キャリヤーを使用しなくてすむ。

【００５９】好ましくは、抗体またはそれらの変種を、
個体における免疫原性を減じるために修飾する。例え
ば、個体がヒトである場合、最も好ましくは、抗体は
「ヒト化」されており；この場合、ハイブリドーマ由来
の抗体の相補性決定領域がヒト・モノクローナル抗体に
移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-5
25（1986）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273
（1991）に記載されている。本発明のポリヌクレオチド
を遺伝学的免疫において使用する場合、例えばプラスミ
ドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Gene
t.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419
（1963））、特異的蛋白キャリヤーとＤＮＡとの複合体
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リ
ン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshe
f、PNAS 83:9551（1986））、種々の形態のリポソーム
中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（198
9））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356:152（199
2）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791（1993））
およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたイン
ビボ感染（Seegerら、PNAS 81:5849（1984））等の適切
な送達方法を用いるのが好ましい。

【００６０】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明ポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細胞標
品、化学ライブラリー、および天然産物混合物中におけ
る小型分子基質およびリガンドの結合を評価してもよ
い。これらの基質およびリガンドは天然基質およびリガ
ンドであってもよく、構造上または機能上の模倣物であ
ってもよい。例えば、Coligan et al.,Current Protoco
ls in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)参照。

【００６１】また本発明は、ヒスチジンキナーゼポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドの作用を増強（アゴニス
ト）または阻害（アンタゴニスト）する化合物、詳細に
は、静菌性および／または殺菌性化合物を同定するため
の、化合物のスクリーニング方法をも提供する。該スク
リーニング方法は高処理量の方法である。例えば、アゴ
ニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするため
に、合成反応混合物、膜、細胞エンベロープもしくは細
胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはヒスチジン
キナーゼポリペプチドおよび標識基質もしくはかかるポ
リペプチドのリガンドを含むそれらの調合物を、ヒスチ
ジンキナーゼゴニストまたはアンタゴニストである可能
性のある候補化合物の不存在下または存在下でインキュ
ベーションする。候補分子がヒスチジンキナーゼポリペ
プチドにアゴナイズまたはアンタゴナイズする能力は、
標識化リガンドの結合の低下またはこのような基質から
の生成物の産生の低下に反映される。結合しても影響を
及ぼさない分子、すなわちヒスチジンキナーゼの効果を
誘導しない分子は、最も良好なアンタゴニストである可
能性がある。結合性が良好で、基質からの生成物の生成
速度を高める分子はアゴニストである。基質からの生成
物の生成速度またはレベルはリポーターシステムを用い
ることにより強調できる。この点に関して有用なリポー
ターシステムには、生成物に転換される比色測定用標識
化基質、ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチドまたはポ
リペプチド活性の変化に応答するリポーター遺伝子、お
よび当該分野で周知の結合アッセイ等があるが、これら
に限定するものではない。

【００６２】ヒスチジンキナーゼンタゴニストのアッセ
イのもう１つの例は競争アッセイであり、競争阻害アッ
セイに適した条件下で、ヒスチジンキナーゼおよび潜在
的アンタゴニストを、ヒスチジンキナーゼ結合分子、組
換えヒスチジンキナーゼ結合分子、天然基質もしくはリ
ガンド、または基質もしくはリガンド模倣物と混合す
る。例えば放射活性または比色測定用化合物によりヒス
チジンキナーゼを標識し、結合分子に結合した、または
生成物に変換されたヒスチジンキナーゼ分子の数を正確
に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価でき
る。

【００６３】潜在的アンタゴニストには、本発明ポリペ
プチドに結合し、そのことによりその活性を阻害し消失
させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗
体などがある。また、潜在的アンタゴニストは、密接に
関連した蛋白または抗体のごとき小型有機分子、ペプチ
ド、ポリペプチドであってもよく、それらは結合分子の
同じ部位に結合するが、ヒスチジンキナーゼにより誘導
される活性を誘導せず、それゆえヒスチジンキナーゼを
結合から排除することによりヒスチジンキナーゼの作用
を妨害する。潜在的アンタゴニストには、ポリペプチド
の結合部位に結合し、およびそれを占領し、それにより
細胞性結合分子への結合を妨害して、正常の生物学的活
性を妨害する小型分子等がある。小型分子の例として
は、小型有機分子、ペプチド、ペプチド様分子等がある
が、これらに限定するものではない。その他の潜在的ア
ンタゴニストにはアンチセンス分子等がある（これらの
分子についての記載に関してはOkano,J.，Neurochem.5
6:560（1991）；Oligodeoxy-nucleotides as Antisense
Inhibitors of Gene Expression，ＣＲＣプレス、ボッ
カラートン、フロリダ州（1988）参照）。好ましい潜在
的アンタゴニストには、ヒスチジンキナーゼ関連化合物
およびヒスチジンキナーゼ変種等がある。

【００６４】本明細書に示す各ＤＮＡ配列を、抗細菌化
合物の発見および開発に使用してもよい。コードされて
いる蛋白は、発現した場合、抗細菌剤のスクリーニング
のための標的として使用されうる。さらに、コードされ
ている蛋白のアミノ末端領域または各ｍＲＮＡのシャイ
ン−ダルガノ配列または他の翻訳容易化配列をコードし
ているＤＮＡ配列を用いてアンチセンス配列を構築し、
目的コーディング配列の発現を制御することもできる。

【００６５】本発明は、感染の続発症に関与する病因お
よび哺乳動物宿主間の最初の物理的相互作用を妨害する
ための本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻
害物質の使用を提供する。とりわけ本発明分子を、内在
デバイス上の哺乳動物細胞外マトリックス蛋白または傷
における細胞外マトリックス蛋白への細菌の付着、詳細
にはグラム陽性細菌の付着の防止；例えば、哺乳動物チ
ロシンキナーゼのホスホリレーションを開始することに
よる、ヒスチジンキナーゼ蛋白により媒介される哺乳動
物細胞への侵入のブロック（Rosenshine et al., Infec
t. Immunol. 60: 2211 (1992)）；哺乳動物細胞外マト
リックス蛋白と細菌ヒスチジンキナーゼ蛋白との間の、
組織ダメージを媒介する細菌付着のブロック；内在デバ
イスの移植または他の外科的方法以外により開始され
る、感染における通常の病状の進行のブロックに使用す
ることができる。

【００６６】本発明はさらに、ｉ）ヒスチジンキナーゼ
と応答レギュレーターとの相互作用を妨害する薬剤を同
定するための薬剤スクリーニング方法であって、薬剤の
存在下でヒスチジンキナーゼを応答レギュレーターとと
もにインキュベーションし、ついで、この相互作用を妨
害する薬剤の能力を測定することを含む方法；および／
またはｉｉ）ヒスチジンキナーゼの自己リン酸化能を妨
害する薬剤を同定するための薬剤スクリーニング方法で
あって、ホスチジンキナーゼを薬剤とともにインキュベ
ーションし、ついで、自己リン酸化を妨害する薬剤の能
力を測定することを含む方法を提供する。

【００６７】本発明アンタゴニストおよびアゴニスト
を、例えば、感染、とりわけ細菌感染、特に中耳炎、結
膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心
内膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄
膜炎のような疾病の抑制および治療に用いてもよい。

【００６８】ヘリコバクター・ピロリ（Ｈelicobacter
pylori）（本明細書中、エッチ・ピロリともいう）菌
は、胃癌、潰瘍、胃炎を発病している世界中の人々の３
分の１以上の胃に感染している（国際癌研究機関（Inte
rnational Agency for Research on Cancer）（1994）S
chistomoses，Liver Flukes and Helicobacter Pylori
（International Agency for Research on Cancer，Lyo
n，France；http：／／www．uicc．ch／ecp／ecp2904．
htm））。さらに、この国際癌研究機関は、最近になっ
て、ヘリコバクター・ピロリと胃腺癌の間の因果関係を
認識し、その細菌をグループＩ（限定的）発癌物質と分
類した。本発明により提供されるスクリーニング法を用
いて見出される本発明の好ましい抗菌化合物（ヒスチジ
ンキナーゼポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチ
ドのアゴニストおよびアンタゴニスト）、特に広スペク
トルの抗生物質は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療
に有用である。このような治療はヘリコバクター・ピロ
リ誘発性癌、例えば胃腸癌の出現を減少させる。かかる
治療はまた胃潰瘍および胃炎も治癒する。

【００６９】ワクチン 本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免
疫学的反応を誘導する方法に関し、該方法は、感染、詳
細には細菌感染、最も詳細にはストレプトコッカス・ニ
ューモニアエ感染から個体を防御するための抗体および
／またはＴ細胞免疫応答を生じさせるに十分なヒスチジ
ンキナーゼまたはそのフラグメントもしくは変種を個体
に接種することを特徴とする。かかる免疫学的応答が細
菌の複製を遅らせる方法も提供される。本発明のさらに
もう１つの態様は、個体における免疫学的応答の誘導方
法に関し、該方法は、疾病が個体においてすでに確立さ
れているか否かにかかわらず、インビボでヒスチジンキ
ナーゼ、またはそのフラグメントもしくは変種を発現さ
せるためにヒスチジンキナーゼまたはそのフラグメント
もしくは変種の発現を指令する核酸ベクターをかかる個
体に送達して、例えば、抗体および／またはＴ細胞免疫
応答（例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞または細胞毒性
Ｔ細胞）を生じさせる免疫学的応答を誘導して、該個体
を疾病から防御する抗体を産生させることを特徴とす
る。迅速に遺伝子を所望細胞中に投与する方法として
は、粒子上にコーティングすること等がある。かかる核酸
ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、またはＤＮＡ／
ＲＮＡハイブリッドを含んでいてもよい。

【００７０】本発明のさらなる態様は、免疫学的反応を
宿主内に誘導できる、または誘導されたた宿主に導入し
た場合、ヒスチジンキナーゼまたはそれによりコードさ
れている蛋白に対する免疫学的反応を該宿主に誘導する
免疫学的組成物に関し、その組成物は組換えヒスチジン
キナーゼまたはそれによりコードされている蛋白を含
み、ヒスチジンキナーゼまたはそれによりコードされて
いる蛋白に対する抗原をコードし発現するＤＮＡを含
む。免疫学的応答を治療的または予防的に用いてもよ
く、また免疫学的応答はＣＴＬまたはＣＤ４⁺Ｔ細胞か
ら生じるような抗体免疫または細胞性免疫の形態であっ
てもよい。

【００７１】ヒスチジンキナーゼポリペプチドまたはそ
れらのフラグメントを、それ自身は抗体を産生しない
が、第１の蛋白を安定化し、免疫原的および保護特性を
有する融合蛋白を産生する能力のある共存蛋白（co-pro
tein）と融合させてもよい。好ましくは、かかる融合組
換え蛋白は、抗原補蛋白、例えばヘモフィルス・インフ
ルエンザエ（Hemophilus influenzae）由来のリポ蛋白
Ｄ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
またはベーターガラクトシダーゼのごとき共存蛋白、蛋
白を可溶化してそれらの産生および精製を促進する比較
的大きな共存蛋白等を含む。さらに、共存蛋白は免疫系
において普遍的な刺激を提供するという意味で、アジュ
バントとして作用することができる。共存蛋白は第１の
蛋白のアミノまたはカルボキシいずれの末端に結合して
いてもよい。

【００７２】本発明は、本発明のポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドおよびSato Y.ら、Science 273:352 (19
66)に記載されているような免疫刺激ＤＮＡ配列を含む
組成物、とりわけワクチン組成物、および方法を提供す
る。

【００７３】また、本発明は、ストレプトコッカス・ニ
ューモニアエに感染した動物モデルにおいて、かかる遺
伝的免疫化実験に用られるＤＮＡ構築物中の細菌細胞表
面蛋白の不変領域をコードすることが示されている、説
明したポリヌクレオチドまたはとりわけそれらのフラグ
メントを用いる方法を提供し、これらはとりわけ予防的
または治療的免疫反応を刺激することができる蛋白エピ
トープを同定するのに有用である。この研究は、哺乳動
物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけストレプト
コッカス・ニューモニアエ感染の予防薬または治療的処
置の開発のために、感染に抵抗しこれを一掃するのに成
功した動物の必須器官から特に価値あるモノクローナル
抗体をうまく調製することを可能にすると思われる。

【００７４】ポリペプチドを宿主接種用抗原として用い
て、例えば損傷組織への細菌の付着を阻害することによ
り細菌の侵入に対して防御する特異的抗体を得てもよ
い。組織損傷の例としては、例えば機械的、化学的もし
くは熱的ダメージにより、または内在デバイスの埋め込
みにより引き起こされた皮膚または結合組織の創傷、ま
たは粘膜、例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷等があ
る。

【００７５】また本発明は、適切な担体と一緒になった
免疫原性組換え蛋白を含有するワクチン処方を包含す
る。蛋白は胃で分解されうるので、非経口的に、例えば
皮下、筋肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好
ましい。非経口投与に適した処方には、抗酸化剤、緩衝
液、静細菌剤、および処方を個体の体液（好ましくは血
液）と等張にする溶質を含有していてもよい水性または
非水性滅菌注射液、および懸濁化剤または増粘剤を含有
していてもよい水性または非水性滅菌懸濁液等がある。
処方は１回投与または多回投与用容器、例えばシールし
たアンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に滅
菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として
保存してもよい。ワクチン処方は処方の免疫原性を高め
るアジュバント系を含有していてもよく、例えば水中油
系または当該分野で周知のその他の系等がある。投与量
はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験法により
容易に決定できる。本発明を特定のヒスチジンキナーゼ
蛋白に関して説明したが、本発明は天然に存在する蛋白
および、実質的に組換え蛋白の免疫原特性に影響しない
付加、欠失または置換を施した類似の蛋白のフラグメン
トを包含することが理解されよう。

【００７６】組成物、キットおよび投与 本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニス
トを含む組成物にも関する。本発明ポリペプチドを、細
胞、組織もしくは生物に用いられる未滅菌もしくは滅菌
済み担体と混合して、例えば対象への投与に適した医薬
的担体と混合して用いることができる。このような組成
物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポ
リペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦形
剤を含む。このような担体には生理食塩水、緩衝化生理
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定
するものではない。処方は投与法に適したものにすべき
である。さらに本発明は、１またはそれ以上の上記本発
明組成物成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む
診断用および医薬用パックおよびキットにも関する。

【００７７】本発明ポリペプチドおよびその他の化合物
を、単独で、あるいは治療用化合物等のその他の化合物
と組み合わせて用いてもよい。いずれかの有効かつ利便
的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、経膣、静脈
内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚内の
経路で医薬組成物を投与してもよい。治療において、ま
たは予防薬として、活性物質を注射用組成物として、例
えば好ましくは等張の滅菌水性分散物として個体に投与
できる。別法として、組成物を局所適用用、例えば軟
膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳液、
洗口剤、含浸包帯および縫合用の糸、ならびにエアロゾ
ール等の形態に処方してもよく、適当な慣用的な添加
物、例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならび
に軟膏およびクリームには軟化剤を含有していてもよ
い。かかる局所用処方は、適合した慣用的な担体、例え
ばクリームまたは軟膏基剤、およびローションにはエタ
ノールまたはオレイルアルコールを含有していてもよ
い。このような担体は重量で処方の約１％から約９８％
であってよく、より通常には重量で処方の約８０％まで
とする。哺乳動物とりわけヒトに投与するために、活性
物質の１日あたりの投与量は、０.０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はあらゆる場合、個体に最も適した実際の投与
量を決定し、年齢、体重および特に個体の反応性に応じ
て変化させる。上述の投与量は、平均的なケースの典型
例である。もちろん、高用量および低用量の範囲が適合
する個々の例もあり、かかる例は本発明の範囲内であ
る。

【００７８】内在デバイスには外科的インプラント、補
てつデバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体
に導入し、長時間その位置に存在するものである。この
ようなデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャ
ント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析（contin
uous ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カ
テーテル等がある。本発明の組成物を注射により投与
し、内在デバイスの挿入の直前に、関連細菌に対する全
身的な効果を得てもよい。手術後、デバイスが体内に存
在する期間中、処置を続けてもよい。さらに、外科的手
技中に広げるカバーに用いて、細菌性創傷感染、とりわ
けストレプトコッカス・ニューモニアエの創傷感染を防
御することもできる。

【００７９】多くの整形外科医は、補てつ関節を有する
ヒトについては、菌血症を生じうる歯科的処置の前に抗
生物質予防法を考慮すべきであると考えている。遅延性
の重篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻な合
併症であり、有意性のある罹病率および死亡率を伴う。
それゆえ、この状況において、予防的な抗生物質に代わ
るものとして、活性物質の使用を拡張することが可能で
ある。

【００８０】上述の治療に加え、一般的には本発明組成
物を創傷の治療薬として使用して、創傷組織において曝
露されたマトリックス蛋白に細菌が付着するのを防いで
もよく、歯科治療においては抗生物質による予防法に代
えて、またはそれと組み合わせて予防的に使用してもよ
い。

【００８１】別法として、本発明の組成物を用いて挿入
直前の内在デバイスを浸してもよい。創傷または内在デ
バイスを浸すためには、活性物質は１μｇ／ｍｌから１
０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。ワクチン組成
物を便宜的に注射可能な形態にする。慣用的なアジュバ
ントを用いて免疫反応を高めてもよい。ワクチン化に適
した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、
このような投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するの
が好ましい。本発明化合物については、指示した投与量
範囲では、適切な個体への投与を妨げるような不利な毒
性効果は観察されない。本明細書に開示した各文献を、
参照によりその全体が本明細書に記載されているものと
みなす。本願が優先権を主張しているいずれの特許出願
も、参照によりその全体が本明細書に記載されているも
のとみなす。

【００８２】

【実施例】以下の実施例は、詳細に説明したこと以外
は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を用いて実施
する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を
限定するものではない。 実施例１：菌株の選択、ライブラリーの製造および配列
決定 配列番号：１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチ
ドを、イー・コリ（E.coli）中のストレプトコッカス・
ニューモニアエの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリ
ーから得た。重複するストレプトコッカス・ニューモニ
アエのＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローン
からの配列決定データを用いて配列番号：１の隣接ＤＮ
Ａ配列を構築した場合もある。通常の方法、例えば以下
の方法１および２によりライブラリーを製造できる。全
細胞ＤＮＡは、ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0
100993から、標準法に準じて単離し、二つの方法のどち
らかによりサイズ分画する。

【００８３】方法１ 標準法に準じてサイズ分画化するために、全細胞ＤＮＡ
を注射針に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの
大きさのフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断されているベクターラムダＺａｐＩＩに
連結し、標準法によりライブラリーをパッケージング
し、次いでパッケージングしたライブラリーでE. coli
を感染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。

【００８４】方法２ 全細胞ＤＮＡは、ライブラリーベクター（例えば、Ｒｓ
ａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）にクロ
ーニングするための一連のフラグメントを適切に生じる
１の制限酵素または制限酵素の組み合わせで部分的加水
分解し、かかるフラグメントを標準法に準じてサイズ分
画化する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメ
ントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断されているベク
ターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブラ
リーをパッケージングし、次いでパッケージングしたラ
イブラリーでE. coliを感染させる。ライブラリーを標
準法により増幅する。

【００８５】実施例２ ストレプトコッカス・ニューモニアエ由来の遺伝子の感
染の間における発現の決定 マウスのストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００
９９３での気道感染４８時間目の切除肺を効果的に破砕
し、カオトロピック剤およびＲＮＡａｓｅ阻害剤の存在
下で処理して動物および細菌のＲＮＡ混合物を得る。安
定な調合物および高収率の細菌ＲＮＡを得るための破砕
および処理の最適条件は、その後のノーザンブロット上
におけるストレプトコッカス・ニューモニアエ １６Ｓ
ＲＮＡに特異的な放射性標識オリゴヌクレオチドとのハ
イブリダイゼーションの使用にも用いる。得られたＲＮ
ＡについてのＲＮＡａｓｅ不含、ＤＮＡａｓｅ不含、Ｄ
ＮＡおよび蛋白不含の調合物は、ストレプトコッカス・
ニューモニアエ０１００９９３の各遺伝子の配列から設
計されたユニークなプライマーペアーを用いる逆転写Ｐ
ＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に適する。

【００８６】ａ）感染（肺）のマウス動物モデルからの
ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３感
染組織の単離 ＴＳＡ／５％ウマ血液プレートまたはＡＧＣＨ培地のい
ずれかで、３７℃、５％ ＣＯ₂で一晩ストレプトコッカ
ス・ニューモニアエ０１００９９３を増殖させる。次い
で、細菌を集め、リン酸塩緩衝化セイライン中に再懸濁
してＡ₆₀₀を約０．４とする。イソフルオランでマウス
を麻酔し、５０ｍｌの細菌懸濁液（約２ｘ１０⁵個）を
ピペットマンを用いて鼻腔内投与する。マウスを回復さ
せ、エサおよび水を自由に取らせる。４８時間後、過剰
量の二酸化炭素によりマウスを安楽死させ、肺を無菌的
に切除し、液体窒素中で素早く凍結する。

【００８７】ｂ）感染組織試料からストレプトコッカス
・ニューモニアエ０１００９９３の単離 ２ｍｌの凍結保存チューブ中の感染組織試料を−８０℃
の貯蔵庫からドライアイス−エタノール浴中に取り出
す。微生物安全キャビネット中で試料を破砕し、残った
試料をドライアイス−エタノール浴中で保存する。組織
試料中の細菌を破砕するために、５０〜１００ｍｇの組
織をシリカ／セラミックマトリックス（BIO 101）を入
れたFastRNAチューブに移す。すぐに抽出試薬（FastRNA
試薬，BIO 101）１ｍｌを添加して試料対試薬の比を約
１対２０とする。６０００ｒｐｍの往復震盪機（FastPr
ep FR120, BIO 101）で２０〜１２０秒チューブを振盪
する。粗ＲＮＡ調合物をクロロホルム／イソアミルアル
コールで抽出し、ＤＥＰＣ−処理イソプロパン−ル沈殿
溶液（Bio 101）で沈殿させる。必要ならば、−８０℃
においてＲＮＡ調合物をこのイソプロパノール溶液中に
保存する。ＲＮＡをペレット化し（１２０００ｇ、１０
分）、７５％（ＤＥＰＣ−処理水中ｖ／ｖ）エタノール
で洗浄し、５〜１０分風乾し、次いで、ＤＥＰＣ処理水
０．１ｍｌに再懸濁し、その後、５５℃で５〜１０分置
く。最後に、氷上に少なくとも１分置き、２００ユニッ
トのＲｎａｓｉｎ（Promega）を添加する。ＲＮＡ調合
物は−８０℃で１カ月まで保存される。長期保存には、
プロトコールの洗浄段階における７５％エタノール中の
ＲＮＡ沈殿は−２０℃で少なくとも１年保存できる。１
％アガロースゲル上に試料を泳動することにより単離Ｒ
ＮＡの品質を評価する。臭化エチジウム染色した１ｘＴ
ＢＥゲルを用いて収集全ＲＮＡを可視化する。感染組織
からの細菌ＲＮＡの単離を示すために、１ｘＭＯＰＳ、
２．２Ｍホルムアルデヒドゲルで泳動を行い、Hybond-N
（Amersham）に減圧ブロッティングする。次いで、ブロ
ットを、ストレプトコッカス・ニューモニアの１６Ｓ
ｒＲＮＡに特異的な³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドプロー
ブ（５’AACTGAGACT GGCTTTAAGAGATTA３’［配列番号：
６］）とハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイ
ゼーションしているバンドのサイズを、インビボ増殖し
たストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９か
ら単離された対照ＲＮＡのものとノーザンブロットにお
いて比較する。全ＲＮＡ試料中において正しいサイズの
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡバンドが検出でき、ＴＢＥゲル上
で可視化した場合、哺乳動物ＲＮＡの分解が示される。

【００８８】ｃ）ストレプトコッカス・ニューモニアエ
由来のＲＮＡからのＤＮＡの除去 最終体積５７μｌのバッファー中で２０ユニットのＲＮ
Ａａｓｅ不含ＤＮＡａｓｅＩ（GenHunter）を用いて３
７℃で３０分処理することにより、５０マイクログラム
のＲＮＡ試料からＤＮＡを除去した。製造者のプロトコ
ールに従ってTRIzol LS試薬（Gibco BRL, Life Technol
ogies）によりＤＮＡａｓｅを不活性化し除去した。Ｄ
ＮＡａｓｅ処理したＲＮＡを上記Ｒｎａｓｉｎを添加し
たＤＰＥＣ処理水１００マイクロリットル中に再懸濁し
た。

【００８９】ｄ）感染組織由来のＲＮＡ試料からのｃＤ
ＮＡの調製 製造者の指示に従って、ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡの
試料１．５マイクログラムを、First Strand cDNA合成
キット用のSuperScript Preamplification System（Gib
co BRL, Life Technologies）を用いて逆転写する。７
５ナノグラムのランダムヘキサマーを用いて各反応を開
始する。SuperScriptII逆転写酵素を添加しない対照も
反応させる。＋／−ＲＴ双方の試料をＲＮａｓｅＨで処
理し、次いで、ＰＣＲ反応に供する。

【００９０】ｅ）細菌ｃＤＮＡ種の存在を調べるための
ＰＣＲの使用 下記成分を添加することにより氷上で０．２ｍｌのチュ
ーブにおいてＰＣＲ反応物をセットアップする：４３マ
イクロリットルのPCR Master Mix（Advanced Biotechno
logies Ltd.）；１マイクロリットルのＰＣＲプライマ
ー（最適には、１８〜２５塩基対の長さで、類似のアニ
ーリング温度を有するように設計されたもの）（各プラ
イマーは初発濃度１０ｍＭ）；および５マイクロリット
ルのｃＤＮＡ。Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600
においてＰＣＲ反応を行った：９４℃で２分、次いで９
４℃、５０℃そして７２℃でそれぞれ３０秒を５０サイ
クル、その後７２℃で７分、次いで、保持温度２０℃と
する（最適には、ＰＣＲ生成物の出現または欠乏を決定
するためのサイクル数は３０〜５０回、ＲＴ反応からの
初発ｃＤＮＡ量の評価を行う場合には、最適には８〜３
０サイクル）。次いで、１０マイクロリットルの部分試
料を１％ ＴＢＥゲルで泳動し、臭化エチジウム染色す
る。ＰＣＲ生成物については、存在するならば、１００
ｂｐのＤＮＡラダー（Gibco BRL, Life Technologies）
との比較によりサイズを評価する。別法として、便利に
は、標識ＰＣＲプライマー（例えば、５’末端を標識し
たもの）を用いてＰＣＲ生成物を標識し、ＰＣＲ生成物
の適当な部分試料をポリアクリルアミドゲルで泳動し、
適当なゲルスキャンニングシステム（例えば、Perkin E
lmerにより提供されるGeneScanTMソフトウェアを用いた
ABI PrismTM 377 Sequencer）を用いてその存在および
量を調べる。ＲＴ／ＰＣＲ対照は＋／−逆転写酵素反応
物、非転写ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１０
０９９３ゲノム配列からＰＣＲ生成物を生じるように設
計された１６Ｓ ｒＲＮＡプライマーもしくはＤＮＡ特
異的プライマーペアーを含んでいてもよい。プライマー
ペアーの効率を試験するために、それらをストレプトコ
ッカス・ニューモニアエ０１００９９３全ＤＮＡを用い
るＤＮＡ ＰＣＲに使用する。ＰＣＲ反応をセットアッ
プし、ｃＤＮＡの代わりに約１マイクログラムのＤＮＡ
を用いて上記のごとく反応を行う。ＤＮＡ ＰＣＲまた
はＰＴ／ＰＣＲのいずれにおいても予想サイズの生成物
を生じないプライマーペアーはＰＣＲ反応できず、その
ようなものとしては不均一である。ＤＮＡ ＰＣＲで正
しいサイズの生成物を生じるものは２つのクラスに分類
される：（１）インビボで転写されない遺伝子であっ
て、ＲＴ／ＰＣＲにおいて生成物を生じる再現性がない
もの；および（２）インビボで転写される遺伝子であっ
て、ＲＴ／ＰＣＲにおいて正しいサイズの生成物を再現
性をもって生じ、＋ＲＴ試料において−ＲＴ対照におけ
るシグナル（生じた場合には）よりも強力なシグナルを
生じるもの。

【００９１】

【配列表】

（１）一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：SmithKline Beecham Corporation （Ｂ）通り名：One Franklin Plaza （Ｃ）都市名：Philadelphia （Ｄ）州名：PA （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９１０３ （ｉｉ）発明の名称：新規ヒスチジンキナーゼ （ｉｉｉ）配列の数：８ （ｉｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）作動システム：ＤＯＳ （Ｄ）Windows用FastSEQバージョン２．０ｂ （ｖ）現出願データ： （Ａ）出願番号：

【００９２】（２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０５３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： ATGAAACTAA AAAGTTATAT TTTGGTTGGA TATATTATTT CAACCCTCTT AACCATTTTG 60 GTTGTTTTTT GGGCTGTTCA AAAAATGCTG ATTGCGAAAG GCGAGATTTA CTTTTTGCTT 120 GGGATGACCA TCGTTGCCAG CCTTGTCGGT GCTGGGATTA GTCTCTTTCT CCTATTGCCA 180 GTCTTTACGT CGTTGGGCAA ACTCAAGGAG CATGCCAAGC GGGTAGCGGC CAAGGATTTT 240 CCTTCAAATT TGGAGGTTCA AGGTCCTGTA GAATTTCAGC AATTAGGGCA AACTTTTAAT 300 GAGATGTCCC ATGATTTGCA GGTAAGCTTT GATTCCTTGG AAGAAAGCGA ACGAGAAAAG 360 GGCTTGATGA TTGCCCAGTT GTCGCATGAT ATTAAGACCC CTATCACTTC GATCCAAGCG 420 ACGGTAGAAG GGATTTTGGA TGGGATTATC AAGGAGTCGG AGCAAGCTCA TTATCTAGCA 480 ACCATTGGAC GCCAGACGGA GAGGCTCAAT AAACTGGTTG AGGAGTTGAA TTTTTTGACC 540 CTAAACACAG CTAGAAATCA GGTGGAAACT ACCAGTAAAG ACAGTATTTT TCTGGACAAG 600 CTCTTAATTG AGTGCATGAG TGAATTTCAG TTTTTGATTG AGCAGGAGAG AAGAGATGTC 660 CACTTGCAGG TAATCCCAGA GTCTGCCCGG ATTGAGGGAG ATTATGCTAA GCTTTCTCGT 720 ATCTTGGTGA ATCTGGTCGA TAACGCTTTT AAATATTCTG CTCCAGGAAC CAAGCTGGAA 780 GTGGTGACTA AGCTGGAGAA GGGCCAGCTT TCAATCAGTG TGACCGATGA AGGGCAGGGC 840 ATTGCCCCAG AGGATTTGGA AAATATTTTC AAACGCCTTT ATCGTGTCGA AACTTCGCGT 900 AACATGAAGA CAGGTGGTCA TGGATTAGGA CTTGCGATTG CGCGTGAATT GGCCCATCAA 960 TTGGGTGGGG AAATCACAGT CAGCAGCCAG TACGGTCTAG GAAGTACCTT TACCCTCGTT 1020 CTCAATCTCT CTGGTAGTGA AAATAAAGCC TAA 1053

【００９３】（２）配列番号：２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３５０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Met Lys Leu Lys Ser Tyr Ile Leu Val Gly Tyr Ile Ile Ser Thr Leu 1 5 10 15 Leu Thr Ile Leu Val Val Phe Trp Ala Val Gln Lys Met Leu Ile Ala 20 25 30 Lys Gly Glu Ile Tyr Phe Leu Leu Gly Met Thr Ile Val Ala Ser Leu 35 40 45 Val Gly Ala Gly Ile Ser Leu Phe Leu Leu Leu Pro Val Phe Thr Ser 50 55 60 Leu Gly Lys Leu Lys Glu His Ala Lys Arg Val Ala Ala Lys Asp Phe 65 70 75 80 Pro Ser Asn Leu Glu Val Gln Gly Pro Val Glu Phe Gln Gln Leu Gly 85 90 95 Gln Thr Phe Asn Glu Met Ser His Asp Leu Gln Val Ser Phe Asp Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Ser Glu Arg Glu Lys Gly Leu Met Ile Ala Gln Leu Ser 115 120 125 His Asp Ile Lys Thr Pro Ile Thr Ser Ile Gln Ala Thr Val Glu Gly 130 135 140 Ile Leu Asp Gly Ile Ile Lys Glu Ser Glu Gln Ala His Tyr Leu Ala 145 150 155 160 Thr Ile Gly Arg Gln Thr Glu Arg Leu Asn Lys Leu Val Glu Glu Leu 165 170 175 Asn Phe Leu Thr Leu Asn Thr Ala Arg Asn Gln Val Glu Thr Thr Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Ile Phe Leu Asp Lys Leu Leu Ile Glu Cys Met Ser Glu 195 200 205 Phe Gln Phe Leu Ile Glu Gln Glu Arg Arg Asp Val His Leu Gln Val 210 215 220 Ile Pro Glu Ser Ala Arg Ile Glu Gly Asp Tyr Ala Lys Leu Ser Arg 225 230 235 240 Ile Leu Val Asn Leu Val Asp Asn Ala Phe Lys Tyr Ser Ala Pro Gly 245 250 255 Thr Lys Leu Glu Val Val Thr Lys Leu Glu Lys Gly Gln Leu Ser Ile 260 265 270 Ser Val Thr Asp Glu Gly Gln Gly Ile Ala Pro Glu Asp Leu Glu Asn 275 280 285 Ile Phe Lys Arg Leu Tyr Arg Val Glu Thr Ser Arg Asn Met Lys Thr 290 295 300 Gly Gly His Gly Leu Gly Leu Ala Ile Ala Arg Glu Leu Ala His Gln 305 310 315 320 Leu Gly Gly Glu Ile Thr Val Ser Ser Gln Tyr Gly Leu Gly Ser Thr 325 330 335 Phe Thr Leu Val Leu Asn Leu Ser Gly Ser Glu Asn Lys Ala 340 345 350

【００９４】（２）配列番号：３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０９７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３： AGATAGAGAA ACCGAGAGGA CAAACATGAA ACTAAAAAGT TATATTTTGG TTGGATATAT 60 TATTTCAACC CTCTTAACCA TTTTGGTTGT TTTTTGGGCT GTTCAAAAAA TGCTGATTGC 120 GAAAGGCGAG ATTTACTTTT TGCTTGGGAT GACCATCGTT GCCAGCCTTG TCGGTGCTGG 180 GATTAGTCTC TTTCTCCTAT TGCCAGTCTT TACGTCGTTG GGCAAACTCA AGGAGCATGC 240 CAAGCGGGTA GCGGCCAAGG ATTTTCCTTC AAATTTGGAG GTTCAAGGTC CTGTAGAATT 300 TCAGCAATTA GGGCAAACTT TTAATGAGAT GTCCCATGAT TTGCAGGTAA GCTTTGATTC 360 CTTGGAAGAA AGCGAACGAG AAAAGGGCTT GATGATTGCC CAGTTGTCGC ATGATATTAA 420 GACCCCTATC ACTTCGATCC AAGCGACGGT AGAAGGGATT TTGGATGGGA TTATCAAGGA 480 GTCGGAGCAA GCTCATTATC TAGCAACCAT TGGACGCCAG ACGGAGAGGC TCAATAAACT 540 GGTTGAGGAG TTGAATTTTT TGACCCTAAA CACAGCTAGA AATCAGGTGG AAACTACCAG 600 TAAAGACAGT ATTTTTCTGG ACAAGCTCTT AATTGAGTGC ATGAGTGAAT TTCAGTTTTT 660 GATTGAGCAG GAGAGAAGAG ATGTCCACTT GCAGGTAATC CCAGAGTCTG CCCGGATTGA 720 GGGAGATTAT GCTAAGCTTT CTCGTATCTT GGTGAATCTG GTCGATAACG CTTTTAAATA 780 TTCTGCTCCA GGAACCAAGC TGGAAGTGGT GACTAAGCTG GAGAAGGGCC AGCTTTCAAT 840 CAGTGTGACC GATGAAGGGC AGGGCATTGC CCCAGAGGAT TTGGAAAATA TTTTCAAACG 900 CCTTTATCGT GTCGAAACTT CGCGTAACAT GAAGACAGGT GGTCATGGAT TAGGACTTGC 960 GATTGCGCGT GAATTGGCCC ATCAATTGGG TGGGGAAATC ACAGTCAGCA GCCAGTACGG 1020 TCTAGGAAGT ACCTTTACCC TCGTTCTCAA TCTCTCTGGT AGTGAAAATA AAGCCTAAAA 1080 CCCCTTTACA AATCCAG 1097

【００９５】（２）配列番号：４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４： GCTTGATGAT TGCCCAGTTG TC 22

【００９６】（２）配列番号：５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５： GGCCCTTCTC CAGCTTAGTC AC 22

【００９７】（２）配列番号：６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：６： AACTGAGACT GGCTTTAAGA GATTA 25

【００９８】（２）配列番号：７に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：７： ATGAAACTAA AAAGTTATAT TTTGG 25

【００９９】（２）配列番号：８に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：８： GGCTTTATTT TCACTACCAG AGAGA 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３１ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３１Ｃ 35/76 35/76 38/45 39/09 39/09 39/395 Ｄ 39/395 Ｒ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/315 Ｃ０７Ｋ 14/315 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 37/52 (72)発明者 マグダレーナ・サラカイン アメリカ合衆国19380ペンシルベニア州ウ エスト・チェスター、ウッドミント・ドラ イブ126番 (72)発明者 ジェイムズ・レイモンド・ブラウン アメリカ合衆国19312ペンシルベニア州バ ーウィン、ロビンズ・レイン９番

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポ
   リペプチドコードしているポリヌクレオチドに対して少
   なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）寄託株のストレプトコッカス・ニューモニアエ中
   に含まれるヒスチジンキナーゼ遺伝子により発現される
   のと同じ成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレ
   オチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリ
   ヌクレオチド； （ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも
   ７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
   ードしているポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   に対して相捕的であるポリヌクレオチド；および （ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   の少なくとも１５個の連続した塩基を含むポリヌクレオ
   チド からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む
   単離ポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチ
   ド。
3. 【請求項３】 ＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチ
   ド。
4. 【請求項４】 配列番号１に示す核酸配列を含む請求項
   ２のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号１に示すヌクレオチド１から１
   ０５０までを含む請求項２のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリ
   ペプチドをコードしている請求項２のポリヌクレオチ
   ド。
7. 【請求項７】 請求項１のポリヌクレオチドを含むベク
   ター。
8. 【請求項８】 請求項７のベクターを含む宿主細胞。
9. 【請求項９】 請求項８の宿主細胞から上記ＤＮＡによ
   りコードされているポリペプチドを発現させることを含
   む、ポリペプチドの製造方法。
10. 【請求項１０】 ヒスチジンキナーゼポリペプチドまた
    はフラグメントの製造方法であって、該ポリペプチドま
    たはフラグメントの生成に十分な条件下で請求項８の宿
    主を培養することを含む方法。
11. 【請求項１１】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して
    少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペ
    プチド。
12. 【請求項１２】 配列番号：２に示すアミノ酸配列を含
    むポリペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項１１のポリペプチドに対する抗
    体。
14. 【請求項１４】 請求項１１のポリペプチドの活性また
    は発現を阻害するアンタゴニスト。
15. 【請求項１５】 治療上有効量の請求項１１のポリペプ
    チドを個体に投与することを含む、ヒスチジンキナーゼ
    ポリペプチドを必要とする個体の治療方法。
16. 【請求項１６】 治療上有効量の請求項１４のアンタゴ
    ニストを個体に投与することを含む、ヒスチジンキナー
    ゼポリペプチドの阻害を必要とする個体の治療方法。
17. 【請求項１７】 個体における請求項１１のポリペプチ
    ドの発現または活性に関連した疾病の診断方法であっ
    て、 （ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸配列を決定
    すること、および／または（ｂ）個体由来の試料中の該
    ポリペプチドの存在または量について分析することを含
    む方法。
18. 【請求項１８】 請求項１１のポリペプチドと相互作用
    して、その活性を阻害または活性化する化合物の同定方
    法であって、 化合物とポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条
    件下で、ポリペプチドとスクリーニングすべき化合物と
    を接触させて化合物の相互作用を評価し（かかる相互作
    用はポリペプチドと化合物との相互作用に応答した検出
    可能シグナルを提供しうる第２の成分に関連したもので
    ある）、 次いで、化合物とポリペプチドとの相互作用により生じ
    るシグナルの存在または不存在を検出することにより、
    化合物がポリペプチドと相互作用して、その活性を活性
    化または阻害するかどうかを決定することを含む方法。
19. 【請求項１９】 哺乳動物における免疫学的応答を誘導
    する方法であって、抗体および／またはＴ細胞免疫応答
    を生じさせて動物を疾病から防御するに十分な請求項１
    １のヒスチジンキナーゼポリペプチドまたはそのフラグ
    メントもしくは変種を哺乳動物に接種することを含む方
    法。
20. 【請求項２０】 哺乳動物における免疫学的応答を誘導
    する方法であって、ヒスチジンキナーゼポリペプチドま
    たはそのフラグメントもしくは変種をインビボで発現さ
    せて、抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生じさせる
    免疫学的応答を誘導して該動物を疾病から防御するする
    ために、請求項１１のヒスチジンキナーゼポリペプチド
    またはそのフラグメントもしくは変種の発現を指令する
    核酸ベクターを送達することを含む方法。