JPH11113582A - ヒスチジン・キナーゼ - Google Patents

ヒスチジン・キナーゼ

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JPH11113582A
JPH11113582A JP10188023A JP18802398A JPH11113582A JP H11113582 A JPH11113582 A JP H11113582A JP 10188023 A JP10188023 A JP 10188023A JP 18802398 A JP18802398 A JP 18802398A JP H11113582 A JPH11113582 A JP H11113582A
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ニコラ・ゲイル・ウォリス
Magdalena Zalacain
マグダレーナ・サラカイン
John Throup
ジョン・スループ
Sanjoy Biswas
サンジョイ・ビスワス
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SmithKline Beecham Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒスチジンキナーゼポリペプチドおよび該ポ
リペプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供す
る。 【解決手段】 本発明は、配列番号２またはのアミノ酸
配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌク
レオチドからなる単離ポリヌクレオチド；ヒスチジンキ
ナーゼポリペプチドおよびヒスチジンキナーゼポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドおよび組換え技法に
より該ポリペプチドの製法を提供するものである。さら
には、抗菌化合物についてスクリーニングするのにヒス
チジンキナーゼポリペプチドを利用する方法を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願 本出願は、１９９７年５月３０日出願の米国仮特許出願
第６０／０４８，３４６号の利益を主張する。
【発明の属する技術分野】本発明は、新規に同定された
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、その製造および
使用、ならびにその変種、アゴニストおよびアンタゴニ
スト、ならびにその使用に関する。特に、本発明は、ヒ
スチジンキナーゼファミリーならびにならびにそれらの
変種（以下、「ヒスチジンキナーゼ」、「ヒスチジンキ
ナーゼポリヌクレオチド」、および「ヒスチジンキナー
ゼポリペプチド」と称する）のポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】ストレプトコッカス属（Streptococci）
は医学的に重要な微生物属を形成しており、ヒトに，例
えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞
炎、膿胸および心内膜炎、特に例えば脳脊髄液の感染の
ごとき髄膜炎を包含する、いくつかの型の疾患を引き起
こすことが知られている。ストレプトコッカス属の単離
から１００年以上も経過しているため、ストレプトコッ
カス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）
は、より詳細な研究が為された微生物の一つである。例
えば、事実、ＤＮＡが遺伝物質であるという我々の初期
の理解の大部分は、この微生物を用いたGriffithならび
に、Avery、MacleodおよびMcCartyの研究にて断言され
た。ストレプトコッカス・ニューモニアエに関する研究
は膨大であるにもかかわらず、この微生物の毒性に関し
ては多くの疑問が残されている。抗生物質の開発のため
の標的としてストレプトコッカス属の遺伝子および遺伝
子産物を用いるのはとりわけ好ましいことである。
【０００３】ストレプトコッカス・ニューモニアエ感染
の頻度は過去２、３０年間に劇的に上昇している。これ
は多重抗生物質耐性株の出現、および免疫系が低下した
人の母集団の増加に起因している。いくつかのまたは全
ての標準的な抗生物質に対して耐性を有するストレプト
コッカス・ニューモニアエ株を単離することはもはやめ
ずらしいことではない。この現象がこの生物に対する新
しい抗菌剤、ワクチンおよび診断試験についての必要性
を形成した。多くの２成分シグナルトランスダクション
システム（ＴＣＳＴＳ）が細菌において同定されている
（Stock, J. B., Ninfa, A. J. & Stock , A. M. (198
9) Microbiol. Rev. 53, 450-490)。これらは、その周
囲を監視し、その環境の変化に適応する細菌の能力に関
連している。これらの細菌のＴＣＳＴＳのいくつかは、
宿主内での毒性および細菌性病原性に関連する。
【０００４】ヒスチジンキナーゼは、ヒスチジン残基で
自動リン酸化するＴＣＳＴＳの成分である。ついで、リ
ン酸基は関連する応答レギュレーターに移される。ヒス
チジンキナーゼは、5個の短い保存されたアミノ酸配列
を有する（Stock. J. B., Ninfa, A. J. & Stock, A.
M. (1989) Microbiol. Rev. 53, 450-490, Swanson, R.
V., Alex, L. A. & Simon, M. I. (1994) TIBS 19 485-
491）。これらは、リン酸化される、保存アスパラギン
残基が約１００残基後に続く、ヒスチジン残基である。
さらに１５ないし４５残基後に、ＤＸＧＸＧモチーフが
見られ、さらに１０−２０残基後にＦＸＸＦモチーフが
続く。さらに１０−２０残基には、他のグリシンモチー
フ、ＧＸＧが見られる。２個のグリシンモチーフは、ヌ
クレオチド結合に関与するものと考えられている。この
ヒスチジンキナーゼファミリーには、バシラス・サチリ
ス（Bacillus subtilis）由来のＰｈｏＲタンパク質が
包含される。ＰｈｏＲは、ビー・サチリスにおいてアル
カラインホスファターゼ産生に関与する遺伝子の調節を
制御するＴＣＳＴＳのヒスチジンキナーゼである（Sek
i, T., Yoshikawa, H., Takahashi, H. & Saito, H.,
(1988), J. Bacteriol.170, 5935-5938）。
【０００５】応答レギュレーターは、ＴＣＳＴＳの成分
である。これらのタンパク質は、ヒスチジンキナーゼか
らリン酸化され、一度リン酸化されると、しばしばＤＮ
Ａ結合ドメインの活性化を介して、応答に作用する。応
答レギュレーターは、約１００アミノ酸残基の保存Ｎ−
末端ドメインにより特徴付けられる。応答レギュレータ
ーのＮ−末端ドメインならびにＣｈｅＹ中の残基Ｄ１
２、Ｄ１３、Ｄ５７、Ｔ８７、Ｋ１０９（Matsumura,
P., Rydel, J. J., Linzmeier, R. & Vacante, D.(198
4) J. Bacteriol. 160, 36-41）に対応する、保持され
た5個の機能的に重要な残基は、保存された構造特性を
有する（Volz, K. (1993) Biochemistry 32,11741-1175
3）。サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhim
urium）（Stock, A. M., Mottonen, J. M., Stock, J.
B. & Schutt, C. E. (1989) Nature,337, 745-749）お
よびエシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Volz,
K. &Matsumura, P. (1991) J. Biol. Chem. 266, 15511
-15519）由来のＣｈｅＹの３次元構造およびエス・チフ
ィムリウム由来の窒素調節タンパク質ＣのＮ−末端ドメ
イン（Volkman, B. F., Nohaile, M. J., Amy, N. K.,
Kutsu, S. & Wemmer,D. E. (1995) Biochemistry, 34 1
413-1424）は、バシラス・サチリス由来のＳｐｏＯＦの
2次元構造（Feher, V. A., Zapf, J. W., Hoch, J. A.,
Dahlquist,F. W., Whiteley, J. M. & Cavanagh, J.
(1995) Protein Science, 4, 1801-1814）と同様、利用
可能である。これらの構造は、（ａ／ｂ）5の折りたた
み（fold）を有する。いくつかの構造残基は、異なる応
答レギュレーター配列間、特に、β−シート疎水性コア
およびα−へリックス由来の部位中の疎水性残基で保存
されている。
【０００６】ＴＣＳＴＳにより調節されるプロセスに
は、毒性因子の生成、運動性、抗生物質耐性および細胞
複製がある。ＴＣＳＴＳタンパク質の阻害剤は、病因に
必要な因子の生成を妨げることにより、細菌が宿主の感
染を確立し維持することを妨げ、それにより、抗細菌治
療において有用性がある。そのうえ、薬剤の発見方法
は、現在のところ、「機能的遺伝学」、すなわち、高処
理量のゲノムまたは遺伝子に基づく生物学を包含するの
で抜本的な改革を受けている。このアプローチは、「位
置的クローニング」に基づく初期のアプローチおよび他
の方法に取って代わりつつある。機能的遺伝学は、現在
利用可能な多くの分子生物学的データベースならびに他
のソースから潜在的に興味ある遺伝子配列を同定するた
めの種々の道具に大きく依存している。薬剤の発見の標
的としての、さらなる遺伝子および他のポリヌクレオチ
ド配列ならびにそれらの関連ポリペプチドの同定および
特徴づけをする必要性があり続けている。
【０００７】抗生物質活性に関して化合物をスクリーニ
ングするために有用であるという利点を有した、本発明
のヒスチジンキナーゼの具体例のごときポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドに対する要望があることは明白で
ある。かかる因子はまた、感染、機能不全および疾患の
発生病理における役割を決定するのに有用である。感
染、機能不全および疾患を予防、改善または治癒するた
めの方法を見出すために、かかる因子ならびにそのアン
タゴニストおよびアゴニストを同定および特徴づけする
必要も明らかにある。本発明のある種のポリペプチド
は、既知のバシラス・サチリス由来のＰｈｏＲタンパク
質に対して有意なアミノ酸配列相同性を有する(Swiss-p
rot database P23545; Polynucleotide TIGR contig 41
72）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒスチジン
キナーゼ、詳細にはヒスチジンキナーゼポリペプチドお
よびヒスチジンキナーゼポリヌクレオチド、組み換え物
質ならびにそれらの製造方法に関する。もう１つの態様
において、本発明は、かかるポリペプチドおよびポリヌ
クレオチドの使用方法に関し、とりわけ、微生物による
疾患の治療を包含する。さらなる態様において、本発明
は、本発明により提供される材料を用いるアゴニストお
よびアンタゴニストの同定方法、ならびに同定された化
合物を用いる微生物による感染およびかかる感染に関連
した症状の治療方法に関する。さらなる態様において、
本発明は、微生物による感染およびかかる感染に関連し
た症状の検出のための診断アッセイ、例えば、ヒスチジ
ンキナーゼ発現または活性の検出のためのアッセイに関
する。開示された本発明の精神および範囲内での種々の
変更および修飾は、以下の説明を読み、本開示の他の部
分読めば、当業者に容易に明らかになるであろう。
【０００９】
【課題を解決するための手段】以下に詳細に説明するよ
うに、本発明は、ヒスチジンキナーゼポリペプチドおよ
びポリヌクレオチドに関する。詳細には、本発明は、バ
シラス・サチリスのＰｈｏＲポリペプチドに対してアミ
ノ酸配列相同性により関連づけられるストレプトコッカ
ス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）のヒ
スチジンキナーゼのポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドに関する。特に、本発明は、それぞれ配列番号１また
は３および配列番号２または４として表１に示されるヌ
クレオチドおよびアミノ酸配列を有するヒスチジンキナ
ーゼに関する。
【００１０】表１ ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ド配列
【００１１】（Ａ）ストレプトコッカス・ニューモニア
エのヒスチジンキナーゼポリヌクレオチド配列（配列番
号１） 5'-CCAATACCTTGAATGTGCATATCCATGCTCTTCGACAGGAGCTGGCA
AAATATAGTAGTGACCAAACGCCCACTATTAAGACAGTTTGGGGGTTGGG
ATATAAGATAGAGAAACCGAGAGGACAAACATGAAACTAAAAAGTTATAT
TTTGGTTGGATATATTATTTCAACCCTCTTAACCATTTTGGTTGTTTTTT
GGGCTGTTCAAAAAATGCTGATTGCGAAAGGCGAGATTTACTTTTTGCTT
GGGATGACCATCGTTGCCAGCCTTGTCGGTGCTGGGATTAGTCTCTTTCT
CCTATTGCCAGTCTTTACGTCGTTGGGCAAACTCAAGGAGCATGCCAAGC
GGGTAGCGGCCAAGGATTTTCCTTCAAATTTGGAGGTTCAAGGTCCTGTA
GAATTTCAGCAATTAGGGCAAACTTTTAATGAGATGTCCCATGATTTGCA
GGTAAGCTTTGATTCCTTGGAAGAAAGCGAACGAGAAAAGGGCTTGATGA
TTGCCCAGTTGTCGCATGATATTAAGACCCCTATCACTTCGATCCAAGCG
ACGGTAGAAGGGATTTTGGATGGGATTATCAAGGAGTCGGAGCAAGCTCA
TTATCTAGCAACCATTGGACGCCAGACGGAGAGGCTCAATAAACTGGTTG
AGGAGTTGAATTTTTTGACCCTAAACACAGCTAGAAATCAGGTGGAAACT
ACCAGTAAAGACAGTATTTTTCTGGACAAGCTCTTAATTGAGTGCATGAG
TGAATTTCAGTTTTTGATTGAGCAGGAGAGAAGAGATGTCCACTTGCAGG
TAATCCCAGAGTCTGCCCGGATTGAGGGAGATTATGCTAAGCTTTCTCGT
ATCTTGGTGAATCTGGTCGATAACGCTTTTAAATATTCTGCTCCAGGAAC
CAAGCTGGAAGTGGTGACTAAGCTGGAGAAGGGCCAGCTTTCAATCAGTG
TGACCGATGAAGGGCAGGGCATTGCCCCAGAGGATTTGGAAAATATTTTC
AAACGCCTTTATCGTGTCGAAACTTCGCGTAACATGAAGACAGGTGGTCA
TGGATTAGGACTTGCGATTGCGCGTGAATTGGCCCATCAATTGGGTGGGG
AAATCACAGTCAGCAGCCAGTACGGTCTAGGAAGTACCTTTACCCTCGTT
CTCAATCTCTCTGGTAGTGAAAATAAAGCCTAAAACCCCTTTACAAATCC
AG-3'
【００１２】（Ｂ）この表のポリヌクレオチド配列より
推定されるストレプトコッカス・ニューモニアエのヒス
チジンキナーゼポリペプチド配列（配列番号２） NH2-MKLKSYILVGYIISTLLTILVVFWAVQKMLIAKGEIYFLLGMTIVA
SLVGAGISLFLLLPVFTSLGKLKEHAKRVAAKDFPSNLEVQGPVEFQQLG
QTFNEMSHDLQVSFDSLEESEREKGLMIAQLSHDIKTPITSIQATVEGIL
DGIIKESEQAHYLATIGRQTERLNKLVEELNFLTLNTARNQVETTSKDSI
FLDKLLIECMSEFQFLIEQERRDVHLQVIPESARIEGDYAKLSRILVNLV
DNAFKYSAPGTKLEVVTKLEKGQLSISVTDEGQGIAPEDLENIFKRLYRV
ETSRNMKTGGHGLGLAIARELAHQLGGEITVSSQYGLGSTFTLVLNLSGS
ENKA-COOH
【００１３】（Ｃ）ストレプトコッカス・ニューモニア
エのヒスチジンキナーゼのＯＲＦ配列（配列番号３） 5'-AACATGAAACTAAAAAGTTATATTTTGGTTGGATATATTATTTCAAC
CCTCTTAACCATTTTGGTTGTTTTTTGGGCTGTTCAAAAAATGCTGATTG
CGAAAGGCGAGATTTACTTTTTGCTTGGGATGACCATCGTTGCCAGCCTT
GTCGGTGCTGGGATTAGTCTCTTTCTCCTATTGCCAGTCTTTACGTCGTT
GGGCAAACTCAAGGAGCATGCCAAGCGGGTAGCGGCCAAGGATTTTCCTT
CAAATTTGGAGGTTCAAGGTCCTGTAGAATTTCAGCAATTAGGGCAAACT
TTTAATGAGATGTCCCATGATTTGCAGGTAAGCTTTGATTCCTTGGAAGA
AAGCGAACGAGAAAAGGGCTTGATGATTGCCCAGTTGTCGCATGATATTA
AGACCCCTATCACTTCGATCCAAGCGACGGTAGAAGGGATTTTGGATGGG
ATTATCAAGGAGTCGGAGCAAGCTCATTACTAC-3'
【００１４】（Ｄ）この表のポリヌクレオチドＯＲＦ配
列より推定されるストレプトコッカス・ニューモニアエ
のヒスチジンキナーゼポリペプチド配列（配列番号４） NH2-MKLKSYILVGYIISTLLTILVVFWAVQKMLIAKGEIYFLLGMTIVA
SLVGAGISLFLLLPVFTSLGKLKEHAKRVAAKDFPSNLEVQGPVEFQQLG
QTFNEMSHDLQVSFDSLEESEREKGLMIAQLSHDIKTPITSIQATVEGIL
DGIIKESEQAHYY-COOH
【００１５】寄託材料 ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３株
を含む寄託株を、１９９６年４月１１日に、スコットラ
ンド、ＡＢ２ １ＲＹ、アバディーン、マチャードライ
ブ２３Ｓt.のナショナル・コレクション・オブ・インダ
ストリアル・アンド・マリーン・バクテリア・リミテッ
ド（本明細書にて「ＮＣＩＭＢ」という）に、ＮＣＩＭ
Ｂ受託番号４０７９４の下で寄託した。その寄託株は寄
託の際にストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００
９９３と命名された。１９９６年４月１７日に、同様
に、エシェリシア・コリ中のストレプトコッカス・ニュ
ーモニアエ０１００９９３ＤＮＡライブラリーがＮＣＩ
ＭＢに寄託され、受託番号４０８００が与えられた。こ
のストレプトコッカス・ニューモニアエ寄託株を、本明
細書では「寄託株」または「寄託株のＤＮＡ」と称す
る。
【００１６】寄託株は全長のヒスチジンキナーゼ遺伝子
を含んでいる。寄託株に含まれるポリヌクレオチドの配
列ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列は、本明細書における配列の記載とのいずれの
不一致においても支配的である。寄託株の寄託は、特許
手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条
約の条件下で行われている。特許が発行されると何ら制
限または条件もなく、最終的に株は分譲される。寄託株
は当業者の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.
１１２条の下に要求されるような、寄託が実施可能要件
であることを承認するものではない。
【００１７】寄託株、それに由来の化合物を製造、使用
または販売するには、ライセンスが必要であるが、その
ようなライセンスはここで付与されるものではない。本
発明の一の態様は、寄託株に含まれるストレプトコッカ
ス・ニューモニアエ０１００９９３株により発現可能な
成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供する
ことである。さらには、本発明はＤＮＡおよびＲＮＡな
どの寄託株中のヒスチジンキナーゼヌクレオチド配列お
よびそれによりコードされるアミノ酸配列を提供する。
また、本発明は寄託株より単離されたヒスチジンキナー
ゼポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列を提供
する。
【００１８】ポリペプチド 本発明のヒスチジンキナーゼポリペプチドは他のヒスチ
ジンキナーゼファミリーのタンパク質に実質的に系統発
生的に関連している。本発明の１の態様において、本明
細書において「ヒスチジンキナーゼ」および「ヒスチジ
ンキナーゼポリペプチド」というストレプトコッカス・
ニューモニアエのポリペプチドならびに生物学的、診断
上、予防上、臨床的または治療上有用なその変種、なら
びにそれを含む組成物が提供される。本発明のとりわけ
好ましい具体例は、ヒスチジンキナーゼ遺伝子の自然発
生対立遺伝子によりコードされるヒスチジンキナーゼポ
リペプチドの変種である。
【００１９】さらに本発明は下記のものである単離ポリ
ペプチド： （ａ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ
酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは
少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも
９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５
％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の
同一性を有するかまたは全く同一であるアミノ酸配列を
含むかまたはそれよりなるポリペプチド； （ｂ）配列番号１の全長にわたって配列番号１に対して
少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０
％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一
性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、
最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有す
るかまたは全く同一であるポリヌクレオチド配列を含む
かまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコー
ドされるポリペプチド； （ｃ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ
酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは
少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも
９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５
％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の
同一性を有するかまたは全く同一であるポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチド配列を含むかまたはそ
れよりなる単離ポリヌクレオチドによりコードされるポ
リペプチド； （ｄ）配列番号３の全長にわたって配列番号１に対して
少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０
％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一
性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、
最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有す
るかまたは全く同一であるポリヌクレオチド配列を含む
かまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコー
ドされるポリペプチド； （ｅ）配列番号３の全長にわたって配列番号３に対して
少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０
％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一
性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、
最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有す
るかまたは全く同一であるポリヌクレオチド配列を含む
かまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコー
ドされるポリペプチド；または （ｆ）配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ
酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは
少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも
９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５
％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の
同一性を有するかまたは全く同一であるポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチド配列を含むかまたはそ
れよりなる単離ポリヌクレオチドによりコードされるポ
リペプチド； （ｇ）配列番号４の全長にわたって配列番号２のアミノ
酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは
少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも
９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５
％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の
同一性を有するかまたは全く同一であるアミノ酸配列を
含むかまたはそれよりなるポリペプチドを提供する。
【００２０】本発明のポリペプチドは、表１（配列番号
２または４）のポリペプチド（とりわけ成熟ポリペプチ
ド）ならびに、特に、ヒスチジンキナーゼの生物活性を
有し、表１（配列番号１または３）のポリペプチドまた
はその該当部分と少なくとも７０％の同一性、好ましく
は表１（配列番号２または４）のポリペプチドと少なく
とも８０％の同一性、より好ましくは表１（配列番号２
または４）のポリペプチドと少なくとも９０％の同一
性、さらにより好ましくは表１（配列番号２または４）
のポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するポ
リペプチドおよびフラグメントを包含し、さらに、一般
に、少なくとも３０個のアミノ酸、より好ましくは、少
なくとも５０個のアミノ酸を含むポリペプチドの部分を
有するかかるポリペプチドの部分も包含する。
【００２１】本発明はまた、式： Ｘ−（Ｒ1）m−（Ｒ2）−（Ｒ3）n−Ｙ （式中、アミノ末端においてＸは水素、金属または修飾
ポリペプチドに関して本明細書中で記載した他の部分で
あり、カルボキシル末端においてＹは水素、金属または
修飾ポリペプチドに関して本明細書中で記載した他の部
分であり、Ｒ1およびＲ3はいずれかのアミノ酸残基また
は修飾アミノ酸残基であり、ｍは１〜１０００の整数ま
たは０であり、ｎは１〜１０００の整数または０であ
り、Ｒ2は本発明のアミノ酸配列、特に表１から選択さ
れるアミノ酸配列またはそれらの修飾形態を意味する）
で示されるポリペプチドを包含する。上記の式中、Ｒ2
はアミノ末端残基がその左側でＲ1に共有結合し、その
カルボキシ末端残基がその右側でＲ3に共有結合するよ
うに方向づけられる。ｍおよび／またはｎが１より大き
い場合、Ｒ1またはＲ3のいずれかの基で表されるアミノ
酸残基の伸長鎖は、ヘテロポリマーまたはホモポリマー
のいずれであってもよく、ヘテロポリマーが好ましい。
本発明の他の好ましい具体例は、ｍが１ないし５０、１
００または５００の間の整数であり、ｎが１ないし５
０、１００または５００の間の整数のものである。
【００２２】本発明がストレプトコッカス・ニューモニ
アエ由来のものであるのが最も好ましいが、同じ分類学
上の属の他の生物由来のものであっても好ましい。また
本発明のポリペプチドは、例えば、同じ科または目から
得られるものであってもよい。フラグメントは、その全
体が、上記したポリペプチドのアミノ酸配列の全部では
ないが、一部と同じであるアミノ酸配列を有する変種ポ
リペプチドである。ヒスチジンキナーゼポリペプチドと
同様、フラグメントは「独立している」か、またはそれ
らが一の部分または領域、最も好ましくは単一のより大
きなポリペプチド中の単一の連続した領域を形成するよ
り大きなポリペプチドの中に含まれていてもよい。
【００２３】好ましいフラグメントは、例えば、表１
（配列番号２または４）のアミノ酸配列または、アミノ
および／またはカルボキシ末端アミノ酸配列を含む連続
した一連の残基のような、その変種の一部を有する末端
切断ポリペプチドを包含する。宿主細胞、特に、ストレ
プトコッカス・ニューモニアエにより生成されるかまた
その中の本発明のポリペプチドの分解型も好ましい。さ
らに、アルファヘリックスおよびアルファヘリックス形
成領域、ベータシートおよびベータシート形成領域、タ
ーンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領
域、親水領域、疎水領域、アルファ両親媒性領域、ベー
タ両親媒性領域、可変領域、界面形成領域、基質結合領
域、および高抗原指数領域を含んでなるフラグメントの
ような、構造的または機能的属性によって特徴づけられ
るフラグメントもまた好ましいフラグメントである。
【００２４】さらに好ましいフラグメントには、配列番
号2のアミノ酸配列からの少なくとも１５、２０、３
０、４０、５０または１００の連続するアミノ酸を有す
るアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、または、配列
番号2のアミノ酸配列から末端切断されたまたは欠失し
た少なくとも１５、２０、３０、４０、５０または１０
０の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離
ポリペプチドが包含される。
【００２５】類似活性または改良活性を有するもの、ま
たは望ましくない活性が減少したフラグメントを含め、
ヒスチジンキナーゼの活性を媒介するフラグメントであ
る、生物学的に活性なフラグメントも好ましいフラグメ
ントである。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性ま
たは免疫原性であるフラグメントも含まれる。特に好ま
しいものは、ストレプトコッカス・ニューモニアエの生
存に必須の機能または個体、特に、ヒトにおける疾患の
開始または原因維持能力を与える酵素群のレセプターま
たはドメインからなるフラグメントである。
【００２６】本発明のポリペプチドのフラグメントであ
る変種は、ペプチド合成法により対応する全長のポリペ
プチドの製造に使用することができる。したがって、こ
れらの変種は、本発明の全長ポリペプチドを製造するた
めの中間体として使用できる。アミノ酸に関する標準的
１文字および３文字表記に加えて、「Ｘ」または「Ｘａ
ａ」なる語もまた、本発明のあるポリペプチドを記載す
るのに用いられる。「Ｘ」および「Ｘａａ」は、２０種
の天然に存在するいずれかのアミノ酸がポリペプチド配
列のそのような指定する位置にあってもよいことを意味
する。
【００２７】ポリヌクレオチド ヒスチジンキナーゼポリペプチドをコードしているポリ
ヌクレオチド、詳細には、本明細書でヒスチジンキナー
ゼと命名されるポリペプチドをコードしているポリヌク
レオチドを提供することが本発明の一つの目的である。
本発明の特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチ
ドは、全長の遺伝子を含む、表１（配列番号：１または
３）に示す配列をヒスチジンキナーゼポリペプチド、ま
たはその変種をコードしている領域を含む。本発明のさ
らなる態様として、ヒスチジンキナーゼポリペプチドお
よびポリヌクレオチド、詳細には、ストレプトコッカス
・ニューモニアエのヒスチジンキナーゼポリペプチドお
よびポリヌクレオチドをコードおよび／または発現する
単離核酸分子が提供され、核酸分子としては、例えば、
未プロセッシングＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、ｍＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、Ｂ−およびＺ−ＤＮＡが
挙げられる。本発明のさらなる具体例は、生物学的、診
断上、予防上、臨床的または治療上有用なポリヌクレオ
チドおよびポリペプチド、ならびにその変種、ならびに
それらを含む組成物を包含する。本発明のもう一つの態
様は、少なくとも一つの全長遺伝子を含む、表１（配列
番号２または４）の推定アミノ酸配列を有するヒスチジ
ンキナーゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオ
チドおよびそれに密接に関連するポリヌクレオチドおよ
びそれらの変種に関する。
【００２８】もう１つの特に好ましい本発明具体例にお
いて、表１（配列番号２または４）のアミノ酸配列を含
むかまたはそれよりなる、ストレプトコッカス・ニュー
モニアエ由来のヒスチジンキナーゼが提供される。表１
（配列番号１または３）に示すポリヌクレオチド配列の
ような本明細書の情報を使用し、出発材料としてストレ
プトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３細胞を使
用し、細菌からの染色体ＤＮＡフラグメントをクローニ
ングし、配列決定し、つづいて全長クローンを得る標準
的クローニングおよびスクリーニング法を使用して、ヒ
スチジンキナーゼポリペプチドをコードする本発明のポ
リヌクレオチドを得ることができる。例えば、表１（配
列番号１または３）に示す配列のような本発明のポリヌ
クレオチド配列を得るには、典型的には、イー・コリま
たは他の適当な宿主中のストレプトコッカス・ニューモ
ニアエ０１００９９３の染色体ＤＮＡのクローンのライ
ブラリーを、部分配列から由来する放射標識したオリゴ
ヌクレオチド、好ましくは１７量体またはそれより長い
オリゴヌクレオチドでプローブする。ついで、該プロー
ブと同じＤＮＡを有するクローンをストリンジェントな
条件を使用して区別できる。該オリジナルポリペプチド
またはポリヌクレオチド配列から設計された配列決定プ
ライマーで同定された個々のクローンを配列決定するこ
とにより、該配列を両方の方向に伸長し、全長を決定す
ることが可能である。都合よくは、プラスミド・クロー
ンから調製された変性二本鎖ＤＮＡを用いてかかる配列
決定を行う。適当な技法は、Maniatis, T., Fritsch,
E. F. およびSambrookら、MOLECULAR CLONING：A LABOR
ATORY MANUAL，2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, Cold Spring Harbor, New York（1989）（特
に、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング１.
９０および変性二本鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定１３.７０
を参照のこと）により記載されている。直接ゲノムＤＮ
Ａ配列決定を用いて全長遺伝子配列を得ることもでき
る。例えば、表１（配列番号１または３）に示すポリヌ
クレオチドは、ストレプトコッカス・ニューモニアエ０
１００９９３から由来するＤＮＡライブラリー中で見い
だしたものである。
【００２９】さらに、表１（配列番号１または３）に示
される各々のＤＮＡ配列は、表１（配列番号２または
４）に示す概数のアミノ酸残基を有し、当業者に周知の
アミノ酸残基の分子量から計算できる推定分子量を有す
るタンパク質をコードするオープンリーディングフレー
ムを有する。ヌクレオチド番号１２８と、配列番号１の
ヌクレオチド番号１１７８で始まる停止コドンの間の配
列番号１のポリヌクレオチドが、配列番号２のポリペプ
チドをコードする。
【００３０】さらなる態様において、本発明は、下記の
ポリヌクレオチドを含むかまたはそれらよりなる単離ポ
リヌクレオチドを提供する： （ａ）配列番号１の全長にわたって配列番号１に対して
少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０
％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一
性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、
さらにより好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性
を有するかまたは全く同一であるポリヌクレオチド配
列； （ｂ）配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ
酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは
少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも
９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５
％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７〜９
９％またはちょうど１００％の同一性を有するポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチド配列；または （ｃ）配列番号３の全長にわたって配列番号１に対して
少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０
％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一
性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、
さらにより好ましくは少なくとも９７〜９９％または１
００％の同一性を有するヌクレオチド配列； （ｄ）配列番号３の全長にわたって配列番号３に対して
少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０
％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一
性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、
さらにより好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性
を有するかまたは全く同一であるヌクレオチド配列；ま
たは （ｅ）配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ
酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは
少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも
９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５
％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７〜９
９％の同一性を有するかまたは全く同一であるポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチド配列。 本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
ド（ストレプトコッカス・ニューモニアエ以外の種由来
のホモログおよびオーソログを包含）を、ストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件において、配列番号
１もしくは３の配列またはそれらのフラグメントを含む
かまたはそれらよりなる標識または検出可能プローブを
用いて適当なライブラリーをスクリーニングし、つい
で、該ポリヌクレオチド配列を含む全長遺伝子および／
またはゲノムクローンを単離する工程を含む方法により
得ることができる。
【００３１】本発明は、表１（配列番号１または３）の
コーディング配列と、その全長にわたって同一であるポ
リヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は、成熟
ポリペプチドまたはそのフラグメント用のコーディング
配列自体ならびにリーダーまたは分泌配列、プレ、プロ
またはプレプロタンパク質配列をコードする配列のよう
な他のコーディング配列を有するリーディング・フレー
ム中の成熟ポリペプチドまたはフラグメントのコーディ
ング配列を提供する。本発明のポリヌクレオチドはま
た、例えば、転写されるが翻訳されない配列、終止シグ
ナル（ｒｈｏ−依存性およびｒｈｏ−非依存性終止シグ
ナル）、リボソーム結合部位、コザック（Kozak）配
列、ｍＲＮＡを安定化する配列、イントロン、ポリアデ
ニル化シグナルのような少なくとも一つの非コーディン
グ５’および３’配列を含む、少なくとも一つの非コー
ディング配列を含むが、これに限定するものではない。
ポリヌクレオチド配列は、付加アミノ酸をコードする付
加コーディング配列を含むこともできる。例えば、融合
ポリペプチドの精製を促進するマーカー配列をコードす
ることができる。本発明のある種の具体例において、マ
ーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen, Inc.）におい
て提供され、Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA（19
89）86: 821-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチ
ジンペプチドであるか、またはＨＡペプチドタグ（Wils
onら、Cell, 37: 767(1984)）であり、これらは両方と
もそれらに融合するポリペプチド配列を精製するのに有
用である。本発明のポリヌクレオチドは、限定するもの
ではないが、構造遺伝子およびその遺伝子の発現を調節
する本来的に結合した配列を含むポリヌクレオチドを包
含する。
【００３２】本発明の好ましい具体例は、表１の配列番
号１に示されるヌクレオチド１２８からヌクレオチド１
１７８のすぐ上流にあるヌクレオチドまたはそのヌクレ
オチドを含むヌクレオチドまでを有するポリヌクレオチ
ドであり、それは共にヒスチジンキナーゼポリペプチド
をコードする。
【００３３】本発明はまた、式： Ｘ−（Ｒ1）m−（Ｒ2）−（Ｒ3）n−Ｙ ［式中、分子の５’末端においてＸは水素、金属または
修飾ヌクレオチド残基あるいはＹと一緒になって共有結
合を形成し、分子の３’末端においてＹは水素、金属ま
たは修飾ヌクレオチド残基あるいはＸと一緒になって共
有結合を形成し、Ｒ1およびＲ3は、各々、独立していず
れかの核酸残基または修飾核酸残基であり、ｍは１〜３
０００の整数または０であり、ｎは１〜３０００の整数
または０であり、Ｒ2は本発明の核酸配列または修飾核
酸配列、特に表１より選択される核酸配列またはその修
飾核酸配列を意味する］で示されるポリヌクレオチドを
含むかそれよりなるポリヌクレオチドを包含する。上記
した式のポリヌクレオチド中、Ｒ2は５’末端残基がそ
の左側でＲ1に結合し、その３’末端残基がその右側で
Ｒ3に結合するように方向付けられる。ｍおよび／また
はｎが１より大きい場合、Ｒ1および／またはＲ2のいず
れかの基で表される核酸残基の伸長鎖は、ヘテロポリマ
ーまたはホモポリマーのいずれであってもよく、ヘテロ
ポリマーが好ましい。好ましい具体例において、Ｘおよ
びＹが一緒になって共有結合を形成する場合、前記した
式のポリヌクレオチドは閉じた環状ポリヌクレオチドで
あり、それは二本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、
その式は第２の鎖が相補性を有する第１の鎖を示す。も
う一つ別の具体例において、ｍおよび／またはｎは１と
１０００の間の整数である。他の好ましい本発明の具体
例は、ｍが１ないし５０、１００または５００の間の整
数であり、ｎが１ないし５０、１００または５００の間
の整数である。
【００３４】本発明のポリヌクレオチドはストレプトコ
ッカス・ニューモニアエ由来であるのが最も好ましい
が、分類学上同じ属の生物より得ることも好ましい。ま
た、例えば、分類学上同じ科または目から得てもよい。
本明細書で使用する「ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド」なる用語は、本発明のポリペプチド、特
に、細菌性ポリペプチド、より詳しくは、表１（配列番
号２または４）に示すアミノ酸配列を有するストレプト
コッカス・ニューモニアエ・ヒスチジンキナーゼのポリ
ペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包
含する。この用語はコードおよび／非コード配列を含ん
でもよいさらなる領域と共に、該ポリペプチドをコード
する単一の連続または非連続領域（例えば、組み込まれ
たファージ、挿入された配列、組み込まれたベクター配
列、組み込まれたトランスポゾン配列、またはＲＮＡエ
デティング（editing）もしくはゲノムＤＮＡ再組織化
により中断されている）を含むポリヌクレオチドを包含
する。本発明はさらに、表１（配列番号２または４）の
推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種をコード
する、本明細書に記載したポリヌクレオチドの変種に関
する。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントは本発
明の全長ポリヌクレオチドの合成に使用できる。
【００３５】さらに好ましい具体例は、数個、わずか
な、５〜１０、１〜５、１〜３、２または１個あるいは
０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、
欠失および／または付加された表１（配列番号２または
４）のヒスチジンキナーゼポリペプチドのアミノ酸配列
を有する、ヒスチジンキナーゼ変種をコードするポリヌ
クレオチドである。特に好ましくは、ヒスチジンキナー
ゼポリペプチドの特性および活性を変化させないサイレ
ント置換、付加および欠失である。
【００３６】本発明のさらに好ましい具体例は、表１
（配列番号２または４）に示すアミノ酸配列をを有する
ヒスチジンキナーゼポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドの全長にわたって少なくとも７０％の同一性を
有するポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオ
チドに相補性のポリヌクレオチドである。また、最も好
ましいものは、ヒスチジンキナーゼポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドと全長にわたって少なくとも８
０％の同一性を有する領域を含むポリヌクレオチドおよ
びそれと相補性のポリヌクレオチドである。この点で、
これと全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有す
るポリヌクレオチドが特に好ましく、中でも少なくとも
９５％の同一性を有するものが特に好ましい。さらに
は、少なくとも９５％の同一性を有するものの中で少な
くとも９７％の同一性を有するものがより好ましく、中
でも少なくとも９８％および少なくとも９９％の同一性
を有するものが特に好ましい。少なくとも９９％の同一
性を有するものがより好ましい。
【００３７】好ましい具体例は、表１（配列番号１また
は３）のＤＮＡによってコードされている成熟ポリペプ
チドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本
発明のある好ましい具体例によれば、特にストリンジェ
ントな条件下で、例えば表１のポリヌクレオチドのごと
きヒスチジンキナーゼポリヌクレオチド配列にハイブリ
ダイゼーションするポリヌクレオチドが提供される。
【００３８】さらに本発明は、本明細書にて上記した配
列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。こ
の点において、本発明は特に、本明細書にて上記したポ
リヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で用い
る場合、「ストリンジェントな条件」および「ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件」という語は、
ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも９５
％、好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合に
のみ起こることを意味する。ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件の一例として、５０％ホルムアル
デヒド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮaＣl、１５ｍＭ ク
エン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（p
Ｈ７.６）、５ｘデンハート（Denhardt's）溶液、１０
％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌ変性切断サケ
精子ＤＮＡを含んでなる溶液中、４２℃で一晩インキュ
ベーションし、ついでハイブリダイゼーション支持体を
０.１ｘＳＳＣ（約６５℃）で洗浄することが挙げられ
る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であ
り、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1
989)、特に、第11章に例示されている。本発明により提
供されるポリヌクレオチド配列に関して溶液ハイブリダ
イゼーションを用いてもよい。
【００３９】本発明は、配列番号１または３に示したポ
リヌクレオチド配列の完全遺伝子を含む適当なライブラ
リーを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下、配列番号１または３に示す該ポリヌクレオチド配
列の配列を有するプローブまたはそのフラグメントでス
クリーニングし、該ＤＮＡ配列を単離することにより得
ることができるポリヌクレオチド配列を含むかまたはそ
れよりなるポリヌクレオチドを提供する。そのようなポ
リヌクレオチドを得るのに有用なフラグメントには、例
えば、本明細書に記載するプローブおよびプライマーが
包含される。
【００４０】本明細書において本発明のポリヌクレオチ
ドの分析についてさらに説明するように、例えば、本発
明のポリヌクレオチドを、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノ
ムＤＮＡに対するハイブリダイゼーション・プローブと
して使用し、ヒスチジンキナーゼをコードする全長ｃＤ
ＮＡおよびゲノムクローンを単離し、ヒスチジンキナー
ゼ遺伝子に対して高い同一性、特に高い配列同一性を有
する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離
することができる。そのようなプローブは、一般に、少
なくとも１５ヌクレオチド残基または塩基対を有してな
るであろう。好ましくは、そのようなプローブは少なく
とも３０ヌクレオチド残基または塩基対からなり、少な
くとも５０ヌクレオチド残基または塩基対を有してもよ
い。特に好ましいプローブは、少なくとも２０ヌクレオ
チド残基または塩基対を有し、３０未満のヌクレオチド
残基または塩基対を有する。ヒスチジンキナーゼ遺伝子
のコーディング領域は、表１（配列番号１または３）の
ＤＮＡ配列を使用してスクリーニングしてオリゴヌクレ
オチド・プローブを合成することにより単離できる。つ
いで、本発明の遺伝子の配列と相補性の配列を有する標
識したオリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニング
し、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリ
ダイズするか決定する。
【００４１】全長のＤＮＡを得る、あるいは短いＤＮＡ
を伸長させるための利用可能で当業者に周知のいくつか
の方法があり、例えば、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡ
ＣＥ）（例えば、Frohmanら、PNAS USA 85: 8998-9002,
1988参照）に基づく方法がある。MarathonTM（登録商
標）法（Clontech Laboratories Inc.）に例示される当
該方法の最近の変法は、例えば、より長いｃＤＮＡの検
索を有意に簡単にしている。MarathonTM法において、ｃ
ＤＮＡは選択組織から抽出されたｍＲＮＡから調製さ
れ、各末端に「アダプター」配列が連結される。つい
で、遺伝子特異的かつアダプター特異的オリゴヌクレオ
チドプライマーを用いて核酸増幅（ＰＣＲ）を行ってＤ
ＮＡの「失われた」５’末端を増幅する。ついで、「ネ
ステッド」プライマー、すなわち、増幅生成物内でアニ
ールするように設計されたプライマー（典型的には、ア
ダプター配列中のさらなる３’にアニールするアダプタ
ー特異的プライマーならびに既知遺伝子配列中のさらな
る５’にアニールする遺伝子特異的プライマー）を用い
てＰＣＲ反応を繰り返す。ついで、この反応の生成物を
ＤＮＡ配列決定により分析し、ついで、存在しているＤ
ＮＡに生成物を直接結合して完全配列を得ること、ある
いは５’プライ−の設計に関する新たな配列の情報を用
いて別個の全長ＰＣＲを行うことにより、全長のＤＮＡ
を構築する。
【００４２】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、本明細書においてポリヌクレオチド分析に関し
てさらに説明するように、例えば、疾患、特にヒトの疾
患に対する治療および診断の発見のための研究試薬およ
び研究材料として用いることができる。表１（配列番号
１または２または３または４）の配列由来のオリゴヌク
レオチドである本発明のポリヌクレオチドは、本明細書
に記載の方法に使用できるが、好ましくはＰＣＲに使用
し、本明細書で同定したポリヌクレオチドが全体とし
て、または部分的に感染組織において細菌中で転写され
るか否か測定する。そのような配列はまた、病因が達し
た感染の段階およびタイプの診断においても有用性があ
る。
【００４３】また、本発明は、成熟タンパク質に、さら
なるアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸が加わるか、
成熟ポリペプチドの内部にアミノ酸が加わった（例え
ば、成熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場
合）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供
する。このような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形
態へのタンパク質のプロセッシングにおいて役割を果た
し、タンパク質を輸送し、タンパク質の半減期を長くし
たり、短くしたり、あるいは分析または生産のためのタ
ンパク質の操作を容易にすることができる。インビボで
一般的なように、該付加アミノ酸は細胞酵素により成熟
タンパク質からプロセッシングにより除かれる。本発明
の各ポリヌクレオチドおよび全ポリヌクレオチドについ
て、それに相捕的なポリヌクレオチドが提供される。こ
れらの相捕的ポリヌクレオチドが、相捕的である各ポリ
ヌクレオチドに対して十分に相捕的であることが好まし
い。一またはそれ以上のプロ配列に融合したポリペプチ
ドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は該ポリペプチ
ドの不活性形でもよい。プロ配列がそのような不活性前
駆体から除かれると、一般に活性化される。プロ配列の
幾らかまたは全体を、活性化の前に除去できる。一般
に、そのような前駆体はプロタンパク質と称される。
【００４４】核酸塩基に関する標準記号Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ
／Ｕに加えて、また「Ｎ」なる語を、本発明の特定のポ
リヌクレオチドを記載するのに用いることができる。
「Ｎ」は、隣接するヌクレオチド位置と一緒になって作
用する場合、正確な読み枠を読み取る場合で、Ｎがその
ような読み枠において未成熟終止コドンを形成する効果
を有する塩基でないことが好ましい場合を除き、４種の
ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基のいずれかがＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列のその指定位置にあることを意味する。
【００４５】総じて、本発明のポリヌクレオチドは成熟
タンパク質、リーダー配列の加わった成熟タンパク質
（プレタンパク質とも称される）、プレタンパク質のリ
ーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有す
る成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列と、一
般に、ポリペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセ
ッシング工程の間に除去される１またはそれ以上のプロ
配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタ
ンパク質をコードする。
【００４６】ベクター、宿主細胞、発現系 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌ
クレオチドを含んでなるベクター、本発明のベクターで
遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術による本発
明のポリペプチドの製造に関する。さらに無細胞翻訳系
を用い、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用して
かかるタンパク質を製造することができる。本発明の組
み換えポリペプチドを、発現系を含む、遺伝子操作され
た宿主細胞から、当業者に周知の方法により製造しても
よい。したがって、さらなる態様において、本発明は、
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む発
現系、かかる発現系で遺伝子操作された宿主細胞、なら
びに組み換え法による本発明のポリペプチドの製造に関
する。本発明のポリペプチドの組換え体製造のために、
宿主細胞を遺伝子操作し、発現系もしくはそれらの一
部、または本発明のポリヌクレオチドを取り込むことが
できる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、Davi
sら、BASIC METHODS INMOLECULAR BIOLOGY（1986）およ
びSambrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANU
AL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,C
old Spring Harbor, N.Y.（1989）のごとき多数の標準
的研究室マニュアルに記載されている方法、たとえば、
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ
キストラン媒介トランスフェクション、トランスベクシ
ョン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介ト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、トラン
スダクション、スクレープ・ローディング、弾道導入お
よび感染によって行うことができる。
【００４７】適当な宿主の代表例は、レンサ球菌（stre
ptococcus）、ブドウ球菌（staphylococcus）、腸球菌
（enterococcus）大腸菌（E.coli）、ストレプトマイセ
ス（streptomyces）、シアノバクテリア（cyanobacteri
a）、枯草菌（Bacillus subtilis）およびストレプトコ
ッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）
のごとき細菌細胞；酵母、クルベロマイセス（Kluverom
yces）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、担子菌
類（basidiomycete）、カンジダ・アルビカンス（Candi
da albicans）およびアスペルギルス（Aspergillus）の
ごとき真菌細胞；ドロソフィラ（Drosophila）Ｓ２およ
びスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞のごとき昆虫
細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、
ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびボーウェス（Bowes）メラ
ノーマ細胞のごとき動物細胞；および裸子植物または被
子植物のごとき植物細胞を包含する。
【００４８】本発明のポリペプチド産生のために非常に
多様な発現系を使用することができる。かかる系は、と
りわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、
例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因
子由来、酵母染色体因子由来、バキュロウイルス、ＳＶ
４０のごときパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、
アデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病
ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス由来の
ベクター、およびコスミドおよびファージミドなどのプ
ラスミドおよびバクテリオファージの遺伝因子由来のベ
クターのごとき、それらの組み合わせに由来するベクタ
ーを包含する。発現系構築物は、発現を制御ならびに引
き起こす調節領域を有していてもよい。一般に、宿主に
おいてポリヌクレオチドを維持、増幅または発現し、お
よび／またはポリペプチドを発現するのに適した系また
はベクターを、この点にて発現に使用してもよい。適当
なＤＮＡ配列を、例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLON
ING，A LABORATORY MANUAL（前掲）に示されている技術
のごとき、種々の周知の慣用的技術のいずれかによっ
て、発現系に挿入してもよい。
【００４９】真核細胞における組換え発現系において、
翻訳されたタンパク質を、小胞体内腔、周辺腔または細
胞外環境に分泌するために、適当な分泌シグナルを発現
されるポリペプチドに挿入してもよい。これらのシグナ
ルは、ポリペプチドに固有のものであってもよく、また
は異種のシグナルであってもよい。本発明のポリペプチ
ドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽
出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、
ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよび
レクチンクロマトグラフィーを包含する、よく知られた
方法によって組換え細胞培養物から回収および精製でき
る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精
製に使用される。ポリペプチドが単離および／または精
製の間に変性する場合、タンパク質を再生するための周
知方法を用いて、再び活性な立体配座とすることができ
る。
【００５０】診断、予後、セロタイピングおよび変異ア
ッセイ また本発明は、診断試薬として使用するための本発明の
ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの使用にも関する。真核生物、とりわけ哺乳動物、特
にヒトにおけるヒスチジンキナーゼの検出は、疾患、疾
患の段階または薬剤に対する感染生物の応答の診断のた
めの診断方法を提供する。ヒスチジンキナーゼ遺伝子ま
たはタンパク質を含む生物に感染するか、または感染し
ている恐れがある真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒ
トを、種々の周知の方法ならびに本明細書記載の方法に
より核酸レベルまたはアミノ酸レベルで検出できる。
【００５１】予後、診断または他の分析に供するポリペ
プチドおよびポリヌクレオチドは、感染したと思われる
個体および／または感染個体の身体材料から得られる。
これらの源由来のポリヌクレオチド、特にＤＮＡまたは
ＲＮＡを検出に直接用いてもよく、あるいは分析に付す
前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いることにより
酵素的に増幅できる。ＲＮＡ、詳細にはｍＲＮＡ、ｃＤ
ＮＡおよびゲノムＤＮＡも同じ方法にて使用できる。増
幅を用い、個体に存在する感染または耐性生物の種およ
び株を、生物の選択されたポリヌクレオチドの遺伝子型
の分析により特徴づけすることができる。関連する生
物、好ましくは同じ属の異なる種または同じ種の異なる
株から選択される対照配列の遺伝子型と比較した増幅生
成物の大きさの変化により、欠失および挿入を検出でき
る。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識したヒスチジンキ
ナーゼポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすること
により同定できる。完全または有意に対合した配列は、
ＤＮＡまたはＲＮＡに対しそれぞれＤＮａｓｅまたはＲ
Ｎａｓｅ消化により、または融解温度または再生キネテ
ィックスの相違の検出により、不完全なまたはより有意
な誤対合二重らせんと区別できる。ポリヌクレオチド配
列の相違はまた、対照配列と比較して、ゲル中のポリヌ
クレオチドフラグメントの電気泳動の移動度の変化によ
り検出できる。これは、変性剤と共にまたなしで行って
もよい。ポリヌクレオチドの相違はまた、直接的ＤＮＡ
またはＲＮＡの配列決定により検出することもできる。
例えば、Myersら、Science，230: 1242（1985）を参照
のこと。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレア
ーゼ保護アッセイ、例えば、ＲＮase、Ｖ１およびＳ１
保護または化学的切断法によっても明らかにすることが
できる。例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,US
A，85:4397-4401（1985）を参照のこと。ヌクレアーゼ
保護アッセイ、例えば、ＲＮａｓｅ、Ｖ１およびＳ２保
護アッセイまたは化学的開裂法により、特定位置におけ
る配列の変化を明らかにすることができる。例えば、Co
ttonら、 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:4397-4401
(1985)参照。
【００５２】もう１つの具体例において、ヒスチジンキ
ナーゼヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む
オリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して、例え
ば遺伝学的変異、セロタイプ、分類学的分類または同定
のための効果的なスクリーニングを行うことができる。
アレイ法は周知であり、適応範囲が広く、遺伝子発現、
遺伝学的連関、および遺伝学的変化を包含する分子遺伝
学における種々の問題を解決するために用いることがで
きる（例えば、Chee ら、Science, 274: 610 (1996)参
照）。
【００５３】よって、もう１つの態様において、本発明
は、 （ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号
１または３のヌクレオチド配列、またはそのフラグメン
ト； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して相捕的なヌク
レオチド配列； （ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２ま
たは４のポリペプチド、またはそのフラグメント；ある
いは （ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体、好ましくは
配列番号２または４のポリペプチドに対する抗体 を含む診断キットに関する。かかるキットにおいて、
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が重要な成分を含
んでいてもよいことが理解されよう。かかるキットは、
とりわけ疾患または疾患に対する感受性についての診断
において有用である。
【００５４】また本発明は、診断試薬としての本発明の
ポリヌクレオチドの使用にも関する。疾患または発病に
関連した本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番
号１または３のポリヌクレオチドの変異形態の検出は、
ポリヌクレオチドの発現低下、発現過剰または発現の変
化により生じる疾患の診断、疾患経過の予後、疾患段階
の決定、または疾患に対する感受性の決定に加えて用い
る診断用道具、またはかかる診断等の決定のための道具
を提供するであろう。かかるポリヌクレオチドにおける
変異を有する生物、特に感染生物を、本明細書記載のご
とき種々の方法によりポリヌクレオチドレベルで検出し
てもよい。
【００５５】本発明ヌクレオチド配列は生物の染色体の
同定にも価値がある。配列は特別に標的化され、生物の
染色体（詳細にはストレプトコッカス・ニューモニアエ
の染色体）の上の特定の位置とハイブリダイゼーション
しうる。本発明の染色体に関連した配列のマッピング
は、それらの配列を病原性および／または生物の環境学
的位置および／または生物の薬剤耐性とを関連づけ、さ
らには生物に遺伝子を対応させることにおける重要な工
程でありうる。配列を正確な染色体位置にマッピングし
たならば、染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図
のデータと関連づけることができる。かかるデータは、
配列データベースにおいてオンラインで見いだされる。
ついで、たとえば連関分析（物理的に近接した遺伝子の
同時遺伝）または接合などによる交配研究などの公知の
遺伝学的方法により、同じ染色体領域にマッピングされ
た遺伝子と疾患との関係を同定する。第1の表現型を保
持する生物および異なる第２の表現型を保持する生物間
のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列に
おける相違もまた決定することができる。第1の表現型
を保持する生物のいくつかまたは全部において変異が観
察されるが第２の表現型を保持する生物においては観察
されない場合、その変異は第１の表現型の原因である可
能性がある。
【００５６】本発明のポリヌクレオチドおよび／または
ポリペプチドに変異または多型性（対立遺伝子変異）を
担持する生物由来の細胞はまた、種々の技術により、Ｄ
ＮＡレベルで、例えばセロタイピングすることにより検
出できる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＲＮＡ中の変
異を検出することができる。ＲＴ−ＰＣＲを自動検出
系、例えばＧeneＳcan等と組み合わせて用いるのが特に
好ましい。ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡもまた
同じ目的でＰＣＲに用いることができる。一例として、
ヒスチジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドに相
補的なＰＣＲプライマーを用いて変異を同定および分析
することができる。代表的なプライマーの例を以下の表
2に示す。
【００５７】 表２ ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチドの増幅用のプライマー 配列番号 プライマー配列 ５ 5'- ATGAAACTAAAAAGTTATATTTTG -3' ６ 5'- GGCTTTATTTTCACTACCAGAG -3'
【００５８】本発明はまた、式： Ｘ−（Ｒ1）m−（Ｒ2）−（Ｒ3）n−Ｙ ［式中、分子の５’末端においてＸは水素、金属または
修飾ヌクレオチド残基、分子の３’末端においてＹは水
素、金属または修飾ヌクレオチド残基、Ｒ1およびＲ
3は、いずれかの核酸残基または修飾核酸残基であり、
ｍは１〜２０の整数または０であり、ｎは１〜２０の整
数または０であり、Ｒ2は本発明のプライマー配列、特
に表２より選択されるプライマー配列を意味する］で示
されるプライマーを包含する。上記した式のポリヌクレ
オチド中、Ｒ2は５’末端残基がその左側でＲ1に結合
し、その３’末端残基がその右側でＲ3に結合するよう
に方向付けられる。ｍおよび／またはｎが１より大きい
場合、いずれかのＲ基で表される核酸残基の伸長鎖は、
ヘテロポリマーまたはホモポリマーのいずれであっても
よく、ヘテロポリマーが表１のポリヌクレオチドの一領
域と相補性であることが好ましい。好ましい具体例にお
いて、ｍおよび／またはｎは１と１０の間の整数であ
る。
【００５９】本発明はさらに５’および／または３’末
端から、１、２、３または４個のヌクレオチドが除去さ
れたこれらのプライマーを提供する。特に、これらのプ
ライマーを、個体由来の試料、例えば身体材料から単離
されたヒスチジンキナーゼＤＮＡおよび／またはＲＮＡ
の増幅に用いることができる。プライマーを用いて感染
個体から単離されたポリヌクレオチドを増幅して、ポリ
ヌクレオチド配列研究のための種々の方法に供してもよ
い。このようにして、ポリヌクレオチド配列中の変異を
検出し、感染または感染段階もしくは経路について診断
および／または予後を行い、あるいは感染物のセロタイ
ピングおよび／または分類を行ってもよい。
【００６０】本発明はさらに、疾患、好ましくは細菌感
染、さらに好ましくはストレプトコッカス・ニューモニ
アエによる感染の診断方法であって、表１（配列番号１
または３）の配列を有するポリヌクレオチドの発現レベ
ルの上昇を、身体材料などの個体由来のサンプルから決
定することを特徴とする方法を提供する。ヒスチジンキ
ナーゼポリヌクレオチドの発現の増加または低下は、ポ
リヌクレオチドの定量法として当該分野で周知の方法で
ある任意の方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、
ＲＮase保護、ノーザンブロッティングおよびその他の
ハイブリダイゼーション法を用いて測定できる。
【００６１】加えて、正常対照組織サンプルと比較して
ヒスチジンキナーゼポリペプチドの過剰発現を検出する
ための本発明による診断アッセイを用いて、例えば感染
の存在を検出することができる。身体材料などの宿主由
来のサンプル中のヒスチジンキナーゼポリペプチドのレ
ベルを決定するために用いることができるアッセイ技法
は、当業者に周知である。このようなアッセイ法は、ラ
ジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタン
ブロット分析、抗体サンドウィッチアッセイ、抗体検出
およびＥＬＩＳＡアッセイを包含する。
【００６２】引き算発現 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、引き
算スクリーニング法の試薬として用いてもよい。多くの
引き算スクリーニングおよび引き算ディスプレイ法が当
該分野に存在し、本発明のポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドを用いることができる。例えば、引き算ディス
プレイ法はChuangら、J. Bacteriol. 175:2026-2036 (1
993)に記載されている。この方法は、ランダムプラムさ
れたＲＴ−ＰＣＲを用いて存在するｍＲＮＡを同定する
ことにより生物中で発現される遺伝子を同定するもので
ある。感染前および感染後の特徴を比較することによ
り、感染の間にアップレギュレーションおよびダウンレ
ギュレーションされる遺伝子を同定し、ＲＴ−ＰＣＲ生
成物を配列決定し、「未知」ＯＲＦにマッチさせること
ができる。
【００６３】インビボ発現法（ＩＶＥＴ）はCamilli
ら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91:2634-2638 (199
4)に記載されている。ＩＶＥＴは、研究室での培養物と
の比較を行って、感染における重要な役割に関与してい
る、感染中にアップレギュレーションされる遺伝子を同
定するものである。この方法により同定されるＯＲＦは
感染の確立および／または維持において重要な役割を有
すると考えられる。この方法において、標的生物のラン
ダムな染色体フラグメントを、プラスミドベクター中の
プロモーター不含組み換え遺伝子の上流にクローン化す
る。レソルバーゼ（resolvase）部位に隣接した抗生物
質耐性遺伝子を担持する標的細胞中にこの構築物を導入
する。抗生物質存在下での生育は、レコンビナーゼ（re
combinase）遺伝子の転写を支持しうるプラスミドベク
ター中にクローン化されたフラグメントの集団から消失
し、それゆえ、抗生物質耐性の消失を引き起こす。耐性
集団が宿主中に導入され、感染後の様々な時点において
細菌が回収され、抗生物質耐性の存在を評価してもよ
い。各抗生物質感受性細菌により担持される染色体フラ
グメントは感染の間に通常アップレギュレーションされ
る遺伝子のプロモーターまたは当該遺伝子の一部を担持
しているはずである。レコンビナーゼ遺伝子上流の配列
決定によりアップレギュレーションされる遺伝子の同定
が可能となる。
【００６４】ＲＴ−ＰＣＲを用いて遺伝子発現パターン
を分析してもよい。本発明のポリヌクレオチドを用いる
ＲＴ−ＰＣＲ用に、メッセンジャーＲＮＡを細菌感染組
織、例えばネズミの感染後４８時間たった肺から単離
し、ついで、ランダムヘキサヌクレオチドでプラムされ
たＲＮＡ試料の逆転写を行い、その後遺伝子特異的プラ
イマーペアーを用いてＰＣＲを行うことによって各ｍＲ
ＮＡ量を評価する。得られたＰＣＲ生成物の定量による
特定のｍＲＮＡ種の存在および量の決定は、感染組織中
で転写された細菌遺伝子についての情報を提供する。遺
伝子転写の分析を感染の異なる時点において行って細菌
による発病における遺伝子調節についての詳細な知識を
得て、いずれの遺伝子産物が抗細菌剤のスクリーニング
のための標的であるのかを明確に理解することができ
る。使用ＰＣＲプライマーの遺伝子特異的な性質によ
り、細菌ｍＲＮＡ調製物が常に哺乳動物ＲＮＡを含まな
いものである必要があるとはいえないことが理解されよ
う。このことは、感染組織からの簡単かつ迅速なＲＮＡ
の調製を可能にし、細菌中で非常に短命（半減期２分の
オーダー）な細菌ｍＲＮＡ種を得ることを可能にする。
最適には、非常に短時間のうちに、ＴＲＩｚｏｌｅ（GI
BCO-BRL）存在下で機械的に破砕し、ついで、ＴＲＩｚ
ｏｌｅ試薬およびＤＮＡａｓｅ処理を製造者の指示に従
って行って夾雑ＤＮＡを除去することにより、感染ネズ
ミ肺組織から細菌ｍＲＮＡを調製する。好ましくは、適
当に標識された配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ
を用いてノーザンをプローブすることにより検出される
ストレプトコッカス・ニューモニアエの１６Ｓリボソー
ムＲＮＡが最大量となるような条件を見いだすことによ
ってプロセスを最適化する。典型的には、５’色素標識
プライマーをＰＣＲ反応において各ＰＣＲプライマーペ
アーに用い、最適にはＰＣＲ反応を８ないし２５サイク
ルで終了する。ＰＣＲ生成物を６％ポリアクリルアミド
で分離し、GeneScanner（ＡＢＩにより製造されてい
る）を用いて検出し定量する。
【００６５】グリッディングおよびポリヌクレオチド引
き抜き いわゆる「高密度ＤＮＡアレイ」またはグリッドを用い
る遺伝子発現および同定についての情報を得るための方
法が記載されている。たとえば、M. Cheeら、Science,
274:610-614 (1996)およびそこに引用される他の参考文
献を参照のこと。かかるグリッディングアッセイは、発
現配列タグ（ＥＳＴ）と称される特定の新規な遺伝子配
列を同定するために適用されている(Adamsら、Science,
252:1651-1656 (1991))。それらの遺伝子産物に基づい
て特定の遺伝子配列を同定するための様々な方法が記載
されている。たとえば、１９９１年５月３０日公開の国
際特許出願番号ＷＯ９１／０７０８７参照のこと。加え
て、所望の配列を増幅する方法が記載されている。たと
えば、１９９１年１１月１４日公開の国際特許出願番号
ＷＯ９１／１７２７１参照のこと。
【００６６】本発明のポリヌクレオチドをポリヌクレオ
チドアレイ、好ましくは高密度アレイまたはグリッドの
成分として用いてもよい。これらの高密度アレイは、特
に診断および予後の目的に有用である。たとえば、それ
ぞれ、異なる遺伝子を含み、さらにポリヌクレオチドま
たは本発明のポリヌクレオチドを含むスポットのセット
を、身体材料から得たまたは身体材料由来のプローブを
用いて、ハイブリダイゼーションまたは核酸増幅に用い
るようなプロ−ビングに用い、個体における特定のポリ
ヌクレオチド配列または関連する配列の存在を調べても
よい。そのような存在は、病原体、とくにストレプトコ
ッカス・ニューモニアエの存在を示唆してもよく、疾患
もしくは疾患経過の診断および／または予後において有
用であることができる。配列番号１または３のポリヌク
レオチド配列の多数の変種を含むグリッドが好ましい。
配列番号２または４のポリペプチド配列をコードするポ
リヌクレオチド配列の多数の変種もまた好ましい。
【００６７】抗体 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドまたはそ
れらの変種、あるいはそれらを発現する細胞を、かかる
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して免疫特異
的な抗体を得るための免疫原として用いることができ
る。本発明の特定の好ましい具体例において、ヒスチジ
ンキナーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対す
る抗体が提供される。
【００６８】本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドに対して得られる抗体は、本発明のポリペプチドお
よび／またはポリペプチド、あるいはエピトープが付い
たいずれかのまたは両方のフラグメント、いずれかのま
たは両方のアナログ、もしくは、いずれかのまたは両方
を発現している細胞を、好ましくはヒト以外の動物に、
慣用的プロトコールを用いて投与することにより得るこ
とができる。モノクローナル抗体を調製する場合、連続
的細胞系培養により産生される抗体を提供する当該分野
にて知られる技術を用いることができる。例えば、Kohl
er, G.およびMilstein, C., Nature, 256: 495−497(19
75); Kozborら、Immunology Today, 4:72(1983); Cole
ら、MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan
R. Liss, Inc., 77−96頁（1985）に記載されるような
種々の技法が挙げられる。
【００６９】一本鎖抗体を製造するための技術（米国特
許第４９４６７７８号）を用いて、本発明のポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチドに対する一本鎖抗体を得るこ
とができる。また、トランスジェニックマウスまたは他
の生物、例えば他の哺乳動物を用いて、本発明のポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドに対するヒト化抗体を発
現させることができる。
【００７０】別法として、ファージディスプレイ（phag
e display）技法を利用して、抗‐ヒスチジンキナーゼ
の保持に関してスクリーニングしたヒトのリンパ球のＰ
ＣＲ増幅したｖ遺伝子のレパートリー、または無処理の
ライブラリーから、ポリペプチドに対する結合活性を有
する抗体遺伝子を選択してもよい（McCafferty, Ｊ.
ら、Nature 348, 552-554（1990）; Marks, J.ら、Biot
echnology 10, 779-783(1992)）。これらの抗体の親和
性は、たとえばチェインシャフリング（chain shufflin
g）により改善することもできる（Clackson, T.ら、Nat
ure 352: 624-628（1991））。
【００７１】前記の抗体を用いて本発明のポリペプチド
またはポリヌクレオチドを発現するクローンを単離また
は同定することができ、たとえば、アフィニティークロ
マトグラフィーにより該ポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドを精製することができる。したがって、とりわ
け、ヒスチジンキナーゼポリペプチドまたはヒスチジン
キナーゼポリヌクレオチドに対する抗体を用いて、感
染、とりわけ細菌感染を治療することができる。
【００７２】ポリペプチド変種は、本発明の特定の態様
を形成する、抗原的、エピトープ的または免疫学的に等
価な変種を包含する。抗原的または免疫学的に等価な誘
導体、またはその融合タンパク質などの本発明のポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドは、マウスまたは他の動
物、例えばラットもしくはニワトリを免疫するための抗
原として使用される。融合タンパク質はポリペプチドに
安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合することによ
り、免疫原性キャリヤタンパク質、例えばウシ血清アル
ブミン、キーホール・リムペット・ヘモシアニン(keyho
le limpet haemocyanin)または破傷風トキソイドに結合
させることができる。別法として、ポリペプチド、また
はその抗原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの
多重コピーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原性を改
良するのに十分な抗原性を有しており、キャリヤを使用
しなくてすむ。
【００７３】好ましくは、抗体またはその変種を修飾し
て個体における免疫原性を減少させる。例えば、個体が
ヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒト化」され
ており、例えばJones,P.ら、Nature 321, 522−525（19
86）またはTempestら、Biotechnology 9, 266-273（199
1）に記載されているように、ハイブリドーマ由来の抗
体の相補性決定領域または複数の領域がヒトモノクロー
ナル抗体に移植されている。本発明の一の態様によれ
ば、治療または予防目的、詳細には遺伝学的免疫化のた
めの本発明のポリヌクレオチドの使用が提供される。本
発明の特に好ましい具体例は、ヒスチジンキナーゼポリ
ヌクレオチドの自然発生対立遺伝子変種およびそれによ
りコードされるポリペプチドである。
【００７４】本発明のポリヌクレオチドの遺伝学的免疫
における使用には、好ましくは、プラスミドＤＮＡの筋
肉への直接注射（Wolffら、Hum. Mol. Genet 1：363（1
992）；Manthorpeら、Hum. Gene Ther. 4：419（196
3））、特異的タンパク質キャリヤを複合させたＤＮＡ
の送達（Wuら、J. Biol. Chem. 264：16985（198
9））、リン酸カルシウムを用いるＤＮＡ共沈（Benveni
sty & Reshef、PNAS USA, 83：9551（1986））、種々の
形態のリポソーム中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Scienc
e 243：375（1989））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 3
56：152（1992）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol 12：7
91（1993））およびクローン化レトロウイルスベクター
を用いたインビボ感染（Seegerら、PNAS USA 81：5849
（1984））などの適当な送達方法を用いる。
【００７５】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 さらに、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド
を用いて、例えば、細胞、無細胞調製物、化学的ライブ
ラリー、および天然産物の混合物中の、小分子基質とリ
ガンドとの結合を評価することもできる。これらの基質
およびリガンドは天然の基質およびリガンドでよく、ま
たは構造上もしくは機能上の模倣物でもよい。例えば、
Coliganら、Current Protocols in Immunology 1(2)：C
hapter 5(1991)を参照のこと。
【００７６】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、多くの疾患状態、詳細には上記疾患を包含する
多くの生物学的機能の原因である。それゆえ、ポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドの機能を刺激または阻害す
る化合物を同定するためのスクリーニング法を工夫する
ことが望ましい。したがって、さらなる態様において、
本発明は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ドならびに関連するポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドの機能を刺激または阻害する化合物を同定するための
スクリーニング方法を提供する。一般的には、アゴニス
トまたはアンタゴニストを上記疾患の治療および予防の
ために用いてもよい。種々の源、例えば、細胞、無細胞
調製物、化学ライブラリーおよび天然産物の混合物から
化合物を同定できる。そのようにして同定されたかかる
アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤は、天然また
は修飾基質、リガンド、レセプター、酵素等であっても
よく、場合によってはヒスチジンキナーゼポリペプチド
およびポリヌクレオチド、あるいはそれらの構造上また
は機能上の模倣物であってもよい（Coliganら、Current
Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)参
照）。
【００７７】スクリーニング法は、簡単には、化合物の
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドへの、あるいはポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドを有する細胞または
膜への、あるいはポリペプチドの融合タンパク質への結
合を、直接的または間接的に候補化合物に結合した標識
により測定するものであってもよい。別法として、スク
リーニング法は標識競争物質との競争を用いるものであ
ってもよい。さらに、これらのスクリーニング法は、ポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドを含む細胞に適した
検出系を用いて、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド
の活性化または阻害により生じるシグナルを化合物が発
生させるかどうかを試験するものであってもよい。一般
的には、既知アゴニスト存在下で活性化の阻害剤をアッ
セイし、ついで、候補化合物存在下でのアゴニストによ
る活性化の効果を観察する。構成的に活性のあるポリペ
プチドおよび／または構成的に発現されるポリペプチド
およびポリヌクレオチドをアゴニストまたは阻害剤の効
果を逆転させる物質を探すスクリーニング法に用いても
よく、アゴニストまたは阻害剤の不存在下で候補化合物
がポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性化を阻害
するかどうかを試験することによる。さらに、スクリー
ニング法は、簡単には、候補化合物を本発明のポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドを含有する溶液と混合して
混合物を作成し、混合物中のヒスチジンキナーゼポリペ
プチドおよび／またはポリヌクレオチド活性を測定し、
ついで、標準に対して混合物中のヒスチジンキナーゼポ
リペプチドおよび／またはポリヌクレオチド活性を比較
する工程を含む。Ｆｃ部分および上記ヒスチジンキナー
ゼポリペプチドから作成されるような融合タンパク質を
用いて高処理量アッセイを行って本発明のポリペプチド
のアンタゴニストならびに系統分類的および／または機
能的に関連したポリペプチドを同定することもできる
（D.Bennettら、J. Mol. Recognition, 8:52-58 (195
5);およびK.Johansonら、 J. Biol. Chem., 270(16):95
49-9471 (1955)参照）。
【００７８】本発明のポリペプチドと結合および／また
は相互作用するポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび
抗体を用いて、細胞中のｍＲＮＡおよび／またはポリペ
プチドの生成に対する添加化合物の影響を検出するため
のスクリーニング方法を組み立ててもよい。例えば、Ｅ
ＬＩＳＡアッセイを構築して、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌または細
胞結合レベルを、当該分野において標準的な方法により
測定してもよい。これにより、適当に操作された細胞ま
たは組織からのポリペプチドの生成を阻害または促進し
うる作用剤を見いだすことができる。
【００７９】本発明はまた、ヒスチジンキナーゼポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドの作用を亢進（アゴニス
ト）または遮断（アンタゴニスト）する化合物、特に静
菌および／または殺菌性である化合物を同定するための
化合物のスクリーニング方法を提供する。スクリーニン
グ方法には高処理量（high−throughput）技術が包含さ
れる。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスク
リーニングするために、ヒスチジンキナーゼポリペプチ
ドおよびかかるポリペプチドの標識基質またはリガンド
を含んでなる合成反応混合物、膜、細胞エンベロープも
しくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはそ
れらのいずれかの調製物を、ヒスチジンキナーゼアゴニ
ストまたはアンタゴニストであるかもしれない候補分子
の存在下または不在下でインキュベートする。候補分子
がヒスチジンキナーゼポリペプチドに作動または拮抗す
る能力は、標識リガンドの結合の低下またはかかる基質
からの生成物の生成低下に反映される。結合しても影響
を及ぼさない分子、すなわちヒスチジンキナーゼポリペ
プチドの効果を誘起しない分子は、ほとんどの場合、良
好なアンタゴニストであろう。よく結合し、基質からの
生成物の生成速度を高め、シグナルトランスダクション
を増加し、または化学的チャンネル活性を増加させる分
子はアゴニストである。基質からの生成物の生成、シグ
ナルトランスダクション、または化学的チャンネル活性
の速度またはレベルの検出はリポーターシステムを用い
ることにより増強できる。この点に関して有用なリポー
ターシステムは、生成物に転換される比色標識基質、ヒ
スチジンキナーゼポリヌクレオチドまたはポリペプチド
活性の変化に応答するリポーター遺伝子、および当該分
野で公知の結合アッセイを包含するが、これらに限定す
るものではない。
【００８０】本発明のポリペプチドを用いて膜結合また
は可溶性レセプターを同定してもよく、かかるポリペプ
チドは当該分野において公知の標準的なレセプター結合
法により同定される。これらの方法は、リガンド結合お
よびクロスリンキングアッセイを包含するが、これらに
限らない。これらの方法において、ポリペプチドは放射
性標識（例えば125Ｉ）、化学修飾（例えばビオチン
化）または検出および精製に適したペプチド配列に融合
され、推定上のレセプター（例えば細胞、細胞膜、細胞
上清、組織抽出物、身体材料）の源とともにインキュベ
ーションされる。他の方法は表面プラスモン共鳴および
分光学的法を包含する。これらのスクリーニング方法を
用いて、ポリペプチドのそのレセプターへの結合と競争
するポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを
同定してもよい。かかるアッセイを行うための標準的方
法は当該分野において周知である。
【００８１】蛍光−タグ化分子の蛍光分極値は、回転相
関時間またはタンブリング速度に依存する。他のヒスチ
ジンキナーゼポリペプチドまたは他のポリペプチドと結
合したヒスチジンキナーゼポリペプチドにより形成し、
蛍光的に標識化された分子を含むように標識化されたタ
ンパク質複合体は、蛍光的に標識化されたモノマータン
パク質よりも高い分極値を有するであろう。この方法を
用いてポリペプチド複合体を破壊する小分子の解析を行
うことが好ましい。蛍光エネルギー移動を、ヒスチジン
キナーゼポリペプチド二量体、三量体、四量体またはよ
り高い種類の構造、または他のポリペプチドに結合した
ヒスチジンキナーゼポリペプチドにより形成される構造
の形成を阻害する、小分子の解析に用いてもよい。ヒス
チジンキナーゼポリペプチドをドナーおよびアクセプタ
ー発蛍光団の両方で標識化できる。２つの標識化種を混
合し、ドナー発蛍光団が励起されると、蛍光エネルギー
移動をアクセプターの蛍光の観察により検出できる。二
量化を遮断する化合物は、蛍光エネルギー移動を阻害す
るだろう。
【００８２】表面プラスモン共鳴をヒスチジンキナーゼ
ポリペプチドの自己結合ならびにヒスチジンキナーゼポ
リペプチドおよび他のポリペプチドまたは小分子の結合
における小分子の作用を追跡するのに用いることができ
る。ヒスチジンキナーゼポリペプチドを、共有的に結合
した分子が一量体であるように低部位密度でセンサーチ
ップに結合させることができる。ついで、溶液タンパク
質をヒスチジンキナーゼ−被覆表面上に通し、特異的結
合を局所屈折率の変化により引き起こされる共鳴角度に
おける変化を追跡することによりリアルタイムで検出す
ることができる。この方法をヒスチジンキナーゼポリペ
プチド自己結合ならびにヒスチジンキナーゼポリペプチ
ドおよび他のポリペプチドまたは小分子の結合の運動速
度および平衡結合定数における小分子の作用を解析する
のに用いることができる。
【００８３】シンチレーション近接アッセイをヒスチジ
ンキナーゼポリペプチドと他のヒスチジンキナーゼまた
は異なるポリペプチドとの結合間の相互作用を解析する
のに用いてもよい。ヒスチジンキナーゼポリペプチドを
シンチレーション充填ビーズと結合させることができ
る。放射性標識ヒスチジンキナーゼポリペプチドの添加
の結果として、放射活性源分子がシンチレーション流体
にきわめて近接している場合、結合を生じる。それゆ
え、ヒスチジンキナーゼポリペプチド結合時にシグナル
が発生し、ヒスチジンキナーゼポリペプチド自己結合ま
たはヒスチジンキナーゼポリペプチドおよび他のポリペ
プチドまたは小分子の結合を妨げる化合物は、シグナル
を減少させるであろう。ＩＣＳバイオセンサーについ
て、ＡＭＢＲＩ（Australian Membrane Biotechnology
Research Institute）により記載されている。これら
は、懸濁膜二重層中で、マクロ分子の自己結合をグラマ
シジン−促進イオンチャンネルの閉鎖と関連付け、それ
ゆえバイオセンサーのアドミッタンス（インピーダンス
と類似する）における測定可能な変化と結合させる。こ
の方法は、６０年間のアドミッタンス変化において直線
的であり、小分子組み合わせライブラリーの大容量、高
処理スクリーニングに理想的に適している。
【００８４】本発明の他の具体例において、本発明のポ
リペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと結合ある
いは相互作用して、その活性または発現を阻害または活
性化する化合物を同定する方法であって、ポリペプチド
および／またはポリヌクレオチドへの結合、あるいはポ
リペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと化合物と
の他の相互作用を可能にする条件下で、本発明のポリペ
プチドおよび／またはポリヌクレオチドをスクリーニン
グすべき化合物と接触させて、アゴニストとの結合ある
いは他の相互作用を評価し（該方法において、好ましく
は、かかる結合または相互作用はポリペプチドおよび／
またはポリヌクレオチドと化合物との結合あるいは相互
作用に応答した検出可能シグナルを提供しうる第２の化
合物に関連したものである）、ついで、ポリペプチドお
よび／またはポリヌクレオチドと化合物との結合あるい
は相互作用から生じるシグナルの存在または不存在を検
出することにより、化合物がポリペプチドおよび／また
はポリヌクレオチドと結合あるいは相互作用し、その活
性または発現を活性化または阻害するかどうかを決定す
る方法が提供される。
【００８５】ヒスチジンキナーゼアンタゴニストのアッ
セイの別の例は、競争阻害アッセイに適した条件下で、
ヒスチジンキナーゼおよび潜在的なアンタゴニストを、
ヒスチジンキナーゼ結合分子、組換えヒスチジンキナー
ゼ結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質も
しくはリガンド模倣物と混合する、競合アッセイであ
る。ヒスチジンキナーゼを例えば放射活性または比色化
合物により標識し、結合分子に結合した、あるいは生成
物に変換したヒスチジンキナーゼ分子の数を正確に決定
して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価できる。
【００８６】潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリ
ヌクレオチドおよび／またはポリペプチドと結合し、そ
れによりその活性または発現を阻害または消滅させる小
型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を包含
する。潜在的アンタゴニストはまた、ヒスチジンキナー
ゼ誘発活性を誘導しない結合分子のような、結合分子の
同一部位に結合し、ヒスチジンキナーゼポリペプチドお
よび／またはポリヌクレオチドを結合より排除すること
によりヒスチジンキナーゼポリペプチドおよび／または
ポリヌクレオチドの作用または発現を妨げる、密接に関
連したタンパク質または抗体のような小型有機分子、ペ
プチド、ポリペプチドであってもよい。
【００８７】潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチド
の結合部位に結合してその部位を占領し、それにより細
胞性結合分子との結合を妨害して、正常な生物学的活性
を防御する小型分子を包含する。小型分子の例は、小型
有機分子、ペプチド、ペプチド様分子を包含するが、こ
れらに限定するものではない。その他の潜在的なアンタ
ゴニストはアンチセンス分子を包含する（これらの分子
についての記載に関しては、Okano, J., Neurochem. 5
6:560(1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE IN
HIBTORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton,
FL (1988)を参照のこと）。好ましい潜在的アンタゴニ
ストは、ヒスチジンキナーゼに関連する化合物およびそ
の変種を包含する。潜在的なポリペプチドアンタゴニス
トの他の例は抗体を包含し、あるいはいくつかの場合に
は、ポリペプチドのリガンド、基質、レセプター、酵素
等の密接に関連したオリゴヌクレオチドまたはタンパク
質、あるいはリガンド、基質、レセプター、酵素等のフ
ラグメント、あるいは本発明のポリペプチドに結合する
が応答を誘発せず、その結果ポリペプチドの活性を阻害
することとなる小型分子を包含する。
【００８８】本発明のポリペプチドのあるものは、生物
模倣物、天然のヒスチジンキナーゼポリペプチドの機能
的模倣物である。これらの機能的模倣物を、とりわけ、
ヒスチジンキナーゼポリペプチドの活性を拮抗するため
に、または、本明細書のほかの場所で記載されるように
抗原または免疫源として用いてもよい。本発明のポリペ
プチドの機能的模倣物には、末端切断ポリペプチドが包
含されるがこれに限定されるものではない。たとえば、
好ましい機能的模倣物には、２０、３０、４０、５０、
６０、７０または８０個のアミノまたはカルボキシ末端
アミノ酸残基が欠失した配列番号２に示されるポリペプ
チド配列を含むポリペプチドが包含され、さらにこれら
の末端切断配列の一つまたはそれ以上を含む融合タンパ
ク質をも包含される。これらの機能的模倣物のそれぞれ
をコードするポリヌクレオチドを発現カセットとして用
い、それぞれの模倣ポリペプチドを発現させてもよい。
これらのカセットが５’および３’制限部位を含み、所
望の場合にカッセットを一緒にして連結するための簡便
な手段となることが好ましい。これらのカセットが当該
分野にて公知のまたは本明細書のほかの場所で記載され
る遺伝子発現シグナルを含むことがさらに好ましい。
【００８９】かくして、他の態様において、本発明は、
本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド
に関するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、レセ
プター、基質、酵素等；あるいはかかるポリペプチドお
よび／またはポリヌクレオチドの生成を減少または促進
する化合物を同定するためのスクリーニングキットであ
って： （ａ）本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレ
オチド； （ｂ）本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレ
オチドを発現する組み換え細胞； （ｃ）本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレ
オチドを発現する細胞膜；または （ｄ）本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレ
オチドに対する抗体を含むものであり、好ましくは該ポ
リペプチドは配列番号２のものであり、好ましくは該ポ
リヌクレオチドは配列番号１のものである、キットに関
する。かかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）
または（ｄ）は重要成分を含有していてもよいことが理
解されよう。
【００９０】本発明のポリペプチドおよび／またはポリ
ヌクレオチドを、ポリペプチドおよび／またはポリヌク
レオチドのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の
構造に基づく設計方法に用いてもよいことが、当業者に
理解されよう。該方法は： （ａ）最初にポリペプチドおよび／またはポリヌクレオ
チド、またはそれらの複合体の３次元構造を決定し、
（ｂ）アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の反応
部位、結合部位またはモチーフである可能性のある部位
の３次元構造を推定し、（ｃ）推定された反応部位、結
合部位および／またはモチーフと結合または反応すると
予想される候補化合物を合成し、ついで（ｄ）候補化合
物が実際にアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤で
あるかどうかを試験することを含む。これが通常、繰り
返しプロセスであり、自動およびコンピューター制御工
程を用いてこの繰り返しプロセスを行ってもよいこと
が、さらに理解されよう。
【００９１】さらなる態様において、本発明は、例えば
ヒスチジンキナーゼポリペプチドおよび／またはポリヌ
クレオチドの過剰発現、発現不足、上昇した活性、また
は低下した活性に関連した疾患のごとき異常な状態の治
療方法を提供する。ポリペプチドおよび／またはポリヌ
クレオチドの発現および／または活性が過剰な場合、い
くつかの方法を用いることができる。１の方法は、ポリ
ペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの機能および
／または発現を阻害（例えば、リガンド、基質、レセプ
ター、酵素等の結合をブロックすることにより、あるい
は２次的シグナルを阻害することにより）するに有効な
量の上記阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許容さ
れる担体とともに対象に投与し、そのことにより異常な
な症状を改善することを含む。もう１つの方法におい
て、やはり内在性ポリペプチドおよび／またはポリヌク
レオチドと競争してリガンド、基質、酵素、レセプター
等に結合することができる可溶性形態のポリペプチドを
投与してもよい。かかる競争物質の典型例はヒスチジン
キナーゼポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド
のフラグメントを含む。
【００９２】さらなる態様において、本発明は、本発明
のポリペプチドまたはそのフラグメントおよび種々のサ
ブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の免疫グ
ロブリンの重鎖または軽鎖の不変領域の種々の部分を含
んでなる、遺伝子工学により得られる可溶性融合タンパ
ク質に関する。好ましい免疫グロブリンはヒトＩｇＧ
（詳細にはＩｇＧ１）の重鎖の不変部分であり、融合は
ヒンジ領域で起こる。特定の具体例において、血液凝固
因子Ｘａを用いて開裂できる開裂配列を導入することに
よりＦｃ部分を簡単に除去することができる。さらにそ
のうえ、本発明は、遺伝子工学によるこれらの融合タン
パク質の製造方法、ならびに薬剤スクリーニング、診断
および治療におけるそれらの使用に関する。本発明のさ
らなる態様はかかる融合タンパク質をコードしているポ
リヌクレオチドにも関する。融合タンパク質法の例は国
際特許出願ＷＯ９４／２９４５８およびＷＯ９４／２２
９１４に見いだされる。
【００９３】さらにもう１つのアプローチにおいて、発
現ブロッキング法を用いて内在性ヒスチジンキナーゼポ
リペプチドをコードしている遺伝子の発現を阻害するこ
とができる。このブロッキングは遺伝子発現のいずれの
工程を標的としてもよいが、好ましくは、転写および／
または翻訳を標的とする。この種の既知方法の例は、体
内で生じるかまたは別個に投与されるアンチセンス配列
の使用を包含する（例えば、Oligodeoxynucleotides as
Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Pres
s, Bocca Raton, FL (1988)中O'Connor, J. Neurochem
(1991) 56:560参照）。別法として、遺伝子とともに三
重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを提供してもよ
い。例えば、Leeら、Nucleic Acids Res(1979)6: 3073;
Cooneyら、Science(1988)241: 456; Dervanら、Scienc
e(1991)251: 1360参照。これらのオリゴマーはそれ自体
投与することができ、あるいは重要部分のオリゴマーを
インビボで発現させることもできる。
【００９４】本明細書で得られるポリヌクレオチド配列
は、各々、抗菌化合物の発見および開発に用いることが
できる。コードされたタンパク質は、発現されると、抗
菌薬物をスクリーニングするための標的として用いるこ
とができる。加えて、コードされたタンパク質のアミノ
末端領域をコードするＤＮＡ配列あるいはシャイン・ダ
ルガーノまたは他の個々のｍＲＮＡの翻訳容易化配列を
用いて、目的とするコーディング配列の発現を調節する
アンチセンス配列を構築することができる。
【００９５】本発明はまた、感染の続発症に関与する、
病原体および真核生物、特に哺乳動物宿主間の最初の物
理的相互作用を妨害するための、本発明のポリペプチ
ド、ポリヌクレオチドまたはアンタゴニストの使用を提
供する。特に本発明の分子は；細菌、特にグラム陽性菌
および／またはグラム陰性菌が内在装置上の真核生物、
特に哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質、または創
傷部の細胞外マトリックスタンパク質に付着することを
防御するのに；例えば、哺乳動物チロシンキナーゼのリ
ン酸化を開始することによる、ヒスチジンキナーゼタン
パク質介在の哺乳動物細胞侵入を遮断するために(Rosen
shineら、Infect. Immun. 60：2211(1992))；真核生
物、特に哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質と組織
損傷を媒介する細菌性ヒスチジンキナーゼタンパク質と
の間の細菌付着を遮断するためにおよび／または；内在
装置の埋め込みまたは他の外科的手技以外により開始し
た感染における病因の通常の進行を遮断するために使用
することができる。
【００９６】本発明は、ｉ）ヒスチジンキナーゼを応答
レギュレーターとともに薬剤の存在下でインキュベート
し、この相互作用を妨害する薬剤の能力を測定すること
を含む、ヒスチジンキナーゼと応答レギュレーターとの
相互作用を妨害する薬剤をスクリーニングするための薬
剤スクリーニング法；および／またはｉｉ）ヒスチジン
キナーゼと薬剤とともにインキュベートし、自己リン酸
化を妨害する薬剤の能力を測定することを含む、ヒスチ
ジンキナーゼの自己リン酸化能力を妨害する薬剤を同定
するための薬剤スクリーニング法を提供する。好ましく
は、応答レギュレーターは、ヒスチジンキナーゼの同種
の応答レギュレーターであるか、または、ヒスチジンキ
ナーゼが基質として用いることのできる他の応答レギュ
レーターであり、好ましくは、ストレプトコッカス・ニ
ューモニアエ由来であるが、バシラスなどの他の微生物
由来であってもよい。本発明はまた、これにより同定さ
れる阻害剤に関する。
【００９７】本発明のさらに別の態様によれば、ヒスチ
ジンキナーゼのアゴニストおよびアンタゴニスト、好ま
しくは静菌性または殺菌性アゴニストおよびアンタゴニ
ストが提供される。本発明のアンタゴニストおよびアゴ
ニストを用いて、例えば、疾患を阻害しおよび／または
治療することができる。ヘリコバクター・ピロリ（Ｈel
icobacter pylori）（本明細書中、「エイチ・ピロリ
（H. pylori）」という）菌は、胃癌、潰瘍、胃炎を発
病している世界中の人々の３分の１以上の胃に感染して
いる（国際癌研究機関（International Agency for Res
earch on Cancer）（1994）Schistomoses, Liver Fluke
s and Helicobacter Pylori（International Agency fo
r Research on Cancer，Lyon，France；http：／／ww
w．uicc．ch／ecp／ecp2904．htm））。さらに、この国
際癌研究機関は、最近になって、ヘリコバクター・ピロ
リと胃腺癌の間の因果関係を認識し、その細菌をグルー
プＩ（限定的）発癌物質と分類した。本発明により提供
されるスクリーン法を用いて見出された本発明の好まし
い抗菌化合物（ヒスチジンキナーゼポリペプチドおよび
／またはポリヌクレオチドのアゴニストおよびアンタゴ
ニスト）、特に広域スペクトルの抗生物質は、エイチ・
ピロリ感染の治療にて有用である。このような治療はエ
イチ・ピロリ誘発性癌、例えば胃腸癌の出現を減少させ
る。かかる治療はまた胃潰瘍および胃炎も防御し、阻害
しおよび／または治癒する。
【００９８】ワクチン 生成物、組成物、ならびにヒスチジンキナーゼ発現の評
価、疾患の治療、遺伝学的変異のアッセイ、および細
菌、特にストレプトコッカス・ニューモニアエ細菌に対
する免疫学的応答を惹起させるためのヒスチジンキナー
ゼポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの生物
への投与方法が本発明により提供される。本発明の別の
態様は、個体、特に哺乳動物における免疫学的応答を誘
発する方法であって、抗体および／またはＴ細胞免疫応
答を生成するのに適当なヒスチジンキナーゼポリヌクレ
オチドおよび／またはポリペプチド、またはそのフラグ
メントもしくは変種を個体に接種し、該個体を感染、特
に細菌感染、最も好ましくはストレプトコッカス・ニュ
ーモニアエ感染から防御することを含む方法に関する。
さらに、そのような免疫学的応答による細菌複製を遅ら
せる方法も提供する。本発明のさらにもう一つ別の態様
は、個体における免疫学的応答を誘発する方法であっ
て、インビボでヒスチジンキナーゼポリヌクレオチドお
よび／またはポリペプチドまたはそのフラグメントまた
は変種を発現するために、該ヒスチジンキナーゼポリヌ
クレオチドおよび／またはポリヌクレオチドまたはその
フラグメントまたは変種の発現を指向する核酸ベクター
を該個体に送達し、例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞ま
たは細胞毒性Ｔ細胞を含め、抗体および／またはＴ細胞
免疫応答を生じさせるように免疫学的応答を誘発し、該
個体にて疾患が既に確立されているか、否かにかかわら
ず該個体を疾患から保護することを含む方法に関する。
遺伝子を投与する一例は、粒子等上のコーティングとし
て遺伝子を所望の細胞中に加速して投与することによる
ものである。このような核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、リボザイム、修飾核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッ
ド、ＤＮＡ−タンパク質複合体またはＲＮＡ−タンパク
質複合体からなっていてもよい。
【００９９】本発明のさらなる態様は、その中に免疫学
的応答を誘発する能力を有する個体、好ましくはヒトに
導入されると、その個体においてヒスチジンキナーゼポ
リヌクレオチドおよび／またはそれからコードされるポ
リペプチドに対する免疫学的応答を誘発する免疫学的組
成物であって、組換えヒスチジンキナーゼポリヌクレオ
チドおよび／またはそれによりコードされるポリペプチ
ドを含み、さらに／あるいは該ヒスチジンキナーゼポリ
ヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチド、
または本発明の他のポリペプチドの抗原をコードし、発
現するＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む組成物に関す
る。免疫学的応答は、治療的および予防的に使用でき、
抗体免疫またはＣＴＬもしくはＣＤ４＋Ｔ細胞から生ず
るような細胞免疫の形態であってもよい。
【０１００】ヒスチジンキナーゼポリペプチドまたはそ
のフラグメントは、それ自体抗体を産生しないが、第一
タンパク質の安定化ならびに免疫原性および保護特性を
有するであろう融合タンパク質の産生能を有する補タン
パク質（co−Protein）と融合させることができる。こ
のような融合組換えタンパク質は、好ましくは、さら
に、ヘモフィラス・インフルエンザ（Hemophilus influ
enzae）からのリポプロテインＤ、グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベータガラクトシ
ダーゼのような抗原性補タンパク質、または、タンパク
質を可溶化し、その産生および精製を容易にするような
比較的大きい他の補タンパク質からなる。さらに、補タ
ンパク質は、免疫系の汎化した刺激を与える上で、アジ
ュバントとして作用してもよい。補タンパク質は第一タ
ンパク質のアミノまたはカルボキシ末端のいずれかに結
合してもよい。本発明は、本発明のポリペプチドおよび
／またはポリヌクレオチドおよび、Sato，Y.ら，Scienc
e，273: 352(1996)に記載されるような免疫刺激ＤＮＡ
配列を含む組成物、特にワクチン組成物および方法を提
供する。
【０１０１】また、本発明は、ストレプトコッカス・ニ
ューモニアエ感染の動物モデルにおけるそのような遺伝
的免疫実験において使用したＤＮＡ構築物中で細菌細胞
表面タンパク質の非可変領域をコードすることが明らか
にされた記載のポリヌクレオチドまたはその特定のフラ
グメントを使用する方法も提供する。そのような実験
は、予防的または治療的免疫応答を起こさせることので
きるタンパク質エピトープの同定に特に有用である。こ
の方法により、動物、とりわけヒトにおける細菌感染、
特にストレプトコッカス・ニューモニアエ感染の予防剤
または治療剤の開発のために、動物の必要な器官から感
染の抵抗または除去に特に有用なモノクローナル抗体を
産生させることができる。
【０１０２】本発明のポリペプチドを宿主を免疫化する
ための抗原として用い、例えば、損傷組織への細菌の付
着を遮断することにより、細菌の侵入を妨げる特異的抗
体を生じさせることができる。組織損傷の例としては、
例えば、機械的、化学的または熱的損傷による、または
内在装置の埋め込みによる皮膚や結合組織の傷、あるい
は口、咽喉、乳腺、尿道または膣のような粘膜における
傷が挙げられる。
【０１０３】本発明はまた、本発明の免疫原性組換えポ
リペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと、医薬上
許容される担体などの適当な担体を含むワクチン処方も
包含する。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは胃で
破壊されうるので、それぞれ非経口的投与（例えば、皮
下、筋肉内、静脈内、皮内等の投与を包含する）が望ま
しい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝剤、
抗菌剤、およびその処方を個体の体液、好ましくは血液
と等張にする溶質を含有してもよい、水性および非水性
滅菌注射溶液；懸濁化剤または増粘剤を含有してもよ
い、水性および非水性滅菌懸濁液を包含する。処方は、
単位投与または複数投与用容器、例えば、密封されたア
ンプルおよびバイアルにて提供され、使用直前に滅菌液
体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵するこ
とができる。ワクチン処方はまた、水中油系のごとき処
方の免疫原性を高めるアジュバント系および当該分野に
おいて知られている他の系を有してもよい。投与量はワ
クチンの比活性に依存し、慣用的実験操作によって容易
に決定できる。本発明をある種のヒスチジンキナーゼポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドについて記載した
が、この記載は天然のタンパク質のフラグメントおよび
組換えタンパク質の免疫原性を実質的に変化させない付
加、欠失または置換を有する同様なタンパク質も包含す
ることが理解されるであろう。
【０１０４】組成物、キットおよび投与 本発明のさらなる態様において、単細胞または多細胞生
物に投与される、「ヒスチジンキナーゼポリヌクレオチ
ドおよび／またはヒスチジンキナーゼポリペプチドを含
む組成物が提供される。本発明はまた、本明細書で記載
するポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドある
いはそれらのアゴニストまたはアンタゴニストを含む組
成物に関する。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドは、対象への投与に適した医薬担体のような細
胞、組織または器官用の未滅菌または滅菌担体と組み合
わせて使用できる。かかる組成物は、例えば、媒体添加
または治療上有効量の本発明のポリペプチドおよび／ま
たはポリヌクレオチドと、医薬上許容される担体または
賦形剤を含む。かかる担体は、限定するものではない
が、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセ
ロール、エタノールおよびその組み合わせを包含する。
処方は投与方法に適していなければならない。本発明
は、さらには、上記した本発明の組成物の一またはそれ
以上の成分を充填した、一またはそれ以上の容器を含む
診断および医薬用パックおよびキットに関する。
【０１０５】本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド
および他の化合物を、単独で、または、治療用化合物な
どの他の化合物と組み合わせて用いてもよい。該医薬組
成物は、例えば、とりわけ、局所、経口、経肛門、経
膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経鼻、経皮経路に
よる投与を含む、いずれかの有効な、都合のよい方法で
投与される。治療および予防において、活性成分は個体
に注射用組成物、例えば、好ましくは等張の滅菌水性分
散液として投与される。
【０１０６】また、組成物は、例えば、軟膏、クリー
ム、ローション、眼軟膏、点眼剤、点耳剤、洗口剤、含
浸包帯および縫合糸ならびにエアゾルの形態の局所用処
方とすることができ、適当な通常の添加剤、例えば、保
存料、薬剤浸透を助ける溶媒、軟膏やクリームにおける
エモリエント等を含むことができる。そのような局所用
処方はまた、適合する通常の担体、例えば、クリームま
たは軟膏基剤、ローション用のエタノールまたはオレイ
ルアルコールも含有することができる。このような担体
は、処方の約１〜９８重量％を構成してもよく、より一
般的には、処方の約８０重量％までを構成する。
【０１０７】さらなる態様において、本発明は、医薬上
許容される担体または賦形剤を混合された治療上有効量
のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、例え
ば可溶性形態の本発明のポリペプチドおよび／またはポ
リヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストペプ
チドまたは小型分子化合物を含む組成物が提供される。
かかる担体は、限定するものではないが、食塩水、緩衝
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびその組み合わせを包含する。本発明は、さらに
は、上記した本発明の組成物の一またはそれ以上の成分
を充填した、一またはそれ以上の容器を含む医薬用パッ
クおよびキットに関する。本発明のポリペプチド、ポリ
ヌクレオチドおよび他の化合物を、単独で、または、治
療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いてもよ
い。組成物を投与経路、例えば、全身投与または経口投
与に適合させる。全身投与の好ましい形態は、注射、典
型的には静脈注射を包含する。皮下、筋肉内または腹腔
内のごとき他の注射経路を用いることもできる。全身投
与のための別の手段は、胆汁酸塩またはフシジン酸また
は他の界面活性剤のごとき浸透剤を用いる経粘膜または
経皮投与を包含する。さらに、本発明のポリペプチドま
たは他の化合物が腸溶処方またはカプセル処方にうまく
処方されるならば、経口投与も可能である。これらの化
合物の投与は局所および／または局在的なものであって
もよく、膏薬、パスタ、ゲル等の形態であってもよい。
【０１０８】哺乳動物、特にヒトに投与するためには、
一日の活性薬剤の用量は、０.０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍ
ｇ／ｋｇ、典型的には約１ｍｇ／ｋｇである。いずれに
しても、個体に最も適した実際の用量は医者により決定
され、個体の年齢、体重および応答により変化する。上
記の用量は、平均的な場合の例示である。もちろん、よ
り高いまたは低い用量範囲が適当な個体もあり、それら
も本発明の範囲内である。内在装置には外科移植、補綴
およびカテーテル、すなわち、個体の体内に導入され、
その位置に長時間止まる装置が包含される。例えば、そ
のような装置としては、人工関節、心臓弁、ペースメー
カー、血管グラフト、血管カテーテル、脊髄液シャン
ト、尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（continuous amb
ulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カテーテル
が挙げられる。
【０１０９】本発明の組成物を注射により投与し、内在
装置の挿入の直前に、関連する細菌に対する全身的効果
を得ることができる。手術後、装置が体内に在る時間、
治療を続けてよい。加えて、組成物を手術用の手術周辺
カバーを広げて、ストレプトコッカス・ニューモニアエ
創傷感染を防御するために用いることができる。多くの
整形外科医は、補綴関節を有するヒトは、菌血症を生じ
得る歯の治療前に抗生物質による予防を考慮すべきと考
えている。後の重い感染は、重篤な合併症となり、時
に、補綴関節の損失および著しい罹病率、致死率を伴
う。したがって、該活性物質を、この状況の予防的抗生
物質の代替品として使用することにまで拡張することが
できる。
【０１１０】前記の治療に加え、本発明の組成物は、一
般に、創傷組織に露出したマトリックスタンパク質に細
菌が付着するのを防ぐための創傷治療薬として使用で
き、歯科治療において抗生物質の予防法に代わって、ま
たはそれと組み合わせて、予防的に使用できる。別法と
して、本発明の組成物は挿入直前に内在装置を浸すのに
使用できる。該活性物質は、好ましくは、傷または内在
装置を浸す場合、１μｇ／ｍｌ〜１０mg／ｍｌの濃度で
使用できる。
【０１１１】ワクチン組成物は、都合よくは、注射用形
態である。通常のアジュバントを使用して免疫応答を高
めることができる。ワクチン化に適当な単位投与量は抗
原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、この用量を、好ましく
は１〜３週間の間隔で１〜３回投与する。 提示した投
与量範囲では、本発明の化合物で、適当な個体への投与
を妨げるような、不利な毒性効果は観察されない。
【０１１２】配列データベース、触知可能媒体中の配
列、およびアルゴリズム ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、その２次
元および３次元構造を決定し、類似の相同性を有するさ
らなる配列を同定するための貴重な情報源を形成する。
配列をコンピューター読み込み可能媒体に保存し、つい
で、既知の高分子構造プログラムにおいて保存したデー
タを用いて、ＧＣＣのごとき周知の検索ツールを用いて
データベースを検索することにより、これらのアプロー
チを最も容易に簡略化することができる。
【０１１３】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは検索分析に有用なデータベースならびに配列分析
アルゴリズム中の成分として有用である。このセクショ
ンの見出しの「配列データベース、触知可能媒体中の配
列、およびアルゴリズム」、およびこのセクションに関
連した請求項の用語「本発明のポリヌクレオチド」およ
び「本発明のポリヌクレオチド配列」は、本発明のポリ
ヌクレオチドの検出可能な化学的または物理的特性を意
味し、触知可能媒体、好ましくはコンピューター読み込
み可能形態に還元または保存されていてもよいものであ
る。例えば、クロマトグラフィーのスキャンデータまた
はピークのデータ、写真のデータまたはそこから得られ
たスキャンデータ、コールドベース、および質量スペク
トル分析データが挙げられる。データベースおよびアル
ゴリズムという見出しのこのセクションならびにそれに
関連した請求項で用いる用語「本発明のポリペプチド」
および「本発明のポリペプチド配列」は、本発明のポリ
ヌペプチドの検出可能な化学的または物理的特性を意味
し、触知可能媒体、好ましくはコンピューター読み込み
可能形態に還元または保存されていてもよいものであ
る。例えば、クロマトグラフィーのスキャンデータまた
はピークのデータ、写真のデータまたはそこから得られ
たスキャンデータ、および質量スペクトル分析データが
挙げられる。
【０１１４】本発明は、本発明のポリペプチド配列およ
び／または本発明のポリヌクレオチド配列を保存したコ
ンピューター読み込み可能媒体を提供する。例えば、下
記のメンバーを含む、保存したコンピューター読み込み
可能媒体が提供される：メンバーは、本発明のポリヌク
レオチドの配列を含むポリヌクレオチド；本発明のポリ
ペプチド配列の配列を含むポリペプチド；少なくとも１
つの配列が本発明のポリヌクレオチド配列の配列を含む
ものであるポリヌクレオチド配列のセット；少なくとも
１つの配列が本発明のポリペプチド配列の配列を含むも
のであるポリヌペプチド配列のセット；本発明のポリヌ
クレオチド配列の配列を含むポリヌクレオチド配列を表
すデータセット；本発明のポリペプチド配列の配列を含
むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列
を表すデータセット；本発明のポリヌクレオチド配列の
配列を含むポリヌクレオチド；本発明のポリペプチド配
列の配列を含むポリペプチド；少なくとも１つの配列が
本発明のポリヌクレオチド配列の配列を含むものである
ポリヌクレオチド配列のセット；少なくとも１つの配列
が本発明のポリペプチド配列の配列を含むものであるポ
リペプチド配列のセット；本発明のポリヌクレオチド配
列の配列を含むポリヌクレオチド配列を表すデータセッ
ト；本発明のポリペプチド配列の配列を含むポリペプチ
ド配列をコードしているポリヌクレオチド配列を示すデ
ータセットである。コンピューター読み込み可能媒体は
情報またはデータを保存するのに用いる材料のいずれの
組成物であってもよく、例えば、市販フロッピーディス
ク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディ
スク、およびビデオディスクを包含する。
【０１１５】本発明により、特徴配列または鎖、詳細に
は遺伝学的配列またはコードされた遺伝学的配列の分析
方法が提供される。配列分析のための好ましい方法は、
例えば、同一性および類似性の分析のごとき配列相同性
分析、ＲＮＡ構造分析、配列アッセンブリー、クラディ
スティック（cladistic）分析、配列モチーフ分析、読
み枠決定、核酸塩基コーリング（calling）、核酸塩基
トリミング、および配列決定クロマトグラムピーク分析
の方法を包含する。コンピューターによる方法は相同性
の同定を行うために提供される。この方法は、本発明の
ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列をコ
ンピューター読み込み可能媒体中に提供し；ついで、該
ポリヌクレオチド配列を少なくとも１つのポリヌクレオ
チドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同定す
る工程を含む。
【０１１６】コンピューターによる方法は相同性の同定
を行うためにも提供され、該方法は：本発明のポリペプ
チド配列を含むポリペプチド配列をコンピューター読み
込み可能媒体中に提供し；ついで、該ポリペプチド配列
を少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド配列と比較して相同性を同定する工程を含む。さらに
コンピューターによる方法はポリヌクレオチドアッセン
ブリー用にも提供され、該方法は：本発明のポリヌクレ
オチド配列を含む第１のポリヌクレオチド配列をコンピ
ューター読み込み可能媒体中に提供し；ついで、該第１
のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列
との間の少なくとも１つの重複領域をスクリーニングす
る工程を含む。
【０１１７】本発明のさらなる具体例は、相同性の同定
を行うためのコンピューターによる方法を提供し、該方
法は：本発明のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレ
オチド配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供
し；ついで、該ポリヌクレオチド配列を少なくとも１つ
のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して
相同性を同定する工程を含む。本発明のさらなる具体例
は、相同性の同定を行うためのコンピューターによる方
法を提供し、該方法は：本発明のポリペプチド配列を含
むポリペプチド配列をコンピューター読み込み可能媒体
中に提供し；ついで、該ポリペプチド配列を少なくとも
１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較
して相同性を同定する工程を含む。
【０１１８】本発明のさらなる具体例はポリヌクレオチ
ドアッセンブリーのためのコンピューターによる方法を
提供し、該方法は：本発明のポリヌクレオチド配列を含
む第１のポリヌクレオチド配列をコンピューター読み込
み可能媒体中に提供し；ついで、該第１のポリヌクレオ
チド配列と第２のポリヌクレオチド配列との間の少なく
とも１つの重複領域をスクリーニングする工程を含む。
【０１１９】本発明のもう１つの好ましい具体例におい
て、下記のものからなる群より選択されるメンバーを保
存したコンピューター読み込み可能媒体が提供される：
メンバーは、配列番号１または３の配列を含むポリヌク
レオチド；配列番号２または４の配列を含むポリペプチ
ド；少なくとも１つの配列が配列番号１または３の配列
を含むものであるポリヌクレオチド配列のセット；少な
くとも１つの配列が配列番号２または４の配列を含むも
のであるポリペプチド配列のセット；配列番号１または
３の配列を含むポリヌクレオチド配列を表すデータセッ
ト；配列番号２または４の配列を含むポリペプチド配列
をコードしているポリヌクレオチド配列を表すデータセ
ット；配列番号１または３の配列を含むポリヌクレオチ
ド；配列番号２または４の配列を含むポリペプチド；少
なくとも１つの配列が配列番号１または３の配列を含む
ものであるポリヌクレオチド配列のセット；少なくとも
１つの配列が配列番号２または４の配列を含むものであ
るポリペプチド配列のセット；配列番号１または３の配
列を含むポリヌクレオチド配列を表すデータセット；配
列番号２または４の配列を含むポリペプチド配列をコー
ドしているポリヌクレオチド配列を表すデータセットで
ある。さらなる好ましい本発明の具体例は、相同性の同
定を行うためのコンピューターによる方法を提供し、該
方法は、配列番号１または３の配列を含むポリヌクレオ
チド配列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供
し；ついで、該ポリヌクレオチド配列を少なくとも１つ
のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較して
相同性を同定する工程を含む。さらなる好ましい本発明
の具体例は、相同性の同定を行うためのコンピューター
による方法を提供し、該方法は：配列番号２または４の
配列を含むポリペプチド配列をコンピューター読み込み
可能媒体中に提供し；ついで、該ポリペプチド配列を少
なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配
列を比較して相同性を同定する工程を含む。
【０１２０】さらなる好ましい本発明の具体例は、ポリ
ヌクレオチドアッセンブリーのためのコンピューターに
よる方法を提供し、該方法は：配列番号１または３の配
列を含む第１のポリヌクレオチド配列をコンピューター
読み込み可能媒体中に提供し；ついで、該第１のポリヌ
クレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列との間の
少なくとも１つの重複領域をスクリーニングする工程を
含む。本発明のさらなる具体例は、相同性の同定を行う
ためのコンピューターによる方法を提供し、該方法は：
配列番号１または３の配列を含むポリヌクレオチド配列
をコンピューター読み込み可能媒体中に提供し；つい
で、該ポリヌクレオチド配列を少なくとも１つのポリヌ
クレオチドまたはポリペプチド配列を比較して相同性を
同定する工程を含む。
【０１２１】本発明のさらなる具体例は、相同性の同定
を行うためのコンピューターによる方法を提供し、該方
法は：配列番号２または４の配列を含むポリペプチド配
列をコンピューター読み込み可能媒体中に提供し；つい
で、該ポリペプチド配列を少なくとも１つのポリヌクレ
オチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同定
する工程を含む。本発明のさらなる具体例はポリヌクレ
オチドアッセンブリーのためのコンピューターによる方
法を提供し、該方法は：配列番号１または３の配列を含
む第１のポリヌクレオチド配列をコンピューター読み込
み可能媒体中に提供し；ついで、該第１のポリヌクレオ
チド配列と第２のポリヌクレオチド配列との間の少なく
とも１つの重複領域をスクリーニングする工程を含む。
【０１２２】各々の個々の出版物または文献が参照によ
り本明細書に十分に示されていると個々に示されるよう
に、本明細書で引用した特許および特許出願を包含する
（これに限らない）すべての出版物および文献を、出典
明示によりその内容を本明細書の一部とする。本願が優
先権を主張するいずれの特許出願もまた、出版物および
参考文献について上記したように、出典明示によりその
内容を本明細書の一部とする。
【０１２３】定義 本明細書中で頻繁に使用されるある種の用語をその理解
を容易にするために以下に定義する。本明細書で用いる
「抗体（複数でも可）」は、ポリクローナル抗体および
モノクローナル抗体、キメラ、１本鎖、およびヒト化抗
体、ならびにＦａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライ
ブラリーの産物を包含するＦａｂフラグメントを包含す
る。。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導体（複数
でも可）」は、特定の抗体により特異的に認識されるポ
リペプチド、ポリヌクレオチド、またはいずれかの等価
物を包含し、該特定の抗体は、本発明のタンパク質、ポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドに対して生成した場
合に、病原体と哺乳動物宿主との間の身体的相互作用を
妨害するものである。
【０１２４】「二特異的抗体（複数でも可）」とは、少
なくとも２つの抗原結合ドメインを含む抗体を意味し、
各ドメインは異なるエピトープに指向されている。「身
体材料（複数でも可）」とは、個体または個体に感染、
侵入または棲息する生物由来の材料を意味し、骨、血
液、血清、脳脊髄液、精液、唾液、筋肉、軟骨、器官組
織、皮膚、尿、糞便または生検材料のごとき細胞、組織
および排泄物等を包含するがこれに限定するものではな
い。「疾患（複数でも可）」は、細菌感染により引き起
こされる、あるいは細菌感染に関連した疾患を意味し、
例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、脳髄膜炎、副
鼻腔炎、膿胸、および心内膜炎、そして最も詳細には脳
髄膜炎、例えば脳脊髄液の感染を包含する。
【０１２５】「融合タンパク質（複数でも可）」は、２
種の、しばしば関係のない融合遺伝子またはそのフラグ
メントによりコードされたタンパク質をいう。一例にお
いて、ＥＰ−Ａ−０４６４には、別のヒトタンパク質ま
たはその一部と一緒になった免疫グロブリン分子の不変
領域の種々の部分を含む融合タンパク質が開示されてい
る。多くの場合、免疫グロブリンのＦｃ領域を融合タン
パク質の一部分として用いることは治療および診断にお
ける使用に有利であり、例えば、改善された薬物動態学
的特性が得られる（例えば、ＥＰ−Ａ−０２３２２６２
参照）。一方、いくつかの用途には、融合タンパク質が
発現、検出および精製された後、Ｆｃ部分を欠失できる
ことが望ましいであろう。「宿主細胞（複数でも可）」
は外来性ポリヌクレオチド配列によってトランスフォー
ムまたはトランスフェクトされた、あるいはトランスフ
ォームまたはトランスフェクト可能な細胞である。
【０１２６】「同一性」は、当該分野で公知であり、配
列の比較で測定されるような、２またはそれ以上のポリ
ペプチド配列あるいは２またはそれ以上のポリヌクレオ
チド配列の間の関係である。また、当該分野では、「同
一性」は、場合によっては、配列の鎖間の対合によって
測定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ド配列間の配列の関連性の度合を意味する。「同一性」
は限定するものではないが、Computational Molecular
Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press,
New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Gen
ome Projects,Smith, D.W., ed., Academic Press, New
York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, P
art I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Hum
ana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in
Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press,
1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.
and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New Yor
k, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J.
Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載されている方法
を含め、公知方法により容易に決定することができる。
同一性を測定する方法は、テストする配列間に最大の対
合を与えるように設計されている。同一性を測定する方
法は公に入手できるコンピュータ・プログラムに組み込
まれている。２つの配列の間の同一性を測定するコンピ
ュータ・プログラム方法には、限定するものではない
が、例えば、ＧＣＳプログラムパッケージ（Devereux,
J.ら，Nucleic Acids Research(1984)12(1): 387）、BL
ASTP、BLASTNおよびFASTA（Atschul,S. F.ら, J.Molec.
Biol. (1990)215: 403−410）が包含される。ＢＬＡＳ
ＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の源（BLAST Manua
l, Altshul, S．ら，NCBI NLM NIH Bethesda， MD2089
4; Altschul,S．ら，J. Mol. Biol., 215: 403−410(19
90)）から公に入手できる。また、周知のスミス・ウォ
ーターマン（Smith Waterman)アルゴリズムを用いて同
一性を測定することもできる。
【０１２７】ポリペプチド配列の比較のためのパラメー
ターは以下のものを包含する： １）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol Bio
l. 48: 443-453 (1970) 比較マトリックス：Hentikoff and Hentikoff, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA. 8 9:10915-10919 (1992)からのBLOSSUM62 ギャップペナルティー：１２ ギャップ長ペナルティー：４ これらのパラメーターに関して有用なプログラムは、Ge
netics Computer Group, Madison WI.から「ギャップ」
プログラムとして公に利用できる。上記パラメーターは
ポリペプチド比較のためのデフォルトパラメーターであ
る（エンドギャップについてペナルティーを伴わな
い）。
【０１２８】ポリヌクレオチド比較のための好ましいパ
ラメーターは下記のものを包含する： １）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol Bio
l. 48: 443-453 (1970) 比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：５０ ギャップ長ペナルティー：３ Genetics Computer Group, Madison WI.から「ギャッ
プ」プログラムとして利用できる。上記パラメーターは
ポリヌクレオチド比較のためのデフォルトパラメーター
である。
【０１２９】ポリヌクレオチドおよびポリペプチドにつ
いての「同一性」に関する好ましい意味は、下記（１）
および（２）に示される。 （１）さらにポリヌクレオチドの具体例は、配列番号１
の対照配列に対して少なくとも５０、６０、７０、８
０、８５、９０、９５、９７または１００％の同一性を
有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチ
ド配列を包含し、かかるポリヌクレオチド配列は配列番
号１の対照配列と同一であってもよく、あるいは対照配
列と比較してある程度の数までのヌクレオチドの変化を
有していてもよい。かかる変化は、少なくとも１個のヌ
クレオチドの欠失、置換（トランジションおよびトラン
スバージョンを包含）または挿入からなる群より選択さ
れ、該変化は対照ヌクレオチド配列の５’または３’末
端の位置あるいはそれらの末端位置の間の位置におい
て、対照配列中のヌクレオチドにおいて個々にまたは散
在して、あるいは対照配列中の１またはそれ以上の連続
した群として生じてもよい。配列番号１中の全ヌクレオ
チド数と個々の同一性パーセント値（１００で割ったも
の）とをかけて、その積を配列番号１中の全ヌクレオチ
ド数から差し引くことによりヌクレオチド変化の数を決
定する。これを下式により説明する： ｎn≦ｘn−（ｘn・ｙ） 式中、ｎnはヌクレオチド変化の数であり、ｘnは配列番
号１中の全ヌクレオチド数であり、ｙは、５０％なら
０．５０、６０％なら０．６０、７０％なら０．７０、
８０％なら０．８０、８５％なら０．８５、９０％なら
０．９０、９５％なら０．９５、９７％なら０．９７、
１００％なら１．００であり、・は積の演算子であり、
ｘnとｙとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整
数とした後、ｘnから差し引く。配列番号２のポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチド配列の変化は、
好ましくはコーディング配列中のナンセンス、ミスセン
スまたはフレームシフト変異を引き起こす可能性があ
り、それゆえ、かかる変化に随伴してポリヌクレオチド
によりコードされているポリペプチドが変化する。
【０１３０】例えば、本発明のポリヌクレオチド配列は
配列番号１の対照配列と同一であってもよく、すなわ
ち、１００％同一であってもよく、あるいは対照配列と
比較してある程度の数までの核酸の変化を有していても
よい（その場合、同一性％は１００％未満である）。か
かる変化は、少なくとも１個の核酸の欠失、置換（トラ
ンジションおよびトランスバージョンを包含）または挿
入からなる群より選択され、該変化は対照ポリヌクレオ
チド配列の５’または３’末端の位置あるいはそれらの
末端位置の間の位置において、対照配列中の核酸におい
て個々にまたは散在して、あるいは対照配列中の１また
はそれ以上の連続した群として生じてもよい。配列番号
１中の核酸数と個々の同一性パーセント値（１００で割
ったもの）とをかけて、その積を配列番号１中の全核酸
数から差し引くことにより同一性％値についての核酸変
化数を決定する。これを下式により説明する： ｎn≦ｘn−（ｘn・ｙ） 式中、ｎnは核酸変化の数であり、ｘnは配列番号１中の
全核酸数であり、ｙは、例えば７０％なら０．７０、８
５％なら０．８５等であり、・は積の演算子であり、ｘ
nとｙとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整数
とした後、ｘnから差し引く。
【０１３１】（２）さらにポリペプチドの具体例は、配
列番号２のポリペプチド対照配列に対して少なくとも５
０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または
１００％の同一性を有するポリペプチドを含む単離ポリ
ペプチドを包含し、該ポリペプチド配列は配列番号２の
対照配列と同一であってもよく、あるいは対照配列と比
較してある程度の数までのアミノ酸の変化を有していて
もよい。かかる変化は、少なくとも１個のアミノ酸の欠
失、置換（保存的および非保存的置換を包含）または挿
入からなる群より選択され、該変化は対照ポリペプチド
配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置あるいはそれ
らの末端位置の間の位置において、対照配列中のアミノ
酸において個々にまたは散在して、あるいは対照配列中
の１またはそれ以上の連続した群として生じてもよい。
配列番号２中の全アミノ酸数と同一性パーセント値（１
００で割ったもの）とをかけて、その積を配列番号２中
の全アミノ酸数から差し引くことによりアミノ酸変化の
数を決定する。これを下式により説明する： ｎa≦ｘa−（ｘa・ｙ） 式中、ｎaはアミノ酸変化数であり、ｘaは配列番号２中
の全アミノ酸数であり、ｙは、５０％なら０．５０、６
０％なら０．６０、７０％なら０．７０、８０％なら
０．８０、８５％なら０．８５、９０％なら０．９０、
９５％なら０．９５、９７％なら０．９７、１００％な
ら１．００であり、・は積の演算子であり、ｘaとｙと
の整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした
後、ｘaから差し引く。
【０１３２】例えば、本発明のポリペプチド配列は配列
番号２の対照配列と同一であってもよく、すなわち、１
００％同一であってもよく、あるいは対照配列と比較し
てある程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよ
い（その場合、同一性％は１００％未満である）。かか
る変化は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（保
存的または非保存的置換を包含）または挿入からなる群
より選択され、該変化は対照ポリペプチド配列のアミノ
またはカルボキシ末端の位置あるいはそれらの末端位置
の間の位置において、対照配列中のアミノ酸において個
々にまたは散在して、あるいは対照配列中の１またはそ
れ以上の連続した群として生じてもよい。配列番号２中
の全アミノ酸数と個々の同一性パーセント値（１００で
割ったもの）とをかけて、その積を配列番号２中の全ア
ミノ酸数から差し引くことにより同一性％値についての
アミノ酸変化数を決定する。これを下式により説明す
る： ｎa≦ｘa−（ｘa・ｙ） 式中、ｎaはアミノ酸変化の数であり、ｘaは配列番号２
中の全アミノ酸数であり、ｙは、例えば７０％なら０．
７０、８５％なら０．８５等であり、ｘaとｙとの整数
でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、ｘa
から差し引く。
【０１３３】本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導
体（複数でも可）」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチ
ド、またはいずれかの等価物を包含し、それらが脊椎動
物において抗体を生成させるために適当な処方中に用い
られた場合に、抗体は病原体と哺乳動物宿主との間の即
時的な身体的相互作用を妨害するように作用する。「免
疫特異的」とは、他の関連ポリペプチドまたはポリヌク
レオチド、特に先行技術のポリペプチドまたはポリヌク
レオチドに対してよりも本発明のポリペプチドまたは本
発明のポリヌクレオチドに対して実質的に大きなアフィ
ニティーを有する抗体の特性を意味する。「個体（複数
でも可）」とは多細胞真核生物を意味し、後生動物類、
哺乳動物、ヤギ類、ウシ類、類人猿、霊長類もよびヒト
を包含するが、これらに限らない。
【０１３４】「単離された」とは、「ヒトの手によ
り」、その天然の状態から変えられること、すなわち、
天然物の場合、その本来的な環境から変化または除去あ
るいは両方されたことを意味する。例えば、生体に天然
に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単
離された」ものではないが、その天然状態で共存する物
質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドは、本明細書で用いる用語としての「単離された」
ものである。さらには、トランスフォーメーション、遺
伝的操作により、またはいずれか他の方法により生物に
導入されているポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、まだ生物内にあり、その生物が生きているまたは死
んでいるとしても、「単離された」ものである。
【０１３５】「生物（複数でも可）」は、（ｉ）Strept
ococcus、Staphylococcus、Bordetella、Corynebacteri
um、Mycobacterium、Neisseia、Haemophilus、Actinomy
ces、Streptomyces、Nocardia、Enterobacter、Yersini
a、Fancisella、Pasturella、Moraxella、Acinetobacte
r、Erysipelothrix、Branhamella、Actinobacillus、St
reptobacillus、Listeria、Calymmatobacterium、Bruce
lla、Bacillus、Closterdium、Treponema、Escherichi
a、Salmonella、Kleibsiella、Vibrio、Proteus、Erwin
ia、Borrelia、Leptospira、Spirillum、Campylobacte
r、Shigella、Legionella、Pseudomonas、Aeromonas、R
ickettsia、Chlamydia、BorreliaおよびMycoplasmaであ
る属（これらに限らない）のメンバー、ならびにグルー
プＡのStreptococcus、グループＢのStreptococcus、グ
ループＣのStreptococcus、グループＤのStreptococcu
s、グループＧのStreptococcus、Streptococcus pneumo
niae、Streptococcus pyrogenes、Streptoxoxxus agala
ctiae、Streptococcus faecalis、Streptococcus faeci
um、Streptococcus durans、Neisseria gonorrheae、Ne
isseria meningitidis、Staphylococcus aureus、Staph
ylococcus epidermidis、Corynebacterium diptheria
e、Gardnerella vaginalis、Mycobacterium tuberculos
is、Mycobacterium bovis、Mycobacterium ulcerans、M
ycobacterium leprae、Actinomyces israelli、Listeri
a monocytogenes、Bordetella pretusis、Bordetella p
arapertusis、Bordetella bronchiseptica、Esherichia
coli、Shigella dysenteriae、Haemophilus influenza
e、Haemophilus aegyptius、Haemophilus parainfluenz
ae、Haemophilus ducreyi、Bordetella、Salmonella ty
phi、Citrobacter freundii、Proteus mirabilis、Prot
eus vulgaris、Yersinia pestis、Klebsiella pneumoni
ae、Serratia marcessens、Vibrio cholera、Shigella
dysenterii、Shigella flexneri、Pseudomonas aerugin
osa、Franscisellatularensis、Brucella abortis、Bac
illus anthracis、Bacillus cereus、Clostridium perf
ringens、Clostridium tetani、Clostridium butulinu
m、Treponemapallidum、Rickettsia rickettsiiおよびC
hlamydia trachomitisである種またはグループ（これら
に限らない）のメンバーを包含する原核生物、（ｉｉ）
Archaebacter（これに限らない）を包含する古細菌、お
よび（ｉｉｉ）原生動物、真菌類、Saccharomyces、Klu
veromycesまたはCandida属（これらに限らない）のメン
バー、およびSaccharomyces cerevisiae、Kluveromyces
lactisまたはCandidaalbicans種のメンバー（これらに
限らない）を包含する単細胞または糸状真核生物を意味
する。
【０１３６】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボ
ヌクレオチドのいずれをもいい、それらは非修飾ＲＮＡ
またはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであっ
てもよい。「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、単
鎖および二本鎖ＤＮＡ、単鎖および二本鎖領域または単
鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単
鎖および二本鎖ＲＮＡ、単鎖および二本鎖領域の混合物
であるＲＮＡ、および単鎖またはより典型的には二本鎖
または三本鎖領域または一本鎖および二本鎖領域の混合
物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含有してなるハ
イブリッド分子を包含するが、これに限定されない。加
えて、本明細書にて用いる「ポリヌクレオチド」は、Ｒ
ＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方
からなる三本鎖領域をいう。これらの領域の鎖は同じ分
子からのものでも、異なる分子からのものでもよい。該
領域は、これら分子の一またはそれ以上の全てを含んで
もよいが、より典型的には、分子の幾つかの領域のみを
含む。三本螺旋領域の分子の一つは、しばしば、オリゴ
ヌクレオチドである。本明細書にて用いる場合、「ポリ
ヌクレオチド（複数でも可）」なる用語はまた、一つま
たはそれ以上の修飾された塩基を含有する上記ＤＮＡま
たはＲＮＡを包含する。すなわち、安定性または他の理
由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも該用
語が本明細書で意図するところの「ポリヌクレオチド
（複数でも可）」である。さらに、イノシンなどの通常
でない塩基、またはトリチル化された塩基などの修飾塩
基を有してなるＤＮＡまたはＲＮＡ（２つの例だけを示
す）も、その用語を本明細書で用いる場合のポリヌクレ
オチドである。多種の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになさ
れており、当業者に公知のように多くの有用な目的に使
用されている。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド
（複数でも可）」なる語は、ポリヌクレオチドのこのよ
うな化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、な
らびにウイルスおよび、例えば、単純型細胞および複雑
型細胞などの細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学
的形態を包含する。「ポリヌクレオチド（複数でも
可）」はまた、しばしばオリゴヌクレオチド（複数でも
可）と称される比較的短いポリヌクレオチドも包含す
る。
【０１３７】「ポリペプチド（複数でも可）」は、ペプ
チド結合または修飾ペプチド結合で互いに結合した２つ
またはそれ以上のアミノ酸を含有してなるいずれのペプ
チドまたはタンパク質をもいう。「ポリペプチド（複数
でも可）」は、通常、ペプチド、オリゴペプチドまたは
オリゴマーと称される短い鎖、および一般にタンパク質
と称される長い鎖の両方をいう。ポリペプチドは、遺伝
子コードされている２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を
含有してもよい。「ポリペプチド（複数でも可）」は、
プロセッシングおよび他の翻訳後の修飾のごとき自然の
工程、または化学修飾技法のいずれかによって修飾され
たものを有する。かかる修飾は、基本テキストにて、お
よびより詳細な研究論文にて、ならびに膨大な研究文献
にて詳しく記載されており、それらは当業者に周知であ
る。同じ型の修飾が、所定のポリペプチド中、いくつか
の部位で、同じまたは異なる程度にて存在してもよいこ
とは明らかであろう。また、所定のペプチドは多くの型
の修飾を有していてもよい。修飾は、ペプチド骨格、ア
ミノ酸側鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含め、ポ
リペプチドのどこででも起こりうる。修飾は、例えば、
アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド
化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレ
オチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質また
は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの
共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱
メチル化、共有交差結合の形成、シスチンの形成、ピロ
グルタメートの形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシ
ル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード
化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解
的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、
糖鎖形成、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガン
マーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リ
ボシル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などの
転移ＲＮＡ媒介のタンパク質へのアミノ酸付加、および
ユビキチネーションを包含する。例えば、PROTEINS - S
TRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E.
Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (199
3)および Wold, F., Posttranslational Protein Modif
ications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in
POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEI
NS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York
(1983); Seifterら、Meth. Enzymol. 182:626-646 (199
0)およびRattanら、Protein Synthesis: Posttranslati
onal Modifications andAging, Ann. N.Y. Acad. Sci.
663: 48-62 (1992)を参照のこと。ポリペプチドは、分
枝してもよく、分枝を伴ったまたは伴わない環状であっ
てもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、
翻訳後の天然の工程の結果であり、同様に全く合成的な
方法で合成できる。
【０１３８】「組み換え発現系（複数でも可）」は、本
発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造のた
めに宿主細胞または宿主細胞溶解物中に導入またはトラ
ンスフォームされた発現系またはその部分または本発明
のポリヌクレオチドをいう。「引き算セット」は、少な
くとも一つの本発明のポリヌクレオチドを含む、一つま
たはそれ以上、好ましくは１００以下の、ポリヌクレオ
チドである。
【０１３９】本明細書中で用いる「変種（複数でも
可）」なる用語は、各々、対照標準のポリヌクレオチド
またはポリペプチドと異なるが、本質的な特性を保持し
ているポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポ
リヌクレオチドの典型的な変種は、別の対照標準のポリ
ヌクレオチドとヌクレオチド配列において異なってい
る。変種のヌクレオチド配列における変化は、対照標準
のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド
のアミノ酸配列と変わっていてもよいし、または変わっ
ていなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、後記するよ
うに、対照標準の配列によってコードされたポリペプチ
ドにおいて、アミノ酸置換、付加、欠失、融合および切
断をもたらしうる。ポリペプチドの典型的な変種は、別
の対照標準のポリペプチドとはアミノ酸配列において異
なっている。一般に、差異は、対照標準のポリペプチド
とその変種の配列が全体的に非常に類似しており、多く
の領域においては同一であるように限定される。変種お
よび対照標準のポリペプチドは、一またはそれ以上の置
換、付加、欠失のいずれかの組み合わせによって、アミ
ノ酸配列において異なってもよい。置換または挿入され
たアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされたも
のであってもなくてもよい。また本発明は、本発明の各
ポリペプチドの変種、すなわち保存的アミノ酸置換によ
り対象標準とは異なっており、そのことにより残基が同
様の特性を有する別の残基に置換されているものを包含
する。典型的なかかる置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ
およびＩｌｅ間；ＳｅｒおよびＴｈｒ間；酸性残基Ａｓ
ｐおよびＧｌｕ間；ＡｓｎおよびＧｌｎ間；塩基性残基
ＬｙｓおよびＡｒｇ間；あるいは芳香族残基Ｐｈｅおよ
びＴｙｒ間のものである。数個、５〜１０個、１〜５
個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸がいずれ
かの組み合わせで置換、欠失、または付加されている変
種が特に好ましい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドの変種は、対立遺伝子変種のような天然に存在するも
のであってもよく、または天然に存在することが知られ
ていない変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの天然に存在しない変種は、変異誘発法ま
たは直接合成あるいは当業者に公知の他の組換え法によ
って作られてもよい。
【０１４０】
【実施例】以下の実施例は、別に詳細に記載したこと以
外は、当業者に周知で慣用的な常套的な技法を用いて実
施する。実施例は例示であって、本発明を限定するもの
ではない。
【０１４１】実施例１ 株の選択、ライブラリーの製
造および配列決定 表１（配列番号１または３）に示すＤＮＡ配列を有する
ポリヌクレオチドは、イー・コリ中のストレプトコッカ
ス・ニューモニアエの染色体ＤＮＡのクローンライブラ
リーより得た。重複するストレプトコッカス・ニューモ
ニアエＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローン
からの配列データを用いて、配列番号１の連続したＤＮ
Ａ配列を構築した。ライブラリーは常套手段、例えば以
下の方法１および２により製造してもよい。全細胞ＤＮ
Ａをストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９
３より、標準法に従って単離し、以下に示す二つの方法
のいずれかによりサイズ分画する。
【０１４２】方法１ 標準的方法に従ってサイズ分画するために、全細胞ＤＮ
Ａを注射針に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまで
の大きさのＤＮＡフラグメントをエキソヌクレアーゼお
よびＤＮＡポリメラーゼで処理することによって末端切
断し、ＥｃｏＲＩリンカーを付加する。フラグメント
を、ＥｃｏＲＩで切断したベクター、ラムダＺａｐＩＩ
に連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージ
ングし、ついでパッケージングしたライブラリーでエシ
ェリシア・コリを感染させる。ライブラリーを標準方法
により増幅させる。
【０１４３】方法２ 全細胞ＤＮＡをライブラリーベクターにクローニングす
るための一連のフラグメントを得るのに適当な１つの制
限酵素またはその組み合わせで部分的に加水分解し（例
えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５
Ｉ）、かかるフラグメントを標準的方法に従ってサイズ
分画する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡに連結し、つい
でそのフラグメントをＥｃｏＲＩで切断したベクター、
ラムダＺａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラ
リーをパッケージングし、パッケージングしたライブラ
リーでエシェリシア・コリを感染させる。ライブラリー
を標準方法により増幅させる。
【０１４４】実施例２ 感染の間におけるストレプトコッカス・ニューモニアエ
由来の遺伝子発現の検出ストレプトコッカス・ニューモ
ニアエ０１００９９３での気道感染４８時間のマウスか
ら取り出した肺を、効果的に破砕し、カオトロピック剤
およびＲＮＡａｓｅ阻害剤の存在下で処理して動物およ
び細菌ＲＮＡの混合物を得る。安定な調合品および高収
量の細菌ＲＮＡを得るための破砕および処理の最適条件
は、ノーザンブロットによるストレプトコッカス・ニュ
ーモニアエ １６Ｓ ＲＮＡに特異的な放射性標識オリゴ
ヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの使用による
ものである。得られたＲＮＡａｓｅ不含、ＤＮＡａｓｅ
不含、ＤＮＡおよびタンパク質不含のＲＮＡ調合品は、
ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３の
各遺伝子配列から設計した独特なプライマー対を用いる
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に適する。
【０１４５】ａ）マウス動物感染モデルからのストレプ
トコッカス・ニューモニアエ０１００９９３で感染した
組織の単離 ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３を
ＴＳＡ／５％ウシ血液プレート上またはＡＧＣＨ倍地中
で３７℃、５％ＣＯ2で一晩生育させる。ついで細菌を
回収し、リン酸緩衝食塩水に再懸濁し、Ａ600を約０．
４とする。マウスをイソフルランで麻酔し、５０ｍｌの
細菌懸濁液（約２ｘ１０5細菌）をピペットマンを用い
て鼻腔内投与する。マウスを回復させ、任意に食物およ
び水を与える。４８時間後、マウスを過量の二酸化炭素
により安楽死させ、肺を無菌的に除去し、液体窒素中で
すばやく凍結させる。
【０１４６】ｂ）感染組織試料からのストレプトコッカ
ス・ニューモニアエ０１００９９３ＲＮＡの単離 ２ｍｌのスクリューキャップ試験管中の感染組織試料を
−８０℃の貯蔵庫からドライアイスエタノール浴中に取
り出す。微生物学的安全キャビネット中で、試料をドラ
イアイスエタノール浴中で凍結させたまま試料を８個ま
でに破砕する。組織試料中の細菌を破砕するために、５
０〜１００ｍｇの組織をシリカ／セラミック マトリッ
クス（BIO101）を含むＦａｓｔＲＮＡチューブに移す。
すばやく、１ｍｌの抽出試薬（ＦａｓｔＲＮＡ試薬、BI
O101）を添加し、試料：試薬容積比を約１：２０とす
る。チューブを往復シェーカー（FastPrep FP120、BIO1
01）中で２０〜１２０秒間６０００ｒｐｍで振盪させ
る。粗ＲＮＡ調合品をクロロホルム／イソアミルアルコ
ールで抽出し、ＤＥＰＣ−処理／イソプロパノール沈殿
溶液（BIO101）で沈殿させる。必要ならば、ＲＮＡ調合
品をこのイソプロパノール溶液に−８０℃で保存する。
ＲＮＡをペレット化し、７５％エタノール（ＤＥＰＣ−
処理水中ｖ／ｖ）で洗浄し、５〜１０分間空気乾燥さ
せ、０．１ｍｌのＤＥＰＣ−処理水中に再懸濁し、５５
℃で５−１０分置く。最終的に、少なくとも１分間氷上
に置き、２００ユニットのルナジン（Rnasin、Promega)
を添加する。ＲＮＡ調合品は−８０℃で１カ月まで保存
される。長期保存には、プロトコールの７５％エタノー
ル洗浄段階でＲＮＡ沈殿を少なくとも１年間−２０℃で
保存できる。試料を１％アガロースゲル上に泳動させる
ことにより単離ＲＮＡの品質を評価する。臭化エチジウ
ムで染色した１ｘＴＢＥゲルを用いて全ＲＮＡ収量を可
視化する。感染組織からの細菌ＲＮＡの単離を示すため
に、１ｘＭＯＰＳ、２．２Ｍホルムアミドゲルで泳動を
行い、Hybond-N（Amersham）に減圧ブロッティングす
る。ついで、ストレプトコッカス・ニューモニアエの１
６Ｓ ｒＲＮＡに特異的な、配列5' AACTGAGACTGGCTTTAA
GAGATTA 3'（配列番号７）の32Ｐ標識オリゴヌクレオチ
ドプローブにブロットをハイブリダイゼーションさせ
る。ハイブリダイゼーションするバンドのサイズを、イ
ンビトロで増殖したストレプトコッカス・ニューモニア
エ０１１０９９３から単離された対照ＲＮＡのサイズと
ノーザンブロッドにおいて比較する。全ＲＮＡ試料中に
正しいサイズの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡバンドを検出で
き、ＴＢＥゲル上で可視化すると哺乳動物ＲＮＡの進ん
だ分解が示される。
【０１４７】ｃ）ＲＮＡ由来のストレプトコッカス・ニ
ューモニアエからのＤＮＡの除去 最終容積５７マイクロリットルの緩衝液中で２０ユニッ
トのＲＮＡａｓｅ不含−ＤＮＡａｓｅI（GenHunter）で
３７℃で３０分間処理することにより、５０マイクログ
ラムのＲＮＡ試料からＤＮＡを除去した。製造者のプロ
トコールに従ってＤＮＡａｓｅを不活性化し、TRIzol L
S試薬（Gibco BRL,Life Technologies）で処理すること
により除去した。ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡを、前記
したようにRnasinを添加した１００マイクロリットルの
ＤＥＰＣ処理水中に再懸濁した。
【０１４８】ｄ）感染組織由来のＲＮＡ試料からのｃＤ
ＮＡの調製 ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡの３マイクログラムの試料
を、製造者の指示に従ってSuperScript Preamplificati
on System for First Strand cDNA SynthesisKit（Gibc
o BRL,Life Technologies）を用いて逆転写する。１５
０ナノグラムのランダムヘキサマーを用いて各反応を開
始させる。SuperScriptII逆転写酵素を添加していない
対照も反応させる。＋／−両方のＲＴ試料をＲＮａｓｅ
Ｈ処理し、ついで、ＰＣＲ反応を進行させる。
【０１４９】ｅ）細菌ｃＤＮＡ種の存在を調べるための
ＰＣＲの使用 ＰＣＲ反応物を下記成分を添加して、氷上で０．２ｍｌ
のチューブ中にセットアップする:４３マイクロリット
ルのPCR Master MIX (Advanced Biotechnologies Lt
d.)；１マイクロリットルのＰＣＲプライマー（最適に
は、長さ１８ないし２５塩基対あり、類似のアニーリン
グ温度を有するように設計されている）、各プライマー
の開始濃度１０ｍＭ；５マイクロリットルのｃＤＮＡ。
下記のごとくPerkin Elmer GeneAmp PCR System 9600に
よりＰＣＲ反応を行う：９４℃で２分、その後、９４
℃、５０℃および７２℃でそれぞれ３０秒、ついで、７
２℃で７分のサイクルを５０回行い、その後、温度を２
０℃に維持する（ＰＣＲ生成物の出現または不存在を決
定するには、最適にはサイクル数は３０ないし５０回で
あり、ＲＴ反応から得られたｃＤＮＡの初発量の評価を
行う場合には、最適には８ないし３０サイクル）；つい
で、１０マイクロリットルの部分試料を１％の１ｘＴＢ
Ｅゲルで泳動し、ＰＣＲ生成物を臭化エチジウム染色
し、存在する場合には、１００ｂｐのＤＮＡラダー（Gi
bco BRL, Life Technologies）との比較によりサイズを
評価する。別法として、ＰＣＲ生成物が標識化ＰＣＲプ
ライマー（例えば、色素で５’末端を標識されたもの）
により便利に標識される場合には、ＰＣＲ生成物の適当
な部分試料をポリアクリルアミド配列決定ゲルで泳動
し、適当なゲルスキャンニングシステム（例えば、Perk
in Elmerにより提供されるGeneScanTMソフトウェアを用
いるABI PrismTM377シークエンサー）を用いてその存在
および量を検出する。
【０１５０】ＲＴ／ＰＣＲ対照は、＋／−逆転写酵素反
応物、１６ｓ ｒＲＮＡプライマ−または非転写ストレ
プトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３ゲノム配
列からＰＣＲ生成物を得るように設計されたＤＮＡ特異
的プライマー対を含んでもよい。プライマー対の効率を
試験するために、それらをストレプトコッカス・ニュー
モニアエ０１００９９３全ＤＮＡを用いるＤＮＡ ＰＣ
Ｒに使用する。ＰＣＲ反応をセットアップし、ｃＤＮＡ
のかわりに約１マイクログラムのＤＮＡを用いて上記の
ごとく行う。ＤＮＡ ＰＣＲにおいてもＲＴ／ＰＣＲに
おいても予想サイズの生成物を生じないプライマー対は
ＰＣＲを失敗させるものであり、それゆえ有用でない。
ＤＮＡ ＰＣＲを用いて正しいサイズの生成物を生じる
プライマーのうち２つのクラスがＲＴ／ＰＣＲにおいて
区別される：１．インビボで再現可能に転写されない遺
伝子はＲＴ／ＰＣＲにおいて生成物を生じない。２．イ
ンビボで再現可能に転写される遺伝子は、ＲＴ／ＰＣＲ
において正しいサイズの生成物を生じ、−ＲＴ対照にお
けるシグナル（存在する場合）よりも強力なシグナルを
＋ＲＴ試料において示す。これらの分析により、このス
トレプトコッカス・ニューモニアエのヒスチジンキナー
ゼ遺伝子は、インビボで転写されることが見出された。
【０１５１】
【配列表】
（１）一般的情報： （ｉ）出願人：ウォリス、ニコラ・ジー サラカイン、マグダレーナ スループ・ジョン ビスワス・サンジョイ （ｉｉ）発明の名称： ヒスチジン・キナーゼ （ｉｉｉ）配列の数：７ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）名称：ディチャート、プライス＆ローズ （Ｂ）通り名：４０００ベル・アトランティック・タワ
ー、１７１７アーク・ストリート （Ｃ）都市名：フィラフェルフィア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９１０３−２７９３ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：Ｗｉｎｄｏｗｓ９５ （Ｄ）ソフトウェア： Ｆａｓｔ ＳＥＱ バージョン
２．０ｂ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号：６０／０４８,３４６ （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ファルク、ステファン・ティ （Ｂ）登録番号：３６，７９５ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＭ１０００８ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：２１５−９９４−２４８８ （Ｂ）テレファックス番号：２１５−９９４−２２２２ （Ｃ）テレックス：
【０１５２】（２） 配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１９９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： CCAATACCTT GAATGTGCAT ATCCATGCTC TTCGACAGGA GCTGGCAAAA TATAGTAGTG 60 ACCAAACGCC CACTATTAAG ACAGTTTGGG GGTTGGGATA TAAGATAGAG AAACCGAGAG 120 GACAAACATG AAACTAAAAA GTTATATTTT GGTTGGATAT ATTATTTCAA CCCTCTTAAC 180 CATTTTGGTT GTTTTTTGGG CTGTTCAAAA AATGCTGATT GCGAAAGGCG AGATTTACTT 240 TTTGCTTGGG ATGACCATCG TTGCCAGCCT TGTCGGTGCT GGGATTAGTC TCTTTCTCCT 300 ATTGCCAGTC TTTACGTCGT TGGGCAAACT CAAGGAGCAT GCCAAGCGGG TAGCGGCCAA 360 GGATTTTCCT TCAAATTTGG AGGTTCAAGG TCCTGTAGAA TTTCAGCAAT TAGGGCAAAC 420 TTTTAATGAG ATGTCCCATG ATTTGCAGGT AAGCTTTGAT TCCTTGGAAG AAAGCGAACG 480 AGAAAAGGGC TTGATGATTG CCCAGTTGTC GCATGATATT AAGACCCCTA TCACTTCGAT 540 CCAAGCGACG GTAGAAGGGA TTTTGGATGG GATTATCAAG GAGTCGGAGC AAGCTCATTA 600 TCTAGCAACC ATTGGACGCC AGACGGAGAG GCTCAATAAA CTGGTTGAGG AGTTGAATTT 660 TTTGACCCTA AACACAGCTA GAAATCAGGT GGAAACTACC AGTAAAGACA GTATTTTTCT 720 GGACAAGCTC TTAATTGAGT GCATGAGTGA ATTTCAGTTT TTGATTGAGC AGGAGAGAAG 780 AGATGTCCAC TTGCAGGTAA TCCCAGAGTC TGCCCGGATT GAGGGAGATT ATGCTAAGCT 840 TTCTCGTATC TTGGTGAATC TGGTCGATAA CGCTTTTAAA TATTCTGCTC CAGGAACCAA 900 GCTGGAAGTG GTGACTAAGC TGGAGAAGGG CCAGCTTTCA ATCAGTGTGA CCGATGAAGG 960 GCAGGGCATT GCCCCAGAGG ATTTGGAAAA TATTTTCAAA CGCCTTTATC GTGTCGAAAC 1020 TTCGCGTAAC ATGAAGACAG GTGGTCATGG ATTAGGACTT GCGATTGCGC GTGAATTGGC 1080 CCATCAATTG GGTGGGGAAA TCACAGTCAG CAGCCAGTAC GGTCTAGGAA GTACCTTTAC 1140 CCTCGTTCTC AATCTCTCTG GTAGTGAAAA TAAAGCCTAA AACCCCTTTA CAAATCCAG 1199
【０１５３】（２） 配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３５０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Lys Leu Lys Ser Tyr Ile Leu Val Gly Tyr Ile Ile Ser Thr Leu 1 5 10 15 Leu Thr Ile Leu Val Val Phe Trp Ala Val Gln Lys Met Leu Ile Ala 20 25 30 Lys Gly Glu Ile Tyr Phe Leu Leu Gly Met Thr Ile Val Ala Ser Leu 35 40 45 Val Gly Ala Gly Ile Ser Leu Phe Leu Leu Leu Pro Val Phe Thr Ser 50 55 60 Leu Gly Lys Leu Lys Glu His Ala Lys Arg Val Ala Ala Lys Asp Phe 65 70 75 80 Pro Ser Asn Leu Glu Val Gln Gly Pro Val Glu Phe Gln Gln Leu Gly 85 90 95 Gln Thr Phe Asn Glu Met Ser His Asp Leu Gln Val Ser Phe Asp Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Ser Glu Arg Glu Lys Gly Leu Met Ile Ala Gln Leu Ser 115 120 125 His Asp Ile Lys Thr Pro Ile Thr Ser Ile Gln Ala Thr Val Glu Gly 130 135 140 Ile Leu Asp Gly Ile Ile Lys Glu Ser Glu Gln Ala His Tyr Leu Ala 145 150 155 160 Thr Ile Gly Arg Gln Thr Glu Arg Leu Asn Lys Leu Val Glu Glu Leu 165 170 175 Asn Phe Leu Thr Leu Asn Thr Ala Arg Asn Gln Val Glu Thr Thr Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Ile Phe Leu Asp Lys Leu Leu Ile Glu Cys Met Ser Glu 195 200 205 Phe Gln Phe Leu Ile Glu Gln Glu Arg Arg Asp Val His Leu Gln Val 210 215 220 Ile Pro Glu Ser Ala Arg Ile Glu Gly Asp Tyr Ala Lys Leu Ser Arg 225 230 235 240 Ile Leu Val Asn Leu Val Asp Asn Ala Phe Lys Tyr Ser Ala Pro Gly 245 250 255 Thr Lys Leu Glu Val Val Thr Lys Leu Glu Lys Gly Gln Leu Ser Ile 260 265 270 Ser Val Thr Asp Glu Gly Gln Gly Ile Ala Pro Glu Asp Leu Glu Asn 275 280 285 Ile Phe Lys Arg Leu Tyr Arg Val Glu Thr Ser Arg Asn Met Lys Thr 290 295 300 Gly Gly His Gly Leu Gly Leu Ala Ile Ala Arg Glu Leu Ala His Gln 305 310 315 320 Leu Gly Gly Glu Ile Thr Val Ser Ser Gln Tyr Gly Leu Gly Ser Thr 325 330 335 Phe Thr Leu Val Leu Asn Leu Ser Gly Ser Glu Asn Lys Ala 340 345 350
【０１５４】（２） 配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４８０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号３： AACATGAAAC TAAAAAGTTA TATTTTGGTT GGATATATTA TTTCAACCCT CTTAACCATT 60 TTGGTTGTTT TTTGGGCTGT TCAAAAAATG CTGATTGCGA AAGGCGAGAT TTACTTTTTG 120 CTTGGGATGA CCATCGTTGC CAGCCTTGTC GGTGCTGGGA TTAGTCTCTT TCTCCTATTG 180 CCAGTCTTTA CGTCGTTGGG CAAACTCAAG GAGCATGCCA AGCGGGTAGC GGCCAAGGAT 240 TTTCCTTCAA ATTTGGAGGT TCAAGGTCCT GTAGAATTTC AGCAATTAGG GCAAACTTTT 300 AATGAGATGT CCCATGATTT GCAGGTAAGC TTTGATTCCT TGGAAGAAAG CGAACGAGAA 360 AAGGGCTTGA TGATTGCCCA GTTGTCGCAT GATATTAAGA CCCCTATCAC TTCGATCCAA 420 GCGACGGTAG AAGGGATTTT GGATGGGATT ATCAAGGAGT CGGAGCAAGC TCATTACTAC 480
【０１５５】（２） 配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１５９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号４： Met Lys Leu Lys Ser Tyr Ile Leu Val Gly Tyr Ile Ile Ser Thr Leu 1 5 10 15 Leu Thr Ile Leu Val Val Phe Trp Ala Val Gln Lys Met Leu Ile Ala 20 25 30 Lys Gly Glu Ile Tyr Phe Leu Leu Gly Met Thr Ile Val Ala Ser Leu 35 40 45 Val Gly Ala Gly Ile Ser Leu Phe Leu Leu Leu Pro Val Phe Thr Ser 50 55 60 Leu Gly Lys Leu Lys Glu His Ala Lys Arg Val Ala Ala Lys Asp Phe 65 70 75 80 Pro Ser Asn Leu Glu Val Gln Gly Pro Val Glu Phe Gln Gln Leu Gly 85 90 95 Gln Thr Phe Asn Glu Met Ser His Asp Leu Gln Val Ser Phe Asp Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Ser Glu Arg Glu Lys Gly Leu Met Ile Ala Gln Leu Ser 115 120 125 His Asp Ile Lys Thr Pro Ile Thr Ser Ile Gln Ala Thr Val Glu Gly 130 135 140 Ile Leu Asp Gly Ile Ile Lys Glu Ser Glu Gln Ala His Tyr Tyr 145 150 155
【０１５６】（２） 配列番号５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号５： ATGAAACTAA AAAGTTATAT TTTG 24
【０１５７】（２） 配列番号６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号６： GGCTTTATTT TCACTACCAG AG 22
【０１５８】（２） 配列番号７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号７： AACTGAGACT GGCTTTAAGA GATTA 25
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＢＬ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＢＭ ＡＢＭ ＡＤＺ ＡＤＺ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/12 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 9/12 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＣＤ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:46） (71)出願人 595047190 スミスクライン・ビーチャム・パブリッ ク・リミテッド・カンパニー ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ｐ．ｌ．ｃ. イギリス国ミドルセックス・ティーダブリ ュ８・９イーピー、ブレンフォード、ニュ ー・ホライズンズ・コート（番地の表示な し) (72)発明者 ニコラ・ゲイル・ウォリス アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州ウ ェイン、シュガータウン・ロード219番、 ケイ203 (72)発明者 マグダレーナ・サラカイン アメリカ合衆国19380ペンシルベニア州ウ エスト・チェスター、ウッドミント・ドラ イブ126番 (72)発明者 ジョン・スループ アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州ロ イヤーズフォード、ブルック・ドライブ 506番 (72)発明者 サンジョイ・ビスワス アメリカ合衆国19301ペンシルベニア州パ オリ、サウス・バレー・ロード77番、アパ ートメント・ビー４

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ｉ）配列番号２または４の全長にわた
    って配列番号２または４のアミノ酸配列に対して少なく
    とも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉ）配列番号２または４のアミノ酸配列を含む単離
    ポリペプチド、 （ｉｉｉ）配列番号２または４のアミノ酸配列である単
    離ポリペプチド、および （ｉｖ）配列番号1または３のポリヌクレオチド配列を
    含む組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
    プチド からなる群より選択される単離ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 （ｉ）配列番号２または４の全長にわた
    って配列番号２または４のアミノ酸配列に対して少なく
    とも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配
    列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｉｉ）配列番号２または４のポリペプチドをコードし
    ているヌクレオチド配列に対してその全長にわたって少
    なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチ
    ド； （ｉｉｉ）配列番号１または３の全長にわたって配列番
    号１または３のヌクレオチド配列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチ
    ド； （ｉｖ）配列番号２または４のポリペプチドをコードし
    ているヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｖ）配列番号１または３のポリヌクレオチドである単
    離ポリヌクレオチド。 （ｖｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
    件下で配列番号１または３の配列またはそのフラグメン
    トの配列を有するプローブを用いて適当なライブラリー
    をスクリーニングすることにより得ることのできる単離
    ポリヌクレオチド； （ｖｉｉ）ストレプトコッカス・ニューモニアエ中に含
    まれるヒスチジンキナーゼ遺伝子により発現される成熟
    ポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチド；
    および （ｖｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉ
    ｖ）、（ｖ）または（ｖｉ）の単離ポリヌクレオチドに
    対し相補的なポリヌクレオチド配列 からなる群より選択される単離ポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドに対して抗原的
    または免疫特異的な抗体。
  4. 【請求項４】 （ｉ）（ａ）ポリペプチドに対する治療
    上有効量のアゴニストを個体に投与すること；または （ｂ）インビボでポリペプチド活性を生じるような形態
    のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含
    む単離ポリヌクレオチドを個体に提供することを含む、
    請求項１のポリペプチドの活性または発現の促進を必要
    とする個体； （ｉｉ）（ａ）ポリペプチドに対する治療上有効量のア
    ンタゴニストを個体に投与すること；または （ｂ）ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列
    の発現を阻害する核酸分子を個体に投与すること；また
    は （ｃ）リガンド、基質、レセプターに対してポリペプチ
    ドと競争する治療上有効量のポリペプチドを個体に投与
    すること を含む、請求項１のポリペプチドの活性または発現の阻
    害を必要とする個体の治療方法。
  5. 【請求項５】 個体における請求項１のポリペプチドの
    発現または活性に関連した個体における疾患またはかか
    る疾患に対する感受性の診断方法であって、 （ａ）該個体のゲノム中の該ポリペプチドをコードして
    いるヌクレオチド配列における変異の存在または不存在
    を決定すること；および／または （ｂ）該個体由来の試料中の該ポリペプチドの発現の存
    在または量を分析すること を含む方法。
  6. 【請求項６】 請求項１のポリペプチドの機能を活性化
    または阻害する化合物を同定するためのスクリーニング
    方法であって、下記の群： （ａ）候補化合物に直接または間接的に結合した標識を
    用いて候補化合物のポリペプチド（またはポリペプチド
    を有する細胞または膜）またはその融合タンパク質への
    結合を測定すること； （ｂ）標識競争物質の存在下で候補化合物のポリペプチ
    ド（またはポリペプチドを有する細胞または膜）または
    その融合タンパク質への結合を測定すること； （ｃ）ポリペプチドを有する細胞または細胞膜に適する
    検出系を用いて、候補化合物がポリペプチドの活性化ま
    たは阻害により発生するシグナルを生じさせるかどうか
    を試験すること； （ｄ）候補化合物と請求項１のポリペプチドを含有する
    溶液とを混合して混合物を作成し、混合物中のポリペプ
    チドの活性を測定し、ついで、混合物の活性を標準と比
    較すること； （ｅ）例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて細胞中で該ポ
    リペプチドをコードしているｍＲＮＡおよび該ポリペプ
    チドの生成に対する候補化合物の影響を検出すること、
    または （ｆ）（１）化合物の相互作用を評価するために、化合
    物とポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条件下
    でポリペプチドを含む組成物をスクリーニングすべき化
    合物と接触させ（かかる相互作用は、化合物とポリペプ
    チドとの相互作用に応答した検出可能シグナルを生じる
    ことのできる第２の成分に関連したものである）；つい
    で （２）化合物とポリペプチドとの相互作用から生じるシ
    グナルの存在または不存在を検出することにより、化合
    物がポリペプチドと相互作用し、その活性を活性化また
    は阻害するかどうかを決定することから選択される方法
    を含む方法。
  7. 【請求項７】 請求項１のポリペプチドの活性または発
    現についてのアゴニストまたはアンタゴニスト。
  8. 【請求項８】 適合する宿主中に存在する場合に、請求
    項１のポリペプチドを生成する能力のあるポリヌクレオ
    チドを含む発現系。
  9. 【請求項９】 請求項８の発現系を含む宿主細胞、 （ｉ）配列番号２または４の全長にわたって配列番号２
    または４のアミノ酸配列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリ
    ペプチド； （ｉｉ）配列番号２または４のアミノ酸配列を含む単離
    ポリペプチド； （ｉｉｉ）配列番号２または４のアミノ酸配列である単
    離ポリペプチド； （ｉｖ）配列番号１または３のポリヌクレオチド配列を
    含む組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
    プチド からなる群より選択されるポリペプチドを発現するその
    膜。
  10. 【請求項１０】 （ｉ）配列番号２または４の全長にわ
    たって配列番号２または４のアミノ酸配列に対して少な
    くとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリ
    ペプチド； （ｉｉ）配列番号２または４のアミノ酸配列を含む単離
    ポリペプチド； （ｉｉｉ）配列番号２または４のアミノ酸配列である単
    離ポリペプチド； （ｉｖ）配列番号１または３のポリヌクレオチド配列を
    含む組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
    プチド からなる群より選択されるポリペプチドの製造方法であ
    って、該ポリペプチドの生成に十分な条件下で請求項９
    の宿主細胞を培養することを含む方法。
  11. 【請求項１１】 請求項８の発現系を含む宿主細胞また
    はｉ）配列番号２または４の全長にわたって配列番号２
    または４のアミノ酸配列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリ
    ペプチド； （ｉｉ）配列番号２または４のアミノ酸配列を含む単離
    ポリペプチド； （ｉｉｉ）配列番号２または４のアミノ酸配列である単
    離ポリペプチド； （ｉｖ）配列番号１または３のポリヌクレオチド配列を
    含む組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
    プチド からなる群より選択されるポリペプチドを発現するそれ
    らの膜を製造する方法であって、（ｉ）、（ｉｉ）、
    （ｉｉｉ）または（ｉｖ）のポリペプチドを生成できる
    ポリヌクレオチドを含む発現系で細胞をトランスフォー
    ムまたはトランスフェクトする工程を含み、発現系が適
    合する宿主細胞中に存在し、適当な培養条件下で培養し
    た場合に該宿主細胞が（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）ま
    たは（ｉｖ）のポリペプチドを生成するものである方
    法。
  12. 【請求項１２】 （ｉ）配列番号２または４の全長にわ
    たって配列番号２または４のアミノ酸配列に対して少な
    くとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリ
    ペプチド； （ｉｉ）配列番号２または４のアミノ酸配列を含む単離
    ポリペプチド； （ｉｉｉ）配列番号２または４のアミノ酸配列である単
    離ポリペプチド； （ｉｖ）配列番号１または３のポリヌクレオチド配列を
    含む組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
    プチド からなる群より選択されるポリペプチドを発現する請求
    項１１の方法により製造される、宿主細胞、またはその
    膜。
  13. 【請求項１３】 配列番号１または３の配列を含むポリ
    ヌクレオチド；配列番号：２または４の配列を含むポリ
    ペプチド；少なくとも１つの配列が配列番号１または３
    の配列を含むものであるポリヌクレオチド配列のセッ
    ト；少なくとも１つの配列が配列番号２または４の配列
    を含むものであるポリペプチド配列のセット；配列番号
    １または３の配列を含むポリヌクレオチド配列を表すデ
    ータセット；配列番号２または４の配列を含むポリペプ
    チド配列をコードしているポリヌクレオチド配列を表す
    データセット；配列番号１または３の配列を含むポリヌ
    クレオチド；配列番号２または４の配列を含むポリペプ
    チド；少なくとも１つの配列が配列番号１または３の配
    列を含むものであるポリヌクレオチド配列のセット；少
    なくとも１つの配列が配列番号：２または４の配列を含
    むものであるポリペプチド配列のセット；配列番号１ま
    たは３の配列を含むポリヌクレオチド配列を表すデータ
    セット；配列番号２または４の配列を含むポリペプチド
    配列をコードしているポリヌクレオチド配列を表すデー
    タセットからなる群より選択されるメンバーを保存した
    コンピューター読み込み可能媒体。
  14. 【請求項１４】 相同性の同定を行うためのコンピュー
    ターによる方法であって、配列番号１または３の配列を
    含むポリヌクレオチド配列をコンピューター読み込み可
    能媒体中に提供し、ついで、該ポリヌクレオチド配列を
    少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド
    配列を比較して相同性を同定する工程を含む方法。
  15. 【請求項１５】 ポリクレオチドアッセンブリーのため
    のコンピューターによる方法であって、配列番号１また
    は３の配列を含む第１のポリヌクレオチド配列をコンピ
    ューター読み込み可能媒体中に提供し、ついで、該第１
    のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列
    との間の少なくとも１つの重複領域をスクリーニングす
    る工程を含む方法。
  16. 【請求項１６】 （ａ）配列番号３の全長にわたって配
    列番号３に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、
    ９５％、９７％の同一性を有するヌクレオチド配列を含
    む単離ポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号３のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌ
    クレオチド； （ｃ）配列番号３のポリヌクレオチド；または （ｄ）配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ
    酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９
    ５％、９７〜９９％の同一性を有するポリペプチドをコ
    ードしているヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオ
    チド からなる群より選択される単離ポリヌクレオチド。
  17. 【請求項１７】 （ａ）配列番号４の全長にわたって配
    列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８
    ０％、９０％、９５％、９７〜９９％の同一性を有する
    アミノ酸配列を含むポリペプチド； （ｂ）配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ
    酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９
    ５％、９７〜９９％同一であるアミノ酸配列を有するポ
    リペプチド； （ｃ）配列番号４のアミノ酸を含むポリペプチド； （ｄ）配列番号４のポリペプチドであるポリペプチド （ｅ）配列番号３に含まれる配列を含むポリヌクレオチ
    ドによりコードされるポリペプチド からなる群より選択されるポリペプチド。
JP10188023A 1997-05-30 1998-05-29 ヒスチジン・キナーゼ Withdrawn JPH11113582A (ja)

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